JP4684109B2 - Enamelin gene dysfunctional mouse - Google Patents
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Description
本発明は、エナメル質形成不全症モデルマウス及びその作出方法に関する。また本発明は、エナメル質形成不全症の冶療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to an enamel hypoplasia model mouse and a production method thereof. The present invention also relates to a method for screening a drug for the treatment and / or prevention of enamel hypoplasia.
アメロゲニン、エナメリン及びアメロブラスチンは、エナメル質構成タンパクの主成分として知られる。ヒトにおける遺伝解析では、アメロゲニン及びエナメリンは突然変異と疾患との明らかな関連性があることが報告されている（例えば非特許文献１〜４：Ｒａｊｐａｒ ＭＨら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，第１０（１６）巻，ｐ．１６７３−７，２００１年；Ｋｉｄａ Ｍら、Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ．，第８１（１１）巻，ｐ．７３８−４２，２００２年；Ｍａｒｄｈ ＣＫら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，第１１（９）巻，ｐ．１０６９−７４，２００２年；Ｈａｒｔ ＰＳら、Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．，第４８（８）巻，ｐ．５８９−９６，２００３年参照）。ただし、遺伝性エナメル質形成不全症における遺伝的又は臨床的な多様性の原因を明らかにするには、モデル動物による実験が不可欠である。ヒトモデルとして用い得るモデル動物の中で、マウスは以下のような利点を持つ：
１）小型で飼育が簡単である
２）ゲノム情報がヒトに次いで充実している
３）遺伝子ターゲティング等による高度な遺伝子操作が可能である
４）多くの遺伝子による作用を研究するための「遺伝的背景」の異なる多様な近交系統がすでに確立されている
よって、実験動物開発の中でもモデルマウスの開発は非常に重要である。
現在のところ、アメロゲニンでは遺伝子ターゲティング法による突然変異マウスが作製されているが（Ｇｉｂｓｏｎ ＣＷら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，第２７６（３４）巻，ｐ．３１８７１−５、２００１年（Ｅｐｕｂ ２００１ Ｊｕｎ １３）参照）、これは機能欠失の１系統のみである。一方、エナメリン遺伝子に関しては、遺伝子ターゲティング法による突然変異マウス及び自然突然変異ともに未だ報告がない。従って、エナメリン遺伝子の変異によってもたらされる遺伝性エナメル質形成不全症は、モデルとなるエナメリン変異マウスが作出されておらず、エナメリン遺伝子がエナメル質形成において果たす役割、その遺伝的・臨床的な多様性の発生原因、さらには、エナメル質形成不全の治療法等について、実験に基づいた知見を得ることが出来なかった。Amelogenin, enamelin and ameloblastin are known as the main components of enamel constituent proteins. Genetic analysis in humans has reported that amelogenin and enamelin have a clear link between mutation and disease (eg,
1) Small and easy to breed 2) Genome information is next to humans 3) Advanced genetic manipulation by gene targeting is possible 4) “Genetics” to study the effects of many genes Since various inbred strains with different "backgrounds" have already been established, the development of model mice is very important among experimental animals.
At present, mutant mice by gene targeting method have been prepared for amelogenin (Gibson CW et al., J Biol Chem., 276 (34), p. 31871-5, 2001 (Epub 2001 Jun 13)). This is only one line of loss of function. On the other hand, regarding the enamelin gene, neither a mutant mouse by the gene targeting method nor a natural mutation has been reported yet. Therefore, hereditary enamel hypoplasia caused by the enamelin gene mutation has not been created as a model enamelin mutant mouse, and the role of the enamelin gene in enamel formation, its genetic and clinical diversity Based on experiments, it was not possible to obtain information on the cause of the occurrence of the disease and the treatment method of enamel hypoplasia.
従って、本発明は、エナメリン質形成異常を示すモデル動物、及び該モデル動物の用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、化学変異原ＥＮＵ誘発突然変異によりエナメル質形成異常を示す突然変異マウス（Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１）を見出し、そのマウスにおける原因遺伝子のマッピングを行ったところ、エナメリン遺伝子上に一塩基変異が認められた。また、前記突然変異マウスを野生型の近交系ＤＢＡ／２Ｊマウスに戻し交配することによって前記突然変異形質を遺伝したマウス又はその子孫をも樹立することにも成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
すなわち、本発明は、エナメリン遺伝子の変異によってエナメル質形成異常を呈することを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウスである。
上記エナメル質形成不全症モデルマウスにおいて、エナメリン遺伝子の変異は、好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異である：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
また、上記エナメル質形成不全症モデルマウスは、例えば、低石灰化型、低成熟型、及び低形成型のエナメル質形成異常を呈するものである。
上記エナメル質形成不全症モデルマウスとしては、具体的には、突然変異マウスＭ１００３９５、突然変異マウスＭ１００５１４、又は突然変異マウスＭ１００５２１が挙げられる。
本発明はまた、上記エナメル質形成不全症モデルマウスを野生型マウスに戻し交配することによって作出したマウス又はその子孫である、エナメル質形成不全症モデルマウスである。
さらに本発明は、マウスにおけるエナメリン遺伝子に以下からなる群より選択される少なくとも１つの変異を導入し、該マウスにおいて変異型エナメリン遺伝子を発現させることを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウスの作出方法である：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
またさらに本発明は、上記エナメル質形成不全症モデルマウスを被験因子に暴露し、該被験因子がエナメル質形成異常を改善するかどうかを判定することを含む、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法である。
上記スクリーニング方法においては、判定を、例えばエナメル質形成不全症モデルマウスの切歯の異常な摩耗及び切歯表面における異常な凹凸からなる群から選ばれる１又は２以上の項目について行うことができる。Accordingly, an object of the present invention is to provide a model animal exhibiting enamelin dysplasia and a use of the model animal.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found mutant mice (M100395, M100514, and M100521) that show abnormal enamel formation due to the chemical mutagen ENU-induced mutation, and causes in the mice When the gene was mapped, a single base mutation was found on the enamelin gene. The mutant mice were also successfully established by breeding back to the wild-type inbred DBA / 2J mice and also by inheriting the mutant inherited mice or their progeny. The present invention has been completed based on such findings.
