JP4371900B2 - Chromatographic packing material - Google Patents
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Description
本発明はクロマトグラフィー用充填剤に関する。さらに詳しくは、ホスホリルコリン基と特定のイオン交換性の基、または、ホスホリルコリン基と疎水性の基、または、ホスホリルコリン基と芳香族とが基材表面に直接的に共有結合し、ＧＦＣモードとイオン交換モードまたは/および逆相モードが混在した分離を実現しつつ、極めてタンパク質・ペプチドの非特異的不可逆吸着が少ないクロマトグラフィー用充填剤に関する。 The present invention relates to a chromatographic filler. More specifically, a phosphorylcholine group and a specific ion-exchange group, or a phosphorylcholine group and a hydrophobic group, or a phosphorylcholine group and an aromatic group are directly covalently bonded to the substrate surface, and exchange with a GFC mode. The present invention relates to a packing material for chromatography, which realizes separation in which modes and / or reversed-phase modes are mixed, and extremely reduces non-specific irreversible adsorption of proteins and peptides.
ホスホリルコリン基を有する重合体は生体適合性高分子として検討されている。そして、この重合体を各種基剤に被覆させた生体適合性材料が開発されている。 Polymers having a phosphorylcholine group have been studied as biocompatible polymers. Biocompatible materials in which this polymer is coated on various bases have been developed.
例えば、特許文献１にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した医療用材料が記載されている。また、特許文献２にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した分離剤が開示されている。
For example,
上記の材料は、主に水酸基を有するアクリル系モノマーと２−クロロ−１，３，２−ジオキサホスホラン−２−オキシドを反応させ、更にトリメチルアミンにより４級アンモニウムとすることによりホスホリルコリン構造を有するモノマーを合成し、これを重合して得られる重合体により、その表面が被覆されたものである（重合体の製造方法に関しては特許文献３及び４を参照）。
The above materials have a phosphorylcholine structure by reacting mainly an acrylic monomer having a hydroxyl group with 2-chloro-1,3,2-dioxaphosphorane-2-oxide and further converting to quaternary ammonium with trimethylamine. The surface is coated with a polymer obtained by synthesizing a monomer and polymerizing the monomer (see
特許文献３には、２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの共重合体が製造され、特許文献４には２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンの単独重合体が製造されている。
Patent Document 3 manufactures a copolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and methacrylic acid ester, and
一方、タンパク質やタンパク質よりも分子量が小さいポリペプチド等の生体試料をサイズ排除によって分離するＧＦＣ用充填剤には、多くの市販品が存在する。このＧＦＣ用充填剤には、架橋された親水性高分子を基材とする充填剤と、シリカゲルを基材とする充填剤が存在する。 On the other hand, there are many commercially available GFC fillers for separating biological samples such as proteins and polypeptides having a molecular weight smaller than that of proteins by size exclusion. The filler for GFC includes a filler based on a crosslinked hydrophilic polymer and a filler based on silica gel.
架橋された親水性高分子を基材とする充填剤は、適用できる移動相のｐＨ範囲が広く、汎用性が高い。しかしながら、高分子を基材とする充填剤はシリカゲルを基材とする充填剤よりも、（１）細孔径の制御が困難であるためにサイズ排除の観点でも高理論段数を得づらく、また、（２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用される際にかかる高圧条件に対する強度が悪いことと移動相溶媒によって粒子が膨潤することのために再現性のよいクロマトグラムを得られないことも多い。 A filler based on a cross-linked hydrophilic polymer has a wide mobile phase pH range and high versatility. However, the filler based on the polymer is more difficult to control the pore size than the filler based on the silica gel (1) because it is difficult to obtain a high theoretical plate number from the viewpoint of size exclusion. (2) In many cases, reproducible chromatograms cannot be obtained due to poor strength against high pressure conditions when used in high performance liquid chromatography (HPLC) and swelling of particles by mobile phase solvent. .
シリカゲルを基材とする充填剤は、タンパク質やポリペプチドのシリカゲル基材表面への吸着が問題となる。そこで、分析試料中のタンパク質やポリペプチドのシリカゲルへの吸着を抑制する目的で、非解離性の親水性基によって表面が修飾されたシリカゲルを用いた充填剤が市販されている。
例えば、シリカゲル系ＧＦＣ用カラムとして、昭和電工株式会社からは、Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ−８０３（製品名）が市販されている。このシリカゲル系カラムは、カタログに、分子量数千から１００万程度のタンパク質の分析に適したシリカゲル系のＧＦＣモードのカラムであると説明されている。
また、株式会社ワイエムシィからは、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ（製品名）が市販されている。これもシリカゲル系のＧＦＣ用カラムであり、ジオール構造を有する官能基をシリカゲル基材に共有結合したもので、分子数千から数十万のタンパク質の分離に適用できると説明されている。
The filler based on silica gel has a problem of adsorption of protein or polypeptide onto the surface of the silica gel substrate. Therefore, for the purpose of suppressing adsorption of proteins and polypeptides in the analysis sample to the silica gel, a filler using a silica gel whose surface is modified with a non-dissociable hydrophilic group is commercially available.
For example, Shodex PROTEIN KW-803 (product name) is commercially available from Showa Denko KK as a silica gel-based GFC column. This silica gel column is described in the catalog as being a silica gel GFC mode column suitable for the analysis of proteins having a molecular weight of about several thousand to one million.
YMC-Pack Diol (product name) is commercially available from YMC Co., Ltd. This is also a silica gel-based column for GFC, which is obtained by covalently bonding a functional group having a diol structure to a silica gel substrate, and is described as being applicable to separation of several thousand to several hundred thousand proteins.
非特許文献１には、基材上に化学的にグラフトされたホスホリルコリン基により、タンパク質の吸着が減少することが記載されている。
Non-Patent
しかしながら、ホスホリルコリン基を有する重合体により、物体の表面を被覆して改質する方法では、表面全体を効果的に被覆することは難しい。また、被覆した重合体が物体から剥離するため、耐久性に問題が生じる。さらには、物体の表面が重合体により被覆されるため、ホスホリルコリン基による生体適合性等の目的とする機能を付与する目的から逸脱して、物体自体に要求されている基本的性質が失われる場合もある。 However, it is difficult to effectively coat the entire surface by a method of coating and modifying the surface of an object with a polymer having a phosphorylcholine group. Further, since the coated polymer is peeled off from the object, there is a problem in durability. Furthermore, since the surface of the object is coated with a polymer, the basic properties required for the object itself are lost, deviating from the purpose of imparting the intended function such as biocompatibility by the phosphorylcholine group. There is also.
また、ホスホリルコリン基の誘導体を低分子として物体に導入する場合でも、物体にホスホリルコリン基の誘導体と反応させることができる官能基を先に導入し、ついでホスホリルコリン基の誘導体を反応させる方法では、未反応の官能基が物体表面に残るために生体適合性の低下に繋がる。 Even when a phosphorylcholine derivative is introduced into an object as a low molecule, a method in which a functional group capable of reacting with a phosphorylcholine derivative is first introduced into the object and then the phosphorylcholine derivative is reacted is not reacted. Since the functional group remains on the surface of the object, the biocompatibility is lowered.
例えば、まず物体表面にアミノ基を導入し、次にホスホリルコリンのアルデヒド誘導体を物体表面のアミノ基と反応させる場合、多くの未反応のアミノ基が残存してしまう。物質表面にアミノ基が多く残存する場合、アミノ基は強い塩基性を有しているために、主に酸性のタンパク質が著しく強い静電的な相互作用を示し、そのほとんどが吸着してしまう。クロマトグラフィー用充填剤としてとらえた場合は当該タンパク質の回収率の悪化や、ピークの著しいテーリングの原因となる。さらに、タンパク質の吸着はその変性をもたらし、生体適合性素材としてとらえた場合は炎症などの原因となり、好ましくない。 For example, when an amino group is first introduced on the surface of the object and then an aldehyde derivative of phosphorylcholine is reacted with the amino group on the object surface, many unreacted amino groups remain. When many amino groups remain on the surface of the substance, the amino groups have strong basicity, so that acidic proteins mainly exhibit extremely strong electrostatic interactions, and most of them are adsorbed. When taken as a packing material for chromatography, it causes deterioration of the recovery rate of the protein and significant tailing of the peak. Furthermore, protein adsorption brings about its denaturation, and when taken as a biocompatible material, it causes inflammation and the like, which is not preferable.
一方、GFCカラムとは別に、イオン交換カラム、逆相カラムが、独立に既に存在し、タンパク質の分離精製に広く用いられている。 On the other hand, apart from the GFC column, an ion exchange column and a reverse phase column already exist independently and are widely used for separation and purification of proteins.
イオン交換カラムとは、イオン交換性を持つ官能基を修飾鎖に有する充填剤を充填したカラムである。例えば、下記のカラムが市販されている。
（１）−N（CH3）3+を結合させた強陰イオン交換（昭和電工株式会社製 製品名：Shodex IEC QA-825）
（２）−N（C2H5）3+を結合させた弱陰イオン交換（昭和電工株式会社製 製品名：Shodex IEC DEAE-825）
（３）−COO- を結合させた弱陽イオン交換（昭和電工株式会社製 製品名：Shodex IEC CM-825）
（４）−SO3- を結合させた強陽イオン交換（昭和電工株式会社製 製品名：Shodex IEC SP-825）
An ion exchange column is a column packed with a filler having a functional group having ion exchange properties in a modified chain. For example, the following columns are commercially available.
