JP4627912B2

JP4627912B2 - Biosensor

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Publication number: JP4627912B2
Application number: JP2001088176A
Authority: JP
Inventors: 博之徳永; 正次宮崎; 雅樹藤原; 潤子中山; 永吏子山西
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2000-11-09
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2021-03-26
Also published as: JP2002207022A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料中の特定の成分を分析するバイオセンサに関し、特に、バイオセンサの試薬層を構成する試薬構成に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、微生物、酵素、抗体等の生物材料の分子認識能力を利用し、生物材料を分子識別素子として応用したセンサである。すなわち、固定化された生物材料が、目的の特定物質を認識したときに起こる反応、微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光などを利用したものである。
【０００３】
バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、例えば、グルコース、乳酸、コレステロール、ラクトース、尿素、アミノ酸用の酵素センサは、医療計測や食品工業に利用されている。酵素センサは、検体である試料液に含まれる基質と酵素との反応により生成する電子によって電子受容体を還元し、測定装置がその電子受容体の還元量を電気化学的に計測することにより、検体の定量分析を行う。このようなバイオセンサの一例として、例えば、特願平１１−３２４５１１号で提案されたようなセンサが知られている。
【０００４】
図１は、３電極式のバイオセンサの一例を示す分解斜視図である。これは、ポリエチレンテレフタレートのような絶縁性基板１上に、電気伝導性物質からなる測定電極２（作用極とも言う）、対電極３（対極とも言う）ならびに検知電極４が形成されており、これら電極上には試料液中の特定成分と特異的に反応する酵素、及び電子伝達体、親水性高分子を含む試薬層５が形成されている。
【０００５】
そして、試料液中の特定成分と試薬層５中の試薬との反応により生じる電流値を前記電極２、３、４で検出するためのキャビティを形成するため、電極および試薬層上の部分に細長い切り欠け部７を有したスペーサ６と、空気孔９を形成したカバー８とを絶縁基板上に貼りあわせている。
【０００６】
このような構成のバイオセンサにおいて、試料液は、キャビティの入り口（試料液吸引口）から毛細管現象によりキャビティ内に供給され、電極と試薬層のある位置まで導かれる。そして試料液中の特定成分が試薬層の試薬と反応することにより、電流を生じ、生じた電流をバイオセンサのリードを通じて外部の測定装置が読み取ることにより、検体の定量分析が行われる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のような試薬構成のバイオセンサにおいて、熱や水分の介在下、特に、温度が３０℃以上で湿度が８０％以上の高温多湿環境下においては、試薬層５に含まれる酵素蛋白や親水性高分子の一部などと、電子伝達体との還元反応が生じるため、バックグラウンド電流（ノイズ電流）が発生し、経時的にバックグランド電流値が上昇することにより、センサ性能が悪化するという問題が顕著に見られる。
【０００８】
また、これを解決するための手段として、アルミシールや樹脂などの成型容器を用いたバイオセンサ保存容器中に、シリカゲルや活性アルミナのような乾燥剤を封入することによって水分を除去し、センサ性能の悪化を防止するように工夫することができるが、このような乾燥剤だけではバイオセンサに含まれる試薬中に残存する分子レベルの水までを完全に除去することは不可能である。
【０００９】
また、上記保存容器においても、長期間にわたり水分の侵入を皆無（ゼロ）にするのは極めて困難であり、電子伝達体と酵素蛋白、親水性高分子の一部との還元反応は、極微量の水分が介在するだけで進行してしまうため、バックグラウンド電流の経時的な上昇を効果的に抑制することは極めて困難であるという問題点があった。
本発明は、前記問題点に鑑みてなされたものであり、水分との接触によるバイオセンサの性能劣化を効率的に防止することができるバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この発明のバイオセンサは、試料溶液中の特定物質の濃度を計測するバイオセンサにおいて、試料溶液に溶解され、試料溶液中の特定物質と特異的に反応するように予め設けられる試薬層中に糖アルコールを含むことを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記特定物質の濃度を、絶縁性基板上に設けられた少なくとも作用極と対極からなる電極を用いて計測することを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、前記電極上、または当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう，形成され、該試薬層が、少なくとも酵素および電子伝達体を含むことを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記糖アルコールが、鎖状の多価アルコール、もしくは、環式糖アルコール、あるいはそれらの置換体もしくは誘導体であることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記糖アルコールがマルチトール、ラクチトールのいずれか、または両方であることを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明のバイオセンサは、試料溶液中の特定物質の濃度を計測するバイオセンサにおいて、試料溶液に溶解され、試料溶液中の特定物質と特異的に反応するように予め設けられる試薬層中に金属塩を含むことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記特定物質の濃度を、絶縁性基板上に設けられた少なくとも作用極と対極からなる電極を用いて計測することを特徴とするものである。
【００１７】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、前記電極上、または当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう，形成され、該試薬層が、少なくとも酵素および電子伝達体を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記金属塩が硫酸金属塩、硫酸水素金属塩、亜硫酸金属塩、亜硫酸水素金属塩、あるいは次亜硫酸金属塩であることを特徴とするものである。
【００１９】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記金属塩が、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムのいずれかまたは両方であることを特徴とするものである。
【００２０】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記金属塩が硝酸金属塩、硝酸水素金属塩、亜硝酸金属塩、亜硝酸水素金属塩あるいは次亜硝酸金属塩であることを特徴とするものである。
【００２１】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記金属塩が、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムのいずれかまたは両方であることを特徴とするものである。
【００２２】
