JP4361578B2 - Monoclonal antibody against chondroitin sulfate lyase II - Google Patents
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Description
本発明は、コンドロイチン硫酸リアーゼIIに対するモノクローナル抗体、当該抗体を産
生するハイブリドーマ株、当該抗体を用いるコンドロイチン硫酸リアーゼIIの測定方法等
に関する。
The present invention relates to a monoclonal antibody against chondroitin sulfate lyase II, a hybridoma strain producing the antibody, a method for measuring chondroitin sulfate lyase II using the antibody, and the like.
コンドロイチナーゼＡＢＣ（以下、C-ABCという）は椎間板ヘルニア治療剤として利用
できる可能性がある（特許文献１）。C-ABC はプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgari
s)の菌体等の培養物から抽出・精製することができ、これにより得られた精製コンドロイ
チナーゼは安全性も高く十分医薬品として利用できるものである。
Chondroitinase ABC (hereinafter referred to as C-ABC) may be used as a therapeutic agent for disc herniation (Patent Document 1). C-ABC is Proteus vulgari
The purified chondroitinase obtained from the culture of s ) such as cells can be used as a pharmaceutical with high safety.
しかし近年、プロテウス・ブルガリスにはC-ABC に物理化学的性質が類似した、いわゆ
る「コンドロイチン硫酸リアーゼII」（特許文献２；以下、リアーゼIIという）が存在す
ることが明らかとなった。この酵素はC-ABC の精製画分にも極々微量に含まれおり、安全
性には問題ないものの、分析・品質管理上、極力排除することが好ましい。一般に、精製
ステップを繰り返せば不純物の含量を減少させることができるが、その反面、精製物質の
回収率減少は免れない。
However, in recent years, it has been clarified that Proteus vulgaris has so-called “chondroitin sulfate lyase II” (Patent Document 2; hereinafter referred to as lyase II), which has similar physicochemical properties to C-ABC. This enzyme is contained in a very small amount in the purified fraction of C-ABC, and although there is no problem in safety, it is preferable to eliminate it as much as possible for analysis and quality control. In general, the content of impurities can be reduced by repeating the purification step, but on the other hand, the recovery rate of the purified material is inevitably reduced.
本発明は、医薬品等に用いられるC-ABCと物理化学的に類似しているコンドロイチナー
ゼ（リアーゼII）を、分析的に検出できない程度にまで排除した超高純度C-ABC画分を簡
便、迅速、かつ高収率で製造するために用いうるコンドロイチン硫酸リアーゼIIに対する
モノクローナル抗体等を提供することを課題とする。
The present invention provides an easy to use ultra-pure C-ABC fraction that excludes chondroitinase (lyase II), which is physicochemically similar to C-ABC used in pharmaceuticals, etc., to the extent that it cannot be detected analytically. An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody against chondroitin sulfate lyase II that can be used for rapid and high-yield production.
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、C-ABCの超高純度精製
用の抗体を調製し、これを用いたユニークな方法によって類似の酵素を全く検出できない
程度にまで超高純度に精製されたC-ABC画分を提供するに至り、本発明を完成した。
As a result of intensive studies to solve such problems, the present inventors have prepared an antibody for ultra-high purity purification of C-ABC, and to the extent that a similar enzyme cannot be detected at all by a unique method using this antibody. The present invention was completed by providing a C-ABC fraction purified to ultra-high purity.
すなわち本発明は、リアーゼII に対するモノクローナル抗体（以下、本発明抗体１と
もいう）、C-ABC に対するモノクローナル抗体（以下、本発明抗体２ともいう）、本発明
抗体１を産生するハイブリドーマ株（以下、本発明細胞株１ともいう）および本発明抗体
２を産生するハイブリドーマ株（以下、本発明細胞株２ともいう）を提供する。なお、本
発明抗体１および２をまとめて「本発明抗体」ともいう。同様に、本発明細胞株１および
２をまとめて「本発明細胞株」ともいう。
That is, the present invention includes a monoclonal antibody against lyase II (hereinafter also referred to as the present antibody 1), a monoclonal antibody against C-ABC (hereinafter also referred to as the present antibody 2), and a hybridoma strain producing the present antibody 1 (hereinafter referred to as the present antibody 1). Also provided is a hybridoma strain producing the antibody 2 of the present invention (hereinafter also referred to as the present cell line 1). Inventive antibodies 1 and 2 are also collectively referred to as “inventive antibodies”. Similarly, the cell lines 1 and 2 of the present invention are collectively referred to as “cell lines of the present invention”.
また本発明は、本発明抗体１を用いることを特徴とする、リアーゼIIの測定方法（以下
、本発明測定方法１ともいう）、および本発明抗体２を用いることを特徴とする、C-ABC
の測定方法（以下、本発明測定方法２ともいう）を提供する。なお、本発明測定方法１お
よび２をまとめて「本発明測定方法」ともいう。
さらに本発明は、本発明測定方法１によってリアーゼIIを検出する工程を含む本発明画分
の製造方法、および本発明測定方法２によってC-ABCを検出する工程を含む本発明画分の
製造方法（以下、これらをまとめて本発明製造方法２ともいう）を提供する。
In addition, the present invention is characterized by using the inventive antibody 1, a lyase II measuring method (hereinafter also referred to as the present measuring method 1), and using the present invention antibody 2, C-ABC
The measurement method (hereinafter also referred to as the measurement method 2 of the present invention) is provided. In addition, this invention measuring method 1 and 2 are collectively called "this invention measuring method".
Furthermore, the present invention provides a method for producing the fraction of the present invention comprising the step of detecting lyase II by the measurement method 1 of the present invention, and a method for producing the fraction of the present invention comprising the step of detecting C-ABC by the measurement method 2 of the present invention. (Hereinafter, these are collectively referred to as the production method 2 of the present invention).
本発明抗体は、医薬品等に用いられるC-ABCと物理化学的に類似するリアーゼIIを、分
析的に検出できない程度にまで排除した超高純度コンドロイチナーゼ画分の製造方法、本
発明測定方法に用いることができる。従って、当該画分の製造・工程管理や、製造された
当該画分の分析・品質管理等に用いることができ、極めて有用である。本発明細胞株は、
このような本発明抗体の製造に用いることができ、極めて有用である。
The antibody of the present invention is a method for producing an ultrapure chondroitinase fraction in which lyase II that is physicochemically similar to C-ABC used in pharmaceuticals and the like is excluded to the extent that it cannot be detected analytically; Can be used. Therefore, it can be used for production / process management of the fraction, analysis / quality control of the produced fraction, and the like, which is extremely useful. The cell line of the present invention is
It can be used for the production of the antibody of the present invention and is extremely useful.
＜１＞本発明画分
本発明画分は、以下の性質を有する高純度C-ABC画分である。
(1)リアーゼII に対する抗体を用いた免疫測定法で測定することにより、リアーゼIIが検
出されない。
(2)ＨＰＬＣにより、リアーゼIIのピークが検出されない。
<1> Inventive fraction The inventive fraction is a high-purity C-ABC fraction having the following properties.
(1) Lyase II is not detected by measuring with an immunoassay using an antibody against lyase II.
(2) The lyase II peak is not detected by HPLC.
上記（１）で用いる免疫測定法は、後述する「本発明測定方法１」であることが好まし
い。好ましい具体例等を含めて、後述の「＜５＞本発明測定方法」で説明する。
The immunoassay method used in the above (1) is preferably “the present invention measurement method 1” described later. This will be described in the following “<5> Measurement method of the present invention” including preferred specific examples.
本発明画分は、このような免疫測定法で測定してもリアーゼIIが検出されない点に特徴
がある。ここで「検出されない」とは、上記測定において検出限界以下であることを意味
する。
The fraction of the present invention is characterized in that lyase II is not detected even when measured by such an immunoassay. Here, “not detected” means below the detection limit in the above measurement.
