JP4741189B2 - 増殖した細胞系およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2002年2月8日に提出された米国仮特許出願第60/355,157号(これは、あらゆる図、表、核酸配列、アミノ酸配列または図面を含む、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)の優先権による利益を請求する。
ほとんどの細胞は、適した栄養分および増殖のためのその他の条件が与えられれば、従来の細胞培養技術を用いて、限られた程度までインビトロで培養することができる。このような培養物は、遺伝現象、生理現象およびその他の現象を研究するために、さらにはさまざまな発酵手法を用いて特定の生体分子を製造するために用いられてきた。哺乳動物細胞生物学の研究には、例えば、リンパ節、筋肉、結合組織、腎臓、真皮およびその他の組織に由来する細胞培養物が用いられている。しかし、ほとんどの正常細胞は培養下での増殖能が限られている。ある特定回数の細胞分裂(ヘイフリック限界)の後には、それらはそれ以上増殖できなくなる(Hayflick L., Exp. Cell. Res., 1965, 37: 614-636)。この限られた寿命は分裂性老化(replicative senescence)と呼ばれ、寿命の長い動物における無制限のクローン進化および癌に対する防御機構として生じた可能性が高い。このため、あらゆる種類の細胞をインビトロで維持できるようにすることは以前から科学者の目標となっているが、標準的な培養条件はほとんどの細胞の長期的な生存または増殖を促さない。
本発明は、ヒト細胞およびその他の動物細胞の培養物を含む、細胞の増殖能を高めるために有用な腫瘍細胞系に関する。本発明は特に、細胞の増殖能を高めるために有用なラット甲状腺細胞系(UCHT1)に関する。本発明はまた、このような腫瘍細胞系から調製された馴化培地(conditioned medium)、およびその他の腫瘍細胞系抽出物にも関する。本発明の馴化培地は、不死化細胞系または連続継代細胞系の作製に用いることができる。本発明はさらに、本発明の馴化培地を用いて不死化された細胞系にも関する。
本発明は、不死化細胞または連続継代細胞の培養物が作製されるように、ヒト細胞およびその他の動物細胞の培養物を含む細胞培養物の増殖能を高めるために有用な、Fisher 344ラット甲状腺細胞系(UCHT1)などの腫瘍細胞系に関する。本発明はまた、このような腫瘍細胞系から調製された馴化培地にも関し、これも不死化細胞系または連続継代細胞系を作製するために用いることができる。本発明はさらに、本発明の馴化培地を用いて不死化された細胞系にも関する。
本発明の増殖した細胞は、ヒト、または非ヒト霊長類、齧歯類およびブタなどを含むその他の哺乳動物に由来しうる。源となる種の具体例には、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル;イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ダルマブタ、ウサギおよびフェレットなどの飼い慣らされた動物(ペット);ウシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの家畜;動物園で通常みられる外国産動物、例えばクマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウィルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、オポッサム、アライグマ、パンダ、ジャイアントパンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、ネズミイルカ、イルカおよびクジラなどが非制限的に含まれる。標的細胞が魚類などの非哺乳動物に由来してもよい。
本発明の方法を用いて細胞を増殖させ、その細胞の産物を、当技術分野で知られた方法を用いて採取することができる。本発明の方法を用いて増殖させた遺伝子改変(genetically modified)細胞または非遺伝子改変細胞によって産生された種々の生体分子を、薬剤の製造および薬理試験といったさまざまな用途のために採取すること(例えば、当技術分野で知られた方法を用いて生体分子産生細胞から単離すること)ができる。したがって、本発明の方法を用いることで、連続的に増殖する細胞を作製するために細胞を増殖させ、外因性DNAの産物および/または細胞の天然産物をインビトロまたは動物体内のインビボに提供するための生物「工場」として用いることができる。「生体分子」という用語は、細胞によって産生されうる任意の1つまたは複数の分子のことを指す。このような生体分子には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ヌクレオチド、ウイルスおよびその他の物質が非制限的に含まれる。生体分子のいくつかの具体例には、脳由来増殖因子(BDNF)およびグリア由来神経栄養因子(GDNF)などの栄養因子、ホルモンおよび増殖因子が含まれる。例えば、下垂体細胞を成長ホルモンの生産のために増殖させることができる;腎細胞をプラスミノーゲン活性化因子の生産のために増殖させることができる;骨細胞を骨誘導タンパク質(BMP)または骨融合もしくは補綴外科手術にかかわるその他のタンパク質の生産のために増殖させることができ(Urist, M. R.およびStrates, B. S. J. Dent. Res. Suppl., 1971, 50: 1392-1406;Boden, S. D.ら、Spine, 1995, 20: 2633-2644;Boden, S. D.およびSumner, D. R. Spine, 1995, 20(Suppl. 24):1025-1125)、さらにA型肝炎抗原は増殖させた肝細胞によって生産させることができる。細胞を、さまざまなウイルスワクチンおよび抗体を生産するために増殖させることが可能である。インターフェロン、インスリン、血管新生因子、フィブロネクチンおよび他のさまざまな生体分子を、細胞を増殖させて連続継代細胞系を樹立することによって生産することができる。生体分子は例えば、細胞内のものでも膜貫通性でもよく、または細胞によって分泌されてもよい。
もう1つの面において、本発明は、本発明の不死化細胞からの細胞を、それを必要とする罹患生物(例えば、ヒトまたはその他の動物)に投与することにより、さまざまな障害または外傷を治療するための方法に関する。選択的には、増殖した細胞を、罹患生物に対する投与の前に、本発明の増殖因子から単離すること(接触状態から取り除くこと)ができる。有益なことに、本発明の細胞は癌遺伝子の組み入れを必要とせず、インビトロまたはインビボで増殖を停止するように誘導しうるため、それらは分化した表現型をインビトロまたはインビボで発現することができる。本発明の細胞系の大半はインビボで非腫瘍形成性である。このため、特定の細胞系が非腫瘍形成性であることを当技術分野で知られた方法を用いて判定し、その細胞をそれを必要とする罹患生物に対して投与することができる。
本発明の方法は、遺伝子改変細胞の、単独での、または異なる種類の細胞と組み合わせての投与も想定している。すなわち、本発明の遺伝子改変細胞を他の細胞とともに同時投与することができ、後者には遺伝子改変細胞または非遺伝子改変細胞が含まれうる。遺伝子改変細胞は、例えば、同時投与した細胞の生存および機能を補助する働きをしてもよい。
本明細書に記載の腫瘍細胞系増殖因子の活性の機序は少なくとも2つが考えられ、それらは必ずしも排反的ではない。これらの機序には、例えば、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)のリン酸化もしくはCKI(CDK阻害因子)の阻害;および/または、機能を損なわずに正常なDNA修復を障害させる、テロメラーゼもしくはその他のDNA修復機構(例えば、リガーゼ)との相互作用が含まれる。本発明のさらにもう1つの面には、1つまたは複数の細胞の増殖サイクルをモジュレートする方法が含まれる。考えられる標的細胞には、本発明の他の方法に関連して本明細書に述べたものが含まれる。細胞の増殖サイクルのモジュレーションは、細胞を、腫瘍細胞系増殖因子(その生物活性断片または類似体を含む)、増殖因子受容体のアゴニスト、または拮抗抗体などの増殖因子受容体の機能的アンタゴニストと接触させること、または別の様式で曝露させることによって行いうる。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、増殖因子受容体に対して直接的もしくは間接的に作用してもよく、および/または増殖経路の内部にあってもよい。
Tm=81.5℃+16.6 Log [Na+]+0.41(%G+C)−0.61(%ホルムアミド)−600/二重鎖の塩基対単位での長さ
(Beltzら(1983)、Methods of Enzymology, R. Wu, L. GrossmanおよびK. Moldave[編]Academic Press, New York 100: 266-285)。
(1)室温にて1×SSPE、0.1%SDS中で15分間を2回(低ストリンジェンシー洗浄);
(2)Tm-20℃にて0.2×SSPE、0.1%SDS中で15分間を1回(中程度ストリンジェンシー洗浄)。
