JP4509163B2 - 微小粒子の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、微小粒子の測定方法に関する。より詳しくは、流路中を流れる微小粒子を測定する技術に関する。

近年、少量の試料をマイクロ流路等に流し、その試料の分析を流路中で行う技術が、バイオ関連の分析や化学分析等をはじめ、幅広い分野に応用されている。更には、光システムなどの応用分野における注目度の高まりや，流路表面の加工技術等や新材料の開発によって、より一層の発展が期待されている。

このような技術が用いられるものとして、例えば、フローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーでは、被測定物質として細胞やタンパク質等を対象とし、これらの分析を基板等に設けた流路内で行う。この分析結果等を踏まえて、被測定物質の分取（セル ソーティング）を続いて行う。従って、被測定物質のソーティングを正確に行うためには、流路中での測定が正確であることが重要である。

また、流路内部に設けた電極を用いて細胞の電気的物性等を計測する試みも行われている。例えば、タンパク質分析用のチップ類、マイクロディスペンサを用いた質量分析等に供するためのものや、マイクロリアクター等といったようなものである。これらについても、物性の測定や、マイクロリアクター等の反応の解析を行なうには、流路中で正確な測定ができることが重要となる。

それ以外の分野としても、例えば、化学分析等においても、このような流路中での測定技術がマイクロシステム技術として応用されている。例えば、基板上に流体素子としてマイクロ流路を設け、各種検出器等を集積化したマイクロ化学分析システム等への応用が考えられている。

流路中で正確な各種物性の測定を行うために、参照用流路に被測定物質を搬送する流体媒体のみを流し、この測定を行うことで、被測定物質の測定結果に反映させることが行われている。このような技術に関して、特許文献１には、検体流路以外に参照用流路を設けたマイクロチップ等が開示されている。

特開２００３−４７５２号公報。

しかし、前記参照用流路を設けただけでは、測定の度に相違する参照値を正確に把握できないといった問題があった。また、測定の前準備の作業に時間がかかり作業効率が低いといった問題があった。以上の問題は、特に、微小粒子の測定において顕著であった。

そこで、本発明は、流路中において微小粒子の測定をするにあたり、正確な測定が可能である微小粒子の測定方法を提供することを主な目的とする。

まず、本発明は、流路中を流れる微小粒子の測定方法であり、少なくとも（１）測定用流路に微小粒子である被測定物質を、同一の参照用流路に粒子径が異なる複数種類の参照物質を、それぞれ流しながら、前記測定用流路の所定位置で前記被測定物質の物性測定を、前記参照用流路の所定位置で前記参照物質の物性測定を、それぞれ行う工程と、（２）前記被測定物質の測定結果を、前記参照物質の測定結果に基づいて処理する工程、とを行う微小粒子の測定方法を提供する。
また、本発明は、流路中を流れる微小粒子の測定方法であり、少なくとも（１）測定用流路に微小粒子である被測定物質を、同一の参照用流路に粒子形状が異なる複数種類の参照物質を、それぞれ流しながら、前記測定用流路の所定位置で前記被測定物質の物性測定を、前記参照用流路の所定位置で前記参照物質の物性測定を、それぞれ行う工程と、（２）前記被測定物質の測定結果を、前記参照物質の測定結果に基づいて処理する工程、とを行う微小粒子の測定方法を提供する。参照用流路を設けただけでなく、参照物質を用いてその物性測定を行うことで、流路中を流れる微小粒子の状態も考慮して、被測定物質の物性情報の検出に反映させることができるだけでなく、複数種類の参照物質を用いることで、より多くの参照情報を得ることができるため、より精度の高い検出が可能となる。
本発明は、前記各参照物質としてビーズ及び／又は細胞を用いることができる。
次に、本発明は、前記（２）工程では、各参照物質の夫々異なる測定結果に基づいて、前記被測定物質の測定結果を処理する測定方法を提供する。
更に、本発明は、少なくとも前記（１）工程において、前記参照物質の測定結果に基づいて、前記被測定物質の測定条件を調整する工程を行うことができる。参照物質の測定結果に基づいて、前記被測定物質の測定条件をより最適なものに調整できるため、より精度の高い検出が可能となる。
また、本発明は、前記測定する物性は、光学的物性、電気的物性、磁気的物性の少なくともいずれかである測定方法を提供する。微小粒子の光学的物性や電気的物性や磁気的物性は、流路中の微小粒子の状態の影響を受け易いが、参照用流路中に存在する参照物質の測定を行うため、係る影響を考慮することができる。
そして、前記測定は、前記被測定物質と前記参照物質の夫々に光照射を行うことで得られる測定対象光を検出する光学測定であり、前記被測定物質と、前記参照物質との光照射は、光走査することを少なくとも行う微小粒子の測定方法を提供する。これにより、各々の測定条件をより近しく設定できるため、測定条件や測定状態を含めた正確な測定が可能となる。
更に、前記参照物質として用いられるビーズ及び／又は細胞は、蛍光色素を少なくとも有するものを用いることができる。また、前記参照物質として用いられるビーズ及び／又は細胞は、磁性体を少なくとも有するものを用いることができる。前記測定は、前記被測定物質と前記参照物質の夫々に光照射を行い、前記各参照物質の散乱光の強度とパルス幅の関係と、対応する粒子径との相関関係を把握することも可能である。