また、本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、さらに親水性高分子を含むことを特徴とするものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（実施の形態１）
以下に、本発明の実施の形態１によるバイオセンサについて説明する。なお、以下に説明する本発明の各実施の形態では、試料液中の特定物質と特異的に反応する分子識別素子として酵素を用いる酵素センサを例にとって説明することにする。
【００２４】
図１は、３電極方式のバイオセンサの分解斜視図の一例である。図１において、１は絶縁性の基板であり、この絶縁性の基板１上には、電気伝導性物質からなる測定電極２、対電極３、検知電極４がそれぞれ所定の位置、及び形状をもって形成されており、検知電極４は、検体量の不足を検知するための電極として機能するだけでなく、参照電極あるいは対電極の一部として用いることも可能である。
【００２５】
なお、好適な上記絶縁性基板１の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミドなどがある。また、各電極を構成する電気伝導性物質としては、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、あるいは、カーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料があげられる。
【００２６】
なお、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、は、スパッタリング蒸着法などで、またカーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料はスクリーン印刷法などを用いて容易に電気伝導性層を絶縁性基板１に形成することができる。
【００２７】
また、各電極の形成においては、上述したスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などにより絶縁性基板１の全面、もしくは一部に前記電気伝導性層を形成した後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより電極を分割形成することができる。また、あらかじめ電極パターンの形成された印刷版やマスク版を用いたスクリーン印刷法やスパッタリング蒸着法などでも同様に電極を形成することが可能である。
このようにして形成された電極上には、酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び糖アルコールを含む試薬層５が形成される。
【００２８】
本発明の実施の形態１は、試薬層５中に糖アルコールを含むことを特徴とするものであり、この糖アルコールは、電極上に形成された試薬層５中において、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白及び親水性高分子などに存在する反応性に富んだ一部の官能基などと、が接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。
【００２９】
そのため、上述の様な試薬構成のバイオセンサにおいて、熱や水分の介在下、特に温度が３０℃以上で湿度が８０％以上の高温多湿環境下において、試薬層５に含まれる酵素蛋白や親水性高分子の一部などと、電子伝達体との還元反応が生じることにより発生し、経時的に上昇するバックグラウンド電流（ノイズ電流）を抑制することができるため、バイオセンサの性能が悪化することを防ぐことができる。
【００３０】
また、さらには、糖アルコールを試薬層中に含むことにより、血液中、特には血球に存在する様々な共雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性の良好な（回帰式の傾きが大きく切片が小さい）、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、高性能なバイオセンサを提供することができる。
【００３１】
なお、試薬層５中に含まれる前記糖アルコールとしては、ソルビトール、マルチトール、キシリトール、マンニトール、ラクチトール、還元パラチノース、アラビニトール、グリセロール、リビトール、ガラクチトール、セドヘプチトール、ペルセイトール、ボレミトール、スチラシトール、ポリガリトール、イジトール、タリトール、アリトール、イシリトール、還元澱粉糖化物、イシリトールなどの鎖状の多価アルコールや環式糖アルコールがあげられる。
【００３２】
また、これらの糖アルコールの立体異性体、置換体または誘導体であっても同様の効果を得ることができる。
また、これらの糖アルコールの中でも、マルチトール、ラクチトールは比較的材料単価が安く、容易に入手もでき、また、前記バックグラウンド電流を抑制する効果が飛躍的に高いため最も好適な材料であると言える。
【００３３】
なお、これら糖アルコールの添加量は、試薬溶液濃度として０．１〜５００ｍＭが適当であり、より好適には１〜１００ｍＭである。
【００３４】
なお、図１に示すバイオセンサは、その後、このように形成された試薬層５及び電極２、３、４上に、切り欠け部７を有するスペーサ６とカバー８とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキャビティが形成される。
【００３５】
なお、上記スペーサ６およびカバー８の好適な材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロンなどがあげられる。
【００３６】
また、このようなキャビティから構成されたバイオセンサへの試料液供給は毛細管現象により実現されるが、試料液のスムーズな供給を実現するうえでは、キャビティ内にバイオセンサ外部へ空気を逃がすための空気孔９が必要である。
なお、空気孔９の配置は、試料液の供給を妨げない範囲であればキャビティ内のいかなる位置でもよい。
【００３７】
このようにして形成されたバイオセンサにおいて、試料液中の特定成分と、酵素などを含む試薬層５との反応で得られた電流値は、測定電極２、対電極３、検知電極４のそれぞれのリード部１０、１１、１２を通じて接続された外部の測定装置により読み取られる。
【００３８】
（実施の形態２）
以下に、本発明の実施の形態２によるバイオセンサについて説明する。
本発明の実施の形態２によるバイオセンサは、図１で示したバイオセンサの試薬層５が、酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び金属塩により形成されているものである。なお、他の構成要素は、前述した実施の形態１によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。
【００３９】
本発明の実施の形態２は、試薬層５中に金属塩を含むことを特徴とするものであり、この金属塩は、電極上に形成された試薬層５中において、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白、及び親水性高分子などに存在する反応性に富んだ一部の官能基などと、が接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。
【００４０】
そのため、上述の様な試薬構成のバイオセンサにおいて、熱や水分の介在下、特に温度が３０℃以上で湿度が８０％以上の高温多湿環境下において、試薬層５に含まれる酵素蛋白や親水性高分子の一部などと、電子伝達体との還元反応が生じることにより発生し、経時的に上昇するバックグラウンド電流（ノイズ電流）を抑制することができるため、バイオセンサの性能が悪化することを防ぐことができる。
【００４１】
