JP4568463B2 - Drebrin A expression-suppressed animal neuron and non-human model animal - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞及び非ヒトモデル動物、及び該組織細胞及び非ヒトモデル動物を用いたグルタミン酸受容体機能亢進剤又は精神分裂病予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。更には、被検動物の組織細胞のドレブリンＡ遺伝子の異常或いは発現抑制の異常の検査、又は被検動物の組織細胞のグルタミン酸受容体機能の測定を行うことからなる精神分裂病の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミン酸は、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であると考えられており、グルタミン酸受容体は中枢における興奮性シナプス伝達に中心的役割を担っている。哺乳類の脳の神経細胞の興奮性信号はグルタミン酸を神経伝達物質として使っている。このグルタミン酸は樹状突起スパイン上に配置されたグルタミン酸受容体を介してシグナルを次の神経細胞に伝達する。グルタミン酸受容体は、イオンチャネルを内臓して速いシナプス伝達を担うイオンチャネル型グルタミン酸受容体と、Ｇタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝調節型グルタミン酸受容体に大別され、イオンチャネル型受容体は、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒａｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＮＭＤＡ）に感受性のＮＭＤＡ受容体と非感受性のｎｏｎ−ＮＭＤＡ受容体に分類される。このｎｏｎ−ＮＭＤＡ受容体は、更にカイニン酸、α―ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｓｏｘａｚｏｌｅ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ（ＡＭＰＡ）に対する感受性の差により、カイニン酸受容体、ＡＭＰＡ受容体のサブタイプに分類される。
【０００３】
このＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、代謝調節型グルタミン酸受容体は、ともに脳の高次機能発現に欠くことのできないシナプス可塑性に重要な機能を果たすと考えられているが、その分子基盤についてはまだ完全には解明されていない。
神経細胞は、他の体細胞には見られない非常に複雑な形状を有し、核をもつ細胞体からは、樹状突起と軸索という２種類の突起が伸びている。樹枝状に伸びる樹状突起はスパイン（spine）と呼ばれる無数の棘構造を有し、他の細胞からの情報を受け取る機能をもつシナプス後部を形成している。この神経細胞特異的形態は、神経特異的なアクチン結合タンパクにより決定される。このスパインに上記のグルタミン酸受容体が配置されているわけであるが、その配置決定機構として、アクチン細胞骨格との関連が重要だと考えられている。
【０００４】
一方、本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985、J. Biochem. 117, 231-236, 1995）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（J. Neurosci. Res. 38: 149-159, 1994、Exp. Cell Res. 215:145-153, 1994、J. Biol. Chem. 269:29928-29933, 1994）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造中に特異的に存在すること（J. Neurosci. 15: 7161-7170, 1996、Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986、Brain Res. 413, 374-378, 1987）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（J. Biochem. 117, 231-236, 1995）、成熟した神経細胞のスパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986、Brain Res. 413, 374-378, 1987）。
【０００５】
ドレブリンＡはalternative splicing機構によりドレブリンＥに“ｉｎｓ２”と呼ばれる領域が加わった配列をしている。すなわち、５′側から９５６〜１０９３ｂａｓｅにｇｔｃｇｔｃｃｇｔａｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔａａａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｇｇａｃｔｃｃｃｔｔｔｃｃｃｔａｔａｔｃａｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｃｃｃｃａａａｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｔ（配列番号１）が挿入されて発現したものである（Mol. Brain Res. 19, 101-114, 1993、Neuroreport 3, 109-112, 1992）。
【０００６】
また最近、本発明者らは、ドレブリンＡを初代培養神経細胞に発現させると自動的に樹状突起スパインに集まり、しかもその長さを長くすることを見い出した。この発見は、ある一つの蛋白合成量を変化させることによってスパインの形態を変化させることができることを発見した世界で最初の報告である（J. Neurosci. 19, 3918-3925, 1999）。その他、ドレブリンの所属するタンパクファミリーに関して、ドレブリンがADF Homology Domainをもったアクチン結合タンパクの一種に分類できる可能性が示唆されている（Mol. Biol. Cell 9, 1951-1959, 1998）。また、ドレブリンのホモローグとしてＳＨ３Ｐ７が発見されているが、ＳＨ３Ｐ７の機能が明らかになりつつある（Mol. Cell. Biol. 19, 1539-1546, 1999、Nature Biotech. 14, 741-744, 1996）。
【０００７】
その他、神経栄養因子ＢＤＮＦ（Brain-derived neurotrophic factor）を特異ノックアウトするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、外来性のＢＤＮＦがスパイン密度をインビボ及びインビトロで増加させるエストラジオールの効果を遮断し、選択的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＢＤＮＦの発現抑制がエストラジオールに似た効果をもたらし、抗ＢＤＮＦ抗体によりスパイン密度が増加するなど、スパイン密度の調節に関与するＢＤＮＦの役割が明らかにされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11412-11417, 1998）。また、脆弱Ｘ症候群（fragile X syndrome）は、Ｘ染色体にフラジャイル・サイトが存在するため起こる遺伝性の精神遅滞の原因としては最も頻度の高い病気であり、Ｘ染色体上の遺伝子ＦＭＲ１の発現異常、主に発現欠損により引き起こされ、ＦＭＲ１の発現異常は脳神経系の形態異常を伴うが、かかる脆弱Ｘ症候群などの脳神経疾患の治療法は、現在のところ見つかっていない。
【０００８】
また、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体が、その特異的阻害剤によりシナプス活動が抑制されることによりスパインに集積することが、論文で発表されている。
論文には、その機構としてｃＡＭＰ（cyclic adenosine３'，5'−mono−phosphate）依存性蛋白リン酸化酵素が重要であることが示されている。その中で、阻害剤投与により集積するグルタミン酸受容体が正常の機能を持っていることが報告されている（J.Neurosci. 21, 5079-5088, 2001）。
更に、ＮＭＤＡ型グルタミン酸遮断薬が，分裂病様の陽性症状と抗精神病薬抵抗性の陰性症状の双方を発現させることなどから、分裂病においては、特に脳内ドーパミン伝達の亢進やグルタミン酸伝達の低下の可能性が注目されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、グルタミン酸受容体の機能を低下させた動物神経細胞、又はグルタミン酸受容体の機能を低下させた及び／又は精神分裂病徴を発症する非ヒトモデル動物を提供すること、及び該動物神経細胞又は非ヒトモデル動物を用いたグルタミン酸受容体機能亢進剤又は精神分裂病予防或いは治療剤のスクリーニング方法を提供すること、更には、被検動物の組織細胞の遺伝子の異常或いは遺伝子の発現制御の異常の検査、又は被検動物の組織細胞の機能の低下の測定を行うことからなる精神分裂病の診断方法を提供することからなる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、樹状突起スパインのアクチン細胞骨格の調節因子の一つであるドレブリンＡの発現量を、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなドレブリンＡ発現抑制物質を用いて、減少させ、この操作により起こるＮＭＤＡ型受容体の配置の変化を培養神経細胞を用いて解析し、ドレブリンＡの発現を抑制することにより、グルタミン酸受容体の機能を低下させることができることを見い出した。
即ち、培養神経細胞を用いた解析により、ドレブリンタンパク質ファミリーおよびその結合蛋白の発現を調節することによりグルタミン酸受容体の機能を制御することが可能であり、グルタミン酸受容体の機能を制御した神経細胞のような動物神経細胞を作製できることを見い出し、本発明をなした。
【００１１】