本発明によれば、流路中において微小粒子の測定を行うにあたり、正確な測定が可能である微小粒子の測定方法とすることができる。

以下、添付図面に基づいて、本発明に係る微小粒子の測定方法について説明する。なお、以下の添付図面等は、本発明に係わる代表例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

図１は、本発明に係る微小粒子の測定方法の概略を説明するためのフロー図である。図２は、本発明に係る微小粒子の測定方法に用いる流路構造の一例を示す概念図である。図３は、本発明で行う処理の一例を説明するための図である。以下、図１，２，３を参照しながら本発明に係る測定方法の一例について説明する。なお、図２の符号１は、測定用物質が導入される測定用流路１を示している。図２の符号２は、参照物質が導入される参照用流路を示している。

本発明は、少なくとも（１）測定用流路１に微小粒子である被測定物質を、参照用流路２に参照物質を、それぞれ流しながら、前記測定用流路１の所定位置で被測定物質の物性測定を行い、前記参照用流路２の所定位置で参照物質の物性測定を、それぞれ行う工程（（１）工程）と、（２）被測定物質の測定結果を、参照物質の測定結果に基づいて処理する工程（（２）工程）、を行うものである。

まず、被測定物質を測定用流路１にセットする（図１の符号Ｓａ１参照）。
このセットとは、例えば、測定用流路１に被測定物質を導入し、流体媒体で被測定物質を挟み込みながら搬送すること等が挙げられる。この流体媒体はシース液として用いることができ、いわゆる層流状態を作り出すことができる。これにより、被測定物質は測定用流路１内を整然と搬送される（図２の拡大領域参照）。

測定用流路１の導入路１２１から被測定物質を導入し、導入路１２２，１２２から流体媒体を導入することができる。特に、流体媒体で被測定物質を挟み込むように流すことが望ましく、これにより測定用流路１内の流れを層流とすることができる。流体媒体は、被測定物質の種類等を考慮して選択することができ、例えば、細胞等が被測定物質である場合には、流体媒体として生理食塩水等を用いることができる。

このように流体媒体を導入路１２２，１２２からそれぞれ導入する際に、圧力等を適宜調節することで、被測定物質の搬送速度を調節することができる。更には、流路内における被測定物質の位置も高精度に制御できる。

その後、被測定物質について、測定用流路１中の所定位置１１で所望する物性の測定を行う（符号Ｓａ２参照）。

これらの物性の測定は、測定用流路１内の所定位置１１において行われる。この所定位置１１を流路内のどの場所に設けるのかは限定されず、適宜、流路構造や測定条件等を考慮して決定することができる。

一方、参照用流路２にも同様に参照物質をセットする（図１の符号Ｓｂ１参照）。
このセットは、測定用流路１と同様の操作を行なうものとでき、例えば、参照用流路２に参照物質を注入し、流体媒体を流しながら参照物質を搬送することが挙げられる。この参照用流路２でも、参照物質を参照用流路２の導入路２２１から導入し、流体媒体を導入路２２２，２２２から導入することで、層流状態を形成させることが望ましい。

