JP4522994B2 - スキャフォールドフリー自己組織性三次元人工組織(Scaffold−freeSelf−Organized3Dsynthetictissue) - Google Patents
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Description
(1)移植可能な人工組織。
(2)第三次元方向に生物学的に結合されている(integrated)、項目1に記載の人工組織。
(3)周囲との生物学的結合能(integration capability)を有する、項目1に記載の人工組織。
(4)前記生物学的結合能は、周囲の細胞および/または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目3に記載の人工組織。
(5)細胞を含む、項目1に記載の人工組織。
(6)実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目1に記載の人工組織。
(7)実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目1に記載の人工組織。
(8)前記細胞外マトリクスは、コラーゲンI、コラーゲンIII、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目7に記載の人工組織。
(9)前記細胞外マトリクスは、コラーゲンI、コラーゲンIII、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべてを含む、項目7に記載の人工組織。
(10)前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、項目7に記載の人工組織。
(11)前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、項目7に記載の人工組織。
(12)前記細胞マトリクスは、コラーゲンIおよびコラーゲンIIIを含み、コラーゲンは、前記組織のうち5%〜25%を構成し、該コラーゲンIと該コラーゲンIIIとの比率は、1:10〜10:1である、項目7に記載の人工組織。
(13)前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、項目7に記載の人工組織。
(14)前記細胞外マトリクスが前記組織中に分散して配置される、項目7に記載の人工組織。
(15)細胞外マトリクスが分散して配置され、該細胞外マトリクスは、任意の2つの1cm2のセクションにおける分布密度を比較したときに、約1:3〜3:1の範囲内の比率に収まる、項目1に記載の人工組織。
(16)異種、同種異系、同系または自家である、項目1に記載の人工組織。
(17)スキャフォールドフリーである、項目1に記載の人工組織。
(18)細胞を移植するために使用される、項目1に記載の人工組織。
(19)大型である、項目1に記載の人工組織。
(20)少なくとも約20mm3の体積を有する、項目1に記載の人工組織。
=任意の大きさにする方法。
(21)可撓性である、項目1に記載の人工組織。
(22)伸縮性を有する、項目1に記載の人工組織。
(23)心臓の拍動運動に耐え得る、項目1に記載の人工組織。
(24)三次元方向すべてにおいて、生物学的結合がある、項目1に記載の人工組織。
(25)前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される生物学的結合を含む、項目24に記載の人工組織。
(26)臨床適用することができる組織強度を有する、項目1に記載の人工組織。
(27)前記強度は、破断強度において、約0.02N〜約2Nである、項目26の人工組織。
(28)前記強度は、自己支持性を有するに十分である、項目26に記載の人工組織。
(29)前記自己支持性は、0.05〜3.0mm角の先端を有するピンセットで前記人工組織をつまみあげたときに、実質的に破壊されないことを特徴とする、項目28に記載の人工組織。
(30)前記自己支持性は、手でつまみあげたときに破壊されないことを特徴とする、項目28に記載の人工組織。
(31)前記臨床適用が意図される部分は、心臓を含む、項目26に記載の人工組織。
(32)前記臨床適用が意図される部分は、椎間板、半月、軟骨、骨、靭帯または腱を含む、項目26に記載の人工組織。
(33)前記組織は軟骨、骨、椎間板、半月、靭帯または腱であり、前記人工組織が該関節内組織の欠損部に移植された後、補助固定手段なしでも、該人工組織が残存していることを特徴とする、項目26に記載の人工組織。
(34)人工組織を生産するための方法であって、
A)細胞を提供する工程;
B)該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;
C)該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程;および
D)前記細胞を該容器から分離する工程、
を包含する、方法。
(35)前記分離する工程において、自己収縮を惹起する刺激が加えられる、項目34に記載の方法。
(36)前記刺激は、物理的な刺激または化学的刺激を含む、項目35に記載の方法。
(37)前記物理的な刺激は、前記容器の振動、ピペッティングまたは前記容器の変形操作を含む、項目36に記載の方法。
(38)前記分離する工程は、アクチン調節物質の添加を含む、項目34に記載の方法。
(39)前記アクチン調節物質は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、項目38に記載の方法。
(40)前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、CAP(シクラーゼ関連タンパク質)、AIP1(actin-interacting-protein 1)、ADF(actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目39に記載の方法。
(41)前記アクチン重合促進因子は、RhoA、mDi、プロフィリン、Rac1、IRSp53、WAVE2、ROCK、LIMキナーゼ、コフィリン、cdc42、N−WASP、Arp2/3、Drf3、Mena,LPA(lysophosphatidic acid)、インスリン、PDGFa、PDGFb、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目39に記載の方法。
(42)前記容器は、スキャフォールドフリーである、項目34に記載の方法。
(43)前記細胞は、まず単層培養される、項目34に記載の方法。
(44)前記細胞外マトリクス産生促進因子は、TGFβ1、TGFβ3、アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、項目34に記載の方法。
(45)前記アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも0.1mMで存在する、項目44に記載の方法。
(46)前記TGFβ1もしくはTGFβ3またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも1ng/mlで存在する、項目44に記載の方法。
(47)前記細胞は、1cm2あたり、5×104細胞〜5×106細胞で配置され、前記細胞外マトリクス産生促進因子がアスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩であり、該アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも0.1mMで提供される、項目34に記載の方法。
(48)前記人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む、項目34に記載の方法。
(49)前記剥離および自己収縮は、容器に物理的刺激を与えることにより達成される、項目48に記載の方法。
(50)前記剥離および自己収縮は、容器に化学的刺激を与えることにより達成される、項目48に記載の方法。
(51)前記十分な時間は、少なくとも3日間である、項目34に記載の方法。
(52)前記十分な時間は、少なくとも3日間であり、最大で自然に剥離する期間である、項目34に記載の方法。