Tm(℃)=2(T/A塩基対の数)+4(G/C塩基対の数)
(Suggs, S.V.ら(1981)ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. 「精製された遺伝子の使用(Using Purified Genes)」、D.D. Brown[編]、Academic Press, New York, 23: 683-693)。
(1)室温にて1×SSPE、0.1%SDS中で15分間を2回(低ストリンジェンシー洗浄);
(2)ハイブリダイゼーション温度にて1×SSPE、0.1%SDS中で15分間を1回(中程度ストリンジェンシー洗浄)。
低:1または2×SSPE、室温
低:1または2×SSPE、42℃
中程度:0.2×または1×SSPE、65℃
高:0.1×SSPE、65℃。
RCSN-3細胞系の樹立
RCSN-3細胞系は4カ月齢の正常フィッシャー(Fisher)344ラットの黒質から派生させた。初代培養物の樹立に用いた細胞を、UCHT1細胞により馴化した培地にそれらを曝露させることによって不死化させた(図1に示した通り)。標準的な培養条件としては、細胞を、6g/lグルコース、10%ウシ血清、2.5%ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、10μg/mLストレプトマイシン(SIGMA)を含むように改変し、10%(v/v)UCHT1馴化培地を加えたDMEM/Ham F12栄養混合培地(1:1)(SIGMA Chemical Co., Saint Louis, MO, USA)からなる栄養培地中に保った。培養物は37℃、湿度100%および10%CO2の空気を含むインキュベーター内で維持し、形質転換巣または形態変化の出現に関してルーチン的に観察した。10週間培養した後に形質転換巣が認められた。培養物を増殖させ、その一部を液体窒素中で凍結保存した。細胞系のクローン化を希釈培養によって行い、クローン系統RCSN-3を得た。細胞は集密に達した時点でトリプシン処理(1%トリプシン、GIBCO, Grand Island, NY, USA)によって継代した。標準的な増殖条件としては、RCSN-3細胞を栄養培地中で培養した。培地は週2回完全に交換した。分化のためには、以前の記載の通りに2%成体ウシ血清および1%(v/v)N3添加物を添加し(Cardenas A.M.ら、Neuroreport, 1999、10(2): 363-369)、さらに1%(v/v)Site+3添加物(SIGMA)を加えたDMEM/Ham F12栄養混合培地からなる培地中に細胞を保った。細胞を1週間かけて分化させた。
細胞を、4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液pH 7.4中で固定した。細胞化学反応には以下のものが含まれる:ヘマトキシリン-エオジン染色、神経メラニンの形態にあるメラニンの存在を示すための第一鉄イオン捕捉法、カテコールアミンの存在を示すためのパラホルムアルデヒド-グリオキシル酸染色。
固定した細胞に、50%〜96%の範囲で濃度が順に高くなる/低くなる一連のアルコール中で透過化処理を行った。ブロッキング反応は1%BSAを含むリン酸緩衝液中で行った。用いた抗体は以下の通りである:(i)ニューロンマーカー:NSE(希釈済み、BIOGENEX)シナプトフィジン(希釈済み、BIOGENEX)、MAP-2(1:1000、SIGMA);(ii)グリアマーカー:GFAP(希釈済み、BIOGENEX)、S-100(希釈済み、BIOGENEX);および(iii)機能マーカー:TH(1:1000〜1:1500、SIGMA)。一次抗体とのインキュベーションを一晩行い、ABC検出キット(BIOGENEX)をDABを色素原として用いて反応を現像した。ニューロフィラメント200kDおよび破傷風毒素受容体の存在の評価には、特異的な一次抗体、フルオレセイン標識した二次抗体および破傷風毒素を用いた。
細胞内Ca2+の測定のためには細胞を35mm培養皿に再プレーティングした。細胞内Ca2+の変動はFluro-3を用いるCa2+画像化法によって評価した。細胞をこの指示薬とともに37℃で40〜60分間インキュベートした。落射蛍光装置(ハロゲンランプ)を備えたOLYMPUS BH2顕微鏡により、培養皿を可視化した。この顕微鏡には高性能冷却式Isisデジタルカメラ(PHOTONIC SCIENCE, Ltd, Robertsbridge, UK)が装着され、これはAXON DIGIDATA 2000デジタル変換ボード(AXON Instruments, Foster City, CA)を装備した専用PCに接続されている。画像はカスタマイズしたソフトウエアAXON Imaging Workbench 2.1.80(AXON)を用いて解像度12bitおよび1Hzで収集した。正常な細胞外液の組成は以下の通りであった(mM単位):135または145 NaCl、5 KCl、2 MgCl2、1.5または2.5 CaCl2、10 4-(2-ヒドロキシエル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)-NaOH、10 デキストロース(pH=7.4)。
4匹の成体雄性Fisher 344ラット(200〜250g)に対して、内側前脳束に沿った2つの部位への臭化6-ヒドロキシドーパミンの一側注入によって損傷を加えた。移植の前に、アポモルフィンで誘発される回転行動(体重1kg当たり5mgのアポモルフィンの腹腔内注射, National Health Service, Chile)の目視による評価を2回、週1回ずつ行った。30分間に160回転を上回ったラットのみを移植後に3回用いた(第30日、55日および80日)。移植物に関しては、集密化した培養物をPBSで洗い、1%トリプシンで解離させた。容積4μL中にある500,000個の細胞を先の尖っていないHamiltonシリンジで移植し、AP +1.0mm、ML -2.5mmおよびV -4.7mm(ブレグマを基準とした座標)(ツースバー(toothbar)は-2.5に設定)に留置した。移植後に回転行動を2週間毎に目視により評価した。
UCHT1増殖因子の単離および特徴分析のために二段階アプローチを用いた:(i)UCHT1細胞系により馴化した培地の収集;ならびに(ii)UCHT1腫瘍細胞系に付随する増殖因子の同定(すなわち、形質転換促進因子)およびバイオアッセイでの検討。培地は、DMEM/Ham F12栄養混合培地(1:1)(SIGMA Chemical Co, St. Louis, MO. カタログ番号D8900)に1g/l炭酸水素塩を加えたものから構成される。この基礎培地に対して、以下の改変を加えた:完全培地:87.5%基礎培地、10%成体ウシ血清および2.5%ウシ胎仔血清を含む;2%血清培地:98%基礎培地+2%ウシ胎仔血清;ならびに凍結保存培地:70%基礎培地、20%ウシ胎仔血清および10%DMSOを含む。使用しない場合、細胞は凍結保存培地とともに凍結チューブに入れ、液体窒素中で保存した。細胞は37℃の水浴中で90秒以内に解凍させた。解凍した細胞を培養皿に播き、完全培地を与えた。培養皿は37℃、湿度100%および10%CO2下に保ち、培地を3日毎に交換した。細胞が集密に達した時点で継代を行った。細胞をPBSで洗い、トリプシン処理(トリプシン0.1%)で剥離させた上でピペッティングによって再懸濁させた。細胞を1000r.p.m.で10分間遠心し、上清は廃棄した。続いて細胞を新たな培養皿に1/20スリットで播き、完全培地を与えた。
培地を培養皿から吸引し、細胞をPBSで洗った上でトリプシン0.1%により剥離させた。懸濁液を1000r.p.m.で遠心し、細胞ペレットを凍結保存培地中に1×106個/mlの密度で再懸濁した。懸濁液を凍結チューブに入れ、第1段階として、1℃/分の速度で-86℃にして凍結した。24時間後に、凍結チューブを最終的な保存のために液体窒に移した。
UCHT1細胞を直径15cmのペトリ皿の中で集密に達するまで培養した。この時点で馴化培地を収集し、-20℃で凍結した。培地の融解および再凍結を3サイクル繰り返した。その後、培地を5000r.p.m.で約20分間遠心し、上清を孔径0.2μmのニトロセルロースフィルターで濾過した。血清を加えた培地および血清を含まない基礎培地を集密化したUCHT1培養物に対して24時間曝露させた上で収集した。クロマトグラフィー試験に関しては、脱塩および濃縮の手順を行った。培地試料をSEPHADEX G-25M(PHARMACIA BIOTECH)を含むPD-10カラムに通したが、この際、試料は1.4倍に希釈された。続いて試料をCENTRICON分子フィルターバイアル(AMICON)に入れ、SORVALL RC-28S冷却遠心機(DUPONT)により4800r.p.m.で2.5時間遠心することによって濃縮した。各バイアルには100μlの0.1%Tween 80を添加した。
ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル(SDS、SDS-PAGE)を用いた。十分な電荷-質量相関を得るために、併せて1gのタンパク質に対して計1.4gのSDSを想定した。ゲルはBIORAD電気泳動チャンバー(MINI PROTEAN II)により12.5%アクリルアミドで泳動し、試料1つ当たり10カラムを用いた。このゲルの感度は、高輝度クーマシーブルーによる染色ではバンド当たりタンパク質0.1μg〜1.0μgであり、銀染色では2ng〜10ngであった。分解能は15kDa〜60kDa(Bollag, Dら(1996)「タンパク質の方法(Protein Methods)」、第2版)。ゲルはEPS 3500XL電気泳動電源供給装置(PHARMACIA BIOTECH)またはPower Pac 1000(BIORAD)を用いて200Vで45分間泳動した。タンパク質は電場によって生じたpH勾配に従って移動し、タンパク質の等電点を示すため、等電点電気泳動(IEF)により、それらを正味の電荷によって分離することが可能である。ファルマライト(Pharmalyte)3〜9を含むPhast Gel 1%Agarosa IEFという市販のゲルによるPhast System法を用いた。このゲルはpIのスペクトルが広いことから選択した。焦点化の段階は連続的に行い、ゲルをその後に硝酸銀で染色し、さらにその後に色素を除去した。ゲルには勾配がないため、それぞれのpIは直線的に可視化される。
疎水相互作用樹脂およびイオン交換樹脂を用いた。FPLC液体クロマトグラフィーキットをFPLC DIRECTORソフトウエアの指令下で用いた。適切な結合バッファーおよび脱吸着バッファを用いた。操作のための溶出勾配、カラム容積および流量を決定した。収集した情報は導電率および280nmでの吸光度に対応し、これによってクロマトグラフィープロファイルが決定される。EXPRESS-ION、Exchanger Dカラム(WHATMAN INTERNATIONAL)、これはセルロース基質中にあるジエチルアミノエチル、DEAE-セルロースを用いる。吸着能力は1ml当たりタンパク質61mgである。用いた緩衝液は、結合用にはBis-Tris 20mM pH 7.0であり、溶出用には同じ緩衝液にNaCl 1Mを加えたものを用いた。疎水相互作用クロマトグラフィーに関しては、フェニル-セファロースおよびButyl-SEPHAROSE FAST FLOW(SIGMA)の1mlカラムを用いた。結合バッファーはBis-Tris、または(NH4)2SO4 0.7Mを加えたBis-Tris Propane 20mM pH 7.0とした。勾配を作成するためには、硫酸アンモニウムを含まない同じ緩衝液を用いた(Andrews, B.A.ら、Bioseparations, 1996, 6: 303-313)。この手法は高い塩濃度およびpH 6.5〜8.0を想定している。タンパク質の特徴が十分に明らかではないため、フェニル基を置換した樹脂カラムが好ましいとみなした。
タンパク質はBradfordの方法の変法(Deutscher, M.P. [1990]「酵素学におけるタンパク質精製法の手引き(Guide to Protein Purification-Methods in enzymology)」、Academic Press, Inc., 182)により、クーマシーブリリアントブルー(Coomassie Brilliant Blue)G-250を用いて測定した。BSA(SIGMA)を標準化のために用いた。ULTRASPEC 3000分光光度計(PHARMACIA BIOTECH)を用いた。例外的に、タンパク質アッセイキット(PIERCE)を用いて、ビシンコニン酸法によるタンパク質の測定も行った。
収集したUCHT1培地のさまざまな画分による形質転換を検出するのに適切なバイオアッセイを選択することが望ましいと考えた。用いた細胞系はKGFR細胞系、NRK 52E細胞系およびヒト神経芽腫細胞系であった。KGFR細胞系はマウス線維芽細胞3T3細胞系に由来し、EGF受容体をトランスフェクトしたものである。この細胞は、DMEM/F12(1:1)(SIGMA)に10%ウシ胎仔血清を加えたものから構成される培地中で表面に付着して増殖し、標準的なトリプシン処理によって継代される。KGFR細胞系は、UCHT1馴化培地の画分を試験するための軟寒天培地および液体培地アッセイを確立するために用いた。NRK 52E細胞系(ATCC:CRL-1571)はラット(Rattus norvegicus)の正常腎臓上皮に由来する。NRK 52E細胞系はEGF受容体および増殖刺激活性(MSA)を発現し、表面に付着して増殖する。NRK 52E細胞は形質転換しておらず、形質転換および悪性度のアッセイにおける基本的な特性である接触阻止を培養下で呈する。この細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたDMEM/F12 1:1培地(SIGMA)中で増殖する。継代は標準的なトリプシン処理によって行った。継代比率は1:3〜4とし、培地は週2回交換した。組織の外植片に由来するヒト神経芽腫細胞を患者の生検標本から派生させ、その後に培養した。この細胞は10%FBS、10%成体血清およびNGF(CALBIOCHEM)10ng/mlを加えたDMEM/F12 1:1培地(SIGMA)中で基質に付着して増殖する。それらをその後、10%成体血清、7.5%FBSおよび5ng/ml NGFに順応させた。
この技法は形質転換と90%の相関性があり、腫瘍形成性の検出のためにヌードマウスなどの動物モデルを用いて作業を進めるよりも迅速でコストもかからない。細胞を軟寒天中で1週間かけて増殖させ、コロニーを色素で明示させる。この環境で増殖している細胞は足場とは無関係であり、これは形質転換した表現型と相関する。軟寒天法のプロトコールは以下の通りである:(1)5%寒天を培地で10倍に希釈し、最終濃度を0.5%にする;(2)0.7mlの0.5%寒天を直径3.5cmの培養皿に添加する(基部);(3)培養皿1枚当たり0.2mlの細胞懸濁液(約3×104個/ml)を混合する;(4)0.7mlの0.3%寒天を基部寒天の上に重ね、培養皿をインキュベーター内に1週間保つ(37℃、湿度100%、10%CO2);(5)1週間後に細胞を0.5mg/ml p-ヨードニトロテトラゾリウムで染色する;そして(6)細胞を24時間のインキュベーション時間にわたってインキュベートし、コロニーの数を評価する。
沈殿には2種類の方法を用いた:(1)アセトンによる;および(2)硫酸アンモニウムによる。アセトンによる沈殿のためには、血清を含まず、UCHT1馴化培地中に24時間保った培地を用いた。総タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイにより評価した。一連の手順は、無血清馴化培地の5,000rpmでの20分間の遠心処理によって開始し、その後に上清を孔径0.2μmに対して濾過した。その後にアセトンを-20℃として添加し、10,000rpmでの30分間の遠心処理によって沈殿物を収集した。上清を採取し、さらにアセトンを添加した。沈殿物は1mlの冷却滅菌PBS中に再懸濁した。第2の沈殿は、0.1mlずつの各PBS画分および1.5mlアセトンを用いて過剰量のアセトンによって行った。
無血清UCHT1馴化培地を5,000rpmで20分間遠心し、その後に孔径0.2μmに対して濾過した。いずれの時点でもpHは7.0〜7.5の範囲に保ち、温度は4℃とした。硫酸アンモニウムを添加し、30分混合して溶媒をタンパク質と平衡化した。10,000rpm、30分間の遠心処理の後に沈殿物を採取した。上清を再び用いてさらに沈殿させ、最終的な沈殿物を200μlの冷却滅菌緩衝液中に再懸濁した。
規定培地は、表2に列挙した添加物(これらは甲状腺細胞に対する栄養作用がある)を加えたDMEM/F-12に対応する(Scopes, R. [1988]「タンパク質の精製―原理および実践)(Protein Purification-Principles and Practice)」、Springer-Verlag Inc., New York)。UCHT1細胞を、血清含有量を漸減することにより、規定培地に対して徐々に順応させた:12.5%から9.4%、6.3%、3.1%、最終的には1.25%。各血清濃度における2回の継代については条件を同じに保った。
溶液はいずれも滅菌し、3回蒸留し、脱イオン化した水で調製した。リン酸緩衝食塩水(PBS)pH 7.4は以下を含む:8.0g/l NaCl(136.9mM);0.2g/l KCl(2.7mM);1.5g/l NaHPO4(10.6mM);0.2g/l KH2PO4(1.5mM);D溶液、pH 7.4は8.0063g/l NaCl(137mM);0.4026g/l KCl(5.4mM);24.1mg/l Na2HPO4(0.17mM);29.9mg/l KH2PO4(0.22mM);1.0899g/lグルコース(5.5mM);2.0196g/l(5.9mM)を含む。トリプシンはPBSで0.1%w/vに希釈した。培地は、DMEM/F-12に1gr/l炭酸水素塩および40μg/mlゲンタマイシン(Laboratorio Chile、80μg/アンプル)を必要に応じて加えたものを含む。