その後、参照物質について、参照用流路２中の所定位置２１で所望する物性について測定を行う（符号Ｓｂ２参照）。
ここでは、測定用流路１の所定位置１１で測定した物性について測定する。このように、本発明に係る微小粒子の測定方法は、単に参照用流路２を設けるだけでなく、この参照用流路２中に参照物質を存在した状態で少なくとも測定を行うことを特徴の一つとしている。これにより、参照物質の測定結果を、参照情報として用いることができる。得るべき参照情報については限定されず、測定すべき物性に応じた必要な情報を適宜に選択できる。参照情報としては、例えば、流路中の微小粒子や各種媒体の温度、流量、流速、ｐＨ値、粘度比重等の測定条件に関するものや、各参照物質の状態に関するものが挙げられ、より詳細な参照情報を得ることができる。

更に、本発明は、被測定物質の測定結果を、参照物質の測定結果に基づいて処理することを行う（符号Ｓ３参照）。ここでいう処理とは、参照物質の測定結果に基づいて、被測定物質の測定結果の補正を行うことをいい、その処理方法等は限定されない。例えば、較正、補正、規格化、オフセット調整、ゲイン調整等である。具体的には、蛍光強度補正、蛍光波長補正、レーザーパワー補正、レーザースポットのサイズ調整、光検出器等の感度補正、流路中の流量や流速の補正等が挙げられる。そして、測定する物性に応じて、処理内容を決定できる。これについては後述する。

そして、本発明は、参照物質の測定結果に基づいて、被測定物質の測定条件を調整することを行うこともできる。即ち、この参照物質の測定結果に基づいて被測定物質の測定条件を調整する工程を、更に設けることができる。参照物質の測定結果を、被測定物質の測定条件にフィードバックさせることで、より正確な測定が可能となる。この測定条件は特に限定されず、例えば、検出器や各種機器の測定パラメータ等の校正、調整、補正等が挙げられる。具体的には、レーザーパワーや検出器の感度補正や、流路中の流量や流速等に関するものが挙げられる。そして、このような測定条件の調整は本発明の工程中であればよく、各工程の実施順序等について限定するものではない。

検出精度の向上を目的とするものとして、従来は、参照用流路２に流体媒体のみを流し、その測定結果を参照用として反映させていた。確かに、流体媒体の影響を考慮できるので、ある程度の測定精度の改善は可能であった。しかし、流路中での微小粒子の物性測定では、流体媒体の物性以外にも、測定試料の測定条件等の影響が挙げられる。

これに関して、本発明では、参照用流路２に参照物質を流して測定を行うことを必須とする。この測定条件には、測定する物性に関するあらゆる情報が包含され、参照物質を流した状態の測定を少なくとも行うことで、流路中の微小粒子や流体媒体の温度、流量、流速、ｐＨ値、粘度、比重、光学系の状態、例えば、光スポット形状やレーザーパワーの経時変化等といった、物質の各種測定条件の影響等も考慮できる。これにより、より正確な物性情報を得ることができる。

図３は、本発明で行い得る処理の一例を説明するための図である。被測定物質の蛍光測定を行う場合を一例として詳述する。ここでは、被測定物質は蛍光ビーズに担持したものを用い、参照物質は被測定物質が担持されていない蛍光ビーズを用いるものである。

図３の（１）は、参照用流路２で測定した参照物質の蛍光スペクトラムｂ１に基づいて、測定用流路１で得た測定結果を処理して、正確な被測定物質の物性情報として蛍光スペクトラムａ１を検出したものである。以下、参照物質の蛍光スペクトラムを、参照スペクトラムという場合がある。

蛍光検出の際は、流路中を搬送される物質の状態によっては、実際に測定されるスペクトラム強度が十分でない場合や、ピークトップとなる波長がわずかながらずれてしまう場合がある。このような誤差は、参照用流路２に流体溶媒のみを流すだけでは把握できない。しかし、本発明では、参照物質の蛍光スペクトラムｂ１を得ることができるため、これらの誤差を簡便かつ正確に把握できる。

例えば、参照物質の蛍光スペクトラムｂ１の蛍光強度が弱い場合には、この参照スペクトラムｂ１の結果を踏まえて、出力される強度を補正することで、適正な蛍光強度である蛍光スペクトラムａ１を得ることができる（ゲイン補正）。あるいは、光源から照射される励起光強度を増大させることで、得られる蛍光強度を増大させることができるため、参照スペクトラムｂ１の強度を参照しながら、適正な励起光強度とすることでも、適正な蛍光スペクトラムａ１を得ることができる（レーザーパワーによる補正）。