また、ここで用いるＨＰＬＣ法の条件等は以下の通りである。
・カラム担体：カルボキシメチル(CM)基を有する担体
・カラムサイズ：7.5mmｘ7.5cm
・溶出液：(Ａ溶液) 20 mM リン酸緩衝液(pH7.0)
(Ｂ溶液) 0.5 M NaClを含有するＡ溶液
直線濃度勾配(100％ Ａ溶液 → 50％ Ｂ溶液)/15分
流速：1.0 mL/分
・カラム温度：35 ℃
・サンプルの注入量:100 μL
本発明画分は、このようなＨＰＬＣで分析することによっても、リアーゼIIのピークが
検出されない点に特徴がある。また本発明画分は、医薬として混入が許されない物質を実
質的に含まないものが好ましく、また300ユニット/mg蛋白以上の酵素活性を有する画分で
あることが好ましい。より具体的には、300ユニット/mg蛋白以上の比活性を有し、エンド
トキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である画分が特に好
ましい。なお、本明細書においてC-ABCの「１ユニット(1U)」とは、pH8.0、37℃で、１分
間にコンドロイチン硫酸Ｃから１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量を意味す
る。
The conditions of the HPLC method used here are as follows.
-Column carrier: carrier having carboxymethyl (CM) group-Column size: 7.5mm x 7.5cm
-Eluent: (A solution) 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)
(B solution) A solution linear concentration gradient containing 0.5 M NaCl (100% A solution → 50% B solution) / 15 min flow rate: 1.0 mL / min, column temperature: 35 ° C
・ Sample injection volume: 100 μL
The fraction of the present invention is characterized in that the peak of lyase II is not detected even by analysis by such HPLC. Further, the fraction of the present invention is preferably substantially free of substances that are not allowed to be mixed as a pharmaceutical, and is preferably a fraction having an enzyme activity of 300 units / mg protein or more. More specifically, a fraction having a specific activity of 300 units / mg protein or more, substantially free of endotoxin, and having a nucleic acid and protease content below the detection limit is particularly preferred. In this specification, “1 unit (1U)” of C-ABC means the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin sulfate C per minute at pH 8.0 and 37 ° C. To do.
本発明画分は、上記の特徴を有している限りにおいて如何なる製造方法で製造されるも
のであってもよいが、後述する本発明製造方法１によって製造されるものが好ましい。
The fraction of the present invention may be produced by any production method as long as it has the above characteristics, but is preferably produced by the production method 1 of the present invention described later.
また本発明画分は如何なる生物資源に由来するものであってもよいが、本発明製造方法
１ではプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)に由来する液相を用いることが好まし
いことから、本発明画分もプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)に由来するものが
好ましい。
＜２＞本発明医薬
本発明医薬は、本発明画分からなる医薬である。本発明医薬の用途は特に限定されない
が、C-ABCの椎間板ヘルニア治療剤としての利用可能性が強く示唆されてきていることか
ら（米国特許４,６９６,８１６号）、椎間板ヘルニア処置剤としての用途が好ましい。
Further, the fraction of the present invention may be derived from any biological resource. However, in the production method 1 of the present invention, it is preferable to use a liquid phase derived from Proteus vulgaris. A portion derived from Proteus vulgaris is also preferable.
<2> Pharmaceutical of the present invention The pharmaceutical of the present invention is a pharmaceutical comprising the fraction of the present invention. Although the use of the medicament of the present invention is not particularly limited, the possibility of using C-ABC as a therapeutic agent for intervertebral disc herniation has been strongly suggested (US Pat. No. 4,696,816). Use is preferred.
椎間板ヘルニア処置剤は、椎間板ヘルニアの処置に用いられる限りにおいてその具体的
用途は限定されないが、例えば椎間板ヘルニアの治療目的に使用することができ、注射剤
としてヘルニア症の哺乳動物、好ましくはヒトの椎間板に注入し、髄核を溶解して治療す
る椎間板溶解療法に用いることができる。
The specific use of the treatment for intervertebral hernia is not limited as long as it is used for the treatment of intervertebral disc herniation.For example, it can be used for the treatment of intervertebral disc herniation. It can be injected into the intervertebral disc and used for intervertebral disc therapy where the nucleus pulposus is dissolved and treated.
本発明医薬の投与量は、投与対象動物の種類、性別、年齢、週齢、病態の種類、病態進
行程度等によって個別的に設定されるべきものであり、特に限定されないが、C-ABC量と
して１回0.1〜100ユニット程度を注入することができる。
The dosage of the pharmaceutical of the present invention should be individually set according to the type of animal to be administered, sex, age, age, type of pathological condition, degree of progression of pathological condition, etc., and is not particularly limited, but the amount of C-ABC As a result, about 0.1 to 100 units can be injected at a time.
本発明医薬の形態も用途等によって適宜設定されるものであるが、例えば椎間板ヘルニ
ア処置剤として用いる場合には、溶液状、凍結状、または凍結乾燥状のいずれであっても
良い。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、注射
剤とすることができる。
The form of the pharmaceutical agent of the present invention is also appropriately set depending on the use and the like. For example, when used as a treatment for intervertebral hernia, it may be in the form of a solution, frozen or lyophilized. This can be filled and sealed in an appropriate container such as an ampoule, vial, or syringe for injection to obtain an injection.
本発明医薬の製剤化は、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、C-AB
C自体の活性等に悪影響を与えず、かつC-ABCの作用に悪影響を与えない限りにおいて、他
の医薬活性成分や、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、
等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
The pharmaceutical preparation of the present invention can be formulated by a known method. In addition, C-AB
Other active pharmaceutical ingredients, conventional excipients, stabilizers, binders, emulsifiers, osmotic pressure adjustment, as long as they do not adversely affect the activity of C itself and do not adversely affect the action of C-ABC Agent, buffer,
Ingredients usually used in medicine, such as tonicity agents, preservatives, soothing agents, coloring agents, and the like can be used.
なお、公知のC-ABC画分の安全性・有用性等については既に知られており、本発明では
さらにリアーゼIIをも実質的に含有しないものであるから、極めて安全性が高いと推定さ
れる。
＜３＞本発明製造方法１
本発明製造方法１は、以下の工程を少なくとも含む、本発明画分の製造方法である。
工程１：本発明抗体１（後述）を結合させた固相と、C-ABCとリアーゼIIとを含有する液
相とを接触させ、リアーゼIIを本発明抗体１に結合させる工程。
工程２：固相と液相とを分離し、液相を回収する工程。
Note that the safety and usefulness of known C-ABC fractions are already known, and in the present invention, they are also substantially free of lyase II, so it is estimated that they are extremely safe. The
<3> Production method 1 of the present invention
This invention manufacturing method 1 is a manufacturing method of this invention fraction including the following processes at least.
Step 1: A step of bringing a solid phase to which the antibody 1 of the present invention (described later) is bound into contact with a liquid phase containing C-ABC and lyase II to bind the lyase II to the antibody 1 of the present invention.
Step 2: A step of separating the solid phase and the liquid phase and recovering the liquid phase.
本発明抗体１の固相への結合は公知の方法により行うことができる。例えば、本発明抗
体１を直接固相に共有結合させてもよく、生物学的アフィニティーを利用して結合させて
もよく、生物学的アフィニティーを利用して結合した本発明抗体と固相とをさらに架橋剤
等により共有結合させてもよい。
固相としてはゲル、ビーズ、メンブレン等が例示される。
The antibody 1 of the present invention can be bound to the solid phase by a known method. For example, the antibody 1 of the present invention may be directly covalently bound to a solid phase, may be bound using biological affinity, or the antibody of the present invention bound using biological affinity may be bound to a solid phase. Further, it may be covalently bonded with a crosslinking agent or the like.
Examples of the solid phase include gels, beads, and membranes.