機能性があって移植可能なラット甲状腺腫瘍に由来するクローン細胞系を、酵素による解離後に培養-動物での継代手順を交互に行うことにより、連続継代単層培養物として樹立した(Caviedes, R.およびStanbury J.B., Endocrinology, 1976, 99: 549-554)。自律性で移植可能な腫瘍を培養物のための細胞源として用いた(Matovinovic, J.ら、Cancer Res., 1970, 30: 540;Matovinovic, J.ら、Cancer Res., 1971, 31: 288)。ヨウ素欠乏食を14〜18カ月間与えたラット由来の甲状腺組織を、同様の食事を与えた131I甲状腺切除ラットに移植することにより、腫瘍を発達させた。約9カ月後に、通常食を与えたラットに腫瘍を移植した。6カ月後に現れた、十分に分化した濾胞性および機能性の腫瘍(第二世代)を、連続継代培養物の樹立のために選択した。
ガラス製ペトリ皿(直径15cm)に、約5×105個のマイコプラズマ非含有UCHT1細胞(実施例1に記載)を、同容積のHam F12培地およびダルベッコ変法イーグル培地からなる混合溶液(F12/D)に10%ウシ血清、2.5%ウシ胎仔血清、0.015M HEPES(n-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)緩衝液pH 7.2、50mg/l硫酸ストレプトマイシンおよび100mg/lペニシリン-Gナトリウムを加えたもの(これを基礎増殖培地(BGM)として用いた)の中にある状態で接種した。培養物を、10%CO2、90%空気の雰囲気下に調節したインキュベーター内で36℃、湿度100%にてインキュベートし、3日毎に培地をすべて交換した。UCHT1-CMは指数増殖中の培養物から収集し、24時間の培養期間の4回分を続けて採取して、4日後にはペトリ皿1枚当たり合計80mLの量を得た;集密化に達した後の大規模な細胞剥離のためにそれ以上のUCHT1-CM収集は行えない。最終的に、UCHT1-CMを0.2μm Gelman SUPOR-200ニトロセルロース膜で濾過し、-20℃で凍結保温した。
永続的培養下にある細胞系(RCMH)を、甲状腺細胞から得た馴化培地に対する曝露により、外科的に採取した成人正常骨格筋から樹立した。細胞は無限に増殖したが増殖の密度阻止を呈し、いくつかの分化マーカーが維持された。特定のインキュベーション条件下では、細胞は融合して筋管様構造をとり、免疫細胞化学手順を用いて同定したところ、これに伴ってヒトミオグロビン、骨格筋ミオシン、デスミンおよびジストロフィンなどの筋特異的タンパク質が増加した。さらに、RCMH細胞はα-ブンガロトキシン(Bmax=0.7pmol/mgタンパク質、Kd=1.5nM)およびジヒドロピリジン(Bmax=0.3pmol/mgタンパク質、[3H]PN200-110に対するKd=0.5nM)に対する高親和性受容体も示した。これらの値は初代培養下の正常筋細胞と同等である。パッチクランプ試験により、42pSカルバコール依存性チャンネルおよび5pSカルシウムチャンネル(電流はバリウムにより搬送);塩素チャンネルおよびカリウムチャンネルも認められた。RCMH細胞系に対して行った培養物の樹立、培養条件、免疫細胞化学手順、結合実験および単一チャンネル記録、ならびに結果は、Caviedes, Rら、Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1134: 247-255に記載されている。
6カ月齢の雌性Fisherラット10匹に対して106個のUCHT1細胞を皮下注射した。3カ月以内で腫瘍を発達させた後に、ラットに麻酔をかけ、小脳皮質の部分を切離して、ダルベッコ変法イーグル培地およびHam's F12培地の1:1混合物(GRAND ISLAND BIOL. Co., NY, U.S.A.)(血清を含まない)を含む時計皿に載せた。約1mm3の小脳外植片を作製してガラス製ペトリ皿に入れ、15%ウシ血清、2.5%ウシ胎仔血清、0.015H M Hepes緩衝液pH 7.2に加えて50mg/l硫酸ストレプトマイシン、100mg/lペニシリン-Gナトリウム、および総量を6g/lとするのに十分な量のグルコースを含む、同じ培地混合物中で増殖させた。培養した外植片を36℃、湿度100%でインキュベートした。樹立した小脳培養物から25回目の継代の時点、インビトロに15カ月間おいた後にクローンを単離した。1つのクローン(UCHCC1)は培養下に維持して検討したが、残りのものは凍結した。小脳細胞系UCHCC1はニューロン様形態を保っていた;培地へのジメチルスルホキシド(DMSO)の添加により、突起伸長を主な特徴とする、再現性のある形態的「分化」イベントが誘発された。「分化した」細胞において、ベラトリジンは22Naの取り込みを有意に増加させた。この取り込み増強はテトロドトキシン(TTX)によって阻止され、半値阻害濃度は0.9nMであった。TTXの[3H]エチレンジアミン誘導体([3H]en-TTX)と、同じDMSO処理細胞から調製したミクロソーム画分との結合により、最大結合量(Bmax)が173fmol/mgタンパク質であってKdが1.1nMである単一クラスの受容体が示された。甲状腺UCHT1細胞および「未分化」(DMSOの非存在下で培養した)小脳細胞では、22Na取り込みに対しても[3H]en-TTX結合に対してもベラトリジンの明らかな影響は認められなかった。適切な環境操作によって誘導された「分化した」神経様の性質は、中枢ニューロンを発生するモデル系としての小脳UCHCC1細胞の有用性を示している。UCHCC1細胞系に対して行った培養物の樹立、ナトリウム流アッセイ、[3H]エチレンジアミン-テトロドトキシン([3H]en-TTX)を用いた結合アッセイ、形態学的検討、および結果は、Caviedes R.ら、Brain Res., 1986, 365: 259-268に記載されている。
永続的培養下にある細胞系(RCVC)を、成体ラット心室細胞から作製した;形質転換はUCHT1ラット甲状腺細胞系による馴化培地とのインキュベーションによって行った。詳細には、断頭したFisher 344正常雄性ラットの心臓から心室腔を取り出し、脂肪および間充織包膜を除去して微粉砕した。約1mm3の心筋外植片を作製し、直径10cmのガラス製培養皿に播種して付着させ、BGM+20%UCHT1馴化培地(UCHT1-CM)中で増殖させた。心室外植片の約25%が付着し、2週間で増生を開始して40日で集密化した。初期増生物をトリプシン処理およびEDTAによって分離し、「選択的連続継代」法によって選別した。3回の連続的継代を、対応する各24時間のプレプレーティング期間に続いて行い、最も緩徐に付着する細胞を選択した。線維芽細胞を除去するために、システイン、グルタミンおよび血清を除去して一定期間にわたり培養物をインキュベートした。筋原細胞を多く含む培養物をトリプシン処理によって継代し、増殖能力に応じて1:2〜1:10に希釈した。培養下で3カ月間の連続増殖させた後にUCHT1-CMをBGMから除いたが、細胞増殖パラメーターには明らかな影響はなかった。
本発明の方法に従って増殖させた細胞は、細胞が疾患のインビトロモデルとなるように天然または誘発性の病的欠陥を有することができる。したがって、変異、罹患または別の様式の障害のある細胞を、その特定の疾患に対する薬物スクリーニングのために増殖させることができる。例えば、病的組織がUCHT1馴化培地を用いて形質転換を受け、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する罹患生物の骨格筋、嚢胞性線維症を有する罹患生物の膵管、ならびにヒトのダウン症候群およびアルツハイマー病のマウスモデルの神経組織から、細胞系が作製されている。
2種類のラット細胞系(RCHT-1およびRCHT-2)が、Fisher 344ラットの視床下部由来の外植片をUCHT1馴化培地の存在下で培養することによって樹立された。細胞核周囲部で免疫組織化学によって検出されたマーカー(陽性細胞の%)を提示する。値は未分化細胞から得たものである。LHRH(+):10%;破傷風毒素(+):50〜60%;ニューロフィジン:1%;ACTH:1%;α MSH:1%;βエンドルフィン:1%;ソマトスタチン:1%;メトエンケファリン:0.5%;TRH:0.5%;バソプレッシン:0.1%:オキシトシン:0.1%;チロシンヒドロキシラーゼ:0.1%;GAD:0.1%;CRH(-);GFAP(-);S100(-);NSE(-);N-エピネフリン取り込み:存在;ノルエピネフリン(HPLCによる):>10ng/mgタンパク質;および、ドーパミン(HPLCによる):13ng/mgタンパク質。
成体ラットの黒質に由来するRCSN-3細胞系の初代培養物をUCHT1馴化培地の存在下で増殖させた。RCSN-3細胞系は、栄養培地中に保った場合、単層として増殖し、倍加時間は52時間であり、プレーティング効率は21%で飽和密度は410,000個/cm2であった。図2A〜2Fは、未分化RCSN細胞に上皮様形態を示す傾向があり、突起は短いか存在せず、酸性色素に染まりやすい細胞質を有することを示している。分化の後には細胞の増殖が大きく低下し、RCSN細胞が突起を出して近傍細胞との接触を確立する。メラニンの存在が第一鉄イオン捕捉法によって認められたが、このことは細胞質中の色素が均一に分布し、未分化段階では標識がわずかであるが分化に伴って大幅に増強することを示している。
