JP4511805B2 - Method for measuring neprilysin activity - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルツハイマー病の発症・進展に深くかかわっているアミロイドβタンパク質（Ａβ）の分解を促進して、脳内Ａβ量を低下させ、アルツハイマー病の病状を改善する方法に関する。すなわち、本発明は、脳内でＡβの分解を担っている酵素であるネプリライシンの活性または発現を増強させる方法、神経細胞におけるネプリライシンの活性を測定する方法、および、ネプリライシンの活性を測定することにより神経細胞のネプリライシンの活性または発現を増強させるタンパク質、ペプチド、化合物のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、このスクリーニング方法により見出されたＡβの分解を制御するタンパク質、ペプチド、化合物を含有する医薬組成物、疾病の治療方法および予防方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は痴呆を主症状とする神経変性疾患である。アルツハイマー病患者では大脳皮質の萎縮が見られ、病理学的には高度の神経細胞脱落に加え、老人斑や神経原線維変化などの特徴的病変が観察される。これらのうち、比較的早い段階から見られる病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がアミロイドβタンパク質（Ａβ）であることから、Ａβの産生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深く関わっていると考えられている。Ａβは、前駆体タンパク質（βＡＰＰ）からアスパラギン酸プロテアーゼに属するβ−セクレターゼ（非特許文献１参照）とγ−セクレターゼにより切断され産生される。γ−セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）原因遺伝子、プレセニリンあるいはプレセニリンを含む複合体がその活性発現に関与していることが明らかにされている（非特許文献２および非特許文献３参照）。
このＡβは定常的に体内で合成・分泌されており、正常状態では速やかに分解されて蓄積されないと考えられている。この分解能力が何らかの原因により低下すればＡβが蓄積され、逆に、分解能力を増強すればＡβ蓄積を抑制することができる。最近、Ａβの分解に関わる主要酵素は中性エンドペプチダーゼであるネプリライシンであることが明らかにされた（非特許文献４参照）。ネプリライシンのノックアウトマウスでは脳内Ａβレベルが上昇しており、その上昇は海馬において最も顕著であった（非特許文献５参照）。また、実際に、アルツハイマー病患者の脳においてネプリライシンの発現が低下していることが明らかになっている（非特許文献６参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Science 286, 735-741, 1999
【非特許文献２】
Nature 398, 513-517, 1999
【非特許文献３】
Nature 405, 689-694, 2000
【非特許文献４】
Nature Med. 6, 143-151, 2000
【非特許文献５】
Science 292, 1550-1552, 2001
【非特許文献６】
Neuroscience Lett 297，97-100, 2001
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ネプリライシンの活性または発現を増加させＡβの分解能を上昇させると、脳内のＡβのクリアランスが亢進し、Ａβの蓄積が抑制されると考えられる。しかしながら、ネプリライシンの発現制御に関するメカニズムは良くわかっていない。ネプリライシンは中性エンドペプチダーゼであり、種々の脳内ペプチドを分解する作用を有している。脳内には数多くの生理活性ペプチドが存在するが、その中にはレセプターであるＧＰＣＲ（G-protein coupled receptor）あるいは核内レセプターを介してネプリライシンの発現を制御しているペプチドが存在する可能性がある。ネプリライシンの発現を制御する脳内ペプチドが発見できれば、Ａβの分解を促進する新しい薬剤の探索方法を提供することができ、さらに、アルツハイマー病の治療薬、予防薬など、新しい医薬への応用を図ることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、神経細胞におけるネプリライシンの活性を制御する脳内ペプチドを探索するために、まず、マウスの初代神経細胞におけるネプリライシンの活性を蛍光基質によって視覚化する方法を考案した。この測定系を用いて、種々の脳内ペプチドを作用させて、ネプリライシンの活性に影響を与えるものを探索した結果、ソマトスタチンが初代神経細胞のネプリライシン活性を上昇させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は
（１）蛍光物質を用いるネプリライシンの活性の測定法であって、単離された神経細胞または固定された神経細胞を用いることを特徴とするネプリライシンの活性測定法、
（２）単離され、固定された神経細胞を用いる上記（１）記載のネプリライシンの活性測定法、
（３）パラホルムアルデヒドを用いて固定された神経細胞を用いる上記（１）記載のネプリライシンの活性測定法、
（４）前記神経細胞が培養細胞である上記（１）記載の測定法、
（５）前記培養細胞が初代培養細胞である上記（４）記載の測定法、
（６）前記神経細胞の樹状突起を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（７）前記神経細胞の軸索を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（８）前記神経細胞のシナプス終末を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（９）前記神経細胞のシナプス小胞を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（１０）大脳皮質または海馬から調製された神経細胞を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（１１）前記蛍光物質が４−メトキシ−２−ナフチルアミドとニトロサリチルアルデヒドとの反応生成物である上記（１）記載の測定法、
（１２）４−メトキシ−２−ナフチルアミドがネプリライシンの基質から誘導されることを特徴とする上記（１１）記載の測定法、
（１３）ネプリライシンの基質がグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドである上記（１２）記載の測定法、
（１４）４−メトキシ−２−ナフチルアミドが、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドをネプリライシンで処理し、次いでアミノペプチダーゼで処理することにより得られることを特徴とする上記（１１）記載の測定法、
（１５）前記蛍光物質が７−アミノ−４−メチルクマリンである上記（１）記載の測定法、
（１６）７−アミノ−４−メチルクマリンが、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン ４−メチルクマリン−７−アミドをネプリライシンで処理することにより得られることを特徴とする上記（１５）記載の測定法、
（１７）上記（１）記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８）上記（１７）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩、
（１９）上記（１８）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２０）アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である上記（１９）記載の医薬、
（２１）上記（１）記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２）上記（２１）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩、
（２３）上記（２２）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２４）アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である上記（２３）記載の医薬、
（２５）上記（１）記載の活性測定法を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法、
（２６）ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（２７）ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（２８）哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（２９）哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（３０）哺乳動物において、ソマトスタチンレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（３１）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の使用、
（３２）サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（３３）サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（３４）哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（３５）哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（３６）哺乳動物において、サブスタンスＰレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（３７）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのサブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の使用、
（３８）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（３９）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（４０）哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（４１）哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（４２）哺乳動物において、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（４３）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するための下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用、