(1) Strong anion exchange combined with -N (CH 3 ) 3+ (Product name: Shodex IEC QA-825, manufactured by Showa Denko KK)
(2) Weak anion exchange with -N (C 2 H 5 ) 3+ (Product name: Shodex IEC DEAE-825, manufactured by Showa Denko KK)
(3) -COO - weak cation exchange was bound to (Showa Denko Co., Ltd. Product name: Shodex IEC CM-825)
(4) Strong cation exchange combined with -SO 3- (Product name: Shodex IEC SP-825, manufactured by Showa Denko KK)
いずれのイオン交換カラムも、いったんタンパク質を吸着させ、塩濃度グラジェントまたはｐＨグラジェントによって吸着したタンパク質を溶離させることによって分離を実現する。また、充填剤基材としては、親水性ポリマー、シリカゲルの両方が製品化されている。 Both ion exchange columns achieve separation by adsorbing proteins once and eluting the adsorbed proteins with a salt concentration gradient or pH gradient. Moreover, as a filler base material, both hydrophilic polymer and silica gel are commercialized.
イオン交換カラムは、（１）イオン交換基に吸着したタンパク質が正常に脱離しない、（２）イオン交換基以外への望ましくない非特異的不可逆吸着、などの原因のために、特に微量タンパク質分析においてはタンパク質回収率の低さが問題となる。シリカゲルに代表される無機マトリックスを基材とする場合には、該マトリックス表面に存在する、望ましくない相互作用を及ぼす基によって（２）の現象が起こる。また、タンパク質の低回収率における原因としては、（１）よりも（２）の現象が支配的であると考えられている。無機マトリックスとしてシリカゲルを挙げる場合、望ましくない相互作用をもたらす基として代表的なものはシラノール基である。 The ion exchange column is particularly suitable for trace protein analysis due to (1) the protein adsorbed to the ion exchange group does not normally desorb, (2) undesirable non-specific irreversible adsorption to other than the ion exchange group. In this case, low protein recovery is a problem. When an inorganic matrix typified by silica gel is used as a base material, the phenomenon (2) occurs due to an undesired group present on the surface of the matrix. Moreover, it is thought that the phenomenon of (2) is more dominant than (1) as a cause in the low recovery rate of protein. When silica gel is used as the inorganic matrix, a typical group that causes an undesirable interaction is a silanol group.
特許文献５には、モノマーをシリカゲル表面に密着させ、そのままモノマーを重合させることでシラノール基を不活性化する方法が記載されている。本文献によれば、イオン交換基を有するか、またはイオン化が可能な官能基を有するモノマーと、非イオン性の極性置換基を有するモノマーを混合してシリカゲル表面に密着させ、その後マトリックス表面上に密着した該モノマー混合体を重合させることで、シリカゲル表面にイオン交換基を有し、かつシラノール基が親水性重合体で覆われ不活性化された充填剤を製造することができるとされている。 Patent Document 5 describes a method of inactivating a silanol group by adhering a monomer to a silica gel surface and polymerizing the monomer as it is. According to this document, a monomer having an ion exchange group or a functional group capable of ionization and a monomer having a nonionic polar substituent are mixed and brought into close contact with the silica gel surface, and then on the matrix surface. By polymerizing the monomer mixture in close contact, it is said that a filler having an ion exchange group on the silica gel surface and having a silanol group covered with a hydrophilic polymer and inactivated can be produced. .
また、特許文献６にはイオン交換体の表面を非イオン性の極性物質で被覆したイオン交換体について記載されている。本文献によれば、イオン交換体の表面を多糖、ポリオール、ポリアミドなどにより被覆することで、タンパク質や細胞の望ましくない非特異的不可逆吸着を抑制することができると説明されている。 Patent Document 6 describes an ion exchanger in which the surface of the ion exchanger is coated with a nonionic polar substance. According to this document, it is explained that undesirable non-specific irreversible adsorption of proteins and cells can be suppressed by coating the surface of an ion exchanger with polysaccharides, polyols, polyamides and the like.
特許文献５および特許文献６に開示されているような高分子体でシリカゲル表面を被覆する方法では、シリカゲル表面に均一な単分子層を形成することが困難である。すなわちモノマーの重合時に不均一な凹凸を形成したり、細孔全体を塞ぐことがあるために、シリカゲルを基材に用いる場合の大きな利点である細孔径の均一さを活用することができない。また、基材表面を被覆しているポリマーと基材表面との間に共有結合が存在しないことから、耐久性の面で問題がある。 In the method of coating a silica gel surface with a polymer as disclosed in Patent Document 5 and Patent Document 6, it is difficult to form a uniform monomolecular layer on the silica gel surface. That is, since uneven irregularities may be formed during polymerization of the monomer or the entire pores may be blocked, the uniformity of pore diameter, which is a great advantage when silica gel is used as a substrate, cannot be utilized. In addition, since there is no covalent bond between the polymer covering the substrate surface and the substrate surface, there is a problem in terms of durability.
一方で、ＧＦＣカラムにイオン交換性を付与する方法も用いられている。ＧＦＣモードは分析対象物質との相互作用が実質的に排除され、分析対象物質の拡散係数の差だけで分離を行うモードである。充填剤表面との相互作用が無い場合、主に分子サイズのみが拡散係数に反映されるため、ＧＦＣカラムを用いることで溶出時間からおおよその分子量を測定することができる。このような、分析対象物質との相互作用が実質的に存在しないＧＦＣカラムにおいては、一般的にタンパク質の回収率が良好であることが知られている。
高い回収率をもたらすＧＦＣ基材に、弱い相互作用をもたらす基をあえて存在させることで良好な分離と高い回収率を両立させるという試みについては、昭和電工株式会社からＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０が市販されている。このカラムはポリマーを基材とし、ポリマーの主鎖であるポリビニルアルコールによって弱い疎水性を、また表面に残存するカルボキシル基によって弱いカチオン交換性を、それぞれ結果的に付与し、ユニークな分離を実現している。ただし、ポリマーを基材としているために溶媒による膨潤・収縮が避けられず、上述カラムについても使用溶媒に制限がある。具体的にはアセトニトリル濃度は５０％が上限とされている。また、残存するイオン交換性の基や、ポリマー主鎖の性質を利用するために、幅広いイオン交換性や疎水性を充填剤に付与することができない。
一方、シリカゲルを基材とする場合には、溶媒の制限は無く、さらに、ＧＦＣ基材において極めて重要な要素である細孔径の均一さについては、重合体を基材とするよりもシリカゲルを基材とする方が優れている。
On the other hand, a method of imparting ion exchange properties to the GFC column is also used. The GFC mode is a mode in which the interaction with the analysis target substance is substantially eliminated and the separation is performed only by the difference in the diffusion coefficient of the analysis target substance. When there is no interaction with the filler surface, only the molecular size is mainly reflected in the diffusion coefficient. Therefore, the approximate molecular weight can be measured from the elution time by using a GFC column. In such a GFC column substantially free of interaction with the analyte, it is generally known that the protein recovery rate is good.
Asahipak GS-320 is commercially available from Showa Denko KK for an attempt to achieve both good separation and high recovery by deliberately presenting a group that causes weak interaction on a GFC substrate that provides high recovery. Yes. This column is based on a polymer, resulting in weak hydrophobicity by polyvinyl alcohol, the main chain of the polymer, and weak cation exchange by the carboxyl groups remaining on the surface, resulting in a unique separation. ing. However, since the polymer is used as a base material, swelling and shrinkage due to the solvent cannot be avoided, and the solvent used is limited for the above-mentioned column. Specifically, the upper limit of acetonitrile concentration is 50%. In addition, since the remaining ion exchange groups and the properties of the polymer main chain are utilized, a wide range of ion exchange properties and hydrophobicity cannot be imparted to the filler.
On the other hand, when silica gel is used as the base material, there is no limitation on the solvent, and the uniformity of pore diameter, which is a very important factor in the GFC base material, is based on silica gel rather than polymer base material. The material is better.
本願発明は、上述の問題点を解決するために、タンパク質・ペプチドの高回収率と、イオン交換相互作用または疎水性相互作用による高分離能を両立し、かつ、充填剤基材の細孔特性を失うことなく耐久性にも優れた無機マトリックスを基材とする充填剤の開発を目的とするもので、タンパク質を変性させることのない、高回収率及び高分離能の新規充填剤を提供するものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention achieves both a high recovery rate of proteins and peptides and a high resolution by ion exchange interaction or hydrophobic interaction, and the pore characteristics of the filler base material. The purpose is to develop a filler based on an inorganic matrix that is excellent in durability without losing quality, and provides a new filler with high recovery rate and high resolution without denaturing proteins. Is.
すなわち、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（２）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（２）
すなわち、式（２）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖上にカルボキシル基を一つ以上有する化合物であれば良い。
That is, the present invention provides a chromatographic packing characterized in that a compound represented by the following formula (1) and a compound represented by the following formula (2) are directly covalently bonded to the substrate surface. An agent is provided.
(1)
That is, Formula (1) may be any phosphorylcholine group-containing compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more phosphorylcholine groups in the modified chain.
(2)
That is, Formula (2) may be a compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more carboxyl groups on the modified chain.
また、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（３）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（３）
すなわち、式（３）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖にスルホン酸基を一つ以上有する化合物であれば良い。
Further, the present invention provides a chromatographic packing, wherein the compound represented by the following formula (1) and the compound represented by the following formula (3) are directly covalently bonded to the substrate surface. An agent is provided.
(1)
That is, Formula (1) may be any phosphorylcholine group-containing compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more phosphorylcholine groups in the modified chain.
(3)
That is, Formula (3) may be a compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more sulfonic acid groups in the modified chain.
さらに、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、下記式（４）で示される化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
（１）
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
（４）
すなわち、炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖上に４級アンモニウム基を一つ以上有する化合物であれば良い。
また、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基である。
Furthermore, the present invention provides the packing for chromatography, wherein the compound represented by the following formula (1) and the compound represented by the following formula (4) are directly covalently bonded to the substrate surface. An agent is provided.
(1)
That is, Formula (1) may be any phosphorylcholine group-containing compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more phosphorylcholine groups in the modified chain.
(4)
That is, it may be a compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more quaternary ammonium groups on the modified chain.
R 2 , R 3 and R 4 are each independently a methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group or t-butyl group.
