JP4596795B2 - Plant inhibitor containing piperitol or its derivatives as active ingredients - Google Patents
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Description
本発明は、植物抑制剤およびそれを用いた植物抑制方法に関する。更に詳細には、ピペリトールもしくはその誘導体を有効成分とする植物抑制剤、および該植物抑制剤を、植物が芽を出すもしくは成育する土壌表面に散布および／または土壌に混合することにより、あるいは植物が芽を出すもしくは成育する水中に浸漬することにより、植物を抑制する植物抑制方法に関する。 The present invention relates to a plant inhibitor and a plant suppression method using the same. More specifically, a plant inhibitor containing piperitol or a derivative thereof as an active ingredient, and spraying and / or mixing the plant inhibitor on the soil surface where the plant sprouts or grows, The present invention relates to a plant suppression method for suppressing plants by immersing them in water that sprouts or grows.
農業、林業、緑化、空き地、宅地および庭園において雑草の発芽や繁茂を抑制する場合、除草剤および人力による排除が行われている。近年、除草剤の残留問題を解決するため、天然素材による雑草発芽抑制技術の開発が行われており、ヒノキの樹皮や枝葉を利用した雑草発芽抑制技術についても、特許文献１、特許文献２、非特許文献１および非特許文献２によりその効果が報告されている。また、特許文献３には、コウヤマ、ナギ、スギ、ヒノキなどの植物の葉または抽出物を植物に対する生理活性抑制剤として用いることも報告されている。 In the case of controlling weed germination and overgrowth in agriculture, forestry, greening, vacant land, residential land and gardens, herbicides and human exclusion are used. In recent years, in order to solve the problem of herbicide residue, development of weed germination suppression technology using natural materials has been carried out, and weed germination suppression technology using cypress bark and branches and leaves is also disclosed in Patent Document 1, Patent Document 2, Non-patent document 1 and non-patent document 2 report the effect. Patent Document 3 also reports that the leaves or extracts of plants such as Koyama, Nagi, Sugi, and Hinoki are used as physiological activity inhibitors for plants.
現在、雑草抑制用として使用されている除草剤の大部分は化学製品であるため、生態系および人体への影響が問題となっており、その使用低減が望まれている。また、工場および住宅予定地（空き地）や法面では雑草管理に多大な費用と労力が必要となり、その改善方法の開発が望まれている。また、木材を採集した後に残る枝葉は廃棄物として処理され、林地に廃棄されるかあるいは焼却処分されており、有効な利用方法は未だ開発されていない状況にある。反面、ヒノキ等の枝葉には抗菌性や耐虫性といった有用な天然物質が多く含まれており、その有効利用が望まれている。これまでに、それらの有用成分を工業的に抽出し、添加物として利用する試みがなされてきたが、抽出という煩雑な行程を経るため製品の高価格化を招き、普及の妨げとなってきた。枝葉と同様に廃棄物として扱われてきた樹皮については様々な研究・開発がなされ、堆肥や雑草・病害虫抑制資材として使用されている。 At present, most of the herbicides used for weed control are chemical products, and therefore the impact on the ecosystem and human body has become a problem, and the reduction of their use is desired. In addition, a large amount of cost and labor are required for weed management in factories and planned residential areas (vacant land) and on the slope, and development of an improvement method is desired. In addition, the branches and leaves remaining after the collection of timber are treated as waste, and are discarded in forests or incinerated, so that an effective use method has not yet been developed. On the other hand, branches and leaves such as cypress contain many useful natural substances such as antibacterial and insect resistance, and their effective use is desired. Up to now, attempts have been made to industrially extract these useful ingredients and use them as additives, but the complicated process of extraction has led to an increase in the price of the product, which has hindered its widespread use. . Bark that has been treated as waste, like branches and leaves, has been researched and developed in various ways, and is used as a material for controlling compost, weeds and pests.
しかしながら、特許文献１、特許文献２および非特許文献１に記載されているように、ヒノキの樹皮を雑草抑制資材として用いた場合、敷設厚さを５ｃｍ以上取らないと雑草抑制効果が認められず、資材本来の抑制効果なのか、単なる光の遮断による抑制効果なのかが明確ではなく、従ってヒノキ樹皮を含む資材を用いた場合、雑草抑制効果は低いと言える。また、非特許文献１において、ヒノキ枝葉の雑草抑制効果が報告されているが、葉の粉砕材に効果があるという記載に止まっており、具体的な加工方法や使用方法は言及されておらず、更には葉だけでは効果が無かったことが記載されている。また、非特許文献２において、ヒノキ葉からメタノールにより抽出された物質に植物の発芽抑制効果があることが記載されており、メタノール抽出物質であったことから難水溶性物質が主成分であるという推測がなされているが、メタノール抽出物質の中にも水溶性物質が含まれている可能性があることから、発芽抑制効果の主物質を同定するには至っていない。また、特許文献３の植物に対する生理活性抑制剤もその抑制活性が十分に満足がいくものとはいえない。
他方、非特許文献３には、Chamaecyparis obtusa の植物の葉付きシュートからリグナンの一種としてピペリトールが単離されたことが報告されている。しかしながら、その植物に対する生理活性については全く何ら報告されていない。
On the other hand, Non-Patent Document 3 reports that piperitol was isolated as a kind of lignan from the leafy shoot of the plant of Chamaecyparis obtusa. However, nothing has been reported about the physiological activity against the plant.
