JP4706208B2 - Method for producing hematopoietic stem cells - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトの株化間葉系幹細胞を用いて体外でＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を増幅させる方法に関する。 The present invention relates to a method for amplifying CD34 positive / CD38 negative cells in vitro using human established mesenchymal stem cells.
造血幹細胞は血液系の細胞に分化する能力、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つ幹細胞である。臍帯血中に移植可能な造血幹細胞があることが見出されて以来、臍帯血は造血幹細胞移植における細胞供給源として利用されている。しかし、臍帯血は採取量が限られていることから小児への移植のみに利用可能である。このため、成人に移植できるだけの量を得るために臍帯血中の造血幹細胞を増幅培養する技術が強く望まれている。現在、種々のサイトカインの組み合わせのもと、フィーダー細胞を利用した造血幹細胞の培養が試みられている。使用されるフィーダー細胞としては、マウス由来のストロマ細胞株が造血幹細胞の増幅に最も有効だと報告されている（特許文献１参照）。しかし、マウスの細胞を利用して増幅した造血幹細胞では、移植時に異種動物由来の細胞や成分の混入が心配される。
また、ヒト骨髄から分離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞が、ヒト間葉幹細胞あるいは間葉幹細胞誘導脂肪細胞の共存下に培養されると、ＣＤ１４あるいはＣＤ９０を発現するＣＤ３４＋造血前駆細胞が維持、成長することが報告されている（特許文献２）。しかし、使用されたフィーダー細胞はヒトから分離調製された初代細胞であり、繰り返し安定に使用するのは困難である。また維持された細胞はＣＤ１４あるいはＣＤ９０を発現するＣＤ３４＋陽性細胞であり、これらは分化の指向を示す造血前駆細胞であって、全くの未分化の幹細胞ではない。
また、間葉系細胞にテロメラーゼ遺伝子を導入したヒトの株化間葉系幹細胞（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣｓ）をフィーダー細胞として、ヒト骨髄細胞を培養すると、細胞の表現抗原の表現型がＣＤ３４＋であり、かつＣＤ１１ｂ、グリコフォリンＡ（ＧＰＡ），ＣＤ４１，ＣＤ３またはＣＤ１９を示す細胞が増殖されることが報告されている(非特許文献１)。
しかし、本報告もある程度分化が進んだ細胞が増殖することを確認しているものであり、未分化能を維持したまま造血幹細胞のみを増殖する方法については記載されていない。
Further, when human CD34 + stem cells isolated from human bone marrow are cultured in the presence of human mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cell-derived adipocytes, CD34 + hematopoietic progenitor cells expressing CD14 or CD90 are maintained and grown. (Patent Document 2). However, the feeder cells used are primary cells isolated and prepared from humans, and are difficult to use repeatedly and stably. The maintained cells are CD34 + positive cells that express CD14 or CD90, and these are hematopoietic progenitor cells that indicate the direction of differentiation, and are not completely undifferentiated stem cells.
In addition, when human bone marrow cells are cultured using human established mesenchymal stem cells (hTERT-MSCs) in which a telomerase gene is introduced into mesenchymal cells as feeder cells, the phenotype of the cell's expressed antigen is CD34 + Moreover, it has been reported that cells showing CD11b, glycophorin A (GPA), CD41, CD3 or CD19 are proliferated (Non-patent Document 1).
However, this report also confirms that cells that have undergone differentiation to some extent proliferate, and does not describe a method for proliferating only hematopoietic stem cells while maintaining undifferentiated ability.
本発明は、ヒトの株化間葉系細胞を利用し、未分化造血幹細胞であるＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を生体外で簡便にかつ安定して増幅させる方法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a method for easily and stably amplifying CD34 positive / CD38 negative cells, which are undifferentiated hematopoietic stem cells, in vitro using human established mesenchymal cells.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を積み重ねた結果、臍帯血から分離したＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞をヒトの株化間葉系幹細胞とともに培養すると、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を増幅させることができることを知見し、さらに研究を進め本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を、ヒトの株化間葉系幹細胞滲出物の存在下で培養することにより、前記ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を増殖させ、取得することを特徴とするヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の製造方法、
（２）ヒトの株化間葉系幹細胞滲出物の存在下での培養が、ヒトの株化間葉系幹細胞の共存下に栄養培地中での培養であることを特徴とする前記（１）に記載の製造方法、
（３）ヒトの株化間葉系幹細胞滲出物の存在下での培養が、ヒトの株化間葉系幹細胞を栄養培地中で培養した後に前記株化間葉系幹細胞と分離された栄養培地を用いての培養であることを特徴とする前記（１）に記載の製造方法、
（４）ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞が、臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓または末梢血に由来する細胞であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法、
（５）ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞が臍帯血由来であることを特徴とする前記（４）に記載の製造方法、および
（６）ヒトの株化間葉系幹細胞が、テロメラーゼ遺伝子と、ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子とが導入された株化細胞であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法、
に関する。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have cultured CD34 positive / CD38 negative cells isolated from umbilical cord blood together with human established mesenchymal stem cells to obtain CD34 positive / CD38 negative cells. The inventors have found that they can be amplified, and further researched to complete the present invention.
That is, the present invention
(1) The human CD34-positive / CD38-negative cells are cultured in the presence of human cell line mesenchymal stem cell exudates to proliferate and obtain the human CD34-positive / CD38-negative cells. A method for producing human CD34-positive / CD38-negative cells,
(2) The above-mentioned (1), wherein the culture in the presence of exudates of human established mesenchymal stem cells is a culture in a nutrient medium in the presence of human established mesenchymal stem cells. The production method according to
(3) Nutrient medium in which human cell line mesenchymal stem cells were cultured in the presence of exudate of human cell line, and then cultured from human cell line mesenchymal stem cells in nutrient medium The production method according to (1) above, wherein the method is a culture using
(4) The production according to any one of (1) to (3), wherein the human CD34 positive / CD38 negative cell is derived from cord blood, bone marrow, liver, spleen or peripheral blood. Method,
(5) The production method according to (4) above, wherein human CD34-positive / CD38-negative cells are derived from cord blood, and (6) a human established mesenchymal stem cell comprises a telomerase gene, The production method according to any one of (1) to (5) above, which is a cell line into which E6 and E7 genes of human papillomavirus have been introduced,
About.
本発明によれば、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を培養により増幅することができる。本発明の方法により製造されたＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は、異種間での伝染病の心配や動物由来遺伝子の影響の心配なく、白血病や再生不良性貧血などにおける血液の再生のための移植用細胞として利用できる。
本発明の方法で増殖されたＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は、臍帯血由来細胞であるので、例えば組織適合抗原（ＨＬＡ）が２抗原不一致でも移植が可能である。また移植後も拒絶反応が少なく合併症が少ないなどの臍帯血の特徴を維持しているので、上記移植用細胞として好ましく用いることができる。
さらに、本発明の方法は、生体外で造血幹細胞の増殖が可能であるので、特に採取量が限定される臍帯血であっても、容易に臍帯血中の造血幹細胞を増殖できるため必要に応じて速やかに調製することができる。
また、本発明において、ヒトの株化間葉系幹細胞滲出物の存在下での培養が、フィーダー細胞を用いないヒトの株化間葉系幹細胞と分離した栄養培地を用いての培養である場合には、増殖された造血幹細胞はフィーダー細胞と分離の必要なくそのまま移植用細胞として利用でき、かつフィーダー細胞が移植用細胞に混入するのを確実に回避できる。
According to the present invention, CD34 positive / CD38 negative cells can be amplified by culture. CD34 positive / CD38 negative cells produced by the method of the present invention can be used for transplantation for blood regeneration in leukemia, aplastic anemia, etc. without worrying about infectious diseases between different species or the influence of animal-derived genes. It can be used as a cell.
Since the CD34 positive / CD38 negative cells grown by the method of the present invention are umbilical cord blood-derived cells, for example, transplantation is possible even if the histocompatibility antigen (HLA) does not match two antigens. In addition, since the features of cord blood such as few rejection reactions and few complications after transplantation are maintained, it can be preferably used as the cells for transplantation.
Furthermore, since the method of the present invention can proliferate hematopoietic stem cells in vitro, it is possible to easily proliferate hematopoietic stem cells in umbilical cord blood even if it is umbilical cord blood with a limited amount of collection. And can be prepared quickly.