That is, the present invention is an enamel dysplasia model mouse characterized by exhibiting abnormal enamel formation due to a mutation in the enamelin gene.
In the enamel hypoplasia model mouse, the mutation of the enamelin gene is preferably at least one mutation selected from the group consisting of the following (a) to (c):
(A) Mutation of the base corresponding to the 6489th base in the base sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1), or mutation of the amino acid corresponding to the 55th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (b) ) Mutation of the base corresponding to the 6495th base in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1), or mutation of the amino acid corresponding to the 57th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (c) Mouse The mutation of the base corresponding to the 6341st base in the base sequence of the enamelin gene (SEQ ID NO: 1). The enamel hypoplasia model mouse includes, for example, a hypocalcification type, a low maturation type, and a hypoplasia type It presents abnormal enamel formation.
Specific examples of the enamel hypoplasia model mouse include mutant mouse M100395, mutant mouse M100514, or mutant mouse M100521.
The present invention is also an enamel hypoplasia model mouse, which is a mouse produced by backcrossing the enamel hypoplasia model mouse to a wild-type mouse or a descendant thereof.
Furthermore, the present invention provides an enamel hypoplasia model mouse characterized by introducing at least one mutation selected from the group consisting of the following into an enamelin gene in a mouse and expressing the mutant enamelin gene in the mouse: The creation method is:
(A) mutation of the base corresponding to the 6489th base in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1) or mutation of the amino acid corresponding to the 55th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (b) Mutation of the base corresponding to the 6495th base in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1) or mutation of the amino acid corresponding to the 57th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (c) Mouse enamelin Mutation of the base corresponding to the 6341st base in the base sequence of the gene (SEQ ID NO: 1) Furthermore, the present invention exposes the above-mentioned mouse model for enamel hypoplasia to a test factor, and the test factor is an abnormal enamel formation For the treatment and / or prevention of enamel hypoplasia, including determining whether to improve Pharmaceutical is a method of screening.
In the screening method described above, the determination can be performed on one or more items selected from the group consisting of abnormal wear of the incisors and abnormal irregularities on the surface of the incisors of, for example, an enamel hypoplasia model mouse.
図１は、野生型（Ａ）、並びにＭ１００３９５（Ｂ）、Ｍ１００５１４（Ｃ）及びＭ１００５２１（Ｄ）の各突然変異系統の切歯の表現型を示す写真である。Ｂ及びＣにおいては、形成不全型エナメル質形成不全による、エナメル質の障害が見られる。これに対して、Ｄにおいて、粗な切歯表面が示され、かつ咬合部に異常な摩耗が観察される。これはエナメル質が柔らかいことを示す。
図２は、Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１の遺伝子マッピングを示す図である。上側の図は、Ｍ１００３９５（左）及びＭ１００５１４（右）ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐａｎｅｌである。白い四角はＤＢＡ／２Ｊの多型を、黒い四角はＣ５７ＢＬ／６Ｊの多型を示す。組換え体の数は各四角の列の下側に示す。下側は、ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐａｎｅｌから作製されたＭ１００３９５（左）、Ｍ１００５１４（中）Ｍ１００５２１（右）の第５染色体遺伝子マップを示す。全ての突然変異はエナメリン（Ｅｎａｍ）及びアメロブラスチン（Ａｍｂｎ）近傍にマップされた。
図３Ａは、Ｍ１００３９５突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６４８９番目のＧがＴへ塩基置換している。
図３Ｂは、Ｍ１００５１４突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６４９５番目のＡがＧへ塩基置換している。
図３Ｃは、Ｍ１００５２１突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６３４１番目のＴがＡへ塩基置換している。
図４は、Ｍ１００５２１系統を用いたエナメリンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。
発明の実施をするための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１２月１１日に出願された日本国特許出願第２００３−４１３８２９号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、エナメル質形成不全症のモデルマウス（以下、「本モデルマウス」と称する）に関し、エナメリン遺伝子に変異を有することを特徴とするものである。
１．エナメリン遺伝子の変異
本モデルマウスは、エナメリン遺伝子の変異によってエナメル質形成異常を呈することを特徴とする。かかるエナメリン遺伝子の変異としては、以下の（ａ）〜（ｃ）が挙げられ、本モデルマウスはこれらの変異のうち少なくとも１つの変異を有する：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目のグアニン（Ｇ）のチミン（Ｔ）への変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のセリン（Ｓ）のイソロイシン（Ｉ）への変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目のアデニン（Ａ）のグアニン（Ｇ）への変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のグルタミン（Ｅ）のグリシン（Ｇ）への変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目のチミン（Ｔ）のアデニン（Ａ）への変異