また、本発明においては、ドレブリンＡ発現抑制物質をラット脳室内に投与したところ、脳内のドレブリンＡの発現量を減少させることに成功した。そこで、ドレブリンＡの発現を抑制したラットの行動を解析したところ、グルタミン酸受容体の機能の低下と共に、空間記憶形成能力を障害すること無しに、自発運動量の増加や驚愕反応に対するプレパルスインヒビションの衰弱が起きることを確認した。このような行動変化は精神分裂病患者に特有なものであることから、ドレブリンＡの発現を抑制すれば、精神分裂病徴発症モデルの作製が可能であることを見い出した。このことより、本発明では、グルタミン酸受容体の機能を低下させ、且つ精神分裂病徴を発症する非ヒトモデル動物を作製した。
更に、本発明は、該ドレブリンＡの発現を抑制し、グルタミン酸受容体の機能を低下した動物神経細胞及び精神分裂病微発症モデル動物を用いて、グルタミン酸受容体機能亢進物質又は精神分裂病予防或いは治療効果を有する物質を検索し、グルタミン酸受容体機能亢進剤又は精神分裂病予防或いは治療剤のスクリーニングを行うことよりなる。また、本発明においては、ドレブリンＡの遺伝子の異常或いは発現制御の異常と精神分裂病徴の発症との関連、又はグルタミン酸受容体の機能の低下と精神分裂病徴の発症との関連が確認されたことから、被検動物の組織細胞のドレブリンＡの遺伝子の異常或いは発現制御の異常の検査、又は被検動物の組織細胞のグルタミン酸受容体機能の低下の測定を行うことにより精神分裂病の診断を行うことを可能とした。
【００１２】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動物神経細胞にドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによりドレブリンＡの発現を抑制し、グルタミン酸受容体の機能を低下させたことを特徴とする動物神経細胞（請求項１）や、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載の動物神経細胞（請求項２）や、動物神経細胞が、中枢神経細胞、抹消神経細胞、又は株化神経細胞であることを特徴とする請求項２記載の動物神経細胞（請求項３）や、神経細胞が、ラット大脳皮質由来であることを特徴とする請求項３記載の動物神経細胞（請求項４）からなる。
【００１３】
また本発明は、請求項１〜４のいずれか記載の動物神経細胞を被検物質に接触させ、グルタミン酸受容体機能を測定することを特徴とするグルタミン酸受容体機能亢進物質のスクリーニング方法（請求項５）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ動物にドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによりドレブリンＡの発現を抑制したことを特徴とするグルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴発症非ヒトモデル動物（請求項６）や、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項６記載のグルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴発症非ヒトモデル動物（請求項７）や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物の脳室内に導入したことを特徴とする請求項６又は７記載のグルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴発症非ヒトモデル動物（請求項８）や、非ヒトモデル動物が、ラットであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のグルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴発症非ヒトモデル動物（請求項９）や、請求項６〜９のいずれか記載のグルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴発症非ヒトモデル動物に、被検物質を投与し、グルタミン酸受容体機能を測定するか又は非ヒトモデル動物の精神分裂病徴の発症の状況を評価することを特徴とするグルタミン酸受容体の機能亢進及び／又は精神分裂病の予防又は治療効果を有する物質のスクリーニング方法（請求項１０）からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、神経特異的アクチン結合タンパクであるドレブリンＡの発現を抑制して、グルタミン酸受容体の機能を低下させた動物神経細胞を構築することよりなる。ドレブリンＡの発現抑制は、動物神経細胞にドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより行わる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号２に示される塩基配列やその他配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有する塩基配列を使用することができる。
本発明において使用できるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びその導入方法については、後に詳述する。
【００１５】
本発明における動物神経細胞としては、例えばラット大脳皮質のような神経細胞が好ましい例として使用できるが、その他の動物神経細胞例としては、大脳皮質以外の中枢神経細胞、末梢神経細胞、及び株化神経細胞などが挙げられる。
本発明において、ドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞のグルタミン酸受容体の機能の低下を確認する方法としては、ドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞のグルタミン酸受容体機能を電気生理学的に解析したり、あるいは、グルタミン酸を投与し、投与後のグルタミン酸受容体の消失或いはα−アクチニンの消失を検知する方法などがある。
【００１６】
次に、本発明は、ドレブリンＡの発現を抑制して、グルタミン酸受容体の機能の低下及び／又は精神分裂病徴を発症する非ヒトモデル動物を構築することよりなる。ドレブリンＡの発現の抑制には、動物にドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより行われる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号２に示される塩基配列やその他配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有する塩基配列を使用することができる。
本発明において使用できるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びその導入方法については、後に詳述する。
本発明において、ドレブリンＡの発現を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの非ヒトモデル動物への導入は、例えば、ラットのような動物の脳室内に導入することにより行われる。
【００１７】
本発明において、ドレブリンＡの発現を抑制し、グルタミン酸受容体の機能を低下した動物神経細胞及び精神分裂病徴発症モデル動物を用いて、グルタミン酸受容体機能亢進物質又は精神分裂病予防或いは治療効果を有する物質を検索し、グルタミン酸受容体機能亢進剤又は精神分裂病予防或いは治療剤のスクリーニングを行うには、被検物質を該動物神経細胞に接触させるか或いは該精神分裂病徴発症モデル動物に投与して、グルタミン酸受容体の機能の上昇の測定あるいは精神分裂病徴の軽快の観察を行うことにより実施できる。
【００１８】
また、本発明においては、ドレブリンの遺伝子の異常或いは発現制御の異常と精神分裂病徴の発症との関連、又はグルタミン酸受容体の機能の低下と精神分裂病徴の発症との関連が確認されたことから、被検動物の組織細胞のドレブリンの遺伝子の異常或いは発現制御の異常の検査、又はグルタミン酸受容体機能の低下の測定を行うことにより精神分裂病の診断を行うことができる。
以下に、本発明の実施の形態について更に詳述する。
【００１９】
（使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２に示される塩基配列（５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′）からなるＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつドレブリンＡ発現抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ）であれば特に制限されるものではないが、生体に投与した際の安定性がより高いという理由でアンチセンスＤＮＡの方が好ましい。
【００２０】
また、上記ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理や、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。このようにして得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２塩基以上３９塩基以下、特に１５塩基以上２５塩基以下のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡが好ましい。
【００２１】
（動物神経細胞又はモデル動物へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入）
動物神経細胞又はモデル動物へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明における大脳皮質のような動物神経細胞又はモデル動物の脳室内へ直接投与することができる。また必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、人工合成脂質ベジクル、リポソーム、膜融合試薬、高分子ミセル化試薬、高分子坦体、またはその他の細胞内導入試薬とともに投与することができる。この場合、発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独でも投与可能であるが、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する場合には、注射剤のような形で投与することができる。注射剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを水、生理食塩水またはブドウ糖溶液等に溶解させて調製することができ、必要に応じて緩衝剤、保存剤あるいは安定化剤等を含有させてもよい。
