JP4626938B2 - Test tool and measuring method - Google Patents
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Description
本発明は、血球分離可能な血液滴下部を有し、血液中の特定成分について、診療の現場で迅速、簡便、安価に精度良く測定ができる試験用具及び測定方法に関する。さらに、具体的には血液中の糖化アルブミンを、迅速、簡便、安価に精度良く測定できる試験用具及び測定方法に関する。 The present invention relates to a test tool and a measurement method that have a blood dropping part that can separate blood cells and that can measure a specific component in blood accurately, quickly, simply, and inexpensively at a medical site. More specifically, the present invention relates to a test tool and a measurement method capable of measuring glycated albumin in blood accurately, quickly, simply and inexpensively.
糖尿病の診断、管理及び予防を行う上で、糖化タンパク質の測定は非常に重要である。中でも糖化ヘモグロビン及び糖化アルブミンは、血糖コントロール状態を正確に反映することから、臨床の現場でなくてはならない指標として多用されている。これらの糖化タンパク質の定量法としては、通常電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法、免疫法及び酵素法が知られている。近年では、大量の検体を迅速、正確、かつ、安価に測定できることから酵素法が多用され始めている。酵素法としては糖化たんぱく質に存在するケトアミンを測定する方法がもっとも多く用いられており、本発明者等もケトアミンオキシダーゼを用いた糖化アルブミンの測定方法を開発してきた（特許文献１、２、３、非特許文献１）。
In the diagnosis, management and prevention of diabetes, measurement of glycated protein is very important. Among them, glycated hemoglobin and glycated albumin are frequently used as indicators that must be used in clinical practice because they accurately reflect the blood glucose control state. As quantification methods for these glycated proteins, electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, immunization, and enzymatic methods are generally known. In recent years, enzymatic methods have begun to be widely used because a large amount of specimens can be measured quickly, accurately, and inexpensively. As an enzymatic method, a method for measuring ketoamine present in a glycated protein is most often used, and the present inventors have also developed a method for measuring glycated albumin using ketoamine oxidase (
これまで知られている糖化アルブミン中のケトアミンを測定する方法は、大型の生化学自動分析計を用いた方法が主流である。しかし、生化学自動分析装置は高価であり、少量の検体しか分析する必要のない診療所や中小規模の病院で使用することは困難であった。更に、糖化アルブミンの測定は、検体が血漿、血清であるため、診療現場では、測定前に、採取した血液から遠心分離等の血球分離作業が必要となり、同様に困難であった。
そこで診療現場では安価、かつ、簡便に糖化アルブミンを測定する試験用具が望まれてきたが、これまで糖化アルブミンの酵素法を用い、全血を検体とし、試験用具内で血漿、血清を分離した試験用具は知られていない。
Therefore, there has been a demand for a test tool that can measure glycated albumin easily and inexpensively in clinical practice. So far, the enzyme method of glycated albumin has been used to separate whole blood and serum from the test tool using the glycated albumin enzyme method. No test equipment is known.
本発明は、血液中の特定成分について、診療の現場で迅速、簡便、安価に精度良く測定ができる試験用具、測定方法を提供することを目的としたものであり、さらに具体的には、血球分離可能な血液滴下部を有し血液中の糖化アルブミンを、測定できる試験用具、測定方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a test tool and a measurement method capable of measuring a specific component in blood quickly, simply, inexpensively and with high accuracy, and more specifically, a blood cell. An object of the present invention is to provide a test tool and a measurement method that have a separable blood dropping part and can measure glycated albumin in blood.
血球を分離する方法として、遠心分離操作以外では、血球分離膜を用いる方法がある。一般的な血球分離膜は、加圧あるいは減圧など外部から何らかの力を加えないと血漿が膜を通過しない。本発明者らの検討によると、膜に全血を載せただけでは全く血漿成分が得られないことが分かった。吸引装置を用いるなどすれば膜を通過するのは明らかであるが、これは装置の大型化、複雑化を招き、診療の現場で簡便に扱える装置にすることは困難である。
そこで本発明者らは、前記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、血球分離可能な血液滴下部と試験片を毛細管で連結することにより、毛細管力により簡便に血漿成分が分離され、血漿成分が試験片へと導かれることを見出した。更に本発明者らは、酵素／試薬を保持した試験片により血漿中の特定成分を検出できること、試験片上の反応は加熱冷却により制御できること、試験片上をカバーすることにより検体や試薬の蒸発、吸湿を防ぐこと、毛細管力に寄与している通気孔が試験片への検体量の制御機構にも使えること、試験片の発色は白色の光学反射層を利用した反射光の測定により簡便に行えることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）血液中の特定成分を測定可能な試験片を備えた試験用具であって、試験片と毛細管で連結した血球分離可能部を有することを特徴とする試験用具。
（２）試験片が、血液中の特定成分と反応する酵素を含むことを特徴とする上記（１）に記載の試験用具。
（３）血液中の特定成分と反応する酵素は、糖化アルブミンと反応する酵素であることを特徴とする上記（２）に記載の試験用具。
（４）糖化アルブミンと反応する酵素がプロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素である上記３に記載の試験用具。
（５）試験片を複数有し、少なくとも、糖化アルブミンと反応する酵素を含む試験片と、アルブミンと反応する試薬を含む試験片とを備えている上記（１）又は（２）に記載の試験用具。
（６）さらに、糖化アミノ酸を含む試験片を備えている上記（５）に記載の試験用具。
（７）試験片の反応を温度制御する手段をさらに備えていることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の試験用具。
（８）試験片の上面にカバーを有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の試験用具。
（９）カバーが透明であることを特徴とする上記（８）に記載の試験用具。
（１０）試験片上の反応物を検出する検出手段を備えていることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の試験用具。
（１１）白色の光学反射板を試験片の下面に配置してなることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の試験用具。
（１２）毛細管中の液体の流れを制限する制御手段を含むことを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の試験用具。
（１３）制御手段が、試験片に対する液体の流れに先行して毛細管から通気を行うために試験片毎に配置された通気孔であり、かつ、通気孔が試験片から所定の位置に配置されることにより試験片へ分配される液量を制御しうることを特徴とする上記（１２）に記載の試験用具。
（１４）以下の工程を含む血液成分の測定方法。
１）滴下された血液から血球を分離除去する工程と、
２）血球が分離除去された血液を毛細管現象を利用して試験片に導く工程と、
３）試験片上で血液中の特定成分と試験片に含まれる成分が反応する工程と
４）反応物を検出する工程と
（１５）試験片は、血液中の特定成分と反応する酵素を含む上記（１４）に記載の血液成分の測定方法。
（１６）試験片は、血液中の少なくとも糖化アルブミンと反応する酵素を含む試験片とアルブミンと反応する試薬を含む試験片とを含む上記（１５）に記載の血液成分の測定方法。
（１７）反応物の検出は比色法によることを特徴とする上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の血液成分の測定方法。
（１８）反応物の検出を反射光を用いて測定することを特徴とする上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の血液成分の測定方法。
（１９）血液中の特定成分の濃度／割合を決定するための方法において、以下の工程を含む方法。
１）血液を請求項１〜１３のいずれかに記載の試験用具に滴下して、一定の反応物を前記試験用具上に形成する工程
２）前記反応物を検出する工程
３）前記検出した反応物を前記血液中の成分の濃度に対して関連付ける工程
４）得られた前記濃度から求めたい成分の割合を計算する工程
As a method for separating blood cells, there is a method using a blood cell separation membrane other than the centrifugation operation. In a general blood cell separation membrane, plasma does not pass through the membrane unless external force such as pressurization or decompression is applied. According to the study by the present inventors, it has been found that no plasma component can be obtained by simply placing whole blood on the membrane. Obviously, if a suction device is used, it will pass through the membrane, but this will increase the size and complexity of the device, and it will be difficult to make it a device that can be handled easily at the clinical site.