体重180〜200gのFisher 344ラット5匹を用いた(A群:対照(n=1)、損傷も移植もなし;B群:対照損傷(n=1)、損傷ラット、移植は行わず;C群:実験群(n=3)、損傷があって移植したラット)。ラットには同様の食事および水を自由摂取させた。移植および損傷の手順は、ケタミンによる全身麻酔下でDavid Kopfステレオトーム(stereotome)を用いて行った。パーキンソン病モデルの誘導のためには、8μgの6-OHDAを含む4μlの食塩液を、上行性中脳線条体ドーパミン作動性経路を含む腹側被蓋野に神経細胞体を損なわないように注入して定位損傷を作成した。座標は4,4mm AP、ブレグマに対して1,2mm側方、および脳の表面に対して7.8mm垂直方向とした。注入は50μl Hamiltonシリンジを用いて行った。この損傷は同側線条体のドーパミン作動性神経支配を受ける領域の神経支配を除去する(UrgenstedtおよびHerrera-Marschitz, 1981)。6-OHDAは黒質のドーパミン作動性ニューロンの死滅を引き起こし、これにより黒質-線条体経路の遮断を引き起こす。
カテコールアミン遊離の電気化学的検出を以前の記載の通りに行った(Kawagoe, K.T.ら、Analytical Chemistry, 1991, 63: 1589-1594)。簡潔に述べると、カーボンファイバーの単線(直径10μm)を、引張して作製したガラス製キャピラリーに挿入することにより、カーボンファイバー製センサーを構築した。続いて、このカーボンファイバー電極に、塗料の陽極電気泳動沈着法を用いて、薄く均一な絶縁膜をコーティングした。続いてポリマー薄膜を熱硬化させた。各々の実験の前には、マイクロピペット面取り砥石で、電極の先端を45゜に研磨した(NARISHIGE, Tokyo, Japan)。電気化学電流はList EPC-5パッチクランプ増幅器によって増幅した。カーボンファイバー電極の電位は+650mVに設定した。電流シグナルをローパスフィルターに通過させて10kHzでフィルター処理し、保存した上でIBM PC互換コンピュータを用いて解析した。
図19Aおよび19Bは、対照条件下で培養したRCSN-3細胞系(図19A)およびMPP+による処理後のRCSN-3細胞系(図19B)におけるDNA断片化試験(TUNEL)を示している。MPP+処理細胞におけるDNAの断片化が注目され、これはアポトーシス機構の関与を示している。図20A〜20Cは、JC-1色素によるミトコンドリア膜電位変化を示している。JC-1は新規な陽イオン性カルボシアニン色素であり、ミトコンドリアに蓄積する。この色素は低濃度では単量体として存在し、フルオレセインと同様に緑色蛍光を発する。高濃度では、この色素は幅広い励起スペクトルを呈するJ凝集体を形成し、その最大発光波長は約590nmである。これらの特徴により、JC-1はミトコンドリア膜電位の高感度マーカーとなっている(MOLECULAR PROBES, Eugene, OR)。ドーパミンおよびMnで処理した細胞における蛍光の弱さは膜電位の低下を示しており、このことはこれらの物質の作用の基礎にはミトコンドリア機能不全があることを示唆している。図21Aおよび21BはMPP+の存在下でのJC-1染色を示しており、これはこの毒素もミトコンドリア機能に影響を及ぼすことを示唆する。図22Aおよび22Bは、基礎蛍光によって標準化した、JC-1とJ単量体との発光の比を示している。ドーパミン、マンガンおよびMPP+は対照との有意差を示している。
RCSN-3細胞を100μM L-Dopaの存在下で24時間インキュベートした。細胞を低張緩衝液で可溶した。インサイチューで酸化されたメラニンはリポフスチン様の黄色蛍光を呈した。インビトロでのメラニンの酸化によってメラニン重合体が分解され、蛍光性溶液が生じた。天然メラニンおよび合成メラニンのいずれについても、蛍光分光法によって示された最大励起波長は約470nmであり、最大発光波長は約540nmであった。光または過酸化水素への曝露時間が長くなるほどメラニン蛍光は増加した(Kayatz, P.ら、Invest Ophthalmol Vis Sci, Jan. 2001,42(1): 241-6)。
新生ジャコウザルの膵臓の試料を入手し、コラゲナーゼ0.2%によって酵素的に消化処理を行った。細胞を6回継代したところ、ほとんどの細胞にはインスリンを発現した(80%)。約20%はグルカゴン発現した。この比率は、UCHT1プロトコールに用いた本発明者らの標準的なDME/Ham F12培地のグルコース含量が多い(3.15g/l)ためである可能性がある。しかし、試料はインスリン含有細胞の比率が高い尾部から採取した。新生ジャコウザルの膵尾部から樹立した。この細胞系を4〜5回継代したところ、20回を上回る集団倍加が得られた。細胞は形態的には上皮の外観を呈した。免疫蛍光試験では、3.15g/lグルコースを含む培地中でインスリンに対する陽性反応が90%を上回り、グルカゴンに関しては5%未満であった。これらの培養物は、不死化が明らかになって培養物がUCHT1培地に依存しなくなるまで増殖を続けると考えられ、その時点で十分な特徴分析を行うことができると考えられる。
セロトニン作動性細胞系を、胎児、新生児または成体由来の視床下部外側部、縫線核背核または脳から派生させることができる。このような細胞は、神経障害、例えば疼痛および脊髄損傷の治療のために移植することができる。
セルトリ細胞を本発明の方法を用いて増殖させることもできる。セルトリ細胞は任意のさまざまな哺乳動物(例えば、齧歯類、ブタ、ヒト)から解離することができる。セルトリ細胞は思春期前期にあるドナーの睾丸から解離することが好ましい。この時期には例えば、セルトリ細胞が行う栄養供給およびFas-Lの発現が最大になる。非増殖性のセルトリ細胞は生存し、脳に対する神経栄養効果、同時移植片への神経栄養供給を及ぼすほか、Fas-Lまたはその他の機序を介した神経異種移植片ならびに全身性の同種移植片および異種移植片の局所的な免疫防御を行うことが示されている(Sanberg, P.R.ら、Transplant. Proc., 1997, 29: 1926-1928;Willing, A.E.ら、Brain Res., 1999, 246-250;Willing, A.E.ら、Brain Res. Bull., 1999, 48(4): 441-444);Kin, T.ら、Cell Transplantation, 2002, 11: 547-552)。
細胞系の不死化を引き起こすUCHT1増殖因子の特徴は一部は解明されている。この増殖因子は糖タンパク質と推定され、正常細胞および腫瘍性細胞の馴化培地に由来する多くのトランスフォーミング増殖因子(TGF)とは、既知のTGFが馴化培地の除去に対して可逆的な増殖作用を誘導する点で異なる;UCHT1増殖因子は培地を除去しても持続性である。実験動物を用いた研究で、いくつかの種類の実験的腫瘍(すなわち、リンパ腫、乳房腫瘍、原発性および移植性肝癌)の誘導および増殖に対する甲状腺ホルモンの影響が明らかに示されている。トリヨードチロニンは、X線、発癌性化学物質ならびにDNAウイルスおよびRNAウイルスによる培養細胞の腫瘍性形質転換において役割を果たす。ウイルス癌遺伝子(v-erbA)の細胞性対応物が甲状腺ホルモン受容体をコードするという事実は、このホルモンが腫瘍増殖に対して直接的または間接的な影響を及ぼすことを示唆する。しかし、ホルモン単独での作用に反応した細胞形質転換または腫瘍促進は報告されておらず、このため既知および未知の増殖因子が同時に存在することが必要であるため、ホルモンの存在のみでは形質転換を誘導するには不十分であると考えられる。
図25は、表7に示したように、各飽和レベルの硫酸アンモニウムによる沈殿物においてクーマシーブルー色素で染色したSDS-PAGEを示している。最初のカラムは分子量マーカーを含む。図25は、主要成分が約65kDおよび15kDに位置し、それらがそれぞれアルブミンおよびラクトアルブミンと会合していることを示している。ほとんどのタンパク質は飽和度65%〜80%の硫酸アンモニウムで沈殿するが、40%〜50%および50%〜65%の範囲にあるタンパク質の数はさらに多い。理論的にはチログロブリンは40%〜50%で沈殿する。
いくつかの正常な細胞種を不死化させる有効性を評価するために、腫瘍細胞系培養物の元の上清をその亜画分とともに用いる。正常細胞系は迅速に不死化されるものが好ましい。次に、腫瘍上清画分をゲル濾過カラムにより、好ましくはHPLC技術を用いてサイズ画分する。次に、どの画分に不死化成分が存在するかを明らかにする。増殖性のある1つまたは複数の画分が同定されたところで、タンパク質を電荷、疎水性または吸着などによって分離するHPLCまたは一般的な実験用クロマトグラフィーカラムを用いて活性画分の亜分画をさらに行う。続いて、画分の純度をアッセイするために一次元および二次元SDS-PAGEゲルを泳動する。画分が純粋でなければ、ゲルに現れるバンドの数ができるだけ少ない数に減るまで、サイズ、電荷、吸着などに基づいてさらに分離を行うことができる。続いて、これらの画分をゲルから切り出す。
前記の通り、人体には200種類を上回る細胞種が存在しており、本発明の方法は、治療、製造またはその他の目的で、これらの細胞種のうち任意のものを増殖させるのに有用である。本発明の方法を用いて増殖させうる細胞種の例を以下の表に列挙した。増殖させることが可能な細胞種のその他の例は本明細書中に開示されている。
Claims (78)
- その細胞と接触した標的細胞の増殖能を高める、UCHT1ラット甲状腺細胞系。
- 寄託番号DSM ACC2535の細胞系の増殖誘導特性を有する、請求項1記載の細胞系。
- UCHT1ラット甲状腺細胞系から得られる馴化培地。