In the present invention, the culture in the presence of exudates of human established mesenchymal stem cells is a culture using a nutrient medium separated from human established mesenchymal stem cells that do not use feeder cells. In this case, the proliferated hematopoietic stem cells can be used as transplanted cells as they are without separation from feeder cells, and the contamination of the feeder cells with the transplanted cells can be reliably avoided.
本発明において、「ＣＤ３４陽性」とは、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）３４抗原を発現していることを意味する。ＣＤ３４抗原は、分子量１１０ｋＤａの単鎖膜貫通型リン酸化糖タンパクで細胞の表面に表出する膜抗原である。この抗原は造血幹細胞または血液前駆細胞の早期マーカーであり、分化するに従って消失する。ＣＤ３４陽性の有核細胞は造血幹細胞および前駆細胞をより多く含む細胞群である。さらにこれらは白血球特異抗原であるＣＤ４５抗原に対し陰性ではないという特徴を有する。具体的には、ＳＣＩＤ再構築細胞（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ（ＳＲＣ））、長期培養開始細胞（Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ（ＬＴＣ−ＩＣ））、高増殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ−Ｃｅｌｌｓ（ＨＰＰ−ＣＦＣ））、リンパ球系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球前駆細胞）、ＣＦＵ−Ｅ（後期赤芽球前駆細胞）、ＣＦＵ−Ｍｋ（巨核球系幹細胞）、ＣＦＵ−ＥＯ（好酸球系前駆細胞）、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球・単球形成幹細胞）等の造血前駆細胞などが挙げられる。 In the present invention, “CD34 positive” means that CD (cluster of differentiation) 34 antigen is expressed. The CD34 antigen is a membrane antigen that appears on the surface of a cell as a single-chain transmembrane phosphorylated glycoprotein having a molecular weight of 110 kDa. This antigen is an early marker of hematopoietic stem cells or blood progenitor cells and disappears as it differentiates. CD34-positive nucleated cells are a group of cells containing more hematopoietic stem cells and progenitor cells. Furthermore, they have the characteristic that they are not negative for CD45 antigen, which is a leukocyte-specific antigen. Specifically, SCID reconstructed cells (NOD / SCID mouse repopulating cells (SRC)), long-term culture initiating cells (Long-Term Culture-Initiating Cells (LTC-IC)), high-proliferative colony-forming cells (High-Proliferative) Potential Colony-Forming-Cells (HPP-CFC)), lymphoid progenitor cells, myeloid progenitor cells, T progenitor cells, B progenitor cells, BFU-E (erythroid progenitor cells), CFU-E (late erythroid progenitor cells) Cell), CFU-Mk (megakaryocyte stem cell), CFU-EO (eosinophil progenitor cell), hematopoietic progenitor cell such as CFU-GM (granulocyte / monocyte-forming stem cell), and the like.
「ＣＤ３８陰性」とは、ＣＤ３８抗原を発現していないことを意味する。ＣＤ３８抗原は分子量４５ｋＤａの糖蛋白で、支配遺伝子は染色体４ｐ１５に存在する。ＣＤ３８抗原の発現は細胞の分化と活性化に依存し、例えばＴ細胞、Ｂ細胞ともに両者の前駆細胞に発現し、成熟とともに消失するが、活性化すると再び発現する。より具体的には活性化したＴおよびＢ細胞、末梢血中のＮＫ／Ｋ細胞、前胸腺細胞、正常単球の一部、骨髄中のＴｄＴ＋細胞およびＢ細胞、骨髄芽球、前骨髄球の細胞に発現する。 “CD38 negative” means that the CD38 antigen is not expressed. The CD38 antigen is a glycoprotein with a molecular weight of 45 kDa, and the dominant gene is present on chromosome 4p15. The expression of CD38 antigen depends on cell differentiation and activation. For example, both T cells and B cells are expressed in both progenitor cells and disappear with maturation, but they are expressed again when activated. More specifically, activated T and B cells, NK / K cells in peripheral blood, prothymocytes, part of normal monocytes, TdT + cells and B cells in bone marrow, myeloblasts, promyelocytes Expressed in cells.
なお、本願において使用される上述のような「陽性」及び「陰性」なる用語は、場合によっては、各々単に「＋」（ポジティブ）及び「−」（ネガティブ）と表記することもある。 It should be noted that the terms “positive” and “negative” as used above in this application are sometimes simply referred to as “+” (positive) and “−” (negative), respectively.
上記造血幹細胞とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、血小板、好酸球、単球、好中球、好塩基球などの成熟血液細胞を作り出す能力を有し、かつ自己複製能を有する細胞をいう。また上記造血前駆細胞とは造血幹細胞より分化が進み、細胞の分化の方向が決定した細胞であり、自己複製能をもたない細胞をいう。 The above hematopoietic stem cells are cells having the ability to produce mature blood cells such as T cells, B cells, erythrocytes, platelets, eosinophils, monocytes, neutrophils, basophils, and have the ability to self-replicate. Say. The hematopoietic progenitor cell is a cell that has been differentiated from a hematopoietic stem cell and has been determined in the direction of cell differentiation and has no self-replicating ability.
「ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞」とは、ＣＤ３４抗原を発現しているが、ＣＤ３８抗原を発現していない細胞をいう。このような細胞として、具体的にはＴおよびＢ細胞、末梢血中のＮＫ／Ｋ細胞、前胸腺細胞、正常単球の一部、骨髄中のＴｄＴ＋細胞およびＢ細胞、骨髄芽球、前骨髄球などへの分化が未だ進んでいない細胞などが挙げられる。
ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞としては、臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓または末梢血に由来する細胞が好ましいが、（１）採取に際してドナーの負担がない、（２）多数の造血幹細胞が含まれている、（３）組織適合抗原（ＨＬＡ）が２抗原不一致でも移植が可能である、および（４）移植後の拒絶反応や合併症が少ないなどから、臍帯血由来細胞が特に好ましい。
“CD34 positive / CD38 negative cells” refers to cells that express the CD34 antigen but do not express the CD38 antigen. Examples of such cells include T and B cells, NK / K cells in peripheral blood, prothymocytes, part of normal monocytes, TdT + cells and B cells in bone marrow, myeloblasts, progenitors Examples include cells that have not yet differentiated into myelocytes.
As human CD34-positive / CD38-negative cells, cells derived from umbilical cord blood, bone marrow, liver, spleen or peripheral blood are preferable, but (1) there is no burden on the donor at the time of collection, (2) many hematopoietic stem cells are included Umbilical cord blood-derived cells are particularly preferred because (3) transplantation is possible even when the two histocompatibility antigens (HLA) do not match, and (4) there are few rejections and complications after transplantation.
「株化間葉系幹細胞」とは、腫瘍原性が無く、正常株化間葉系幹細胞に近い形態を呈し、株化間葉系幹細胞の有する多分化能を維持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖する特徴を有する株化細胞を意味する。株化細胞とは、体の組織、臓器などに由来する細胞で、生体外で培養することにより無限自律増殖能を獲得することによって、生体外で継代培養することが可能となった細胞をいう。株化間葉系幹細胞とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、間質細胞のすべてまたはいくつかへの分化が可能な幹細胞および前駆細胞を指す。株化間葉系幹細胞の表面抗原をフローサイトメトリーなどにより評価すると、ＣＤ３４およびＣＤ４５は陰性を示す。 “Corporated mesenchymal stem cells” are not tumorigenic, have a morphology similar to that of normal mesenchymal stem cells, maintain the pluripotency of established mesenchymal stem cells, and have special culture conditions. It means a cell line that has the characteristic of proliferating in a short time without need. A cell line is a cell derived from a body tissue, organ, or the like, and is a cell that can be subcultured in vitro by acquiring infinite autonomous growth ability by in vitro culture. Say. Established mesenchymal stem cells are stem cells and progenitor cells that proliferate in an undifferentiated state and can differentiate into all or some of bone cells, chondrocytes, adipocytes, muscle cells, tendon cells, and stromal cells Point to. When the surface antigen of the established mesenchymal stem cell is evaluated by flow cytometry or the like, CD34 and CD45 are negative.
