JP4283351B2

JP4283351B2 - Production method and use of novel oil and fat composition

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Publication number: JP4283351B2
Application number: JP24233098A
Authority: JP
Inventors: 恒夫山根; 雄吾岩崎; 美保成田
Original assignee: サントリー酒類株式会社
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1998-08-27
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2018-08-27
Also published as: JP2000060587A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸を含む構造脂質および／またはドコサヘキサエン酸を含む構造脂質の製造方法、この方法により得られる構造脂質を含有する油脂組成物、およびこの油脂組成物の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の生理化学分野の研究から、トリグリセリドの１および３位に長鎖脂肪酸（Ｃ１８以上）が結合した油脂よりも、１および３位に中鎖脂肪酸（Ｃ８〜Ｃ１２）が結合した油脂の方が、生体内の膵臓リパーゼによって容易に分解され易く、従って、腸内で吸収され易いことが判明している［油化学、第37巻、ｐ781、1995年］。脂肪酸のなかでも、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸は、動物体内で種々の生理活性を有するものと考えられている。それゆえ、１および３位に中鎖脂肪酸が、そして２位に高度不飽和脂肪酸が結合した構造脂質は、有用脂肪酸である高度不飽和脂肪酸が結合し、かつ腸内で吸収されやすい油脂として、注目を集めている。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸は、含まれる不飽和結合の位置の相違により、（ｎ−３）系の高度不飽和脂肪酸および（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸に分けられる。
動物体内では、（ｎ−３）系の高度不飽和脂肪酸と（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸とは別の代謝経路に属する。炭素数が１８のリノール酸〔１８：２（ｎ−６）〕およびα−リノレン酸〔１８：３（ｎ−３）〕は、植物油脂の主要成分として広く存在する。一方、動物には、リノール酸およびα−リノレン酸を生合成する能力がない。そのため、動物は、これらの（ｎ−３）系および（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸を必須脂肪酸として要求する。摂取されたリノール酸などの高度不飽和脂肪酸は、さらに不飽和化および炭素鎖の延長が繰り返されて、より不飽和度が高く、炭素数の多い高度不飽和脂肪酸に変換される。しかし、成人病患者、乳児、老人などでは、生合成における不飽和化反応の働きが低下することが多いため、不飽和度が高く炭素数の多い高度不飽和脂肪酸が不足しがちになる。
【０００４】
（ｎ−３）系の高度不飽和脂肪酸には、例えばエイコサペンタエン酸〔２０：５（ｎ−３）〕、ドコサヘキサエン酸〔２２：６（ｎ−３）〕などが含まれる。これらの（ｎ−３）系の高度不飽和脂肪酸は、抗炎症活性、抗血栓活性などの生理活性を有することが知られており、そのため、機能性食品および医薬品の素材として注目されている。
【０００５】
一方、（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸には、例えばγ−リノレン酸〔１８：３（ｎ−６）〕、ジホモ−γ−リノレン酸〔２０：３（ｎ−６）〕、アラキドン酸〔２０：４（ｎ−６）〕などが含まれる。これらの（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸は、局所ホルモンと呼ばれるプロスタグランジン、ロイコトリエンなどのエイコサノイドの１群または２群への中間代謝物質として注目されている。
【０００６】
動物体内においては、組織により変わるが、一般に、（ｎ−３）系の高度不飽和脂肪酸としてはドコサヘキサエン酸が、そして（ｎ−６）系の高度不飽和脂肪酸としてはアラキドン酸が、最終代謝産物となっている。動物体内では、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸の含有量は極めて少ない。
【０００７】
（ｎ−３）系の最終代謝産物であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、動物の脳および網膜に特異的に存在している。ＤＨＡは、これらの器官において何らかの機能を果たしていると考えられる。近年、マグロの眼窩脂肪などの、ＤＨＡを高濃度に含有する原料が発見されたこと、および脂肪酸の高度精製技術が発達したことなどから、ＤＨＡの生理活性機能の解明および実用化についての研究が活発に進められている。ＤＨＡの生理活性機能としては、血中コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、制癌作用、さらには脳代謝系に関連して、記憶学習能力の向上および老人性痴呆症の予防に作用することなどが明らかとなった。これらのことから、ＤＨＡは、アルツハイマー疾病の治療薬としても期待されている。また、ＤＨＡは、稚魚の成長必須脂肪酸であることも明らかとなった。実用化については、ＤＨＡは、健康食品、ベビーミルク等の素材として使用されている。