現在、雑草抑制用として使用されている除草剤の大部分は化学製品であるため、生態系および人体への影響が問題となっており、その使用低減が望まれている。工場および住宅予定地(空き地)や法面では雑草管理に多大な費用と労力が必要となり、その改善方法の開発が望まれている。また木材を採集した後に残る枝葉は廃棄物として処理され、林地に廃棄されるか、焼却処分されており有効な利用方法は今だ開発されていない状況にある。反面、ヒノキ等の枝葉には抗菌性や耐虫性といった有用な天然物質が多く含まれておりその有効利用が望まれている。
従って、本発明の課題は人体に対して安全性が高く、植物抑制活性の強い植物抑制剤およびそれを利用した植物抑制方法を提供することにある。
At present, most of the herbicides used for weed control are chemical products, and therefore the impact on the ecosystem and human body has become a problem, and the reduction of their use is desired. Factories and residential areas (vacant land) and slopes require significant costs and labor to manage weeds, and the development of improvements is desired. In addition, the branches and leaves remaining after the collection of timber are treated as waste, discarded in forests, or incinerated, and there is no effective way to use them yet. On the other hand, branches and leaves such as hinoki contain many useful natural substances such as antibacterial and insect resistance, and their effective use is desired.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a plant inhibitor that is highly safe for the human body and has strong plant inhibitory activity, and a plant suppression method using the same.
本発明者は上記した課題を解決することを目的として鋭意研究した結果、ヒノキ科の葉の乾燥粉末には他の植物の発芽を抑制する作用を有することを見出した。そこで、この点に着目し、ヒノキ葉中に存在する化学物質としてピペリトールを抽出精製・単離することに成功し、この化学物質が植物抑制剤として利用できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下記式Ｉ
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素原子、アルキル基、アシル基またはアルカリ金属を示す）で表わされるピペリトールもしくはその誘導体を有効成分とする植物抑制剤に関する。
更に、本発明は、上記植物抑制剤を、植物が芽を出すもしくは成育する土壌表面に散布および／または土壌に混合することにより、あるいは植物が芽を出すもしくは成育する水中に浸漬することにより、植物を抑制することを特徴とする植物抑制方法に関する。
As a result of intensive studies aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors have found that the dried powder of cypress leaves has an action of suppressing germination of other plants. Therefore, paying attention to this point, the present inventors have succeeded in extracting and purifying and isolating piperitol as a chemical substance present in cypress leaves, and have found that this chemical substance can be used as a plant inhibitor, thereby completing the present invention.
That is, the present invention relates to the following formula I
(Wherein R1 and R2 each represent a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, or an alkali metal).
Furthermore, the present invention provides the above plant inhibitor by spraying and / or mixing with the soil surface on which the plants sprout or grow, or by immersing in the water in which the plants sprout or grow, The present invention relates to a plant suppression method characterized by suppressing a plant.
本発明によれば、ヒノキ科の葉から抽出されるピペリトールは、他の植物の生理活性に阻害的に働く物質であり、発芽抑制、成長抑制などの生理活性物質として利用できる。また、ピペリトールを植物に適用しその薬効が切れると通常通り植物は発芽することから、化学的に殺滅する従来の農薬とは異なり、生物学的作用を止めることなく防除することが出来る。従来の除草剤のように毒性はなく、安全性も高く、周辺土壌を汚染することもない。
従って、ピペリトールもしくはその誘導体を有効成分とする本発明の植物抑制剤は、従来の農薬と比べて取り扱い上、良好であり、特に環境保全の点では著しく優れており、また従来の農薬と併用することによって農薬の使用量を削減することが出来る。
According to the present invention, piperitol extracted from cypress leaves is a substance that inhibits the physiological activity of other plants, and can be used as a physiologically active substance such as germination suppression and growth suppression. In addition, when piperitol is applied to a plant and its medicinal properties are lost, the plant will germinate as usual, so that it can be controlled without stopping the biological action, unlike conventional agricultural chemicals that are chemically killed. Unlike conventional herbicides, it is not toxic, highly safe, and does not contaminate the surrounding soil.
Therefore, the plant inhibitor of the present invention containing piperitol or a derivative thereof as an active ingredient is better in handling than conventional agricultural chemicals, particularly excellent in terms of environmental conservation, and is used in combination with conventional agricultural chemicals. This can reduce the amount of pesticide used.
本発明の植物抑制剤の有効成分である、式ＩにおいてＲ１がメチル、Ｒ２は水素原子であるピペリトールは、ヒノキの葉乾燥粉末を、８０％メタノールで抽出し、得られるメタノール抽出液を濃縮し、溶媒を溜去させ水溶液とし、この水溶液をｐＨ７に調整した後、ｎ−ヘキサンで抽出し、次いで残りの水層を酢酸エチルで抽出し、次いで、このｐＨ７酢酸エチル画分を、後述する実施例で詳細に説明するように、酢酸エチルとｎ−ヘキサンとの各種比率の溶出液にてシリカゲルクロマトグラフィーで精製を繰り返すことにより単離・精製することができる。また、非特許文献３である The Japan Wood Research Society (2001) 47:476-482 に記載されているように、Chamaecyparis obtusa cv. Breviramea の葉付きシュートの粉砕物をメタノールにて数回抽出し、抽出物を水に懸濁し、ジエチルエーテルで抽出し、得られる抽出物を、溶出液としてメタノール／ジクロロメタン、酢酸エチル／ｎ−へキサン、アセトン／ジクロロメタンなどの混合溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、次いでＴＬＣ、更に逆相高速液体クロマトグラフィーに付すことにより単離・精製することができる。 Piperitol, which is an active ingredient of the plant inhibitor of the present invention, wherein R1 is methyl and R2 is a hydrogen atom, is extracted from cypress leaf dry powder with 80% methanol, and the resulting methanol extract is concentrated. The solvent was distilled off to obtain an aqueous solution, and the aqueous solution was adjusted to pH 7, followed by extraction with n-hexane, and then the remaining aqueous layer was extracted with ethyl acetate. As will be described in detail in the examples, it can be isolated and purified by repeating purification by silica gel chromatography using eluents of various ratios of ethyl acetate and n-hexane. In addition, as described in Non-Patent Document 3, The Japan Wood Research Society (2001) 47: 476-482, crushed shoots with leaves of Chamaecyparis obtusa cv. Breviramea were extracted several times with methanol. The extract is suspended in water and extracted with diethyl ether, and the resulting extract is purified by column chromatography using a mixed solvent such as methanol / dichloromethane, ethyl acetate / n-hexane, acetone / dichloromethane as an eluent. Then, it can be isolated and purified by subjecting it to TLC and then reverse phase high performance liquid chromatography.