- UCHT1ラット甲状腺細胞系が、寄託番号DSM ACC2535の細胞系の増殖誘発特性を有する、請求項3記載の馴化培地。
- 細胞の増殖を誘導するための方法であって、1つまたは複数の標的細胞をUCHT1ラット甲状腺細胞系から調製された馴化培地と培養する段階を含み、その馴化培地が1つまたは複数の標的細胞の増殖を誘導するような方法。
- UCHT1ラット甲状腺細胞系が寄託番号DSM ACC2535の細胞系の増殖誘導特性を有する、請求項5記載の方法。
- 培養が1つまたは複数の標的細胞を24時間毎に少なくとも1回の速度で分裂させる原因となる、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、幹細胞、芽細胞、クローン化細胞、前駆細胞および分化細胞からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、外胚葉、中胚葉および内胚葉からなる群より選択される源から得られる、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が分泌細胞である、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が栄養因子産生細胞である、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、芽細胞、クローン化細胞、受精卵、胎盤細胞、ケラチノサイト、基底表皮細胞、毛幹細胞、毛根鞘細胞、表面上皮細胞、基底上皮細胞、尿路上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道もしくは消化管の杯細胞、胃の粘液細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生性β細胞、グルカゴン産生性α細胞、ソマトスタチン産生性δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のII型肺胞細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、消化管もしくは気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、生殖腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の密集斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、外分泌腺の横紋管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管細胞、精巣輸出管の無線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、I型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の無紋性管細胞、唾液腺の無紋性管細胞、乳腺の無紋性管細胞、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い区域の細胞、集合管細胞、精嚢の管細胞、前立腺の管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内層をなす扁平細胞、耳の内リンパ腔の内層をなす細胞、脈絡叢細胞、軟クモ膜の扁平細胞、眼の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する線毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、線維芽細胞、毛細血管の周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、前骨芽細胞、眼の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、プラズマ細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、キラーT細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器官の内有毛細胞、コルチ器官の外有毛細胞、耳の前庭器のI型有毛細胞、耳の前庭器のII型細胞、II型味蕾細胞、嗅覚ニューロン、嗅覚上皮の基底細胞、I型頸動脈体細胞、II型頸動脈体細胞、メルケル細胞、触覚に特化した一次感覚ニューロン、温覚に特化した一次感覚ニューロン、痛覚に特化した一次ニューロン、固有受容一次感覚ニューロン、自律神経系のコリン作動性ニューロン、自律神経系のアドレナリン作動性ニューロン、自律神経系のペプチド作動性ニューロン、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内支持細胞、コルチ器官の外支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味蕾の支持細胞、嗅覚上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸グリア細胞、中枢神経系のニューロン、中枢神経系のアストロサイト、中枢神経系のオリゴデンドロサイト、水晶体前嚢上皮細胞、水晶体線維細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞および胸腺上皮細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、骨髄細胞、セルトリ細胞、肝細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵臓細胞、下垂体細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、桿体細胞、錐体細胞、有毛細胞、好中球、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経内分泌クロマフィン細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が遺伝子改変細胞である、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン化細胞および受精卵からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項5記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞がヒト細胞である、請求項5記載の方法。
- 馴化培地との培養後に、馴化培地と1つまたは複数の標的細胞との接触を遮断することにより、1つまたは複数の標的細胞が増殖を停止するように誘導する、請求項5記載の方法。
- 遮断が、1つもしくは複数の標的細胞を馴化培地との接触状態から取り除く段階、または馴化培地を1つもしくは複数の細胞との接触状態から取り除く段階を含む、請求項18記載の方法。
- 馴化培地との培養後に、1つまたは複数の標的細胞を分化させることにより、1つまたは複数の標的細胞が増殖を停止するように誘導する、請求項5記載の方法。
- 分化が、1つまたは複数の標的細胞を分化誘導物質と接触させる段階を含む、請求項20記載の方法。
- 分化誘導物質が、ホルモン補給剤、プトレッシン-トランスフェリン、フォルスコリン、ジブチリルアデノシン-3',5'-サイクリック一リン酸(cAMP)、レチノイン酸、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス調製物からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
- 分化が、1つまたは複数の標的細胞を血清と接触させなくする段階を含む、請求項20記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が生体分子を産生し、培養後に1つまたは複数の標的細胞からその生体分子を収集する段階をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 連続継代細胞系を製造するための方法であって、1つまたは複数の標的細胞を不死化させるのに十分な期間にわたって1つまたは複数の標的細胞をUCHT1ラット甲状腺細胞系から調製された馴化培地と培養する段階を含み、その馴化培地が1つまたは複数の標的細胞が無限に増殖するように1つまたは複数の標的細胞の増殖能を高めるような方法。
- 期間が約1カ月から約8カ月までの範囲にある、請求項25記載の方法。