(53)前記自然に剥離する期間は、少なくとも40日間である、項目52に記載の方法。
(54)前記人工組織を分化させる工程、をさらに含む、項目34に記載の方法。
(55)前記分化は、骨分化、軟骨分化、脂肪分化、皮下組織または腱靭帯組織への分化を含む、項目54に記載の方法。
(56)前記骨分化は、デキサメタゾン、βグリセロホスフェートおよびアスコルビン酸2リン酸を含む培地中で行われる、項目55に記載の方法。
(57)前記培地はさらに、BMP−2、BMP−4およびBMP−7からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目56に記載の方法。
(58)前記軟骨分化は、ピルビン酸、デキサメタゾン、アスコルビン酸2リン酸、インスリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸を含む培地中で行われる、項目55に記載の方法。
(59)前記培地はさらに、BMP−2、BMP−4、BMP−7、TGFβ1およびTGFβ3からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目58に記載の方法。
(60)前記分化工程は、前記剥離工程の前または後に行われる、項目54に記載の方法。
(61)前記分化工程は、前記剥離工程より後に行われる、項目54に記載の方法。
(62)前記細胞は、3継代以上の細胞を含む、項目34に記載の方法。
(63)前記細胞は、3継代〜8継代の細胞を含む、項目34に記載の方法。
(64)前記細胞は、1cm2あたり、5×104細胞〜5×106細胞で提供される、項目34に記載の方法。
(65)前記細胞は、筋芽細胞を含む、項目34に記載の方法。
(66)前記細胞は、脂肪細胞を含む、項目34に記載の方法。
(67)前記細胞は、滑膜細胞を含む、項目34に記載の方法。
(68)前記細胞は、間葉系幹細胞を含む、項目34に記載の方法。
(69) 前記間葉系幹細胞は、脂肪組織、滑膜、腱、骨または骨髄由来である、項目68に記載の方法。
(70) 前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、項目34に記載の方法。
(71)細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物であって、
A)該細胞を維持するための成分;および
B)細胞外マトリクス産生促進因子、
を含む、組成物。
(72)前記細胞外マトリクス産生促進因子は、TGFβ1、TGFβ3、アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む、項目68に記載の方法。
(73)前記TGFβ1またはTGFβ3は、少なくとも1ng/mlで存在し、あるいはアスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩は、少なくとも0.1mMで存在する、項目72に記載の方法。
(74)生体の部分を補強、修復または再生するための、細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体(complex)。
(75)周囲との生物学的結合能を有する、項目75に記載の複合体。
(76)前記生物学的結合能は、周囲の細胞および/または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目74に記載の複合体。
(77)実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目74に記載の複合体。
(78)実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目74に記載の複合体。
(79)前記細胞外マトリクスは、コラーゲンI、コラーゲンIII、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目78に記載の複合体。
(80)前記細胞外マトリクスと細胞とが一体化して三次元構造をとっている、項目78に記載の複合体。
(81)細胞外マトリクスが表面に配置される、項目78に記載の複合体。
(82)細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、項目78に記載の複合体。
(83)細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の2つの1cm2のセクションにおける分布密度を比較したときに、約1:3〜3:1の範囲内の比率に収まる、項目74に記載の複合体。
(84)前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、項目78に記載の複合体。
(85)異種、同種異系、同系または自家である、項目74に記載の複合体。
(86)前記部分は、袋状臓器を含む、項目74に記載の複合体。
(87)前記袋状臓器は、心臓を含む、項目86に記載の複合体。
(88)前記部分は、骨または軟骨組織を含む、項目74に記載の複合体。
(89)前記部分は、無血管組織を含む、項目74に記載の複合体。
(90)前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、項目74に記載の複合体。
(91)前記補強は、前記人工組織を、前記部分を置換することまたは前記部分を被覆するように配置することあるいはその両方によって達成される、項目74に記載の複合体。
(92)前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、項目74に記載の複合体。
(93)生物学的結合を有する、項目74に記載の複合体。
(94)前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、項目74に記載の複合体。
(95)前記人工組織は、細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって形成される、項目74に記載の複合体。
(96)自己支持性を有する、項目74に記載の複合体。
(97)生体の部分を補強するための方法であって、
A)細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程;および
B)該複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間該複合体を保持する工程、
を包含する、方法。
(98)前記結合は、細胞外マトリクスと細胞外マトリクスとの結合によって達成される、項目97に記載の方法。
(99)前記複合体は、周囲との生物学的結合能を有する、項目97に記載の方法。
(100)前記生物学的結合能は、周囲の細胞および/または細胞外マトリクスとの接着能を含む、項目99に記載の方法。
(101)前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目97に記載の方法。
(102)前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目97に記載の方法。
(103)前記複合体は、コラーゲンI、コラーゲンIII,ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目102に記載の方法。
(104)前記複合体は、コラーゲンI、コラーゲンIII,ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのすべての細胞外マトリクスを含む、項目102に記載の方法。
(105)前記細胞外マトリクスは、ビトロネクチンを含む、項目102に記載の方法。
(106)前記細胞外マトリクスは、フィブロネクチンを含む、項目102に記載の方法。
(107)細胞外マトリクスが表面に配置される、項目97に記載の方法。
(108)細胞外マトリクスが分散して表面に配置される、項目97に記載の方法。
(109)細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の2つの1cm2のセクションにおける分布密度を比較したときに、約1:3〜3:1の範囲内の比率に収まる、項目97に記載の方法。