【００２２】
また、細胞への取り込みの促進や標的とする細胞への指向性を高める目的で、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を発現させるようにデザインされたプラスミドやウイルスベクターを遺伝子治療用のベクターとして用いることもできる。このようなベクターとしては、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター等のウイルスベクターを好適に挙げることができるが、これらウイルスベクターの中でもＨＳＶベクターが好ましい。ＨＳＶベクターは、神経親和性が高く、ＨＳＶが細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれないため安全であり、また、導入遺伝子の発現期間を調節することが可能である。また、ウイルスベクターを用いる場合、リコンビナーゼが認識する逆方向反復配列、例えば大腸菌Ｐ１ファージ由来のｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロミセス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を利用すると、所望の時期に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させることができる。
【００２３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（神経細胞の調製、培養）
妊娠２０日のSprague-Dawleyラットをエーテル麻酔し、断頭後、胎仔を取り出した。大脳皮質を摘出して髄膜を剥がし、パパイン添加ＣＧＢＤ溶液に入れて、３７℃恒温槽で１５分間放置した。上清を吸引除去し、ＭＥＭ培地５ｍｌで洗浄し、再度上清を吸引除去した後、ＭＥＭ培地３ｍｌと馬血清２ｍｌを加えてピペッティングし、神経細胞含有溶液をフィルター濾過してから遠心し、上清を捨て、５％牛血清、５％馬血清を含むＭＥＭ培地で攪拌し、直径３．５ｃｍのディッシュ内に３．０×１０6／２ｍｌ（ウェスタンブロット用）、又は２．０×１０6／２ｍｌ（免疫染色用）の濃度で２ｍｌずつそれぞれ注入した。これらディッシュ内の神経細胞をＣＯ2インキュベーター内で３７℃で培養した。５日目以降、ＡｒａＣ５μＭ入りグリアコンディション培地を用い、週に２回、培地を半量ずつ交換して培養を継続した。
【００２４】
実施例２（神経細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与）
培養開始１２日目に、調製したドレブリンA発現抑制物質であるアンチセンスオリゴヌクレオチド５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′（配列番号２）を最終濃度が１０μＭになるように、該アンチセンスオリゴヌクレオチド単独、或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド（１０μＭ）とグルタミン酸（１００μＭ）を培地内に投与し、その２日後に神経細胞を回収し、免疫染色とウェスタンブロット分析を行った。
【００２５】
実施例３（ウエスタンブロット分析）
アンチセンス鎖投与２日後における神経細胞内のドレブリンＡタンパクの発現量を調べるために、ウエスタンブロット分析を行った。神経細胞の抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分離し、分離したタンパク質をメンブレンフィルター（MILIPORE社製「Immobilon transfer membranes」）にブロッティングした。このブロッティングした膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳで５倍希釈した抗ドレブリンＡ抗血清（Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994)；抗ドレブリンＡポリクローナル抗体）含有溶液中、室温で６０分間インキュベーションした。０．０５％のツイーン２０を含むＴＢＳで洗浄後、５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈したＨＲＰ標識化抗ラビットＩｇＧ抗体のＦ(ａｂ′)2フラグメント（カッペル社製）溶液に上記インキュベーションした膜を浸した。抗原特異的ＨＲＰ反応により生じた化学ルミネッセンスをKodak Scientific Imaging Film（X-OMAT AR, Kodak）とECL detection kit（Amersham Pharmacia Biotech）により視覚化した。その結果、ドレブリンＡの発現量を低下させることに有効であることがわかった（図１）。
【００２６】
実施例４（免疫染色）
アンチセンス鎖５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′（配列番号２）投与２日後における神経細胞を、３．５％のパラホルムアルデヒドを添加したＰＢＳにより４℃で１５分間振盪固定した後、ＴＢＳ中で室温にて５分間洗浄し、３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて１０分間ブロッキングし、更抗ドレブリンＡ抗血清（Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994)；抗ドレブリンＡポリクローナル抗体）を３％のＢＳＡを含むＰＢＳで希釈して調製した溶液を用いて、室温で６０分間反応させた。これら反応させた標本をＰＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＰＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を用いて室温にて３０分間染色した。これら染色物を遮光したままＰＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄した後、パーマフロー（シャンドン社製）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。この結果を図２に示す。
【００２７】
実施例５（グルタミン酸受容体機能の測定）
上記のように調製したドレブリンAの発現を抑制したラット神経細胞について、グルタミン酸受容体の機能についての測定を行った。
ドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞のグルタミン酸受容体の機能の低下を確認する方法としては、ドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞に、グルタミン酸を投与し、投与後のグルタミン酸受容体の消失或いはα−アクチニンの消失を、特異抗体を用いた間接蛍光抗体染色法を行って、顕微鏡下で観察した。グルタミン酸受容体の機能が阻害された場合は、グルタミン酸受容体の消失およびアルファーアクチニンの消失が起こらなくなるので、この方法によりグルタミン酸受容体の機能を間接的に試験することができる。
（実験結果）
上記試験から、次のような結果が得られ、このことよりドレブリンAの発現を抑制することによって、グルタミン酸受容体の機能の低下が起こっていることが確認された。
（１）ドレブリンAの発現を抑制した結果、グルタミン酸投与後のグルタミン酸受容体の消失が起こらなくなった（図３）。
（２）ドレブリンAの発現を抑制した結果、グルタミン酸投与後のα−アクチニンの消失が起こらなくなった（図４）。
【００２８】
実施例６（ドレブリンＡの発現を抑制した非ヒトモデル動物の構築）
樹状突起スパインの形態形成を制御しているタンパク質であるドレブリンAのアンチセンスオリゴヌクレオチド５′−ＡＧＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＣＴ−３′（配列番号２）を、以下に示す方法によりＨＶＪ−リポソーム遺伝子導入法を用いて、脳室内投与を行うことにより、ラット全脳に導入した。
即ち、ドレブリンＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス）を封入したリポソーム（リン脂質小胞）を作製し、次いでこのリポソームに細胞融合能をもつ不活性化センダイウィルス（ＨＶＪ）を融合させて、アンチセンス含有ＨＶＪ−リポソーム複合体を作製した。このＨＶＪ−リポソーム複合体は細胞融合能をもち、アンチセンスをはじめとする遺伝子を高効率で細胞に導入するベクターとして働く（ＨＶＪ−リポソーム遺伝子導入法）。ＨＶＪ−リポソーム遺伝子導入の際には、アンチセンス含有ＨＶＪ−リポソーム複合体のサスペンジョン３０μｌ（１．２〜３．６μｇオリゴヌクレオチド）を麻酔下で、ラットの脳室にマイクロシリンジ又はガラスミクロピペットを用いて圧注入することにより行った。ＨＶＪ−リポソームベクターにより脳細胞に導入されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２週間に亘って持続的に作用し続けるため、アンチセンス脳内導入ラットの長期に亘る行動実験が可能である。
【００２９】
実施例７（ドレブリンＡの発現を抑制した非ヒトモデル動物の行動解析）
上記のようにして構築した非ヒトモデル動物について、アンチセンスオリゴヌクレオチド注入後４日目に、いくつかの行動課題を行った。
１．オープンフィールド解析
オープンフィールド解析は以下に示す方法により行った。即ち、ラットにとって新規な環境である白色円形ボックス（直径１．５ｍ、高さ０．５ｍ）の中央に、ＢＳＳ注入コントロールラット（bss）又はドレブリンアンチセンス注入ラット（dre）を置き、その行動を３０分間に亘ってビデオカメラにより記録した。この行動記録から、初期１０分間の総移動距離（total distance）を自発運動量として計測した。また３０分間の全行動において、１）立ち止まりやうずくまりからなる移動停止（Lying）、２）直進、方向転換あるいは壁に沿う歩行等からなる移動（Walking）、３）口や手足による毛繕い（Grooming）の３タイプの行動にそれぞれ費やされた時間を情動行動の指標として計測した。新規な環境下における自発運動量の測定を行った結果を、図５に示す。