（４４）バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（４５）バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（４６）哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（４７）哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（４８）哺乳動物において、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（４９）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのバソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用、等に関する。
また、本発明は
（５０）ネプリライシンの活性または発現を増強することによるアルツハイマー病の予防および／または治療方法を提供する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の実施の形態】
（１）ネプリライシンの活性測定法
本発明の第１の態様によれば、蛍光物質を用いるネプリライシンの活性の測定法であって、単離された神経細胞（生細胞）または固定された神経細胞（好ましくは、単離され、固定された神経細胞）を用いることを特徴とするネプリライシンの活性測定法が提供される。
本発明の測定法において使用する神経細胞は、通常、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）から公知の方法（例えば、Culturing Nerve Cells（The MIT press, 1991）などに記載の方法）を用いて採取される。本発明においては、好ましくは、大脳皮質または海馬から採取した神経細胞を用いる。
【０００７】
本発明においては、上記のようにして採取・単離される神経細胞をそのまま用いることもできるが、通常は、採取した細胞を培養して得られる培養細胞を用いる。培養することにより細胞の性質が安定化し付着性になるので、好ましくは、初代培養細胞が用いられる。また、神経細胞の機能の点から、神経細胞全体ではなく、神経細胞の樹状突起、あるいは軸索、シナプス終末、シナプス小胞などを用いることが好ましい。
【０００８】
培養は、当業者によって適宜選択される条件で行われる。例えば、上記のような部位から採取した細胞を、マイクロタイタープレートあるいはチャンバースライド等を用いて、血清を添加したNeurobasal Medium（LifeTech）、血清を添加したＤＥＭＥ、血清を添加したＭＥＭなどのような培地中で、３７℃、５％ ＣＯ2存在下で、４から６日間培養する。あるいは、２１から２８日間程度まで培養してもよい。後述するように、本発明の測定法では、通常、顕微鏡で細胞を観察するために、得られた神経細胞をチャンバースライド上で培養すると都合がよい。
【０００９】
本発明の測定法においては、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を固定化剤を用いて固定することが好ましい。本発明で用いられる細胞固定化剤としては、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、アセトンなどが用いられる。本発明において好適に用いられる細胞固定化剤は、パラホルムアルデヒドである。固定化の条件は、当業者によって適宜選択することができる（Current Protocols in Cell Biology（John Wiley & Sons, NIH）などの文献参照）。例えば、パラホルムアルデヒド溶液（１．５％ パラホルムアルデヒド／５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．８）中で１０から４０分間細胞を処理することにより固定化を行う。
【００１０】
本発明の測定法の一態様によれば、上記のようにして単離・固定された細胞に、試験化合物と基質溶液を反応させ、さらにアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液およびニトロサリチルアルデヒド溶液を添加、反応させる。ここで用いられる基質としては、例えば、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−２−ナフチルアミド、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン ４−メチルクマリン−７−アミド等の合成基質が挙げられる。好ましい基質は、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドである。上記反応の反応条件は、使用する細胞、基質、試験化合物の種類・量などに応じて当業者が適宜選択できる。例えば、細胞と試験化合物と基質溶液との反応は、細胞として大脳皮質、海馬等から調製された神経細胞を用い、基質としてグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドを用いる場合は、０〜２０℃で、１〜７２時間反応させる。その後のアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液とニトロサリチルアルデヒド溶液との反応は、例えば、２０〜４０℃で１０〜６０分間行う。
【００１１】
上記反応において、ネプリライシンおよびアミノペプチダーゼ処理により、基質として用いる化合物が分解され、分解して得られる化合物が、例えば、ニトロサリチルアルデヒドと反応し、蛍光物質を生じる。基質としてグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドが用いられた場合は、これが分解され、遊離の４−メトキシ−２−ナフチルアミン（ＭＮＡ）が生成される。この遊離のＭＮＡがニトロサリチルアルデヒドと反応し、不溶性の黄色蛍光物質を生ずる。一方、基質としてサクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン ４−メチルクマリン−７−アミドが用いられた場合は、これが分解され、７−アミノ−４−メチルクマリンが生成される。
本発明の測定法においては、上記のような反応を行い、例えば、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて、生成された蛍光物質による陽性染色像を観察する。
【００１２】
ネプリライシンの活性または遺伝子発現の増強は、上記の活性測定により得られる染色像から、画像解析のためのソフトウェアを用いてその蛍光強度を数値化することにより定量できる。該ソフトウェアとしては、日本ローパー社のＭｅｔａＶｕｅなどが用いられる。
【００１３】
（２）ネプリライシン活性染色を用いたネプリライシンの活性および／または発現を増強する化合物のスクリーニング方法
本発明の他の態様によれば、上記ネプリライシン活性の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。すなわち、本発明のネプリライシン活性染色を用いることにより、ネプリライシンの活性および／または発現を増強する化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ネプリライシン活性を促進（あるいは増強）する効果を有する化合物、（ロ）ネプリライシン遺伝子の発現を上昇（あるいは増強）する効果を有する化合物等が含まれる。
具体的には、本発明のスクリーニング法においては、（ｉ）試験化合物を用いずに神経細胞のみを用いた場合と（ｉｉ）神経細胞を試験化合物で処理した場合で、ネプリライシン活性（例えば、ネプリライシンの特異的酵素阻害剤であるチオルファンで阻害を受ける分から測定される活性など）の比較を行なうことを特徴とするネプリライシンの活性または発現を増強する化合物またはその塩をスクリーニングする。
【００１４】
より具体的には、まず、上記のようにして調製される神経細胞をチャンバースライド上で培養する。細胞を培養後、試験化合物の種類および濃度に依存するが、該化合物が細胞と十分反応できる程度に、添加して一定時間（例えば、後述するソマトスタチンの場合、終濃度１μＭで２４時間）インキュベートした後、細胞をパラホルムアルデヒドを用いて固定する。固定した細胞と基質溶液（グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド）を反応させ、さらにアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液およびニトロサリチルアルデヒド溶液を添加、反応させる。これらの反応の反応条件などは、上述した通りである。反応後、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて陽性染色像を観察する。
本発明のスクリーニング方法において、試験化合物としては、例えば、ペプチド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、パンクレアスタチン、トロンボキサン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン）、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。また、後述する、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩、あるいはサブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰのレセプターアンタゴニストまたはその塩は、本発明におけるスクリーニング方法における好ましい試験化合物である。
該スクリーニング方法において、神経細胞を試験化合物で処理した場合、例えば、ネプリライシン活性が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物をネプリライシン活性またはその発現を増強する効果を有する化合物として選択することができる。
【００１５】
（３）スクリーニングの結果得られる化合物を含んでなる医薬
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ネプリライシン活性またはその発現を増強する効果を有するので、アルツハイマー病に対する安全で低毒性な予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００１６】
（４）アルツハイマー病の診断方法
本発明の活性測定法を用いることによりアルツハイマー病の発症前診断を行うことができる。すなわち、本発明の活性測定法により得られた結果を定量化し、定量値をコントロールから得られたものと比較することにより、その個体でのアルツハイマー病の発症リスクを予測することが可能となる。
【００１７】
（５）ネプリライシン活性の増強剤
本発明の別の態様によれば、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。ソマトスタチンは、１４個のアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）からなる公知のタンパク質（ペプチド）であり、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6932−6936, 1983、Science 224, 168-171, 1984などに開示されている。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。また、「部分ペプチド」とは、ソマトスタチンの部分ペプチドであればいずれのペプチドでもかまわないが、構成アミノ酸配列のうち少なくとも３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００１８】