本発明の方法においては、株化間葉系幹細胞は上記ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を製造するためのフィーダー細胞としての働きを有する細胞であればいずれの株化間葉系幹細胞も用いることができるが、骨髄間質細胞由来の細胞が好ましい。前記フィーダー細胞とは、細胞培養を行う際、目的とする細胞単独では生存・増殖できない場合に、目的とする細胞とは別の細胞であって、目的の細胞の培養条件を整えるために、例えば培地中に不足する栄養分や成長因子の補給、過剰成分の代謝・解毒、コラーゲンなどの分泌による接着性の増大、目的細胞に直接接触することによる支持などを果たす補助的役割を果たす細胞をいう。また、株化間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞または軟骨細胞への三方向への分化が可能な細胞が好ましい。このような細胞としては、ヒトから分離された骨髄間質細胞を継体培養し株化した細胞でもよいが、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素およびヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子が導入され株化された細胞、例えばｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｏｌａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｅｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００２年、第２９５巻、ｐ．３５４−３６１）などを好ましく挙げることができる。 In the method of the present invention, any established mesenchymal stem cell can be used as long as the established mesenchymal stem cell is a cell that functions as a feeder cell for producing the CD34 positive / CD38 negative cell. However, cells derived from bone marrow stromal cells are preferred. The feeder cell is a cell different from the target cell when the target cell alone cannot survive and proliferate when cell culture is performed, in order to adjust the culture conditions of the target cell, for example, A cell that plays a supporting role such as supplementing nutrients and growth factors that are deficient in the medium, metabolism / detoxification of excess components, increased adhesion due to secretion of collagen and the like, and support by direct contact with target cells. The established mesenchymal stem cells are preferably cells that can be differentiated in three directions into adipocytes, osteoblasts, or chondrocytes. Such cells may be cells obtained by subcultured bone marrow stromal cells isolated from humans, and for example, human telomerase reverse transcriptase and human papillomavirus E6 and E7 genes were introduced and established. Preferred examples include cells such as hMSC-hTERT-E6 / E7 (Takeshi Olamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communication, 2002, Vol. 295, p. 354-361).
「株化間葉系幹細胞滲出物」とは、株化間葉系幹細胞の培養開始前の栄養培地と培養後（例えば、１〜７日間、好ましくは１〜４日間培養後）の培地成分を比較して、培養開始時に含まれていない全ての成分をいう。株化間葉系幹細胞滲出物には、例えば株化間葉系幹細胞の細胞膜に保持されている物質、株化間葉系幹細胞から分泌、放出または溶出される種々の細胞分泌物、細胞放出物または細胞溶出物（以下、細胞分泌物等という）が包含される。細胞分泌物等としては、例えば、株化間葉系幹細胞から分泌、放出または溶出される種々の細胞分泌物、細胞放出物または細胞溶出物（以下、細胞分泌物等という。）が包含される。細胞分泌物等としては、例えばインターロイキン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞増殖因子、Ｆｌｋ２またはＦｌｔ３−リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの細胞増殖因子および未知のペプチドやタンパクなどが含まれる。 “Established mesenchymal stem cell exudate” refers to a nutrient medium before culturing of established mesenchymal stem cells and a medium component after culturing (eg, after culturing for 1 to 7 days, preferably 1 to 4 days). By comparison, it refers to all components not included at the start of culture. Examples of exudates of established mesenchymal stem cells include, for example, substances retained in the cell membrane of established mesenchymal stem cells, various cell secretions that are secreted from, released from, or eluted from established mesenchymal stem cells Alternatively, cell eluate (hereinafter referred to as cell secretion etc.) is included. Examples of cell secretions include various cell secretions, cell discharges or cell eluates (hereinafter referred to as cell secretions) secreted, released or eluted from established mesenchymal stem cells. . Examples of cell secretions include interleukin, interferon, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), monocyte colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating. Factor, eosinophil colony stimulating factor, platelet colony stimulating factor, stem cell factor (SCF), stem cell growth factor, Flk2 or Flt3-ligand, leukemia inhibitory (blocking) factor, erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), macrophage-derived inflammation Growth factors such as sex protein 1α (MIP-1α), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), nerve cell growth factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF) and unknown peptides And protein.
また、「株化間葉系幹細胞滲出物の存在下で培養する」とは、（ａ）株化間葉系幹細胞の共存下でヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を培養すること、または（ｂ）株化間葉系幹細胞の培養後（例えば、１〜７日間、好ましくは１〜４日間培養後）の培養液を株化間葉系幹細胞と分離し、分離された培養液をそのまま、もしくは濃縮または希釈した液を用いてＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を培養すること、あるいは（ｃ）株化間葉系幹細胞培養後の培養液から栄養培地成分を除去などし、株化間葉系幹細胞滲出物を分離、精製したものを栄養培地に添加して培養すること、あるいは（ｄ）株化間葉系幹細胞とヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を、細胞を通過させず、かつ細胞滲出物等を通過させる分離膜で隔離しながら培養することをいう。中でも株化間葉系幹細胞滲出物を分離することなく培養ができる前記（ａ）または（ｂ）が好ましく、培養後に株化間葉系幹細胞とＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を分離する必要がない（ｂ）がより好ましい。前記（ｃ）の分離精製は、通常糖、タンパク、ペプチドなど生体試料などの分離精製に用いられる公知の手段、例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフぃー、アフィニティクロマトグラフィーなどを単独または適宜組合わせればよい。前記（ｄ）の分離膜は、通常細胞を分離あるいは除去するのに使用される公知の膜、例えば、ヌクレオポア膜、精密濾過膜などを単独または適宜組み合わせればよい。 “Culturing in the presence of exudate of established mesenchymal stem cells” means (a) culturing human CD34 positive / CD38 negative cells in the presence of established mesenchymal stem cells, or (b ) The culture solution after culturing the established mesenchymal stem cells (for example, after culturing for 1 to 7 days, preferably 1 to 4 days) is separated from the established mesenchymal stem cells, and the separated culture solution is used as it is or Culturing CD34 positive / CD38 negative cells using the concentrated or diluted solution, or (c) removing nutrient medium components from the culture solution after culturing the established mesenchymal stem cell, and exuding the established mesenchymal stem cell The isolated and purified product is added to the nutrient medium and cultured, or (d) the mesenchymal stem cell line and the human CD34 positive / CD38 negative cell do not pass through the cell and the cell exudate, etc. Incubate while separating with a separation membrane that passes through Say that. Among them, the above (a) or (b) is preferable, which allows culturing without separating the mesenchymal stem cell exudate, and it is not necessary to separate the established mesenchymal stem cell from the CD34 positive / CD38 negative cell after culturing ( b) is more preferred. For the separation and purification of (c), known means usually used for separation and purification of biological samples such as sugars, proteins, peptides, etc., for example, gel filtration column chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Or they may be combined appropriately. The separation membrane of (d) may be a known membrane that is usually used for separating or removing cells, for example, a nucleopore membrane, a microfiltration membrane, etc. alone or in combination.
上記共存とは、所望の細胞と第２の細胞、具体的にはＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞と株化間葉系細胞が一つの培地（培養液）中で任意の状態で存在している状態をいい、例えばＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞と株化間葉系細胞が接触状態、非接触状態又は間接的接触状態で存在している状態が挙げられる。 The coexistence is a state in which desired cells and second cells, specifically, CD34 positive / CD38 negative cells and established mesenchymal cells are present in an arbitrary state in one medium (culture solution). For example, a state in which CD34 positive / CD38 negative cells and established mesenchymal cells are present in a contact state, a non-contact state or an indirect contact state can be mentioned.
本発明の方法に用いられる栄養培地としては、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、前述に定義されるＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を、増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、動物細胞、特に造血幹細胞の培養に用いられる栄養培地であればいずれも好ましく用いることができる。このような栄養培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社）またはＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社）などが挙げられる。 Examples of the nutrient medium used in the method of the present invention include a natural medium, a semi-synthetic medium, a synthetic medium, a solid medium, a semi-solid medium, a liquid medium, and the like. Any nutrient medium that is used for growth, differentiation, maturation, or preservation and is used for culturing animal cells, particularly hematopoietic stem cells, can be preferably used. Examples of such nutrient media include Dulbecco's Modified Eagles' Medium (DMEM), Ham's F12 Medium (Ham's Nutrient Mixture F12), McCoy's 5A Medium, McCoy's 5A medium. MEM medium (Minimum Essential Medium; EMEM), RPMI 1640 medium, Iskov modified Dulbecco medium (Isocove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), StemPro34 (Invitrogen), X-VIVO 10 (X-VIVO 10) (Cambrex), HPGM (Cambrex), StemSpan H3000 Beam cell Technologies), StemlineII (Sigma-Aldrich) or QBSF-60 (Quality Biological, Inc.) and the like.