例えば、検出ピークトップ波長がλ２であるべきところを、参照スペクトラムにおいて波長λ１として検出されてしまう場合には、（λ２−λ１）の誤差が生じていることが把握できる。この誤差を考慮して補正を行なうことで、適正な蛍光スペクトラムａ１を得ることができる。

更には、検出精度の補正にフィードバックさせることも行うことができる。図示はしないが、検出部として用いられるディテクタ等の受光強度等を補正することで、適切な検出強度とすることができる（光検出器による補正）。

図３の（２）は、参照用流路２で測定した参照物質の蛍光スペクトラムｂ２だけでなく、予め得ておいた正確な波長の数値λも踏まえた処理を行ったものであり、これにより正確な被測定物質の物性情報として蛍光スペクトラムａ２を検出したものである。

図３の（２）では、使用する蛍光ビーズの波長λ等について予め正確な情報を得ておく。これにより、参照物質の参照スペクトラムで検出した波長λ１と、前記波長λとの誤差（λ−λ１）を検出することができる。

そして、この処理によって得られた情報を被測定物質の物性情報として検出する（符号Ｓ４参照）。これによって、より正確な物性情報を得ることができ、後続で行う操作等に反映させることができる。

これまで説明した、測定用流路１で行った各操作（図１の符号Ｓａ１，Ｓａ２等参照）と、参照用流路２で行なった各操作（図１の符号Ｓｂ１，Ｓｂ２等参照）の順番はここで説明した順番等に限定されない。被測定物質の測定結果（図１の符号Ｓａ２参照）、参照物質の測定結果（図１の符号Ｓｂ２参照）とを、処理操作（図１の符合Ｓ３参照）に用いることができればよいからである。

従って、測定用流路１における所定位置１１での測定と、参照用流路２における所定位置２１での測定とを同時に行うことに限定はしないが、好適には、少なくとも同時に測定することが望ましい。これにより、より近い条件で夫々測定ができるため、より正確な物性測定が可能となる。更に、図２に示す如き、測定用流路と参照用流路はできるだけ近接して配置することが望ましい。走査位置を近づけることによって、各測定条件をより近似させて夫々測定できるため、より正確な物性測定が可能となる。

ここでは、光学的物性として蛍光検出を行う場合について例示的に説明したが、本発明において測定可能な物性はこれに限定されるものではない。例えば、光学的物性、電気的物性、磁気的物性等を測定することができる。

本発明で可能な光学的物性の測定として、例えば、蛍光測定、散乱光測定、透過光測定、反射光測定、回折光測定、紫外分光測定、赤外分光測定、ラマン分光測定、ＦＲＥＴ測定、ＦＩＳＨ測定その他各種スペクトラム測定等を用いることができる。そして、その際、必要に応じ、ビーズ等に被測定物質を担持させることもできる。

そして、参照物質として、ビーズや細胞等を用いる場合として、蛍光測定を行う場合には蛍光色素を用いることができる。参照物質が細胞である場合には、蛍光色素を抗原抗体反応により、その表面に修飾させることが可能である。一方、ビーズの場合には、蛍光色素をその表面に化学的に修飾したり、ビーズ内部に混合させたしてもよい。あるいはビーズの形状や大きさを異ならせてもよい。更に、励起波長が異なる蛍光色素を併用してもよい。これについては、後述する。

本発明で可能な電気的物性の測定としては、例えば、被測定物質に関する抵抗値、容量値（キャパシタンス値）、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値等の測定を行うことができる。

例えば、被測定物質を対向する電極間に通過させ、発生したインピーダンスの直流成分や高周波成分である周波数スペクトルを測定すること等に用いることができる。本発明では、測定用流路１の所定領域１１に何らかの電気的測定素子を形成させ、そこに被測定物質を通過させて電気的な物性情報を得る。参照用流路２の所定領域２１にも同様の電気的測定素子を形成させ、そこに参照物質を通過させて参照用の電気的な物性情報を得る。このようにして得られた参照用の電気的な物性情報に基づいて、被測定物質の電気的な物性情報を処理すること等が可能である。

本発明で可能な磁気的物性の測定としては、磁化、磁界変化、磁場変化等の測定を行うことができる。このようなものとして、例えば、細胞表面に磁性体を修飾した細胞や磁気ビーズを用いることができる。更には、磁気ビーズ等を蛍光色素で標識して一体としてもよい。