【０００８】
動物体内で、脂肪酸の組成に占める（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の含有量が大きくなっている場合は、（ｎ−３）系必須脂肪酸が欠乏していることが多い。このことは、欠乏している（ｎ−３）系高度不飽和脂肪酸の機能を、（ｎ−６）系高度不飽和脂肪酸が代償していると考えられる。特に、ＤＨＡの代償として、（ｎ−６）系ＤＰＡが生体内で作られる例が複数報告されている。これは、（ｎ−６）系ＤＰＡが何らかの生理的役割を有していることを示唆する。（ｎ−６）系ＤＰＡはまた、アラキドン酸のアンタゴニストとしても期待できる。
【０００９】
（ｎ−６）系ＤＰＡは、一般的に供給される油脂の中には全く存在せず、魚油の中に（ｎ−３）系ＤＰＡとともにわずかに含まれている。しかし、魚油中の（ｎ−６）系ＤＰＡの含有量が、１％程度と微量であることなどのため、（ｎ−６）系ＤＰＡを効率良く分離および濃縮することは容易ではない。
【００１０】
以上のように、魚油には、注目すべき生理機能を有するＤＨＡおよび（ｎ−６）系ＤＰＡが存在し、その精製方法についても多くの知見が得られている。一方、魚油には、▲１▼ＤＨＡおよび（ｎ−６）系ＤＰＡの含有量が少ない；▲２▼主に回遊魚が原料となるが、回遊魚の漁獲量は季節によって変化するので、安定して供給されにくい；▲３▼特有の異臭がある；および▲４▼アラキドン酸（ＡＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸も含まれるため、酸化され易く、安定した品質の油脂を得ることが困難である、などの欠点がある。
【００１１】
ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の、魚油以外の供給源としては、これらの高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物の培養菌体中に蓄積した油脂（微生物オイル）が挙げられる。これらの微生物の例としては、深海から分離された細菌ビブリオ・マリナス（Vibrio marinus）ATCC 15381、深海魚の腸内から分離されたビブリオ属細菌、鞭毛菌類であるスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium sp.）ATCC 28211、ATCC 20890およびATCC 20891、シゾキトリウム属（Schizochytrium sp.）ATCC 20888およびATCC 20889〔米国特許No.5,340,742〕、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium sp.）ＳＲ２１株〔日本農芸化学会誌、第69巻、臨時増刊号、1995年７月５日発行〕、ジャポノキトリウム属（Japonochytrium sp.）ATCC 28207〔特開平１−１９９５８８号公報〕、微細藻類であるシクロテラ・クリプティカ（Cyclotella cryptica）、クリプテコディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）〔特表平５−５０３４２５号公報〕、エミリアニア〔特開平５−３０８９７８号公報〕などが知られている。
【００１２】
上記のいずれの微生物にも、ＤＨＡおよび／またはＤＰＡの生産率が低い、培養時間が長い、生産に特別の培地または培養条件を必要とするなどの欠点がある。特に、エミリアニアなどの藻類を用いる場合、ＤＨＡの生産量が高くても、培養に光を必要とするために工程が複雑になり、工業生産に適していない等の欠点がある。
【００１３】
さらに、上記のいずれの油脂を用いるかにかかわらず、従来、ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する構造脂質、特に、主としてトリグリセリドの２位のみにこれらの高度不飽和脂肪酸のいずれかが結合した構造脂質を、効率的に製造することは困難であった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方を含む構造脂質を効率的に製造する、工業的規模での利用に適した方法を提供することを目的とする。本発明はまた、この方法により得られる構造脂質を含有する油脂組成物、およびこの油脂組成物を利用した食品を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく、鋭意努力した結果、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方を含む油脂、特に微生物の生産する油脂を、細菌由来のリパーゼを用いて処理することにより、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方を含む構造脂質を、良好な収率で製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明は、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方を含む構造脂質の製造方法であって、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方を含む油脂を、中鎖脂肪酸の存在下で、細菌由来のリパーゼを用いて処理する工程を包含する方法を提供する。
【００１７】
一つの実施態様では、上記リパーゼは、シュードモナス属由来のリパーゼである。好ましい実施態様では、上記リパーゼは、シュードモナス属KWI-56株由来のリパーゼである。
【００１８】