本モデルマウスは、上記の位置における一塩基変異又は一アミノ酸変異を有するものであるが、これは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のハツカネズミ種における位置を示すものである。一般的に、遺伝子の配列及び構造、並びにアミノ酸の配列及び構造は、動物種により異なることが知られている。従って、本モデルマウスは、上記の位置の塩基に「相当する塩基の変異」又は上記の位置のアミノ酸に「相当するアミノ酸の変異」を有するものであってもよい。「相当する」塩基又はアミノ酸の位置は、アミノ酸配列の相同性、ペプチドのコンホメーション、塩基配列のアライメントなどによって当業者であれば容易に決定することができる。
ヒト遺伝性エナメル質形成不全症の臨床学的な分類には、以下が含まれる：
（１）低石灰化型（ｈｙｐｏｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｔｙｐｅ）
エナメル質は正常の厚さだが、石灰化が不十分
（２）低成熟型（ｈｙｐｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）
エナメル質は正常の厚さだが、表面が粗でありエナメル質が柔らかい
（３）低形成型（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｙｐｅ）
エナメル質が薄く、表面ではエナメル質の崩落等がみられる。
従って、本モデルマウスは、上記の低石灰化型、低成熟型、及び低形成型のうち少なくとも１つのエナメル質形成異常を呈することが好ましい。
本発明者らにより作出されたエナメリン遺伝子の異なる位置に変異を有するマウスが、上記ヒト遺伝性エナメル質形成不全症分類のうち２種類（低成熟型、低形成型）を示すことが確認されている。以下に、本発明者らが作出したエナメル質形成不全症モデルマウス系統について説明する。
（ａ）Ｍ１００３９５系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６４８９番目の塩基が、ＧからＴへ変異している。この変異は、エナメリンタンパク質では、５５番目のアミノ酸のＳからＩへの変異に相当する。このＭ１００３９５系統マウスの歯の表面では、エナメル質の崩落が観察され、低形成型の遺伝性エナメル質形成不全症を呈する。
（ｂ）Ｍ１００５１４系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６４９５番目の塩基が、ＡからＧへ変異している。この変異は、エナメリンタンパク質では、５７番目のアミノ酸のＥからＧへの変異に相当する。このＭ１００５１４系統マウスの歯の表面では、エナメル質の崩落が観察され、低形成型の遺伝性エナメル質形成不全症を呈する。
（ｃ）Ｍ１００５２１系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６３４１番目の塩基が、ＴからＡへ変異している。この変異は、転写の際のｍＲＮＡスプライシングにおけるアクセプターシグナル部位に相当する。従って、この変異により、エナメリン遺伝子の転写産物が第４イントロンを含んだままとなり、結果的に第５エクソンでフレームシフトを引き起こし、第５エクソンの途中で停止コドンにより翻訳が止まる。この異常な転写産物は、（おそらくｍＲＮＡナンセンス分解により）ほぼ分解される。よって、この変異は機能欠失型の変異であると結論付けられた。このマウスの歯の表面は粗面であり、咬合部で異常な摩耗を示す。これはエナメル質が正常より柔らかいことを示している。
２．エナメル質形成不全症モデルマウスの作出、維持
本モデルマウスは、例えば、以下の手法により作出、維持することができる。
（１）点突然変異誘発による作出
まず、化学変異剤（ＥＮＵ：Ｎ−エチル−ニトロソ尿素）により精子に点突然変異を誘発した初代（ＧＯ世代）の雄マウスと野生型の雌から生まれた第１世代マウス（Ｇ１）の中から「エナメル質形成異常」を示す表現型により突然変異マウスをスクリーニングする。
次に、この突然変異Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）を野性型の雌（＋／＋）と交配すると、第２世代マウス（Ｇ２）において、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／Ｍ）が１：１の割合で出現（エナメル質形成異常：正常が１：１に分離）し、変異に遺伝性があることを確認できる。
さらに、Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）とＧ２雌マウス（＋／Ｍ）を交配すると、第３世代マウス（Ｇ３）において、いわゆるメンデルの分離の法則に従い、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／Ｍ）、ホモ接合体（Ｍ／Ｍ）が、１：２：１の割合で出現（エナメル質形成異常：正常が３：１に分離）することが予想される。
このような戻し交配を１０世代以上繰り返すことにより、単一の遺伝子座だけに変異が認められるコンジェニック系統が樹立できる。
本発明において点突然変異を誘発した雄マウスは上記のような遺伝形式をとることから、本突然変異はエナメリン遺伝子に支配されていることいえる。従って、作出される各世代のヘテロ接合体（＋／Ｍ）マウスは、前記のエナメル質形成異常を示し、かつ致死も認められないので、エナメル質形成不全症モデルマウスとして有用であるとともに、ホモ接合体（Ｍ／Ｍ）マウスの製造の親動物としても利用できる。
また、突然変異Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）の精子を凍結保存しておくことにより、マウスが死滅又は老化などの理由により不妊となっている場合であっても、その凍結精子を用時融解し、未受精卵との体外受精、あるいは培養によって受精胚を作製して偽妊娠雌マウスの子宮に移植することによって産仔を得ることができ、本モデルマウスを維持することが可能である。
本モデルマウスとなる突然変異マウス系統Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１の精子は、独立行政法人理化学研究所 ゲノム科学総合研究センター（横浜市戸塚区前田町２１４）、及びバイオリソースセンター（つくば市高野台３−１−１）施設において、凍結保存されており、特許後においては希望者に分譲する。
（２）点特異的突然変異導入法による作出
本モデルマウスは、点特異的突然変異導入法を利用することによって、遺伝子工学的手法により作出することも可能である。すなわち、本発明に係るエナメル質形成不全症モデルマウスの作出方法は、マウスにおけるエナメリン遺伝子に上記の少なくとも１つの変異を導入し、該マウスにおいて変異型エナメリン遺伝子を発現させることを含む。
上記のような変異をマウスに導入するには、目的のマウスエナメリン遺伝子をクローニングし、この遺伝子に対し、上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの変異を導入し、その後、相同組換え法を利用して変異型エナメリン遺伝子を当技術分野で公知のＤＮＡ導入法により染色体上の遺伝子と置換することによって行うことができる。このような操作を行う対象となる動物種は、マウスであれば特に限定されない。またマーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子を使用することが好ましく、例えば限定するものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ガンシクロビル耐性遺伝子等が挙げられる。当技術分野で公知のＤＮＡ導入法としては、限定するものではないが、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）法等が挙げられる。
具体的には、次のようにして本モデルマウスを作出する。最初に、操作の対象となるマウスのエナメリン遺伝子のタンパク質翻訳領域（ＯＲＦ）及びその周囲について遺伝子を単離し、この遺伝子に以下の（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも１つの変異を導入する：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
遺伝子への変異導入手法は当業者に周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して行うことができる。次に、変異型エナメリン遺伝子を含むＤＮＡをＥＳ細胞に導入し、マーカーを指標にして相同組換えを起こした細胞のコロニーを選別する。例えばネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選別する。選別された変異型エナメリン遺伝子を有するＥＳ細胞を胚盤胞に注入してキメラ胚を作製する。その後、キメラ胚を仮親の子宮に移植し、キメラ動物を生育する。生まれてきたキメラ動物が置換された遺伝子（変異型エナメリン遺伝子）を有するか否かは、例えば尾の先端等を一部切り取って調製したＤＮＡを用いて、例えばＰＣＲ法で確認することが可能である。仔動物のいくつかは破壊された遺伝子を片方の染色体にもつヘテロ接合体（＋／Ｍ）である。従って、これらヘテロ接合体である動物同士を交配することにより、変異型エナメリン遺伝子を両方の染色体上にもつホモ接合体（Ｍ／Ｍ）が得られる。
３．エナメル質形成不全症モデルマウスの用途
本モデルマウスは、エナメル質形成不全症を呈するものであるため、以下の態様で、エナメル質形成不全症のための医薬のスクリーニングに使用することができる。