これら培地は、基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸または糖などを含有する。また、目的に応じてその他の化学成分もしくは血清（例、牛胎児血清など）のような生体成分を含有させることもできる。サイトカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、単球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、ＳＣＦ、幹細胞増殖因子、Ｆｌｋ２またはＦｌｔ３−リガンド、白血病阻害（阻止）因子、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＭＩＰ−１α、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの細胞増殖因子などが挙げられ、好ましくはＳＣＦ、Ｆｌｋ２またはＦｌｔ３−リガンドまたはＴＰＯなどが挙げられる。 These culture media contain sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acids, vitamins, cytokines, hormones, antibiotics, fatty acids or sugars as basic components. In addition, other chemical components or biological components such as serum (eg, fetal calf serum) can be included depending on the purpose. Examples of cytokines include interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), and interleukin-5 ( IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-7 (IL-7), interleukin-8 (IL-8), interleukin-9 (IL-9), interleukin-10 ( IL-10), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-14 (IL-14), interleukin-15 ( IL-15), interleukin-16 (IL-16), interferon α (IFN-α), interferon β (IFN-β), Interferon γ (IFN-γ), G-CSF, GM-CSF, monocyte colony stimulating factor, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, eosinophil colony stimulating factor, platelet colony stimulating factor, SCF, stem cell growth factor, Flk2 Or Flt3-ligand, leukemia inhibitory (blocking) factor, EPO, TPO, MIP-1α, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), nerve cell growth factor (NGF) hepatocyte growth factor (HGF) ) And the like, preferably SCF, Flk2 or Flt3-ligand or TPO.
本発明のＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の好ましい製造方法を以下に例示する。
まず、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の調製は、例えば臍帯血、骨髄、末梢血などを採取し、ＣＤ３４陽性の細胞（以下、ＣＤ３４陽性細胞という。）を分離することにより行われる。ＣＤ３４陽性細胞は、比重遠心法および磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）システムまたはフローサイトメトリーを組み合わせることにより分離することができる。例えばＣＰＤ液（クエン酸−リン酸−デキストラン）添加血液を、比重遠心法などにより分画し、単核球を多く含む画分（以下、有核細胞画分という。）を分離回収する。比重遠心法としては、例えばデキストランやＦｉｃｏｌｌ液を用いた比重遠心法、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ密度勾配法、Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配比重遠心法、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた密度勾配比重遠心法などが挙げられる。ついで、抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体を固定した磁気ビーズ（ミルテニー・バイオテク社；以下、ＣＤ３４抗体磁気ビーズという。）と上記分離回収した有核細胞画分を混合し、次いで約２〜８℃でインキュベーション（約３０分）し、有核細胞画分中のＣＤ３４陽性細胞をこの抗体磁気ビーズに結合させる。結合した抗体磁気ビーズ／ＣＤ３４陽性細胞を専用磁気細胞分離装置、例えばオートＭＡＣＳシステム（ミルテニー・バイオテク社）などを用い分離回収する。このようにして得られたＣＤ３４陽性細胞リッチ画分のうちＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の割合は個体差もあるが、約１〜１０％程度である。このＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞はフローサイトメトリーで分離後取り出し培養増殖してもよく、また他のＣＤ３４陽性細胞と分離することなく、他のＣＤ３４陽性細胞とともに培養増殖してもよい。なお、得られたＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞は、白血球細胞の共通表面抗原であるＣＤ４５陽性または弱陽性を示し、ＣＤ４５陰性ではない。
A preferred method for producing the CD34 positive / CD38 negative cell of the present invention is exemplified below.
First, CD34 positive / CD38 negative cells are prepared by, for example, collecting umbilical cord blood, bone marrow, peripheral blood and the like, and separating CD34 positive cells (hereinafter referred to as CD34 positive cells). CD34 positive cells can be separated by a combination of specific gravity centrifugation and a magnetic cell sorting (MACS) system or flow cytometry. For example, CPD solution (citrate-phosphate-dextran) -added blood is fractionated by specific gravity centrifugation or the like, and a fraction containing a large amount of mononuclear cells (hereinafter referred to as nucleated cell fraction) is separated and recovered. Specific gravity centrifugation methods include, for example, specific gravity centrifugation using dextran and Ficoll solution, Ficoll-paque density gradient method, Percoll discontinuous density gradient specific gravity centrifugation method, and density gradient specific gravity centrifugation using Lymphoprep. Subsequently, magnetic beads (Miltenyi Biotech; hereinafter referred to as CD34 antibody magnetic beads) immobilized with anti-human CD34 monoclonal antibody were mixed with the separated and collected nucleated cell fraction, and then incubated at about 2 to 8 ° C. ( About 30 minutes) and bind CD34 positive cells in the nucleated cell fraction to the antibody magnetic beads. The bound antibody magnetic beads / CD34 positive cells are separated and recovered using a dedicated magnetic cell separation device such as an auto MACS system (Miltenyi Biotech). The ratio of CD34 positive / CD38 negative cells in the CD34 positive cell rich fraction thus obtained is about 1 to 10%, although there are individual differences. The CD34 positive / CD38 negative cells may be taken out after separation by flow cytometry and cultured and grown, or may be cultured and grown together with other CD34 positive cells without being separated from other CD34 positive cells. The obtained CD34-positive cell-rich fraction cells show CD45 positive or weak positive, which is a common surface antigen of white blood cells, and are not CD45 negative.
別途、ヒトの株化間葉系幹細胞を培養する。具体的には、例えばヒトの骨髄間質細胞に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素およびヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子を導入され株化されたｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７（Ｔａｋｅｓｈｉ ＯｋａｍｏｔｏらＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｅｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００２年、第２９５巻、ｐ．３５４−３６１）を、約２×１０３〜５×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは約１〜３×１０４細胞／ｃｍ２となるよう、培養プレート、例えば１２ウェルマルチプレートなどに播種する。約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、９５％の湿度において、通常約１〜７日、好ましくは約２〜３日間培養し、細胞が培養プレート内で均一にセミコンフルエント状態になるまで増殖させる。セミコンフルエント状態に増殖したことを確認したのち、細胞が過度に成育しないようにＸ線照射またはガンマ線照射（例．１３７Ｃｓ、６０Ｃｏなど）、あるいは抗生物質（例．マイトマイシンＣなど）等によって処理する。Ｘ線照射またはガンマ線照射の場合、細胞への照射量は、例えば約１５Ｇｙ程度が好ましい。このように培養、処理されたｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７細胞層がフィーダー細胞層として用いられる。 Separately, human established mesenchymal stem cells are cultured. Specifically, for example, human telomerase reverse transcriptase and human papillomavirus E6 and E7 genes have been introduced into human bone marrow stromal cells, and hMSC-hTERT-E6 / E7 (Takeshi Okamoto et al. Biochemical and Biophysical Research Communications) , 2002, Vol. 295, p. 354-361) is cultured at about 2 × 10 3 to 5 × 10 4 cells / cm 2 , preferably about 1 to 3 × 10 4 cells / cm 2. For example, seed in a 12-well multiplate. Cultivation at about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , 95% humidity, usually for about 1 to 7 days, preferably about 2 to 3 days, and grown until the cells are uniformly semi-confluent in the culture plate . After confirming that cells have grown to a semi-confluent state, treatment with X-ray irradiation or gamma irradiation (eg, 137 Cs, 60 Co, etc.) or antibiotics (eg, mitomycin C, etc.) to prevent cells from growing excessively To do. In the case of X-ray irradiation or gamma irradiation, the amount of irradiation to the cells is preferably about 15 Gy, for example. The hMSC-hTERT-E6 / E7 cell layer thus cultured and treated is used as a feeder cell layer.