Therefore, as a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors can easily separate plasma components by capillary force by connecting a blood drop separation part that can separate blood cells and a test piece with a capillary. It was found that the plasma component was led to the test piece. Furthermore, the present inventors can detect a specific component in plasma by a test piece holding an enzyme / reagent, that the reaction on the test piece can be controlled by heating and cooling, and by covering the test piece, evaporation or moisture absorption of the specimen or reagent. The vents that contribute to the capillary force can also be used as a mechanism for controlling the amount of specimen on the test piece, and the color of the test piece can be easily measured by measuring the reflected light using the white optical reflection layer. The present invention has been completed based on this finding.
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A test tool including a test piece capable of measuring a specific component in blood, the test tool having a blood cell separable portion connected to the test piece by a capillary.
(2) The test tool according to (1) above, wherein the test piece contains an enzyme that reacts with a specific component in blood.
(3) The test device according to (2) above, wherein the enzyme that reacts with a specific component in blood is an enzyme that reacts with glycated albumin.
(4) The test tool according to 3 above, wherein the enzyme that reacts with glycated albumin is an enzyme that acts on proteases and glycated amino acids.
(5) The test according to the above (1) or (2), which has a plurality of test pieces and includes at least a test piece containing an enzyme that reacts with glycated albumin and a test piece containing a reagent that reacts with albumin. Tools.
(6) The test tool according to (5), further including a test piece containing a glycated amino acid.
(7) The test tool according to any one of (1) to (6) above, further comprising means for controlling the temperature of the reaction of the test piece.
(8) The test tool according to any one of (1) to (7) above, wherein a cover is provided on the upper surface of the test piece.
(9) The test tool according to (8) above, wherein the cover is transparent.
(10) The test tool according to any one of (1) to (9) above, further comprising detection means for detecting a reactant on the test piece.
(11) The test tool according to any one of (1) to (10), wherein a white optical reflector is disposed on the lower surface of the test piece.
(12) The test tool according to any one of (1) to (11) above, which includes a control unit that restricts a flow of liquid in the capillary tube.
(13) The control means is a vent hole arranged for each test piece for venting from the capillary tube prior to the flow of liquid to the test piece, and the vent hole is arranged at a predetermined position from the test piece. The test tool according to (12) above, wherein the amount of liquid distributed to the test piece can be controlled.
(14) A blood component measurement method comprising the following steps.
1) separating and removing blood cells from the dropped blood;
2) a step of guiding blood from which blood cells have been separated and removed to a test piece using capillary action;
3) a step in which a specific component in blood reacts with a component contained in the test piece on the test piece; 4) a step of detecting the reactant; and (15) the test piece contains an enzyme that reacts with the specific component in blood. (14) The blood component measurement method according to (14).
(16) The method for measuring a blood component according to (15), wherein the test piece includes a test piece containing at least an enzyme that reacts with glycated albumin in blood and a test piece containing a reagent that reacts with albumin.
(17) The method for measuring a blood component according to any one of (14) to (16) above, wherein the detection of the reaction product is performed by a colorimetric method.
(18) The method for measuring a blood component according to any one of the above (14) to (17), wherein detection of the reaction product is measured using reflected light.
(19) A method for determining the concentration / ratio of a specific component in blood, comprising the following steps.
1) Dropping blood onto the test device according to any one of claims 1 to 13 to form a certain reaction product on the test device 2) Detecting the reaction product 3) The detected reaction A step of associating an object with the concentration of a component in the blood; 4) calculating a proportion of the component to be obtained from the obtained concentration
本発明の試験用具及び測定方法を用いることにより、診療の現場で、全血を滴下部に滴下するだけで簡便に血漿を分離することができ、血漿中の特定成分、特に糖化アルブミンを迅速、簡便、安価に精度良く測定することが可能になる。 By using the test tool and the measuring method of the present invention, plasma can be easily separated simply by dropping whole blood into the dropping part at a medical site, and a specific component in plasma, particularly glycated albumin, can be quickly obtained. It becomes possible to measure easily and inexpensively with high accuracy.
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
＜試験用具の構成材料＞
本発明に用いることができる血球分離可能部としては、血球分離膜を用いることができる。血球分離膜の材質は、特に限定されないが、例えばセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリスルホン、ポリアミドなどのポリマー素材やガラス繊維などが挙げられる。簡便には一般に市販されているポリエチレン製膜やポリスルホン製膜などが使用可能である。血液が血球分離膜を通過することで、血液から血球が分離されることになる。
Hereinafter, the configuration and preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
<Construction materials of test tools>
As the blood cell separable part that can be used in the present invention, a blood cell separation membrane can be used. The material of the blood cell separation membrane is not particularly limited, and examples thereof include polymer materials such as cellulose, polyethersulfone, polypropylene, polyethylene, nylon, polysulfone, and polyamide, and glass fibers. For convenience, a commercially available polyethylene membrane or polysulfone membrane can be used. As blood passes through the blood cell separation membrane, blood cells are separated from the blood.
本発明に使用しうる試験片としては、シート状の物であればどの様な試験片を用いても良いが、例えば紙、不織布、セルロース誘導体，ガラスファイバー等を主成分とする濾紙状体等を用いることができる。また、その性質としては、吸水性を有し、試薬、酵素類を保持できる物であれば何れの物を用いても良い。試験片の厚みとしては、０．１ｍｍから２ｍｍ程度であれば良く、０．２ｍｍ〜１ｍｍ程度がより好ましい。試験片の面積としては、１試料を測定するためには０．０１ｃｍ２〜２ｃｍ２程度の面積があれば良く、０．０５ｃｍ２〜１ｃｍ２がより好ましい。
As a test piece that can be used in the present invention, any test piece may be used as long as it is a sheet-like material, for example, a filter paper-like body mainly composed of paper, nonwoven fabric, cellulose derivative, glass fiber, or the like. Can be used. In addition, as a property thereof, any material may be used as long as it has water absorbency and can retain reagents and enzymes. The thickness of the test piece may be about 0.1 mm to 2 mm, and more preferably about 0.2 mm to 1 mm. The area of the test strip, may be any area of about 0.01
また、支持体の材料としては、公知のものでもよいが、具体的には、
ポリスチレン，ポリエステル，ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロースなどの高分子プラスチックを主成分とするフィルム，シート、板状成形品等が好ましく、光学的には反応測定時に支持体を反射層として用いるため、光非透過性のもの、例えば白色ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等が望ましい。
Moreover, as a material for the support, known materials may be used, but specifically,
Films, sheets, and plate-shaped products mainly composed of high molecular plastics such as polystyrene, polyester, polyethylene terephthalate, and cellulose acetate are preferable. Optically, the support is used as a reflective layer during reaction measurement, so that it does not transmit light. Desirable ones such as white polyethylene terephthalate (PET) are desirable.