すなわち、本発明によれば、本発明に係るエナメル質形成不全症モデルマウスを被験因子に暴露し、該被験因子がエナメル質形成異常を改善するかどうかを判定することを含む、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験因子の種類は特に限定されない。例えば、物質的因子（医薬品、食品など）、環境因子（放射線、紫外線など）が挙げられる。具体的には、天然に生じる分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など）；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物など）；及び天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物）；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験因子としては単一の被験因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
被験因子の改善効果の判定では、まず本モデルマウスを上記被験因子に暴露する。被験因子の暴露条件は、その因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば被験因子として被験因子を投与する場合には、その投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、被験因子の種類の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。また、被験因子の効果を、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験因子に暴露する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験因子の希釈系列を作成するなどして複数の投与量を設定することができる。被験因子の投与期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間までの期間に渡って投与することができる。本モデルマウスに被験因子を投与する場合の投与経路は特に限定されず、被験因子の種類に応じて経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
さらに、複数の因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験因子を組み合わせて用いてもよい。
判定は、ＳＨＩＲＰＡ法（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１９９７）８（１０）：７１１−７１３）を改変した、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＳＨＩＲＰＡ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ Ｕｓ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｈｔｍ）の表現型スクリーニングにおける３７番目の項目に挙げられている「テスト中の歯形態の観察」（Ｔｅｅｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を用いて行なうことができる。具体的には、マウス口腔内を目視で検査し、マウス切歯が正常であるか、又は何らかの異常を示すかについて、判定を行う。
本発明のスクリーニング方法の結果、被験因子に暴露した本モデルマウスにおいてエナメル質形成異常の改善が認められる場合の被験因子は、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬の候補とすることができる。ここで、エナメル質形成異常の改善は、例えば、エナメル質硬度の回復や、歯表面に変化があったと判断される場合にその被験因子の効果があったと評価することができる。
以上から、本モデルマウスを用いることにより、エナメル質形成異常に関連する疾患を治療又は予防するための医薬又は治療法候補を見出し、あるいは医薬又は治療法の効果を確認することが可能となる。FIG. 1 is a photograph showing the incisor phenotypes of the wild type (A) and the mutant strains of M100395 (B), M100514 (C) and M100521 (D). In B and C, enamel damage due to dysplastic enamel formation failure is observed. On the other hand, in D, a rough incisor surface is shown, and abnormal wear is observed at the occlusal portion. This indicates that the enamel is soft.
FIG. 2 is a diagram showing gene mapping of M100395, M100514, and M100521. The upper figure shows the M1000039 (left) and M100514 (right) segregation panels. White squares indicate DBA / 2J polymorphism, and black squares indicate C57BL / 6J polymorphism. The number of recombinants is shown below each square column. The lower side shows the chromosome 5 gene maps of M100395 (left) and M100514 (middle) M100521 (right) prepared from the segregation panel. All mutations were mapped near enamelin (Enam) and ameloblastin (Ambn).
FIG. 3A is a diagram showing a sudden displacement site discovered by sequencing of the enamelin gene in a heterozygous individual of the M100395 mutant strain. The arrow indicates the mutation site induced by ENU. The upper figure shows the wild type, and the lower two figures show the heterozygous nucleotide sequences. The 6489th G of the enamelin gene has a base substitution to T.
FIG. 3B is a diagram showing a sudden displacement site discovered by sequencing of the enamelin gene in a heterozygous individual of the M100514 mutant strain. The arrow indicates the mutation site induced by ENU. The upper figure shows the wild type, and the lower two figures show the heterozygous nucleotide sequences. The 6495th A of the enamelin gene has a base substitution to G.
FIG. 3C is a diagram showing a sudden displacement site discovered by sequencing of the enamelin gene in a heterozygous individual of the M100521 mutant strain. The arrow indicates the mutation site induced by ENU. The upper figure shows the wild type, and the lower two figures show the heterozygous nucleotide sequences. The 6341st T of the enamelin gene is base-substituted to A.
FIG. 4 is a photograph showing RT-PCR results of enamelin mRNA using M100521 strain.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail below. This application claims the priority of the Japan patent application 2003-413829 for which it applied on December 11, 2003, and includes the content described in the specification and / or drawing of the said patent application. .
The present invention relates to a model mouse for enamel hypoplasia (hereinafter referred to as “the present model mouse”), and is characterized by having a mutation in the enamelin gene.