固相への共有結合は、例えば市販のカップリングゲル(例えば、CNBr-活性化ゲル、N-ヒ
ドロキシスクシイミド活性化ゲル、エポキシ活性化ゲル、マレイミド活性化ゲル等)等を
用いて行うことができる。また生物学的アフィニティーを利用した結合は、抗体のFc部分
を特異的に認識するリガンドが結合した固相、例えばプロテインＡやプロテインＧ等のリ
ガンドが結合した固相を用いて行うことができる。このような固相に本発明抗体１をアフ
ィニティー結合させ、さらにジメチルピメリミデート(DMP)、ジイソチオシアノスチルベ
ンジスルホン酸ナトリウム(DIDS)、マレイミドブチリルオキシスクシンイミド(GMBS)、マ
レイミドカプロイルオキシスクシンイミド(EMCS)、グルタルアルデヒド等の二価架橋剤を
作用させ、本発明抗体１とリガンドとを共有結合させてもよい。また、抗体のFc部分に存
在する糖鎖を酸化しアルデヒド化した後、ヒドラジンのリガンドを有するゲルと共有結合
させることによって固相化することもできる。
Covalent bonding to the solid phase should be performed using, for example, a commercially available coupling gel (for example, CNBr-activated gel, N-hydroxysuccinimide activated gel, epoxy activated gel, maleimide activated gel, etc.), etc. Can do. Binding using biological affinity can be performed using a solid phase to which a ligand specifically recognizing the Fc portion of the antibody is bound, for example, a solid phase to which a ligand such as protein A or protein G is bound. The antibody 1 of the present invention is affinity-bound to such a solid phase, and further dimethylpimelimidate (DMP), sodium diisothiocyanostilbene disulfonate (DIDS), maleimidobutyryloxysuccinimide (GMBS), maleimidocaproyloxy A divalent crosslinking agent such as succinimide (EMCS) or glutaraldehyde may be allowed to act to covalently bond the antibody 1 of the present invention and the ligand. Alternatively, the sugar chain present in the Fc portion of the antibody can be oxidized and aldehyded, and then solid-phased by covalently bonding to a gel having a hydrazine ligand.
このように調製された固相(本発明抗体１が結合した固相)に、C-ABCとリアーゼIIとを
含有する液相を接触させることにより、当該液相中に存在するリアーゼIIが固相の本発明
抗体１に結合し、固相と液相を分離することにより液相中のリアーゼIIを除去することが
できる。固相に接触させる液相(C-ABCとリアーゼIIを含有する)の由来等は特に限定され
ないが、例えばプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)の菌体等の培養物等に由来す
る液相であることが好ましい。プロテウス・ブルガリスは、C-ABCの大量製造に極めて有
用であるが、同時にリアーゼIIも産生する。よってプロテウス・ブルガリスからリアーゼ
IIを実質的に含まないC-ABC画分を大量に製造する際には、本発明製造方法が極めて有用
である。なお本発明において「プロテウス・ブルガリス由来」とは、必ずしもプロテウス
・ブルガリスの培養物等のみを意味するものではなく、プロテウス・ブルガリスのC-ABC
遺伝子を用いて創製した同菌以外の組換え生物体由来のものであっても、リアーゼIIが混
在する限り包含される。
By bringing the liquid phase containing C-ABC and lyase II into contact with the solid phase thus prepared (the solid phase to which the antibody 1 of the present invention is bound), the lyase II present in the liquid phase is fixed. Liase II in the liquid phase can be removed by binding to the antibody 1 of the present phase and separating the solid phase and the liquid phase. The origin of the liquid phase (containing C-ABC and lyase II) to be brought into contact with the solid phase is not particularly limited, but for example, it is a liquid phase derived from a culture of Proteus vulgaris ( Proteus vulgaris ). Preferably there is. Proteus vulgaris is extremely useful for mass production of C-ABC, but also produces lyase II. So Proteus Bulgaris to Riase
The production method of the present invention is extremely useful when producing a large amount of C-ABC fraction substantially free of II. In the present invention, “derived from Proteus bulgaris” does not necessarily mean only a culture of Proteus bulgaris, etc., but C-ABC of Proteus bulgaris.
Even those derived from recombinant organisms other than the same bacteria created using genes are included as long as lyase II is mixed.
前記固相に接触させる液相としてプロテウス・ブルガリス由来の液相を用いる場合には
、極力高純度に精製されたものであることが好ましい。具体的には、SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により単一のバンドを示し、ＨＰＬＣ(ゲル濾過およびカチオン交換)に
おいても単一のピークを示し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸およびプロテアー
ゼ含量が検出限界以下であり、結晶化しうるものであり、比活性が300U/mg以上に精製さ
れたC-ABCを含有する液相が好ましい。このような液相は、例えば特開平６―１５３９４
７号公報に記載されている方法で製造することができる。この液相自体も安全性が高く、
十分医薬品として利用できるものであるが、さらに本発明製造方法に付すことによりリア
ーゼIIを実質的に完全に除去することができ、医薬品の分析や品質管理をより容易かつ完
全なものとすることができる。
When a liquid phase derived from Proteus vulgaris is used as the liquid phase to be brought into contact with the solid phase, it is preferable that the liquid phase is purified as highly as possible. Specifically, it shows a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a single peak in HPLC (gel filtration and cation exchange), substantially free of endotoxin, and has a nucleic acid and protease content. A liquid phase containing C-ABC that is below the detection limit, can be crystallized, and purified to have a specific activity of 300 U / mg or more is preferable. Such a liquid phase is disclosed in, for example, JP-A-6-15394.
It can be produced by the method described in No. 7 publication. This liquid phase itself is highly safe,
Although it can be used as a pharmaceutical product, lyase II can be substantially completely removed by applying the production method of the present invention, and the analysis and quality control of the pharmaceutical product can be made easier and more complete. it can.
固相と液相との接触方法は、固相に結合した本発明抗体１の分子と、液相中のリアーゼ
II分子とが接触して、該分子が固相に捕捉される限りにおいて特に限定されず、バッチ法
、カラム法のいずれをも用いることができる。このような方法で固相と液相とを接触させ
ると、液相中のリアーゼIIのみが固相に結合した本発明抗体１に結合する。その後、固相
と液相とを分離して液相を回収することにより、本発明画分を得ることができる。
The contact method between the solid phase and the liquid phase includes the molecule of the antibody 1 of the present invention bound to the solid phase and the lyase in the liquid phase.
There is no particular limitation as long as the molecule II comes into contact with the molecule and is captured by the solid phase, and either a batch method or a column method can be used. When the solid phase and the liquid phase are brought into contact with each other by such a method, only lyase II in the liquid phase binds to the antibody 1 of the present invention bound to the solid phase. Thereafter, the fraction of the present invention can be obtained by separating the solid phase and the liquid phase and collecting the liquid phase.
固相と液相との分離は通常の固液分離手段により行うことができる。例えば、固相と液
相との接触をバッチ法により行った場合には、固相を沈殿、遠心、濾過等することにより
分離、除去することができる。固相と液相の接触をカラム法により行った場合には、カラ
ムから溶出してくる液相を回収するだけでよいことから、簡便・迅速に操作することがで
きる。この点で、固相と液相との接触は、カラム法により行うことが好ましい。
Separation of the solid phase and the liquid phase can be performed by ordinary solid-liquid separation means. For example, when the contact between the solid phase and the liquid phase is performed by a batch method, the solid phase can be separated and removed by precipitation, centrifugation, filtration, or the like. When the contact between the solid phase and the liquid phase is carried out by the column method, it is only necessary to collect the liquid phase eluted from the column, so that it can be operated simply and rapidly. In this regard, the contact between the solid phase and the liquid phase is preferably performed by a column method.
このようにして得られた液相をさらに本発明製造方法に付してもよく、これによって、
リアーゼII除去の確実性・完全性を期することができる。
＜４＞本発明細胞株、本発明抗体
本発明抗体は、リアーゼIIに対するモノクローナル抗体（本発明抗体１）およびC-ABC
に対するモノクローナル抗体（本発明抗体２）である。
また本発明細胞株は、本発明抗体１を産生するハイブリドーマ株（本発明細胞株１）、お
よび本発明抗体２を産生するハイブリドーマ株（本発明細胞株２）である。
The liquid phase thus obtained may be further subjected to the production method of the present invention, whereby
The certainty and completeness of lyase II removal can be expected.