ピペリトールの誘導体としては、例えば、式Ｉにおいて、Ｒ１がメチルでＲ２が水素原子であるピペリトール以外の化合物であって、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素原子、アルキル基、アシル基またはアルカリ金属である化合物が挙げられる。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１から６の低級アルキル基；アシル基としては、アセチル、プロパノイル、ブタノイルなどの炭素数２から６のアシル基；アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが挙げられる。これらの誘導体のうち、Ｒ１が水素原子でＲ２は水素原子である誘導体は、例えば、ピペリトールを適当な処理剤で処理して、Ｒ１のメチルを水素原子に変換することにより得ることができる。また、ピペリトールまたはこの誘導体を水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどと水溶液中で処理することにより、Ｒ１および／またはＲ２がアルカリ金属である誘導体が得られる。ピペリトールまたはこの誘導体をアセチルクロライド、プロパノイルクロライド、ブタノイルクロライドなどの塩化物と処理することにより、Ｒ１および／またはＲ２がアシル基である誘導体が得られる。これらの変換反応は自体はいずれも当業者に周知の化学反応であり、従って当業者にとって容易に実施可能である。 Examples of the derivatives of piperitol are compounds other than piperitol, in which, in formula I, R1 is methyl and R2 is a hydrogen atom, and R1 and R2 are each a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, or an alkali metal Is mentioned. Examples of the alkyl group include lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, and propyl; examples of the acyl group include acyl groups having 2 to 6 carbon atoms such as acetyl, propanoyl, and butanoyl; examples of the alkali metal include sodium, Examples include potassium and lithium. Among these derivatives, a derivative in which R1 is a hydrogen atom and R2 is a hydrogen atom can be obtained, for example, by treating piperitol with an appropriate treating agent to convert methyl of R1 into a hydrogen atom. Further, by treating piperitol or this derivative with sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like in an aqueous solution, a derivative in which R1 and / or R2 is an alkali metal can be obtained. By treating piperitol or a derivative thereof with a chloride such as acetyl chloride, propanoyl chloride, butanoyl chloride, a derivative in which R1 and / or R2 is an acyl group is obtained. All of these conversion reactions are chemical reactions well known to those skilled in the art, and thus can be easily performed by those skilled in the art.
ピペリトールおよびその誘導体は、植物に対して、発芽抑制作用あるいは成長抑制作用を有し、従って、植物抑制剤として用いることができる。ピペリトールおよびその誘導体は、そのまま植物抑制剤として使用してもよいが、例えば、固体担体と混合あるいはそれに吸着させ、あるいは適宜液体担体で希釈し、必要に応じて界面活性剤、溶剤およびその他の製剤用補助剤を添加して、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、懸濁剤などに製剤化して用いることができる。これらの製剤には、通常、そのまま使用するものと、水などに希釈して使用するものとがあるが、希釈する場合、ピペリトールまたはその誘導体の濃度は５００ｐｐｍ以上になるように希釈することが望ましい。製剤に使用する固体担体としてはクレー、タルク炭酸カルシウム、珪藻土、ベントナイトなど、液体担体としては、脂肪族溶剤、芳香族溶剤、灯油などの炭化水素溶剤がある。そのほかの溶剤としてはアルコール類、多価アルコール類、多価アルコール誘導体類、ケトン類、エステル類、油脂類などがある。例えば、これらの溶剤と界面活性剤を組み合わせることにより様々な製剤化が可能である。
ピペリトールまたはその誘導体は、例えば、マイクロカプセル化などによって包埋し、水田、湿地など、製剤が拡散しやすい場所に使用することも出来る。
本発明の植物抑制剤は、他の除草剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、その他の植物成長調整剤、肥料、土壌改良剤などと混合して使用することも出来る。
Piperitol and its derivatives have a germination-inhibiting action or a growth-inhibiting action on plants, and therefore can be used as plant inhibitors. Piperitol and its derivatives may be used as plant inhibitors as they are, for example, mixed with a solid carrier or adsorbed on it, or diluted appropriately with a liquid carrier, and if necessary, surfactants, solvents and other preparations Can be formulated into powders, granules, emulsions, wettable powders, suspensions and the like. Some of these preparations are usually used as they are, and others are used after diluting in water or the like. When diluting, it is desirable to dilute the concentration of piperitol or its derivative to 500 ppm or more. . Solid carriers used in the preparation include clay, talc calcium carbonate, diatomaceous earth, bentonite and the like, and liquid carriers include aliphatic solvents, aromatic solvents, and hydrocarbon solvents such as kerosene. Other solvents include alcohols, polyhydric alcohols, polyhydric alcohol derivatives, ketones, esters, fats and the like. For example, various formulations can be made by combining these solvents and surfactants.
Piperitol or a derivative thereof can be embedded, for example, by microencapsulation or the like, and can be used in a place where the preparation is easily diffused, such as paddy fields and wetlands.
The plant inhibitor of the present invention can be used by mixing with other herbicides, fungicides, insecticides, acaricides, other plant growth regulators, fertilizers, soil improvers and the like.