なお、試薬層５に含まれる金属塩としては、硫酸金属塩や硝酸金属塩などが特に効果的であり、例えば、硫酸金属塩、硫酸水素金属塩、亜硫酸金属塩、亜硫酸水素金属塩、あるいは次亜硫酸金属塩としては、硫酸アルミニウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸アンチモン、硫酸インジウム、硫酸ウラニル、硫酸ウラン、硫酸カドミウム、硫酸カリウム、硫酸ガリウム、硫酸カルシウム、硫酸銀、硫酸クロム、硫酸コバルト、硫酸水素カリウム、硫酸ジルコニウム、硫酸水銀、硫酸すず、硫酸ストロンチウム、硫酸セシウム、硫酸セリウム、硫酸タリウム、硫酸チタン、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸ナトリウム、硫酸鉛、硫酸ニッケル、硫酸ネオジム、硫酸バナジウム、硫酸パラジウム、硫酸バリウム、硫酸ビスマス、硫酸プラセオジム、硫酸ベリリウム、硫酸マンガン、硫酸ランタン、硫酸リチウム、硫酸ルビジウム、硫酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムナトリウム、硫酸ウラニルカリウム、硫酸カリウムクロム、硫酸二ナトリウムマグネシウム、硫酸マグネシウム二カリウム、硫酸マンガンセシウム、硫酸ルビジウムアルミニウム、硫酸水素カリウム、硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸カルシウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸バリウム、亜硫酸ビスマス、次亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素ナトリウムなどが、また、硝酸金属塩、硝酸水素金属塩、亜硝酸金属塩、亜硝酸水素金属塩、あるいは次亜硝酸金属塩としては、硝酸アルミニウム、硝酸マグネシウム、硝酸亜鉛、硫酸アンチモン、硝酸イッテルビウム、硝酸イットリウム、硝酸インジウム、硝酸ウラニル、硝酸エルビウム、硝酸カドミウム、硝酸ガドリニウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、硝酸銀、硝酸クロム、硝酸コバルト、硝酸サマリウム、硝酸ジルコニウム、硝酸ジスプロシウム、硝酸水銀、硝酸すず、硝酸ストロンチウム、硝酸セシウム、硝酸セリウム、硝酸タリウム、硝酸鉄、硝酸テルビウム、硝酸銅、硝酸トリウム、硝酸ナトリウム、硝酸鉛、硝酸ニッケル、硝酸ネオジム、硝酸パラジウム、硝酸バリウム、硝酸ビスマス、硝酸プラセオジウム、硝酸ベリリウム、硝酸ホルミウム、硝酸マンガン、硝酸ユウロピウム、硝酸ランタン、硝酸リチウム、硝酸ルテニウム、硝酸ルビジウム、硝酸ロジウム、硝酸タリウム水銀、亜硝酸カリウム、亜硝酸銀、亜硝酸カルシウム、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸コバルトカリウム、亜硝酸コバルトナトリウム、次亜硝酸ナトリウムなどがあげられる。
【００４２】
また、これらの金属塩の中でも、特に硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムは吸湿防止効果が高く好適である。
なお、これら金属塩の添加量は、試薬溶液濃度として０．１〜５００ｍＭが適当であり、より好適には１〜５０ｍＭである。
【００４３】
なお、本発明の実施の形態１、２では、上記試薬層５中に、糖アルコール、金属塩をそれぞれ添加した例を説明したが、さらにはそれらを組み合わせることでも同様の効果が得られる。
また、前記実施の形態１、２の試薬中に含まれる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ウリカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼなどを、電子伝達体としてはフェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体などを用いることができる。
【００４４】
また、本発明の実施の形態１、２では、試薬層５中に親水性高分子を含むものについて説明したが、このように、試薬層５中に親水性高分子を含むことにより、試薬溶液に粘性を持たせ、電極への試薬形成を容易に均質にするとともに、電極と試薬との密着性を高める効果も得られる。さらに、試薬乾燥後の試薬結晶状態も、親水性高分子を含むことでムラなく均質となり、高精度なバイオセンサを作製することが可能になる。
【００４５】
以上のような目的で使用する親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩、アガロースゲルおよびその誘導体などがあげられる。
【００４６】
また、本発明の実施の形態１、２では、前述した試薬層５が、電極上に設けられるものとして説明をしたが、具体的には、電極上の全面もしくは一部に試薬層５を配置することができ、また、それ以外にも、バイオセンサの性能を悪化させることのない範囲内、すなわち、試薬層中の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が設けられるよう，試薬層５を配置してもよい。
【００４７】
【実施例】
（実施例１）
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁基板上に、スパッタリング蒸着により前記絶縁基板の表面全面に約１０ｎｍの厚みのパラジウム薄膜を形成した後、ＹＡＧレーザにより、前記薄膜の一部にスリットを設けることにより、測定電極、対電極、および検知電極に、電極を分割形成した。その上に酵素（グルコースオキシターゼ）、電子伝達体（フェリシアン化カリウム）、親水性高分子（カルボキシメチルセルロース）、および糖アルコールを含んだ水溶液を前記測定電極を中心にして対電極ならびに検知電極の一部を覆うように円状に滴下し、乾燥させることで試薬層を形成した。さらにその上からポリエチレンテレフタレートからなる切欠部を有するスペーサと、同じくポリエチレンテレフタレートからなる空気孔を有するカバーとを貼り合わせることで、血液が導かれる毛細管となるキャビティが形成された３電極方式の血糖値測定センサを作製した。
【００４８】
図２は試薬溶液中に糖アルコールとしてラクチトールを添加した場合のセンサ応答特性を示すものであり、試料液が全血で、ラクチトール濃度を変化させた場合を４種類示すものである。また、図３は同様に糖アルコールとしてマルチトールを添加した場合で、マルチトール濃度を４種類に変化させたセンサの応答特性を示すものである。なお、ここでは糖アルコールの添加濃度（試薬水溶液としての濃度）を０としたものを従来センサとして取り扱い、５、１０、２５、５０ｍＭとしたものを本願のセンサとして用いた。
【００４９】
また、図４はこのようにして作製したセンサを用いて過酷環境下（温度３０℃、湿度８０％での曝露）でのバックグラウンド電流の経時的な変化を測定したものである。試料液としてはグルコースを含まない精製水を用いた。また、図５には試料液としてグルコース濃度が８０ｍｇ／ｄＬに調整された全血を用いた場合の経時的なセンサ応答値の変化を示す。何れの場合も、測定時期は、センサ作製直後（０時間）、作製後６時間、１２時間、２４時間後の、計４ポイントである。
【００５０】
電流測定条件は、試料液がキャビティ内に充填されたのを確認した後、２５秒間酵素反応を促進し、その後、測定電極と対電極および検出電極間に０．２Ｖの電圧を印加し、その５秒後に得られた電流値を測定した。なお、ここでは検知電極も対電極の一部として用いた。
また、測定回数ｎは各濃度および測定時期ごとにｎ＝１０であり、図中にはその平均値をプロットしてある。
【００５１】
先に示した図２から明らかなように、糖アルコールであるラクチトールを添加したセンサ応答特性は、糖アルコールを含まない従来センサに比べ、特にグルコース濃度が４００ｍｇ／ｄＬ以上の高濃度域で高応答値傾向を示しており、回帰式の良好な（切片が小さく傾きの大きい）優れた応答特性が得られていることがわかる。
【００５２】
また、図３から明らかなように、糖アルコールとしてマルチトールを用いた場合にも、前述のラクチトールを用いた場合と同様に、優れた応答特性が得られていることがわかる。
【００５３】
また、図４および図５から明らかなように、これらの糖アルコールの添加されたセンサにおいては、高温高湿度下の曝露環境下でのバックグラウンド電流の増加が効率的に抑制され、センサ応答値の経時的な変化が少ない優れた保存安定性が得られていることがわかる。
【００５４】
（実施例２）
実施例１と同様な手順により血糖値測定センサを作製した。なお、ここでは、バックグラウンド電流の経時的な上昇を抑制するための添加剤として、糖アルコールの代わりに、硫酸金属塩である、硫酸マグネシウムを添加した。