さらに、本発明は、下記式（１）で示される化合物と、飽和アルキル基または不飽和アルキル基または芳香族化合物とが、基材表面に直接的に共有結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
なお、飽和アルキル鎖および不飽和アルキル鎖とは炭素数１〜３０のものであり、芳香族化合物とは、例えば、フェニルプロピル基やナフチル基といったベンゼン核、またはピロール環、ピリジン環といった複素環である。
（１）
すなわち、式（１）は炭素骨格の炭素原子数が１〜３０であって、その修飾鎖に上記ホスホリルコリン基を一つ以上有するホスホリルコリン基含有化合物であれば良い。
Furthermore, the present invention provides a chromatographic method characterized in that a compound represented by the following formula (1) and a saturated alkyl group, an unsaturated alkyl group or an aromatic compound are directly covalently bonded to the surface of a substrate. The present invention provides a lithographic filler.
The saturated alkyl chain and the unsaturated alkyl chain are those having 1 to 30 carbon atoms, and the aromatic compound is, for example, a benzene nucleus such as a phenylpropyl group or a naphthyl group, or a heterocyclic ring such as a pyrrole ring or a pyridine ring. is there.
(1)
That is, Formula (1) may be any phosphorylcholine group-containing compound having 1 to 30 carbon atoms in the carbon skeleton and having one or more phosphorylcholine groups in the modified chain.
また、本発明は、前記基材が、球状多孔質シリカゲルであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。 The present invention also provides the above-mentioned chromatography filler, wherein the base material is spherical porous silica gel.
さらに、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの平均粒径が１〜２００μｍであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides the above-mentioned chromatographic filler, wherein the spherical porous silica gel has an average particle diameter of 1 to 200 μm.
また、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜１０００オングストロームであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。 The present invention also provides the above-mentioned chromatographic packing material, wherein the spherical porous silica gel has an average pore diameter of 10 to 1000 angstroms.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣモード（有機溶媒を含まず、３００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の塩を含む移動相を用いるモード）で使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少なく、高い分離能力を発揮する。
本来、イオン交換基やアルキル鎖といった生体試料との間に相互作用を及ぼす基はタンパク質の非特異的不可逆吸着をもたらすが、本発明のクロマトグラフィー用充填剤は生体試料との間に相互作用を及ぼす基および生体適合性の高いホスホリルコリン基を分子レベルで混在させることによってこれらの相互作用と高いタンパク質回収率を両立するものである。
When the chromatographic packing material of the present invention is used in the GFC mode (a mode using a mobile phase not containing an organic solvent and containing a salt of about 300 mmol / L), the adsorption of proteins and polypeptides is extremely small and a high separation ability is achieved. Demonstrate.
Inherently, groups that interact with biological samples such as ion exchange groups and alkyl chains cause non-specific irreversible adsorption of proteins. However, the chromatographic packing material of the present invention does not interact with biological samples. These interactions and a high protein recovery rate can be achieved by mixing the effecting group and the highly biocompatible phosphorylcholine group at the molecular level.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、ホスホリルコリン基の有するタンパク質吸着抑制効果に加えてイオン交換性または/および疎水性を有している。したがってそれらの相互作用に応じた分離が可能であり、それら相互作用の強さは移動相の塩濃度やｐＨによって調整することができる上に、充填剤表面における両官能基の混合比率によっても任意に調整することが可能である。 The chromatographic packing material of the present invention has ion exchange property and / or hydrophobicity in addition to the protein adsorption inhibiting effect of the phosphorylcholine group. Therefore, separation according to the interaction is possible, and the strength of the interaction can be adjusted by the salt concentration and pH of the mobile phase, and also by the mixing ratio of both functional groups on the filler surface. It is possible to adjust to.
ＧＦＣモードは移動相溶媒として水だけを用いるために、タンパク質の活性を保ったままの分離・分析方法として極めて重要なモードである。イオン交換基または疎水性基といったタンパク質・ペプチドと相互作用を及ぼす基だけが基材表面に存在する場合、有機溶媒を含まない移動相を用いるＧＦＣモードではタンパク質は非特異的不可逆吸着を起こす。一方、その表面にホスホリルコリン基が存在することによってタンパク質の回収率は格段に向上し、一般のＧＦＣカラムと同等以上のタンパク質回収率を得ることができる。 Since the GFC mode uses only water as a mobile phase solvent, it is an extremely important mode as a separation / analysis method while maintaining protein activity. When only a group that interacts with a protein / peptide, such as an ion exchange group or a hydrophobic group, is present on the substrate surface, the protein causes nonspecific irreversible adsorption in the GFC mode using a mobile phase that does not contain an organic solvent. On the other hand, the presence of phosphorylcholine groups on the surface significantly improves the protein recovery rate, and a protein recovery rate equal to or higher than that of a general GFC column can be obtained.
加えて、本発明の表面修飾方法は基材表面を重合体で覆う方法とは異なり、ホスホリルコリン基および、タンパク質、ペプチドといった生体試料との間に相互作用を及ぼす基を低分子のまま導入するために、基材表面を単分子層レベルの厚みで修飾し、かつ、基材固有の細孔形状を維持することができる。グラジェントによる溶出を行わず、一定の組成の移動相を流し続けるアイソクラティックな条件においては、高理論段数を得るためには基材の細孔径の均一さが重要であり、本発明の方法ではそれを失うことなく、極めて良好なピーク形状を得ることができる。 In addition, the surface modification method of the present invention is different from the method of covering the substrate surface with a polymer, in order to introduce a phosphorylcholine group and a group that interacts with a biological sample such as a protein or peptide as a low molecule. In addition, the surface of the base material can be modified with a monolayer thickness, and the pore shape unique to the base material can be maintained. In isocratic conditions where a mobile phase having a constant composition is kept flowing without performing elution by gradient, uniformity of the pore diameter of the substrate is important in order to obtain a high theoretical plate number. Then, a very good peak shape can be obtained without losing it.
さらには、本発明の表面修飾方法は基材表面を重合体で覆う方法と比べて、基材表面と修飾鎖が共有結合をしているために、耐久性が極めて良好である。 Furthermore, since the surface modification method of the present invention has a covalent bond between the substrate surface and the modified chain, the durability is very good as compared with the method of covering the substrate surface with a polymer.
ＧＦＣモードは有機溶媒を用いず、酸性やイオン強度の強い溶離液を流さなくとも分析対象物質を回収することができる。したがってタンパク質を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能が役立つことが期待される。 The GFC mode does not use an organic solvent, and the analyte can be recovered without flowing an eluent with strong acidity or ionic strength. Therefore, since these can be separated and purified without inactivating the protein, it is expected that the high resolution of the column packing of the present invention is useful also in terms of isolation of unknown biological samples and medical applications.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤において、式（１）のホスホリルコリン基を有する化合物と、式（２）〜（４）のイオン交換性の基を有する化合物および、飽和アルキル基または不飽和アルキル基またはフェニル基・ベンゼン核とが基材表面に直接的に共有結合しているとは、両者が基材表面に化学的な結合状態によって導入されていることを意味し、両者を有する重合体で被覆することにより両者を導入した基材は含まないという意味である。化学的な結合は特に限定されない。 In the packing material for chromatography of the present invention, a compound having a phosphorylcholine group of formula (1), a compound having an ion-exchangeable group of formulas (2) to (4), and a saturated alkyl group or unsaturated alkyl group or That the phenyl group and benzene nucleus are directly covalently bonded to the surface of the substrate means that they are introduced to the surface of the substrate in a chemically bonded state, and are coated with a polymer having both. This means that the base material into which both are introduced is not included. The chemical bond is not particularly limited.
式（１）に示した官能基を導入するためには、下記式（５）または（６）で示されるホスホリルコリン基含有化合物によりシリカゲルにホスホリルコリン基を導入する方法が好ましい。導入に際しては化合物（５）だけでよく、（６）が混在しても良い。以下に下記式（５）または（６）の製造方法について説明する。
（５）
(5)
「式（５）または（６）のホスホリルコリン基含有化合物の製造方法」
下記式（７）に示したホスホリルコリン誘導体を蒸留水に溶解させる。下記式（３）のホスホリルコリン誘導体は公知の化合物であり市販品を入手することができる。
（７）
A phosphorylcholine derivative represented by the following formula (7) is dissolved in distilled water. The phosphorylcholine derivative of the following formula (3) is a known compound, and a commercially available product can be obtained.
(7)
式（７）の化合物の水溶液を氷水浴中で冷却し、過ヨウ素酸ナトリウムを式（７）の化合物に対して２当量添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより下記式（８）に示すアルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を抽出する。構造式及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。なお、式（８）の化合物は、水中において式（９）の化合物と平衡状態であるので、実際のスペクトルは式（８）と（９）の双方を反映したものとなる。
（８）
(8)
次に、式（８）のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを０．５当量添加する。この混合溶液を室温で所定時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウムを２当量添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続ける。沈殿をろ過した後、式（５）及び／又は式（６）のメタノール溶液を得る。 Next, 0.5 equivalent of 3-aminopropyltrimethoxysilane is added to the methanol solution of the formula (8). The mixed solution is stirred at room temperature for a predetermined time, and then ice-cooled, and 2 equivalents of sodium cyanohydroborate are added, and the mixture is returned to room temperature and stirred for 16 hours. During this time, dry nitrogen is continuously supplied to the reaction vessel. After filtering the precipitate, a methanol solution of formula (5) and / or formula (6) is obtained.