また本発明の別の態様によれば、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。サブスタンスＰは、１1個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）からなる公知のペプチドであり、例えば、Neuropeptides: Regulators of Physiological Processes, (Fleur L. Strand, ed), The MIT Press, Massachusetts, 1999などに開示されている。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。また、「部分ペプチド」とは、サブスタンスＰの部分ペプチドであればいずれのペプチドでもかまわないが、構成アミノ酸配列のうち少なくとも３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００１９】
さらに本発明の別の態様によれば、ＰＡＣＡＰレセプター、ＶＩＰレセプター等のアンタゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。これらは、Neuropeptides: Regulators of Physiological Processes, (Fleur L. Strand, ed), The MIT Press, Massachusetts, 1999などに開示される公知のペプチドである。ＰＡＣＡＰあるいはＶＩＰがネプリライシン活性あるいはその遺伝子発現に対して抑制的に作用するので、ＰＡＣＡＰレセプター、ＶＩＰレセプター等のアンタゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００２０】
本発明ではまた、上記の既知のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をプローブとして、新規なネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。すなわち、ソマトスタチン、ソマトスタチンレセプターのアゴニスト、サブスタンスＰ、サブスタンスＰレセプターのアゴニスト、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰレセプターのアンタゴニスト等により活性あるいは発現を増強したネプリライシンに、試験化合物を加えた場合のネプリライシン活性あるいは発現の量と、試験化合物を加えない場合のネプリライシン活性あるいは発現の量とを比較することにより、新規のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。あるいは、ソマトスタチン、ソマトスタチンレセプターのアゴニスト、サブスタンスＰ、サブスタンスＰレセプターのアゴニスト、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰレセプターのアンタゴニスト等により増強したネプリライシン活性あるいは発現の量と、試験化合物により増強するネプリライシン活性あるいは発現の量とを比較することにより、新規のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。試験化合物としては、例えば、ペプチド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、パンクレアスタチン、トロンボキサン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン）、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
【００２１】
（６）製剤化、投与量、投与方法など
本発明の活性測定法を用いたスクリーニング方法により得られた化合物を、ネプリライシン活性を利用することによるＡβの分解促進剤または除去剤ひいてはアルツハイマー病の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
上記化合物が、製薬学的に許容できる塩を形成できるときは、そのような塩を形成していてもよい。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記化合物（その塩も含む）は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、上記活性化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００２２】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００２３】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
本発明において得られる化合物の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このようにして得られる製剤は例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００２４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００２５】
【実施例】
実施例１ 初代培養神経細胞のネプリライシン活性染色
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、ポリ−Ｌ−リジンをコートしたチャンバースライド（８チャンバー、IWAKI 4730-040）に１×１０5細胞／チャンバーの濃度で播種し７日間培養した。培養終了後、細胞をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、パラホルムアルデヒド溶液（１．５％ パラホルムアルデヒド／５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．８）により１２．５分間、２０℃で細胞を固定した。細胞をＴＢＳで２回洗浄した後、０．２ｍｌの基質溶液（グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、Sigma G3769、最終濃度０．５ｍＭ；0.05M Tris-HCl緩衝液、ｐＨ７．４（４℃でｐＨを７．４に調整））を加え、４℃で４８時間反応させた。反応終了後、さらに２５μｌのアミノペプチダーゼ（Sigma L-5006、最終濃度２０．４μｇ／ｍｌ）・ホスホラミドン（Peptide Inst. 4082、最終濃度１０μＭ）混合液および２５μｌのニトロサリチルアルデヒド溶液（６ｍＭ）を順次添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応はＴＢＳで２回細胞を洗浄することで完結し、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて陽性染色像を観察した（図１）。ネプリライシンにより基質が分解されると不溶性の蛍光反応物が形成され、ネプリライシンの存在部位が黄色に視覚化される。この方法により、マウス胎仔大脳皮質および海馬の初代培養神経細胞にはネプリライシンの酵素活性が存在することが確認された。ネプリライシンの存在部位は神経細胞の突起部分で顕著であった。
【００２６】
実施例２ ソマトスタチンによるネプリライシン酵素活性の誘導
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、実施例１と同様に培養した。培養７日目に、ソマトスタチン（ソマトスタチン１４および２８、最終濃度１μＭ）を添加し、さらに２４時間培養した。培養終了後、実施例１で示した方法により、マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性を視覚化して観察した（図２）。ソマトスタチンの添加により神経細胞のネプリライシン活性はソマトスタチン非添加コントロールに比較して顕著に増加した。また、このネプリライシン酵素活性は、ネプリライシンに特異的な酵素阻害剤チオルファン（Sigma T6031、最終濃度１０μＭ）を基質溶液に添加することによりほぼ完全に消失することから、ネプリライシンに特異的であることが確認された。さらに、詳細に検討するために、これらの染色像を画像解析ソフトウェア（日本ローパー社、ＭｅｔａＶｕｅ）により定量化して検討した結果、ソマトスタチンによりネプリライシンの酵素活性は約２．５倍に増加していることが確認された（図３）。
【００２７】
実施例３ 神経ペプチドによるネプリライシン酵素活性の調節
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、実施例１と同様に培養する。培養７日目に、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰなどの各種神経ペプチド（最終濃度１μＭ）を添加し、さらに２４時間培養する。培養終了後、実施例１で示した方法により、マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性を視覚化して観察する。ペプチド非添加コントロールに比較して、ペプチドの添加により神経細胞のネプリライシン活性が顕著に変化（増強または抑制）するものを選択する。
ＰＡＣＡＰ（ＰＡＣＡＰ３８、最終濃度１μＭ）を添加し、実施例２と同様に処理した結果を図４に示す。ＰＡＣＡＰの添加により神経細胞のネプリライシン活性はＰＡＣＡＰ非添加コントロールに比較して顕著に減少した。また、このネプリライシン酵素活性は、ネプリライシンに特異的な酵素阻害剤チオルファン（Sigma T6031、最終濃度１０μＭ）を基質溶液に添加することによりほぼ完全に消失することから、ネプリライシンに特異的であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のネプリライシン活性測定法を用いることを特徴とするスクリーニング方法から得られるネプリライシン活性および／または発現を増強する化合物はネプリライシン活性を利用することによるＡβの分解促進剤または除去剤ひいてはアルツハイマー病の予防および／または治療剤として有用である。また、本発明の活性測定法はアルツハイマー病の発症前の診断に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性の活性染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】 マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性に対するソマトスタチンおよびチオルファンの効果を示す顕微鏡写真である。
【図３】 実施例２で得られた染色像を画像解析ソフトウェアにより定量化した結果を示す。