1. Mutation of the enamelin gene This model mouse is characterized by exhibiting enamel malformation due to the mutation of the enamelin gene. Examples of the mutation of the enamelin gene include the following (a) to (c), and the model mouse has at least one of these mutations:
(A) Mutation of the 6489th guanine (G) to thymine (T) in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the mouse enamelin gene, or the 55th serine (S) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (B) Mutation of the 6495th adenine (A) to guanine (G) in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the mouse enamelin gene, or in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) Mutation of the 57th glutamine (E) to glycine (G) (c) Mutation of the 6341st thymine (T) to adenine (A) in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1) This model The mouse has a single base mutation or a single amino acid mutation at the above position, which is a murine species of the mouse (Mus musculus). The position at is indicated. In general, it is known that the sequence and structure of a gene and the sequence and structure of an amino acid differ depending on the animal species. Therefore, the model mouse may have a “corresponding base mutation” for the base at the above position or a “corresponding amino acid mutation” for the amino acid at the above position. A “corresponding” base or amino acid position can be easily determined by those skilled in the art based on amino acid sequence homology, peptide conformation, base sequence alignment, and the like.
The clinical classification of human hereditary enamel dysplasia includes the following:
(1) Hypocalcified type
Enamel is of normal thickness, but calcification is insufficient (2) hypomaturation type
Enamel has a normal thickness, but the surface is rough and the enamel is soft. (3) Hypoplastic type
The enamel is thin, and the enamel collapses on the surface.
Therefore, it is preferable that this model mouse exhibits at least one abnormal enamel formation among the above-mentioned hypocalcification type, low-maturation type, and low-formation type.
It has been confirmed that mice having mutations at different positions of the enamelin gene produced by the present inventors show two types (low-maturation type and low-formation type) among the above-mentioned human hereditary enamel hypoplasia classifications. Yes. The enamel hypoplasia model mouse strain produced by the present inventors will be described below.
(A) M100395 strain The 6489th base of the mouse enamelin gene genomic sequence (AF303737; SEQ ID NO: 1) disclosed in NCBI is mutated from G to T. This mutation corresponds to an S to I mutation at the 55th amino acid in the enamelin protein. Decay of enamel is observed on the tooth surface of this M100395 strain mouse, and hypoplastic hereditary enamel hypoplasia is exhibited.
(B) M100514 strain The 6495th base of the mouse enamelin gene genomic sequence (AF303737; SEQ ID NO: 1), which is disclosed in NCBI, is mutated from A to G. This mutation corresponds to an E to G mutation at the 57th amino acid in the enamelin protein. On the surface of the teeth of this M100514 strain mouse, the collapse of enamel is observed, and hypoplastic hereditary enamel hypoplasia is exhibited.
(C) M100521 strain The 6341st base of the mouse enamelin gene genomic sequence (AF303737; SEQ ID NO: 1), which is disclosed in NCBI, is mutated from T to A. This mutation corresponds to an acceptor signal site in mRNA splicing during transcription. Therefore, due to this mutation, the transcription product of the enamelin gene remains containing the fourth intron, resulting in a frameshift in the fifth exon and translation being stopped by a stop codon in the middle of the fifth exon. This abnormal transcript is almost degraded (perhaps due to mRNA nonsense degradation). Therefore, it was concluded that this mutation is a loss-of-function mutation. The surface of the teeth of this mouse is rough and exhibits abnormal wear at the occlusal area. This indicates that the enamel is softer than normal.
2. Production and maintenance of enamel hypoplasia model mouse This model mouse can be produced and maintained, for example, by the following method.
(1) Production by point mutagenesis First of all, the first (GO generation) male mice and wild type females in which point mutations were induced in sperm by a chemical mutagen (ENU: N-ethyl-nitrosourea). Mutant mice are screened from the 1st generation mice (G1) with a phenotype showing “enamel formation abnormality”.
Next, when this mutant G1 male mouse (+ / M) is crossed with a wild type female (+ / +), in the second generation mouse (G2), wild type (+ / +), heterozygote (+ / M) appears at a ratio of 1: 1 (enamel formation abnormality: normal is separated into 1: 1), and it can be confirmed that the mutation is heritable.
Furthermore, when a G1 male mouse (+ / M) and a G2 female mouse (+ / M) are mated, in the third generation mouse (G3), in accordance with the so-called Mendel's law of separation, wild type (+ / +), heterozygous Bodies (+ / M) and homozygotes (M / M) are expected to appear at a ratio of 1: 2: 1 (enamel malformation: normal is separated into 3: 1).
By repeating such backcrossing for 10 generations or more, a congenic line in which a mutation is found only in a single locus can be established.
Since the male mouse in which the point mutation is induced in the present invention adopts the above-described genetic form, it can be said that this mutation is controlled by the enamelin gene. Therefore, each generation of heterozygous (+ / M) mice produced is useful as an enamel dysplasia model mouse because it exhibits the above-mentioned abnormal enamel formation and is not lethal. It can also be used as a parent animal for the production of zygote (M / M) mice.
In addition, by preserving the sperm of a mutant G1 male mouse (+ / M), even if the mouse is infertile due to death or aging, the frozen sperm can be thawed at the time of use. In addition, in vitro fertilization with unfertilized eggs or by producing a fertilized embryo by culturing and transplanting it into the uterus of a pseudopregnant female mouse, it is possible to maintain this model mouse.
The sperm of mutant mouse strains M100395, M100514 and M100521, which are the model mice, are RIKEN Genomic Sciences Research Center (214 Maedacho, Totsuka-ku, Yokohama) and BioResource Center (3-1 Takanodai, Tsukuba City). -1) It is stored frozen in the facility and will be distributed to the applicant after the patent.
(2) Creation by point-specific mutagenesis The model mouse can also be created by genetic engineering techniques using the point-specific mutagenesis method. That is, the method for producing an enamel hypoplasia model mouse according to the present invention includes introducing at least one mutation into the enamelin gene in the mouse and expressing the mutant enamelin gene in the mouse.