オープンフィールド解析の結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注入し、ドレブリンＡの発現を抑制したラットでは、全脳でドレブリンＡの発現を抑制した結果、新規な環境下における自発運動量の著明な増加（多動）が起こった（図５上）。さらに、全脳でドレブリンＡの発現を抑制した結果、新規な環境に順応しにくいことからくる毛繕い行動の多発及び移動停止行動の減少（落ち着きの無さ）が認められた（図５下）。上記結果より、ドレブリンＡ発現抑制動物は多動で、かつ新規な環境に順応しにくいと考えられる。
【００３０】
２．空間記憶機能解析
モリスの水迷路課題やプローブテストによる空間記憶機能の解析を以下に示す方法で行った。
即ち、モリスの水迷路課題では、円形プール（直径１．５ｍ、高さ０．５ｍ、水深約０．３ｍ）に入れられたラットが、プールの水面下１．５ｃｍに沈められ隠されている透明なプラットフォーム（直径１５ｃｍ）を見つけ出し、水からプラットフォームに脱出するまでの時間（latency）を計測した。プラットフォームの場所を周囲の視覚的手がかりから空間配置として学習記憶することにより、試行を重ねる毎に水からプラットフォームに脱出する時間が短縮する。１日６回の試行を１セッションとして、５日間５セッション（全３０回試行）で、この水迷路課題を無処置ラット（nt）、ＢＳＳ注入ラット（bss）、逆配列アンチセンス注入ラット（rev）からなる対照群（control）とドレブリンアンチセンス注入ラット（dre）からなる実験群（test）について行った。
更に水迷路課題全３０回試行の後に、１回のプローブテストを行った。プローブテストは、プラットフォームを取り除いたプールに６０秒間ラットを泳がせて、プラットフォームがあった場所を含むプールの４分の１の領域（target quadrant）内での滞在時間を計測し、target quadrantに他の４分の１領域（quadrant）よりも長く滞在するかどうかで、ラットの水迷路課題学習の達成度をチェックした。モリスの水迷路課題やプローブテストによる空間記憶機能の解析結果を、図６に示す。
モリスの水迷路課題では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注入したラットと対照との間で、空間記憶形成に差が見られなかった。プローブテストにおいては、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注入したラットでは、プラットホームがあった場所で、滞在時間の延長が見られた。
空間記憶機能解析の結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注入しドレブリンＡの発現を抑制したラットでは、空間記憶機能に障害はみられなかったが、状況変化（プラットフォームの撤去・消失）の認知に異常が認められた。
【００３１】
３．驚愕反応解析
プレパルスインヒビション（prepulse inhibition：ＰＰＩ）テストで、驚愕反応解析を以下に示す方法で行った。
即ち、荷重変化モニター用の計測器を内蔵した床からなるテスト箱にラットを入れ、１０分間テスト箱に慣れさせた後、背景ノイズ音を聴かせながら５分間新しい環境に順応させた。さらに、驚愕反応を引き起こす音刺激（１２０デシベル、２０ミリ秒）を十分の時間間隔をもって５回与えて、この驚愕音刺激を覚えさせた。次いで、８０デシベル、２０ミリ秒又は７０デシベル、２０ミリ秒の先行音刺激（Prepulse：ＰＰ）と１２０デシベル、２０ミリ秒の驚愕音刺激（Pulse：Ｐ）を１００ミリ秒間隔で組み合わせた２種のペアー刺激（８０ＰＰ＋Ｐ、７０ＰＰ＋Ｐ）、驚愕音刺激のみ（Ｐ）、背景ノイズ音のみの４種類の音刺激を用意し、音刺激４０回（各音刺激１０回×４）をランダムな順序で、平均４０秒の間隔をもってラットに与え、驚愕反応の大きさ（荷重の増加）を記録した。
上記の先行音刺激（ＰＰ）により驚愕音刺激（Ｐ）が誘起する驚愕反応に抑制がかかるプレパルスインヒビション反応（prepulse inhibition：ＰＰＩ）を次の公式に基づき数値化した。
% PPI 80 = [１- (80 PP + P)／(P )] x 100
プレパルスインヒビション反応は、先行刺激を伴う驚愕刺激と驚愕刺激そのものとの違いを識別する知覚情報処理の結果の行動表現であり、このＰＰＩ反応の減少は、知覚内容を識別する認知機能の障害を意味している。上記のＰＰＩテストをＢＳＳ注入ラット（bss）、逆配列アンチセンス注入ラット（rev）からなる対照群とドレブリンアンチセンス注入ラット（dre）からなる実験群について行った。
【００３２】
ＰＰＩテストでは、８０デシベルでＰＰＩ減少傾向がみられ、７０デシベルで有意なＰＰＩ減少がみられた。このＰＰＩ反応異常（驚愕反応を誘起する刺激に慣れにくい）は、明かな認知機能の障害と見られる。結果を、図７に示す。
この結果より、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注入し、ドレブリンＡの発現を抑制したラットでは、認知障害が生じると考えられる。
上記１〜３の解析の結果は、非ヒトモデル動物において、ドレブリンＡの発現を抑制すると精神分裂病様の行動異常を生ずることが示された。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によりドレブリンＡの発現を抑制した動物神経細胞及び非ヒトモデル動物を作製することにより、グルタミン酸受容体の機能を低下させた動物神経細胞、或いはグルタミン酸受容体の機能を低下させた及び／又は精神分裂病徴を発症する非ヒトモデル動物を構築することができる。該動物神経細胞又は非ヒトモデル動物は、グルタミン酸受容体機能亢進物質や精神分裂病予防或いは治療効果を有する物質のスクリーニングに利用することができ、グルタミン酸受容体機能亢進剤や精神分裂病予防或いは治療剤の開発に有用な方法を提供することができる。
更には、本発明においては、グルタミン酸受容体の機能の低下と精神分裂病徴の発症との関連を利用して、被検動物の組織細胞のグルタミン酸受容体機能を測定することにより精神分裂病の診断を行うことを可能とする。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したラット神経細胞の、ドレブリンＡタンパクの発現を分析したウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したラット神経細胞の免疫染色の結果を示す図である。
【図３】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したラット神経細胞において、ドレブリンAの発現を抑制した結果、グルタミン酸投与後のグルタミン酸受容体の消失が起こらなくなったことを表す写真を示す図である。
【図４】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したラット神経細胞において、ドレブリンAの発現を抑制した結果、グルタミン酸投与後のα−アクチニンの消失が起こらなくなったことを表す写真を示す図である。
【図５】本発明のドレブリンＡの発現を抑制したラットにおける行動解析において、新規な環境下における自発運動量の測定を行った結果を示す図である。
【図６】本発明のドレブリンＡの発現を抑制したラットにおいて、モリスの水迷路課題やプローブテストによる空間記憶機能の解析を行った結果を示す図である。
【図７】本発明のドレブリンＡの発現を抑制したラットにおいて、プレパルスインヒビション（PPI）テストで、驚愕反応解析を行った結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to animal nerve cells and non-human model animals in which the expression of drebrin A is suppressed, and a screening method for glutamate receptor function enhancers or schizophrenia preventive or therapeutic agents using the tissue cells and non-human model animals. . Furthermore, the present invention relates to a method for diagnosing schizophrenia, comprising testing for abnormalities in drebrin A gene or abnormal expression suppression in tissue cells of a test animal, or measuring glutamate receptor function in tissue cells of the test animal.
[0002]
[Prior art]
Glutamate is thought to be a major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of higher animals, and glutamate receptors play a central role in excitatory synaptic transmission in the center. Mammalian brain neuronal excitability signals use glutamate as a neurotransmitter. This glutamate transmits a signal to the next neuron via a glutamate receptor arranged on the dendritic spine. Glutamate receptors are broadly divided into ion channel glutamate receptors that have a built-in ion channel and are responsible for fast synaptic transmission, and metabotropic glutamate receptors that indirectly transmit signals by coupling with G proteins. Type receptors are classified into N-methyl-D-asparagic acid (NMDA) sensitive NMDA receptors and insensitive non-NMDA receptors. This non-NMDA receptor is further classified into subtypes of kainate receptor and AMPA receptor according to the difference in sensitivity to kainic acid, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isopropylazoleicacid (AMPA). Is done.