上記の手順は、式（５）または（６）に示した化合物中のｍ、ｎが変わっても全く同様に行うことができる。ここで示した手順はｍ＝３、ｎ＝２の場合である。反応溶媒は特に限定されず、上述したメタノール以外にも水や、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（略称：ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（略称：ＤＭＳＯ）などの非プロトン性溶媒を用いることができる。ただし、反応中の重合を防ぐためには脱水溶媒が好ましく、なかでも脱水メタノールが好適である。
また、（５）または（６）中のメトキシ基（ＯＭｅ）がエトキシ基（ＯＥｔ）の場合はメタノールをエタノールに変えて反応を行い、Ｃｌの場合はジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドに変更するだけでよい。
さらには、Ｓｉと結合するＯＭｅまたはＯＥｔまたはＣｌの内、２つまたは１つがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基のいずれかで置換されている場合も上記の手法と全く同様に製造することができる。
The above procedure can be carried out in the same manner even if m and n in the compound represented by formula (5) or (6) are changed. The procedure shown here is for m = 3 and n = 2. The reaction solvent is not particularly limited. In addition to the above-described methanol, aprotic such as water, alcohols such as ethanol, propanol, and butanol, N, N-dimethylformamide (abbreviation: DMF), dimethyl sulfoxide (abbreviation: DMSO), and the like. A solvent can be used. However, in order to prevent polymerization during the reaction, a dehydrated solvent is preferable, and dehydrated methanol is particularly preferable.
Further, when the methoxy group (OMe) in (5) or (6) is an ethoxy group (OEt), the reaction is carried out by changing methanol to ethanol, and in the case of Cl, it is only necessary to change to dimethylformamide or dimethyl sulfoxide. .
Further, the above method is also applicable when two or one of OMe, OEt, or Cl bonded to Si is substituted with any of a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, and an isobutyl group. Can be produced in exactly the same way.
「ホスホリルコリン基とカルボキシル基が基材表面に直接的に共有結合した充填剤の製造」
式（５）及び／又は（６）の化合物のメタノール溶液と、タンパク質やペプチドなどに対して相互作用を及ぼす基を有するシランカップリング剤を混合してシリカゲルに導入することで、極めて簡便に目的の機能を有する充填剤を製造することができる。
具体的には、基材表面に存在する水酸基と、式（５）および（６）の化合物や市販のシランカップリング剤のメトキシ基、エトキシ基との脱水反応によってホスホリルコリン基および相互作用を有する基を同時に基材表面に導入する。ここで、相互作用を有する基とはイオン交換性を有するか、イオン化が可能な官能基、または疎水性相互作用を有する飽和アルキル基、不飽和アルキル基、フェニル基などを示す。
“Production of fillers in which phosphorylcholine groups and carboxyl groups are directly covalently bonded to the substrate surface”
By mixing a methanol solution of the compound of formula (5) and / or (6) with a silane coupling agent having a group that interacts with proteins, peptides, etc., and introducing it into silica gel, the purpose is extremely simple. A filler having the following functions can be produced.
Specifically, a phosphorylcholine group and a group having an interaction by a dehydration reaction between a hydroxyl group present on the substrate surface and the compounds of formulas (5) and (6) or a methoxy group or an ethoxy group of a commercially available silane coupling agent. Are simultaneously introduced into the substrate surface. Here, the group having an interaction refers to a functional group having ion exchangeability or ionization, or a saturated alkyl group, an unsaturated alkyl group, a phenyl group or the like having a hydrophobic interaction.
トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸（アヅマックス株式会社）０．７３ｇ をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬ（和光純薬工業）に溶解させ、４ｍＬの蒸留水と４−ジメチルアミノピリジン０．３５ｇを添加し、１６時間室温で撹拌し、下記式（９）に示したカルボキシル基を有するシランカップリング剤を得る。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンによる加水分解反応であり、公知の反応である。
（１０）
(10)
式（５）および（６）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１０）に示す化合物を含む溶液を添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１００ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０％水溶液５０ｍＬと、メタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とする粉体を得る。反応溶媒は水-メタノール混合溶液以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、さらにはこれらを単一、または組み合わせて用いることができる。 A solution containing the compound represented by the formula (10) is added to a methanol solution containing 4.8 mmol of the compounds of the formulas (5) and (6). Further, 20 mL of distilled water, 4.0 g of spherical high-purity silica gel (manufactured by Dokai Kagaku) with an average particle size of 5 μm, an average pore size of 300 Å, and a specific surface area of 100 m 2 / g are added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours in an oil bath. . Then, it is filtered and washed with 50 mL of a 50% aqueous solution of N, N-dimethylformamide and 50 mL of methanol, and dried under reduced pressure at 80 ° C. for 3 hours to obtain the desired powder. As the reaction solvent, in addition to the water-methanol mixed solution, protic solvents such as water, ethanol, 2-propanol, and aprotic solvents such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, toluene, diethyl ether can be used. They can be used singly or in combination.
なお、基材表面に水酸基が存在しない場合は、式（５）および（６）の化合物を揮発性溶媒に溶解させ、その溶液を物質表面に塗布後、溶媒を乾燥させる方法が有効である。具体的には、式（５）および（６）の化合物のメタノール溶液（０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ）を物質の比表面積応じて適量を直接物質に塗布する。次に自然乾燥、加熱乾燥等によりメタノールを気化させる。このとき、式（５）および（６）の化合物のＳｉ−ＯＭｅどうしが脱水反応を起こし、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成し、物質表面を覆うことが可能である。この脱水反応は公知である。メタノールの揮発の際にこのように生成する膜は、ほとんどの物質表面に微量に存在する水酸基とも所々で結合を生じるために比較的強靱に表面改質を行うことができる。本法は水酸基を持たない物質のみならず、水酸基を有する物質についても極めて有効な表面改質法である。 When there is no hydroxyl group on the substrate surface, it is effective to dissolve the compounds of formulas (5) and (6) in a volatile solvent, apply the solution to the material surface, and then dry the solvent. Specifically, an appropriate amount of a methanol solution (0.3 mmol / mL) of the compounds of formulas (5) and (6) is directly applied to the substance according to the specific surface area of the substance. Next, methanol is vaporized by natural drying, heat drying or the like. At this time, Si—OMe of the compounds of the formulas (5) and (6) cause a dehydration reaction to generate a Si—O—Si bond, thereby covering the surface of the substance. This dehydration reaction is known. The film formed in this way during the volatilization of methanol can be subjected to surface modification relatively strongly because it forms bonds with hydroxyl groups present in a trace amount on most material surfaces. This method is an extremely effective surface modification method not only for a substance having no hydroxyl group but also for a substance having a hydroxyl group.
すでに開示された技術である、モノマーをシリカゲル表面に密着させ、そのままモノマーを重合させることでシラノール基を不活性化する方法や、イオン交換体の表面を非イオン性の極性物質で被覆したイオン交換体を得る方法では、シリカゲル表面に均一な単分子層を形成させることが困難であり、シリカゲルを基材に用いる場合の利点である細孔径の均一さを活用することができない。すなわちモノマーの重合時に不均一な凹凸を形成することから、実効細孔径にばらつきが生じたり、細孔自体がポリマーで埋め尽くされたりする場合がある。また、基材表面を被覆しているポリマーと基材表面との間に共有結合が存在しないことから、耐久性の面で問題がある。 Already disclosed techniques, such as a method of inactivating silanol groups by adhering a monomer to the silica gel surface and polymerizing the monomer as it is, or ion exchange with the surface of the ion exchanger coated with a nonionic polar substance In the method of obtaining a body, it is difficult to form a uniform monomolecular layer on the surface of silica gel, and it is impossible to utilize the uniformity of pore diameter, which is an advantage when silica gel is used as a substrate. That is, since uneven irregularities are formed during polymerization of the monomer, the effective pore diameter may vary, or the pores themselves may be filled with the polymer. In addition, since there is no covalent bond between the polymer covering the substrate surface and the substrate surface, there is a problem in terms of durability.
一方、本発明の方法ではシランカップリング剤による表面処理であるために基材表面に単分子層とほぼ同等の厚さで表面修飾を行うことができる。さらに、シランカップリング剤と基材表面に強固な共有結合を形成するために耐久性も極めて良好である。基材がシリカゲルである場合には強固なＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成する。式（５）および（６）の化合物を用いることで、これまでは困難であったタンパク質の吸着を抑制する効果に優れたホスホリルコリン基の単分子レベルでの導入と、相互作用をもたらす一般的なシランカップリング剤との混在が容易になった。さらには式（５）および（６）の化合物と相互作用をもたらす基の混合比についても自由に設定することができる。
本発明における式（５）および（６）の化合物と、生体試料に相互作用を及ぼす基との混合比率は、（５）および（６）の化合物のモル比にして５％〜９５％である。
On the other hand, in the method of the present invention, since the surface treatment is performed with a silane coupling agent, the surface modification can be performed on the surface of the base material with a thickness almost equal to that of the monomolecular layer. Furthermore, the durability is extremely good because a strong covalent bond is formed between the silane coupling agent and the substrate surface. When the substrate is silica gel, a strong Si—O—Si bond is formed. By using the compounds of the formulas (5) and (6), it is possible to introduce a phosphorylcholine group excellent in the effect of suppressing protein adsorption, which has been difficult until now, at a single molecule level, and to provide a general interaction Mixing with silane coupling agent became easy. Furthermore, the mixing ratio of groups that can interact with the compounds of the formulas (5) and (6) can also be set freely.
The mixing ratio of the compounds of the formulas (5) and (6) in the present invention to the group that interacts with the biological sample is 5% to 95% as the molar ratio of the compounds of (5) and (6). .