- UCHT1ラット甲状腺細胞系が、寄託番号DSM ACC2535の細胞系の増殖誘導特性を有する、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、幹細胞、前駆細胞、分化細胞、芽細胞、クローン化細胞および受精卵からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、外胚葉、中胚葉および内胚葉からなる群より選択される源から得られる、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が分泌細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が栄養因子産生細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、芽細胞、クローン化細胞、受精卵、胎盤細胞、ケラチノサイト、基底表皮細胞、毛幹細胞、毛根鞘細胞、表面上皮細胞、基底上皮細胞、尿路上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道もしくは消化管の杯細胞、胃の粘液細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生性β細胞、グルカゴン産生性α細胞、ソマトスタチン産生性δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のII型肺胞細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、胃もしくは気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、生殖腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の密集斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、外分泌腺の横紋管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管細胞、精巣輸出管の無線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、I型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の無紋性管細胞、唾液腺の無紋性管細胞、乳腺の無紋性管細胞、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い区域の細胞、集合管細胞、精嚢の管細胞、前立腺の管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内層をなす扁平細胞、耳の内リンパ腔の内層をなす細胞、脈絡叢細胞、軟クモ膜の扁平細胞、眼の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する線毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、線維芽細胞、毛細血管の周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、前骨芽細胞、眼の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、プラズマ細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、キラーT細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器官の内有毛細胞、コルチ器官の外有毛細胞、耳の前庭器のI型有毛細胞、耳の前庭器のII型細胞、II型味蕾細胞、嗅覚ニューロン、嗅覚上皮の基底細胞、I型頸動脈体細胞、II型頸動脈体細胞、メルケル細胞、触覚に特化した一次感覚ニューロン、温覚に特化した一次感覚ニューロン、痛覚に特化した一次ニューロン、固有受容一次感覚ニューロン、自律神経系のコリン作動性ニューロン、自律神経系のアドレナリン作動性ニューロン、自律神経系のペプチド作動性ニューロン、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内支持細胞、コルチ器官の外支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味蕾の支持細胞、嗅覚上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸グリア細胞、中枢神経系のニューロン、中枢神経系のアストロサイト、中枢神経系のオリゴデンドロサイト、水晶体前嚢上皮細胞、水晶体線維細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞および胸腺上皮細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が、骨髄細胞、セルトリ細胞、肝細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵臓細胞、下垂体細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、桿体細胞、錐体細胞、有毛細胞、好中球、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経内分泌クロマフィン細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が遺伝子改変細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が胚性幹細胞または成体幹細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞がヒト細胞である、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞が生体分子を産生し、培養後に1つまたは複数の標的細胞からその生体分子を収集する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 1つまたは複数の標的細胞と馴化培地との約1カ月から約8カ月までの範囲内のある期間にわたる培養後に、1つまたは複数の標的細胞を分化させることによって1つまたは複数の標的細胞が増殖を停止するように誘導する段階を含む、請求項25記載の方法。
- 分化が、1つまたは複数の標的細胞を分化誘導物質と接触させる段階を含む、請求項39記載の方法。
- 分化誘導物質が、ホルモン補給剤、プトレッシン-トランスフェリン、フォルスコリン、ジブチリルアデノシン-3',5'-サイクリック一リン酸(cAMP)、レチノイン酸、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス調製物からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
- 分化が、1つまたは複数の標的細胞を血清と接触させなくする段階を含む、請求項39記載の方法。
- それを必要とする罹患生物に投与するための1つ以上の細胞であって、1つ以上の細胞は、複数の細胞をUCHT1ラット甲状腺細胞系から調製された馴化培地と接触させることによって確立された培養物から入手され、その馴化培地によって複数の細胞の増殖能が高められている、1つ以上の細胞。
- 1つ以上の細胞が、自己移植片、同種同系移植片、同種異系移植片および異種移植片からなる群より選択される1つまたは複数の移植片として投与される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、投与の前に増殖を停止するように誘導されている、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、馴化培地と1つまたは複数の標的細胞との接触を遮断することにより、増殖を停止するように誘導される、請求項45記載の1つ以上の細胞。
- 遮断が、複数の細胞を馴化培地との接触状態から取り除く段階、または馴化培地を複数の細胞との接触状態から取り除く段階を含む、請求項46記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞を、複数の細胞を不死化させるのに十分な期間にわたって馴化培地と接触させ、その後に、投与の前に複数の細胞を分化させることによって複数の細胞が増殖を停止するように誘導する、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 分化が、複数の細胞を分化誘導物質と接触させる段階を含む、請求項48記載の1つ以上の細胞。
- 分化誘導物質が、ホルモン補給剤、プトレッシン-トランスフェリン、フォルスコリン、ジブチリル アデノシン3',5'サイクリック一リン酸(cAMP)、レチノイン酸、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス調製物からなる群より選択される、請求項49記載の1つ以上の細胞。
- 分化が、複数の細胞を血清と接触させなくする段階を含む、請求項48記載の1つ以上の細胞。