<4> Cell line of the present invention, antibody of the present invention The antibody of the present invention comprises a monoclonal antibody against lyase II (the present antibody 1) and C-ABC.
It is a monoclonal antibody against this (antibody 2 of the present invention).
The cell lines of the present invention are a hybridoma strain that produces the antibody 1 of the present invention (the cell line 1 of the present invention), and a hybridoma strain that produces the antibody 2 of the present invention (the cell line 2 of the present invention).
本発明抗体は、モノクローナル抗体の公知の調製方法(Kohler and Milstein,
Nature 256, p495-497(1975)）により調製することができる。具体的には以下の方法で行
うことができる。
抗原を、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の被免疫動物の腹腔内、皮下あるい
は足蹠(footpad)に投与する。ここで、本発明細胞株１を取得するためには「抗原」とし
てリアーゼIIを用い、本発明細胞株２を取得するためには「抗原」としてC-ABCを用いる
。
The antibody of the present invention is a known method for preparing monoclonal antibodies (Kohler and Milstein,
Nature 256, p495-497 (1975)). Specifically, it can be performed by the following method.
The antigen is administered intraperitoneally, subcutaneously, or footpad of an immunized animal such as a mouse, rat, guinea pig, hamster or the like. Here, lyase II is used as the “antigen” in order to obtain the cell line 1 of the present invention, and C-ABC is used as the “antigen” in order to obtain the cell line 2 of the present invention.
その後、脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した抗体産生細胞と腫瘍細胞
株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立する。
Thereafter, the spleen or popliteal lymph nodes are removed, and antibody producing cells collected from these are fused with myeloma cells, which are tumor cell lines, to establish hybridomas.
細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細
胞等を用いることもできる。ミエローマ細胞株は、抗体産生細胞と異種のものに比べ、同
種のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
In addition to spleen cells, lymph node cells and lymphocytes in peripheral blood can also be used as cells used for cell fusion. The myeloma cell line is preferably of the same type as that of a different type from that of the antibody-producing cell, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、このハイブリドーマの中から、リアーゼIIに
特異的に反応しC-ABCには反応しない抗体を継続的に産生する細胞株、あるいはC-ABCに特
異的に反応しリアーゼIIには反応しない抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。前者
の選別を繰り返すことによって本発明細胞株１が、後者の選別を繰り返すことによって本
発明細胞株２がそれぞれ得られる。
The resulting hybridoma is continuously propagated, and from this hybridoma, a cell line that continuously produces an antibody that specifically reacts with lyase II but does not react with C-ABC, or reacts specifically with C-ABC. A cell line that continuously produces antibodies that do not react with lyase II is selected. The cell line 1 of the present invention is obtained by repeating the former selection, and the cell line 2 of the present invention is obtained by repeating the latter selection.
本発明細胞株１としてはＫ１５Ｇ１１(Ｇ２)が好ましい。また本発明細胞株２としては
７Ｂ１１Ａが好ましい。これらの細胞株は、本発明抗体１および本発明抗体２を産生する
ハイブリドーマ株として本発明者により確立されたものであり、平成１２年９月２６日に
、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８０５４
およびＦＥＲＭ Ｐ−１８０５５の受託番号で寄託されている。
As the cell line 1 of the present invention, K15G11 (G2) is preferable. Further, as the cell line 2 of the present invention, 7B11A is preferable. These cell lines were established by the present inventor as hybridoma strains producing the antibodies 1 and 2 of the present invention. On September 26, 2000, the biotechnology industry of the Ministry of International Trade and Industry FERM P-18054 in the technical laboratory
And the deposit number of FERM P-18055.
本発明抗体１は、本発明細胞株１を適当な培地中で培養し、その培養上清から採取する
ことによって製造することができる。また同様に、本発明抗体２は本発明細胞株２の培養
上清から採取することによって製造することができる。またマウスの腹腔などの生体内に
て本発明細胞株を培養し、腹水などを採取することによっても本発明抗体を製造すること
もできる。
The antibody 1 of the present invention can be produced by culturing the cell line 1 of the present invention in an appropriate medium and collecting it from the culture supernatant. Similarly, the antibody 2 of the present invention can be produced by collecting from the culture supernatant of the cell line 2 of the present invention. The antibody of the present invention can also be produced by culturing the cell line of the present invention in a living body such as the abdominal cavity of a mouse and collecting ascites.
本発明抗体は、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿
およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、プロテインＡやプロテインＧ等を用いたアフィニティークロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固相化した免疫吸
着クロマトグラフィー、ゲル濾過法、超遠心法等によって精製することもできる。
The antibody of the present invention has an affinity using salting out with sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., low temperature alcohol precipitation and selective precipitation fractionation with polyethylene glycol or isoelectric point, electrophoresis, ion exchange chromatography, protein A, protein G, etc. It can also be purified by chromatography, hydroxyapatite chromatography, immunoadsorption chromatography in which an antigen is immobilized, gel filtration, ultracentrifugation, or the like.
本発明抗体１は、リアーゼIIに対するモノクローナル抗体であり、本発明抗体２はC-AB
Cに対するモノクローナル抗体である。本発明抗体１はリアーゼIIに特異的に反応し、C-A
BCには反応しないものであることが好ましく、本発明抗体２は、C-ABCに特異的に反応し
、リアーゼIIには反応しないものであることが好ましい。
Inventive antibody 1 is a monoclonal antibody against lyase II, and invented antibody 2 is C-AB.
It is a monoclonal antibody against C. The antibody 1 of the present invention specifically reacts with lyase II, and CA
It is preferable that it does not react with BC, and the antibody 2 of the present invention preferably reacts specifically with C-ABC and does not react with lyase II.
本発明抗体はそのまま使用することもできるが、抗原との特異的結合能を有する限りに
おいてフラグメント化したものを使用することもできる。例えば、本発明抗体の抗原結合
部位(Fab)分解しないプロテアーゼ(例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等)で処理し
て得られるFabを含むフラグメントとしてもよい。また本発明抗体をコードする遺伝子の
塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に本発明抗体のFab
を含むフラグメントやキメラ抗体(例えば本発明抗体のFab部分を含むキメラ抗体等)を作
製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も、本発明抗体に包含される。
The antibody of the present invention can be used as it is, or a fragmented antibody can be used as long as it has a specific binding ability with an antigen. For example, it may be a fragment containing Fab obtained by treatment with a protease that does not degrade the antigen-binding site (Fab) of the antibody of the present invention (for example, plasmin, pepsin, papain, etc.). If the nucleotide sequence of the gene encoding the antibody of the present invention or the amino acid sequence of the antibody is determined, the Fab of the antibody of the present invention is genetically engineered.
Or a chimeric antibody (for example, a chimeric antibody containing the Fab portion of the antibody of the present invention) can be prepared, and such a fragment or chimeric antibody is also encompassed by the antibody of the present invention.
本発明抗体のクラスは特に限定されないが、IgGであるものが好ましく、IgG1であるも
のがより好ましい。またＬ鎖のタイプも限定されないが、κ型であるものが好ましい。
The class of the antibody of the present invention is not particularly limited, but is preferably IgG and more preferably IgG1. Further, the type of the L chain is not limited, but is preferably κ type.
本発明抗体１としては結合定数(Kd)が 7.4 x 10−８ M 以下であるものが好ましく、本
発明抗体２としては結合定数(Kd)が 1.6 x 10−７ M 以下であるものが好ましい。結合定
数(Kd)は、L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering B.D. Hames
(Ed) pp.77-96 Oxford University Press, New Yorkに記載された方法で測定することが
できる。
The antibody 1 of the present invention preferably has a binding constant (Kd) of 7.4 × 10 −8 M or less, and the antibody 2 of the present invention preferably has a binding constant (Kd) of 1.6 × 10 −7 M or less. Coupling constant (Kd) is determined by L. Djavadi-Ohaniance et al. (1996) In Antibody Engineering BD Hames
(Ed) pp. 77-96 It can be measured by the method described in Oxford University Press, New York.