カルボキシル基をホスホリルコリン基と混在させた粉体は式（１０）に示した化合物を用いる他に、以下の示すような方法によっても可能である。具体例（Ａ〜Ｄ）を以下に示す。
Ａ：３−シアノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、シアノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に得られた粉体を５％塩酸水溶液（和光純薬工業株式会社）に分散させ、５時間、８０℃で撹拌し、シアノ基をカルボキシル基に変換することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。なお、シアノ基の塩酸水溶液によるカルボキシル基への変換は公知の反応である。
Ｂ：３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に得られた粉体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社）に分散し、カルボキシル基を保護基で保護したアミノ酸と、カルボニルジイミダゾール（和光純薬工業株式会社）、トリエチルアミン（和光純薬工業株式会社）各１等量を添加、室温で２時間攪拌することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。なお、アミノ基同士のカルボニルジイミダゾールによる尿素結合形成反応は公知の反応である。
Ｃ：３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。次に、得られた粉体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社）に分散し、無水コハク酸（和光純薬工業株式会社）または無水マレイン酸（和光純薬工業株式会社）を一当量と、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（和光純薬工業株式会社）１．２当量、ＷＳＣ・ＨＣｌ（１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（和光純薬工業株式会社）１．２当量を０℃下で添加することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。
Ｄ：Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキサイドウレタン（アヅマックス株式会社）を、式（５）および（６）の化合物を含むメタノール溶液と所定の割合で混合し、シリカゲルを加えて８０℃で５時間還流する。次いでメタノールにてろ過洗浄し、ヒドロキシル基とホスホリルコリン基の混在した粉体を得る。得られた粉体を１％水酸化ナトリウム水溶液に分散させ、２−ブロモ酢酸を１．２当量添加し、８０℃で５時間還流することでホスホリルコリン基とカルボキシル基が混在した粉体を得ることができる。
The powder in which the carboxyl group is mixed with the phosphorylcholine group can be obtained by the following method in addition to using the compound represented by the formula (10). Specific examples (A to D) are shown below.
A: 3-Cyanopropyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) is mixed with a methanol solution containing the compounds of formulas (5) and (6) at a predetermined ratio, and silica gel is added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours. Next, it is filtered and washed with methanol to obtain a powder in which cyanopropyl groups and phosphorylcholine groups are mixed. Next, the obtained powder is dispersed in a 5% hydrochloric acid aqueous solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), stirred for 5 hours at 80 ° C., and converted from a cyano group to a carboxyl group, thereby mixing phosphorylcholine groups and carboxyl groups. Powder can be obtained. The conversion of a cyano group into a carboxyl group with a hydrochloric acid aqueous solution is a known reaction.
B: 3-aminopropyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) is mixed with a methanol solution containing the compounds of formulas (5) and (6) at a predetermined ratio, and silica gel is added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours. Next, it is filtered and washed with methanol to obtain a powder in which aminopropyl groups and phosphorylcholine groups are mixed. Next, the obtained powder was dispersed in N, N-dimethylformamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), an amino acid having a carboxyl group protected with a protective group, carbonyldiimidazole (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), triethylamine. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Each 1 equivalent amount is added and stirred at room temperature for 2 hours to obtain a powder in which phosphorylcholine groups and carboxyl groups are mixed. In addition, the urea bond formation reaction by carbonyldiimidazole of amino groups is a well-known reaction.
C: 3-aminopropyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) is mixed with a methanol solution containing the compounds of formulas (5) and (6) at a predetermined ratio, and silica gel is added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours. Next, it is filtered and washed with methanol to obtain a powder in which aminopropyl groups and phosphorylcholine groups are mixed. Next, the obtained powder is dispersed in N, N-dimethylformamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and succinic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or maleic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 1 equivalent, HOBt (N-hydroxybenzotriazole) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.2 equivalent, WSC · HCl (1-ethyl-3- (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (Wako Pure Chemical) Kogyo Co., Ltd.) By adding 1.2 equivalents at 0 ° C., a powder in which phosphorylcholine groups and carboxyl groups are mixed can be obtained.
D: N- (trimethoxysilylpropyl) -O-polyethylene oxide urethane (Amax Co., Ltd.) was mixed with a methanol solution containing the compounds of formulas (5) and (6) at a predetermined ratio, and silica gel was added to add 80. Reflux at 5 ° C. for 5 hours. Next, it is filtered and washed with methanol to obtain a powder in which hydroxyl groups and phosphorylcholine groups are mixed. Disperse the resulting powder in a 1% aqueous sodium hydroxide solution, add 1.2 equivalents of 2-bromoacetic acid, and reflux at 80 ° C. for 5 hours to obtain a powder in which phosphorylcholine groups and carboxyl groups are mixed. Can do.
本発明で使用する基材には、シリカ、シリカゲル、活性炭、ゼオライト、アルミナ、粘土鉱物等の無機多孔質体、多孔質の有機高分子樹脂がある。基材は粉体が好ましい。好ましくは球型または破砕型多孔質シリカゲルである。球状多孔質シリカゲルの平均粒径は１〜２００μｍ、好ましくは１〜１０μｍ、球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜５００オングストローム、好ましくは８０〜３００オングストロームで、比表面積は５０〜８００ｍ2／ｇ、好ましくは１００〜６００ｍ2／ｇである。 The base material used in the present invention includes inorganic porous bodies such as silica, silica gel, activated carbon, zeolite, alumina, clay mineral, and porous organic polymer resins. The substrate is preferably a powder. Spherical or crushed porous silica gel is preferred. The average particle diameter of the spherical porous silica gel is 1 to 200 μm, preferably 1 to 10 μm, the average diameter of the pores of the spherical porous silica gel is 10 to 500 Å, preferably 80 to 300 Å, and the specific surface area is 50 to 800 m 2. / G, preferably 100 to 600 m 2 / g.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣ用カラムとして使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少なく、かつ、イオン交換相互作用又は／および疎水性相互作用による高い分離能力を発揮する。相互作用を及ぼす基の配合について製造上の制約がないことから、アニオン交換性、カチオン交換性、疎水性、π電子相互作用など、様々な特性を任意の割合で導入することが可能である。 When the chromatographic packing material of the present invention is used as a column for GFC, the adsorption of proteins and polypeptides is extremely small, and a high separation ability by ion exchange interaction and / or hydrophobic interaction is exhibited. Since there is no production restriction on the blending of groups that exert an interaction, various characteristics such as anion exchangeability, cation exchangeability, hydrophobicity, and π-electron interaction can be introduced at an arbitrary ratio.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、試料の持つ微弱な電荷や疎水性の違いに基づいた、より高い分離能力を有するカラム充填剤である。このように、ホスホリルコリン基が相互作用を及ぼす基と分子レベルで混在した充填剤はこれまでに例が無く、全く新しいタイプのマルチモードカラム充填剤であると言える。移動相のｐＨや塩濃度を変化させることによって充填剤表面とタンパク質およびポリペプチドとの相互作用の強さを任意に制御することも可能であり、さらには幅広い条件においてＧＦＣカラムと同等以上のタンパク質回収率を有する。移動相のｐＨや塩濃度を最適化することで目的とするタンパク質やポリペプチドを自在に保持させることができる。本発明のクロマトグラフィー用充填剤で用いることのできるＧＦＣモードはタンパク質や酵素を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能および高回収率が役立つことが期待される。 The chromatographic packing material of the present invention is a column packing material having a higher separation ability based on the weak charge and hydrophobicity of the sample. Thus, a packing material in which a phosphorylcholine group interacts with a molecular level at a molecular level has never been seen before, and can be said to be a completely new type of multi-mode column packing material. By changing the pH and salt concentration of the mobile phase, it is possible to arbitrarily control the strength of the interaction between the filler surface and the protein and polypeptide. Furthermore, in a wide range of conditions, the protein is equivalent to or better than the GFC column. It has a recovery rate. The target protein or polypeptide can be freely retained by optimizing the pH and salt concentration of the mobile phase. Since the GFC mode that can be used in the packing material for chromatography of the present invention can separate and purify proteins and enzymes without inactivating them, the column packing of the present invention can also be used for isolation of unknown biological samples and medical applications. It is expected that high resolution and high recovery of the agent will be useful.
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には、タンパク質およびポリペプチドの吸着が極めて少ない高分離能カラム充填剤として、例えばヒト血清中のタンパク質の分離、または、タンパク質をトリプシン消化して得られた試料に含まれるポリペプチドの分離、または生体中に含まれる未知タンパク質の活性評価に基づいた分離・分取に優れている。
また、タンパク質、ペプチドのみならず、アミノ酸や生体ホルモンなど親水性の強い低分子化合物の分離にも適用することができる。ホスホリルコリン基の極めて強い親水性により、有機溶媒を含む移動相条件において、これらの分析対象物質と親水性相互作用による分離を達成することができる。この際、表面に存在するホスホリルコリン基以外の相互作用を及ぼす基によるイオン交換性や疎水性およびπ電子相互作用によって、より優れた分離を達成することができる。
The chromatographic packing material of the present invention is specifically obtained as a high-resolution column packing material with very little protein and polypeptide adsorption, for example, separation of proteins in human serum or trypsin digestion of proteins. It is excellent for separation of polypeptides contained in the obtained sample or separation / sorting based on activity evaluation of unknown proteins contained in the living body.
Moreover, it can be applied not only to separation of proteins and peptides but also low molecular weight compounds having strong hydrophilicity such as amino acids and biological hormones. Due to the extremely strong hydrophilicity of the phosphorylcholine group, separation by hydrophilic interaction with these analytes can be achieved under mobile phase conditions including an organic solvent. At this time, more excellent separation can be achieved by ion exchange properties, hydrophobicity, and π-electron interaction due to groups other than phosphorylcholine groups existing on the surface.
次に本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
Next, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
「合成例１ ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド化合物」
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出した。下記化合物（８）に構造を示す。式（８）の化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。なお、式（８）の化合物は、水中において式（９）の化合物と平衡状態であるので、実際のスペクトルは式（８）と（９）の双方を反映したものとなる。
（８）
L-α-glycerophosphorylcholine (450 mg) was dissolved in 15 ml of distilled water and cooled in an ice-water bath. Sodium periodate (750 mg) was added and stirred for 5 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure and dried under reduced pressure, and the target product was extracted with methanol. The following compound (8) has a structure. A 1H-NMR spectrum of the compound of formula (8) is shown in FIG. Since the compound of formula (8) is in equilibrium with the compound of formula (9) in water, the actual spectrum reflects both formulas (8) and (9).