【００５５】
図６はこのようにして作製したセンサを用いて過酷環境下（温度３０℃、湿度８０％での曝露）でのバックグラウンド電流の経時的な変化を測定したものであり、試料液としてはグルコースを含まない精製水を用いた。また、図７には、試料液としてグルコース濃度が８０ｍｇ／ｄＬに調整された全血を用いた場合の経時的なセンサ応答値の変化を示す。
何れの場合も、測定時期はセンサ作製直後（０時間）、作製後６時間、１２時間、２４時間後の、計４ポイントである。
なお、電流測定条件および測定回数ｎは、実施例１と同様である。
【００５６】
図６および図７から明らかなように、硫酸金属塩の添加されたセンサにおいても、実施例１の糖アルコールと同様に、高温高湿度下の曝露環境下でのバックグラウンド電流の増加が抑制され、センサ応答値の経時的な変化が少ない優れた保存安定性が得られていることがわかる。
【００５７】
なお、前記実施例１、２は血液中のグルコース濃度を測定するバイオセンサについて示したが、測定対象とする試料液、物質、およびバイオセンサの形式はこれに限定されるものではなく、例えば、対象試料液としては血液以外にも生体試料液として唾液、細胞間質液、尿や汗などを、また、食品や飲料水などをも用いることができる。また、対象物質としては、グルコース以外にも乳酸、コレステロール、尿酸、アスコルビン酸、ビリルビンなどを用いることができる。また、前記実施例１、２においては、電流測定方式として、図１で示した、測定電極２、対電極３、検知電極４からなる３電極方式を用いたが、その他、測定電極、対電極のみからなる２電極方式などがあり、何れの方式を用いてもよい。なお、３電極方式の方が２電極方式より正確な測定が可能である。
【００５８】
また、本実施例では、バイオセンサとして酵素センサを例に挙げて説明したが、本発明は、試料液中の特定物質と特異的に反応する分子識別素子として酵素以外に抗体、微生物、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを利用するバイオセンサにも、同様に適応することができる。
【００５９】
【発明の効果】
以上のように、本発明のバイオセンサによれば、絶縁性基板上に設けられた少なくとも測定電極と対電極からなる電極を用い、試料液中の測定対象物質と、上記電極上、またはその近傍に形成された少なくとも酵素、及び電子伝達体からなる試薬層との反応により得られる電流値から、該測定対象物質の含有量を計測するバイオセンサにおいて、上記試薬層中に糖アルコールを含むものとしたので、試薬中に糖アルコールを添加するという簡易な手法を用いることで酵素反応等を阻害することなく、経時的なバックグラウンド電流の上昇を抑制することができ、さらには、血液中に存在する様々な共雑物質との不必要な反応も併せて抑制できるため、直線性の良好な、センサ個々のバラツキが少ない高性能なバイオセンサを提供することができるという効果が得られる。
【００６０】
また、本発明のバイオセンサによれば、絶縁性基板上に設けられた少なくとも測定電極と対電極からなる電極を用い、試料液中の測定対象物質と、上記電極上、またはその近傍に形成された少なくとも酵素、及び電子伝達体からなる試薬層との反応により得られる電流値から、該測定対象物質の含有量を計測するバイオセンサにおいて、上記試薬層中に金属塩を含むものとしたので、試薬中に金属塩を添加するという簡易な手法を用いることで、酵素反応等を阻害することなく、経時的なバックグラウンド電流の上昇を抑制することができるという効果が得られる。
【００６１】
また、本発明のバイオセンサによれば、上記試薬層に親水性高分子を含むものとしたので、親水性高分子を含むことで電極面への均質な試薬形成を容易にし、試薬層内において各々の物質が均質な分散状態になることを促進することができる。また、均質な試薬形成を実現できることにより、センサ個々のバラツキが少ない高性能なバイオセンサを提供することができるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バイオセンサの分解斜視図の一例である。
【図２】実施例１において、試薬溶液中に糖アルコールとしてラクチトールを添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。
【図３】実施例１において、試薬溶液中に糖アルコールとしてマルチトールを添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。
【図４】実施例１において、試料液として精製水を用いた場合の過酷環境下でのバックグラウンド電流の上昇を示す図である。
【図５】実施例１において、試料液として全血を用いた場合の過酷環境下での全血応答値の上昇を示す図である。
【図６】実施例２において、試料液として精製水を用いた場合の過酷環境下でのバックグラウンド電流の上昇を示す図である。
【図７】実施例２において、試料液として全血を用いた場合の過酷環境下での全血応答値の上昇を示す図である。
【符号の説明】
１絶縁性基板
２測定電極
３対電極
４検知電極
５試薬層
６スペーサ
７切り欠け部
８カバー
９空気孔
１０リード（測定電極）
１１リード（対電極）
１２リード（検知電極）[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a biosensor that analyzes a specific component in a liquid sample, and particularly to a reagent configuration that constitutes a reagent layer of the biosensor.
[0002]
[Prior art]
A biosensor is a sensor that utilizes the molecular recognition ability of biological materials such as microorganisms, enzymes, and antibodies, and applies the biological material as a molecular identification element. That is, the immobilized biological material utilizes a reaction that occurs when a specific target substance is recognized, oxygen consumption due to respiration of microorganisms, an enzymatic reaction, luminescence, and the like.
[0003]
Among biosensors, enzyme sensors are being put to practical use. For example, enzyme sensors for glucose, lactic acid, cholesterol, lactose, urea, and amino acids are used in medical measurement and the food industry. The enzyme sensor reduces the electron acceptor by electrons generated by the reaction between the substrate and the enzyme contained in the sample liquid that is the specimen, and the measurement device electrochemically measures the reduction amount of the electron acceptor, Perform quantitative analysis of specimens. As an example of such a biosensor, for example, a sensor as proposed in Japanese Patent Application No. 11-324511 is known.