[0003]
The NMDA receptor, AMPA receptor, and metabotropic glutamate receptor are all thought to play an important function in synaptic plasticity that is indispensable for the expression of higher-order functions in the brain. It has not been fully elucidated.
A nerve cell has a very complicated shape that is not found in other somatic cells, and two types of protrusions, dendrites and axons, extend from a cell body having a nucleus. Dendrites extending in a dendritic manner have innumerable spine structures called spines, and form a posterior synapse that functions to receive information from other cells. This nerve cell specific morphology is determined by the nerve specific actin binding protein. The glutamate receptor described above is arranged in this spine, and it is considered that the relationship with the actin cytoskeleton is important as the arrangement determining mechanism.
[0004]
On the other hand, the present inventors have discovered, for the first time in the world, actin-binding protein Drebrin that is highly expressed in developing neurons (J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985, J. Biochem. 117, 231-236, 1995), that this drebrin is involved in neuronal morphogenesis, particularly protrusion formation, by changing the properties of actin fibers (J. Neurosci. Res. 38: 149-159, 1994, Exp. Cell) 215: 145-153, 1994, J. Biol. Chem. 269: 29928-29933, 1994) and in developing neurons that are present throughout the cell body and processes, but mature neurons In cells, it exists specifically in the spine structure (J. Neurosci. 15: 7161-7170, 1996, Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986, Brain Res. 413, 374-378, 1987). Proven already. There are two isoforms of drebrin: embryonic type drebrin E and adult type drebrin A (J. Biochem. 117, 231-236, 1995). Drebrin A, which is specifically found in neuronal spines, is characterized by being expressed only in neurons (Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986, Brain Res. 413, 374-378, 1987).
[0005]
Drebrin A has a sequence in which a region called “ins2” is added to drebrin E by an alternative splicing mechanism. Ie, 5 'gtcgtccgtactgccctttcataaaggcatcggacagtgggccttcctcctcctcctcttcctcctcttcccctccacggactccctttccctatatcacctgccaccgcaccccaaacctctcttcctccctcccat to 956~1093base from (SEQ ID NO: 1) in which is expressed is inserted (Mol. Brain Res. 19, 101-114, 1993,
[0006]
Recently, the present inventors have found that when drebrin A is expressed in primary cultured neurons, it automatically gathers in the dendritic spine and increases its length. This discovery is the first report in the world that discovered that the form of a spine can be changed by changing the amount of a protein synthesized (J. Neurosci. 19, 3918-3925, 1999). In addition, regarding the protein family to which drebrin belongs, it has been suggested that drebrin can be classified as a kind of actin-binding protein having an ADF Homology Domain (Mol. Biol. Cell 9, 1951-1959, 1998). In addition, SH3P7 has been discovered as a homologue of drebrin, but the function of SH3P7 is becoming clear (Mol. Cell. Biol. 19, 1539-1546, 1999, Nature Biotech. 14, 741-744, 1996).
[0007]
In addition, antisense oligonucleotides that specifically knock out the neurotrophic factor BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) were prepared, and exogenous BDNF blocked the effects of estradiol, which increases spine density in vivo and in vitro, and selective The role of BDNF involved in the regulation of spine density has been elucidated, such as suppression of BDNF expression using sense oligonucleotides has an effect similar to estradiol, and the spine density is increased by anti-BDNF antibody (Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 11412-11417, 1998). Fragile X syndrome is the most common cause of hereditary mental retardation caused by the presence of fragile sites on the X chromosome, and is an abnormal expression of the gene FMR1 on the X chromosome. Although it is mainly caused by expression deficiency and abnormal expression of FMR1 is accompanied by abnormal morphology of the cranial nervous system, no therapeutic method for such cranial nerve diseases such as fragile X syndrome has been found.