このような本発明抗体１としては、前記Ｋ１５Ｇ１１(Ｇ２)から選ばれるハイブリドー
マ株が産生するものが好ましい。また本発明抗体２としては、前記７Ｂ１１Ａのハイブリ
ドーマ株が産生するものが好ましい。
＜５＞本発明測定方法
本発明測定方法は、本発明抗体１を用いることを特徴とするリアーゼIIの測定方法（本
発明測定方法１）、および本発明抗体２を用いることを特徴とする、C-ABCの測定方法（
本発明測定方法２）である。ここでいう「測定」という概念には、単に目的物質の量を測
定することのみならず、目的物質の存否（有無）を判定ないし検定することも包含される
。
Such an antibody 1 of the present invention is preferably one produced by a hybridoma strain selected from K15G11 (G2). The antibody 2 of the present invention is preferably one produced by the 7B11A hybridoma strain.
<5> Measurement method of the present invention The measurement method of the present invention is characterized by using the measurement method of lyase II (the measurement method 1 of the present invention) characterized by using the antibody 1 of the present invention and the antibody 2 of the present invention. C-ABC measurement method (
This is the measurement method 2) of the present invention. The concept of “measurement” here includes not only measuring the amount of the target substance but also determining or testing the presence (presence) of the target substance.
本発明抗体１はリアーゼIIに反応するモノクローナル抗体であり、本発明抗体２はC-AB
Cに反応するモノクローナル抗体である。本発明測定方法は、このような本発明抗体の性
質を、リアーゼIIの測定およびC-ABCの測定に応用したものである。
Inventive antibody 1 is a monoclonal antibody that reacts with lyase II, and invented antibody 2 is C-AB.
It is a monoclonal antibody that reacts with C. The measurement method of the present invention applies such properties of the antibody of the present invention to the measurement of lyase II and the measurement of C-ABC.
本発明測定方法は、本発明抗体を用いた免疫測定法により行うことができ、酵素やビオ
チン等で標識した抗体を用いる酵素免疫測定法、ラジオアイソトープで標識した抗体を用
いる放射線免疫測定法、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体法等、通常の免疫測定の手法
を用いることができる。これらの物質による本発明抗体の標識は、直接的であっても間接
的であってもよい。
The measurement method of the present invention can be performed by an immunoassay method using the antibody of the present invention. An enzyme immunoassay method using an antibody labeled with an enzyme or biotin, a radioimmunoassay method using an antibody labeled with a radioisotope, a fluorescence method A usual immunoassay technique such as a fluorescent antibody method using a labeled antibody can be used. The labeling of the antibody of the present invention with these substances may be direct or indirect.
ここで用いる免疫測定法は、直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドイッチ法
等が利用できるが、目的物質の検出特異性を高めるためには二抗体サンドイッチ法を用い
ることが好ましい。
As the immunoassay used here, a direct antibody method, an indirect antibody method, a competitive method, a two-antibody sandwich method, and the like can be used. In order to increase the detection specificity of the target substance, the two-antibody sandwich method is preferably used.
また、免疫測定法に用いる固相としては、マイクロタイターウェル、アガロース粒子、
ラテックス粒子、ビーズ、チューブ、メンブレンなどを用いることができる。目的等に応
じて適宜選択できるが、多くのサンプルを同時に検定する場合には、マイクロタイターウ
ェルを用いることが好ましい。
The solid phase used for immunoassay includes microtiter wells, agarose particles,
Latex particles, beads, tubes, membranes and the like can be used. Although it can be selected appropriately according to the purpose, etc., when many samples are assayed simultaneously, it is preferable to use a microtiter well.
以下に、本発明測定方法の具体例を「本発明測定方法１」を例に挙げて説明する。以下
に示す方法は、本発明測定方法１の特に好ましい具体例であるとともに、前記した「本発
明画分」の性質を調べるための好ましい免疫測定法の具体例でもある。
(1)抗リアーゼIIポリクローナル抗体を、マイクロタイターウェルに固相化する。なお抗
リアーゼIIポリクローナル抗体の製造方法は、後述の実施例で説明する。
(2)このマイクロタイターウェルに検定する画分を入れてインキュベートする（リアーゼI
Iを、固相化した抗リアーゼIIポリクローナル抗体に結合させる）。
(3)洗浄後、ビオチン標識した本発明抗体１を入れてインキュベートする（固相化した抗
リアーゼIIポリクローナル抗体に結合したリアーゼIIに、ビオチン標識した本発明抗体１
を結合させる）。
(4)洗浄後、アビジン標識されたペルオキシダーゼを入れてインキュベートする（本発明
抗体１が結合したビオチンとアビジンが結合する）。
(5)洗浄後、酵素基質を入れてインキュベートして発色させ、発色の程度を測定する。
Hereinafter, specific examples of the measurement method of the present invention will be described by taking “measurement method 1 of the present invention” as an example. The following method is a particularly preferred specific example of the measurement method 1 of the present invention, and is also a specific example of a preferable immunoassay for examining the properties of the above-mentioned “fraction of the present invention”.
(1) An anti-lyase II polyclonal antibody is immobilized on a microtiter well. In addition, the manufacturing method of an anti- lyase II polyclonal antibody is demonstrated in the below-mentioned Example.
(2) Place the fraction to be assayed in this microtiter well and incubate (Lyase I)
I is bound to the immobilized anti-lyase II polyclonal antibody).
(3) After washing, the biotin-labeled antibody 1 of the present invention is added and incubated (the lyase II bound to the immobilized anti-lyase II polyclonal antibody and biotin-labeled antibody 1 of the present invention)
).
(4) After washing, avidin-labeled peroxidase is added and incubated (biotin bound to the antibody 1 of the present invention and avidin bind).
(5) After washing, add enzyme substrate and incubate to develop color, and measure the degree of color development.
本発明画分は、このような免疫測定法で測定してもリアーゼIIが検出されない点に特徴
がある。ここで「検出されない」とは、上記測定において検出限界以下であることを意味
する。
The fraction of the present invention is characterized in that lyase II is not detected even when measured by such an immunoassay. Here, “not detected” means below the detection limit in the above measurement.
このように本発明測定方法１は、本発明画分中のリアーゼIIの存否や含量をアッセイす
る際にも使用することができる。また同様に、本発明測定方法２も、本発明画分中のC-AB
Cの存否や含量をアッセイする際に使用することができる。
＜６＞本発明製造方法２
本発明製造方法２は、本発明測定方法１によってリアーゼIIを検出する工程を含む本発
明画分の製造方法、および本発明測定方法２によってC-ABCを検出する工程を含む本発明
画分の製造方法の両方を包含する。
As described above, the measurement method 1 of the present invention can also be used for assaying the presence and content of lyase II in the fraction of the present invention. Similarly, the measurement method 2 of the present invention also uses C-AB in the fraction of the present invention.
It can be used when assaying the presence or content of C.
<6> Production method 2 of the present invention
The production method 2 of the present invention comprises a method for producing a fraction of the present invention comprising a step of detecting lyase II by the measurement method 1 of the present invention, and a step of the present invention comprising a step of detecting C-ABC by the measurement method 2 of the present invention. Includes both manufacturing methods.
本発明製造方法２は、「本発明測定方法」を本発明画分の製造工程に取り入れたもので
ある。本発明製造方法２は、本発明製造方法１に「本発明測定方法」を取り入れた態様で
あることが好ましく、より具体的には、本発明製造方法１中の「工程２」の後に、本発明
測定方法を組み入れた態様であることが好ましい。特に、本発明製造方法１中の「工程２
」の後に、本発明測定方法１を組み入れた態様であることが好ましい。
The production method 2 of the present invention incorporates the “measurement method of the present invention” in the production process of the fraction of the present invention. The production method 2 of the present invention is preferably an embodiment in which the “measurement method of the present invention” is incorporated into the production method 1 of the present invention. More specifically, after the “step 2” in the production method 1 of the present invention, It is preferable that the invention measurement method is incorporated. In particular, “Step 2” in the production method 1 of the present invention.