続いて上記フィーダー細胞層の培養ウェルのｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７を剥がさないように注意しながら緩衝液〔例、ハンクス平衡塩溶液、リン酸緩衝生理食塩溶液など〕で通常約１〜５回、好ましくは約２〜３回洗浄し、上記ＭＡＣＳシステムにより分離したＣＤ３４陽性細胞リッチ画分（ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の割合：約１〜１０％程度）の細胞をフィーダー細胞層上に１ウェルあたり、細胞数が約１×１０３〜１×１０４細胞となるように播種し培養する。培養液としては、上記栄養培地、例えばＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（インビトロジェン社）などを使用し、サイトカイン〔例、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）など〕等を添加することが好ましい。培養は、約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で、通常約５〜１４日間、好ましくは約６〜８日間行われるのがよい。 Subsequently, with care not to peel off hMSC-hTERT-E6 / E7 in the culture well of the feeder cell layer, usually about 1 to 5 times with a buffer solution (eg, Hanks balanced salt solution, phosphate buffered saline solution, etc.). Preferably, the cells of the CD34 positive cell rich fraction (ratio of CD34 positive / CD38 negative cells: about 1 to 10%) separated by the MACS system and washed by about 2 to 3 times are placed on the feeder cell layer for 1 well. The cells are seeded and cultured so that the number of cells is about 1 × 10 3 to 1 × 10 4 cells. As the culture medium, it is preferable to use the above nutrient medium, for example, StemPro34 medium (Invitrogen), etc. and add cytokines (eg, stem cell factor (SCF), Flt-3, thrombopoietin (TPO), etc.) and the like. The culture is performed under conditions of about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%, usually for about 5 to 14 days, preferably about 6 to 8 days.
ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７と共存下に培養されたＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞は、通常約０．０１〜０．５Ｗ／Ｖ％トリプシン溶液で処理、あるいは緩衝液（例．ＰＢＳ、ＨＢＳＳ〔Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩）〕など）でピペッティングするなどにより細胞をウェルから剥離・回収できる。回収した細胞を例えばＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｇｅｎ社；以下、同様である。）、例えばＰＥ標識抗ヒトＣＤ３８（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｇｅｎ社；以下、同様である。）、例えばＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｇｅｎ社；以下、同様である。）を用いて共染色、例えば酵素抗体法などにより免疫染色を行い、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）でＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を分離、分取することができる。 Cells of the CD34-positive cell rich fraction cultured in the presence of hMSC-hTERT-E6 / E7 are usually treated with about 0.01 to 0.5 W / V% trypsin solution or buffered (eg, PBS, HBSS). The cells can be detached and collected from the wells by pipetting with [Hanks' Balanced Salt Solution] or the like. The recovered cells are treated with, for example, FITC-labeled anti-CD34 (BD PharMigen; hereinafter the same), such as PE-labeled anti-human CD38 (BD PharMigen; hereinafter the same), such as APC-labeled anti-human CD45 (BD PharMigen). The same shall apply hereinafter), and immunostaining is performed by, for example, an enzyme antibody method, and CD34 positive / CD38 negative cells are separated and sorted by flow cytometry (FACSCalibur, Becton Dickinson). Can do.
また、別の態様としては、上記した株化間葉系幹細胞、例えばｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに分散し、約２×１０３〜５×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは約１〜３×１０４細胞／ｃｍ２となるよう、培養プレート、例えば１２ウェルマルチプレートなどに播種する。約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、９５％の湿度において、通常約１〜７日、好ましくは約２〜３日間培養し、細胞が培養プレート内で均一にセミコンフルエント状態になるまで増殖させる。セミコンフルエントにまで増殖した細胞はそのまま、あるいはＸ線またはガンマ線照射（約１５Ｇｙ程度）された後、ＨＢＳＳ（＋）で３回おだやかに洗浄される。洗浄された細胞は、サイトカイン（例．Ｆｌｔ−３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯなど）を含む無血清培地（例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ３４；インビトロジェン社）でさらに培養される。培養条件は、約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で、約１〜１０日間、好ましくは約２〜７日間、さらに好ましくは約２〜５日間程度が好ましい。培養後、培養上清を回収する。回収した培養上清をポアサイズ０．２２μｍのフィルタ（例えば、マイレクスＧＳ，ミリポア社）で濾過し、これをヒトの株化間葉系幹細胞滲出物含有培地（以下、コンディショニング培地ともいう。）とする。細胞はさらに、上記サイトカインを含む無血清培地中で継代的に培養し、該培養上清はコンディショニング培地として用いることができる。 Moreover, as another aspect, the above-mentioned established mesenchymal stem cells, for example, hMSC-hTERT-E6 / E7 are dispersed in DMEM containing 10% FBS, and about 2 × 10 3 to 5 × 10 4 cells / cm. 2 , preferably about 1 to 3 × 10 4 cells / cm 2 in a culture plate such as a 12-well multiplate. Cultivation at about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , 95% humidity, usually for about 1 to 7 days, preferably about 2 to 3 days, and grown until the cells are uniformly semi-confluent in the culture plate . Cells that have grown to semi-confluence are either washed as they are or after X-ray or gamma-ray irradiation (about 15 Gy) and then gently washed with HBSS (+) three times. The washed cells are further cultured in a serum-free medium (eg, StemPro34; Invitrogen) containing cytokines (eg, Flt-3 ligand, SCF, TPO, etc.). The culture conditions are preferably about 1 to 10 days, preferably about 2 to 7 days, more preferably about 2 to 5 days under the conditions of about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%. After culture, the culture supernatant is collected. The collected culture supernatant is filtered through a filter having a pore size of 0.22 μm (for example, Milex GS, Millipore), and this is used as a medium containing exudate of human established mesenchymal stem cells (hereinafter also referred to as a conditioning medium). . The cells are further subcultured in a serum-free medium containing the above cytokines, and the culture supernatant can be used as a conditioning medium.
次いで、臍帯血から比重遠心法およびＭＡＣＳシステムを組み合わせることにより分離回収した上記ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分（ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の割合：約１〜１０％程度）の細胞をコンディショニング培地またはコンディショニング培地と新鮮培地を適当な比率（通常コンディショニング培地が約１０〜１００％、好ましくは約３０〜１００％）で混合した培地に約１〜１０×１０３ｃｅｌｌ／ｍＬ、好ましくは約１〜５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度に播種し、培養するのがよい。培養は、約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で、通常約５〜１４日間、好ましくは約６〜８日間行われるのがよい。培養後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによる細胞の表面抗原試験によりＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を分離することができる。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３４、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３８、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ４５の抗体混合溶液で共染色、例えば酵素抗体法などにより免疫染色を行い、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）でＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を分離、分取することができる。 Next, cells of the above-mentioned CD34 positive cell rich fraction (ratio of CD34 positive / CD38 negative cells: about 1 to 10%) separated and recovered from cord blood by combining specific gravity centrifugation and MACS system are conditioned medium or conditioned medium. And a fresh medium in an appropriate ratio (usually about 10 to 100%, preferably about 30 to 100% of a conditioned medium) is mixed with about 1 to 10 × 10 3 cells / mL, preferably about 1 to 5 × 10 It is better to inoculate and culture at about 3 cells / mL. The culture is performed under conditions of about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%, usually for about 5 to 14 days, preferably about 6 to 8 days. After culturing, the cells can be collected, and CD34 positive / CD38 negative cells can be separated by cell surface antigen test by flow cytometry. Co-staining with an antibody mixed solution of FITC-labeled anti-human CD34, PE-labeled anti-human CD38, and APC-labeled anti-human CD45, for example, immunostaining by the enzyme antibody method or the like, CD34 positive / flow cytometry (Bacton Dickinson FACSCalibur) CD38 negative cells can be separated and sorted.
本発明の方法によれば、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞数は培養初期時の約１００〜５００倍程度に増幅される。 According to the method of the present invention, the number of CD34 positive / CD38 negative cells is amplified to about 100 to 500 times that in the initial stage of culture.
分離、分取されたＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は、さらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保護剤を添加し、凍結保存することができる。かかるＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は、移植用の造血幹細胞として必要に応じて、さらに必要細胞数に増幅できる。 The separated and sorted CD34 positive / CD38 negative cells can be further cryopreserved by adding a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide (DMSO). Such CD34 positive / CD38 negative cells can be further amplified as necessary as hematopoietic stem cells for transplantation.