(8)
「合成例２：式（５）および（６）の化合物の製造」
合成例１の化合物７．５ｇを脱水したメタノール３０ｍＬに溶解させ、容器内を乾燥窒素で置換する。次に、化合物１のメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシランを３．６ｇ添加した。この混合溶液を、室温で５時間撹拌したのち、氷冷し、シアノヒドロホウ素化ナトリウム２．５ｇを添加し、室温に戻して１６時間撹拌した。この間も反応容器には乾燥窒素を流し続けた。沈殿をろ過した後、目的物質である下記式（１１）および（１２）の化合物のメタノール溶液を得た。
（１１）
7.5 g of the compound of Synthesis Example 1 is dissolved in 30 mL of dehydrated methanol, and the inside of the container is replaced with dry nitrogen. Next, 3.6 g of 3-aminopropyltrimethoxysilane was added to the methanol solution of
(11)
「合成例３：式（９）の化合物の製造」
式（２）の化合物としてトリエトキシシリルプロピル無水コハク酸（アヅマックス株式会社）０．７３ｇ をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬ（和光純薬工業）に溶解させ、４ｍＬの蒸留水と４−ジメチルアミノピリジン０．３５ｇを添加し、１６時間室温で撹拌し、下記式（９）に示したカルボキシル基を有するシランカップリング剤を得た。本反応は無水コハク酸の４−ジメチルアミノピリジンを触媒とする加水分解反応であり、公知の反応である。
（１０）
As a compound of the formula (2), 0.73 g of triethoxysilylpropyl succinic anhydride (Amax Co., Ltd.) is dissolved in 10 mL of N, N-dimethylformamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 4 mL of distilled water and 4-dimethylaminopyridine are dissolved. 0.35 g was added and stirred at room temperature for 16 hours to obtain a silane coupling agent having a carboxyl group represented by the following formula (9). This reaction is a hydrolysis reaction using 4-dimethylaminopyridine, which is succinic anhydride, as a catalyst, and is a known reaction.
(10)
「実施例１：クロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に上述の式（１０）に示す化合物を含む溶液を添加した。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０％水溶液５０ｍＬと、メタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、目的とするクロマトグラフィー用充填剤を得た。反応溶媒は水-メタノール混合溶媒以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒や、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、トルエン、ジエチルエーテル等の非プロトン性溶媒を使用でき、さらにはこれらを単一、または組み合わせて用いることができる。
"Example 1: Production of packing material for chromatography"
A solution containing the compound represented by the formula (10) was added to a methanol solution containing 4.8 mmol of the compounds of the formulas (11) and (12). Further, 20 mL of distilled water, 4.0 g of spherical high-purity silica gel (manufactured by Dokai Kagaku) having an average particle size of 5 μm, an average pore size of 300 Å, and a specific surface area of 140 m 2 / g are added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours in an oil bath. . Then, it was filtered and washed with 50 mL of a 50% aqueous solution of N, N-dimethylformamide and 50 mL of methanol, and dried under reduced pressure at 80 ° C. for 3 hours to obtain the intended packing material for chromatography. As the reaction solvent, in addition to the water-methanol mixed solvent, protic solvents such as water, ethanol, 2-propanol, and aprotic solvents such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, toluene, diethyl ether can be used. They can be used singly or in combination.
「リンの定量によるＰＣ基導入の証明」
実施例１で製造したホスホリルコリン基およびカルボキシル基を表面に有する改質粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤のリン元素の定量を行った。本発明の製造方法においてリン元素はホスホリルコリン基固有の元素であり、粉体表面に存在するリン元素を定量することで実際に導入されたホスホリルコリン基を定量することができる。
リン元素の定量はモリブデン酸発色法によって行った。以下に定量方法を説明する。
１） 所定量の粉体を十分洗浄した試験管に計りとる。
２） １の粉体に６０％過塩素酸水溶液を３ｍＬ添加する。
３） 液の気散を避けるため、２の試験管上部に冷却管を取り付け、１２０℃で１時間、次いで１８０℃で２時間加熱する。本操作にて粉体表面の修飾鎖をすべて酸化させ、特にリン元素についてはリン酸として遊離させる。
４） ３の溶液を遠心分離機にかけ（３０００ｒｐｍ，５分）、上清を１ｍＬサンプルチューブに移す。
５） ４の溶液に蒸留水１ｍＬと０．５Ｍのモリブデン酸ナトリウムを５００μＬ、および０．５Ｍのアスコルビン酸を５００μＬ添加する。
６） ５の溶液を９５℃の湯浴にて５分間熱し、その後冷水で冷却する。
７） ６の発色済み溶液を９６穴プレートに２００μＬ滴下し、プレートリーダにて７１０ｎｍにおける発色強度を測定する。
８） あらかじめ既知の濃度のリン酸溶液の発色強度から得た検量線を元に、サンプルに含まれるリン元素の量を定量する。
本定量で用いた検量線を図２に示す。
また、実施例１で製造したホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に有する改質粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤におけるリン定量の結果を「表１」に示す。
The phosphorus element of the packing material for chromatography made of the modified powder having phosphorylcholine groups and carboxyl groups on the surface produced in Example 1 was quantified. In the production method of the present invention, the phosphorus element is an element inherent to the phosphorylcholine group, and the phosphorylcholine group actually introduced can be quantified by quantifying the phosphorus element present on the powder surface.
Phosphorus element was quantified by molybdic acid coloring method. The quantitative method will be described below.
1) Weigh a predetermined amount of powder into a thoroughly cleaned test tube.
2) Add 3 mL of 60% aqueous perchloric acid to 1 powder.
3) To avoid liquid dispersion, attach a cooling tube to the top of the two test tubes and heat at 120 ° C. for 1 hour and then at 180 ° C. for 2 hours. In this operation, all the modified chains on the powder surface are oxidized, and in particular phosphorus element is liberated as phosphoric acid.
4) Centrifuge the solution of 3 (3000 rpm, 5 minutes) and transfer the supernatant to a 1 mL sample tube.
5) Add 1 mL of distilled water, 500 μL of 0.5 M sodium molybdate, and 500 μL of 0.5 M ascorbic acid to the solution of 4.
6) Heat the solution of 5 in a 95 ° C. water bath for 5 minutes and then cool with cold water.
7) 200 μL of 6 colored solution is dropped onto a 96-well plate, and the color intensity at 710 nm is measured with a plate reader.
8) The amount of phosphorus element contained in the sample is quantified based on a calibration curve obtained in advance from the color intensity of a phosphoric acid solution having a known concentration.
The calibration curve used in this determination is shown in FIG.
In addition, Table 1 shows the results of phosphorus determination in the chromatographic filler comprising the modified powder having phosphorylcholine groups and carboxyl groups on the surface produced in Example 1.
「ＦＴ−ＩＲスペクトルによるカルボキシル基導入の証明」
次に、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。図３によれば１７２５ｃｍ-1付近と１５６０ｃｍ-1付近にカルボキシル基の特性吸収が確認され、カルボキシル基が導入されたことが分かる。
以上、リン元素の定量およびＦＴ−ＩＲスペクトルにおけるカルボキシル基の特性吸収の存在から、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤はホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に直接的に共有結合していることがわかる。
“Proof of introduction of carboxyl group by FT-IR spectrum”
Next, FIG. 3 shows an FT-IR spectrum of the chromatography filler of Example 1. According to FIG. 3 characteristic absorption of carboxyl group near 1725 cm -1 and near 1560 cm -1 was confirmed, it can be seen that a carboxyl group is introduced.
As described above, the quantitative determination of phosphorus element and the presence of the characteristic absorption of the carboxyl group in the FT-IR spectrum indicate that the chromatography filler of Example 1 has covalently bonded the phosphorylcholine group and the carboxyl group directly to the surface. .
「実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のカラム充填及び分離」
実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス製エンプティカラムに充填した。
クロマトグラムの取得条件は次の通りである。
移動相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸バッファー ＋ＮａＣｌ（所定濃度） ｐＨ６．９
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ ２８０ｎｍ
“Column packing and separation of the chromatographic packing material of Example 1”
The chromatographic packing material of Example 1 was packed into a stainless steel empty column having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 250 mm by an ordinary slurry method.
Chromatogram acquisition conditions are as follows.
Mobile phase: 50 mmol / L phosphate buffer + NaCl (predetermined concentration) pH 6.9
Flow rate: 200 μL / min
Temperature: 25 ° C
Detection: UV 280nm
「表２」に示した１２種類のタンパク質・ペプチドをそれぞれ、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムに注入し、それらの溶出時間およびピーク面積から詳細な評価を行った。「表２」に、検討に用いたタンパク質・ペプチドと、それらの等電点（ｐI）、分子量、試料濃度を示す。
実施例１のカラムを、移動相のＮａＣｌ濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌで用いた場合の分子量と溶出時間の関係を図４に示した。図４によれば本条件においては分子量の大きい物質ほど早く溶出することが分かる。移動相塩濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌにおいてはタンパク質と充填剤表面との間に働く相互作用が極めて少ないために、結果として分子量順の溶出が起こるＧＦＣモードでの分離が行われたことが分かる。
FIG. 4 shows the relationship between the molecular weight and elution time when the column of Example 1 was used at a mobile phase NaCl concentration of 500 mmol / l. According to FIG. 4, it can be seen that a substance having a higher molecular weight elutes earlier under this condition. It can be seen that when the mobile phase salt concentration is 500 mmol / l, there is very little interaction between the protein and the filler surface, and as a result, separation in the GFC mode in which elution in the order of molecular weight occurs.