- 分化が、複数の細胞を、細胞外マトリックス調製物を含む支持体と接触させる段階を含む、請求項48記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、芽細胞、クローン化細胞、胎児細胞、胚細胞、新生児細胞、青年期細胞、成体細胞、幹細胞、前駆細胞および分化細胞からなる群より選択される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、外胚葉、中胚葉および内胚葉からなる群より選択される源から得られる、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が分泌細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が栄養因子産生細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、芽細胞、クローン化細胞、受精卵、胎盤細胞、ケラチノサイト、基底表皮細胞、毛幹細胞、毛根鞘細胞、表面上皮細胞、基底上皮細胞、尿路上皮細胞、唾液腺細胞、粘液細胞、漿液細胞、フォンエブナー腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、アポクリン汗腺細胞、モル腺細胞、脂腺細胞、ボーマン腺細胞、ブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトル腺細胞、子宮内膜細胞、気道もしくは消化管の杯細胞、胃の粘液細胞、胃腺の酵素原細胞、胃腺の酸分泌細胞、インスリン産生性β細胞、グルカゴン産生性α細胞、ソマトスタチン産生性δ細胞、膵臓ポリペプチド産生細胞、膵管細胞、小腸のパネート細胞、肺のII型肺胞細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞、下垂体中葉細胞、下垂体後葉細胞、胃もしくは気道のホルモン分泌細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、生殖腺細胞、腎臓の傍糸球体細胞、腎臓の密集斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、腸の刷子縁細胞、外分泌腺の横紋管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓の近位尿細管の刷子縁細胞、腎臓の遠位尿細管細胞、精巣輸出管の無線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、肝細胞、脂肪細胞、I型肺胞細胞、膵管細胞、汗腺の無紋性管細胞、唾液腺の無紋性管細胞、乳腺の無紋性管細胞、腎糸球体の壁細胞、腎糸球体の有足細胞、ヘンレ係蹄の細い区域の細胞、集合管細胞、精嚢の管細胞、前立腺の管細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞、漿膜細胞、耳の外リンパ腔の内層をなす扁平細胞、耳の内リンパ腔の内層をなす細胞、脈絡叢細胞、軟クモ膜の扁平細胞、眼の毛様体上皮細胞、角膜内皮細胞、推進機能を有する線毛細胞、エナメル芽細胞、耳の前庭器の半月面細胞、コルチ器官の歯間細胞、線維芽細胞、毛細血管の周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、象牙芽細胞、象牙細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、前骨芽細胞、眼の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、プラズマ細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、キラーT細胞、キラー細胞、桿体細胞、錐体細胞、コルチ器官の内有毛細胞、コルチ器官の外有毛細胞、耳の前庭器のI型有毛細胞、耳の前庭器のII型細胞、II型味蕾細胞、嗅覚ニューロン、嗅覚上皮の基底細胞、I型頸動脈体細胞、II型頸動脈体細胞、メルケル細胞、触覚に特化した一次感覚ニューロン、温覚に特化した一次感覚ニューロン、痛覚に特化した一次ニューロン、固有受容一次感覚ニューロン、自律神経系のコリン作動性ニューロン、自律神経系のアドレナリン作動性ニューロン、自律神経系のペプチド作動性ニューロン、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器官の内支持細胞、コルチ器官の外支持細胞、境界細胞、ヘンゼン細胞、前庭器の支持細胞、味蕾の支持細胞、嗅覚上皮の支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸グリア細胞、中枢神経系のニューロン、中枢神経系のアストロサイト、中枢神経系のオリゴデンドロサイト、水晶体前嚢上皮細胞、水晶体線維細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、卵原細胞、卵母細胞、精母細胞、精原細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞および胸腺上皮細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、骨髄細胞、セルトリ細胞、肝細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵臓細胞、下垂体細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、桿体細胞、錐体細胞、有毛細胞、好中球、GABA作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび神経内分泌クロマフィン細胞、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が遺伝子改変細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、芽細胞、クローン化細胞および受精卵からなる群より選択される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が哺乳動物細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が、ヒト、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ニワトリおよび魚からなる群より選択される細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞がヒト細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 罹患生物が哺乳動物である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 罹患生物がヒトである、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- UCHT1ラット甲状腺細胞系が、寄託番号DSM ACC2535の細胞系の増殖誘発特性を有する、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が癌遺伝子を含まない、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞がインビボで非腫瘍形成性である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 複数の細胞が第1のタイプの細胞および第2のタイプの細胞を含み、第2のタイプの細胞が、第1のタイプの細胞および第2のタイプの細胞を罹患生物に投与した後に第1のタイプの細胞に免疫保護による恩恵を付与する免疫保護細胞である、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 免疫保護細胞が、セルトリ細胞、卵巣間質細胞、腰椎間板細胞、およびFasリガンドを産生するように遺伝的に改変された細胞からなる群より選択される、請求項69記載の1つ以上の細胞。
- 罹患生物が病的状態に冒されている、請求項70記載の1つ以上の細胞。
- 病的状態が、細胞死、細胞喪失または細胞機能不全に関連する、請求項71記載の1つ以上の細胞。
- 病的状態が、癌、神経変性疾患、糖尿病および外傷からなる群より選択される、請求項71記載の1つ以上の細胞。
- 病的状態が、熱傷、頭部外傷、脊髄損傷、脳卒中、心筋梗塞、関節症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、トゥレット症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アジソン病、下垂体機能不全、肝不全、炎症性関節症、神経障害性疼痛、失明および難聴からなる群より選択される、請求項72記載の1つ以上の細胞。
- 1つ以上の細胞が、血管内、頭蓋内、大脳内、筋肉内、皮内、静脈内、眼内、経口的、経鼻的、局所外用的および観血的外科処置からなる群より選択される経路によって罹患生物に投与される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- 1つ以上の細胞が、薬学的に許容される担体とともに罹患生物に投与される、請求項43記載の1つ以上の細胞。
- ある作用物質の1つまたは複数の細胞に対する効果を判定するための方法であって、1つまたは複数の細胞をUCHT1ラット甲状腺細胞系から調製された馴化培地と培養する段階、1つまたは複数の細胞を被験作用物質に対して曝露させる段階、および1つまたは複数の細胞に対する作用物質の効果を判定する段階を含み、その馴化培地が1つまたは複数の細胞の増殖能を高めるような方法。
- 曝露が、1つまたは複数の細胞を被験作用物質と接触させる段階を含む、請求項77記載の方法。
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