別の実施態様では、上記油脂は、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の少なくとも一方の生産能を有する微生物の培養物から得られる。好ましい実施態様では、上記微生物は、スラウストキトリウム科に属する微生物である。さらにより好ましい実施態様では、上記微生物は、ウルケニア属、シゾキトリウム属、またはスラウストキトリウム属に属する微生物である。さらにより好ましい実施態様では、上記微生物は、ウルケニア属に属する微生物である。さらにより好ましい実施態様では、上記微生物は、ウルケニア属ＳＡＭ２１７９株である。
【００１９】
本発明はまた、上記のいずれかの方法によって得られた構造脂質を含有する油脂組成物を提供する。
【００２０】
一つの実施態様では、上記構造脂質は、１位のみ、３位のみ、または１および３位のみに中鎖脂肪酸が結合したトリグリセリドである。好ましい実施態様では、上記中鎖脂肪酸はカプリル酸である。
【００２１】
本発明はさらに、上記のいずれかの油脂組成物を含有する、栄養補助食品、健康食品、または機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳または未熟児用調製乳、ならびに老人用食品を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳しく説明する。
【００２３】
１．用語の定義
本明細書において、「ドコサペンタエン酸」とは、他に特定されない限り、（ｎ−６）系のドコサペンタエン酸〔２２：５（ｎ−６）〕を指す。ＤＰＡは、ドコサペンタエン酸の略語である。
【００２４】
本明細書において、「ドコサヘキサエン酸」とは、他に特定されない限り、（ｎ−３）系のドコサヘキサエン酸〔２２：６（ｎ−３）〕を指す。ＤＨＡは、ドコサヘキサエン酸の略語である。
【００２５】
本明細書において、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物（例えば、グリセリド）またはその類似体（例えば、コレステロールエステル）などを含む単純脂質、その他にさらにリン酸、硫酸、糖、アミノ基などを含む複合脂質、および脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質を含む用語である。
【００２６】
本明細書において、「油脂」、「オイル」および「トリグリセリド」という用語は、同じ意味で使用する。
【００２７】
本明細書において、「構造脂質」とは、短鎖および／または中鎖脂肪酸と、長鎖脂肪酸との混合物を含むように改変された、非天然のトリグリセリドを指す。ここで、短鎖脂肪酸とは、約７個以下の炭素を有する脂肪酸を指し、中鎖脂肪酸とは、約８〜１２個の炭素を有する脂肪酸を指し、長鎖脂肪酸とは、約１３個以上の炭素を有する脂肪酸を指す。
【００２８】
本明細書において、「油脂組成物」とは、油脂を含有する組成物を指す。油脂組成物は、通常、組成物全体の重量を基準として約１０重量％以上の油脂を含有し、好ましくは約２０重量％以上、より好ましくは約５０重量％以上、さらにより好ましくは約７０重量％以上の油脂を含有する。
【００２９】
２．材料
2.1 リパーゼ
リパーゼは、エステルの加水分解、エステルの合成、エステル転移（アシドリシス、アルコーリシス、エステル交換、アミノリシス）などの各種反応を触媒する。本発明においては、細菌由来のリパーゼが、アシドリシス反応を高い活性で触媒し得ることを利用して、構造脂質を効率的に生成させる。アシドリシス反応は、以下の反応式１により示される。
【化１】

【００３０】
本発明においては、任意の細菌由来のリパーゼを使用し得る。細菌由来のリパーゼは、トリグリセリドでのアシドリシス反応において、通常、位置選択性がなく、そして約２０個以上の炭素を有する長鎖脂肪酸のアシドリシス反応を触媒する活性は著しく低い。これは、細菌自身は本来約２０個以上の炭素を有する長鎖脂肪酸を合成しないため、このような長鎖脂肪酸の反応を触媒し難いためと考えられる。従って、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡを含有するトリグリセリドをアシドリシス反応の基質とした場合、これらＤＰＡおよび／またはＤＨＡを実質的に維持したまま、より短鎖の脂肪酸についての反応を選択的に触媒し得る。リパーゼを採取するための細菌の例としては、シュードモナス属（Pseudomonas）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属などの属に分類される細菌が挙げられるが、好ましくは、シュードモナス属に分類される細菌であり、より好ましくは、シュードモナス属（Pseudomonas sp.） KWI-56株である。
【００３１】
リパーゼは、細菌を培養して採取したものを用いても、市販のものを用いてもよい。細菌からリパーゼを採取する場合、当該分野で公知の方法を利用し得る。精製したリパーゼが好ましく、その純度は、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上であり得るが、未精製のリパーゼであってもよい。
【００３２】
リパーゼは、固定化せずに用いてもよい。しかし、連続的に酵素反応を行い得る点、および反応後に酵素を回収して再利用し得る点で有利であるために、固定化酵素が好ましい。固定化には、リパーゼの活性を著しく低下させない限り、任意の方法を用い得る。固定化方法の例としては、当該分野で公知の、担体結合法、架橋法、包括法、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００３３】