ピペリトールまたはその誘導体を有効成分とする本発明の植物抑制剤は、植物が芽を出すもしくは成育する土壌表面に散布および／または土壌に混合することにより、あるいは植物が芽を出すもしくは成育する水中に浸漬することにより、植物を抑制することができる。
植物抑制剤を、土壌表面に散布する場合には、該有効成分の散布量は、剤形、使用状況、使用場所、使用方法、対象作物によって異なり、必要に応じて増減することは可能である。通常、有効成分の散布量は、０．１ｇ／ｍ２以上、好ましくは１．０ｇ／ｍ２以上であり、また、土壌に混合する場合は、有効成分の濃度が、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上となる量を混合する。
水に浸漬して用いる場合の有効成分の量は、対象とする水田や池などの面積等に応じて適当に決定することができる。
本発明の植物抑制剤は、いずれの植物にも適用可能であるが、特に、白クローバー、アカツメクサ、カラスノエンドウ、ゲンゲ、クズなどのマメ科植物、レタス、アゲラタム、ブタクサ、オオアレチノギク、セイタカアワダチソウ、ハルジオン、ヒメジョオン、ハハコグサなどのキク科植物に適している。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
The plant inhibitor of the present invention comprising piperitol or a derivative thereof as an active ingredient is applied to and / or mixed with the soil surface where the plant sprouts or grows, or in the water where the plant sprouts or grows. Plants can be suppressed by soaking.
When a plant inhibitor is sprayed on the soil surface, the amount of the active ingredient sprayed varies depending on the dosage form, usage status, place of use, method of use, target crop, and can be increased or decreased as necessary. . Usually, the application amount of the active ingredient is 0.1 g / m 2 or more, preferably 1.0 g / m 2 or more. When mixed with soil, the concentration of the active ingredient is usually 0.1 g / L. Above, preferably an amount of 0.5 g / L or more is mixed.
The amount of the active ingredient when used by immersing in water can be appropriately determined according to the area of the target paddy field or pond.
The plant inhibitor of the present invention can be applied to any plant, in particular, legumes such as white clover, red clover, oak, peas, genus, and cucumber, lettuce, ageratum, ragweed, giant peony, stag beetle, Suitable for asteraceae plants such as Halzion, Himejoon, Hakhakusa.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these.
ピペリトールの単離・精製
１．極性溶媒による抽出と発芽抑制試験
１−１．極性溶媒による抽出
ヒノキ葉粉末を 60℃ で通風乾燥し、絶乾状態にした後、ミルを用いて粉末状に加工した。この粉末 50ｇ に 80％ メタノールを粉末重量の 5 倍量の 250 ml 加え、よく攪拌し、さらに超音波処理を施した。処理後、吸引ろ過を行い、メタノール抽出液を得た。次いで、メタノールを減圧濃縮し、水溶液としたものをpH7 に調整し、n-ヘキサン、酢酸エチル、n-ブタノールで液々分配し、次いで水溶液を pH2 に調整し、n-ヘキサン、酢酸エチル、n-ブタノールで液々分配し、最終の水溶液を加えて 7 画分を得た。
Isolation and purification of piperitol Extraction with polar solvent and germination inhibition test 1-1. Extracted cypress leaf powder with a polar solvent was dried by ventilation at 60 ° C. to make it completely dry, and then processed into powder using a mill. To 50 g of this powder, 250 ml of 80% methanol, 5 times the weight of the powder, was added, stirred well, and further subjected to ultrasonic treatment. After the treatment, suction filtration was performed to obtain a methanol extract. Next, the methanol was concentrated under reduced pressure, and the aqueous solution was adjusted to pH 7 and partitioned with n-hexane, ethyl acetate, and n-butanol. The aqueous solution was then adjusted to pH 2, and n-hexane, ethyl acetate, n -Partitioned with butanol and added the final aqueous solution to obtain 7 fractions.
１−２．発芽抑制試験
ヒノキ葉乾燥粉末から抽出した７画分を用いて発芽試験を行った。7 画分を乾固した後、それぞれの重量を測定した。重量測定をし、各画分を 30ｍｌ のメタノールに溶解後、各抽出液を植物に対する影響を考えて、EC、pHの調整を行った。EC が 1m／s 以下になるように蒸留水で希釈した。各サンプルの pH を測定し、4.5〜6.5 の間に調整した。調整後、各抽出液 300μｌ を 100％ メタノール 6ｍｌにそれぞれ溶解し、それをガラスシャーレに入れた脱脂綿(2.5cm×2.5cm) 1 枚あたり 1.5ml 添加した。メタノールの影響がでないようにシャーレに蓋をし、デシケーターに入れ 3 時間の減圧乾固をして完全にメタノールを飛ばした。脱脂綿に蒸留水を 2ml 添加後、脱脂綿上に白クローバーの種を 9 粒播種し、シャーレに蓋をして、25℃ 暗黒下で培養した。168 時間後、発芽率、幼根長、胚軸長、根端褐変率を測定した。
その結果を表１に示した。表１の結果から分かるように、ｐH７酢酸エチル画分に発芽抑制効果が確認された。実際の施用量に基づいて調整すると、ｐH７ 酢酸エチル画分は 2415ppm の濃度に調整されたことになるので、以後 2415ppm以上を調整濃度として 2500ppm で活性を測ることとした。
1-2. Germination suppression test A germination test was performed using 7 fractions extracted from dried cypress leaf powder. After the 7 fractions were dried, the weight of each was measured. After weighing, each fraction was dissolved in 30 ml of methanol, and each extract was adjusted for EC and pH in consideration of the effect on plants. Diluted with distilled water so that the EC would be 1 m / s or less. The pH of each sample was measured and adjusted between 4.5 and 6.5. After the adjustment, 300 μl of each extract was dissolved in 6 ml of 100% methanol, and 1.5 ml was added per absorbent cotton (2.5 cm × 2.5 cm) placed in a glass petri dish. The petri dish was capped so that it was not affected by methanol, placed in a desiccator and dried under reduced pressure for 3 hours to completely blow off the methanol. After adding 2 ml of distilled water to absorbent cotton, 9 seeds of white clover were sown on the absorbent cotton, covered with a petri dish, and cultured in the dark at 25 ° C. After 168 hours, germination rate, radicle length, hypocotyl length, and root tip browning rate were measured.