【図４】 マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性に対するＰＡＣＡＰおよびチオルファンの効果を示す顕微鏡写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for ameliorating the pathology of Alzheimer's disease by promoting the degradation of amyloid β protein (Aβ), which is deeply involved in the onset and progression of Alzheimer's disease, thereby reducing the amount of Aβ in the brain. That is, the present invention provides a method for enhancing the activity or expression of neprilysin, an enzyme responsible for Aβ degradation in the brain, a method for measuring the activity of neprilysin in nerve cells, and measuring the activity of neprilysin. The present invention relates to a screening method for proteins, peptides, and compounds that enhance neprilysin activity or expression in neurons. The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing a protein, peptide or compound that controls the degradation of Aβ found by this screening method, a method for treating and preventing a disease.
[0002]
[Prior art]
Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease whose main symptom is dementia. In patients with Alzheimer's disease, cortical atrophy is observed, and pathologically, in addition to severe neuronal loss, characteristic lesions such as senile plaques and neurofibrillary tangles are observed. Among these, the pathological change seen from a relatively early stage is the formation of senile plaques, and since its main component is amyloid β protein (Aβ), abnormal production or degradation of Aβ is the onset of Alzheimer's disease. It is thought to be deeply involved in progress. Aβ is cleaved from a precursor protein (βAPP) by β-secretase belonging to aspartic protease (see Non-Patent Document 1) and γ-secretase. Regarding γ-secretase, it has been clarified that familial Alzheimer's disease (FAD) causal gene, presenilin or a complex containing presenilin is involved in the expression of its activity (see Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). ).
This Aβ is constantly synthesized and secreted in the body, and is considered to be rapidly decomposed and not accumulated under normal conditions. Aβ is accumulated if this degradation ability decreases for some reason, and conversely, if the degradation ability is enhanced, Aβ accumulation can be suppressed. Recently, it was revealed that the main enzyme involved in the degradation of Aβ is neprilysin, which is a neutral endopeptidase (see Non-Patent Document 4). Neprilysin knockout mice had elevated brain Aβ levels, and the increase was most prominent in the hippocampus (see Non-Patent Document 5). Moreover, it has been clarified that the expression of neprilysin is actually decreased in the brain of Alzheimer's disease patients (see Non-Patent Document 6).
[0003]
[Non-Patent Document 1]
Science 286, 735-741, 1999
[Non-Patent Document 2]
Nature 398, 513-517, 1999
[Non-Patent Document 3]
Nature 405, 689-694, 2000
[Non-Patent Document 4]
Nature Med. 6, 143-151, 2000
[Non-Patent Document 5]
Science 292, 1550-1552, 2001
[Non-Patent Document 6]
Neuroscience Lett 297, 97-100, 2001
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
When the activity or expression of neprilysin is increased to increase the resolution of Aβ, it is considered that the clearance of Aβ in the brain is increased and the accumulation of Aβ is suppressed. However, the mechanism for the regulation of neprilysin expression is not well understood. Neprilysin is a neutral endopeptidase and has an action of degrading various brain peptides. There are a number of physiologically active peptides in the brain. Among them, there is a possibility that there are peptides that control the expression of neprilysin through GPCR (G-protein coupled receptor) or nuclear receptor. There is. If a brain peptide that controls the expression of neprilysin can be discovered, a method for searching for a new drug that promotes the degradation of Aβ can be provided, and further, it can be applied to a new drug such as a therapeutic drug or a preventive drug for Alzheimer's disease. be able to.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to search for a peptide in the brain that controls neprilysin activity in neurons, the present inventor first devised a method for visualizing neprilysin activity in mouse primary neurons with a fluorescent substrate. Using this measurement system, various brain peptides were allowed to act to search for those that affect neprilysin activity. As a result, it was found that somatostatin increased neprilysin activity in primary neurons, and the present invention was completed. It came to.
That is, the present invention
(1) A method for measuring the activity of neprilysin using a fluorescent substance, the method comprising measuring isolated or fixed nerve cells, and measuring the activity of neprilysin,
(2) The method for measuring neprilysin activity according to (1) above, using isolated and fixed nerve cells,
(3) The method for measuring neprilysin activity according to the above (1), using nerve cells fixed with paraformaldehyde,
(4) The measuring method according to the above (1), wherein the nerve cell is a cultured cell,
(5) The measurement method according to (4) above, wherein the cultured cells are primary cultured cells,
(6) The measurement method according to (1) above, wherein dendrites of the nerve cells are used,
(7) The measuring method according to (1) above, wherein the nerve cell axon is used.