担体結合法によりリパーゼを固定化する場合、担体の例としては、炭酸カルシウム（CaCO₃）粉末、イオン交換樹脂、ポリウレタンフォーム、セラミック、多糖類（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなど）の誘導体、ポリアクリルアミド、活性炭、ベントナイト、珪藻土、キチン、キトサンなどが挙げられる。担体は、好ましくは、炭酸カルシウム粉末、イオン交換樹脂、珪藻土、セラミック、ベントナイト、キトサンであり、より好ましくは、炭酸カルシウム粉末である。
【００３４】
架橋法によりリパーゼを固定化する場合、架橋のために、通常は、２個以上の官能基を有する、水可溶性の２官能基試薬を用いる。このような試薬の例としては、グルタルアルデヒド、イソシアナート誘導体、ビスジアゾベンジジン、N,N'-ポリメチレンビスヨードアセトアミド、N,N'-エチレンビスマレインイミドなどが挙げられる。２官能性試薬としては、グルタルアルデヒドおよびイソシアナート誘導体が好ましい。
【００３５】
包括法によりリパーゼを固定する場合、例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル、ケイ素樹脂、デンプンマトリックス、コンニャク粉、ウレタン樹脂ポリマー、アルギン酸カルシウム、寒天などを用いる格子型包括法、ならびにナイロン、ポリウレア、フェニルシロキサンのはしご形重合体、ポリスチレン、エチルセルロース、コロジオン、硝酸セルロース、ブチル酢酸セルロースなどを用いるマイクロカプセル型包括法により固定化し得る。包括法としては、ポリアクリルアミドゲル、ウレタン樹脂ポリマー、アルギン酸カルシウム、および寒天を用いる方法が好ましい。酵素の固定化法については、例えば、千畑一郎編、「固定化酵素」、株式会社講談社、9-85頁、1975に詳細に説明されている。
【００３６】
2.2 （ｎ−６）系ＤＰＡおよび／またはＤＨＡを含む油脂
本発明においては、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の少なくとも一方を含む油脂として、これらの高度不飽和脂肪酸を所望の量含む任意の油脂を使用し得る。油脂すなわちトリグリセリドにおいては、少なくとも２位に（ｎ−６）系ＤＰＡまたはＤＨＡが結合していることが好ましい。従って、２位のみ、１位および２位、または２位および３位にＤＰＡまたはＤＨＡを含む油脂が好ましい。
【００３７】
このような油脂の例としては、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の生産能を有する微生物の培養物から得られる油脂が挙げられる。もっとも、本発明は微生物由来の油脂に限定はされず、イワシ、サバ、サンマ、サケなどから採取される魚油、アザラシなどから採取される動物油なども使用し得る。
【００３８】
油脂を採取するために培養される微生物の例としては、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の生産能を有する、スラウストキトリウム科（Thraustochytiidae）に分類される微生物、好ましくは、ウルケニア属、シゾキトリウム属、またはスラウストキトリウム属に分類される微生物、より好ましくはウルケニア属に分類される微生物が挙げられる。ウルケニア属の微生物として好ましい例は、本発明者らが海水から分離した、ウルケニア属ＳＡＭ２１７９株およびＳＡＭ２１８０株である（WO 98/03671）。これらの菌株のうち、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡを特に高含有量で生産し得るのは、ＳＡＭ２１７９株である。ウルケニア属ＳＡＭ２１７９株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年７月23日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５６０１を取得している。
【００３９】
ウルケニア属ＳＡＭ２１７９株およびＳＡＭ２１８０株の菌学的性質は以下の通りである：これら微生物を、ＫＭＶ液体培地〔Fuller. M.およびA. Jaworski（編）：Zoosporic Fungi in Teaching & Research VII+303 pp., 1987,Southeastern Publishing Corporation, Athens〕において20℃暗黒下で培養すると、球形ないし卵形の細胞が観察され、また２本の鞭毛を持つ遊走子も観察される。しかしながら、網目状の裸の原形質は観察されない。よって、これら微生物は、小林義雄・今野和子：日本産水棲菌類図説〔169頁、1986年、著者自費出版〕に準拠して、Thraustochytrialesに所属する菌類であると判断される。さらに、これら微生物は、ＫＭＶ液体培地において、仮根を形成する、胞嚢を欠く、アメーバー状の細胞を形成するということからウルケニア属に属する菌類であると判断される。
【００４０】
本発明において用いる微生物は、天然から分離したウルケニア属の微生物（野性株）だけでなく、その変異株または組換え株であってもよい。即ち、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する油脂をさらに高水準で産生するように設計された変異株および組換え株の使用は本発明の範囲内にある。このような変異株または組換え株には、同じ基質を用いて培養したときに、元の野性株が産生する量と比べて、油脂中の（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の含有量が多くなるように、または総油脂量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。さらに、費用効果の優れた基質を効率よく用いて、対応する野性株と同量の（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を産生するように設計された微生物も含まれる。