そして、本発明では、このような磁気ビーズと磁石を用いることで特定の細胞を捕集して分別する手法等にも応用できる。従来であれば分離精度はそれほど高くないといった問題があったが、本発明によればこのような問題を解消できる。例えば、モノクロナール抗体等と磁気ビーズとを反応させた細胞を、強力な磁界中に配置した測定用流路１と参照用流路２に通過させて細胞を測定（更には分離）すること等が可能である。例えば、被測定物質を対向する磁気コイルに通過させ、発生した磁界の直流成分や高周波成分である周波数スペクトルを測定することができる。あるいは、磁気抵抗素子等により磁化の変化を測定することもできる。

上述のように、参照物質としてビーズや細胞等を用いることができる。そして、ビーズとして通常用いられる種々のビーズを採用でき、例えば、ポリスチレン等の樹脂製のビーズや、ガラス等のガラス製ビーズを用いることができる。更には、これらの表面や内部に、蛍光色素や磁性体、導体、光学物質等を混合したり修飾したりしたものを用いることができ、例えば、樹脂ビーズや蛍光ビーズや磁気ビーズ等を用いることができる。更に、これらビーズの大きさや形状等も適宜選択することができ、例えば、球体以外にも楕円体や立方体や直方体等の形状であってもよい。そして、このようなビーズは、測定する物性に応じて選択できる。

図４は、本発明の別の一例を説明するための概念図である。

図４は、測定用流路１に被測定物質を流し、参照用流路２に参照物質Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７を流している。これらに対して、光照射（励起光照射）することで蛍光検出等を行うものであり、かつ両流路に対して測定用の光スポットＭを走査して光照射している（図４の両矢印参照）。

測定用流路１には、被測定物質Ａが順次流路中を矢印の方向に搬送されている。この被測定物質Ａの大きさや形状等がそれぞれ異なっている。ここでは説明の便宜上、図示された測定光スポット上に位置する被測定物質Ａ１に注目して説明する（図４の両矢印参照）。測定用流路１に層流が形成されることによって、被測定物質Ａ１は流路の略中心部分（点線参照）を搬送されている。この被測定物質Ａ１は、測定したい試料に蛍光ビーズを担持させており、前記測定光スポットで蛍光検出と前方散乱光検出を行うものである。なお、ここで測定したい試料としては、細胞やビーズ等が挙げられる。

参照用流路２には、参照物質として７種類の蛍光ビーズが順次流路中を矢印の方向に搬送されている。そして、参照用流路２は、層流が形成されることによって流路の略中心部分（点線参照）を参照物質Ｂ１〜Ｂ７が順次搬送されている。ここでは、参照物質が被測定物質Ａ１と異なる種類の蛍光ビーズを用いていることや、参照物質Ｂ１〜Ｂ７同士のビーズの直径と蛍光波長が異なることを特徴の一としている。

なお、ビーズの直径と蛍光波長が異なる蛍光ビーズを用いることは、蛍光検出や散乱光検出等を行う際の一例である。図４では、ビーズの直径と蛍光波長が相違する参照物質（蛍光ビーズ）を複数種類用いている。本発明では、複数種類の参照物質を用いる際には、測定する物性（光学的物性、電気的物性、磁気的物性等）に応じて、どのような測定パラメータを相違させるかについて適宜決定できる。

本発明では、測定用流路１と参照用流路２に対して励起光を走査させて照射することが望ましい。励起光を走査させることで、被測定物質Ａ１と各参照物質Ｂ１〜Ｂ７の夫々に励起光を照射できる。そして、これら流路を順次に走査することで、着目する測定物性情報（例えば、スペクトル強度分布等）を連続的に参照でき、より高精度の物性検出が可能となる。

走査手法は限定するものでなく、例えば、ガルバノミラーやポリゴンミラーやＭＥＭＳ等の光走査素子等の公知の手法によって走査させることができる。また、必要に応じて、異なる波長の光を時分割的に照射してもよい。これにより、複数波長についての測定が可能となる。その結果、より多くの参照情報を取得可能であり、正確な物性測定が可能となる。また、被測定用流路１と参照用流路２とを近接させて配置させることが望ましい。そして、光走査を行うことで各々の測定条件をより近しい条件に設定できるため、測定条件や測定状態を含めた正確な測定が可能となる。