[0008]
In addition, it has been published in the paper that NMDA-type glutamate receptors accumulate in spines by suppressing synaptic activity by their specific inhibitors.
The paper shows that cAMP (
In addition, NMDA-type glutamate blockers develop both schizophrenia-like positive symptoms and negative symptoms of antipsychotic resistance, and so on, especially in schizophrenia, increased dopamine transmission in the brain and decreased glutamate transmission. The possibility of is attracting attention.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an animal nerve cell having a decreased function of glutamate receptor, or a non-human model animal having a decreased function of glutamate receptor and / or developing schizophrenia symptoms, and To provide a screening method for a glutamate receptor function-enhancing agent or a schizophrenia preventive or therapeutic agent using animal neurons or a non-human model animal, and further, abnormalities in gene or expression of genes in tissue cells of test animals It comprises providing a method for diagnosing schizophrenia comprising testing for abnormal control or measuring a decrease in tissue cell function of a subject animal.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor reduced the expression level of drebrin A, which is one of the regulators of the actin cytoskeleton of dendritic spine, using a drebrin A expression inhibitor such as an antisense oligonucleotide. The changes in the arrangement of NMDA type receptors that occurred were analyzed using cultured neurons, and it was found that the function of glutamate receptors can be reduced by suppressing the expression of drebrin A.
That is, it is possible to control the function of the glutamate receptor by regulating the expression of the drebrin protein family and its binding protein by analysis using cultured neuronal cells. It was found that such animal nerve cells could be produced, and the present invention was made.
[0011]
In the present invention, when a drebrin A expression inhibitor was administered into the rat ventricle, the expression level of drebrin A in the brain was successfully reduced. Therefore, we analyzed the behavior of rats that suppressed the expression of drebrin A, and as a result of the decrease in glutamate receptor function, premature inhibition of startle response to increased spontaneous motor activity and startle response without impairing the ability to form spatial memory. Confirmed that the weakness occurred. Since such behavioral changes are peculiar to schizophrenic patients, it has been found that if the expression of drebrin A is suppressed, a schizophrenia symptom onset model can be created. Based on this, in the present invention, a non-human model animal that reduces the function of the glutamate receptor and develops schizophrenia symptoms was produced.
Furthermore, the present invention provides a glutamate receptor function-enhancing substance or a schizophrenia preventive substance or an animal neuron cell and a schizophrenia-onset model animal in which the expression of the drebrin A is suppressed and the glutamate receptor function is reduced. Searching for a substance having a therapeutic effect and screening for an agent for enhancing glutamate receptor function or preventing or treating schizophrenia. In the present invention, the relationship between abnormalities in the drebrin A gene or abnormal expression control and the onset of schizophrenia symptoms, or the reduction in glutamate receptor function and the onset of schizophrenia symptoms has been confirmed. Therefore, diagnosis of schizophrenia by examining abnormalities in drebrin A gene or abnormal expression control in tissue cells of test animals, or measuring decreases in glutamate receptor function in tissue cells of test animals Made it possible to do.
[0012]
That is, the present invention It suppresses the expression of drebrin A by introducing an antisense oligonucleotide that hybridizes with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing under stringent conditions and has a drebrin A expression suppressing action into animal neurons. , An animal neuron characterized by reducing the function of a glutamate receptor (claim 1), A The antisense sequence is a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Consist of It is characterized by
[0013]
The present invention also provides Claims 1-4 A method for screening a glutamate receptor function-enhancing substance, which comprises contacting the animal neuron according to any of the above with a test substance and measuring glutamate receptor function ( Claim 5 ) And By introducing an antisense oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and has an action of suppressing drebrin A expression in animals. Non-human animal model with decreased glutamate receptor function and / or onset of schizophrenia characterized by suppression of drebrin A expression ( Claim 6 ) And A The antisense sequence is a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Consist of It is characterized by Claim 6 A non-human animal model with a reduced function of the glutamate receptor and / or onset of schizophrenia ( Claim 7 ) And antisense oligonucleotides are introduced into the animal's
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention comprises constructing animal nerve cells in which the expression of drebrin A, which is a nerve-specific actin-binding protein, is suppressed and the function of glutamate receptors is reduced. The suppression of drebrin A expression is performed by introducing an antisense oligonucleotide having a drebrin A expression suppression action into animal neurons. As an antisense oligonucleotide, a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing or other nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and that has a drebrin A expression suppressing action Can be used.
Antisense oligonucleotides that can be used in the present invention and methods for their introduction will be described in detail later.
[0015]
As the animal neuron in the present invention, for example, a neuron such as rat cerebral cortex can be used as a preferred example. Examples include nerve cells.
In the present invention, as a method for confirming a decrease in the glutamate receptor function of animal nerve cells in which the expression of drebrin A is suppressed, the glutamate receptor function in animal nerve cells in which the expression of drebrin A is suppressed is analyzed electrophysiologically. Alternatively, there is a method of detecting glutamic acid receptor disappearance or α-actinin disappearance after administration of glutamic acid.
[0016]
Next, the present invention consists in constructing a non-human model animal that suppresses the expression of drebrin A and develops a decrease in glutamate receptor function and / or symptoms of schizophrenia. Suppression of drebrin A expression is performed by introducing an antisense oligonucleotide having a drebrin A expression suppression action into an animal. As an antisense oligonucleotide, a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing or other nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and that has a drebrin A expression suppressing action Can be used.
Antisense oligonucleotides that can be used in the present invention and methods for their introduction will be described in detail later.
In the present invention, an antisense oligonucleotide for suppressing the expression of drebrin A is introduced into a non-human model animal by, for example, introducing it into the ventricle of an animal such as a rat.
[0017]
In the present invention, a glutamate receptor function-enhancing substance or a schizophrenia preventive or therapeutic effect is obtained using an animal neuron and a schizophrenic onset model animal that suppresses the expression of drebrin A and decreases the function of glutamate receptor. In order to search for substances possessing and screen for glutamate receptor function enhancers or preventive or therapeutic agents for schizophrenia, the test substance is brought into contact with the nerve cells of the animal or administered to the animal model of schizophrenia symptoms Thus, it can be carried out by measuring the increase in glutamate receptor function or observing the improvement of schizophrenia symptoms.