次に移動相のＮａＣｌ濃度を２５０ｍｍｏｌ／ｌに低下させた条件下における分子量と溶出時間の関係を図５に示した。移動相のＮａＣｌ濃度を５００ｍｍｏｌ／ｌの場合である図４に比較して、一部のタンパク質の溶出時間が増加したことが分かる。移動相の塩濃度の低下によって具体的にどのようなタンパク質に保持が生じたかをイオン交換性の観点から明確にするために、溶出時間の増加率とタンパク質の等電点の関係を図６に示した。図６から明白なように、ホスホリルコリン基とカルボキシル基を表面に有する本発明のカラムは、等電点の高い塩基性タンパク質を保持する能力があることが分かる。この保持能力は塩濃度を低下させることで発現した。一般的にイオン交換相互作用は移動相の塩濃度が低いほど強くなることが知られている。よって、本発明のカラムによる塩基性タンパク質に対する特有の保持挙動はイオン交換性の相互作用に起因するものであり、具体的には充填剤表面に存在するカルボキシル基によるカチオン交換能が発揮された結果である。 Next, FIG. 5 shows the relationship between the molecular weight and elution time under the condition that the NaCl concentration of the mobile phase is lowered to 250 mmol / l. Compared to FIG. 4 where the NaCl concentration of the mobile phase is 500 mmol / l, it can be seen that the elution time of some proteins has increased. FIG. 6 shows the relationship between the rate of increase of elution time and the isoelectric point of the protein in order to clarify from the viewpoint of ion exchange properties what kind of protein is specifically retained due to the decrease in the salt concentration of the mobile phase. Indicated. As is clear from FIG. 6, it can be seen that the column of the present invention having phosphorylcholine groups and carboxyl groups on its surface has the ability to retain basic proteins with high isoelectric points. This retention ability was expressed by reducing the salt concentration. In general, it is known that the ion exchange interaction becomes stronger as the salt concentration of the mobile phase is lower. Therefore, the specific retention behavior for the basic protein by the column of the present invention is due to the ion exchange interaction, and specifically, the result of the ability to exchange cation by the carboxyl group present on the surface of the filler. It is.
次に、式（１１）および（１２）だけを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤との比較について述べる。本比較は、ホスホリルコリン基だけを導入した場合に対する、本発明の優位性を明確にするためのものである。
まず、式（１１）および（１２）だけを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤の製造と充填について説明する。
「比較例１：式（１１）および（１２）のみを導入した粉体からなるクロマトグラフィー用充填剤の製造及びカラム充填」
合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物を含むメタノール溶液に蒸留水３５ｍＬを加え、さらに平均粒子径５μｍ、平均細孔径３０ｎｍで比表面積が１４０ｍ2／ｇのシリカゲルを１４ｇ添加した。この粉体分散溶液を８０℃で５ｈ還流させ、カップリングさせた。還流の後メタノール１００ｍＬでろ過洗浄し、目的物質を得た。以上の手順で、実施例１の表面改質剤で処理した改質粉体の元素分析値を「表３」に示す。表中のＣ％またはＮ％とは、粉体に含まれる炭素元素または窒素元素の質量％を示している。この値から、表面処理後の炭素と窒素の原子数比（Ｃ／Ｎ）は５．０８となる。式（１１）および（１２）の表面改質剤がカップリングした後のＣ／Ｎは５であるから、表面改質剤が破壊されることなく粉体に導入されたことを示している。製造した改質粉体を、クロマトグラフィー用充填剤として、通常のスラリー法により、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのエンプティカラムに充填した。
First, the production and packing of a chromatographic filler composed of a powder into which only formulas (11) and (12) are introduced will be described.
“Comparative Example 1: Production of a packing material for chromatography consisting of powder into which only formulas (11) and (12) are introduced and column packing”
Distilled water (35 mL) is added to the methanol solution containing the compounds of formulas (11) and (12) produced in Synthesis Example 2, and 14 g of silica gel having an average particle size of 5 μm, an average pore size of 30 nm and a specific surface area of 140 m 2 / g is added. did. This powder dispersion was refluxed at 80 ° C. for 5 hours to be coupled. After refluxing, the product was filtered and washed with 100 mL of methanol to obtain the target substance. The elemental analysis values of the modified powder treated with the surface modifier of Example 1 in the above procedure are shown in “Table 3”. C% or N% in the table indicates mass% of carbon element or nitrogen element contained in the powder. From this value, the atomic ratio (C / N) of carbon and nitrogen after the surface treatment is 5.08. C / N after the coupling of the surface modifiers of the formulas (11) and (12) is 5, indicating that the surface modifier was introduced into the powder without being destroyed. The produced modified powder was packed into an empty column having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 250 mm by an ordinary slurry method as a chromatography filler.
「比較試験１：相互作用を及ぼす基を混在させることで得られる効果」
実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムと、比較例１で製造した式（１１）および（１２）のみを導入した粉体を充填したカラムとを、実施例１で評価に用いた１２種類のタンパク質により評価、比較を行った。
比較例１で製造した式（１１）および（１２）のみを導入した粉体を充填したカラムにおいて移動相ＮａＣｌ濃度を５００ｍｍｏｌ／ｌから２５０ｍｍｏｌ／ｌに低下させた場合の各タンパク質の溶出時間増加率を図７に示した。実施例１で製造したクロマトグラフィー用充填剤のカラムとは図６と図７によって比較することができる。具体的には、（１）比較例１で製造した粉体を充填したカラムでは等電点の低い酸性タンパク質が保持され（図７）、（２）実施例１のクロマトグラフィー用充填剤のカラムにおいては、等電点の高い塩基性タンパク質が保持された（図６）。（１）はホスホリルコリン基および修飾鎖に含まれる２級アミンに起因するアニオン交換相互作用による保持であり、（２）については「相互作用を及ぼす基」としてホスホリルコリン基と混在させて導入したカルボキシル基によるカチオン交換相互作用である。
"Comparative test 1: Effect obtained by mixing groups that interact with each other"
The column packed with the chromatographic packing material of Example 1 and the column packed with the powder introduced only with the formulas (11) and (12) manufactured in Comparative Example 1 were used for evaluation in Example 1. Evaluation and comparison were performed using 12 kinds of proteins.
Increase rate of elution time of each protein when the mobile phase NaCl concentration is reduced from 500 mmol / l to 250 mmol / l in the column packed with the powder introduced only with the formulas (11) and (12) produced in Comparative Example 1 Is shown in FIG. The column of the packing material for chromatography manufactured in Example 1 can be compared with FIG. 6 and FIG. Specifically, (1) the column packed with the powder produced in Comparative Example 1 retains acidic protein having a low isoelectric point (FIG. 7), and (2) the column for the packing material for chromatography in Example 1 In FIG. 6, a basic protein having a high isoelectric point was retained (FIG. 6). (1) is retention by phosphorylcholine group and anion exchange interaction caused by secondary amine contained in the modified chain, and (2) is a carboxyl group introduced in a mixed manner with phosphorylcholine group as “group having interaction” Is a cation exchange interaction.
さらに両者の違いを明確にするために、ヒト血清アルブミンとリゾチームを各塩濃度にて注入したときのクロマトグラムを図８に示す。図８から明らかなように、比較例１で製造した粉体はホスホリルコリン基およびスペーサーに存在する２級アミンの影響からアニオン交換能を有し、負の電荷を帯びたヒト血清アルブミンを低塩濃度において保持する傾向があり、一方、実施例１で製造したクロマトグラフィー用充填剤はカルボキシル基の影響からカチオン交換能を有し、正の電荷を帯びたシトクロムＣを低塩濃度において保持する傾向にあることが分かる。本発明のカラム充填剤は、従来のホスホリルコリン基のみを導入した粉体においては不可能であったカチオン交換能を付与するという、全く新しい充填剤である。 Further, in order to clarify the difference between the two, a chromatogram when human serum albumin and lysozyme are injected at each salt concentration is shown in FIG. As is apparent from FIG. 8, the powder produced in Comparative Example 1 has anion exchange ability due to the influence of the secondary amine present in the phosphorylcholine group and the spacer, and negatively charged human serum albumin has a low salt concentration. On the other hand, the chromatographic packing material produced in Example 1 has a cation exchange ability due to the influence of the carboxyl group, and tends to hold positively charged cytochrome C at a low salt concentration. I understand that there is. The column packing material of the present invention is a completely new packing material that imparts a cation exchange ability that was impossible in a powder having only a conventional phosphorylcholine group introduced.
「比較試験２：一般的なＧＦＣ用カラムとの溶出時間および回収率の比較」
市販品のクロマトグラフィー用カラム（Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ８０３、昭和電工株式会社製）を市販の状態のまま用いてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を蒸留水にて二倍に希釈した）中のタンパク質の分離を試みた。比較例で挙げた本カラムは、実施例１で述べたカラムと同じ内径と長さである。
この充填剤は多孔性シリカゲルの表面に、親水性基を共有結合させたサイズ排除モード用の充填剤であると説明されている。平均細孔径３００オングストローム、平均粒子径５μｍであり、実施例１で述べた充填剤との比較に好適である。分子量１万から数十万のタンパク質の分離に適していると説明されている。
Ｓｈｏｄｅｘ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＷ８０３は、非解離性の親水性基を用いているために、本願発明の表面改質剤を用いて調製した充填剤と違って電荷を帯びた官能基を有していない。したがってタンパク質とのイオン的な相互作用はほとんど無いと考えられる。
実施例１と同様に、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ2ＨＰＯ4及びＫＨ2ＰＯ4から調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを加えた移動相を用い、流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度２５℃にてヒト血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ）およびリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図９に示す。
“Comparison test 2: Comparison of elution time and recovery rate with general GFC column”
Proteins in a human serum sample (Concerer N (product name) diluted twice with distilled water) using a commercially available chromatography column (Shodex PROTEIN KW803, Showa Denko KK) as it is commercially available Attempted separation. The column mentioned in the comparative example has the same inner diameter and length as the column described in Example 1.
This filler is described as a filler for size exclusion mode in which a hydrophilic group is covalently bonded to the surface of porous silica gel. The average pore diameter is 300 angstroms and the average particle diameter is 5 μm, which is suitable for comparison with the filler described in Example 1. It is described that it is suitable for separation of proteins having a molecular weight of 10,000 to several hundred thousand.
Since Shodex PROTEIN KW803 uses a non-dissociable hydrophilic group, it does not have a charged functional group unlike a filler prepared using the surface modifier of the present invention. Therefore, it is considered that there is almost no ionic interaction with the protein.