(110)細胞外マトリクスが分散して表面に配置され、該細胞外マトリクスは、任意の2つの1cm2のセクションにおける分布密度を比較したときに、約1:2〜2:1の範囲内の比率に収まる、項目97に記載の方法。
(111)異種、同種異系、同系または自家である、項目97に記載の方法。
(112)前記部分は、袋状臓器を含む、項目97に記載の方法。
(113)前記袋状臓器は、心臓を含む、項目112記載の方法。
(114)前記複合体は、前記部分の伸縮に対して抵抗性を有する、項目97に記載の方法。
(115)前記複合体は、生物学的結合を有する、項目97に記載の方法。
(116)前記生物学的結合は、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合および細胞間の情報伝達からなる群より選択される、項目115に記載の方法。
(117)細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養して前記複合体を形成する工程をさらに包含する、項目97に記載の方法。
(118)前記部分は心臓であり、該心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、項目97に記載の方法。
(119)前記部分は、無血管障害部分を含む、項目97に記載の方法。
(120)前記部分は、血行が障害を受けている部分を含む、項目97に記載の方法。
(121)前記部分は、骨または軟骨を含む、項目97に記載の方法。
(122)前記部分は、椎間板、半月、靭帯または腱を含む、項目97に記載の方法。
(123)前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、損傷を受けているかまたは変性していることを特徴とする、項目97に記載の方法。
(124)前記部分は骨または軟骨であり、該骨または軟骨は、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性を有することを特徴とする、項目97に記載の方法。
(125)前記十分な時間は、少なくとも10日である、項目97に記載の方法。
(126)前記複合体は、自己支持性を有する、項目97に記載の方法。
(127)前記複合体は、周囲との生物学的結合能(integrationcapability)を有する、項目97に記載の方法。
(128)前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目97に記載の方法。
(129)他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、項目97に記載の方法。
(130)前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目126に記載の方法。
(131)前記人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目97に記載の方法。
(132)前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目130に記載の方法。
(133)生体の部分を処置するための方法であって、
A)細胞と該細胞に由来する成分とを含む複合体を、該部分を置換することまたは該部分を被覆するように配置するかあるいはその両方を行う工程;および
B)該生体の部分の状態が改善するに十分な時間保持する工程、
を包含する、方法。
(134)前記処置は、心臓、骨、軟骨、靭帯、腱、椎間板または半月の疾患、障害または状態を処置、予防または強化するものであることを特徴とする、項目133に記載の方法。
(135)前記複合体は、自己支持性を有する、項目133に記載の方法。
(136)前記複合体は、周囲との生物学的結合能(integrationcapability)を有する、項目133に記載の方法。
(137)前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目133に記載の方法。
(138)前記置換されるまたは被覆される部分に他の人工組織をさらに移植する工程を包含する、項目133に記載の方法。
(139)前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目138に記載の方法。
(140)前記複合体は、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成され、前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料である、項目133に記載の方法。
(141)前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目139に記載の方法。
(142)所望の厚さを有する人工組織を生産するための方法であって、
A)細胞を提供する工程;
B)該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;
C)該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程;および
D)物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、
を包含する、方法。
(143)前記物理的刺激は、前記人工組織と前記容器との間にずり応力を引き起こす刺激、容器の底面変形、容器の振動、またはピペッティングを含む、項目142に記載の方法。
(144)前記化学的刺激は、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を使用する、項目142記載の方法。
(145)前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、CAP(シクラーゼ関連タンパク質)、AIP1(actin-interacting-protein 1)、ADF(actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目144に記載の方法。
(146)前記アクチン重合促進因子は、RhoA、mDi、プロフィリン、Rac1、IRSp53、WAVE2、ROCK、LIMキナーゼ、コフィリン、cdc42、N−WASP、Arp2/3、Drf3、Mena,LPA(lysophosphatidic acid)、インスリン、PDGFa、PDGFb、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目144に記載の方法。
(147)前記所望の厚さの調整は、前記アクチン脱重合促進因子と前記アクチン重合促進因子との比率を調節することによって達成される、項目144記載の方法。
(148)前記人工組織を複数作製し、該複数の人工組織を接触させて一体化させる工程をさらに包含する、項目142に記載の方法。
(149)移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織。
(150)前記移植可能な人工組織は、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成される、項目149に記載の複合組織。
(151)実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される、項目149に記載の複合組織。
(152)前記細胞外マトリクスは、コラーゲンI、コラーゲンIII,ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される細胞外マトリクスを含む、項目151に記載の複合組織。
(153)前記細胞外マトリクスは、コラーゲンI、コラーゲンIII,ビトロネクチンおよびフィブロネクチンをすべて含む、項目151に記載の複合組織。
(154)前記他の人工組織は、人工骨または微線維性コラーゲン医療材料を含む、項目149に記載の複合組織。
(155)前記人工骨は、ハイドロキシアパタイトを含む、項目154に記載の複合組織。
(156)前記移植可能な人工組織と、前記他の人工組織とは、生物学的に結合される、項目149に記載の複合組織。
(157)前記生物学的結合は、細胞外マトリクスを介する、項目156に記載の複合体。