【００４１】
本発明において用いる微生物を培養するには、その菌株を予め培養して得られた前培養液を、適切な液体培地または固体培地に接種し、培養する。培地に添加する炭素源、窒素源、微量栄養源などの培地成分、ならびにｐＨ、温度などの培養条件は、公知の条件から選択される。（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の含有量に悪影響を与えない限り、これらの条件は特に限定されない。
【００４２】
（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方の生産を促進するために、その前駆体を培地に添加することができる。前駆体としては、例えば、テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸等の脂肪酸、またその塩（例えば、ナトリウム塩やカリウム塩）もしくはエステルを挙げることができる。さらに、これら脂肪酸を構成成分として含む油脂（例えば、オリーブ油、大豆油、綿実油、ヤシ油）等も添加することができる。これらは、単独でまたは組合せて用いることができる。
【００４３】
炭素源、窒素源、前駆体などの培地への添加は、培養開始前または培養中に行うことができる。また、これらの添加は、一回または複数回で、あるいは連続的に行うことができる。（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する油脂を実用上好ましい収率で得るには、液体培地を用いて通気撹拌培養することが好ましい。培養には、通常の撹拌式発酵槽または気泡塔型培養装置を使用することができる。
【００４４】
このように培養して、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する油脂が菌体内に生成および蓄積される。液体培地を使用した場合には、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液もしくはその殺菌した培養液、培養終了時の培養液もしくはその殺菌した培養液、またはそれぞれの培養液から集菌した培養菌体もしくはその乾燥物から、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する油脂を採取する。培養菌体からの油脂の採取は、例えば、次のようにして行う。
【００４５】
培養終了後、遠心分離、濾過等の常用の固液分離手段により、培養液から培養菌体を得る。菌体を十分水洗する。好ましくは、分離した菌体を乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥菌体を、例えばダイノミルや超音波などによリ破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としては、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができる。また、メタノールと石油エーテルとの交互抽出、クロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。減圧下で抽出物から有機溶媒を留去することにより、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を高濃度で含有する油脂が得られる。
【００４６】
上記の方法に代えて、湿菌体を用いて抽出を行うこともできる。この場合には、メタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、またはこれらアルコールと水および／または他の溶媒とからなる水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同様である。
【００４７】
このようにして得られた脂質中には、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方が、中性脂質（例えば、トリグリセリド）および極性脂質（例えば、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール）の形で存在している。この脂質からの、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する油脂の精製は、常法により、例えば冷却分離法、カラムクロマトグラフィーなどにより行い得る。
【００４８】
2.3 中鎖脂肪酸
中鎖脂肪酸は、約８〜12個の炭素を有する飽和または不飽和の脂肪酸である。飽和脂肪酸が好ましい。飽和の中鎖脂肪酸の例としては、カプリル酸〔８：０〕、カプリン酸〔１０：０〕、およびラウリン酸〔１２：０〕が挙げられる。中鎖脂肪酸は、天然油脂原料、例えば、ココナツ油またはパーム核油由来の分画物として入手できる。本発明においては、天然の油脂から豊富にかつ安価に入手できるため、中鎖脂肪酸として特にカプリル酸が好ましい。
【００４９】
３．構造脂質の製造
（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の少なくとも一方を含む油脂、リパーゼ、および中鎖脂肪酸を混合し、撹拌または振盪してアシドリシス反応を進行させることにより、目的とする構造油脂が得られる。
【００５０】
中鎖脂肪酸の量は、油脂の重量を１００重量部として、通常、約１０〜１０００重量部であり、好ましくは、約１５０〜５００重量部であり、より好ましくは、約２００〜３００重量部である。リパーゼの量は、油脂１ｇあたり、通常、約１００〜１０００００Ｕ、好ましくは、約１０００〜５００００Ｕ、より好ましくは、約５０００〜１００００Ｕである。