(8) The measurement method according to (1) above, wherein the synaptic terminal of the nerve cell is used.
(9) The measurement method according to (1) above, wherein the neuronal synaptic vesicle is used.
(10) The measurement method according to the above (1), wherein a nerve cell prepared from cerebral cortex or hippocampus is used.
(11) The measuring method according to the above (1), wherein the fluorescent substance is a reaction product of 4-methoxy-2-naphthylamide and nitrosalicylaldehyde,
(12) The method according to (11) above, wherein 4-methoxy-2-naphthylamide is derived from a substrate of neprilysin.
(13) The measuring method according to the above (12), wherein the substrate of neprilysin is glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide,
(14) Characteristically, 4-methoxy-2-naphthylamide is obtained by treating glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide with neprilysin and then with aminopeptidase. The measurement method according to (11) above,
(15) The measuring method according to the above (1), wherein the fluorescent substance is 7-amino-4-methylcoumarin.
(16) The method according to (15) above, wherein 7-amino-4-methylcoumarin is obtained by treating succinyl-alanyl-alanyl-phenylalanine 4-methylcoumarin-7-amide with neprilysin. ,
(17) A screening method for a compound that enhances neprilysin activity or a salt thereof, characterized by using the measurement method according to (1) above,
(18) A compound or a salt thereof that enhances the activity of neprilysin, which can be obtained using the screening method according to (17) above,
(19) A medicament comprising the compound according to (18) or a salt thereof,
(20) The medicament according to the above (19), which is a prophylactic and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease, a symptom ameliorating agent or a progression inhibitor,
(21) A screening method for a compound that enhances the expression of neprilysin or a salt thereof, characterized by using the measurement method according to (1) above,
(22) A compound or a salt thereof that enhances the expression of neprilysin, which can be obtained using the screening method according to (21) above,
(23) A medicament comprising the compound according to (22) or a salt thereof,
(24) The medicament according to the above (23), which is an agent for preventing and / or treating Alzheimer's disease, a symptom improving agent or a progression inhibitor,
(25) A method for diagnosing Alzheimer's disease, characterized by using the activity measurement method described in (1) above,
(26) an enhancer of neprilysin activity comprising a somatostatin, a protein or a partial peptide thereof containing substantially the same amino acid sequence as somatostatin, a somatostatin receptor agonist or a salt thereof,
(27) an enhancer of neprilysin expression comprising somatostatin, a protein or a partial peptide thereof containing substantially the same amino acid sequence as somatostatin, an agonist of a somatostatin receptor or a salt thereof,
(28) Neprilysin activity characterized by administering to mammals an effective amount of somatostatin, a protein containing an amino acid sequence substantially the same as somatostatin or a partial peptide thereof, an agonist of a somatostatin receptor or a salt thereof. Enhancement method,
(29) Expression of neprilysin characterized by administering to mammals an effective amount of somatostatin, a protein containing substantially the same amino acid sequence as somatostatin or a partial peptide thereof, a somatostatin receptor agonist or a salt thereof Enhancement method,
(30) A method for enhancing neprilysin activity or expression, characterized by promoting the activity of a somatostatin receptor in a mammal;
(31) Use of somatostatin, a protein containing the same amino acid sequence as somatostatin or a partial peptide thereof, an agonist of somatostatin receptor or a salt thereof for producing an agent for enhancing activity or expression of neprilysin.
(32) Substance P, a protein containing a substantially identical amino acid sequence to substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof, an agent for enhancing neprilysin activity,
(33) an agent for enhancing expression of neprilysin, comprising substance P, a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of a substance P receptor or a salt thereof,
(34) An effective amount of substance P, a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof, is administered to a mammal. A method for enhancing the activity of neprilysin,
(35) An effective amount of substance P, a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof, is administered to a mammal. A method for enhancing the expression of neprilysin,
(36) A method for enhancing the activity or expression of neprilysin, which comprises promoting the activity of a substance P receptor in a mammal,
(37) Use of substance P, a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof for producing an agent for enhancing neprilysin activity or expression,
(38) An enhancer of neprilysin activity comprising an antagonist of a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor or a salt thereof,
(39) An enhancer of neprilysin expression comprising an antagonist of a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor or a salt thereof,
(40) A method for enhancing the activity of neprilysin, which comprises administering an effective amount of an antagonist of a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor or a salt thereof to a mammal,
(41) A method for enhancing the expression of neprilysin, comprising administering to a mammal an effective amount of an antagonist of a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor or a salt thereof,
(42) A method for enhancing the activity or expression of neprilysin, which comprises inhibiting the activity of a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor in a mammal.
(43) Use of an antagonist of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor or a salt thereof for producing an agent for enhancing the activity or expression of neprilysin.
(44) An enhancer of neprilysin activity comprising an antagonist of a vasoactive intestinal peptide receptor or a salt thereof,
(45) An agent for enhancing the expression of neprilysin, comprising an antagonist of a vasoactive intestinal peptide receptor or a salt thereof,
(46) A method for enhancing neprilysin activity, comprising administering an effective amount of an antagonist of a vasoactive intestinal peptide receptor or a salt thereof to a mammal,
(47) A method for enhancing the expression of neprilysin, which comprises administering an effective amount of an antagonist of a vasoactive intestinal peptide receptor or a salt thereof to a mammal,
(48) A method for enhancing the activity or expression of neprilysin, which comprises inhibiting the activity of a vasoactive intestinal peptide receptor in a mammal,
(49) Use of an antagonist of a vasoactive intestinal peptide receptor or a salt thereof for producing an agent for enhancing activity or expression of neprilysin.
The present invention also provides
(50) Provided is a method for preventing and / or treating Alzheimer's disease by enhancing neprilysin activity or expression.
[0006]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Neprilysin activity measurement method
According to the first aspect of the present invention, there is provided a method for measuring the activity of neprilysin using a fluorescent substance, which is an isolated nerve cell (live cell) or a fixed nerve cell (preferably isolated and fixed). Provided is a method for measuring neprilysin activity.