[0018]
Further, in the present invention, it was confirmed that the relationship between abnormalities in the drebrin gene or abnormal expression control and the onset of schizophrenia symptoms, or the reduction in glutamate receptor function and the onset of schizophrenia symptoms. Thus, diagnosis of schizophrenia can be performed by examining abnormalities in drebrin gene or abnormal expression control in tissue cells of test animals, or measuring the decrease in glutamate receptor function.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
[0019]
(Antisense oligonucleotide used)
The antisense oligonucleotide of the present invention hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (5'-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 ') or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the antisense oligonucleotide (antisense DNA or antisense RNA) having an inhibitory action on drebrin A expression is not particularly limited, but antisense is more stable when administered to a living body. DNA is preferred.
[0020]
The hybridization conditions under the above stringent conditions include, for example, hybridization at 42 ° C., and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS, Examples include hybridization at 65 ° C. and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS. In addition, there are various factors other than the above temperature conditions as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art will be able to combine various components as appropriate to achieve the same stringency of hybridization as exemplified above. Stringency can be realized. The antisense oligonucleotide thus obtained is preferably an antisense DNA or antisense RNA having 12 to 39 bases, particularly 15 to 25 bases.
[0021]
(Introduction of antisense oligonucleotides into animal neurons or model animals)
For the introduction of antisense oligonucleotides into animal neurons or model animals, methods commonly used in this field can be used.
For example, antisense oligonucleotides can be administered directly into animal neurons such as the cerebral cortex in the present invention or into the ventricle of model animals. If necessary, pharmaceutically acceptable intracellular introduction reagents such as lipofectin reagent, lipofectamine reagent, DOTAP reagent, Tfx reagent, artificially synthesized lipid vesicles, liposomes, membrane fusion reagents, polymeric micellization reagents, high It can be administered with molecular carriers or other intracellular introduction reagents. In this case, the antisense oligonucleotide of the invention can be administered alone, but a normal pharmaceutically acceptable carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent, pH buffer, disintegrant, Various preparation compounding ingredients such as a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent can be added. When an antisense oligonucleotide is administered, it can be administered in the form of an injection. In the case of an injection, it can be prepared by dissolving the antisense oligonucleotide of the present invention in water, physiological saline, glucose solution or the like. If necessary, a buffer, preservative or stabilizer can be added. You may make it contain.
[0022]
In addition, a plasmid or viral vector designed to express the antisense oligonucleotide sequence of the present invention is used as a gene therapy vector for the purpose of promoting uptake into cells or enhancing directivity to target cells. You can also. Suitable examples of such vectors include viral vectors such as herpes virus (HSV) vectors, adenovirus vectors, and human immunodeficiency virus (HIV) vectors. Among these viral vectors, HSV vectors are preferred. HSV vectors have high neurophilicity, are safe because HSV is not integrated into the chromosomal DNA of cells, and can regulate the expression period of the transgene. When a viral vector is used, an inverted repeat sequence recognized by recombinase, for example, a loxP sequence derived from Escherichia coli P1 phage or a wild type FRT sequence derived from yeast Saccharomyces cerevisiae, is used at the desired time. Nucleotides can be expressed.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 (preparation and culture of nerve cells)
Sprague-Dawley rats on
[0024]
Example 2 (Administration of antisense oligonucleotide to nerve cells)
On the 12th day from the start of the culture, the
[0025]
Example 3 (Western blot analysis)
In order to examine the expression level of drebrin A protein in neurons two days after administration of the antisense strand, Western blot analysis was performed. The nerve cell extract was separated by SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the separated protein was blotted on a membrane filter ("Immobilon transfer membranes" manufactured by MILIPORE). The blotted membrane was incubated at room temperature in a solution containing anti-drebrin A antiserum (Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994); anti-drebrin A polyclonal antibody) diluted 5-fold with TBS containing 5% skim milk. Incubated for minutes. F (ab ') of HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody washed with TBS containing 0.05
[0026]
Example 4 (immunostaining)
Two days after administration of the antisense strand 5'-AGGAAGGCCCCACTGTCCGATGCCT-3 '(SEQ ID NO: 2), the nerve cells were fixed by shaking with PBS supplemented with 3.5% paraformaldehyde at 4 ° C for 15 minutes, and then at room temperature in TBS. For 5 minutes, blocked in PBS containing 3% BSA for 10 minutes at room temperature, and further anti-drebrin A antiserum (Exp. Cell Res. 215, 145-153 (1994); anti-drebrin A polyclonal antibody) Was reacted for 60 minutes at room temperature using a solution prepared by diluting with PBS containing 3% BSA. These reacted specimens were washed by shaking in PBS at room temperature for 5 minutes × 3 times, and then FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Kappel) diluted 100-fold with PBS containing 3% BSA was used. And stained for 30 minutes at room temperature. These dyed products were washed by shaking in PBS at room temperature for 5 minutes × 3 times with light shielding, sealed with Permaflow (manufactured by Chandon), and observed with a fluorescence microscope. The result is shown in FIG.
[0027]
Example 5 (Measurement of glutamate receptor function)
The function of the glutamate receptor was measured on the rat neurons that suppressed the expression of drebrin A prepared as described above.
As a method for confirming a decrease in the function of glutamate receptor in animal nerve cells in which expression of drebrin A is suppressed, glutamate is administered to animal nerve cells in which expression of drebrin A is suppressed, and disappearance of glutamate receptor after the administration. Alternatively, the disappearance of α-actinin was observed under a microscope by performing an indirect fluorescent antibody staining method using a specific antibody. When glutamate receptor function is inhibited, glutamate receptor disappearance and alpha-actinin disappear, and this method allows the glutamate receptor function to be tested indirectly.
(Experimental result)
From the above test, the following results were obtained. From this, it was confirmed that the function of the glutamate receptor was reduced by suppressing the expression of drebrin A.
(1) As a result of suppressing the expression of drebrin A, the glutamate receptor disappeared after glutamate administration (FIG. 3).
(2) As a result of suppressing the expression of drebrin A, α-actinin disappeared after glutamic acid administration (FIG. 4).
[0028]
Example 6 (Construction of non-human model animal with suppressed expression of drebrin A)
An antisense oligonucleotide 5'-AGGAAGGCCCACTGTCCGATGCCT-3 '(SEQ ID NO: 2) of drebrin A, a protein that regulates morphogenesis of dendritic spine, was prepared using the HVJ-liposome gene transfer method according to the following method. By introducing intraventricularly, it was introduced into the whole rat brain.
That is, a liposome (phospholipid vesicle) encapsulating an antisense oligonucleotide (antisense) of drebrin A is prepared, and then an inactivated Sendai virus (HVJ) having a cell fusion ability is fused to the liposome. A sense-containing HVJ-liposome complex was prepared. This HVJ-liposome complex has a cell fusion ability and acts as a vector for introducing a gene such as antisense into a cell with high efficiency (HVJ-liposome gene introduction method). At the time of HVJ-liposome gene transfer, an antisense-containing HVJ-
[0029]
Example 7 (Behavioral analysis of non-human model animal with suppressed expression of drebrin A)
For the non-human model animal constructed as described above, several behavioral tasks were performed on the fourth day after the antisense oligonucleotide injection.