(158)所望の厚さを有する人工組織を生産するために使用される組成物であって、アクチン脱重合促進因子およびアクチン重合促進因子からなる群より選択される化学物質を含む、組成物。
(159)前記アクチン脱重合促進因子は、Slingshot、コフィリン、CAP(シクラーゼ関連タンパク質)、AIP1(actin-interacting-protein 1)、ADF(actin depolymerizing factor)、デストリン、デパクチン、アクトフォリン、サイトカラシンおよびNGF(nerve growth factor)からなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
(160)前記アクチン重合促進因子は、RhoA、mDi、プロフィリン、Rac1、IRSp53、WAVE2、ROCK、LIMキナーゼ、コフィリン、cdc42、N−WASP、Arp2/3、Drf3、Mena,LPA(lysophosphatidic acid)、インスリン、PDGFa、PDGFb、ケモカインおよびTGFβからなる群より選択される、項目158に記載の組成物。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される「再生」(regeneration)とは,個体の組織の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し,不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には,生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し,さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨、心臓および末梢神経の再生医療がある。軟骨、神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞(体性幹細胞)の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞(ES細胞)はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが実現には至っていない。
本明細書において「組織」(tissue)とは、細胞生物において、同一の機能・形態をもつ細胞集団をいう。多細胞生物では、通常それを構成する細胞が分化し、機能が専能化し、分業化がおこる。従って細胞の単なる集合体であり得ず,ある機能と構造を備えた有機的細胞集団,社会的細胞集団としての組織が構成されることになる。組織としては、外皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の組織は、生物のどの臓器または器官由来の組織でもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明が対象とする組織としては、骨、軟骨、腱、靭帯、半月、椎間板、骨膜、血管、血管様組織、心臓、心臓弁、心膜、硬膜などの組織が挙げられるがそれらに限定されない。
RhoA→mDi→プロフィリン⇒アクチン重合
RhoA→ROCK/Rho→LIMキナーゼ→コフィリンをリン酸化(抑制)⇒アクチン重合
Rac1→IRSp53→WAVE2→プロフィリン、Arp2/3⇒アクチン重合
cdc42→N−WASP→プロフィリン、Arp2/3⇒アクチン重合
cdc42→Drf3→IRSp53→Mena⇒アクチン重合
(以上において、→はリン酸化などのシグナル伝達経路を示す。)本発明では、このような経路に関与する任意の因子を使用することができる。
Slingshot→コフィリンの脱リン酸化(活性化)⇒アクチン脱重合
コフィリンのLIMキナーゼ活性によるリン酸化とSlingshotによる脱リン酸化のバランスでアクチンの脱重合を制御している。コフィリンを活性化させる他の因子としては、CAP(cyclase−associated protein)およびAIPI(actin−interacting−protein 1)が同定されており、これらは、任意のものを使用することができることが理解される。
B)皮膚(ケラチノサイト):TGF−β、FGF−7(KGF:keratinocyte growth factor)、EGF
C)血管内皮:VEGF、FGF、アンギオポエチン(angiopoietin)
D)腎臓:LIF、BMP、FGF、GDNF
E)心臓:HGF、LIF、VEGF
F)肝臓:HGF、TGF−β、IL−6、EGF、VEGF
G)臍帯内皮:VEGF
H)腸管上皮:EGF、IGF−I、HGF、KGF、TGF−β、IL−11
I)神経:神経成長因子(NGF)、BDNF(脳由来神経栄養因子)、GDNF(グリア細胞由来神経栄養因子)、ニューロトロフィン(neurotrophin)、IL−6、TGF−β、TNF
J)グリア細胞:TGF−β、TNF−α、EGF、LIF、IL−6
K)末梢神経細胞:bFGF、LIF、TGF−β、IL−6、VEGF、
L)肺(肺胞上皮):TGF−β、IL−13、IL−1β、KGF、HGF
M)胎盤:成長ホルモン(GH)、IGF、プロラクチン、LIF、IL−1、アクチビンA、EGF
N)膵臓上皮:成長ホルモン、プロラクチン
O)膵臓ランゲルハンス氏島細胞:TGF−β、IGF、PDGFa、PDGFb、EGF、TGF−β、TRH(thyroropin)
P)滑膜細胞:FGF、TGF−β(特にTGF−β1、TGF−β3)
Q)骨芽細胞:BMP(特に、BMP−2、BMP−4、BMP−7)、FGF
R)軟骨芽細胞:FGF、TGF−β(特にTGF−β1、TGF−β3)、BMP(特に、BMP−2、BMP−4、BMP−7)、TNF−α、IGF
S)網膜細胞:FGF、CNTF(絨毛神経栄養因子=cilliary neurotrophic factor)
T)脂肪細胞:インスリン、IGF、LIF
U)筋肉細胞:LIF、TNF−α、FGF。
本発明の処置方法において使用される医薬(人工組織、併用される医薬化合物など)の量は、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、組織の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体(または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に1回(例えば、1週間に1回−1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1週間−1ヶ月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
別の局面において、本発明は、人工組織を生産するための方法を提供する。この人工組織生産法は、A)細胞を提供する工程;B)該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;およびC)該容器中の該細胞を、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程、を包含する。
別の局面において、本発明は、人工組織または複合体を提供する。本明細書では、本発明の人工組織は、移植可能な人工組織である。これまでも細胞培養によって人工組織を作製することが試みられているが、いずれも、大きさ、強度、培養容器からの剥離のときの物理的損傷などによって移植に適した人工組織とはなっていなかった。本発明は、上述のような細胞外マトリクス産生促進因子の存在下で細胞を培養することによって、大きさ、強度などの点で問題が無く、剥離させるときに特に困難を伴わない組織培養方法が提供された。このような組織培養法が提供されたことによって、初めて移植可能な人工組織が提供されたことになる。
別の局面において、本発明は、動物の生体の部分を補強するための人工組織または複合体を提供する。このような補強を行うことができる人工組織または複合体は、本発明の人工組織生産法によって初めて達成された技術である。本発明の人工組織または複合体は、自己支持性を有することから、従来提供されなかったような用途(例えば、充填(置換)補強、全体の補強、漏れのない補強、被覆など)にも使用可能である。特に、充填、置換補強(すなわち、細胞供給)が顕著に改善されたという点では、本発明は顕著な効果を奏する。また、分化誘導をかけることができるという点でもその適用範囲は拡大する。