The results are shown in Table 1. As can be seen from the results in Table 1, a germination inhibitory effect was confirmed in the pH 7 ethyl acetate fraction. When adjusted based on the actual application rate, the pH 7 ethyl acetate fraction was adjusted to a concentration of 2415 ppm, and hence the activity was measured at 2500 ppm with an adjusted concentration of 2415 ppm or higher.
２．ｐH７ 酢酸エチル画分の発芽抑制物質の精製
２−１．シリカゲルクロマトグラフィーによる精製−１
分離したい Crude サンプルの重さの 5倍量（ヒノキの場合葉油成分が多いため分離するのには 5 倍量のシリカゲルが必要）のシリカゲル（Silica gel 60：70-230mesh）を先端に綿をつめたクロマト管に充填し、後から等量のシリカゲルに Crude サンプルであるｐＨ７酢酸エチル画分を添着させ、減圧乾固させたものを重層させた。全体として、カラムの長さが、添着、分離層合わせて 15〜20cm の長さになるようなクロマト管を選択した。
カラム上層から以下の組成の溶媒を展開として流した。溶媒量は全シリカゲル体積の 10 倍量の溶媒を用いた。
Fraction 1. へキサン 100％
2. ヘキサン：酢酸エチル＝80：20
3. ヘキサン：酢酸エチル＝50：50
4. ヘキサン：酢酸エチル＝20：80
5. 酢酸エチル 100％
6. ジクロロメタン 100％
7. ジクロロメタン：メタノール＝95：5
8. ジクロロメタン：メタノール＝90：10
9. ジクロロメタン：メタノール＝50：50
それぞれ組成ごとに分け取り、以下に記載する濃度による発芽試験を行い、発芽抑制効果のあるヘキサン：酢酸エチル＝80：20とヘキサン：酢酸エチル＝50：50のフラクションをあわせて（フラクション2とする）、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。
2. 2. Purification of germination inhibitor of pH7 ethyl acetate fraction 2-1. Purification by silica gel chromatography-1
Put the cotton on the tip of silica gel (Silica gel 60: 70-230mesh) that is 5 times the weight of the Crude sample you want to separate. The packed chromatograph tube was filled, and then a crude sample of pH7 ethyl acetate fraction was attached to an equal amount of silica gel, and dried under reduced pressure, and was overlaid. As a whole, the chromatograph tube was selected so that the length of the column combined with the attached and separated layers was 15 to 20 cm.
A solvent having the following composition was allowed to flow from the upper layer of the column as a development. The solvent amount was 10 times the total volume of silica gel.
Fraction 1. Hexane 100%
2. Hexane: ethyl acetate = 80:20
3. Hexane: ethyl acetate = 50:50
4. Hexane: ethyl acetate = 20:80
5. Ethyl acetate 100%
6. Dichloromethane 100%
7. Dichloromethane: methanol = 95: 5
8. Dichloromethane: methanol = 90: 10
9. Dichloromethane: methanol = 50: 50
Divided into each composition, germination test was carried out at the concentrations described below, and the fractions of hexane: ethyl acetate = 80: 20 and hexane: ethyl acetate = 50: 50, which have germination inhibiting effects, were combined (referred to as fraction 2) ) And again subjected to silica gel column chromatography.
２−２．濃度による発芽試験
各抽出物をアッセイに使用したい濃度になるように、メタノールにより濃度を調整し、24 穴シャーレに入れた 1.25cm 角に切った綿に 375μl 添加した。シャーレの蓋をして、デシケーターにいれ 3 時間の減圧乾固した。メタノールがとんだら 475μl の蒸留水を添加し、白クローバーの種 9 粒を播種し、イチゴパックで蓋をして 25℃暗黒下で培養する。168 時間後、発芽率、幼根長、胚軸長、根端褐変率を測定した。
2-2. Germination test by concentration The concentration of each extract was adjusted with methanol so that it would be the concentration to be used in the assay, and 375 μl was added to cotton cut into a 1.25 cm square in a 24-well petri dish. Cover the petri dish and put it in a desiccator to dry under reduced pressure for 3 hours. When methanol is stopped, add 475 µl of distilled water, seed 9 seeds of white clover, cover with a strawberry pack and incubate in the dark at 25 ° C. After 168 hours, germination rate, radicle length, hypocotyl length, and root tip browning rate were measured.
２−３．シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製−２
ヘキサン：酢酸エチル＝80：20とヘキサン：酢酸エチル＝50：50をあわせてフラクション 2 とし、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。分離したい Crude サンプルの重さの 5 倍量のシリカゲル（Silica gel 60：70-230mesh）を先端に綿をつめたクロマト管に充填し、後から等量のシリカゲルに Crude サンプルを添着させ、減圧乾固させたものを重層させた。全体として、カラムの長さが、添着、分離層合わせて 15〜20cm の長さになるようなクロマト管を選択した。
カラム上層から以下の組成の溶媒を展開液として流した。溶媒量はシリカゲル体積の 10 倍量の溶媒を用いた。
Fraction 2-1. ヘキサン 100％
2-2. ヘキサン：酢酸エチル＝95： 5
2-3. ヘキサン：酢酸エチル＝90：10
2-4. ヘキサン：酢酸エチル＝80：20
2-5. ヘキサン：酢酸エチル＝70：30
2-6. ヘキサン：酢酸エチル＝60：40
2-7. ヘキサン：酢酸エチル＝50：50
2-8. ヘキサン：酢酸エチル＝20：80
2-9. 酢酸エチル 100％
それぞれ組成ごとに分けて取り、上記したと同様に濃度による発芽試験を行った。発芽抑制効果のある一番活性の高い Fraction 2-4 と、２番目以降の活性の Fraction 2-5、2-6 および 2-7 をそれぞれ、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。
2-3. Purification by silica gel column chromatography-2
Hexane: ethyl acetate = 80: 20 and hexane: ethyl acetate = 50: 50 were combined to make fraction 2, which was again subjected to silica gel column chromatography. Fill a chromatographic tube with cotton at the tip of silica gel (Silica gel 60: 70-230mesh) 5 times the weight of the Crude sample to be separated, and then attach the Crude sample to an equal amount of silica gel and dry under reduced pressure. The solidified ones were overlaid. As a whole, the chromatograph tube was selected so that the length of the column combined with the attached and separated layers was 15 to 20 cm.