”Is preferably an embodiment in which the measurement method 1 of the present invention is incorporated.
このように、「本発明測定方法」を本発明画分の製造工程に取り入れ、「本発明測定方
法によってリアーゼIIおよび／またはC-ABCを検出する工程」を設けることによって、万
一所定の品質を満たさない画分が製造された場合にはこれを発見でき、その画分を排除す
ることができる。従って、本発明製造方法２によって、所定の品質を満たす本発明画分が
安定的に製造できることとなる。
In this way, the “measurement method of the present invention” is incorporated into the production process of the fraction of the present invention, and the “step of detecting lyase II and / or C-ABC by the measurement method of the present invention” is provided. If a fraction that does not satisfy is produced, it can be discovered and the fraction can be eliminated. Therefore, the production method 2 of the present invention can stably produce the fraction of the present invention that satisfies the predetermined quality.
以下に、実施例によって本発明をより具体的に説明する。しかしながら、これらにより
本発明の技術的範囲は限定されない。
＜１＞本発明細胞株および本発明抗体の製造
(1)本発明細胞株１の作製
公知のリアーゼII画分（特開平10-262660号公報に記載の方法で製造したもの） 1mg/ml
を、同量のフロイント完全アジュバント(Freund's Complete Adjuvant；Sigma社)と混合
し、エマルジョン化した。この溶液約400μlを、Balb/cマウスに２〜３回に分けて皮下注
射した。１週間後、同様に製造した公知のリアーゼII画分 1mg/mlを、同量のフロイント
不完全アジュバント(Freund's Incomplete Adjuvant；Sigma社)と混合してエマルジョン
化した溶液約400μlを皮下注射した。さらに１週間後、同様に、公知のリアーゼII画分と
フロイント不完全アジュバントとのエマルジョン化溶液を皮下注射した。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these.
<1> Production of the cell line of the present invention and the antibody of the present invention
(1) Production of the present cell line 1 Known lyase II fraction (manufactured by the method described in JP-A-10-262660) 1 mg / ml
Was mixed with the same amount of Freund's Complete Adjuvant (Sigma) and emulsified. About 400 μl of this solution was injected subcutaneously into Balb / c mice in 2 to 3 divided doses. One week later, 1 mg / ml of a known lyase II fraction prepared in the same manner was mixed with the same amount of Freund's Incomplete Adjuvant (Sigma), and about 400 μl of an emulsified solution was injected subcutaneously. After another week, similarly, an emulsified solution of a known lyase II fraction and Freund's incomplete adjuvant was subcutaneously injected.
免疫後、マウスの脾臓細胞を採取し、この細胞を KohlerとMilsteinの方法（Nature 25
6, p495-497(1975)）によってマウスミエローマ細胞株（P3X63Ag8.635）と融合させてハ
イブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清を、リアーゼIIおよびC-ABCを抗原とし
た免疫測定法により検定して、リアーゼIIに特異的に結合しC-ABCには結合しないモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を得た（K15G11(G2)株）。このハイブリドーマ
株により産生されるモノクローナル抗体のクラスはIgG1であり、Ｌ鎖はκ型であった。K1
5G11(G2)株により産生されるモノクローナル抗体をK15G11(G2)と命名した。
(2)本発明細胞株２の作製
リアーゼIIに代えて公知のC-ABC画分（特開平6-153947号公報に記載の方法で製造した
もの）を用い、上記(1)と同様の方法でハイブリドーマ株を得た。ハイブリドーマの培養
上清を、上記(1)と同様に検定して、C-ABCに特異的に結合しリアーゼIIには結合しないモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株得た（7B11A株）。このハイブリドーマ株
により産生されるモノクローナル抗体のタイプはIgG1であり、Ｌ鎖はκ型であった。7B11
A株により産生されるモノクローナル抗体を7B11Aと命名した。
After immunization, mouse spleen cells are collected, and the cells are collected by Kohler and Milstein (Nature 25).
6, p495-497 (1975)) and hybridized with a mouse myeloma cell line (P3X63Ag8.635). The hybridoma culture supernatant was assayed by immunoassay using lyase II and C-ABC as antigens to obtain a hybridoma strain that produced a monoclonal antibody that specifically bound to lyase II but did not bind to C-ABC. (K15G11 (G2) strain). The class of monoclonal antibodies produced by this hybridoma strain was IgG1, and the L chain was κ type. K1
The monoclonal antibody produced by the 5G11 (G2) strain was named K15G11 (G2).
(2) Preparation of the present cell line 2 A method similar to the above (1) using a known C-ABC fraction (produced by the method described in JP-A-6-153947) instead of lyase II A hybridoma strain was obtained. The hybridoma culture supernatant was assayed in the same manner as in (1) above to obtain a hybridoma strain that produces a monoclonal antibody that specifically binds to C-ABC but does not bind to lyase II (7B11A strain). The type of monoclonal antibody produced by this hybridoma strain was IgG1, and the L chain was kappa. 7B11
The monoclonal antibody produced by the A strain was named 7B11A.
モノクローナル抗体 K15G11(G2)および7B11Aの結合定数(Kd)を L. Djavadi-Ohaniance
et al. (1996) In Antibody Engineering B.D. Hames (Ed) pp.77-96 Oxford Universit
y Press, New York に記載された方法で測定した結果、以下の通りであった。
Binding constants (Kd) of monoclonal antibodies K15G11 (G2) and 7B11A were determined using L. Djavadi-Ohaniance
et al. (1996) In Antibody Engineering BD Hames (Ed) pp.77-96 Oxford Universit
The results of measurement by the method described in y Press, New York were as follows.
K15G11(G2) Kd＝7.4 x 10−８ M
7B11A Kd＝1.6 x 10−７ M
(3)ポリクローナル抗体の製造
公知のリアーゼII画分 1mg/mlを、同量のフロイント完全アジュバント(Sigma社)と混合
し、エマルジョン化した。この溶液約２mlを、JWウサギに５〜６回に分けて皮下注射した
。１週間後、同様に公知のリアーゼII画分をフロイント不完全アジュバント(Sigma社)と
混合してエマルジョン化した溶液約２mlを皮下注射した。さらに１週間後、同様に、公知
のリアーゼII画分とフロイント不完全アジュバントとのエマルジョン化溶液を皮下注射し
た。
K15G11 (G2) Kd = 7.4 x 10 -8 M
7B11A Kd = 1.6 x 10 -7 M
(3) Production of polyclonal antibody A known lyase II fraction (1 mg / ml) was mixed with the same amount of Freund's complete adjuvant (Sigma) and emulsified. About 2 ml of this solution was injected subcutaneously into JW rabbits in 5-6 divided doses. One week later, about 2 ml of an emulsified solution obtained by mixing the known lyase II fraction with Freund's incomplete adjuvant (Sigma) was injected subcutaneously. After another week, similarly, an emulsified solution of a known lyase II fraction and Freund's incomplete adjuvant was subcutaneously injected.
免疫したウサギから血清を採取し、抗体価をオクタロニーにより検定し、十分に抗体価
が上昇したウサギについて頸動脈と心臓から全採血し、遠心操作により抗血清を得た。抗
体価の低いウサギについてはさらに免疫を繰り返し、同様に抗血清を得た。
Serum was collected from the immunized rabbit, antibody titer was assayed by octalony, and rabbits with sufficiently elevated antibody titer were collected from the carotid artery and heart, and antiserum was obtained by centrifugation. Rabbits with low antibody titers were further immunized to obtain antisera in the same manner.
このようにして得られた抗リアーゼII抗血清から、以下の通りリアーゼIIに特異的な抗
リアーゼIIポリクローナル抗体を精製した。
From the thus obtained anti-lyase II antiserum, an anti-lyase II polyclonal antibody specific for lyase II was purified as follows.