本発明を、以下に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、実施例において使用される略号は以下に示す。
ＭＡＣＳ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ
ＦＢＳ：牛胎児血清
ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）
Ｇｙ：グレイ
ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス平衡塩）
ＳＣＦ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（幹細胞因子）
Ｆｌｔ−３：ｆｍｓ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−３
ＴＰＯ：トロンボポエチン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩溶液
ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（フルオレセイン−イソチオシアネート）
ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（フィコエリスリン）
ＡＰＣ：ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（アロフィコシアニン）
ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（牛血清アルブミン）
ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（エチレンジアミン四酢酸）
The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In addition, the symbol used in an Example is shown below.
MACS: Magnetic cell Sorting
FBS: fetal bovine serum DMEM: Dulbecco's modification of MEM (Dulbecco's modified Eagle medium)
Gy: Gray HBSS: Hanks' Balanced Salt Solution
SCF: Stem Cell Factor (Stem Cell Factor)
Flt-3: fms-like tyrosine kinase-3
TPO: thrombopoietin PBS: phosphate buffered saline solution FITC: fluorescein-isothiocyanate (fluorescein-isothiocyanate)
PE: phycoerythrin (phycoerythrin)
APC: allophycocyanin
BSA: bovine serum albumin (bovine serum albumin)
EDTA: ethylenediaminetic acetic acid (ethylenediaminetetraacetic acid)
（ヒトの株化間葉系幹細胞層の調製）
細胞系の樹立者である戸口田から分譲されたｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２年、第２９５巻（２号）、ｐ．３５４−３６１）２株を使用した。これらの細胞株は、ヒトの骨髄間質細胞にヒトテロメラーゼ逆転写酵素およびヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子導入により株化されており、脂肪、骨の２方向への分化能（ＭＳＣ−ＡＯ）と、脂肪、骨の２方向への分化能を有する株（ＭＳＣ−ＡＯ）と、脂肪、骨および軟骨の３方向への分化能を有する株（ＭＳＣ−ＡＯＣ）であることが確認されている。
１２ウェルマルチプレート上に、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７を２×１０４細胞／ウェル播種した。培養液は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いた。３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％条件下で３日間培養し、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７が均一にウェルに増殖したことを確認した。セミコンフルエント状態に増殖したことを確認したのち、細胞にＸ線を照射（１５Ｇｙ）し、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７が過度に成育しないように処置した。
(Preparation of human established mesenchymal stem cell layer)
Using two strains of hMSC-hTERT-E6 / E7 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, Vol. 295 (2), p. 354-361) distributed from Toguchida, a cell line founder did. These cell lines have been established by introducing human telomerase reverse transcriptase and human papillomavirus E6 and E7 genes into human bone marrow stromal cells, and are capable of differentiating fat and bone in two directions (MSC-AO). It has been confirmed that the strain has the ability to differentiate in two directions of fat and bone (MSC-AO) and the strain has the ability to differentiate in three directions of fat, bone and cartilage (MSC-AOC).
HMSC-hTERT-E6 / E7 was seeded at 2 × 10 4 cells / well on a 12-well multiplate. As the culture solution, 10% FBS-added DMEM was used. The cells were cultured for 3 days under conditions of 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%, and it was confirmed that hMSC-hTERT-E6 / E7 was uniformly grown in the wells. After confirming that the cells had grown in a semi-confluent state, the cells were irradiated with X-rays (15 Gy) and treated so that hMSC-hTERT-E6 / E7 did not grow excessively.
（ＣＤ３４陽性細胞の調製）
妊産婦へのインフォームドコンセントによる同意と協力を得て臍帯血を約８０ｍＬ採取した。ＣＰＤを臍帯血８０ｍＬに対し２８ｍＬ添加、混和し、その全量をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ５０ｍＬに重層した。１６００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。密度勾配法により分離された単核球を多く含有する画分を分離回収した。得られた単核球を多く含有する画分（以下、有核細胞画分という。）をＭＡＣＳ磁気分離キット（ミルテニー・バイオテク社製）を用い、ＣＤ３４陽性細胞を分離するために、次の作業をおこなった。まずＣＤ３４抗体磁気ビーズを有核細胞画分とＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＣＤ３４抗体磁気ビーズ／有核細胞懸濁液を磁石カラムに流し、ＣＤ３４陽性細胞を吸着させ、ＣＤ３４陰性細胞を洗い流した。ひきつづき、磁石をはずし溶出することで、ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分を回収した。
得られた画分の細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４とＰＥ標識抗ＣＤ３８で染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で測定した。その結果、分離したＣＤ３４陽性細胞リッチ画分のＣＤ３４陽性率は９５％以上であり、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の割合は約５％であった。
(Preparation of CD34 positive cells)
About 80 mL of umbilical cord blood was collected with the consent and cooperation of informed consent to pregnant women. 28 mL of CPD was added to and mixed with 80 mL of cord blood, and the entire amount was layered on 50 mL of Lymphoprep. Centrifugation was performed at 1600 rpm for 30 minutes. A fraction containing a large amount of mononuclear cells separated by the density gradient method was separated and recovered. In order to separate CD34 positive cells from the fraction containing a large amount of mononuclear cells (hereinafter referred to as nucleated cell fraction) using a MACS magnetic separation kit (Miltenyi Biotech), the following work was performed. I did it. First, CD34 antibody magnetic beads were suspended in the nucleated cell fraction and PBS and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The CD34 antibody magnetic beads / nucleated cell suspension was then passed through a magnet column to adsorb CD34 positive cells and wash out CD34 negative cells. Subsequently, the magnet was removed and the elution was performed to recover the CD34-positive cell rich fraction.
Cells of the obtained fraction were stained with FITC-labeled anti-CD34 and PE-labeled anti-CD38 and measured by flow cytometry (BD; FACSCalibur). As a result, the CD34 positive rate of the separated CD34 positive cell rich fraction was 95% or more, and the ratio of CD34 positive / CD38 negative cells was about 5%.
（共培養）
上記で調製したｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７細胞層を剥がさないように注意しながらｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７培養ウェルをＨＢＳＳ（＋）で３回洗浄し、ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞をｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７上に１ウェルあたり５×１０３細胞／ウェル（ＣＤ陽性／ＣＤ陰性細胞：１．１×１０２細胞／ウェル）となるように播種した。培養液はＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、ＴＰＯを含む無血清ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を用いた。３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％条件下で７日間培養した。
培養後、０．０５Ｗ／Ｖ％トリプシン溶液を添加処理することにより培養ウェル中の細胞を剥離・回収した。回収した細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４、ＰＥ標識抗ＣＤ３８、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５で染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ；ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で培養後の細胞の解析をおこなった。
(Co-culture)
Wash the hMSC-hTERT-E6 / E7 culture well three times with HBSS (+), taking care not to peel off the hMSC-hTERT-E6 / E7 cell layer prepared above, The cells were seeded on hMSC-hTERT-E6 / E7 at 5 × 10 3 cells / well (CD positive / CD negative cells: 1.1 × 10 2 cells / well). As the culture solution, a serum-free StemPro34 medium containing SCF, Flt-3, and TPO was used. The cells were cultured for 7 days at 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%.
After culturing, the cells in the culture wells were detached and collected by adding 0.05 W / V% trypsin solution. The collected cells were stained with FITC-labeled anti-CD34, PE-labeled anti-CD38, and APC-labeled anti-CD45, and the cells after culture were analyzed by flow cytometry (BD; FACSCalibur).
（フローサイトメトリーによる免疫学的表面抗原の測定方法）
上記で回収した細胞の懸濁液にＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３４、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３８およびＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ４５の抗体混合溶液を添加し、暗所冷蔵（２〜８℃）にて３０分間インキュベートした。細胞を０．１％ＢＳＡ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いて洗浄し、０．５ｍＬの０．１％ＢＳＡ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメータを用いて測定した。
(Measurement method of immunological surface antigen by flow cytometry)
To the cell suspension collected above, an antibody mixed solution of FITC-labeled anti-human CD34, PE-labeled anti-human CD38 and APC-labeled anti-human CD45 was added, and incubated for 30 minutes in the dark (2-8 ° C.). . The cells were washed with 0.1% BSA-1 mM EDTA-PBS and resuspended in 0.5 mL 0.1% BSA-1 mM EDTA-PBS. Measurement was performed using a flow cytometer.