A solvent having the following composition was allowed to flow from the upper layer of the column as a developing solution. The solvent amount was 10 times the volume of silica gel.
Fraction 2-1. Hexane 100%
2-2. Hexane: ethyl acetate = 95: 5
2-3. Hexane: ethyl acetate = 90: 10
2-4. Hexane: ethyl acetate = 80:20
2-5. Hexane: ethyl acetate = 70:30
2-6. Hexane: ethyl acetate = 60:40
2-7. Hexane: ethyl acetate = 50:50
2-8. Hexane: ethyl acetate = 20:80
2-9. Ethyl acetate 100%
Each of the compositions was taken separately, and a germination test by concentration was performed as described above. Fraction 2-4 having the highest activity with germination inhibitory effect and Fraction 2-5, 2-6 and 2-7 having the second and subsequent activities were again subjected to silica gel column chromatography.
２−４．シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製−３
それぞれのフラクションをカラムクロマトグラフィーにかけた。分離したい Crude サンプルの重さの 5 倍量のシリカゲル（Silica gel 60：70-230mesh）を先端に綿をつめたクロマト管に充填し、後から等量のシリカゲルに Crude サンプルを添着させ、減圧乾固させたものを重層させ、カラム上層から以下の組成の溶媒を展開として流した。全体として、カラムの長さが、添着、分離層合わせて 15〜20cm の長さになるようなクロマト管を選択した。
また別の方法として、サンプルの重さが 1g 以下の少量の場合は精製度合いによって、理論段数をあげるため、あらかじめ、ヘキサンに懸濁しておいたシリカゲルをクロマト管にそそぎ、上から少量の溶媒にとかしたサンプルをのせ、溶媒を注ぎ、溶出させる方法をとる。フラクションはカラムから落ちる溶出液の色（自然光、目視）で分けた。
Fraction 2-4-1. ヘキサン 100％
2-4-2. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-3. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-4. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-5. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-6. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-7. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-4-8. ヘキサン：酢酸エチル＝1：1
2-4-9. ヘキサン：酢酸エチル＝1：1
2-4-10. ヘキサン：酢酸エチル＝1：1
2-4-11. 酢酸エチル 100％
2-4-12. 酢酸エチル 100％
上記と同様にして発芽抑制試験を行ったところ、フラクション 2-4-5、2-4-6、2-4-7 に発芽抑制物質が含まれていた。
2-4. Purification by silica gel column chromatography-3
Each fraction was subjected to column chromatography. Fill a chromatographic tube with cotton at the tip of silica gel (Silica gel 60: 70-230mesh) 5 times the weight of the Crude sample to be separated. The solidified ones were overlaid, and a solvent having the following composition was allowed to flow as a development from the upper layer of the column. As a whole, the chromatograph tube was selected so that the length of the column combined with the attached and separated layers was 15 to 20 cm.
Alternatively, if the sample weighs less than 1 g, the silica gel previously suspended in hexane is poured into a chromatograph tube to increase the number of theoretical plates depending on the degree of purification. Place the melted sample, pour solvent and elute. Fractions were separated by the color of the eluate falling from the column (natural light, visual observation).
Fraction 2-4-1. Hexane 100%
2-4-2. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-3. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-4. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-5. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-6. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-7. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-4-8. Hexane: ethyl acetate = 1: 1
2-4-9. Hexane: ethyl acetate = 1: 1
2-4-10. Hexane: ethyl acetate = 1: 1
2-4-11. Ethyl acetate 100%
2-4-12. Ethyl acetate 100%
When a germination suppression test was performed in the same manner as described above, germination inhibitory substances were contained in fractions 2-4-5, 2-4-6, and 2-4-7.
２−５．シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製−４
フラクション2-5、2-6 および 2-7 をまとめてフラクション 2-5 とし、展開溶媒としては以下の溶媒を用いた。
Fraction 2-5-1. ヘキサン 100％
2-5-2. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-5-3. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-5-4. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-5-5. ヘキサン：酢酸エチル＝7：3
2-5-6. ヘキサン：酢酸エチル＝6：4
2-5-7. ヘキサン：酢酸エチル＝6：4
2-5-8. 酢酸エチル 100％
上記と同様の発芽抑制試験を行ったところ、フラクション2-5-2、2-5-3、2-5-4 および 2-5-6 に発芽抑制物質が含まれていた。
2-5. Purification by silica gel column chromatography-4
Fractions 2-5, 2-6 and 2-7 were combined into fraction 2-5, and the following solvents were used as developing solvents.
Fraction 2-5-1. Hexane 100%
2-5-2. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-5-3. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-5-4. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-5-5. Hexane: ethyl acetate = 7: 3
2-5-6. Hexane: ethyl acetate = 6: 4
2-5-7. Hexane: ethyl acetate = 6: 4
2-5-8. Ethyl acetate 100%
When a germination suppression test similar to the above was performed, fractions 2-5-2, 2-5-3, 2-5-4 and 2-5-6 contained a germination inhibitor.