また、カバーの材料も公知のものでもよいが、具体的には、ポリエステル，酢酸セルロース，ポリカーボネート，ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンなどを主成分とするフィルム又はシート状の物が好ましく、光学的には測定用の照射光に対して妨害の少ない光透過性の物が好ましい。例えば透明ＰＥＴフィルムなどが好適に用いられる。 The cover material may also be a known material. Specifically, a film or a sheet-like material mainly composed of polyester, cellulose acetate, polycarbonate, polyethylene terephthalate, polystyrene or the like is preferable, and optically for measurement. It is preferable to use a light-transmitting material that has little interference with the irradiation light. For example, a transparent PET film is preferably used.
＜試験片の作製及び用いる試薬＞
試験片へ試薬及び酵素類を保持させるには、必要な組成から成る液状の試薬を作成し、その液に試験片を、例えば、室温好ましくは冷蔵にて、０．１分〜１日、好ましくは１分から８時間程度浸し、乾燥させればよい。
乾燥方法は、常圧あるいは減圧条件で、温度は、例えば４℃〜６０℃程度で１分〜２日程度行えばよいが、好ましくは、酵素類が失活しにくい４℃〜３０程度が好ましい。更に好ましくは、１３〜１７℃の低温、１０％以下の低湿度の冷風を当てることにより、より効率よく安全に試験紙を製造することができ好ましい。
<Preparation of test piece and reagent used>
In order to retain the reagent and enzymes on the test piece, a liquid reagent having the required composition is prepared, and the test piece is placed in the liquid, for example, at room temperature, preferably refrigerated, preferably for 0.1 minute to 1 day. May be soaked for about 1 minute to 8 hours and dried.
The drying method may be normal pressure or reduced pressure, and the temperature may be, for example, about 4 ° C. to 60 ° C. for about 1 minute to 2 days. . More preferably, a test paper can be produced more efficiently and safely by applying cold air at a low temperature of 13 to 17 ° C. and a low humidity of 10% or less.
本発明に用いることができるプロテアーゼはアルブミンに作用して糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを切り出すプロテアーゼであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。また、酵素は目的とする活性が発現すれば精製物であっても非精製物であっても良い。 As the protease that can be used in the present invention, any protease may be used as long as it is a protease that acts on albumin to excise a glycated amino acid or a peptide containing a glycated amino acid. Further, the enzyme may be a purified product or a non-purified product as long as the desired activity is expressed.
本発明に使用し得るプロテアーゼの好ましい例としては、例えば、トリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ及び微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。 Preferred examples of proteases that can be used in the present invention include proteases derived from animals such as trypsin and chymotripsin, plant-derived proteases such as papain and bromelain, and microorganisms. Examples include protease.
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン(Subtilisin)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase) 等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c（シグマ社製）等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製) 等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeputidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は１例に過ぎず、なんら限定されるものではないが、測定対象が糖化アルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きい為好ましい。 Examples of proteases derived from microorganisms include proteases derived from the genus Bacillus represented by Subtilisin and the like, proteases derived from Aspergillus represented by protease type-XIII (manufactured by Sigma), PD enzyme ( Penicillium-derived protease represented by Kikkoman Corp.), Streptomyces-derived protease represented by Pronase, etc., Lysobacter represented by endoproteinase Lys-c (Sigma), etc. (Lysobacter) derived protease, proteinase A (Proteinase A; manufactured by Sigma), etc.Yeast (Yeast) derived protease, proteinase K (Proteinase K; manufactured by Sigma) and the like, a protease derived from Tritirachium (Tritirachium), Aminopeptidase T; Boehringer Mannheim ) And other proteases derived from Thermus, endoproteinase Asp-N (EndoproteinaseAsp-N; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and other proteases derived from Pseudomonus, Lysylendopeputidase Wako Pure Chemical Industries Achromobacter-derived protease represented by These specific examples are only one example, and are not limited at all. However, when the measurement target is glycated albumin, microorganisms derived from microorganisms of the genus Bacillus and Streptomyces have a large effect on human albumin. Therefore, it is preferable.
プロテアーゼの活性測定法は、カゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、１分間、３７℃において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。
また、本発明におけるプロテアーゼの使用に関しては、プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを同時に使用しても良い。
The caseinfoline method was used as a method for measuring protease activity. The definition of activity was defined as 1 U for color development corresponding to 1 μg of tyrosine at 37 ° C. for 1 minute.
Further, regarding the use of the protease in the present invention, it is of course possible to use the protease alone, but other endoproteases or other exoproteases may be used simultaneously.
本発明に使用しうる糖化アミノ酸に作用する酵素としては、糖化アミノ酸のケトアミン構造を認識して作用するデヒドロゲナーゼ、キナーゼ、オキシダーゼ等があげられるが、もっとも安価に大量に入手できるオキシダーゼが好ましい。 Examples of enzymes that act on glycated amino acids that can be used in the present invention include dehydrogenases, kinases, oxidases, and the like that act by recognizing the ketoamine structure of glycated amino acids, but oxidases that are available in large quantities at the lowest cost are preferred.
また、糖化アミノ酸に作用する酵素としては、糖化アミノ酸又は糖化アミノ酸を含むペプチドのごとき低分子糖化アミンに良好に作用する酵素であれば如何なるものを用いても良い。目的とする測定対象が糖化アルブミンである場合には、εアミノ基が糖化されたアミノ酸に効率的に作用する酵素が好ましく、εアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用しαアミノ基が糖化されたアミノ酸には実質的に作用しない酵素が最も好ましい。 Moreover, as an enzyme which acts on a glycated amino acid, any enzyme may be used as long as it acts on a low molecular weight glycated amine such as a glycated amino acid or a peptide containing a glycated amino acid. When the target measurement target is glycated albumin, an enzyme that efficiently acts on amino acids whose ε-amino group is glycated is preferable, and the α-amino group specifically acts on amino acids whose ε-amino group is glycated. Most preferred are enzymes that do not substantially act on glycated amino acids.
また安定性の高いεアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸の両方に良く作用する酵素を用いて測定しても良い。さらに、αアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用する酵素を用いて、αアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを消去し、安定性の高いεアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸の両方に良く作用する酵素を用いてεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定しても良い。 Alternatively, measurement may be performed using an enzyme that acts well on both ε-amino groups and glycated amino acids in which α-amino groups are glycated. Furthermore, by using an enzyme that specifically acts on glycated amino acids in the α-amino group, only the amino acids in which the α-amino group is glycated are eliminated, and the highly stable ε-amino group and α-amino group are glycated. You may measure only the amino acid by which the epsilon amino group was saccharified using the enzyme which acts on both amino acids well.