別の局面において、本発明は、動物の生体の部分を補強するための方法を提供する。この方法は、A)人工組織または複合体を、該部分を置換するようにおよび/または被覆するように配置する工程;およびB)該人工組織または複合体と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間保持する工程、を包含する。ここで、ある部分を置換するように配置するとは、代表的には、罹患部を必要に応じて掻爬(debridement、curetage)し、罹患部に本発明の人工組織または複合体を配置して、置換が促進されるように静置することをいう。このような置換は、細胞の充填を目的としており、当該分野において公知の技術を組み合わせて用いることができる。ここで、ある部分を被覆するように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。ここで、十分な時間は、その部分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後1週間、2週間、1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえ、特に限定する必要はない。本発明の人工組織はまた、自己支持性を有することから、ハンドリングが楽で、実際の処置時に破壊されず、手術も容易であるという特徴も有する。
別の局面において、本発明は、BMP(例えば、BMP−2、BMP−4、BMP−7など)、TGF−β1、TGF−β3、HGF、FGF、IGFなどのようなサイトカインと人工組織とを併用することによる再生療法を提供する。
別の局面において、本発明は、所望の厚さを有する人工組織または複合体を生産するための方法を提供する。この方法は、A)細胞を提供する工程;B)該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子(例えば、アスコルビン酸類、TGF−β1、TGF−β3など)を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織または複合体のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;C)該容器中の該細胞を、細胞外マトリクス産生促進因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織または複合体を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程;およびD)物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、を包含する。ここで、細胞の提供、細胞の配置、刺激および人工組織または複合体とする工程は、本発明の人工組織または複合体を生産する方法において詳細に説明されており、任意の実施形態を採ることができることが理解される。
別の局面において、本発明はまた、移植可能な人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織を提供する。ここで、他の人工組織としては、本発明の範囲に入る人工組織またはそれに入らない人工組織(すなわち従来の人工組織)のいずれであってもよい。従来の人工組織(例えば、人工骨、微線維性コラーゲン医療材料など)は、生物学的結合能を有していないかまたは有してもほとんど実用に耐えなかったことから、このような複合組織を形成することは不可能であった。従って、本発明を使用すれば、例えば、骨に軟骨を組み合わせて治療することができることが理解される。あるいは、骨などの欠損には、特に、骨軟骨複合体の治療において、人工骨(例えば、ネオボーンなどのハイドロキシアパタイト構成物、微線維性コラーゲン医療材料など)と本発明の人工組織または複合体との複合組織を用いることによって、骨の部分は、人工骨によって、その表層にある軟骨については人工組織によって同時に治療され得ることから、本発明の人工組織または複合体を人工骨と結合させて治療することができることが理解される。ここで、本発明の移植可能な人工組織または複合体は、例えば、実質的に細胞および該細胞に由来する物質から構成され、より好ましくは、実質的に細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される。ここで使用される細胞外マトリクスは、コラーゲンI,コラーゲンIII,ビトロネクチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される。
本実施例では、種々の滑膜細胞を用いて、人工組織を作製した。以下に説明する。
ブタ(LWD三元交配種、細胞採取時には2〜3月齢のものを使用)膝関節より滑膜細胞を採取し、コラゲナーゼ処理後、10%FBS−DMEM培地(HyCloneから入手可能、DMEMはGIBCOから入手したものを使用)にて培養および継代を行った。継代数について、滑膜細胞においては10継代にても多分化能を有するという報告もあることから、本実施例においては最大10継代まで使用したが、用途に応じてそれ以上の継代細胞も用いることが理解される。実際に人体に移植する場合には自家移植であるが、十分な細胞数の確保しつつ、感染等の危険性を軽減するために培養期間の短縮する必要がある。
35mm皿、60mm皿または100mm皿(BD Biosciences、セルカルチャー皿・マルチウェルセルカルチャープレート)の上に4.0x106個の滑膜細胞を2mlの10%FBS−DMEM培地にまきこんで培養した。その際にアスコルビン酸を添加した。皿、アスコルビン酸および細胞の濃度は、以下のとおりである。
皿:BD Biosciences、細胞培養皿・マルチウェル細胞培養プレート
アスコルビン酸2リン酸:0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、および5mM
細胞数:5×104細胞/cm2、1×105細胞/cm2、2.5×105細胞/cm2、4.0×105細胞/cm2、5×105細胞/cm2、7.5×105細胞/cm2、1×106細胞/cm2、5×106細胞/cm2、および1×107細胞/cm2
予定培養期間まで、2回/週で培地交換を行った。培養期間に達したら、皿周囲を全周性に100μlのピペットマンでピペッティングを行いながら、細胞シートと皿を分離した。分離できたら皿を軽く揺することにより細胞シートを可能な限り平坦にした。その後培地を1ml追加し、細胞シートを完全に浮遊させ、2時間放置することにより細胞シートが収縮をおこし、3次元化することにより人工組織を作製した(図1)。
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、HE染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン(例えば、純エタノールにて)、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを10分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを30秒間行った。その後、流水水洗を5分行い、塩酸エオジン10倍希釈液で2分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
1)凍結ストックから、5μm厚の切片を作製する。
3)内因性ペルオキシド活性は、メタノール中0.3%H2O2中で20分間室温でブロックする(1ml 30%H2O2+99mlメタノール)
4)PBSで洗浄する(3×5分)。
12)茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
20)キシレンで3回×1分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
次に、本発明の人工組織の移植により、細胞外マトリクスであるコラーゲンが十分産生されているかどうかを確認した。以下のプロトコールを使用した。
培養期間:3日、7日、14日、21日、28日
アスコルビン酸2リン酸の濃度:0mM、0.1mM、1mM、5mMで
の条件を用いて、滑膜由来人工組織を作製した。