The nerve cells used in the measurement method of the present invention are usually each part of the brain (eg, olfactory bulb, cephalic nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, subthalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital region. It is collected from a leaf, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra using a known method (for example, the method described in Culture Nerve Cells (The MIT press, 1991)). . In the present invention, nerve cells collected from the cerebral cortex or hippocampus are preferably used.
[0007]
In the present invention, the nerve cells collected and isolated as described above can be used as they are, but usually cultured cells obtained by culturing the collected cells are used. Since cultured cells are stabilized and become adherent, primary cultured cells are preferably used. From the viewpoint of the function of nerve cells, it is preferable to use dendrites of nerve cells, axons, synaptic terminals, synaptic vesicles, etc., instead of whole nerve cells.
[0008]
The culture is performed under conditions appropriately selected by those skilled in the art. For example, using a microtiter plate or a chamber slide or the like, cells collected from the above sites can be used as a medium such as Neurobasal Medium (LifeTech) to which serum is added, DEME to which serum is added, or MEM to which serum is added. In, 37 ° C, 5% CO 2 Incubate in presence for 4-6 days. Alternatively, it may be cultured for about 21 to 28 days. As will be described later, in the measurement method of the present invention, it is usually convenient to culture the obtained nerve cells on a chamber slide in order to observe the cells with a microscope.
[0009]
In the measurement method of the present invention, it is preferable to fix cells using a fixing agent after adding a test compound and incubating for a certain period of time. As the cell fixing agent used in the present invention, paraformaldehyde, formalin, acetone or the like is used. The cell fixing agent preferably used in the present invention is paraformaldehyde. Conditions for immobilization can be appropriately selected by those skilled in the art (see literature such as Current Protocols in Cell Biology (John Wiley & Sons, NIH)). For example, immobilization is performed by treating cells for 10 to 40 minutes in paraformaldehyde solution (1.5% paraformaldehyde / 50 mM phosphate buffer, pH 6.8).
[0010]
According to one aspect of the measurement method of the present invention, the test compound and the substrate solution are reacted with the cells isolated and fixed as described above, and an aminopeptidase / phosphoramidone mixed solution and a nitrosalicylaldehyde solution are added, React. Examples of the substrate used here include glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide, glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-2-naphthylamide, succinyl-alanyl-alanyl- Examples include synthetic substrates such as phenylalanine 4-methylcoumarin-7-amide. A preferred substrate is glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide. The reaction conditions for the above reaction can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type, amount, etc. of the cells to be used, the substrate, and the test compound. For example, the reaction between a cell, a test compound and a substrate solution is performed using neurons prepared from cerebral cortex, hippocampus, etc. as cells, and glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide as a substrate. Is used, it is reacted at 0 to 20 ° C. for 1 to 72 hours. The subsequent reaction between the aminopeptidase / phosphoramidone mixed solution and the nitrosalicylaldehyde solution is carried out, for example, at 20 to 40 ° C. for 10 to 60 minutes.
[0011]
In the above reaction, the compound used as a substrate is decomposed by treatment with neprilysin and aminopeptidase, and the compound obtained by decomposition reacts with, for example, nitrosalicylaldehyde to produce a fluorescent substance. When glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide is used as a substrate, it is decomposed to produce free 4-methoxy-2-naphthylamine (MNA). This free MNA reacts with nitrosalicylaldehyde to produce an insoluble yellow fluorescent material. On the other hand, when succinyl-alanyl-alanyl-phenylalanine 4-methylcoumarin-7-amide is used as a substrate, it is decomposed to produce 7-amino-4-methylcoumarin.
In the measurement method of the present invention, the reaction as described above is performed, and for example, a positive stained image with the generated fluorescent substance is observed under a confocal laser microscope using an argon laser and a rhodamine filter.
[0012]
The enhancement of neprilysin activity or gene expression can be quantified by digitizing the fluorescence intensity from the stained image obtained by the above activity measurement using software for image analysis. As the software, for example, MetaVue manufactured by Nippon Roper is used.
[0013]
(2) Screening method for compounds that enhance neprilysin activity and / or expression using neprilysin activity staining
According to another aspect of the present invention, there is provided a screening method for a compound that enhances neprilysin activity or a salt thereof, characterized by using the above-described method for measuring neprilysin activity. That is, by using the neprilysin activity staining of the present invention, a compound that enhances neprilysin activity and / or expression (eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof can be efficiently produced. Can be screened.
Such compounds include (a) a compound having an effect of promoting (or enhancing) neprilysin activity, (b) a compound having an effect of increasing (or enhancing) the expression of neprilysin gene, and the like.
Specifically, in the screening method of the present invention, neprilysin activity (for example, neprilysin) is observed when (i) only nerve cells are used without using a test compound and (ii) nerve cells are treated with a test compound. A compound or a salt thereof that enhances the activity or expression of neprilysin, which is characterized by comparison of the activity measured from the amount inhibited by thiorphan, a specific enzyme inhibitor.
[0014]
More specifically, first, nerve cells prepared as described above are cultured on a chamber slide. After culturing the cells, depending on the type and concentration of the test compound, it was added and incubated for a certain time (for example, in the case of somatostatin, which will be described later, 24 hours at a final concentration of 1 μM) so that the compound can sufficiently react with the cells. The cells are then fixed using paraformaldehyde. The fixed cells are reacted with a substrate solution (glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide), and an aminopeptidase / phosphoramidone mixed solution and a nitrosalicylaldehyde solution are added and reacted. The reaction conditions for these reactions are as described above. After the reaction, a positive stained image is observed under a confocal laser microscope using an argon laser and a rhodamine filter.
In the screening method of the present invention, test compounds include, for example, peptides (for example, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, substance P, PACAP. , Secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), pancreatinstatin, thromboxane, adrenaline , Chemokine superfamily, endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreas I click poly peptide, galanin), proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like are used. These compounds may be novel compounds or known compounds. Moreover, the mixture of 2 or more types of these compounds can also be provided as a sample. In addition, a protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence substantially the same as somatostatin, a somatostatin receptor agonist or a salt thereof, or a protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence substantially the same as substance P, which will be described later Substance P receptor agonists or salts thereof, PACAP and VIP receptor antagonists or salts thereof are preferred test compounds in the screening methods of the present invention.