特異性の点から、最も好ましいケトアミン構造を認識する酵素の例としては、εアミノ基が糖化されたアミノ酸には作用せずαアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的な酵素、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（FAOD）：コリネバクテリウム（Corynebacterium） 属由来（FERM P-8245）があげられる。一方、εアミノ基及びαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸両方に良く作用する酵素であり、安定性が高い酵素としてはギベレラ（Gibberella）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属（例えばIFO-6365、-4242、-5710等）由来フルクトサミンオキシダーゼ、カンジダ（Candida ）属由来フルクトシルアミンデグリカーゼ、ペニシリウム（Penicillium）属（例えばIFO-4651、-6581、-7905、-5748、-7994、-4897、-5337等）由来フルクトシルアミノ酸分解酵素、フサリウム（Fusarium）属（例えばIFO-4468、-4471、-6384、-7706、-9964、-9971、-31180、-9972 等）由来、アクレモニウム（Acremonium）属由来又はデブリオマイゼス（Debaryomyces）属由来ケトアミンオキシダーゼ等のケトアミン構造を認識する酵素が挙げられる。さらに好ましい例としては、プロテアーゼと共存した状態でも十分な活性を有する、遺伝子組み替えケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）が挙げられる。 Examples of enzymes that recognize the most preferred ketoamine structure in terms of specificity include enzymes that are specific to amino acids in which the α-amino group is glycated without acting on glycated amino acids, such as fructosyl amino acids. Oxidase (FAOD): derived from the genus Corynebacterium (FERM P-8245). On the other hand, it is an enzyme that acts well on both glycated amino acids in which the ε-amino group and the α-amino group are glycated. Examples of highly stable enzymes include the genus Gibberella or the genus Aspergillus (for example, IFO-6365, -4242). , -5710 etc.) derived fructosamine oxidase, Candida genus fructosylamine deglycase, Penicillium genus (eg IFO-4651, -6581, -7905, -5748, -7994, -4897, -5337 Etc.) derived from fructosyl amino acid degrading enzyme, Fusarium genus (eg, IFO-4468, -4471, -6384, -7706, -9964, -9971, -31180, -9972, etc.), Acremonium genus Examples include enzymes that recognize ketoamine structures, such as those derived from or derived from the genus Debaryomyces. More preferable examples include genetically modified ketoamine oxidase (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) that has sufficient activity even in the presence of proteases.
αアミノ基が糖化されたアミノ酸には作用しないが、εアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的な酵素としては、遺伝子改変で作成された遺伝子改変ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）が挙げられる。 An enzyme specific to an amino acid whose ε-amino group is glycated, although it does not act on an amino acid whose α-amino group is glycated, includes a genetically modified ketoamine oxidase (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) created by genetic modification.
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は糖化Ｚリジン若しくは糖化バリン（ハシバらの方法に従って合成、精製した。（Hashiba H,J.Agric.FoodChem.24:70,1976））より、37℃、1分間に1μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を1Ｕと定義した。 The activity of the enzyme that acts on glycated amino acids is glycated Z lysine or glycated valine (synthesized and purified according to the method of Hashiba et al. (Hashiba H, J. Agric. Food Chem. 24:70, 1976)) at 37 ° C. for 1 minute. The amount of enzyme that generates 1 μmol of hydrogen peroxide was defined as 1 U.
プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含む試薬を試験片に保持させる場合のこれらの酵素を含む試薬液中の各酵素の濃度はそれぞれ１２５Ｕ／ｍｌ以上、０．２５ｍＵ以上の濃度が好ましい。試験片に試薬を保持させるには、前記濃度の試薬１ｍｌに５ｃｍ×５ｃｍの試験片を浸す程度で良く、この場合全ての試薬が吸収されたとすると試験片１ｃｍ２あたりのプロテアーゼ含有量は５Ｕ／ｍｌ以上、糖化アミノ酸に作用する酵素の量は１０ｍＵ以上となる。また、プロテアーゼの濃度は、試験片１ｃｍ２あたりのプロテアーゼ含有量が５Ｕ／ｍｌ以上であればいくらでも良いが、バッククラウンドの上昇やコストを考えると、試験片１ｃｍ２あたり１０ＫＵ以下が好ましい。また、糖化アミノ酸に作用する酵素の濃度は、１ｃｍ２あたり１０ｍＵ／ｍｌ以上であればいくらでも良いが、コストを考えると試験片１ｃｍ２あたりのプロテアーゼ含有量は５０Ｕ／ｍｌ以下が好ましい。 In the case where a reagent containing an enzyme that acts on protease and glycated amino acid is held on a test piece, the concentration of each enzyme in the reagent solution containing these enzymes is preferably 125 U / ml or more and 0.25 mU or more. In order to hold the reagent on the test piece, it is sufficient to immerse a test piece of 5 cm × 5 cm in 1 ml of the reagent having the above concentration. In this case, if all the reagents are absorbed, the protease content per 1 cm 2 of the test piece is 5 U / The amount of enzyme acting on glycated amino acid is 10 mU or more. The protease concentration may be any amount as long as the protease content per 1 cm 2 of the test piece is 5 U / ml or more, but is preferably 10 KU or less per 1 cm 2 of the test piece in view of the increase in background and cost. In addition, the concentration of the enzyme acting on the glycated amino acid may be any amount as long as it is 10 mU / ml or more per cm 2 , but considering the cost, the protease content per cm 2 of the test piece is preferably 50 U / ml or less.
プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含む液状試薬のｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨを選択すればよい。例えば、プロテアーゼにプロテアーゼタイプXXVII （シグマ社製）を用いた場合には、本酵素はｐＨ７〜１０付近で蛋白質分解活性が強いことから、反応のｐＨは７ 〜１０が好ましい。また、糖化アミノ酸に作用する酵素として遺伝子改変ケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）を用いた場合には、最大活性の５０％以上の活性を示す領域がｐＨ６．５〜１０と広いことから、反応のｐＨは６．５〜１０が好ましい。このようにプロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素の反応ｐＨを比較すると、液状試薬のｐＨとしては、両者の活性の強いｐＨ７〜１０を選択することができる。 The pH of the liquid reagent containing the protease and the enzyme acting on the glycated amino acid may be selected so that the reaction proceeds efficiently in consideration of the optimum pH of the enzyme used. For example, when protease type XXVII (manufactured by Sigma) is used as the protease, the enzyme has a strong proteolytic activity at around pH 7-10, so the pH of the reaction is preferably 7-10. In addition, when genetically modified ketoamine oxidase (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) is used as an enzyme that acts on glycated amino acids, the region showing an activity of 50% or more of the maximum activity is as wide as pH 6.5 to 10, so that The pH is preferably 6.5-10. Thus, when the reaction pH of the enzyme acting on the protease and the glycated amino acid is compared, pH 7-10 having strong activity of both can be selected as the pH of the liquid reagent.