In order to introduce such mutations into mice, the target mouse enamelin gene is cloned, and any of the mutations (a) to (c) above is introduced into this gene. It can be carried out by replacing the mutant enamelin gene with a gene on the chromosome by a DNA introduction method known in the art using the replacement method. The animal species to be subjected to such an operation is not particularly limited as long as it is a mouse. Further, as the marker gene, it is preferable to use a drug resistance gene, and examples thereof include, but are not limited to, a neomycin resistance gene and a ganciclovir resistance gene. The DNA introduction method known in the art includes, but is not limited to, a microinjection method, a viral vector method, an ES cell (embryonic stem cell) method, and the like.
Specifically, this model mouse is created as follows. First, a gene is isolated for the protein translation region (ORF) of the mouse enamelin gene to be manipulated and its surroundings, and at least one mutation of the following (a) to (c) is introduced into this gene:
(A) mutation of the base corresponding to the 6489th base in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1) or mutation of the amino acid corresponding to the 55th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (b) Mutation of the base corresponding to the 6495th base in the nucleotide sequence of the mouse enamelin gene (SEQ ID NO: 1) or mutation of the amino acid corresponding to the 57th amino acid in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (c) Mouse enamelin Mutation of the base corresponding to the 6341st base in the base sequence of the gene (SEQ ID NO: 1) The method for introducing a mutation into a gene is well known to those skilled in the art, and can be performed, for example, using polymerase chain reaction (PCR). it can. Next, DNA containing the mutant enamelin gene is introduced into ES cells, and colonies of cells that have undergone homologous recombination are selected using the marker as an indicator. For example, when a neomycin resistance gene is used, cells that are resistant to the G418 drug are selected. ES cells having the selected mutant enamelin gene are injected into blastocysts to produce chimeric embryos. Thereafter, the chimeric embryo is transplanted into the temporary parent's uterus to grow a chimeric animal. Whether or not the resulting chimeric animal has a substituted gene (mutant enamelin gene) can be confirmed, for example, by PCR, using DNA prepared by partially cutting off the tip of the tail, etc. is there. Some pups are heterozygotes (+ / M) with the disrupted gene on one chromosome. Therefore, by mating these heterozygous animals, a homozygote (M / M) having a mutant enamelin gene on both chromosomes is obtained.
3. 4. Use of enamel dysplasia model mouse Since this model mouse exhibits enamel dysplasia, it can be used for screening of drugs for enamel dysplasia in the following manner.
That is, according to the present invention, the enamel hypoplasia model mouse according to the present invention is exposed to a test factor, and the test factor includes determining whether or not the test factor improves enamel malformation. A method for screening a medicament for the treatment and / or prevention of symptom is provided.
The kind of test factor used as the object of the screening method of the present invention is not particularly limited. Examples include material factors (pharmaceuticals, foods, etc.) and environmental factors (radiation, ultraviolet rays, etc.). Specifically, naturally occurring molecules (eg, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleic acids, etc.); lipids, steroids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans, etc .; or synthetic analogs of naturally occurring molecules or Derivatives (eg, peptidomimetics); and non-naturally occurring molecules (eg, low molecular weight organic compounds created using combinatorial chemistry techniques, etc.); and mixtures thereof. In addition, as a test factor, a single test factor may be tested independently, or a mixture of several candidate test factors (including a library and the like) may be tested. Examples of the library containing a plurality of test factors include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library).
In determining the improvement effect of a test factor, first, the model mouse is exposed to the test factor. The exposure condition of the test factor varies depending on the type of the factor, but can be easily determined by those skilled in the art. For example, when a test factor is administered as a test factor, the administration conditions such as the dose, administration period, and administration route vary depending on the type of the test factor, but those skilled in the art can easily determine it. it can. In addition, the effect of the test factor can be examined under several conditions. Such conditions include the time or period of exposure to the test factor, the amount (large or small), the number of times, and the like. For example, a plurality of doses can be set by creating a dilution series of test factors. The administration period of the test factor can also be set as appropriate, and can be administered over a period from 1 day to several weeks, for example. The administration route when administering the test factor to this model mouse is not particularly limited, and oral, intravenous, intraperitoneal, transdermal, subcutaneous injection, etc. are appropriately used depending on the type of the test factor. be able to.
Furthermore, when examining the additive action and synergistic action of a plurality of factors, test factors may be used in combination.
The determination is made by the modified-SHIRPA method (http://www.gsc.riken.go.jp/Mouse/About Us / screening) modified from the SHIRPA method (Mamm. Genome (1997) 8 (10): 711-713). .Htm) phenotypic screening can be performed using the “observation of tooth morphology during testing” (Teeth morphology) listed in the 37th item. Specifically, the inside of the mouse mouth is visually inspected to determine whether the mouse incisor is normal or shows some abnormality.
As a result of the screening method of the present invention, when the improvement in enamel malformation is observed in this model mouse exposed to the test factor, the test factor is a drug candidate for treatment and / or prevention of enamel hypoplasia. can do. Here, the improvement of the enamel formation abnormality can be evaluated as having the effect of the test factor when, for example, it is judged that the enamel hardness has been recovered or the tooth surface has changed.
As described above, by using this model mouse, it becomes possible to find a drug or a therapeutic method candidate for treating or preventing a disease associated with abnormal enamel formation, or to confirm the effect of the drug or the therapeutic method.