【００５１】
ここで、リパーゼについては、加水分解により毎分１μmolの脂肪酸を生産する酵素量を、１Ｕと定義する。リパーゼの酵素量は、例えば、次の方法により測定される。まず、100mlサンプル瓶にオリーブ油2.0ml、0.05M CaCl₂水溶液1.0ml、および0.1M 酢酸緩衝液（pH5.6）10mlを加える。この混合液を30℃±0.1℃の反応装置に入れ、500rpmで撹拌しながら10分間予備加温する。酵素試料をサンプル瓶に加えて撹拌を続け、１時間反応させた後、エタノール40mlを加えて反応を停止させる。反応停止後、サンプル瓶に0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液を、pHが10となるまで添加することにより、滴定を行う。このとき、試料を加えないこと以外は同じ手順で、同時に空試験を行う。測定後、以下の式により、酵素の加水分解活性を算出する：
Ａ＝（ａ−ｂ）×ｆ×50×1/60×1/S
ただし、Ａ：加水分解活性（U/mgまたはU/ml）
ａ：試料の測定に要した0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液（ml）
ｂ：空試験の測定に要した0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液（ml）
ｆ：0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液のファクター
Ｓ：試料の量（mgまたはml）
50：0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液１mlに相当する脂肪酸量（μmol）
60：反応時間（分）。
【００５２】
油脂、リパーゼ、および中鎖脂肪酸の混合物は、さらに他の物質を含んでいてもよい。例えば、混合物を、ヘキサン、エーテル、エステルなどの溶媒に溶解してもよい。有機溶媒は人体に悪影響を及ぼすので反応後に除去する必要性があり、そのために費用および手間がかかるので、無溶媒系で反応を行うことが好ましい。
【００５３】
油脂、リパーゼ、および中鎖脂肪酸の混合物を処理する温度は、特に限定されないが、通常、約10℃〜50℃、好ましくは約20℃〜40℃、より好ましくは約25〜35℃である。上記の混合物を反応させる時間は、特に限定されないが、通常、約１〜500時間、好ましくは約10〜300時間、より好ましくは約２0〜250時間である。反応の際には、不飽和脂肪酸の酸化および水分の混入を防ぐために、反応液の入っている容器の空気を窒素置換することが好ましい。反応系に水分が混入すると、アシドリシス反応と平行して加水分解反応が進行するため、好ましくない。このような条件で油脂と中鎖脂肪酸とのアシドリシス反応を進行させることにより、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含む構造脂質が生成する。反応の進行度ならびに反応に用いた油脂に含まれる（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの量により、１位または３位のいずれかに中鎖脂肪酸が結合し、２位に（ｎ−６）系ＤＰＡまたはＤＨＡが結合したトリグリセリド；ならびに１位および３位に中鎖脂肪酸が結合し、２位に（ｎ−６）系ＤＰＡまたはＤＨＡが結合したトリグリセリドが生成し得る。
【００５４】
反応終了後、反応液をアルカリで洗浄するなどにより、遊離の脂肪酸を除去することが好ましい。生成した構造脂質の精製は、必要に応じて、上記2.2に記載した油脂の精製と同様に行うことができる。従って、構造脂質は通常、他の成分をも含有する油脂組成物として得られるが、目的とする構造脂質を純品として単離することも可能である。
【００５５】
生成した構造脂質には、構造脂質に含まれる脂肪酸全体を100モル％として、一般に、約20〜80モル％、好ましくは約40〜70モル％、より好ましくは約60〜70モル％の中鎖脂肪酸が取り込まれている。中鎖脂肪酸は、トリグリセリドの１および３位に取り込まれていることが好ましい。１および３位に中鎖脂肪酸（ＭＡ）が、そして２位に（ｎ−６）系ＤＰＡまたはＤＨＡが結合したトリグリセリド（ＭＡ−ＤＰＡ／ＤＨＡ−ＭＡ）の、１および２位に中鎖脂肪酸が、そして３位に（ｎ−６）系ＤＰＡまたはＤＨＡが結合したトリグリセリド（ＭＡ−ＭＡ−ＤＰＡ／ＤＨＡ）に対する比率（両者の和を１００％としたときの前者の割合）は、代表的には６０％以上、好ましくは６５％以上であり得るが、これらに限定はされない。
【００５６】
４．構造脂質の利用
（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する構造油脂を、種々の食品または飼料もしくは餌料に添加することにより、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの不足を補い得る油脂含有食品などが提供される。これによれば、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を、生体内の膵臓リパーゼにより分解されやすく、従って腸内で吸収され易い状態で摂取し得る。
【００５７】
上記の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品などが挙げられる。本明細書中では、食品は、固体、流動体および液体ならびにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