また、プロテアーゼ及び糖化アミノ酸に作用する酵素を含有する試験片には、反応を色に変える発色系の試薬を同時に保持させておくと検出がしやすい。
検出を助ける発色系の試薬成分としては、例えば糖化アミノ酸に作用する酵素としてデヒドロゲナーゼを用いた場合には例えば補酵素であるＮＡＤ等を用いることができ、その場合は生成される還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長で検出すればよい。また各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上、同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の発色試薬を用いる事もでき、生じた還元型補酵素を色に変換して検出してもよい。またこれ以外の公知の方法により直接あるいは間接的に測定してもよい。
In addition, a test piece containing a protease and an enzyme that acts on a glycated amino acid is easy to detect if a coloring reagent that changes the reaction into a color is held at the same time.
For example, when a dehydrogenase is used as an enzyme that acts on a glycated amino acid, for example, NAD that is a coenzyme can be used as a reagent component of a chromogenic system that assists detection. A certain reduced NAD may be detected at a wavelength around 340 nm which is the maximum absorption wavelength region. Further, various diaphorases, or electron carriers such as phenazine methosulfate and coloring reagents such as nitrotetrazolium, various tetrazolium salts represented by WST-1, WST-8 (above, manufactured by Dojin Chemical Laboratories), and the like can be used. The resulting reduced coenzyme may be detected by converting it into a color. Moreover, you may measure directly or indirectly by other well-known methods.
またオキシダーゼを用いた場合、例えば、ケトアミンオキシダーゼを用いた場合には、反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソンを検出できる公知の成分を用いることができる。
上記過酸化水素の量を検出できる成分としては、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、比色、発光、蛍光等に変換し検出すればよい。
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上、和光純薬社製等）等を用いることが出来る。
When oxidase is used, for example, when ketoamine oxidase is used, hydrogen peroxide and glucosone are generated by the reaction, and known components capable of detecting hydrogen peroxide and glucosone can be used.
As the component capable of detecting the amount of hydrogen peroxide, for example, a dye or the like may be generated using peroxidase or the like, and converted into colorimetric, luminescent, fluorescent, or the like and detected.
In the presence of peroxidase, the hydrogen peroxide coloring system produces dyes by oxidative condensation of couplers such as 4-AA or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) with chromogens such as phenol. A leuco-type reagent (N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4-bis (dimethylamino) biphenylamine (DA64), 10- (carboxymethylamino) that directly oxidizes and colors in the presence of peroxidase. Carbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine (DA67); manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like can be used.
タンパク質発色試薬としては公知のタンパク質を測定する方法を用いた試薬であれば如何なるタンパク質発色試薬を用いても良いが、例えばタンパク質がアルブミンの場合にはブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモフェノールブルー、メチルオレンジ、又は２-（４-ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）等のアルブミン特異的な色素を用いるかアルブミン抗体を用いた発色試薬を用いればよい。 As the protein coloring reagent, any protein coloring reagent may be used as long as it uses a known method for measuring protein. For example, when the protein is albumin, bromocresol green (BCG), bromocresol purple (BCP) ), Bromophenol blue, methyl orange, or 2- (4-hydroxybenzeneazo) benzoic acid (HABA) or other albumin-specific dye or a coloring reagent using an albumin antibody may be used.
試験片に保持させる前の溶液状態の試薬の例としては、例えばＨＡＢＡを用いる場合、選択できるｐＨはｐＨ３〜１０であり、好ましくはｐＨ４〜９である。ＨＡＢＡの濃度としては、０．００１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜５％であれば良い。この場合検出に用いる波長は４８０〜５５０ｎｍ付近である。また同様にＢＣＰを用いる場合には、選択できるｐＨはｐＨ４〜８、好ましくは４．５〜７．５であり、好ましくは着色を抑える界面活性剤、例えばＢｒｉｊ３５等を０．０１％〜５％好ましくは０．０５％〜３％共存させれば良い。ＢＣＰの濃度としては０．０００１〜０．２％、好ましくは０．０００５〜０．１％であり、検出に用いることができる波長は６００ｎｍ付近である。 As an example of a reagent in a solution state before being held on the test piece, for example, when HABA is used, the pH that can be selected is pH 3 to 10, preferably pH 4 to 9. The concentration of HABA may be 0.001% to 10%, preferably 0.01% to 5%. In this case, the wavelength used for detection is around 480 to 550 nm. Similarly, when BCP is used, the pH that can be selected is pH 4 to 8, preferably 4.5 to 7.5, and preferably 0.01% to 5% of a surfactant that suppresses coloring, such as Brij35. Preferably, 0.05% to 3% may coexist. The concentration of BCP is 0.0001 to 0.2%, preferably 0.0005 to 0.1%, and the wavelength that can be used for detection is around 600 nm.
＜試験用具の作製＞
本発明の血液中の特定成分を測定可能な試験片、及び該試験片と毛細管で連結した血球分離可能部を有することを特徴とする試験用具としては、少なくとも血液中の特定成分と反応する試験片が構成要素に含まれていればいかなる試験用具を用いても良い。例えば、本発明の試験用具の血球分離可能部は、血液滴下部と、血液分離膜と、血液滴下部から一定量の血液を血液分離膜を介して吸引しうる毛細管とからなる。また、試験片は、血液中の特定成分と反応する酵素を含有する。
<Preparation of test tool>
The test tool characterized by having a test piece capable of measuring a specific component in blood of the present invention and a blood cell separable part connected to the test piece by a capillary tube is a test that reacts with at least a specific component in blood Any test tool may be used as long as the piece is included in the component. For example, the blood cell separable portion of the test device of the present invention includes a blood dropping portion, a blood separation membrane, and a capillary tube that can suck a certain amount of blood from the blood dropping portion through the blood separation membrane. Moreover, a test piece contains the enzyme which reacts with the specific component in blood.
試験用具への毛細管の形成は公知の方法で行えば良いが、例えば厚さ０．０１ｍｍ〜１ｍｍ、幅０．５ｍｍ〜１０ｃｍ、長さ１ｍｍ〜１０ｃｍ程度のフィルムを３枚使用し、１枚のフィルムに１本の幅０．０１ｍｍ〜１ｃｍの溝を形成し、上下から溝の無いフィルムで挟むことにより毛細管を形成する方法などがある。フィルムは公知技術により張り合わせることができ、簡便には光学測定を妨害しない両面テープなどで容易に貼り合わせる事ができる。この時、上部のフィルムに直径０．０５ｍｍ〜８ｃｍの血液滴下孔、直径０．０５ｍｍ〜５ｍｍの円形の通気孔を開け、上部のフィルムと中部のフィルムの間には、血液滴下孔に対応する位置に血球分離膜を配置し、また、毛細管の溝の途中に試験片が配置される構造が望ましい。 The capillary tube may be formed on the test device by a known method. For example, three films having a thickness of 0.01 mm to 1 mm, a width of 0.5 mm to 10 cm, and a length of 1 mm to 10 cm are used. There is a method of forming a capillary tube by forming a groove having a width of 0.01 mm to 1 cm in a film and sandwiching the film with a film having no groove from above and below. The films can be bonded together by a known technique, and can be easily bonded with a double-sided tape that does not interfere with optical measurement. At this time, a blood dripping hole having a diameter of 0.05 mm to 8 cm and a circular vent hole having a diameter of 0.05 mm to 5 mm are opened in the upper film, and a blood dripping hole is provided between the upper film and the middle film. A structure in which a blood cell separation membrane is disposed at a position and a test piece is disposed in the middle of a capillary groove is desirable.