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
［実施例１］
（１）ＥＮＵによる突然変異の誘発とエナメル質形成異常の検出
化学変異原ＥＮＵ（Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素）を、１回あたり５５〜１００ｍｇ／ｋｇ、総量１５０〜２５０ｍｇ／ｋｇを１週間間隔でＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｇ０）に２〜３回腹腔内投与し、突然変異を誘発した。ＥＮＵ投与に関する詳細は、理研ＧＳＣのＷｅｂサイトに記述されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／）。Ｇ０の子孫（Ｇ１）を作出するためにＧ０とＤＢＡ／２Ｊ雌マウスとの交配を実施し、産生されたＧ１を用いて歯形態に関するスクリーニングを行った。
歯形態のスクリーニングは、ＳＨＩＲＰＡ法（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１９９７）８（１０）：７１１−７１３）を改変した、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＳＨＩＲＰＡ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ Ｕｓ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｈｔｍ）の表現型スクリーニングにおける３７番目の項目に挙げられている「テスト中の歯形態の観察」（Ｔｅｅｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を用いて行なった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ Ｕｓ／ｓｈｉｒｐａｌｉｓｔ．ｈｔｍ）。
この結果、Ｇ１のＭ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１に歯の形態の異常が観察された（図１のＢ〜Ｄ）。これらの表現型の詳細は以下の通りである。
Ｍ１００３９５は、切歯表面のエナメル質部分に脱落がみられた（図１のＢ）。Ｍ１００５１４もまたＭ１００３９５と全く同一の表現型が得られた（図１のＣ）。これらは明らかに形成不全型（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｙｐｅ）のエナメル質形成不全症の症状である。Ｍ１００５２１は切歯の表面が粗であり、咬合面に異常な摩耗が観察された（図１のＤ）。これは、エナメル質が正常よりも柔らかいことを示し、未成熟型（ｈｙｐｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）のエナメル質形成不全症の症状である。
得られた歯形態異常マウスは、野生型のＤＢＡ／２Ｊ系統と交配し、それらの子孫（Ｇ２）においても同様の表現型が得られるかどうかを検討した。Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１から、それぞれ、３９匹、４０匹及び８９匹のＧ２世代マウスを得た。その結果、それぞれ、１６／３９匹、１８／４０匹及び３４／８９匹において、親の歯形態と全く同じ表原型が観察された。すなわち、これらの異常が遺伝性のものであることが確認された。
（２）原因遺伝子のマッピング
全ての個体からＤＮＡを抽出し、全染色体を約１０ｃＭ間隔でカバーできるよう、ＭＩＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｎｐ／ｍｏｕｓｅ／）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＤＢＡ／２Ｊの間に多型のあるＳＮＰマーカー７６個を選び出した。プライマーの塩基配列とＰＣＲの条件設定に関する情報もＭＩＴデータベースから得た。アレル判定のためには、ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用した。
その結果３つの突然変異体全てが、第５染色体のＤ５Ｍｉｔ１１２とＤ５Ｍｉｔ３６１の間にマップされた（図２）。
［実施例２］突然変異の検出
（１）候補遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定
Ｄ５Ｍｉｔ１１２とＤ５Ｍｉｔ３６１の間には、エナメル質構成タンパク質をコードする、アメロブラスチン遺伝子及びエナメリン遺伝子が存在することがすでに知られていた。そこで、Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１のヘテロ接合体において、アメロブラスチン遺伝子及びエナメリン遺伝子の全エクソンの塩基配列決定を行なった。
アメロブラスチンの各エクソンのＰＣＲ増幅には、以下のプライマーを用いた：
第１エクソン
第１エクソン
（２）Ｍ１００５２１の転写産物の解析
３つの突然変異のうち、Ｍ１００５２１のみが異なる表現型を示す。また、この変異のみ変異のタイプが異なる、すなわちアミノ酸の直接変異に寄与するものではない。そこで、Ｍ１００５２１でスプライシング異常が起こっていることを確認するために、ホモ接合体、ヘテロ接合体及び野生型におけるエナメリン遺伝子の逆転者酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析を行なった。
エナメリン遺伝子のＭ１００５２１変異の遺伝子型決定には、アリル特異的なゲノムのＰＣＲを用いた。すなわち、野生型のエナメリン遺伝子の検出には、ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＧ Ｔ（配列番号４３）及びＡＡＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＴＣＣ ＣＴＴ ＡＧＴ ＣＣ（配列番号４４）を、変異型のエナメリン遺伝子（Ｍ１００５２１）の検出には、ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＧ Ａ（配列番号４５）及びＡＡＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＴＣＣ ＣＴＴ ＡＧＴ ＣＣ（配列番号４４）を用いた。総ＲＮＡは成体（８週齢以降）の下顎を手早く摘出した後、突出した骨突起と切歯を切り取り、これを素早くマイクロチューブ内に入れ、チューブごと液体窒素内で凍結した。さらに凍結したまま、マルチビーズショッカー（安井機械）を用いて粉砕した。総ＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、ｃＤＮＡ特異的なＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＰＣＲキットＶｅｒ．１．１（ＴａＫａＲａ）を用いた。ｃＤＮＡの増幅には、第４エクソン内に設定したフォワードプライマーＧＡＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＣ（配列番号４６）、及び、第６、７エクソンの境界をまたぐように設定したリバースプライマＡＴＣ ＡＴＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＴ（配列番号４７）を用いた。
この結果を図４に示す。野生型（＋／＋；レーン１）及びヘテロ接合体（＋／−；レーン２）は１５６ｂｐの位置にバンドを示す。一方、ホモ接合体（−／−；レーン３）は、これにイントロン４の長さを足した２６３ｂｐの位置にバンドを示す。またコントロール用のゲノムＤＮＡからはＰＣＲの増幅は見られなかった（レーン４）。これにより、Ｍ１００５２１でスプライシング異常が起こっていることが確認された。また、ホモ接合体ではこのバンドはかなり薄く、ヘテロ接合体ではほとんど検出出来なかった。これは、野生型アリルから転写されるｍＲＮＡ量に比べてＭ１００５２１変異アリルからの転写産物が極端に少ないことを示す。これは、変異アリルからの転写産物が停止コドンを含むため、ナンセンスｍＲＮＡ分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ）によって分解されていることを示唆する。このＭ１００５２１アリルは機能欠失型のアリルであり、ホモ個体ではエナメル質が完全に欠失した。これはマウス切歯の萌出以前でも観察された。以上の結果から、エナメリン遺伝子は、エナメル形成初期、及び成熟期の両方で機能しており、初期ではエナメル質形成そのものを支配していること、また成熟期ではエナメル質硬度を正常に保つものと考えられた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these examples do not limit the present invention.