Protein G Sepharose 4FF(Amersham Pharmacia Biotech社製) を結合緩衝液(20 mMリン
酸緩衝液, pH 7.8)に懸濁し、10mlのスラリーをカラムに充填した。さらにカラムに５倍
量の結合緩衝液を流して平衡化した。平衡化したカラムに結合緩衝液で５倍希釈した抗リ
アーゼII抗血清を添加した。さらに５倍量の結合緩衝液を流してProtein Gに結合しない
血清タンパク質を除去した。次に溶出緩衝液(0.1M Glycine-HCl, pH2.8)をカラムに流し
て、溶出液を10mlのフラクションとして回収した。溶出液は直ちに適当量の中和緩衝液(1
M Tris-HCl, pH 9.0)と混合し、溶出されたIgGの変性を防いだ。各フラクションの吸光度
(A280nm)を測定し、0.1以上のフラクションをプールした。このプールに最終飽和濃度が5
0％となるように硫酸アンモニウムを添加した。氷上で30分放置した後、遠心操作で沈殿
を回収し、IgGを濃縮・精製した。得られた沈殿を0.1M 重炭酸緩衝液(pH 8.3)に溶解し、
0.1M 重炭酸緩衝液(pH 8.3)に対して３日間透析した。透析して得られたIgG溶液を、あら
かじめC-ABCを固相化したAffigel-10(Bio-Rad)ゲルと混合してインキュベートすることに
より、溶液中に微量に含まれる可能性がある抗C-ABCポリクローナル抗体を吸着除去した
。
Protein G Sepharose 4FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was suspended in a binding buffer (20 mM phosphate buffer, pH 7.8), and 10 ml of slurry was packed in the column. Further, the column was equilibrated with a 5-fold amount of binding buffer. Anti-lyase II antiserum diluted 5-fold with binding buffer was added to the equilibrated column. Furthermore, serum protein that did not bind to Protein G was removed by flowing a 5-fold amount of binding buffer. Next, elution buffer (0.1 M Glycine-HCl, pH 2.8) was passed through the column, and the eluate was collected as a 10 ml fraction. Immediately eluate the appropriate amount of neutralization buffer (1
M Tris-HCl, pH 9.0) to prevent denaturation of the eluted IgG. Absorbance of each fraction
(A280nm) was measured, and fractions of 0.1 or more were pooled. This pool has a final saturation concentration of 5
Ammonium sulfate was added to 0%. After leaving on ice for 30 minutes, the precipitate was recovered by centrifugation, and IgG was concentrated and purified. Dissolve the resulting precipitate in 0.1M bicarbonate buffer (pH 8.3)
Dialyzed against 0.1M bicarbonate buffer (pH 8.3) for 3 days. The IgG solution obtained by dialysis is mixed with Affigel-10 (Bio-Rad) gel in which C-ABC is solid-phased and incubated, so that anti-C that may be contained in a trace amount in the solution. -ABC polyclonal antibody was removed by adsorption.
精製された抗リアーゼII IgGポリクローナル抗体を還元し、あるいはそのままSDS-14％
ポリアクリルアミドゲル（旭テクノグラス）を用いた電気泳動に付した結果、Ｈ鎖およ
びＬ鎖で構成される単一バンドの抗体蛋白質であることが確認された。
Purified anti-lyase II IgG polyclonal antibody is reduced or as is SDS-14%
As a result of subjecting to electrophoresis using polyacrylamide gel (Asahi Techno Glass), it was confirmed to be a single band antibody protein composed of H chain and L chain.
なお抗C-ABC抗血清からのC-ABCに特異的な抗C-ABCポリクローナル抗体の製造、精製お
よびその確認も、上記と同様に行った。
(4)抗体固相化カラムの作製
抗体を固相化したアフィニティーカラム担体は、Protein G 結合ゲル(Pierce Chemical
社)を用いて作製した。50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.2)(以下、B/W 緩衝液という)
５mlをカラムに２回添加して平衡化した。精製した抗リアーゼII抗体 １ml(12mg蛋白/ml)
を、1mlのB/W 緩衝液で希釈してカラムに添加した。カラムを室温で30分間、穏やかに転
倒攪拌して、カラム担体のProtein Gと抗体のFc部分を結合させた。B/W 緩衝液 ５mlでカ
ラムを２回洗浄し、次に6.6mg/mlのジメチルピメリミデート(Dimethylpimelimidiate)溶
液を加えて、カラムを室温にて60分間穏やかに転倒攪拌し、カラム担体と抗体とを共有結
合により架橋させた。カラム洗浄後、アミノ基のブロッキング緩衝液(0.1M エタノールア
ミン, pH 8.2) ５mlを添加して、室温で10分間穏やかに転倒攪拌した。その後、架橋して
いない抗体を、5mlの0.1M Glycine-HCl, pH2.8により溶出させた。カラムはB/W 緩衝液
５mlで２回洗浄し、この状態で次回の使用まで4℃で保存した。
In addition, production, purification and confirmation of an anti-C-ABC polyclonal antibody specific for C-ABC from anti-C-ABC antiserum were performed in the same manner as described above.
(4) Preparation of antibody-immobilized column An affinity column carrier on which an antibody is immobilized is a Protein G binding gel (Pierce Chemical
For example). 50 mM sodium borate buffer (pH 8.2) (hereinafter referred to as B / W buffer)
5 ml was added to the column twice and equilibrated. 1 ml of purified anti-lyase II antibody (12 mg protein / ml)
Was diluted with 1 ml B / W buffer and added to the column. The column was gently agitated at room temperature for 30 minutes to bind the protein carrier Protein G and the antibody Fc portion. Wash the column twice with 5 ml of B / W buffer, then add 6.6 mg / ml Dimethylpimelimidiate solution, gently invert the column for 60 minutes at room temperature, The antibody was cross-linked by covalent bond. After column washing, 5 ml of an amino group blocking buffer (0.1 M ethanolamine, pH 8.2) was added, and the mixture was gently agitated for 10 minutes at room temperature. The uncrosslinked antibody was then eluted with 5 ml of 0.1 M Glycine-HCl, pH 2.8. Column is B / W buffer
It was washed twice with 5 ml and stored at 4 ° C. in this state until next use.
試薬等は ImmunoPure Protein G Orientation Kit(Pierce Chemical社)を使用した。 As a reagent, ImmunoPure Protein G Orientation Kit (Pierce Chemical) was used.
抗C-ABC抗体の固相化カラムの作製も、これと同様に行った。
＜２＞本発明画分の製造
本発明画分の製造は、全てエンドトキシンフリーの条件下で実施した。
An anti-C-ABC antibody-immobilized column was prepared in the same manner.
<2> Production of the fraction of the present invention The production of the fraction of the present invention was all carried out under endotoxin-free conditions.
公知のC-ABC画分(特開平６―１５３９４７号公報に記載の方法で製造したもの；エンド
トキシンフリー) 約20mlを0.22μmのフィルターで濾過した後、上記で作製した抗リアー
ゼII抗体固相化カラム（カラムの５倍量の１％POELE溶液で洗浄した後、エンドトキシン
フリーの蒸留水で平衡化したもの）に添加した。カラムから滴下してきた液(フロースル
ー)を、3mlずつのフラクションとして回収して吸光度(A280nm)を測定した。吸光度0.1以
上のフラクションをプールして、同じ操作をもう一度繰り返し、フロースルーを回収して
、C-ABC画分を得た。
Known C-ABC fraction (manufactured by the method described in JP-A-6-153947; endotoxin-free) About 20 ml was filtered through a 0.22 μm filter, and the anti-lyase II antibody prepared above was immobilized. It was added to the column (washed with 1% POELE solution in 5 times the volume of the column and equilibrated with endotoxin-free distilled water). The liquid dropped from the column (flow-through) was collected as 3 ml fractions, and the absorbance (A280 nm) was measured. Fractions with an absorbance of 0.1 or more were pooled, the same operation was repeated once more, and the flow-through was collected to obtain a C-ABC fraction.