より具体的な構成の１例を図１に示す。５は上部フィルムからなるカバー材であり、６は中部フィルムからなる中板、７は、下部のフィルムからなる支持体を兼ねた光学反射板７である。カバー材５には、血液滴下孔１２が１箇所、試験片１と同数の通気孔３が設けられている。中板６には試験片の数に対応した溝が血液滴下孔に対応する位置から放射状に例えばこの例では４本形成されている。１は試験片であり、毛細管上で、血液滴下孔と通気孔との間の経路に位置している。中板６の溝、カバー材５、支持体を兼ねた光学反射板７によって毛細管４を形成している。８はペルチェ素子で、９はこれを用いた温度制御装置である。１０は光学検出部である。
An example of a more specific configuration is shown in FIG. 5 is a cover material made of an upper film, 6 is a middle plate made of a middle film, and 7 is an optical reflector 7 also serving as a support made of a lower film. The
このように構成された試験用具において、血液の特定成分が試験片上で酵素と反応し検出されるまでの作用を説明する。測定対象である血液が血液滴下孔１２から滴下されると、毛細管４の吸引力により、血液はその真下に配置された血球分離膜２を通過し、ここで血球が分離除去され、残りの成分だけが毛細管の流れ方向に配置されている試験片１へと導かれる。そして、血液成分が試験片に到達すると、そこで試験片上の酵素と反応し、反応物を生成する。反応生成物は、各試験片の上部に設けられた検出部１０により、測定が行われる。
In the test tool configured as described above, an operation until a specific component of blood reacts with an enzyme on a test piece and is detected will be described. When the blood to be measured is dropped from the
上部フィルムには、毛細管の先端に対応する位置に通気孔が設けられているため、試験片への液体の流れに先行して毛細管から通気が行われる。そして、この通気孔を試験片から所定の位置に配置することにより、試験片へ分配される液量を制御することが可能となる。すなわち、試験片から通気孔までの距離を短くすれば分配量は少なく、反対に試験片からの距離を遠くすれば分配量を多くすることができる。 Since the upper film is provided with a vent hole at a position corresponding to the tip of the capillary tube, the capillary tube is ventilated prior to the liquid flow to the test piece. By disposing the vent hole at a predetermined position from the test piece, it is possible to control the amount of liquid distributed to the test piece. That is, if the distance from the test piece to the vent hole is shortened, the distribution amount is small, and conversely, if the distance from the test piece is increased, the distribution amount can be increased.
試験片の上面には、試験片からの試薬類の蒸発を防止するためにカバーを設けることが望ましい。また、そのカバーは、試験片上の反応物を光学測定する際に、測定の妨害をしないよう透明なカバーであることが望ましい。例えば透明ＰＥＴフィルムなどが好適に用いられる。 It is desirable to provide a cover on the upper surface of the test piece in order to prevent evaporation of reagents from the test piece. Further, it is desirable that the cover is a transparent cover so as not to interfere with the measurement when the reactant on the test piece is optically measured. For example, a transparent PET film is preferably used.
試験片と検体の組み合わせについて説明する。図１の構成は、主に１検体の血液について複数種類の試験片を用いて複数成分の測定が可能である。例えば、１つの血液に対して糖化アルブミンと反応する酵素を含む試験片、アルブミンと反応する試薬を含む試験片、糖化アミノ酸を含む試験片の３種類を試験用具にセットし、これらの３つを同時に測定し、測定結果から血液中の糖化アルブミンの割合を算出することができる。また、他の構成としては、例えば、血液分離可能部を複数設け、それぞれについて１成分、あるいは複数成分の測定をすることもできる。 A combination of the test piece and the specimen will be described. The configuration of FIG. 1 can measure a plurality of components mainly using a plurality of types of test pieces for one sample of blood. For example, a test piece containing an enzyme that reacts with glycated albumin for one blood, a test piece containing a reagent that reacts with albumin, and a test piece containing a glycated amino acid are set in a test tool. It can measure simultaneously and the ratio of glycated albumin in blood can be calculated from a measurement result. Further, as another configuration, for example, a plurality of blood separable portions can be provided, and one component or a plurality of components can be measured for each.
＜検出手段＞
反応の検出は試薬の発色した試験片に対して光をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。例えば照射する光源としてはＵＶランプやハロゲンランプ等の通常の透過率測定に用いる光源はもちろんであるが、発行ダイオード、レーザーなどを使用することができる。光の照射角度は何れでも良いが、反射光の検出は検出面に対して４５°あるいは垂直が好ましい。検出はフォトダイオードや市販の積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
<Detection means>
It is most convenient to detect the reaction by irradiating the test piece colored with the reagent and detecting the reflected light, but other methods may be used. For example, as a light source for irradiation, a light emitting diode, a laser, or the like can be used as well as a light source used for normal transmittance measurement such as a UV lamp and a halogen lamp. The light irradiation angle may be any, but detection of reflected light is preferably 45 ° or perpendicular to the detection surface. Detection can be easily performed by using a photodiode, a commercially available integrating sphere, or the like.
更に、光学測定の効率を上げるために、試験片下部に光学反射層を配置した構成が好ましい。光学反射層としては、光非透過性のもの、例えば白色ＰＥＴ等が望ましい。 Furthermore, in order to raise the efficiency of optical measurement, the structure which has arrange | positioned the optical reflection layer in the test piece lower part is preferable. As the optical reflection layer, a light-impermeable layer, for example, white PET or the like is desirable.
検出された反射光は、濃度が既知の糖化タンパク質の感度と比較することにより、糖化タンパク質濃度に換算すれば良い。一般的には、試験紙のロットにより感度は一定であるから、ロット毎に濃度が既知の糖化タンパク質濃度における感度をあらかじめ測定しておき、これらをもとに換算できるようにしておけば良い。 The detected reflected light may be converted to the glycated protein concentration by comparing with the sensitivity of the glycated protein having a known concentration. In general, since the sensitivity is constant depending on the lot of the test paper, the sensitivity at a glycated protein concentration whose concentration is known for each lot may be measured in advance so that it can be converted based on these.
<温度制御手段＞
試験片は、通常、乾燥しているが、検体の水分により試薬成分が溶解し、反応が自動的に進行する。反応の温度は、通常、室温であるが、保温あるいは加熱機能を持つ温度制御手段を備えることにより、反応性、再現性が良くなる。
<Temperature control means>
The test piece is usually dry, but the reagent component is dissolved by the moisture of the specimen, and the reaction proceeds automatically. The reaction temperature is usually room temperature, but the reactivity and reproducibility are improved by providing a temperature control means having a heat retaining or heating function.