[0004]
FIG. 1 is an exploded perspective view showing an example of a three-electrode biosensor. This is because a measurement electrode 2 (also called a working electrode), a counter electrode 3 (also called a counter electrode) and a detection electrode 4 made of an electrically conductive substance are formed on an insulating substrate 1 such as polyethylene terephthalate. On the electrode, a reagent layer 5 containing an enzyme that specifically reacts with a specific component in the sample solution, an electron carrier, and a hydrophilic polymer is formed.
[0005]
And in order to form the cavity for detecting the electric current value which arises by reaction with the specific component in a sample liquid, and the reagent in the reagent layer 5 by the said electrodes 2, 3, and 4, it is long in the part on an electrode and a reagent layer. A spacer 6 having a notch 7 and a cover 8 in which air holes 9 are formed are bonded to an insulating substrate.
[0006]
In the biosensor having such a configuration, the sample solution is supplied into the cavity by capillary action from the entrance (sample solution suction port) of the cavity and guided to a position where the electrode and the reagent layer are located. A specific component in the sample solution reacts with the reagent in the reagent layer to generate an electric current, and the generated electric current is read by an external measuring device through the lead of the biosensor, whereby the sample is quantitatively analyzed.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the biosensor having the reagent structure as described above, in the presence of heat or moisture, particularly in a high temperature and high humidity environment where the temperature is 30 ° C. or higher and the humidity is 80% or higher, the enzyme protein contained in the reagent layer 5 Since a reduction reaction between a part of the hydrophilic polymer and the electron carrier occurs, a background current (noise current) is generated, and the background current value increases with time, thereby deteriorating the sensor performance. The problem is noticeable.
[0008]
In addition, as a means to solve this, moisture is removed by encapsulating a desiccant such as silica gel or activated alumina in a biosensor storage container using a molded container such as an aluminum seal or resin, and sensor performance Although it is possible to devise so as to prevent the deterioration of the water, it is impossible to completely remove even the water at the molecular level remaining in the reagent contained in the biosensor with such a desiccant alone.
[0009]
Also, in the above storage container, it is extremely difficult to eliminate moisture (zero) over a long period of time, and the reduction reaction between the electron carrier, the enzyme protein, and a part of the hydrophilic polymer is extremely small. However, there is a problem that it is extremely difficult to effectively suppress the increase of the background current over time.
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a biosensor that can efficiently prevent performance degradation of the biosensor due to contact with moisture.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
This invention No ba The Io sensor is a biosensor that measures the concentration of a specific substance in a sample solution, and contains a sugar alcohol in a reagent layer that is dissolved in the sample solution and previously provided to specifically react with the specific substance in the sample solution. It is characterized by.
[0011]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the concentration of the specific substance is measured using an electrode that is provided on an insulating substrate and includes at least a working electrode and a counter electrode.
[0012]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the reagent layer is formed such that the electrode is disposed on the electrode or in a diffusion area where the reagent of the reagent layer dissolves and diffuses in the sample solution, and the reagent layer includes at least an enzyme and An electron carrier is included.
[0013]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the sugar alcohol is a chain polyhydric alcohol, a cyclic sugar alcohol, or a substituted or derivative thereof.
[0014]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the sugar alcohol is maltitol, lactitol, or both.
[0015]
In addition, the present invention No ba The Io sensor is a biosensor that measures the concentration of a specific substance in a sample solution, and is dissolved in the sample solution and contains a metal salt in a reagent layer that is provided in advance so as to specifically react with the specific substance in the sample solution. It is characterized by.
[0016]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the concentration of the specific substance is measured using an electrode that is provided on an insulating substrate and includes at least a working electrode and a counter electrode.
[0017]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the reagent layer is formed such that the electrode is disposed on the electrode or in a diffusion area where the reagent of the reagent layer dissolves and diffuses in the sample solution, and the reagent layer includes at least an enzyme and An electron carrier is included.
[0018]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the metal salt is a metal sulfate, metal bisulfate, metal sulfite, metal bisulfite, or metal hyposulfite.
[0019]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the metal salt is any one or both of magnesium sulfate and calcium sulfate.
[0020]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the metal salt is a metal nitrate, metal hydrogen nitrate, metal nitrite, metal hydrogen nitrite, or metal metal hyponitrite.
[0021]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the metal salt is one or both of magnesium nitrate and calcium nitrate.
[0022]
In addition, the present invention No ba Io sensor Above In the biosensor, the reagent layer further includes a hydrophilic polymer.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Embodiment 1)
The biosensor according to Embodiment 1 of the present invention will be described below. In each embodiment of the present invention described below, an enzyme sensor using an enzyme as a molecular identification element that specifically reacts with a specific substance in a sample solution will be described as an example.
[0024]
FIG. 1 is an example of an exploded perspective view of a three-electrode biosensor. In FIG. 1, reference numeral 1 denotes an insulating substrate. On this insulating substrate 1, a measurement electrode 2, a counter electrode 3, and a detection electrode 4 made of an electrically conductive material are formed with predetermined positions and shapes, respectively. Thus, the detection electrode 4 not only functions as an electrode for detecting the shortage of the sample amount, but can also be used as a part of the reference electrode or the counter electrode.
[0025]
Suitable materials for the insulating substrate 1 include polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, and the like. Examples of the electrically conductive substance constituting each electrode include noble metals such as gold, platinum and palladium, and simple materials such as carbon, or composite materials such as carbon paste and noble metal paste.
[0026]
In addition, simple materials such as gold, platinum, palladium, and other precious metals and carbon are easily deposited by sputtering, and composite materials such as carbon paste and precious metal paste can be easily formed by screen printing. It can be formed on the insulating substrate 1.
[0027]
In forming each electrode, after forming the electrically conductive layer on the entire surface or a part of the insulating substrate 1 by the above-described sputtering deposition method or screen printing method, a slit is provided using a laser or the like. Thus, the electrodes can be divided and formed. Further, the electrodes can be similarly formed by a screen printing method or a sputtering deposition method using a printing plate or a mask plate on which an electrode pattern is formed in advance.
A reagent layer 5 containing an enzyme, an electron carrier, a hydrophilic polymer, and a sugar alcohol is formed on the electrode thus formed.