【００５８】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な、または健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品などを含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化および吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調整乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【００５９】
これらの食品の形態の例としては、肉、魚、ナッツなどの天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープなどの調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖など、熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリームなどの油脂食品または加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパンなどの加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布した食品などを挙げることができる。もっとも、本発明の食品は、本来油脂を含んでいる食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、めん類、ごはん、菓子類（キャンデ−、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐およびその加工品などの農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、味噌などの発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージなどの畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺんなどの水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料などであってもよい。
【００６０】
本発明の食品はまた、医薬製剤の形態、またはタンパク質（タンパク質源としては、アミノ酸バランスが良くかつ栄養価の高い乳タンパク質、大豆タンパク質、卵アルブミンなどのタンパク質が最も広く使用されるが、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物、各種アミノ酸の混合物などが使用され得る）、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料などに本発明の油脂が配合された自然流動食、半消化態栄養食および成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤などの加工形態であってもよい。本発明の食品が医薬製剤の形態である場合、本発明の食品は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、経腸栄養剤などの形態であり得る。
【００６１】
これらの食品は、公知の方法によって製造し得る。本発明の油脂組成物は、構造脂質を実質的に変性または分解させない限り、任意の段階において添加される。油脂組成物の添加量は特に限定されず、目的とする構造脂質が所望の含有量となるように適宜設定される。
【００６２】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
【００６３】
＜実施例１＞ウルケニア属微生物による油脂の製造（１）
ウルケニア属ＳＡＭ２１７９株およびＳＡＭ２１８０株を、それぞれ、容量５Ｌのジャーファーメンター型の培養槽で、以下の（１）の組成の培地３Ｌおよび以下の（２）の培養条件を用いて培養した。
【００６４】
（１）培地組成（ｇ／Ｌ）
１）グルコース：60
２）リン酸カリウム：３
３）硫酸アンモニウム：２
４）コーンスティープリカー：0.7
５）50％人工海水：１Ｌ
６）ｐＨ：4.0
（２）培養条件
１）培養温度（℃）：28
２）通気量（ＶＶＭ）：0.5
３）撹拌速度（ｒｐｍ）：300
４）ｐＨ調整：10％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウムでｐＨ４に保持した。
【００６５】
３日間の培養後、遠心分離により菌体を集めて凍結乾燥し、培地１Ｌ当たりの菌体量（重量）を求めた。次いで、この乾燥菌体にクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）混合液を菌体重量に対して100ｖ／ｗ比で加え、ガラスビーズの存在下でホモジナイズすることにより、菌体の破砕および油脂の抽出を行った。抽出液をFolch法により洗浄した後、溶媒を留去して精製油脂を得、その重量を測定した。
【００６６】
得られた精製油脂の脂肪酸組成を評価するため、油脂の一部を、10％ＨＣｌを含むメタノール溶液とジクロロメタンの等量混合液に溶解し、60℃で２時間熱処理することにより、脂肪酸メチルエステルを調製した。これをガスクロマトグラフに導入して脂肪酸組成を分析した。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の分離条件は次のようであった。
【００６７】
（３）分離条件
１）カラム：キャピラリーカラム、ＴＣ−70
ＧＬサイエンス社（GL Science Co., Ltd)、
内径0.25mm×長さ30ｍ
２）流速：0.8ml／分、100kPa（カラム頭部圧力）
３）キャリアーガス：窒素ガス
４）カラム温度：昇温モード、170〜220℃（４℃／分）
５）検出：＝ＦＩＤ
この結果を以下の表１および表２に示す。
【表１】

【００６８】
【表２】

【００６９】