1) コラーゲン産生量について、アスコルビン酸については、0mM<< 5mM < 1mM ≦ 0.1mMであった。コラーゲン産生という観点においては、至適濃度は0.1〜1mMであった(図7および8)。
次に、皿の大きさおよび継代数の影響を調べた。
次に、実施例1において、4×106細胞/cm2の細胞を3週間アスコルビン酸2リン酸を添加して培養して、剥離後48時間たったものを使用して、力学的特性を調べた。本発明の人工組織の力学的特性を測定した。そのプロトコールを以下に示す。
次に、自己支持性の判定実験を行った。ピンセットとして、先曲がり先細無鈎ピンセットA−11(ステンレス製、全長120mm、先曲がり20mm、先端は0.1mmのもの;夏目製作所)を用いて人工組織を挟み、試験した。自己支持性を有するか否かは、目視により判断した。片が複数になったものは自己支持性を有しないと判断した。この判定は、他のピンセット、例えば、別の種類のピンセットとして先曲がり先細無鈎ピンセットA−12−2(ステンレス製・ボッチ付、全長100mm、先端は0.05mmのもの;夏目製作所)を用いて別の実験者が行った場合でも、同様の結果が見出された。
本実施例では、骨分化誘導を行った場合でも本発明の人工組織が機能するかどうかを確認した。
次に、本発明の人工組織の製造方法において、軟骨分化誘導が使用可能かどうか確認した。
細胞密度:4×104/cm2
条件:CO2 5%, air 95%, 37℃
この培地を用いて、以下の軟骨分化誘導培地を用いて、培養を行い、人工組織を作製した。
次に、軟骨修復が可能であるかどうかを確認した。ここでは、同種異系の人工組織を使用した。
次に、本発明の人工組織が半月修復においても使用可能かどうかを確認した。
15〜17週齢の豚(LWD三元交配種)に対してケタラール20mg/kg+ セラクタール10mg/kgを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン0.5mg/kg/hrの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤(セファメジン1g)を投与した。
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、傍内側膝蓋アプローチにより膝関節内に侵入。内側関節包を同定した後その中央部で切離。助手が下腿を屈曲+外旋させ、さらに前方引き出しを行うことで内側半月の前角部を展開。同部にφ6.5mmの円柱型の欠損をモザイクプラスティーDP(Smith & Nephew)により作成した(図29)。欠損部に人工組織を充填した(図30)。人工組織が生着するまでの保護のため、コラーゲンシート(ニプロ(株))を半月の周囲に巻きつけ縫合により固定を行った。止血を確認した後、切離した内側側副靭帯を修復し、関節包、皮下、表皮を縫合。膝関節屈曲位にてギプス固定とし、手術を終了した。
肉眼所見、組織学的検討により行った。
術後4週の肉眼所見(図31)および組織学的所見(図32)により人工組織を充填した群において修復が有意に改善を認めた。
本実施例において、ブタにおいて腱・靭帯組織を対象とする修復手術を行う。腱・靭帯組織の損傷状態を確認し、その際に滑膜細胞を一部採取して、滑膜細胞を培養し、実施例1に記載されるようなプロトコールを用いて人工組織を作製する。
15〜17週齢の豚(LWD三元交配種)に対してケタラール20mg/kg + セラクタール10mg/kgを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン 0.5mg/kg/hrの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤(セファメジン1g)を投与した。
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、傍内側膝蓋アプローチにより膝関節内に侵入。内側関節包の剥離を進め内側側副靭帯を同定し、モザイクプラスティーDP(Smith & Nephew)によりφ3.5mmの欠損部を内側側副靭帯の大腿骨付着部より1横指遠位に作成した。欠損部に人工組織を充填した後関節包により被覆。止血を確認した、関節包、皮下、表皮を縫合。膝関節軽度屈曲位にてギプス固定とし、手術を終了した。
(評価法)
組織学的検討はFrankらの方法に基づき行った(J.Orthop.Res.13;923−9,1995)。
(結果)
術後6週で肉眼所見および組織学的所見により人工組織を充填した群において修復が有意に改善していた。
本実施例では、ブタにおいて骨の修復実験を行う。実施例1に記載されるようなプロトコールを用いて、滑膜細胞を採取および培養し、人工組織を作製する。
15〜17週齢の豚(LWD三元交配種)に対してケタラール20mg/kg + セラクタール10mg/kgを後頚部より筋注を行った。その後耳静脈より輸液ルートを確保後、気管内挿管により気道確保を行い、ディプリバン 0.5mg/kg/hrの持続注入により麻酔の維持を行った。術後の感染予防のため抗生剤(セファメジン1g)を投与した。
体位をとり、滅菌ドレープにより術野を清潔とした後、第2中足骨上に縦切開を加え侵入。第2中足骨の骨膜をメスにより可及的に切除、中足骨表面を露出した。中足骨表面に横1.5cm×縦3cmの開窓を骨ノミにて行った後、開窓部の骨表面を広げた人工組織で被覆した。人工組織の接着を確認し、皮下および表皮を縫合。下腿ギプス固定とし手術を終了した。
レントゲン撮影。マイクロCT。組織学的検討
(結果)
術後4週の評価において、人工組織を被覆した群において開窓部における骨形成の有意な亢進を確認した。
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸2リン酸は、0mM(なし)、0.1mM、0.5mM、1.0mM、5.0mMの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法(実施例1に記載される)に準じて行った。初期の播種条件としては、5×104細胞/cm2を用いた。結果を図33に示す。培養日数は14日間を採用した。脂肪組織由来の細胞からも人工組織は作成され、滑膜細胞由来人工組織と同様にフィブロネクチンおよびビトロネクチンが豊富に存在していた。またコラーゲンI, IIIについても同様豊富に発現していた。
アスコルビン酸2リン酸 1.0mM:接線係数(ヤング率)1.33
C)移植実験
次に、この人工組織を実施例8(軟骨修復)、実施例9(半月修復)に記載されるように、移植実験に供する。その結果、脂肪細胞が、滑膜細胞由来の人工組織と同様に、修復機能を有することがわかる。
本実施例で作製した骨または軟骨の人工組織を、軟骨または骨に分化誘導させた、その結果を図34に示す。左の実験は骨分化実験の結果を示す。上段は人工組織、下段は単層培養である。人工組織は骨分化誘導培地にてアルザリンレッド陽性反応を呈し、骨分化が確認できた。右の実験は軟骨分化誘導実験で人工組織は軟骨分化誘導培地+BMP-2の刺激によりアルシアンブルー陽性の軟骨様組織へと分化した。つまり、脂肪由来人工組織も滑膜細胞由来人工組織と同様に骨・軟骨への分化能を保持していることが判明した。
本実施例では、ブタにおける人工組織の形状による機能の相違を観察する。この実施例では、人工組織をシート状に貼り付ける以外に、丸めて患部に移植しても効果を有し得ることを確認する。このことにより、欠損部の形状等に応じたテイラーメイド手術が可能かどうかを確認する。
次に、半月板損傷患者からの滑膜細胞採取、さらに人工組織の作製が可能であるかどうかを本実施例において確認する。
ヒト患者であって、画像により軟骨損傷または半月板損傷と診断された患者の精査として、腰椎麻酔または全身麻酔下において、関節鏡検査を施行する。その際に、数十mg滑膜を採取する。採取した滑膜を50mlの遠心管(Falcon社製)に移し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて洗浄し、その後、10cm径の培養皿(Falcon社製)に移し、滅菌した鋏刀を用いて細かく切断する。切断物を、さらに、0.1%コラゲナーゼ(Sigma社製)10mlを加えて、37℃恒温槽中で1時間30分振盪する。溶解液に予め採取しておいた自己血清またはウシ血清(FBS)を含む培地(DMEM、Gibco社製)を10ml加えて、コラゲナーゼを不活化し、1500rpmで5分間遠心分離し、細胞を沈降させる。その後、血清入り培地5mlを再度加え、70μlフィルター(Falcon社製)に通し、25cm2フラスコ(Falcon社製)に移して37℃に保温したCO2インキュベータ内において培養する。