また、公知のリアーゼII画分(特開平１０-２６２６６０号公報に記載の方法で製造した
もの)を、同様に上記で作製した抗C-ABC抗体を固相化したカラムに通し、同様にリアーゼ
II画分を得た。
＜３＞本発明画分の性質
上記で得られた各画分中に含まれるC-ABC およびリアーゼIIの含量を、免疫測定法およ
びＨＰＬＣ法により測定した。測定方法は以下の通りである。
(1)免疫測定法
(1-1)ビオチン標識抗体の作製
前記で得られた抗C-ABCモノクローナル抗体および抗リアーゼIIモノクローナル抗体を
、それぞれ50 mM 重炭酸緩衝液 (pH 8.3)で2 mg/mlに調製した。これらの溶液とSulfo-NH
S-LC-LC-Biotin (Pierce Chemical社製)と混合し、室温で１時間、ゆるやかに攪拌した。
得られたラベル化抗体から未反応のビオチンを除去するために、50 mM 重炭酸緩衝液に対
して２日間透析した。
(1-2)サンドイッチ-免疫測定法による、C-ABCおよびリアーゼIIの測定
抗C-ABCポリクローナル抗体または抗リアーゼIIポリクローナル抗体を、炭酸-重炭酸緩
衝液(pH 9.4)で20μg/mlに調製し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（Nunc immun
oplate）に100μl/wellで添加して、37℃で1.5時間インキュベートした。次いでイムノス
タビライザー(ABI社)をプレートに200μl/ウエル添加して、37℃で1.0時間インキュベー
トして抗体結合プレートを作製した。
Further, a known lyase II fraction (produced by the method described in JP-A-10-262660) is passed through a column on which an anti-C-ABC antibody prepared in the same manner is immobilized, and lyase is similarly produced.
II fraction was obtained.
<3> Properties of the fraction of the present invention The contents of C-ABC and lyase II contained in each of the fractions obtained above were measured by immunoassay and HPLC. The measuring method is as follows.
(1) Immunoassay
(1-1) Preparation of biotin-labeled antibody The anti-C-ABC monoclonal antibody and the anti-lyase II monoclonal antibody obtained above were each adjusted to 2 mg / ml with 50 mM bicarbonate buffer (pH 8.3). These solutions and Sulfo-NH
The mixture was mixed with S-LC-LC-Biotin (Pierce Chemical Co.) and stirred gently at room temperature for 1 hour.
In order to remove unreacted biotin from the labeled antibody obtained, it was dialyzed against 50 mM bicarbonate buffer for 2 days.
(1-2) Measurement of C-ABC and lyase II by sandwich-immunoassay Prepare anti-C-ABC polyclonal antibody or anti-lyase II polyclonal antibody at 20 μg / ml with carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.4) 96-well microtiter plate (Nunc immun
oplate) at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. Next, 200 μl / well of immunostabilizer (ABI) was added to the plate and incubated at 37 ° C. for 1.0 hour to prepare an antibody-binding plate.
別途、測定用サンプル(＜２＞で得られたC-ABCまたはリアーゼII)をリン酸緩衝生理食
塩液（PBS）で適当な濃度に希釈して、C-ABCおよびリアーゼIIのスタンダードを作製した
。測定用サンプルとスタンダードを、上記で作製した抗体結合プレートに100μl/ウエル
で添加して、37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをPBS-0.0
5％ Tween20で４回洗浄した。
Separately, samples for measurement (C-ABC or lyase II obtained in <2>) were diluted to an appropriate concentration with phosphate buffered saline (PBS) to prepare C-ABC and lyase II standards. . Samples for measurement and standards were added to the antibody-binding plate prepared above at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. After incubation, the plate is washed with PBS-0.0
Washed 4 times with 5% Tween20.
上記(1-1)で作製したビオチン標識抗C-ABC抗体またはビオチン標識抗リアーゼII抗体を
PBSで2500倍希釈して、プレートに100μl/ウエルで添加し、37℃で１時間インキュベート
した。インキュベート後、プレートをPBS-0.05％ Tween20で４回洗浄した。
The biotin-labeled anti-C-ABC antibody or biotin-labeled anti-lyase II antibody prepared in (1-1) above
It was diluted 2500 times with PBS, added to the plate at 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the plate was washed 4 times with PBS-0.05% Tween20.
アビジン-ペルオキシダーゼ(Sigma社)をPBSで10000倍希釈して、プレートに100μl/ウ
エルで添加し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをPBS-0.
05％ Tween20で４回洗浄した。
Avidin-peroxidase (Sigma) was diluted 10,000 times with PBS, added to the plate at 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the plate is PBS-0.
Washed 4 times with 05% Tween20.
基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Moss,INC)をプレートに100μl/wellで
添加し、室温で10分間反応させた。1M HClをプレートに100μl/wellで添加して反応を停
止させた後、ウェルリーダー SK601(生化学工業株式会社販売)により、450〜630nmの吸光
度を測定した。
(2)ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣカラム、溶出溶媒、流速等の条件は以下の通りで行った。
Substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (Moss, INC) was added to the plate at 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 10 minutes. 1M HCl was added to the plate at 100 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 450 to 630 nm was measured with a well reader SK601 (sold by Seikagaku Corporation).
(2) HPLC method Conditions such as HPLC column, elution solvent, and flow rate were as follows.
・カラム：TSKgel CM-5PW(7.5 mmx7.5 cm；東ソー製)
・溶出液：(Ａ溶液) 20 mM リン酸緩衝液( pH7.0 )
(Ｂ溶液) 0.5 M NaClを含有するＡ溶液
・直線濃度勾配( 100％ Ａ溶液 → 50％ Ｂ溶液 )/15分
・流速：1.0 mL/分
・カラム温度：35 ℃
・サンプルの注入量:100 μL
(3)上記＜２＞で得られたC-ABC画分(本発明画分)の分析結果を以下に示す。なお「N.D.
」は検出されなかったこと(検出限界以下)を示す。
(3-1)免疫測定法
・ Column: TSKgel CM-5PW (7.5 mmx7.5 cm; manufactured by Tosoh Corporation)
-Eluent: (A solution) 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)
(B solution) A solution containing 0.5 M NaCl ・ Linear concentration gradient (100% A solution → 50% B solution) / 15 minutes ・ Flow rate: 1.0 mL / min ・ Column temperature: 35 ℃
・ Sample injection volume: 100 μL
(3) The analysis results of the C-ABC fraction (the fraction of the present invention) obtained in <2> above are shown below. "ND"
"" Indicates that it was not detected (below the detection limit).
(3-1) Immunoassay
(3-2)ＨＰＬＣ法（A280nmの検出チャートのピーク面積の相対値） (3-2) HPLC method (relative value of peak area of A280nm detection chart)
（リアーゼIIのピークは、溶出時間15.73分付近に検出された）
この結果から、本発明方法は、精製目的物の収量をほとんど減ずることなく、リアーゼ
IIを効率よく検出限界以下まで除去できることが明らかとなった。
上記＜２＞で得られたリアーゼII画分の分析結果を以下に示す。
(The lyase II peak was detected at an elution time of around 15.73 minutes)
From this result, the method of the present invention was able to reduce the yield of the purified product with little decrease in lyase.
It was revealed that II could be efficiently removed to below the detection limit.
The analysis results of the lyase II fraction obtained in <2> above are shown below.
なお、リアーゼII含量はＨＰＬＣ法で、C-ABC含量は免疫測定法で測定した。またカッ
コ内の数値は、リアーゼII含量に対するC-ABC含量の重量比を示す。
The lyase II content was measured by HPLC, and the C-ABC content was measured by immunoassay. The numerical value in parenthesis indicates the weight ratio of C-ABC content to lyase II content.
この結果から、本発明方法をリアーゼII画分の精製に応用しても、精製目的物の収量を
ほとんど減ずることなく、C-ABC含量を効率よく検出限界近くまで除去できることが明ら
かとなった。
From these results, it has been clarified that even when the method of the present invention is applied to the purification of the lyase II fraction, the C-ABC content can be efficiently removed to near the detection limit without substantially reducing the yield of the purification target product.
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