（結果）
ＣＤ４５は白血球共通特異抗原であり、株化間葉系幹細胞には発現せず、培養により増幅された造血前駆細胞および造血幹細胞を含む血液系の有核細胞に発現している。培養後に回収した細胞のうちＣＤ４５陽性細胞数は３．９×１０５細胞／ウェルであった。
またＣＤ３４陽性細胞は造血幹細胞および造血前駆細胞を含む細胞集団である。培養後に回収した細胞のうち、ＣＤ４５陽性細胞に占めるＣＤ３４陽性細胞は１１．８％であった。これは、７日間の培養期間中に、ＣＤ３４陽性細胞が増殖と共に分化し、分化するに従ってＣＤ３４抗原が消失したためである。ＣＤ３４陽性細胞は、絶対数にすると４．５３±１．８６×１０４細胞／ウェルであった。ＣＤ３４陽性細胞の播種数は５×１０３細胞／ウェルであったから、約９倍に増幅された（図２）。
さらに、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は未分化な造血幹細胞を含む細胞集団である。培養後に回収した細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞に占めるＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は約６２％であり、細胞数にすると２．８±１．０×１０４細胞／ウェルであった。播種時のＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞数と比較すると約２５５倍に増幅された（図３）。
(result)
CD45 is a leukocyte common specific antigen and is not expressed in established mesenchymal stem cells, but is expressed in nucleated cells of the blood system including hematopoietic progenitor cells and hematopoietic stem cells amplified by culture. Among the cells collected after the culture, the number of CD45 positive cells was 3.9 × 10 5 cells / well.
CD34 positive cells are a cell population containing hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells. Of the cells collected after culture, CD34 positive cells accounted for 11.8% of CD45 positive cells. This is because CD34 positive cells differentiated with proliferation during the 7 day culture period, and CD34 antigen disappeared as they differentiated. The absolute number of CD34 positive cells was 4.53 ± 1.86 × 10 4 cells / well. Since the seeding number of CD34 positive cells was 5 × 10 3 cells / well, it was amplified about 9 times (FIG. 2).
Furthermore, CD34 positive / CD38 negative cells are a cell population containing undifferentiated hematopoietic stem cells. Of the cells collected after culture, CD34 positive / CD38 negative cells accounted for about 62% of CD34 positive cells, and the number of cells was 2.8 ± 1.0 × 10 4 cells / well. As compared with the number of CD34 positive / CD38 negative cells at the time of seeding, the number of amplified cells was about 255 times (FIG. 3).
この結果は、従来の技術であるマウスストロマ細胞を用いた場合の結果と同等またはそれ以上の効果を示し、本発明の有効性を示す結果である。 This result shows the effectiveness of the present invention, showing an effect equivalent to or better than the result obtained when mouse stromal cells, which are conventional techniques, are used.
増幅された造血幹細胞の分化の程度を調べるため、実施例１と同様に、臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞をｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７の共存下で７日間培養したのち回収し、各種の分化マーカーの発現をフローサイトメトリーにより測定した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５、ＦＩＴＣまたはＰＥ標識された分化マーカーで染色し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４５陽性細胞に占める分化マーカー陽性細胞の割合、またＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性細胞に占める分化マーカー陽性細胞を評価した。分化マーカーとしては、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２（Ｔ細胞、ＮＫ細胞の表面マーカー）、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｂ（単球、マクロファージ、顆粒球、ＮＫ細胞などの表面マーカー）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１５（顆粒球の細胞表面マーカー）、ＰＥ標識抗ＣＤ１９（Ｂ細胞の表面マーカー）、ＰＥ標識抗ＣＤ４１（巨核球、血小板の表面マーカー）、ＰＥ標識抗ＣＤ６１（巨核球、血小板の表面マーカー）、ＰＥ標識抗ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ（赤芽球および赤血球のマーカー）を使用した。なお、これら分化マーカーは、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｇｅｎ社製を使用した。フローサイトメトリーの結果を図４に示した。
増幅されたＣＤ４５陽性細胞について、各種分化マーカーの発現は、ＣＤ２、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ４１、ＣＤ６１の各抗原に関して陽性率はほぼ０％であり、ＣＤ１１ｂ、ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡについてはそれぞれ２１％、２３％であった。ＣＤ１１ｂ陽性細胞およびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ陽性細胞についてはＣＤ３４は陰性であることがわかった。このことから本発明においては、ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、巨核球、血小板には分化しておらず、また一部が赤芽球および骨髄系細胞に分化していることがわかった。ＣＤ３４陽性細胞について着目すると分化抗原は陰性であり、実施例１においてＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性が増幅されたという結果と併せて考えると、未分化な自己複製能を有する細胞が増幅されたことを示す。
In order to examine the degree of differentiation of the amplified hematopoietic stem cells, cells of the umbilical cord blood-derived CD34 positive cell-rich fraction were cultured in the presence of hMSC-hTERT-E6 / E7 for 7 days and collected, as in Example 1. The expression of various differentiation markers was measured by flow cytometry. Stained with FITC-labeled anti-CD34, APC-labeled anti-CD45, FITC or PE-labeled differentiation marker, and by flow cytometry, the proportion of differentiation marker-positive cells in CD45-positive cells, or the differentiation marker in CD45-positive / CD34-positive cells Positive cells were evaluated. As differentiation markers, FITC-labeled anti-CD2 (surface markers for T cells, NK cells), PE-labeled anti-CD11b (surface markers such as monocytes, macrophages, granulocytes, NK cells), FITC-labeled anti-CD15 (cells of granulocytes) Surface marker), PE-labeled anti-CD19 (B cell surface marker), PE-labeled anti-CD41 (megakaryocyte, platelet surface marker), PE-labeled anti-CD61 (megakaryocyte, platelet surface marker), PE-labeled anti-Glycophorin A (red) Blast and red blood cell markers) were used. In addition, the differentiation marker made from BD PharMigen was used for these differentiation markers. The results of flow cytometry are shown in FIG.
Regarding the amplified CD45 positive cells, the expression of various differentiation markers was almost 0% for CD2, CD15, CD19, CD41, and CD61 antigens, and 21% and 23% for CD11b and Glycophorin A, respectively. It was. CD34 was found to be negative for CD11b positive cells and Glycophorin A positive cells. Therefore, in the present invention, the CD34-positive cell-rich fraction cells are not differentiated into T cells, B cells, megakaryocytes, and platelets, and some of them differentiate into erythroblasts and myeloid cells. I found out. When focusing on CD34 positive cells, differentiation antigen is negative, and in combination with the result that CD34 positive / CD38 negative was amplified in Example 1, it indicates that cells having undifferentiated self-replicating ability were amplified. .
増幅培養された細胞が種々の血液細胞に分化する機能を有することを確認すべく、実施例１と同様にｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７の共存下で増幅培養した臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞についてコロニーアッセイ法による機能評価を実施した。増幅培養されたＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞をメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４，ステムセル・テクノロジーズ社）上に１０００／ｄｉｓｈとなるよう播種し、２週間、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２、９５％湿度のインキュベータ内で培養し、発生したコロニーの数を数えた。その結果、ＨＰＰ−ＣＦＣ（Ｈｉｇｈ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）については４．５個、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（骨髄系幹細胞：ＣＦＵ−ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）については８６個、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球・単球形成幹細胞：ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）については６７個、ＢＦＵ−Ｅ（赤芽球前駆細胞：ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）については６．３個となった。マウスストロマ細胞株で培養された細胞では、それぞれ３．５個、８０個、５７個、６．８個であり、ほぼ同等の高い分化能を有することがわかった（表１）。 In order to confirm that the cells that have been amplified and cultured have the function of differentiating into various blood cells, the CD34 positive cell rich cell line derived from cord blood that has been amplified and cultured in the presence of hMSC-hTERT-E6 / E7 in the same manner as in Example 1. Functional evaluation by colony assay was performed on the cells of the fraction. Cells of the enriched CD34 positive cell rich fraction were seeded at 1000 / dish on methylcellulose medium (MethoCult H4434, Stem Cell Technologies), 2 weeks, 37 ° C., 5 v / v% CO 2 , 95%. The cells were cultured in a humidity incubator, and the number of colonies generated was counted. As a result, 4.5 for HPP-CFC (High-proliferative-potential colony-forming cells), CFU-GEMM (for myeloid stem cells: CFU-granulocyte-erythroid-macrophye-GCF, 86 for CF). There were 67 cells (granulocyte / monocyte-forming stem cells: the colony-forming unit of granules and macrophages) and 6.3 cells (BFU-E (erythroblast-forming-units)). The cells cultured in the mouse stromal cell line were 3.5, 80, 57, and 6.8, respectively, and were found to have almost the same high differentiation ability (Table 1).