初期培養において、1週間に2回培地交換を行い、コンフルエントの状態になれば、細胞継代を行う。初期継代として、培地を吸引した後、PBSを用いて洗浄し、トリプシン−EDTA(Gibco社製)を加えて、5分間放置する。その後、血清入り培地を加え、用怪物を50ml遠心分離管(Falcon社製)に移し、1500rpm×5分間遠心分離後、沈澱に血清入り培地15mlを加え、150cm2培養皿(Falcon社製)に細胞を播く。以後の継代は、1:3の細胞比となるよう継代を施行し、4〜5継代となるまで同様の操作を行う。
4〜5継代の滑膜細胞をトリプシン・EDTAによって処理し、滑膜細胞4.0×106個を0.2mMアスコルビン酸2リン酸含有血清入り培地2mlに溶解し、35ml培養皿(Falcon社製)にて37℃に保温したCO2インキュベータにて7日間培養する。これにより、培養細胞−細胞外マトリクス複合体が形成される。この複合体は、移植手術予定の2時間以上前に周囲をピペッティングすることによって機械的に培養皿から剥離させる。剥離後は、培養細胞−細胞外マトリクス複合体は拘縮し、直径約15mm、厚さ約0.1mmの三次元組織となる。
局所麻酔により、ヒト患者の採取予定部(例えば、膝関節周囲)に小切開を加え、脂肪細胞数十mgを採取する。採取した脂肪細胞は、滑膜細胞と同様の処理を行うことによって、三次元の人工組織を作製することができる。
実施例14または実施例15において作製した人工組織を実際に移植する。ヒト被検体を腰椎麻酔または全身麻酔後、関節内を関節鏡視下にあるいは少皮切にて展開する。軟骨損傷部を確認した後、軟骨損傷の大きさを測定し、モザイクプラスティーハーベスティングシステム(Smith and Nephew社製)および歯科用エクスプローラーを用いて、損傷した軟骨を完全に含む形で、骨軟骨境界部において軟骨を剥離するように円形に切除する。軟骨欠損部に人工組織を移植する。人工組織は、移植後数分で欠損部母床と接着するが、力学的ストレスが強くかかる部位が病巣部の場合は、初期固定を強固に得るために、フィブリンのりを用いて固定を補強することができるがそれに限定されないようである。固定後は、関節包、皮下組織および皮膚を層層に縫合する。閉創後、関節はギブスあるいは装具にて2〜3週間固定する。その後、可動域訓練を開始する。病巣が下肢の荷重関節(膝、足関節等)にある場合では、荷重は6〜8週間で全荷重とする。
次に、実施例14または実施例15において作製した人工組織を実際に半月板損傷部に移植する。
実施例14または実施例15において作製した人工組織をアキレス腱損傷部位に移植する。
次に、難治性偽関節を実施例14または実施例15において作製した人工組織を用いて処置する。難治性偽関節の一つとして、本来は骨折治療の際に細胞の供給源となる骨膜が重度な外傷によって欠損していることが挙げられる。このような場合、人工組織の移植が適切であると考えられる。
活動レベルの回復。このように、本発明の人工組織は、顕著な副作用もなく、欠損部位の機能をも改善することが観察される。
次に、腱板損傷部への移植実験を試みた。人工組織は、実施例1に記載されるように作製した。ヒト被検体を全身麻酔したのちに三角筋縦割アプローチにて展開し腱板損傷部を同定した。
次に、ヒト滑膜細胞を用いた人工組織の製造を示す。その模式図を図35に示す。
次に、脂肪組織由来の細胞を用いて人工組織を作製した。
次に、この脂肪由来の細胞を用いて人工組織を作製した。アスコルビン酸2リン酸は、0mM(なし)、0.1mM、0.5mM、1.0mM、5.0mMの条件を用いた。作製は、上記滑膜細胞を作製した方法(実施例1に記載される)に準じて行った。初期の播種条件としては、5×104細胞/cm2を用いた。
(実施例23:生物学的結合(integration)の確認)
従来のコラーゲンゲルを用いた場合に移植後に生物学的結合を確実にできないことが知られている。本実施例において、従来のコラーゲンゲル(商品名3%タイプIコラーゲン、高研(株)、Tokyo,Japan)を用いてその中に滑膜細胞(105細胞/ml)を包埋し、軟骨欠損部に移植すると図37のようにコラーゲンゲルと隣接軟骨間の結合が不十分で亀裂を認めた。
次に、本発明の人工組織の製造方法において、物理的剥離(機械的剥離、例えば、ピペッティングによる)の代わりに、化学的剥離条件が使用可能かどうか確認した。
細胞密度:4×104/cm2
条件:CO2 5%, air 95%, 37℃
培地:DMEM/F12 (FBS 10%)にTGFβ1 10ng/mlを添加した。
アクチン脱重合作用を有することで知られるジヒドロサイトカラシンBおよびY27632(山之内製薬)を用いて、人工組織の収縮への影響を検討した。
12wellの培養皿を用いて人工組織を作製した。
次に、実施例26におけるNEOBONEに代えて、微線維性コラーゲン医療材料であるコラーゲン人工組織(CMI(Collagen Meniscal Implant) コラーゲンスポンジ、Amgen,USA)を貼り付けた人工組織を作製した。その結果(拡大写真)を図42に示す。本発明の人工組織がCMIの表面において生物学的に結合していることが観察される。このように、従来の人工組織である微線維性コラーゲン医療材料を用いても、本発明の人工組織が複合組織を形成することが明らかになった。
次に、筋芽細胞を用いた場合の、アスコルビン酸またはその誘導体による人工組織作製への影響を検討した。人工組織生産は、実施例1に準じた。
アスコルビン酸類を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数mm程度の大きさまでしか培養されず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。しかも、はがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった(図43)。これに対し、本発明のアスコルビン酸類を添加した培地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、容易に人工組織を単離することができた(図44)。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり進んでいることが判明した(図45)。
実施例28においてアスコルビン酸類の存在下で作製した人工組織を、拡張型心筋症マウスに移植した。ラットの左前下行枝(LAD)を2週間結紮することによって、28匹のラットにおいて、損傷心臓を作製する。損傷心臓に本発明の人工組織を移植するもの、しないものを作製する。コントロールとして、心臓に損傷を与えないラットも作製する。
上記実施例で作成された人工組織と遺伝子治療の併用療法を施行した。これは併用療法により人工組織移植部の血管新生を促進し、移植人工組織の生着促進、人工組織内部の細胞壊死を抑制する目的である。
センダイウイルス(HVJ)およびリポソーム複合体の調製は文献(Kaneda Y,Iwai K, Uchida T. Increased expression of DNA co−introduced with nuclearprotein in adult rat liver. Science. 1989;243:375−378)の記載に従っておこなった。以下に簡潔に示す。DNA溶液200μlを加え、30秒間振盪し、37度恒温槽に30秒間静置する。これを8回繰り返す。5秒間超音波処理をし、30秒間振盪する。0.3mlのBSSを加え、37度恒温槽で振盪する。不活化したHVJを加え、氷上で10分間置く。37度恒温槽にて1時間振盪する。超遠心チューブに60%と30%のショ糖溶液をそれぞれ1ml、6mlで重層し、HVJリポソーム液をのせ、BSSをチューブの付近まで加える。62,800g、4度で1.5時間超遠心する。30%ショ糖溶液層のすぐ上を回収し、4度に保存し、遺伝子導入に用いた。
人工組織を移植した群、併用療法群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに併用療法をした群では心筋梗塞部分に血管新生を認め、移植細胞の生着が改善していることが確認できる。