In the screening method, when nerve cells are treated with a test compound, for example, when neprilysin activity is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is treated with neprilysin activity or It can be selected as a compound having the effect of enhancing its expression.
[0015]
(3) A pharmaceutical comprising a compound obtained as a result of screening
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds and has an effect of enhancing neprilysin activity or its expression, and thus a safe and low-toxic preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease It can be used as a pharmaceutical. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
[0016]
(4) Alzheimer's disease diagnosis method
By using the activity measurement method of the present invention, pre-onset diagnosis of Alzheimer's disease can be performed. That is, it is possible to predict the risk of developing Alzheimer's disease in an individual by quantifying the results obtained by the activity measurement method of the present invention and comparing the quantitative values with those obtained from the control.
[0017]
(5) Neprilysin activity enhancer
According to another aspect of the present invention, an agent for enhancing the activity of neprilysin, comprising somatostatin, a protein or a partial peptide thereof containing substantially the same amino acid sequence as somatostatin, an agonist of a somatostatin receptor or a salt thereof, or An agent for enhancing the expression of neprilysin is provided. Somatostatin is a known protein (peptide) consisting of 14 amino acids (Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys), for example, Proc Natl. Acad. Sci. USA 80, 6932-6936, 1983, Science 224, 168-171, 1984, and the like.
Here, the “substantially identical amino acid sequence” refers to, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, and further preferably about 80% to the amino acid sequences to be compared. % Or more, preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence. Further, the “partial peptide” may be any peptide as long as it is a partial peptide of somatostatin. However, the amino acid sequence of at least 3 or more, preferably 5 or more, more preferably 7 or more of the constituent amino acid sequences. Peptides having such are preferred.
Or administration of an effective amount of a somatostatin, a protein containing a substantially identical amino acid sequence to somatostatin or a partial peptide thereof, an agonist of a somatostatin receptor or a salt thereof, to enhance the neprilysin activity of the target mammal or Neprilysin expression can be enhanced.
[0018]
According to another aspect of the present invention, the activity of neprilysin comprising substance P, a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof. Or an enhancer of neprilysin expression is provided. Substance P is a known peptide consisting of 11 amino acids (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met), for example, Neuropeptides: Regulators of Physiological Processes, (Fleur L. Strand, ed), The MIT Press, Massachusetts, 1999. Here, the “substantially identical amino acid sequence” refers to, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, and further preferably about 80% to the amino acid sequences to be compared. % Or more, preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence. The “partial peptide” may be any peptide as long as it is a partial peptide of substance P. Among the constituent amino acid sequences, at least 3, preferably 5 or more, more preferably 7 or more amino acid sequences. Peptides having and the like are preferred.
Substance P, neprilysin activity of the target mammal by administering to the mammal an effective amount of a protein containing the same amino acid sequence as substance P or a partial peptide thereof, an agonist of substance P receptor or a salt thereof Or expression of neprilysin can be enhanced.
[0019]
Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided an agent for enhancing neprilysin activity or an agent for enhancing neprilysin expression, comprising an antagonist such as a PACAP receptor, a VIP receptor or a salt thereof. These are known peptides disclosed in Neuropeptides: Regulators of Physiological Processes, (Fleur L. Strand, ed), The MIT Press, Massachusetts, 1999, and the like. Since PACAP or VIP suppresses neprilysin activity or gene expression thereof, neprilysin of the target mammal can be obtained by administering an effective amount of an antagonist such as PACAP receptor or VIP receptor or a salt thereof to the mammal. The activity can be enhanced or the expression of neprilysin can be enhanced.
[0020]
In the present invention, a novel neprilysin activity or expression enhancer can be screened using the above-described known neprilysin activity or expression enhancer as a probe. That is, the amount of neprilysin activity or expression when a test compound is added to neprilysin whose activity or expression has been enhanced by somatostatin, an agonist of somatostatin receptor, substance P, agonist of substance P receptor, antagonist of PACAP and VIP receptor, etc. By comparing the amount of neprilysin activity or expression when no test compound is added, a novel neprilysin activity or expression enhancer can be screened. Alternatively, the amount of neprilysin activity or expression enhanced by somatostatin, an agonist of somatostatin receptor, substance P, an agonist of substance P receptor, an antagonist of PACAP and VIP receptor, etc. is compared with the amount of neprilysin activity or expression enhanced by a test compound Thus, a novel neprilysin activity or expression enhancer can be screened. Examples of the test compound include peptides (for example, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, substance P, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, Adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), pancreatin, thromboxane, adrenaline, chemokine superfamily, endothelin, Enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin), Protein, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like are used. These compounds may be novel compounds or known compounds. Moreover, the mixture of 2 or more types of these compounds can also be provided as a sample.
[0021]
(6) Formulation, dosage, administration method, etc.
When the compound obtained by the screening method using the activity measurement method of the present invention is used as an agent for promoting or removing Aβ by utilizing neprilysin activity, and as a preventive and / or therapeutic agent for Alzheimer's disease, it is conventionally used. It can be formulated according to the means.