図５は、図４に示した参照物質を用いる場合の説明に供する図である。ここで示す一例は、７種類の参照物質を用いて、蛍光検出と前方散乱光の検出を行った場合の一例である。

蛍光色素とビーズ直径がそれぞれ異なる７種類の参照物質を用いている。これらの参照物質は、参照用流路２内の所定位置（例えば、図２の符号２１等参照）で測定することができる。表１にそれぞれの蛍光色素名とビーズ直径について示す。

参照物質Ｂ１は、蛍光色素としてCascade Blueを用い、ビーズ直径が０．５μｍである。参照物質Ｂ２は、蛍光色素としてFITCを用い、ビーズ直径が１μｍである。参照物質Ｂ３は、蛍光色素としてPEを用い、ビーズ直径が２μｍである。参照物質Ｂ４は、蛍光色素としてPE−Texas Redを用い、ビーズ直径が４μｍである。参照物質Ｂ５は、蛍光色素としてPE−Cy5を用い、ビーズ直径が８μｍである。参照物質Ｂ６は、蛍光色素としてAPCを用い、ビーズ直径が１６μｍである。参照物質Ｂ７は、蛍光色素としてAPC−Cy7を用い、ビーズ直径が３２μｍである。

蛍光検出は、使用する蛍光色素の励起波長、吸収波長によって異なるスペクトラムとなる。このため、図５の（１）に示す如く各蛍光色素に対応した７つの波長ピークが認められる（図５の（１）の符号Ｂ１〜Ｂ７参照）。

なお、この図５の（１）は、実際に測定された参照スペクトラムを規格化したものである。本発明において、複数の参照物質から得られた各測定結果は、処理する（例えば、図１の符号Ｓ３等参照）前に規格化することが望ましい。特に、走査して光照射を行っている場合では、各測定用物質で検出波長の微小なずれや、検出信号強度のずれ等が生じやすい。各測定用物質の測定結果を規格化することで、このようなずれ等を解消し、適正に評価することができる。

更に、図５の（１）に図示するように被測定物質Ａ１の測定スペクトラムを処理する（例えば、図１の符号Ｓ４等参照）際に、被測定物質の蛍光スペクトラム信号を、前記７種類の各蛍光色素のスペクトラムの線形和として、逆行列解析を行なうこともできる。ここで行う逆行列解析の手法は、特に限定されず、適宜、測定するパラメータや、参照物質の数等を考慮して好適な手法を選択することができる。

本発明では、必要に応じて、各蛍光色素について予め知られている数値を併用してもよい。例えば、図５の場合であれば、７種類の蛍光色素のうちの一部について、励起波長や蛍光波長を予め求めておき、これを用いることができる。更には、必要に応じて、参照物質に関して実際に測定すべきパラメータ情報の一部を、予めライブラリ化しておくこともできる。

この図５の（２）は、参照用流路２中の参照物質Ｂ１〜Ｂ７のそれぞれの前方散乱光について示している。これらのビーズの直径が異なるため、各前方散乱光はパルス幅と前方散乱光の強度がそれぞれ異なっている。そのため、少なくとも７種類のビーズの直径に対応する生データを得ることができる。これにより、例えば、前方散乱光の強度とパルス幅の関係と、それに対応するビーズ径との相関関係等を把握できる。そして、測定用流路１中の被測定物質Ａ１の直径等について高い精度で見積もることができる。特に、前方散乱光の検出は、流路中の流れだけでなく、ビーズ自身の大きさや、流路中の位置や、光のアライメントの影響等が大きいという問題がある。これに関して、特に、大きさが異なる参照物質を複数用いることで、より正確な前方散乱光の検出が可能である。

ここでは、一例として蛍光検出と前方散乱光の検出を行う場合について説明したが、これら以外の測定パラメータについても、同様に行うことができる。異なる種類の測定用物質を併用して参照用の測定結果を得て、これらの測定結果に基づいて被測定物質の測定結果を処理することで、被測定物質の正確な測定情報を検出できる。

図６は、本発明の更に別の一例を説明するための概念図である。

図６は、６本の測定用流路１を略並行に配置して、それぞれに被測定物質Ａを流し、１本の参照用流路２を配置して参照物質Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７を流している。なお、測定用流路１には、蛍光ビーズに担持された被測定物質が順次流路中を矢印の方向に搬送されている。このように、複数の測定用流路１を配置させて、まとめて測定を行なうこともできる。この場合、これらの各流路に対して光照射を走査させながら行うことで、効率よく測定できる（図６の両矢印参照）。また、走査させる際には、経時的なばらつき等が測定結果に影響を及ぼす場合があるが、本発明では参照物質の測定結果も経時的に得ることができるので、このようなばらつきも逐次に補正しながら、被測定物質の測定情報を補正することができる。