人工組織と遺伝子治療とを併用することにより心機能改善効果とさらに血管新生効果と細胞保護効果があり、より心機能の改善が認められる。
配列番号1は、ミオシン重鎖IIa(ヒト:アクセッション番号NM_017534)の核酸配列を示す。
配列番号2は、ミオシン重鎖IIa(ヒト:アクセッション番号NM_017534)のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、ミオシン重鎖IIb(ヒト:アクセッション番号NM_017533)の核酸配列を示す。
配列番号4は、ミオシン重鎖IIb(ヒト:アクセッション番号NM_017533)のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、ミオシン重鎖IId(IIx)(ヒト:アクセッション番号NM_005963)の核酸配列を示す。
配列番号6は、ミオシン重鎖IId(IIx)(ヒト:アクセッション番号NM_005963)のアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、CD56(ヒト:アクセッション番号U63041)の核酸配列を示す。
配列番号8は、CD56(ヒト:アクセッション番号U63041)のアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、ヒトMyoDの核酸配列(GENBANK登録番号:X56677)を示す。
配列番号10は、配列番号9の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号11は、ヒト筋原性因子5(myogenic factor 5)(MYF5)の核酸配列(GENBANK登録番号:NM_005593)を示す。
配列番号12は、配列番号11の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号13は、ヒトミオゲニン(myogenin)(筋原性因子4)の核酸配列(GENBANK登録番号:BT007233)を示す。
配列番号14は、配列番号13の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号15は、Sox9(ヒト:アクセッション番号 NM_000346=軟骨細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号16は、配列番号15の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号17は、Col 2A1(ヒト:アクセッション番号 NM_001844=軟骨細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号18は、配列番号17の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号19は、Aggrecan(ヒト:アクセッション番号 NM_001135=軟骨細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号20は、配列番号19の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号21は、Bone sialoprotein(ヒト:アクセッション番号 NM_004967=骨芽細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号22は、配列番号21の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号23は、Osteocalcin(ヒト:アクセッション番号 NM_199173=骨芽細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号24は、配列番号23の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号25は、GDF5(ヒト:アクセッション番号 NM_000557=靱帯細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号26は、配列番号25の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号27は、Six1(ヒト:アクセッション番号 NM_005982=靱帯細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号28は、配列番号27の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号29は、Scleraxis(ヒト:アクセッション番号 BK_000280=靱帯細胞に特異的なマーカ−)の核酸配列を示す。
配列番号30は、配列番号29の核酸配列にコードされるポリペプチド配列を示す。
Claims (9)
- 実質的に、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞および該細胞に由来する細胞外マトリクスから構成される移植可能な人工組織であって、該細胞外マトリクスは、コラーゲンIおよび/またはコラーゲンIIIを含み、該コラーゲンIおよび/またはコラーゲンIIIは、コラーゲンIIよりも多く、該細胞外マトリクスが該組織中に分散して配置され、臨床適用することができる組織強度を有する、人工組織。
- 請求項1に記載の人工組織を生産するための方法であって、
A)細胞を提供する工程;
B)該細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;
C)該容器中の該細胞を、該因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程;および
D)該人工組織を該容器から剥離して、該人工組織を自己収縮させる工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞培養液が、TGFβ1、TGFβ3、BMP−2、BMP−4およびBMP−7からなる群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 細胞から請求項1に記載の人工組織を生産するための細胞培養組成物であって、
A)該細胞を維持するための成分;および
B)アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩、
を含む、組成物。 - C)TGFβ1、TGFβ3、BMP−2、BMP−4およびBMP−7からなる群より選択される少なくとも1つの因子
をさらに含む、請求項4に記載の組成物。 - 生体の部分を補強、修復または再生するための、請求項1に記載の人工組織を含む医薬。
- 所望の厚さを有する請求項1に記載の人工組織を生産するための方法であって、
A)筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、および骨髄細胞からなる群より選択される細胞を提供する工程;
B)該細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸2リン酸またはその誘導体あるいはその塩を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;
C)該容器中の該細胞を、該因子を含む細胞培養液とともに、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養して、細胞を人工組織とする工程;
D)該人工組織を該容器から剥離して、該人工組織を自己収縮させる工程、および
E)物理的刺激または化学的刺激により、該人工組織の厚さを調節して所望の厚さにする工程、
を包含する、方法。 - 前記細胞培養液が、TGFβ1、TGFβ3、BMP−2、BMP−4およびBMP−7からなる群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 移植可能な請求項1に記載の人工組織と、他の人工組織とを含む、複合組織。
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