[0028]
Embodiment 1 of the present invention is characterized in that a sugar alcohol is contained in the reagent layer 5, and this sugar alcohol is oxidized in the reagent layer 5 formed on the electrode. And a part of the functional group having high reactivity present in the enzyme protein and hydrophilic polymer contained in the reagent, and the electron carrier is denatured from an oxidized form to a reduced form (reduction) It has a function to suppress that).
[0029]
Therefore, in the biosensor having the reagent structure as described above, the enzyme protein or hydrophilicity contained in the reagent layer 5 is present under the presence of heat or moisture, particularly in a high temperature and high humidity environment where the temperature is 30 ° C. or higher and the humidity is 80% or higher. Biosensor performance deteriorates because the background current (noise current) that occurs due to a reduction reaction between a part of the polymer and the electron carrier occurs and can be suppressed over time. Can be prevented.
[0030]
Furthermore, since sugar alcohol is contained in the reagent layer, unnecessary reactions with various concomitant substances present in blood, particularly blood cells, can also be suppressed. It is possible to provide a high-performance biosensor that is favorable (the slope of the regression equation is large and the intercept is small) and that there is little variation among sensors.
[0031]
The sugar alcohol contained in the reagent layer 5 includes sorbitol, maltitol, xylitol, mannitol, lactitol, reduced palatinose, arabinitol, glycerol, ribitol, galactitol, sedheptitol, perseitol, boremitol, suffler, polygalitol, Examples thereof include chain polyhydric alcohols and cyclic sugar alcohols such as iditol, taritol, allitol, isilitol, reduced starch saccharified product, and isilitol.
[0032]
Moreover, the same effect can be acquired even if it is the stereoisomer of these sugar alcohol, a substituted body, or a derivative.
Among these sugar alcohols, maltitol and lactitol are the most suitable materials because they are relatively inexpensive and easily available, and the effect of suppressing the background current is remarkably high. I can say that.
[0033]
In addition, 0.1-500 mM is suitable for the addition amount of these sugar alcohol as a reagent solution concentration, More preferably, it is 1-100 mM.
[0034]
The biosensor shown in FIG. 1 is a sample obtained by bonding a spacer 6 having a notch 7 and a cover 8 on the reagent layer 5 and the electrodes 2, 3, 4 thus formed. A cavity to which liquid is supplied is formed.
[0035]
Suitable materials for the spacer 6 and the cover 8 include polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, polybutylene terephthalate, polyamide, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, nylon and the like.
[0036]
In addition, sample liquid supply to a biosensor composed of such cavities is realized by capillary action, but in order to achieve a smooth supply of sample liquid, it is necessary to allow air to escape outside the biosensor in the cavity. Air holes 9 are required.
The air holes 9 may be arranged at any position within the cavity as long as the supply of the sample liquid is not hindered.
[0037]
In the biosensor formed in this way, the current values obtained by the reaction between the specific component in the sample solution and the reagent layer 5 containing an enzyme or the like are the values of the measurement electrode 2, the counter electrode 3, and the detection electrode 4, respectively. Are read by an external measuring device connected through the lead portions 10, 11, and 12.
[0038]
(Embodiment 2)
Hereinafter, a biosensor according to the second embodiment of the present invention will be described.
In the biosensor according to Embodiment 2 of the present invention, the reagent layer 5 of the biosensor shown in FIG. 1 is formed of an enzyme, an electron carrier, a hydrophilic polymer, and a metal salt. The other constituent elements are the same as those of the biosensor according to the first embodiment described above, and the description thereof is omitted.
[0039]
Embodiment 2 of the present invention is characterized in that the reagent layer 5 contains a metal salt, and this metal salt is an oxidized electron carrier in the reagent layer 5 formed on the electrode. And the enzyme protein contained in the reagent, and a part of the reactive functional group present in the hydrophilic polymer, etc., and the electron carrier is denatured from the oxidized form to the reduced form ( (Reduced).
[0040]
Therefore, in the biosensor having the reagent structure as described above, the enzyme protein or hydrophilicity contained in the reagent layer 5 is present under the presence of heat or moisture, particularly in a high temperature and high humidity environment where the temperature is 30 ° C. or higher and the humidity is 80% or higher. Biosensor performance deteriorates because the background current (noise current) that occurs due to a reduction reaction between a part of the polymer and the electron carrier occurs and can be suppressed over time. Can be prevented.
[0041]
The metal salt contained in the reagent layer 5 is particularly effective as a metal sulfate, metal nitrate or the like. For example, metal sulfate, metal hydrogensulfate, metal sulfite, metal hydrogensulfite, Metal sulfites include aluminum sulfate, magnesium sulfate, zinc sulfate, antimony sulfate, indium sulfate, uranyl sulfate, uranium sulfate, cadmium sulfate, potassium sulfate, gallium sulfate, calcium sulfate, silver sulfate, chromium sulfate, cobalt sulfate, hydrogen sulfate Potassium, zirconium sulfate, mercury sulfate, tin sulfate, strontium sulfate, cesium sulfate, cerium sulfate, thallium sulfate, titanium sulfate, iron sulfate, copper sulfate, sodium sulfate, lead sulfate, nickel sulfate, neodymium sulfate, vanadium sulfate, palladium sulfate, Barium sulfate, bismuth sulfate, praseodymium sulfate, Lithium, manganese sulfate, lanthanum sulfate, lithium sulfate, rubidium sulfate, potassium aluminum sulfate, sodium aluminum sulfate, uranyl potassium sulfate, chromium chromium sulfate, disodium magnesium sulfate, magnesium dipotassium sulfate, manganese cesium sulfate, rubidium aluminum sulfate, hydrogen sulfate Potassium, sodium bisulfate, potassium sulfite, calcium sulfite, sodium sulfite, barium sulfite, bismuth sulfite, sodium hyposulfite, potassium bisulfite, sodium bisulfite, etc. Also, metal nitrate, metal hydrogen nitrate, metal nitrite Metal nitrates of hydrogen nitrite or hyponitrite include aluminum nitrate, magnesium nitrate, zinc nitrate, antimony sulfate, ytterbium nitrate, yttrium nitrate, Palladium, uranyl nitrate, erbium nitrate, cadmium nitrate, gadolinium nitrate, potassium nitrate, calcium nitrate, silver nitrate, chromium nitrate, cobalt nitrate, samarium nitrate, zirconium nitrate, dysprosium nitrate, mercury nitrate, tin nitrate, strontium nitrate, cesium nitrate, cerium nitrate , Thallium nitrate, iron nitrate, terbium nitrate, copper nitrate, thorium nitrate, sodium nitrate, lead nitrate, nickel nitrate, neodymium nitrate, palladium nitrate, barium nitrate, bismuth nitrate, praseodymium nitrate, beryllium nitrate, holmium nitrate, manganese nitrate, nitric acid Europium, lanthanum nitrate, lithium nitrate, ruthenium nitrate, rubidium nitrate, rhodium nitrate, thallium mercury nitrate, potassium nitrite, silver nitrite, calcium nitrite, sodium nitrite, cobalt nitrite Examples include potassium, sodium cobalt nitrite, and sodium hyponitrite.