（膜を介した接触の共培養）
実施例１の共培養を、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７と非接触下で実施した。具体的には、１２ウェル用セルカルチャーインサートの底裏面で、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７をコンフルエントになるまで３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％条件下で３日間培養し、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７が均一に膜面に増殖したことを確認したのち、細胞にＸ線を照射（１５Ｇｙ）することで、ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７が過度に成育しないように処置した。続いてｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７のフィーダー層を剥がさないように注意しながらセルカルチャーインサートの内面および外面をＨＢＳＳ（＋）で３回洗浄した。ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７のセルカルチャーインサート内に実施例１と同様に調製したＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞を５×１０３細胞／ウェルとなるように播種した。培養液はＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、ＴＰＯを含む無血清ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を用いた。これによりｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７とＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞は、セルカルチャーインサート底面のヌクレポア膜を介して接触し共培養される。
３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％条件下で７日間培養したのち、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄・回収し、回収した細胞の表面抗原を実施例１と同様にフローサイトメトリーで解析した。
（結果）
培養後のＣＤ４５陽性細胞数は４．１±２．５×１０４細胞／ウェルであった。ＣＤ４５陽性細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞は、４．７±２．９×１０４細胞／ウェルで、播種時のＣＤ３４陽性細胞数と比較して、培養後には約９倍になった。このうち、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は３８．６％であり、数にすると１．８±１．３×１０４細胞／ウェルとなる。播種時のＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞数（１．２×１０２細胞／ウェル）と比較すると１５０倍になった。この結果は実施例１とほぼ同様の結果であり、フィーダー細胞と造血幹細胞が直接接せず、膜を隔てて接触することでも同様の効果が得られるということを示す。
またマウスストロマ細胞株で培養した結果と比較して、同等またはそれ以上の効果が得られていた。
(Co-culture of contact through membrane)
The co-culture of Example 1 was performed without contact with hMSC-hTERT-E6 / E7. Specifically, hMSC-hTERT-E6 / E7 was cultured for 3 days under conditions of 37 ° C., 5 V / V% CO 2 and 95% humidity until it became confluent on the bottom rear surface of the cell culture insert for 12 wells. -After confirming that hTERT-E6 / E7 was uniformly grown on the membrane surface, the cells were irradiated with X-rays (15 Gy) to prevent hMSC-hTERT-E6 / E7 from growing excessively. Subsequently, the inner and outer surfaces of the cell culture insert were washed three times with HBSS (+), taking care not to peel off the feeder layer of hMSC-hTERT-E6 / E7. Cells of the CD34 positive cell rich fraction prepared in the same manner as in Example 1 were seeded in a cell culture insert of hMSC-hTERT-E6 / E7 so as to be 5 × 10 3 cells / well. As the culture solution, a serum-free StemPro34 medium containing SCF, Flt-3, and TPO was used. As a result, the cells of the hMSC-hTERT-E6 / E7 and CD34 positive cell rich fraction are contacted and co-cultured via the Nuclepore membrane on the bottom of the cell culture insert.
After culturing at 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95% for 7 days, the cells were washed and recovered with PBS (−), and the surface antigens of the recovered cells were subjected to flow cytometry in the same manner as in Example 1. We analyzed with.
(result)
The number of CD45 positive cells after culture was 4.1 ± 2.5 × 10 4 cells / well. Among the CD45-positive cells, the number of CD34-positive cells was 4.7 ± 2.9 × 10 4 cells / well, which was about 9 times after culture as compared with the number of CD34-positive cells at the time of seeding. Among these, CD34 positive / CD38 negative cells are 38.6%, and the number is 1.8 ± 1.3 × 10 4 cells / well. Compared with the number of CD34 positive / CD38 negative cells (1.2 × 10 2 cells / well) at the time of seeding, the number was 150 times. This result is almost the same as that in Example 1, indicating that the feeder cells and hematopoietic stem cells are not in direct contact with each other and that the same effect can be obtained by contacting them with a separation across the membrane.
Moreover, compared with the result of culturing with a mouse stromal cell line, the same or better effect was obtained.
コンディショニング培地を利用したＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の培養
ｈＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ−Ｅ６／Ｅ７を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに分散し、５×１０３細胞／ｃｍ２となるよう、培養容器に播種した。播種された細胞を、約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で、３日間培養した。播種された細胞が培養容器中で、セミコンフルエントになったことを確認後、セミコンフルエントにまで増殖した細胞にＸ線照射（１５Ｇｙ）した後、ＨＢＳＳ（＋）で３回おだやかに洗浄した。培地をＦｌｔ−３リガンド、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む無血清培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４；インビトロジェン社）に交換し、約３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で、３日間培養した。培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清をポアサイズ０．２２μｍのフィルタ（マイレクスＧＳ；ミリポア社）で濾過し、コンディショニング培地とした。
Cultivation of CD34 positive / CD38 negative cells using conditioning medium hMSC-hTERT-E6 / E7 was dispersed in DMEM containing 10% FBS and seeded in a culture vessel so as to be 5 × 10 3 cells / cm 2 . The seeded cells were cultured for 3 days under conditions of about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%. After confirming that the seeded cells became semi-confluent in the culture vessel, the cells grown to semi-confluent were irradiated with X-rays (15 Gy), and then gently washed with HBSS (+) three times. The medium was replaced with a serum-free medium (StemPro34; Invitrogen) containing Flt-3 ligand, SCF and TPO, and cultured at about 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95% for 3 days. After culturing, the culture supernatant was collected. The collected culture supernatant was filtered with a filter having a pore size of 0.22 μm (Mirex GS; Millipore) to obtain a conditioned medium.
コンディショニング培地を利用して，ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞の培養をおこなった。実施例１と同様に、ＣＤ３４陽性細胞リッチ画分を調製した。調製したＣＤ３４陽性細胞リッチ画分の細胞をコンディショニング培地で懸濁し，１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、１ウェルあたり５×１０３細胞／２ｍＬコンディショニング培地となるよう播種した。３７℃、５Ｖ／Ｖ％ＣＯ２、湿度９５％の条件下で７日間培養した。培養後、細胞を回収し、実施例１と同様にフローサイトメトリーによる細胞の表面抗原試験を実施した。
（結果）
培養後に回収されたＣＤ４５陽性細胞数は約１９０倍，ＣＤ３４陽性細胞は約１４倍、ＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞は約１１０倍に増幅された。
Using a conditioning medium, CD34 positive / CD38 negative cells were cultured. Similar to Example 1, a CD34 positive cell rich fraction was prepared. Cells of the prepared CD34-positive cell rich fraction were suspended in a conditioned medium, and seeded on a 12-well plate so as to be 5 × 10 3 cells / 2 mL of conditioned medium per well. The cells were cultured for 7 days under conditions of 37 ° C., 5 V / V% CO 2 , and humidity of 95%. After culturing, the cells were collected, and the cell surface antigen test by flow cytometry was performed in the same manner as in Example 1.
(result)
The number of CD45 positive cells collected after the culture was amplified about 190 times, CD34 positive cells about 14 times, and CD34 positive / CD38 negative cells about 110 times.
本発明の方法は、ヒトの株化間葉系細胞を使用し、ヒトのＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性細胞を増殖できるので、本方法を利用して増殖された細胞は、ヒトの移植用造血幹細胞として有用である。 Since the method of the present invention uses human established mesenchymal cells and can proliferate human CD34 positive / CD38 negative cells, cells proliferated using this method can be used as human hematopoietic stem cells for transplantation. Useful.
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