[Example 1]
(1) Mutation induction by ENU and detection of enamel formation abnormality Chemical mutagen ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) is 55 to 100 mg / kg at a time, total amount 150 to 250 mg / kg for one week. Mutations were induced by intraperitoneal administration to C57BL / 6J male mice (G0) 2-3 times at intervals. Details on administration of ENU are described on the RIKEN GSC website (http://www.gsc.riken.go.jp/Mouse/). In order to produce G0 offspring (G1), G0 and DBA / 2J female mice were crossed, and the produced G1 was used to screen for tooth morphology.
Tooth morphology screening was performed using the Modified-SHIRPA method (http://www.gsc.riken.go.jp/Mouse/About) modified from the SHIRPA method (Mamm. Genome (1997) 8 (10): 711-713). (Us / screening.htm) was performed using the “observation of tooth morphology under test” (http: //www.gsc.riken.go) listed in item 37 in the phenotypic screening of Us / screening. .Jp / Mouse / About Us / shirpalist.htm).
As a result, abnormal tooth morphology was observed in M100395, M100514, and M100521 of G1 (BD in FIG. 1). Details of these phenotypes are as follows.
M100395 was removed from the enamel portion of the incisor surface (B in FIG. 1). M100514 also gave exactly the same phenotype as M100395 (C in FIG. 1). These are clearly symptoms of hypoplastic type enamel hypoplasia. M100521 had a rough incisor surface, and abnormal wear was observed on the occlusal surface (D in FIG. 1). This indicates that the enamel is softer than normal and is a symptom of hypoplasia type enamel hypoplasia.
The obtained morphologically abnormal mouse was mated with a wild type DBA / 2J strain, and it was examined whether or not a similar phenotype could be obtained in their offspring (G2). From M100395, M100514, and M100521, 39, 40, and 89 G2 generation mice were obtained, respectively. As a result, in each of 16/39 animals, 18/40 animals, and 34/89 animals, the same surface prototype as the parental tooth form was observed. That is, it was confirmed that these abnormalities were hereditary.
(2) Mapping of causative genes To extract DNA from all individuals and cover all chromosomes at intervals of about 10 cM, the MIT database (http://www-genome.wi.mit.edu/snp/mouse/) It was used to select 76 SNP markers with polymorphism between C57BL / 6J and DBA / 2J. Information on the primer base sequence and PCR condition settings was also obtained from the MIT database. A TaqMan MGB probe (Applied Biosystems, USA) was used for allele determination.
As a result, all three mutants were mapped between D5Mit112 and D5Mit361 on chromosome 5 (FIG. 2).
[Example 2] Detection of mutation (1) Determination of DNA sequence of candidate gene It is already known that an ameloblastin gene and an enamelin gene encoding an enamel constituent protein exist between D5Mit112 and D5Mit361. It was. Therefore, in the heterozygotes of M100395, M100514, and M100521, the base sequences of all exons of the ameloblastin gene and enamelin gene were determined.
The following primers were used for PCR amplification of each exon of ameloblastin:
First exon
First exon
(2) Analysis of transcript of M100521 Of the three mutations, only M100521 shows a different phenotype. Also, this mutation differs only in the type of mutation, that is, it does not contribute to the direct mutation of amino acids. Therefore, in order to confirm that splicing abnormality occurred in M100521, reverse enzyme-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis of enamelin gene in homozygote, heterozygote and wild type was performed.
Allele-specific genomic PCR was used for genotyping the M100521 mutation of the enamelin gene. That is, for detection of wild-type enamelin gene, TCT CTG CTG CCA TGC CAGT (SEQ ID NO: 43) and AAT TTT ACC TCC CTT AGT CC (SEQ ID NO: 44) were used for detection of mutant enamelin gene (M100521). TCT CTG CTG CCA TGC CAG A (SEQ ID NO: 45) and AAT TTT ACC TCC CTT AGT CC (SEQ ID NO: 44) were used. Total RNA was obtained by quickly removing the lower jaw of an adult (after 8 weeks of age), then cutting out protruding bone processes and incisors, quickly putting them in a microtube, and freezing the whole tube in liquid nitrogen. Furthermore, it grind | pulverized using the multi bead shocker (Yasui machine), with freezing. TRIzol (registered trademark) reagent (Gibco BRL) was used for extraction of total RNA, and cDNA-specific RT-PCR was performed using mRNA Selective PCR Kit Ver. 1.1 (TaKaRa) was used. For the amplification of cDNA, the forward primer GAT GAG TCT CCT TGT TTT CC (SEQ ID NO: 46) set in the fourth exon and the reverse primer ATC ATT GGT GGG GCA set to cross the boundaries of the sixth and seventh exons were used. TTC AT (SEQ ID NO: 47) was used.
The result is shown in FIG. Wild type (+ / +; lane 1) and heterozygote (+/−; lane 2) show a band at 156 bp. On the other hand, the homozygote (-/-; lane 3) shows a band at a position of 263 bp obtained by adding the length of
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
本発明によれば、エナメリン遺伝子の変異によりエナメル質形成異常を呈するエナメル質形成不全症モデルマウスが提供される。本発明のモデルマウスは、ヒトエナメル質形成不全症の病態を示すため、かかる疾患の病因の究明と病態の解析、遺伝性研究、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニングなどに有用である。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the enamel hypoplasia model mouse which shows an enamel formation abnormality by the variation | mutation of an enamelin gene is provided. Since the model mouse of the present invention shows the pathogenesis of human enamel hypoplasia, the investigation of the etiology of such diseases, analysis of the pathology, genetic studies, the treatment of and / or prevention of enamel hypoplasia. Useful for screening.
配列番号３〜４７：合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 3-47: Synthetic oligonucleotides
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