[0042]
Among these metal salts, magnesium sulfate, calcium sulfate, magnesium nitrate, and calcium nitrate are particularly suitable because of their high moisture absorption preventing effect.
In addition, 0.1-500 mM is suitable for the addition amount of these metal salts as a reagent solution concentration, More preferably, it is 1-50 mM.
[0043]
In Embodiments 1 and 2 of the present invention, an example in which sugar alcohol and metal salt are added to the reagent layer 5 has been described, but the same effect can be obtained by combining them.
The enzymes contained in the reagents of the first and second embodiments include glucose oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, uricase, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, and the like. As the body, potassium ferricyanide, p-benzoquinone and derivatives thereof, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and derivatives thereof can be used.
[0044]
In the first and second embodiments of the present invention, the reagent layer 5 containing a hydrophilic polymer has been described. As described above, the reagent layer 5 contains a hydrophilic polymer, whereby a reagent solution is obtained. In addition, it is possible to obtain an effect that makes the formation of the reagent on the electrode uniform and makes the formation of the reagent on the electrode easy, and improves the adhesion between the electrode and the reagent. Furthermore, the reagent crystal state after the reagent is dried also becomes uniform by including a hydrophilic polymer, and a highly accurate biosensor can be manufactured.
[0045]
Examples of the hydrophilic polymer used for the purpose as described above include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, carboxymethylethylcellulose, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polylysine and the like. Polystyrene sulfonic acid, gelatin and derivatives thereof, acrylic acid and salts thereof, methacrylic acid and salts thereof, starch and derivatives thereof, maleic anhydride and salts thereof, agarose gel and derivatives thereof, and the like.
[0046]
In the first and second embodiments of the present invention, the above-described reagent layer 5 is described as being provided on the electrode. Specifically, the reagent layer 5 is disposed on the entire surface or a part of the electrode. In addition, the electrodes may be provided in a range where the performance of the biosensor is not deteriorated, that is, in a diffusion area where the reagent in the reagent layer is dissolved and diffused in the sample solution. The reagent layer 5 may be disposed.
[0047]
【Example】
Example 1
On the insulating substrate made of polyethylene terephthalate, a palladium thin film having a thickness of about 10 nm is formed on the entire surface of the insulating substrate by sputtering vapor deposition, and then a measuring electrode is formed by providing a slit in a part of the thin film with a YAG laser. Electrodes were divided and formed on the counter electrode and the detection electrode. An aqueous solution containing an enzyme (glucose oxidase), an electron carrier (potassium ferricyanide), a hydrophilic polymer (carboxymethylcellulose), and a sugar alcohol is placed on the counter electrode and a part of the detection electrode. A reagent layer was formed by dropping in a circle so as to cover and drying. Furthermore, a blood glucose level of a three-electrode system in which a cavity serving as a capillary tube through which blood is guided is formed by bonding a spacer having a notch made of polyethylene terephthalate and a cover having an air hole made of polyethylene terephthalate from above. A measurement sensor was produced.
[0048]
FIG. 2 shows sensor response characteristics when lactitol is added as a sugar alcohol to the reagent solution, and shows four types of cases where the sample liquid is whole blood and the lactitol concentration is changed. FIG. 3 shows the response characteristics of a sensor in which maltitol was similarly added as a sugar alcohol and the maltitol concentration was changed to four types. In addition, the thing which made the addition density | concentration (concentration as reagent aqueous solution) of sugar alcohol 0 here was handled as a conventional sensor, and what was set to 5, 10, 25, 50 mM was used as a sensor of this application.
[0049]
FIG. 4 shows the measurement of changes in the background current over time in a harsh environment (exposure at a temperature of 30 ° C. and a humidity of 80%) using the sensor thus prepared. As the sample solution, purified water containing no glucose was used. FIG. 5 shows changes in sensor response values over time when whole blood whose glucose concentration is adjusted to 80 mg / dL is used as a sample solution. In any case, the measurement time is 4 points in total, immediately after sensor production (0 hour), 6 hours, 12 hours, and 24 hours after production.
[0050]
The current measurement condition was that after confirming that the sample liquid was filled in the cavity, the enzyme reaction was promoted for 25 seconds, and then a voltage of 0.2 V was applied between the measurement electrode, the counter electrode, and the detection electrode. The current value obtained after 5 seconds was measured. Here, the detection electrode was also used as a part of the counter electrode.
Further, the number n of times of measurement is n = 10 for each concentration and measurement time, and the average value is plotted in the figure.
[0051]
As is apparent from FIG. 2 described above, the sensor response characteristics with the addition of lactitol, which is a sugar alcohol, show a high response particularly in a high concentration region where the glucose concentration is 400 mg / dL or higher compared to a conventional sensor not containing a sugar alcohol. The value tendency is shown, and it can be seen that an excellent response characteristic with a good regression equation (small intercept and large slope) is obtained.
[0052]
Further, as is apparent from FIG. 3, when maltitol is used as the sugar alcohol, excellent response characteristics are obtained as in the case where lactitol is used.
[0053]
Further, as apparent from FIGS. 4 and 5, in the sensor to which these sugar alcohols are added, an increase in background current in an exposure environment under high temperature and high humidity is efficiently suppressed, and the sensor response value It can be seen that excellent storage stability with little change over time is obtained.
[0054]
(Example 2)
A blood glucose level measurement sensor was produced by the same procedure as in Example 1. In this case, magnesium sulfate, which is a metal sulfate, was added instead of sugar alcohol as an additive for suppressing an increase in background current over time.