例えば、フィルターの下部には、温度制御装置を設けることができる。試験片上の反応は主に酵素反応であるから、温度管理を適切に行うことでより効率的に反応が進行し、精度の良い測定が可能となる。特に、各試験片の反応温度が異なる場合には、試験片毎に独立した温度制御を行うことが望ましい。そのような温度制御手段としては、公知の加熱、または冷却装置を使うことができるが、精度が良く小型の温度制御装置としてはペルチェ素子を使うことが望ましい。 For example, a temperature control device can be provided below the filter. Since the reaction on the test piece is mainly an enzyme reaction, the reaction proceeds more efficiently and can be measured with high accuracy by appropriately controlling the temperature. In particular, when the reaction temperatures of the test pieces are different, it is desirable to perform independent temperature control for each test piece. As such temperature control means, a known heating or cooling device can be used, but it is desirable to use a Peltier element as a small temperature control device with high accuracy.
なお、光学検出は試験片の下から行ってもよい。この場合の構成について説明する。試験片の下には、光透過性のフィルターが支持体を兼ねて配置され、試験片の上には、光反射板がカバーを兼ねて配置される。温度制御装置を設ける場合は、カバーの上部に設けることが望ましい。 Optical detection may be performed from below the test piece. The configuration in this case will be described. A light transmissive filter is also disposed as a support under the test piece, and a light reflecting plate is also disposed as a cover above the test piece. When providing a temperature control device, it is desirable to provide it at the top of the cover.
本発明に使用しうる試料としては、測定対象物質が血清中に存在する場合、たとえば糖化アルブミン等を測定する場合には、全血、血清、血漿を用いることができるが、診療現場で迅速に測定する目的から、全血を用いることが好ましい。
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
As a sample that can be used in the present invention, whole blood, serum, or plasma can be used when a substance to be measured is present in serum, for example, when measuring glycated albumin or the like. For the purpose of measurement, it is preferable to use whole blood.
Next, although the Example of this invention is described in detail, this invention is not limited at all by this.
＜糖化アルブミン測定試薬試験片の作製＞
糖化アルブミン測定試薬試験片は、厚さ０．４ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍのろ紙（ワットマン社製クロマトグラフィ用ろ紙）を、下記組成のうち酵素濃度を変化させた試薬に室温にて５分間浸し、その後、３７℃２０分間風乾し、糖化アルブミン測定試薬試験片を作製した。乾燥後、室温にて２時間処理した後、乾燥剤と共に遮光密閉し、使用時まで冷蔵保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
２０００Ｕ／ｍｌ プロテアーゼタイプＸＸVII（シグマ社製）
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
<Preparation of glycated albumin measuring reagent test piece>
The glycated albumin measuring reagent test piece was immersed in a 0.4 mm thick, 50 mm × 50 mm filter paper (Whatman's chromatographic filter paper) for 5 minutes at room temperature in a reagent with the enzyme concentration changed in the following composition, and then Air-dried at 37 ° C. for 20 minutes to prepare a glycated albumin measuring reagent test piece. After drying, it was treated at room temperature for 2 hours, sealed in a light-shielding manner with a desiccant and stored in a refrigerator until use.
50 mM Tris buffer, pH 7.5
2000 U / ml protease type XXVII (manufactured by Sigma)
4 mM 4-aminoantipyrine (4-AA; manufactured by Dojindo Laboratories)
2 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine
(TOOS: Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.)
4000 mU / ml ketoamine oxidase (Asahi Kasei)
4U / ml peroxidase (Roche)
＜糖化アミノ酸測定試薬試験片の作製＞
糖化アミノ酸測定試薬試験片は、下記組成の試薬を用い、上記糖化アルブミン検出試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ トリス緩衝液 ｐＨ７．５
４ｍＭ ４−アミノアンチピリン（4-ＡＡ；同仁化学研究所社製）
２ｍＭ N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m-トルイジン
(ＴＯＯＳ；同人化学研究所社製)
４０００ｍＵ／ｍｌ ケトアミンオキシダーゼ (旭化成社製)
４Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（ロシュ社製）
<Preparation of glycated amino acid measuring reagent test piece>
The glycated amino acid measurement reagent test piece was prepared and stored in the same manner as the glycated albumin detection reagent test piece using the reagent having the following composition.
50 mM Tris buffer, pH 7.5
4 mM 4-aminoantipyrine (4-AA; manufactured by Dojindo Laboratories)
2 mM N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine
(TOOS: Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.)
4000 mU / ml ketoamine oxidase (Asahi Kasei)
4U / ml peroxidase (Roche)
＜アルブミン測定試薬試験片の作製＞
アルブミン測定試薬試験片は下記組成の試薬を用い、糖化アルブミン検出試薬試験片の作製と同じ方法で作製し、保存した。
５０ｍＭ クエン酸緩衝液 ｐＨ４．０
１％ Ｂｒｉｊ ３５（和光純薬社製）
０．０３％ ブロモクレゾールグリーン（和光純薬社製）
<Preparation of test specimen for albumin measurement reagent>
An albumin measuring reagent test piece was prepared and stored in the same manner as the preparation of the glycated albumin detection reagent test piece using the reagent having the following composition.