参照用流路２には、７種類の蛍光ビーズが順次流路中を矢印の方向に搬送されている。特に、複数の被測定物質を検出する際には、このように複数種類の参照物質を用いることで、より多くの参照情報を得ることができるため好適である。これにより、流路構造としての省スペース化に寄与できるだけでなく、網羅的な解析にも寄与することができる。

図７は、本発明の更に別の一例を説明するための概念図である。

図７は、６本の測定用流路１を略並行に配置して、それぞれに被測定物質を流し、その両側に参照用流路２ａ，２ｂを配置して参照物質の測定を行っている。なお、各測定用流路１には、蛍光ビーズに担持された被測定物質が順次流路中を矢印の方向に搬送されている。このように、必要に応じて、複数の測定用流路１と、複数の参照用流路２ａ，２ｂをまとめて測定することもできる。以下、今まで述べた例との共通点の説明は割愛し、相違点を中心に説明する。

参照用流路２ａでは、ビーズの直径が同じであるが、蛍光色素が異なる参照物質Ｂ８，Ｂ９，Ｂ１０，Ｂ１１，Ｂ１２，Ｂ１３，Ｂ１４を逐次搬送させている。一方、参照用流路２ｂでは、蛍光色素を有しなく、ビーズの直径が異なる参照物質Ｂ１５，Ｂ１６，Ｂ１７を逐次搬送させている。

このように、本発明では、複数の参照用流路を用いて、夫々に異なる種類の参照物質を搬送させることもできる。また、必要に応じて、参照物質を搬送する参照用流路２ａ，２ｂ等以外に、参照物質を流さず流体媒体のみを流す参照用流路を別途設けてもよい。

図８は、本発明の更に別の一例を説明するための概念図である。

図８は、測定用流路１に被測定物質Ａを搬送し、参照用流路に複数の参照物質Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７を搬送しているが、夫々３箇所の測定スポットＭ１，Ｍ２，Ｍ３で測定を行っている。図８は、測定用流路１と参照用流路２の夫々において複数箇所で測定を行うことを特徴の一としている。

そして、この測定スポットＭ１，Ｍ２，Ｍ３では異なる波長の光をそれぞれ照射することができる。流路中において複数波長での測定を行うことで、より多くの物性の測定が可能となる。例えば、測定スポットＭ１，Ｍ２，Ｍ３において、異なる励起波長λ１，λ２，λ３とすることで、複数波長に対する蛍光検出や前方散乱光等の光学測定を行うことができる。更に、前述した電気的特性や磁気的特性に関する測定を行ってもよいし、これらを組み合わせることで多元的な参照情報を得ることができる。これらの特性についても、参照物質Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５，Ｂ６，Ｂ７を用いることや、複数の測定位置において測定することによって、精度の高い測定や検出が可能である。更には、リアルタイムでの検出測定も可能とならしめる。

基板等に、測定対象とする細胞やビーズを流す測定用流路１とは別に、参照スペクトルや参照直径を得るためのビーズを流す参照用流路２を設け、これらの流路を略同時に測定できるよう、測定光スポットをスキャンさせることで、参照スペクトルや参照直径やスペクトル強度やこれらの分布等を連続的かつ経時的に参照できる。

そして、参照スペクトルや参照直径に基づいて処理を行うことで、物性測定の定量性についても精度を更に高めることができる。また、参照スペクトルは、測定対象とする細胞やビーズ等の参照スペクトルとしても利用することが可能である。その際でも、同じ光学条件や水流条件でのスペクトル強度や分布を利用することができるので、より定量性に優れ、高精度の解析が可能となる。

加えて、測定中の光学系や水流系、更には光学系や分取系のアライメントのずれ等も防止したり補正したりできる。また、作業者にとっても前準備のための作業等が軽減され、作業効率の改善にも貢献できる。