２−６．TLC による精製
カラムにより精製したフラクション2-4-5、2-4-6、2-4-7、2-5-2、2-5-3、2-5-4 および 2-5-6のそれぞれを TLC（TLCplate Silicagel60 F254）でヘキサン：酢酸エチル＝1：1＋0.1％CH3COOH の展開溶媒で展開すると、Rf 0.00〜0.92、366nm下で青色蛍光物質から赤色に蛍光する物質までの間に数種の発芽抑制物質が含まれていることを確認した。その中で、一番精製しやすい物質Ａを精製した。
物質Ａの TLC パターンは、蛍光剤ありの TLC（Silica Gel 60 F254 MERCK）にチャージし、展開液にヘキサン：酢酸エチル＝1：1＋0.1％CH3COOHで展開すると、254nm 下で Rf 0.57 に吸収を持つものであった。
よって活性物質Ａ活性区を TLC により精製し、酢酸エチルで溶出した。その後、HPLC で分析、分取することにした。
2-6. Of fractions 2-4-5, 2-4-6, 2-4-7, 2-5-2, 2-5-3, 2-5-4 and 2-5-6 When each is developed with TLC (TLCplate Silicagel 60 F254) with a developing solvent of hexane: ethyl acetate = 1: 1 + 0.1% CH 3 COOH, the range from Rf 0.00 to 0.92 to a substance that fluoresces red at 366 nm. Was confirmed to contain several germination inhibitors. Among them, the substance A that was most easily purified was purified.
The TLC pattern of substance A was charged to TLC (Silica Gel 60 F254 MERCK) with a fluorescent agent, and developed with hexane: ethyl acetate = 1: 1 + 0.1% CH 3 COOH in the developing solution. It had absorption.
Therefore, the active substance A active section was purified by TLC and eluted with ethyl acetate. After that, we decided to analyze and sort by HPLC.
２−７．HPLCによる分析・分取
使用カラムは島津社製 PREP-ODS(H)・KITの分析カラム(4.6×25)、分取カラム（20×250）を用いた。
物質Ａは、溶離液にはアセトニトリル：水＝50：50 流速８ml／minで分取した場合、17.508 分に検出され、アセトニトリル：水＝50：50 流速 1ml／minで分析した場合、7.688 分に検出され、PDA 検出器では 231nm で 202.4、233.0、283.8 に吸収を持つピークであった。
2-7. As HPLC analysis / preparative columns, Shimadzu PREP-ODS (H) · KIT analytical columns (4.6 × 25) and preparative columns (20 × 250) were used.
Substance A is detected in 17.508 minutes when fractionated with acetonitrile: water = 50: 50 flow rate 8 ml / min in the eluent, and at 7.688 minutes when analyzed with acetonitrile: water = 50: 50 flow rate 1 ml / min. It was detected, and the PDA detector had a peak with absorption at 231 nm at 202.4, 233.0, and 283.8.
３．構造解析
物質Ａについて、HPLC によって分取後、これを減圧乾固して純粋な透明、棒状の結晶まで精製し、2.6mg の結晶を得た。これを MS、NMR により構造解析を行った。
３−１．LCTOFMS 測定
測定条件
イオン化方式：ESI
測定イオン：正イオン、負イオン
スプレー電圧：3000V
コーン電圧：30V（正イオン）、40V（負イオン）
イオン源温度：150℃
デソルベーション部温度：250℃
測定結果
ESI-MS 測定は、正イオン、負イオン両方行い、正イオンでは m／z 379（M+Na）+が強く観測された。負イオンではm／z 355（M-H）-が強く観測された。よってこの物質は分子量 356 と推定された。
3. The structural analysis substance A was fractionated by HPLC and then dried under reduced pressure to purify it into a pure transparent, rod-like crystal to obtain 2.6 mg of crystals. This was subjected to structural analysis by MS and NMR.
3-1. LCTOFMS measurement
Measurement conditions Ionization method: ESI
Measurement ion: Positive ion, Negative ion Spray voltage: 3000V
Cone voltage: 30V (positive ion), 40V (negative ion)
Ion source temperature: 150 ° C
Desolvation temperature: 250 ° C
Measurement result
ESI-MS measurement was performed for both positive and negative ions, and m / z 379 (M + Na) + was strongly observed for positive ions. In the negative ion m / z 355 (MH) - it was strongly observed. The substance was therefore estimated to have a molecular weight of 356.
３−２．一次元 NMR スペクトル（ 1 HNMR、 13 CNMR、DEPT）
1HNMR スペクトルを図１に示した。図１から分かるように、1HNMR スペクトルではプロトン 19 個が観測された。13CNMR スペクトルを図２に示した。図２から分かるように、13CNMR スペクトルからは炭素ピーク 20 本が観測され、炭素が 20 個であることが推定された。DEPT スペクトル を図３に示した。図３から分かるように、DEPT スペクトルでは、56.92ppm は CH3、73.11、73.18ppm は CH2、134.24、137.05、147.89、149.10、149.65、149.91ppmは四級炭素、その他は CH であった。この結果、分子量 356 から推定した組成式は C20H20O6 となった。
3-2. One-dimensional NMR spectrum (1 HNMR, 13 CNMR, DEPT )
The 1 HNMR spectrum is shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, 19 protons were observed in the 1 HNMR spectrum. The 13 CNMR spectrum is shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, 20 carbon peaks were observed from the 13 C NMR spectrum, and it was estimated that there were 20 carbons. The DEPT spectrum is shown in FIG. As can be seen from FIG. 3, in the DEPT spectrum, 56.92 ppm was CH 3 , 73.11, 73.18 ppm was CH 2 , 134.24, 137.05, 147.89, 149.10, 149.65, 149.91 ppm were quaternary carbon, and the others were CH 3. As a result, the composition formula estimated from the molecular weight 356 was C 20 H 20 O 6 .