[0055]
FIG. 6 shows the measurement of changes over time in the background current in a harsh environment (exposure at a temperature of 30 ° C. and a humidity of 80%) using the sensor thus prepared. Purified water containing no was used. FIG. 7 shows changes in sensor response values over time when whole blood whose glucose concentration is adjusted to 80 mg / dL is used as the sample solution.
In any case, the measurement time is 4 points in total, immediately after sensor production (0 hour), 6 hours, 12 hours, and 24 hours after production.
The current measurement conditions and the number of measurements n are the same as in Example 1.
[0056]
As is apparent from FIGS. 6 and 7, in the sensor to which the metal sulfate salt was added, as in the case of the sugar alcohol of Example 1, an increase in background current in an exposure environment under high temperature and high humidity was suppressed. It can be seen that excellent storage stability with little change in the sensor response value over time is obtained.
[0057]
In addition, although the said Example 1, 2 showed about the biosensor which measures the glucose level in blood, the format of the sample liquid, substance, and biosensor used as a measuring object is not limited to this, For example, In addition to blood, saliva, cell interstitial fluid, urine, sweat, and the like, and food and drinking water can be used as the target sample solution. In addition to glucose, lactic acid, cholesterol, uric acid, ascorbic acid, bilirubin, and the like can be used as the target substance. In the first and second embodiments, the three-electrode method including the measurement electrode 2, the counter electrode 3, and the detection electrode 4 shown in FIG. 1 is used as the current measurement method. There is a two-electrode system consisting of only, and any system may be used. Note that the three-electrode method can measure more accurately than the two-electrode method.
[0058]
Further, in this example, an enzyme sensor is described as an example of a biosensor. However, the present invention is not limited to an enzyme as a molecular identification element that specifically reacts with a specific substance in a sample solution. The present invention can be similarly applied to a biosensor using RNA or the like.
[0059]
【The invention's effect】
As described above, according to the biosensor of the present invention, an electrode composed of at least a measurement electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate is used, and the substance to be measured in the sample liquid is placed on or near the electrode. In the biosensor for measuring the content of the substance to be measured from the current value obtained by the reaction with at least the enzyme formed on the reagent layer and the electron carrier, the sugar reagent contains sugar alcohol in the reagent layer Therefore, by using a simple method of adding sugar alcohol to the reagent, it is possible to suppress an increase in background current over time without inhibiting the enzyme reaction, etc. In addition, unnecessary reactions with various co-contaminating substances can be suppressed at the same time, so it is possible to provide a high-performance biosensor with good linearity and little sensor variation. The effect is obtained that that.
[0060]
Further, according to the biosensor of the present invention, an electrode composed of at least a measurement electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate is used, and the substance to be measured in the sample liquid is formed on or near the electrode. In addition, in the biosensor for measuring the content of the substance to be measured from the current value obtained by the reaction with the reagent layer consisting of at least an enzyme and an electron carrier, the reagent layer contains a metal salt. By using a simple method of adding a metal salt to the reagent, an effect of suppressing an increase in background current over time can be obtained without inhibiting an enzyme reaction or the like.
[0061]
Further, according to the biosensor of the present invention, since the reagent layer contains a hydrophilic polymer, the inclusion of the hydrophilic polymer facilitates the formation of a homogeneous reagent on the electrode surface. Each substance can be promoted to be in a homogeneous dispersion state. In addition, since the formation of a homogeneous reagent can be realized, an effect of providing a high-performance biosensor with little variation among sensors can be obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an example of an exploded perspective view of a biosensor.
FIG. 2 is a graph showing sensor response characteristics when lactitol is added as a sugar alcohol to a reagent solution in Example 1.
3 is a graph showing sensor response characteristics when maltitol is added as a sugar alcohol to a reagent solution in Example 1. FIG.
4 is a graph showing an increase in background current in a harsh environment when purified water is used as a sample solution in Example 1. FIG.
FIG. 5 is a graph showing an increase in whole blood response value in a harsh environment when whole blood is used as a sample solution in Example 1.
6 is a graph showing an increase in background current in a harsh environment when purified water is used as a sample solution in Example 2. FIG.
7 is a graph showing an increase in whole blood response value under a severe environment when whole blood is used as a sample solution in Example 2. FIG.
[Explanation of symbols]
1 Insulating substrate
2 Measuring electrode
3 Counter electrode
4 detection electrodes
5 Reagent layer
6 Spacer
7 Notch
8 Cover
9 Air hole
10 Lead (measuring electrode)
11 Lead (counter electrode)
12 Lead (detection electrode)

Claims

In a biosensor comprising an electrode comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and a reagent layer containing at least an enzyme and an electron carrier, and measuring the concentration of a specific substance in a sample solution,
The reagent layer may further be maltitol, xylitol, reduced palatinose, arabinitol, galactitol, sedoheptitol, perseitol, boremitol, sfurtaitol, polygalitol, iditol, thalitol, allitol, isilitol, reduced starch saccharified product, or A biosensor comprising a combination of sugar alcohols.

The biosensor according to claim 1 , wherein
Biosensor wherein the reagent layer is a reagent of the upper electrode, or the reagent layer so that the electrodes are disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, which is formed, characterized the Turkey.

In a biosensor comprising an electrode comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and a reagent layer containing at least an enzyme and an electron carrier, and measuring the concentration of a specific substance in a sample solution,
The reagent layer further sulfuric acid zinc, potassium sulfate, potassium hydrogen sulfate, copper sulfate, sodium sulfate, lead sulfate, nickel sulfate, potassium aluminum sulfate, sodium aluminum sulfate, potassium hydrogen sulfate, sodium hydrogen sulfate, potassium sulfite, sodium sulfite, sodium hyposulfite, potassium bisulfite, sodium bisulfite, nitric acid, zinc, potassium nitrate acid, copper nitrate, sodium nitrate, lead nitrate, nickel nitrate, potassium nitrite, sodium nitrite, either nitroxyl sodium, A biosensor comprising a metal salt that is a combination thereof.

The biosensor according to claim 3 , wherein
Biosensor wherein the reagent layer is a reagent of the upper electrode, or the reagent layer so that the electrodes are disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, which is formed, characterized the Turkey.

The biosensor according to any one of claims 1 to 4 ,
The biosensor, wherein the reagent layer further contains a hydrophilic polymer.