When the above compound can form a pharmaceutically acceptable salt, such a salt may be formed. Such salts include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.), especially physiologically acceptable acid additions. Salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
The above compounds (including salts thereof) can be used orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of sterile solutions or injections such as suspensions. For example, the active compound is admixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in unit dosage forms generally required for the practice of accepted formulations. Can be manufactured. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
[0022]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0023]
The preventive and / or therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The dose of the compound obtained in the present invention varies depending on the administration subject, symptoms, administration method and the like, but in the case of oral administration, it is generally about 0. 0 per day for a patient (as 60 kg). 1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, symptoms, administration method, etc. For example, in the form of an injection, it is usually given to a patient (as 60 kg) per day. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
The preparation thus obtained can be administered to, for example, humans and other mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
[0024]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are abbreviated based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
[0025]
【Example】
Example 1 Neprilysin activity staining of primary cultured neurons
Nerve cells were prepared from mouse fetal cerebral cortex and hippocampus, and 1 × 10 4 on a poly-L-lysine coated chamber slide (8 chamber, IWAKI 4730-040). Five Seeding at cell / chamber concentration and culturing for 7 days. After completion of the culture, the cells were washed with TBS (pH 7.4), and fixed with paraformaldehyde solution (1.5% paraformaldehyde / 50 mM phosphate buffer, pH 6.8) for 12.5 minutes at 20 ° C. . After washing the cells twice with TBS, 0.2 ml of substrate solution (glutaryl-alanyl-alanyl-phenylalanyl-4-methoxy-2-naphthylamide, Sigma G3769, final concentration 0.5 mM; 0.05 M Tris-HCl Buffer solution, pH 7.4 (adjusted to pH 7.4 at 4 ° C.)) was added and reacted at 4 ° C. for 48 hours. After completion of the reaction, 25 μl of aminopeptidase (Sigma L-5006, final concentration 20.4 μg / ml) / phosphoramidone (Peptide Inst. 4082, final concentration 10 μM) and 25 μl of nitrosalicylaldehyde solution (6 mM) were sequentially added. And reacted at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was completed by washing the cells twice with TBS, and a positive stained image was observed under a confocal laser microscope using an argon laser and a rhodamine filter (FIG. 1). When the substrate is degraded by neprilysin, an insoluble fluorescent reaction product is formed, and the site of neprilysin is visualized in yellow. By this method, it was confirmed that neprilysin enzyme activity exists in mouse embryonic cerebral cortex and hippocampal primary cultured neurons. The site of neprilysin was prominent in the protrusions of neurons.
[0026]
Example 2 Induction of neprilysin enzyme activity by somatostatin
Nerve cells were prepared from mouse fetal cerebral cortex and hippocampus and cultured in the same manner as in Example 1. On day 7 of culture, somatostatin (somatostatin 14 and 28, final concentration 1 μM) was added, and the cells were further cultured for 24 hours. After completion of the culture, neprilysin activity of mouse primary cultured neurons was visualized and observed by the method shown in Example 1 (FIG. 2). The addition of somatostatin significantly increased neprilysin activity in neurons compared to the control without somatostatin. This neprilysin enzyme activity disappears almost completely when the enzyme inhibitor thiorphan (Sigma T6031, final concentration 10 μM) specific for neprilysin is added to the substrate solution, confirming that it is specific to neprilysin. It was done. Furthermore, in order to examine in detail, these stained images were quantified by image analysis software (Nippon Roper, MetaVue), and as a result, the enzyme activity of neprilysin was increased about 2.5 times by somatostatin. Was confirmed (FIG. 3).
[0027]
Example 3 Regulation of neprilysin enzyme activity by neuropeptides
Nerve cells are prepared from mouse fetal cerebral cortex and hippocampus and cultured in the same manner as in Example 1. On the 7th day of culture, various neuropeptides (final concentration 1 μM) such as substance P, PACAP, VIP and the like are added, and further cultured for 24 hours. After completion of the culture, neprilysin activity of mouse primary cultured neurons is visualized and observed by the method shown in Example 1. As compared with the peptide non-added control, those in which neprilysin activity of nerve cells is remarkably changed (enhanced or suppressed) by the addition of the peptide are selected.
The result of adding PACAP (PACAP38, final concentration of 1 μM) and treating in the same manner as in Example 2 is shown in FIG. The addition of PACAP significantly decreased the neprilysin activity of neurons compared with the control without PACAP. This neprilysin enzyme activity disappears almost completely when the enzyme inhibitor thiorphan (Sigma T6031, final concentration 10 μM) specific for neprilysin is added to the substrate solution, confirming that it is specific to neprilysin. It was done.
[0028]
【The invention's effect】
A compound that enhances neprilysin activity and / or expression obtained from a screening method characterized by using the neprilysin activity measurement method of the present invention is an agent for promoting or removing Aβ by using neprilysin activity, and thus prevention of Alzheimer's disease. And / or useful as a therapeutic agent. Moreover, the activity measuring method of this invention can be used for the diagnosis before onset of Alzheimer's disease.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph showing the results of activity staining of neprilysin activity in mouse primary cultured neurons.
FIG. 2 is a photomicrograph showing the effects of somatostatin and thiorphan on neprilysin activity in mouse primary cultured neurons.
FIG. 3 shows the result of quantification of the stained image obtained in Example 2 using image analysis software.
FIG. 4 is a photomicrograph showing the effect of PACAP and thiorphan on neprilysin activity in mouse primary cultured neurons.
Claims (18)
単離された神経細胞または固定された神経細胞を、ネプリライシンの基質、アミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液、およびニトロサリチルアルデヒドと反応させて、蛍光物質を生成させる工程、および
前記生成した蛍光物質による前記細胞の染色像の蛍光強度を測定する工程、
を含む、ネプリライシンの活性測定法。A method for measuring the activity of neprilysin,
Reacting isolated or fixed neurons with neprilysin substrate, aminopeptidase / phosphoramidone mixture, and nitrosalicylaldehyde to produce a fluorescent material, and the cells produced by the generated fluorescent material Measuring the fluorescence intensity of the stained image of
A method for measuring neprilysin activity, comprising:
単離された神経細胞または固定された神経細胞を、試験化合物、ネプリライシンの基質、アミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液、およびニトロサリチルアルデヒドとともにインキュベートして、蛍光物質を生成させる工程、
前記生成した蛍光物質による前記細胞の染色像の蛍光強度を測定する工程、ならびに
試験化合物がない場合と比較して、前記蛍光強度を上昇させる試験化合物をネプリライシン活性またはその発現を増強する化合物として選択する工程、
を含む、スクリーニング方法。A method for screening a compound or a salt thereof that enhances the activity of neprilysin or expression thereof,
Incubating isolated or fixed neurons with a test compound, a substrate for neprilysin, an aminopeptidase-phosphoramidone mixture, and nitrosalicylaldehyde to produce a fluorescent substance;
The step of measuring the fluorescence intensity of the stained image of the cells with the generated fluorescent substance, and selecting the test compound that increases the fluorescence intensity as a compound that enhances neprilysin activity or its expression compared to the case where there is no test compound The process of
A screening method comprising:
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Citations (3)
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| JPH11506926A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-22 | アイデックス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | Method and composition for detecting bacterial contamination in food |
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| JPH11506926A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-22 | アイデックス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | Method and composition for detecting bacterial contamination in food |
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