As in Example 1, using a mobile phase in which 500 mmol / l sodium chloride was added to 50 mmol / l phosphate buffer (prepared from Na 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 ), the flow rate was 0.1 ml / min, column Human serum albumin (5 mg / ml) and lysozyme (1 mg / ml) were injected at an oven temperature of 25 ° C. Detection was performed at UV 280 nm. The results are shown in FIG.
一般的なＧＦＣカラムであるＫＷ８０３では、塩濃度の低下による保持時間の変化は、酸性タンパク質であるヒト血清アルブミンおよび塩基性タンパク質であるリゾチームが共に観測されない。
一方、本願発明の実施例１では、従来のＧＦＣ用カラムとは異なり、塩基性タンパク質であるリゾチームのみが塩濃度の低下に伴って保持されることが分かる。これまで述べてきたように、この本願発明の粉体特有である塩基性タンパク質の保持は、ホスホリルコリン基と共存するカルボキシル基によるものである。これは、移動相条件を変化させることで、目的とするタンパク質を他の成分から分離できることを意味している。
In KW803, which is a general GFC column, a change in retention time due to a decrease in salt concentration is not observed for both human serum albumin that is an acidic protein and lysozyme that is a basic protein.
On the other hand, in Example 1 of this invention, it turns out that only the lysozyme which is basic protein is hold | maintained with the fall of salt concentration unlike the column for conventional GFC. As described above, the retention of the basic protein, which is peculiar to the powder of the present invention, is due to the carboxyl group coexisting with the phosphorylcholine group. This means that the target protein can be separated from other components by changing the mobile phase conditions.
さらに、ＫＷ８０３と本願発明の粉体を充填したカラムに各タンパク質をそれぞれ注入したときのピーク面積比較による回収率について述べる。「表２」に示したタンパク質、ペプチドの試料を用いて検討を行った。ＫＷ８０３に試料を注入したときのピーク面積を１００とした場合の、本願発明の実施例１のクロマトグラフィー用充填剤に試料を注入したときのピーク面積を「表４」に示す。
移動相ＮａＣｌ濃度が５００ｍｍｏｌ／ｌの場合では、本願発明のカラム特有であるイオン交換性がほとんど現れないために相互作用が存在せず、回収率は極めて良好である。さらには、上述の通り塩基性タンパク質に保持が生じ始め、カチオン交換性を併発する条件である移動相ＮａＣｌ濃度が２５０ｍｍｏｌ／ｌの場合においても、一般に回収率が良いとされるＧＦＣカラム以上の回収率を誇る。本来タンパク質を吸着させる性質を有するカルボキシル基が存在しながらもこれほどまでに回収率が高いのは、カルボキシル基と分子レベルで共存するホスホリルコリン基の影響である。
このように、本来タンパク質・ペプチドの非特異的不可逆吸着をもたらす「相互作用を及ぼす基」であっても、ホスホリルコリン基と共存させることによって相互作用に基づいた分離と優れた回収率を両立させることができる。
Furthermore, the recovery rate by comparison of peak areas when each protein is injected into a column packed with KW803 and the powder of the present invention will be described. The examination was carried out using the protein and peptide samples shown in Table 2. Table 4 shows the peak areas when the sample was injected into the chromatographic packing material of Example 1 of the present invention when the peak area when the sample was injected into KW803 was 100.
When the mobile phase NaCl concentration is 500 mmol / l, the ion exchange property peculiar to the column of the present invention hardly appears, so there is no interaction, and the recovery rate is very good. Furthermore, as described above, the basic protein begins to be retained, and even when the mobile phase NaCl concentration is 250 mmol / l, which is a condition that causes cation exchange, the recovery is more than the GFC column, which generally has a good recovery rate. Boasting rate. The reason why the recovery rate is so high even though the carboxyl group originally has the property of adsorbing protein is due to the influence of the phosphorylcholine group coexisting with the carboxyl group at the molecular level.
In this way, even if it is an “interaction group” that inherently causes non-specific irreversible adsorption of proteins and peptides, coexistence with the phosphorylcholine group achieves both separation based on interaction and excellent recovery. Can do.
「実施例２：ホスホリルコリン基およびスルホン酸基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（３）の化合物はスルホン酸を有するシランカップリング剤であれば特に限定されないが、式（１３）に示す、３−（トリヒドロキシシリル）−１−プロパンスルホン酸（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１３）
Although the compound of Formula (3) will not be specifically limited if it is a silane coupling agent which has a sulfonic acid, Manufacture by 3- (trihydroxysilyl) -1-propanesulfonic acid (Amax Co., Ltd.) shown to Formula (13) An example is described.
(13)
「実施例３：ホスホリルコリン基および４級アンモニウム基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
式（３）の化合物は４級アンモニウム基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されないが、式（１４）に示す、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１４）
また、以下の方法によっても目的とする改質粉体を得ることができる。
合成例２で製造した式（１１）および（１２）の化合物４．８ｍｍｏｌを含むメタノール溶液に３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）を０．７０ｇ添加する。さらに蒸留水２０ｍＬと平均粒子径５μｍ、平均細孔径３００オングストローム、比表面積１４０ｍ2／ｇの球状高純度シリカゲル（洞海科学製）４．０ｇを添加し、オイルバス中８０℃で５時間還流する。その後、反応溶液をろ過し、次いで５０％メタノール水溶液５０ｍＬでろ過洗浄し、さらにメタノール５０ｍＬでろ過洗浄し、８０℃で３時間減圧乾燥させ、アミノプロピル基とホスホリルコリン基の混在する粉体を得る。この粉体をトルエンに分散させ、ヨウ化メチルをアミノ基に対して５当量添加し、１００℃で５時間還流し、目的とする粉体を得ることができる。
"Example 3: Production of a packing material for chromatography having phosphorylcholine groups and quaternary ammonium groups on the substrate surface"
The compound of formula (3) is not particularly limited as long as it is a silane coupling agent having a quaternary ammonium group, but N-trimethoxysilylpropyl-N, N, N-trimethylammonium chloride represented by formula (14) (Amax) A manufacturing example by the company) will be described.
(14)
The target modified powder can also be obtained by the following method.
To a methanol solution containing 4.8 mmol of the compounds of formulas (11) and (12) produced in Synthesis Example 2, 0.70 g of 3-aminopropyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) is added. Further, 20 mL of distilled water, 4.0 g of spherical high-purity silica gel (manufactured by Dokai Kagaku) having an average particle size of 5 μm, an average pore size of 300 Å, and a specific surface area of 140 m 2 / g are added and refluxed at 80 ° C. for 5 hours in an oil bath. . Thereafter, the reaction solution is filtered, then filtered and washed with 50 mL of 50% aqueous methanol solution, further filtered and washed with 50 mL of methanol, and dried under reduced pressure at 80 ° C. for 3 hours to obtain a powder in which aminopropyl groups and phosphorylcholine groups are mixed. This powder is dispersed in toluene, 5 equivalents of methyl iodide are added to amino groups, and the mixture is refluxed at 100 ° C. for 5 hours to obtain the desired powder.
「実施例４：ホスホリルコリン基およびブチル基を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
疎水性基による疎水性相互作用をホスホリルコリン基と混在させる場合については、任意の鎖長のアルキル鎖を導入することができる。本実施例では式（１５）に示す、n-ブチルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１５）
In the case where the hydrophobic interaction by the hydrophobic group is mixed with the phosphorylcholine group, an alkyl chain having an arbitrary chain length can be introduced. In this example, a production example using n-butyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) represented by the formula (15) will be described.
(15)
「実施例５：ホスホリルコリン基および芳香族化合物を基材表面に有するクロマトグラフィー用充填剤の製造」
疎水性およびπ電子相互作用相互作用をホスホリルコリン基と混在させる場合については、芳香族を分子内に有するシランカップリング剤を適用することで実現することができる。本実施例では式（１６）に示す、フェニルトリメトキシシラン（アヅマックス株式会社）による製造例について述べる。
（１６）
The case of mixing hydrophobicity and π-electron interaction with the phosphorylcholine group can be realized by applying a silane coupling agent having an aromatic group in the molecule. In this example, a production example using phenyltrimethoxysilane (Amax Co., Ltd.) represented by the formula (16) will be described.
(16)
本発明のクロマトグラフィー用充填剤の特徴は、ＧＦＣモードに起因する分子量の違いによる分離はもちろんのこと、アニオン交換性相互作用、カチオン交換性相互作用、疎水性相互作用、π電子相互作用を任意の強度で導入することができ、かつ、タンパク質・ペプチドの回収率が極めて優れているという点である。
さらに、これらの相互作用は移動相の塩濃度やｐＨ、有機溶媒濃度に応じて調節することができるために、タンパク質に応じたユニークな分離をすることが可能である。そのうえ、タンパク質が粉体表面に非可逆的吸着を起こすことがないので、タンパク質の変成、失活を伴うことなく分離・分取・分析することが可能である。
The characteristics of the packing material for chromatography according to the present invention include not only separation due to the difference in molecular weight due to the GFC mode, but also any anion exchange interaction, cation exchange interaction, hydrophobic interaction, and π electron interaction. The strength of the protein / peptide recovery is extremely excellent.
Furthermore, since these interactions can be adjusted according to the salt concentration, pH, and organic solvent concentration of the mobile phase, it is possible to perform a unique separation according to the protein. In addition, since protein does not cause irreversible adsorption on the powder surface, it can be separated, fractionated, and analyzed without protein alteration or deactivation.
Claims (7)
（１）
（２）
(1)
(2)
（１）
（３）
(1)
(3)
（１）
（４）
また、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基である。 A packing material for chromatography, wherein a compound represented by the following formula (1) and a compound represented by the following formula (4) are directly covalently bonded to the substrate surface.
(1)
(4)
R 2 , R 3 and R 4 are each independently a methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group or t-butyl group.
（１）
(1)
The packing material for chromatography according to claim 5 or 6, wherein the average diameter of the pores of the spherical porous silica gel is 10 to 1000 angstroms.
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