1. Open field analysis
The open field analysis was performed by the following method. That is, a BSS-injected control rat (bss) or a drebrin antisense-injected rat (dre) is placed in the center of a white circular box (diameter 1.5 m, height 0.5 m), which is a new environment for rats. The video camera recorded for 30 minutes. From this action record, the total distance of movement for the first 10 minutes was measured as the amount of spontaneous movement. Also, in all actions for 30 minutes, 1) Stopping movement (Lying) consisting of stopping and crouching (2), 2) Moving straight movement, changing direction or walking along the wall (Walking), 3) Grooming with mouth and limbs (Grooming) The time spent for each of the three types of actions was measured as an index of emotional action. FIG. 5 shows the results of measuring the amount of spontaneous movement under a new environment.
As a result of the open field analysis, in the rat in which antisense oligonucleotide was injected and the expression of drebrin A was suppressed, the drebrin A expression was suppressed in the whole brain. (Upper figure). Furthermore, as a result of suppressing the expression of drebrin A in the whole brain, frequent hair repairing behavior and decrease in movement stopping behavior (no rest) were observed because it was difficult to adapt to the new environment (bottom of FIG. 5). . From the above results, it is considered that drebrin A expression-suppressed animals are hyperactive and difficult to adapt to a new environment.
[0030]
2. Spatial memory function analysis
The analysis of the spatial memory function by the Morris water maze task and the probe test was performed as follows.
That is, in the Morris water maze task, a rat placed in a circular pool (diameter 1.5 m, height 0.5 m, water depth approximately 0.3 m) is sunk and hidden 1.5 cm below the surface of the pool. A transparent platform (15 cm in diameter) was found and the latency to escape from the water to the platform was measured. By learning and storing the platform location as a spatial arrangement from the surrounding visual cues, the time to escape from the water to the platform with each trial is reduced. This trial consists of 6 trials per day and 5 sessions over 5 days (30 trials in total). This water maze task was treated with untreated rats (nt), BSS-injected rats (bss), reverse-sequence antisense-injected rats (rev ) And a test group consisting of drebrin antisense-injected rats (dre).
In addition, after a total of 30 trials of water maze tasks, one probe test was performed. The probe test involves swimming a rat for 60 seconds in a pool with the platform removed, measuring the dwell time within the quarter area of the pool (where the platform was) (target quadrant) Rats were checked for their ability to learn water maze tasks by staying longer than a quadrant. FIG. 6 shows the analysis result of the spatial memory function by the Morris water maze task and the probe test.
In the Morris water maze task, there was no difference in spatial memory formation between rats injected with antisense oligonucleotides and controls. In the probe test, the rats injected with the antisense oligonucleotide showed an extended residence time where the platform was.
From the results of spatial memory function analysis, the rats that injected antisense oligonucleotides and suppressed the expression of drebrin A did not show any impairment in spatial memory function, but there was an abnormality in the recognition of changes in the situation (platform removal / disappearance). Was recognized.
[0031]
3. Startle response analysis
In the prepulse inhibition (PPI) test, a startle response analysis was performed by the following method.
That is, a rat was placed in a test box consisting of a floor with a load change monitoring instrument built in, and after getting used to the test box for 10 minutes, it was acclimated to the new environment for 5 minutes while listening to background noise. Furthermore, a sound stimulus (120 decibels, 20 milliseconds) that causes a startle response was given five times with a sufficient time interval to remind the startle sound stimulus. Next, 80 decibels, 20 msec or 70 decibels, 20 msec pre-stimulus (PP) and 120 decibels, 20 msec startle sound stimulation (Pulse: P) combined at 100 msec
The prepulse inhibition (PPI) that suppresses the startle response induced by the startle sound stimulus (P) by the preceding sound stimulus (PP) was quantified based on the following formula.
The prepulse inhibition response is a behavioral expression as a result of perceptual information processing that identifies the difference between a startle stimulus with a preceding stimulus and the startle stimulus itself, and this decrease in PPI response is a disturbance in cognitive function that identifies perceptual content Means. The above PPI test was performed on a control group consisting of BSS-injected rats (bss), reverse-sequence antisense-injected rats (rev) and experimental group consisting of drebrin-antisense-injected rats (dre).
[0032]
In the PPI test, a PPI decrease trend was observed at 80 dB, and a significant PPI decrease was observed at 70 dB. This PPI response abnormality (it is difficult to get used to the stimulus that induces the startle response) appears to be a clear cognitive impairment. The results are shown in FIG.
From this result, it is considered that cognitive impairment occurs in rats in which antisense oligonucleotides are injected and the expression of drebrin A is suppressed.
The results of analyzes 1 to 3 above show that suppression of drebrin A expression causes schizophrenia-like behavioral abnormalities in non-human model animals.
[0033]
【The invention's effect】
By producing animal nerve cells and non-human model animals in which the expression of drebrin A is suppressed according to the present invention, animal nerve cells in which the function of glutamate receptors is reduced, and / or the function of glutamate receptors are reduced and / or Non-human model animals that develop schizophrenia symptoms can be constructed. The animal neuron or the non-human model animal can be used for screening for a glutamate receptor function-enhancing substance or a substance having a preventive or therapeutic effect for schizophrenia, and a glutamate receptor function-enhancing agent or schizophrenia preventive or therapeutic. A useful method for the development of agents can be provided.
Furthermore, in the present invention, by utilizing the relationship between the decrease in glutamate receptor function and the onset of schizophrenia symptoms, the glutamate receptor function of the tissue cells of the test animal is measured to determine schizophrenia. It is possible to make a diagnosis.
[0034]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of Western blot analysis in which expression of drebrin A protein is analyzed in rat neurons into which antisense oligonucleotides have been introduced in the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the results of immunostaining of rat neurons into which antisense oligonucleotides have been introduced in the present invention.
FIG. 3 is a view showing a photograph showing that the glutamate receptor disappears after administration of glutamate as a result of suppressing the expression of drebrin A in rat neurons into which the antisense oligonucleotide of the present invention has been introduced. .
FIG. 4 is a view showing a photograph showing that disappearance of α-actinin after administration of glutamic acid does not occur as a result of suppressing the expression of drebrin A in rat neurons into which the antisense oligonucleotide of the present invention has been introduced. .
FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of spontaneous momentum in a novel environment in behavioral analysis in rats with suppressed expression of drebrin A of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing the results of analysis of a spatial memory function by a Morris water maze task and a probe test in a rat in which expression of drebrin A of the present invention is suppressed.
FIG. 7 is a view showing the results of a startle response analysis in a prepulse inhibition (PPI) test in rats in which the expression of drebrin A of the present invention was suppressed.
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