50 mM citrate buffer, pH 4.0
1% Brij 35 (Wako Pure Chemical Industries)
0.03% Bromocresol Green (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
＜試験用具の作製＞
図１を用いて試験用具の構成を説明する。実施例１で作製した各試験片１を直径４ｍｍの大きさで4枚切り出した。血球分離膜２には、ポリスルフォンからなるフィルターを用い、直径１０ｍｍの大きさで1枚切り出した。試験用具は３枚のフィルムが重ねられた状態で構成されている。
上部のフィルムはカバー材５であり、中部のフィルムは中板６、下部のフィルムは支持体を兼ねた光学反射板７である。カバー材５は、厚さ０．２ｍｍの透明ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、直径８ｍｍの血液滴下孔１２が１箇所、試験片１と同数の直径１ｍｍの通気孔３が設けられている。カバー材の下には中板６が配置されている、中板は厚さ０．４ｍｍのＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）であり、試験片の数に対応した幅１ｍｍの溝が血液滴下孔に対応する位置から放射状に４本形成されている。更に、試験片と血球分離膜に対応する位置に円形の保持部（図示せず）が設けられている。試験片の位置は毛細管上にあり、血液滴下孔と通気孔との間の経路になるように配置した。
さらに、中板６の下部には、支持体及び光学反射板７が配置されている。これは、厚さ０．６ｍｍの白色ＰＥＴフィルム（３０ｍｍ×４０ｍｍ）からなり、透明フィルムのカバー材５とともに中板を挟み込む形で毛細管４を形成している。なお、これら３枚のフィルムは両面テープで接着されている。
また、試験用具の下部にはペルチェ素子８からなる温度制御装置９が設けられ、各試験片をそれぞれ所望の温度に制御可能である。
<Preparation of test tool>
The configuration of the test tool will be described with reference to FIG. Four test pieces 1 prepared in Example 1 were cut out to have a diameter of 4 mm. For the blood
The upper film is the
Further, a support body and an optical reflection plate 7 are disposed below the
In addition, a temperature control device 9 including a
＜糖化アルブミンの測定＞
健常者５検体、糖尿病患者５検体の全血検体を用いて糖化アルブミンの割合の測定を行った。糖化アルブミン濃度、糖化アミノ酸濃度及びアルブミン濃度は、ルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を別途測定して各濃度に換算した。検出部１０には発光ダイオードを用いたデジタルファイバーセンサー１１（キーエンス社製）を用い、検体滴下後の反射光を１０分間測定し、記録した。
糖化アルブミンの割合は、全アルブミン濃度に対する糖化アルブミン濃度の割合のことであり、以下の式で表すことができる。
糖化アルブミンの割合（％）
＝糖化アルブミン濃度（ｇ／Ｌ）÷アルブミン濃度（ｇ／Ｌ）×１００
ここで、アルブミン濃度は、測定したアルブミン濃度を用い、糖化アルブミン濃度は、測定した糖化アルブミン濃度から測定した糖化アミノ酸濃度を差し引いたものを用いることで糖化アルブミン濃度を算出することができる。このようにして求めた糖化アルブミンの割合を表１の左欄に示す。
これから、血球分離膜により全血中の血球等の不要物質が除かれるため、本発明の試験用具を用いて全血検体から直接、糖化アルブミンを測定可能であることがわかる。
さらに、同じ全血検体を遠心分離後、ルシカＧＡ試薬（旭化成製）を用いて自動分析装置で測定した結果（表１の右欄）ともよく一致しており、本発明の測定装置を用いて正確に測定が可能であることが明らかである。
<Measurement of glycated albumin>
The proportion of glycated albumin was measured using whole blood samples of 5 healthy subjects and 5 diabetic patients. The glycated albumin concentration, glycated amino acid concentration, and albumin concentration were separately measured by a calibrator for Lucika GA (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) and converted to each concentration. A digital fiber sensor 11 (manufactured by Keyence Corporation) using a light emitting diode was used as the
The ratio of glycated albumin is the ratio of the glycated albumin concentration to the total albumin concentration, and can be expressed by the following equation.
Ratio of glycated albumin (%)
= Glycated albumin concentration (g / L) ÷ albumin concentration (g / L) × 100
Here, the albumin concentration can be calculated by using the measured albumin concentration, and the saccharified albumin concentration can be calculated by subtracting the measured glycated amino acid concentration from the measured glycated albumin concentration. The ratio of glycated albumin thus determined is shown in the left column of Table 1.
From this, it can be seen that unnecessary substances such as blood cells in whole blood are removed by the blood cell separation membrane, so that glycated albumin can be measured directly from a whole blood sample using the test tool of the present invention.
Furthermore, after the same whole blood sample was centrifuged, the results (right column in Table 1) measured with an automatic analyzer using Lucika GA reagent (manufactured by Asahi Kasei) were in good agreement with the measurement apparatus of the present invention. It is clear that an accurate measurement is possible.
＜試薬の蒸発に対する透明フィルムカバーの影響＞
血球分離膜を用いずに、試験片の上面がカバーされた通常型と、試験片の上面に直径３ｍｍの穴を開けた開放型の２種類の試験用具を実施例２の手順で作製した。
サンプルには、ルシカＧＡ用キャリブレータＨ（旭化成社製）を用い、化学天秤中、室温にて、８μＬを毛細管に直接吸わせて試験片に吸収させた。吸収させた瞬間を０秒とし、以後６００秒まで３０秒毎に重量を測定し、０秒時の重量からの残存重量％を計算した。結果を図２に示す。これから明らかなように、カバー無しの試験片では、１０分間に４０％も蒸発が進むのに対し、カバー有りの試験片では、１０％しか蒸発しなかった。
従って、試験片の上面をカバーすることにより、測定中の試薬の蒸発を３０％減少させることができ、より正確な測定が可能となることが明らかとなった。
<Effect of transparent film cover on reagent evaporation>
Two types of test tools, a normal type in which the upper surface of the test piece was covered and an open type in which a hole with a diameter of 3 mm was formed in the upper surface of the test piece, were prepared by the procedure of Example 2 without using a blood cell separation membrane.
As a sample, Lucica GA calibrator H (Asahi Kasei Co., Ltd.) was used, and 8 μL was directly sucked into a capillary tube at room temperature in an analytical balance and absorbed by a test piece. The moment of absorption was defined as 0 seconds, and thereafter, the weight was measured every 30 seconds until 600 seconds, and the remaining weight% from the weight at 0 seconds was calculated. The results are shown in FIG. As is clear from this, the test piece without the cover evaporates as much as 40% in 10 minutes, whereas the test piece with the cover evaporates only 10%.
Therefore, it was clarified that by covering the upper surface of the test piece, the evaporation of the reagent during measurement can be reduced by 30%, and more accurate measurement can be performed.
＜測定温度の影響＞
検体にはルシカＧＡ用のキャリブレーター（旭化成社製）を用い、反応温度を３０℃、４０℃、４５℃、５０℃に設定し、反射率の経時変化を測定した。結果を図３に示す。これから明らかなように、測定時温度３０℃〜４５℃までは、温度の上昇と共に試験片上の反応速度が加速しており、温度制御による安定した測定が可能となることが明らかとなった。
<Influence of measurement temperature>
A calibrator for Lucika GA (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) was used as a specimen, reaction temperatures were set to 30 ° C., 40 ° C., 45 ° C., and 50 ° C., and changes in reflectance over time were measured. The results are shown in FIG. As is clear from this, it has been clarified that the reaction rate on the test piece is accelerated as the temperature increases from 30 ° C. to 45 ° C. during measurement, and stable measurement by temperature control is possible.
本発明は診療現場で迅速、簡便、安価に精度良く血液検体の測定が可能であり、臨床診断の分野で好適に利用できる。 The present invention can measure a blood sample quickly, conveniently, and accurately at a clinical site, and can be suitably used in the field of clinical diagnosis.
１ 試験片
２ 血球分離膜
３ 通気孔
４ 毛細管（溝）
５ カバー材
６ 中板
７ 支持体を兼ねた光学反射板７
８ ペルチェ素子
９ 温度制御部
１０ 検出部
１１ センサー
１２ 血液滴下孔
1
5 Cover
8 Peltier element 9
Claims (13)
１）血球分離可能部
２）血球分離可能部で血球が分離除去された血液を試験片へと導入する、試験片と血球分離可能部を連結する毛細管
３）毛細管の流れ方向の先端に対応する位置に配置され、試験片に対する液体の流れに先行して毛細管から通気を行うために試験片毎に配置されている通気孔 A test tool comprising a plurality of test pieces capable of measuring a specific component in blood and having the following configuration.
1) Blood cell separable part 2) Blood from which blood cells have been separated and removed by the blood cell separable part is introduced into the test piece. Capillary tube connecting the test piece and the blood cell separable part 3) Corresponding to the tip of the capillary in the flow direction Vents located on each specimen to be vented from the capillary tube prior to the flow of liquid to the specimen and in position
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