３−３．HSQC、COSY スペクトル解析
HSQC スペクトルを図４に示した。図４の HSQC スペクトルを解析し、次いで図５に示した COSYスペクトルの解析を行い結果を合わせると下記に示す部分構造が得られた。なお構造式に記載された記号は、13CNMR で得られたピークを高磁場側から順に A,B,C…S,T と付した記号に対応する。
The HSQC spectrum is shown in FIG. When the HSQC spectrum of FIG. 4 was analyzed and then the COZY spectrum shown in FIG. 5 was analyzed and the results were combined, the partial structure shown below was obtained. The symbols described in the structural formula correspond to the symbols obtained by attaching A, B, C,... S, T to the peaks obtained by 13 CNMR in order from the high magnetic field side.
３−４．HMBC、NOSYスペクトル解析
HMBC スペクトルを図６に示した。図６の HMBC スペクトルから以下に示す構造が確認された。
NOESYスペクトルを図７に示した。図７の NOESY スペクトルを解析した結果は以下のとおりである。以下に主な相関シグナルを示す。
物質Ａについて、MS 測定、NMR 測定を行い解析し、推定構造を得ることが出来た。
以上の各種 NMR 分析結果より、表２に示すように、13C-１Hの化学シフトが確認された。
3-4. HMBC, NOSY spectrum analysis
The HMBC spectrum is shown in FIG. The structure shown below was confirmed from the HMBC spectrum of FIG.
The NOESY spectrum is shown in FIG. The results of analyzing the NOESY spectrum in Fig. 7 are as follows. The main correlation signals are shown below.
The substance A was analyzed by MS measurement and NMR measurement, and an estimated structure was obtained.
From the above NMR analysis results, as shown in Table 2, a chemical shift of 13 C- 1 H was confirmed.
物質名はリグナンの一種であるピペリトールと確認された。この物質はリグナンの一種であるピノレジノールという物質の一方のフェノール性水酸基とメトキシル基の部分がメチレンジオキシになったものである。また、この物質の 1H-NMR および 13C-NMR のデータは、非特許文献３の The Japan Wood Research Society (2001) 47:476-482 に示されているデータと一致した。 The substance name was identified as piperitol, a kind of lignan. This substance is one in which one phenolic hydroxyl group and methoxyl group part of pinoresinol, which is a kind of lignan, is methylenedioxy. Further, the 1 H-NMR and 13 C-NMR data of this substance coincided with the data shown in The Japan Wood Research Society (2001) 47: 476-482 of Non-Patent Document 3.
単離したピペリトールの発芽抑制効果
上記したと同様にして、ピペリトールの発芽抑制試験を行い、その結果を図８に示した。
図８に示したとおり、ピペリトールは顕著な発芽抑制効果を示した。500ppm では完全な抑制効果を示し、125ppm で 50％の 発芽抑制効果を示した。各精製段階での検量線を作成し、図９に示した。図９から分かるように、ピペリトールは、700ppm 以上の濃度があれば、100％の阻害が見られることが明らかになった。同一濃度で比較すると、ピペリトールは精製元の酢酸エチル画分よりも約 1.6 倍、80％メタノール抽出の段階よりも約 2.8 倍の発芽抑制効果を示した。なお、発芽抑制の見られた種子をピペリトールの含まれない培地で培養した場合、発芽、生長した。ここで、ピペリトール 700ppm の量は、ピペリトールを 1.68g／m2 で散布した量に相当する。
Germination inhibition effect of isolated piperitol A piperitol germination inhibition test was conducted in the same manner as described above, and the results are shown in FIG.
As shown in FIG. 8, piperitol showed a remarkable germination inhibitory effect. At 500 ppm, a complete inhibitory effect was shown, and at 125 ppm, a germination inhibitory effect of 50% was shown. A calibration curve at each purification stage was prepared and shown in FIG. As can be seen from FIG. 9, it was revealed that piperitol was inhibited by 100% when the concentration was 700 ppm or more. When compared at the same concentration, piperitol showed a germination inhibitory effect that was approximately 1.6 times that of the ethyl acetate fraction and approximately 2.8 times that of the 80% methanol extraction stage. In addition, when the seed in which germination suppression was observed was cultured in a medium not containing piperitol, germination and growth occurred. Here, the amount of 700 ppm piperitol corresponds to the amount of piperitol sprayed at 1.68 g / m 2 .
本発明によれば、ヒノキ科の葉から抽出されるピペリトールは、他の植物の生理活性に阻害的に働く物質であり、発芽抑制、成長抑制などの生理活性物質として利用できる。また、ピペリトールを植物に適用しその薬効が切れると通常通り植物は発芽することから、化学的に殺滅する従来の農薬とは異なり、生物学的作用を止めることなく防除することが出来る。従来の除草剤のように毒性はなく、安全性も高く、周辺土壌を汚染することもない。
従って、ピペリトールもしくはその誘導体を有効成分とする本発明の植物抑制剤は、従来の農薬と比べて取り扱い上、良好であり、特に環境保全の点では著しく優れており、従来の農薬と併用をすることによって農薬の使用量を削減することが出来る。
According to the present invention, piperitol extracted from cypress leaves is a substance that inhibits the physiological activity of other plants, and can be used as a physiologically active substance such as germination suppression and growth suppression. In addition, when piperitol is applied to a plant and its medicinal properties are lost, the plant will germinate as usual, so that it can be controlled without stopping the biological action, unlike conventional agricultural chemicals that are chemically killed. Unlike conventional herbicides, it is not toxic, highly safe, and does not contaminate the surrounding soil.
Therefore, the plant inhibitor of the present invention comprising piperitol or a derivative thereof as an active ingredient is better in handling than conventional agricultural chemicals, and particularly excellent in terms of environmental conservation, and is used in combination with conventional agricultural chemicals. This can reduce the amount of pesticide used.
Claims (4)
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれメチルおよび水素原子を示す）で表わされるピペリトールを有効成分とする植物抑制剤。 Formula I
(In formula, R1 and R2 respectively show a methyl and a hydrogen atom ) The plant inhibitor which uses piperitol represented by an active ingredient .
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- 2004-02-27 JP JP2004054424A patent/JP4596795B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
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