本発明に係る微小粒子の測定方法は、細胞等のような微小物質を流路内で分析する技術等として好適に用いることができる。例えば、フローサイトメトリーやビーズアッセイ等への応用が考えられる。フローサイトメトリーでは、蛍光分析や前方散乱光（ＦＳＣ；Forward Scatter）や側方散乱光（ＳＳＣ；Side Scatter）等の測定を行う光学系等に対して、本発明に関する技術を応用できる。本発明によれば、短時間に多くの細胞を正確に測定することができる。また、参照物質の測定結果等に基づく処理を行うことで、検出において微弱な光であっても検出することができる。あるいは、参照物質と被測定物質とを光走査によって照射・検出することで、略同一条件で測定することができる。

また、複数種類の参照物質を用いることで、クラスター分析の手法を適用することもでき、目的の細胞群について高精度の分析が可能である。従って、特定の細胞の分取（セル・ソーティング）も高速で行うことができる。

また、化学反応等の所定反応を微小流路等で行うマイクロリアクターにも応用することができる。分光測定や加熱を目的として光照射を、流路内で行う場合には、照射制御に反映させることができる。例えば、レーザー照射を行う際には、検出した光学情報（例えば、蛍光強度等）を考慮して出力パワーを制御することができる。

本発明に係る微小粒子の測定方法の概略を説明するためのフロー図である。 本発明に係る微小粒子の測定方法に用いる流路構造の一例を示す概念図である。 本発明で行う処理の一例を説明するための図である。 本発明に係る微小粒子の測定方法の別の一例を説明するための概念図である。 図４に示した参照物質を用いる場合の説明に供する図である。 本発明に係る微小粒子の測定方法の更に別の一例を説明するための概念図である。 本発明に係る微小粒子の測定方法の更に別の一例を説明するための概念図である。 本発明に係る微小粒子の測定方法の更に別の一例を説明するための概念図である。

符号の説明

１ 測定用流路
２ 参照用流路
Ａ 被測定物質
Ｂ 参照物質

Claims (10)

1. 流路中を流れる微小粒子の測定方法であり、少なくとも以下の（１）工程と（２）工程とを行う微小粒子の測定方法。
   （１）測定用流路に微小粒子である被測定物質を、同一の参照用流路に粒子径が異なる複数種類の参照物質を、それぞれ流しながら、前記測定用流路の所定位置で前記被測定物質の物性測定を、前記参照用流路の所定位置で前記参照物質の物性測定を、それぞれ行う工程、
   （２）前記被測定物質の測定結果を、前記参照物質の測定結果に基づいて処理する工程。
2. 流路中を流れる微小粒子の測定方法であり、少なくとも以下の（１）工程と（２）工程とを行う微小粒子の測定方法。
   （１）測定用流路に微小粒子である被測定物質を、同一の参照用流路に粒子形状が異なる複数種類の参照物質を、それぞれ流しながら、前記測定用流路の所定位置で前記被測定物質の物性測定を、前記参照用流路の所定位置で前記参照物質の物性測定を、それぞれ行う工程、
   （２）前記被測定物質の測定結果を、前記参照物質の測定結果に基づいて処理する工程。
3. 前記各参照物質はビーズ及び／又は細胞である請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の微小粒子の測定方法。
4. 前記（２）工程では、各参照物質の夫々異なる測定結果に基づいて、前記被測定物質の測定結果を処理することを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の微小粒子の測定方法。
5. 少なくとも前記（１）工程において、前記参照物質の測定結果に基づいて、前記被測定物質の測定条件を調整する工程を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の微小粒子の測定方法。
6. 前記測定する物性は、光学的物性、電気的物性、磁気的物性の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の測定方法。
7. 前記測定は、前記被測定物質と前記参照物質の夫々に光照射を行うことで得られる測定対象光を検出する光学測定であり、
   前記被測定物質と、前記参照物質との光照射は、光走査することを少なくとも行うことを特徴とする請求項６記載の微小粒子の測定方法。
8. 前記参照物質として用いられるビーズ及び／又は細胞は、蛍光色素を少なくとも有するものであることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の微小粒子の測定方法。
9. 前記参照物質として用いられるビーズ及び／又は細胞は、磁性体を少なくとも有するものであることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の微小粒子の測定方法。
10. 前記測定は、前記被測定物質と前記参照物質の夫々に光照射を行い、
    前記各参照物質の散乱光の強度とパルス幅の関係と、対応する粒子径との相関関係を把握する請求項１記載の測定方法。