以上のように、SAM2179株およびSAM2180株は、人工海水を含む培地中において、ＤＰＡ含有量およびＤＨＡ含有量の高い油脂を生産した。
【００７０】
＜実施例２＞ウルケニア属微生物による油脂の製造（２）
ウルケニア属SAM2179株について、容量５Ｌのジャーファーメンター型の培養槽で、以下の（１）の組成の培地３Ｌおよび以下の（２）の培養条件を用いて培養した。試験は２回行なった（試験１および２）。
【００７１】
（１）培地組成（ｇ／Ｌ）
１）グルコース：60
２）リン酸カリウム：３
３）硫酸アンモニウム：２
４）塩化マグネシウム：1.3
５）硫酸ナトリウム：１
６）塩化カルシウム：0.3
７）コーンスティープリカー：0.7
８）ｐＨ：4.0
（２）培養条件
１）培養温度（℃）：28
２）通気量（ＶＶＭ）：0.5
３）撹拌速度(ｒｐｍ)：300
４）ｐＨ調製：10％(ｗ／ｖ)水酸化ナトリウムでｐＨ４に保持した。
【００７２】
３日間の培養後、実施例１と同様の条件により、精製油脂を得、その重量を測定した。得られた精製油脂の脂肪酸組成は、実施例１と同様にして、ＧＣにより分析した。結果を以下の表３および表４に示す。
【表３】

【００７３】
【表４】

【００７４】
以上のように、SAM2179株は、人工海水を含まない培地中においても、ＤＰＡ含有量およびＤＨＡ含有量の高い油脂を生産した。
【００７５】
＜実施例３＞（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡを含有する構造脂質の製造 Pseudomonas sp.KWI-56株由来の粉末状リパーゼ（PSL）（クリタ工業株式会社製：加水分解活性＝56.5U/mg）500mgを、５mlの蒸留水に溶解することにより、5600U/mlのPSL溶液を調製した。このPSL溶液５mlに、固定化担体としてCaCO₃を2.5g加え、氷冷しながら10分間撹拌した。この溶液に40mlの冷アセトンを添加することにより、固定化酵素を沈澱させた後、8000rpm、４℃で20分間遠心分離し、上清を捨てて残渣を得た。残渣を乾燥することにより、使用する固定化酵素を得た。この固定化酵素の比活性は9.3U/mgであった。コントロールとして、Rhizomucor miehei由来リパーゼ（Lipozyme）を使用した。Lipozyme（登録商標）は、イオン交換樹脂を担体とする固定化酵素であり、ノボ・ノルディスク社から販売されている。
【００７６】
実施例２の試験２で得られた、（ｎ−６）系ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸を含有する精製油脂１ｇ、固定化PSL540mg（またはLipozyme 100mg）、およびカプリル酸１、２、または３ｇを混合した。この混合液を30℃で撹拌または振盪することにより、アシドリシス反応を進行させた。反応中、経時的に反応液をサンプリングした。常法に従って、反応混合物をアルカリ洗浄して脂肪酸を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより、トリグリセリドを回収した。回収したトリグリセリドについて、脂肪酸組成を分析した。
【００７７】
脂肪酸のＧＣによる分析は、実施例１と同様に行なった。結果を以下の表５ならびに図１、図２、および図３に示す。
【００７８】
表５において、固定化PSLについての結果は、油脂とカプリル酸との重量比を１：３として144時間反応させた後に得られた構造脂質に含まれる脂肪酸の組成を示す。Lipozymeについての結果は、油脂とカプリル酸との重量比を１：２として144時間反応させた後に得られた構造脂質に含まれる脂肪酸の組成を示す。
【００７９】
Lipozymeを用いた場合、カプリル酸の取り込みは約23％であるのに対し、固定化PSLを用いた場合、カプリル酸の取り込みは約65％であった。つまり、固定化PSLでは、Lipozymeの場合の約３倍まで、トリグリセリドへのカプリル酸の取り込みが増加し得ることが示された。
【表５】

【００８０】
図１は、油脂とカプリル酸との重量比による、カプリル酸取り込み量への影響を示すグラフである。図１ａは、固定化PSLを用いた場合の結果を示し、図１ｂは、Lipozymeを用いた場合の結果を示す。それぞれ、反応に用いた油脂とカプリル酸との重量比が、１：１の場合（○）、１：２の場合（△）、および１：３の場合（□）を示す。
【００８１】
図２は、アシドリシス反応の進行に伴う、油脂に含まれる脂肪酸組成の変化を示すグラフである。図２ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いた場合の結果を示す。図２ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いた場合の結果を示す。
【００８２】
図１および図２から、Lipozymeを用いた場合、油脂へのカプリル酸の取り込み量は２３％程度が限度であり、過剰のカプリル酸を用いても取り込み量が増加しないことがわかる。これに対して、固定化PSLを用いた場合、油脂へのカプリル酸の取り込み量が著しく増加することがわかる。油脂とカプリル酸との重量比が１：３である場合、２１６時間で約７７％のカプリル酸が油脂に取り込まれた。
【００８３】
図３は、ＧＣによるクロマトグラムである。図３ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いて144時間反応させた結果を示す。図３ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いて144時間反応させた結果を示す。図３ｃは、未処理の油脂についての結果を示す。図３において、Ｃ２７は８−８−８を示し、Ｃ３５は８−８−１６を示し、Ｃ４１は８−８−２２または８−１４−１６を示し、Ｃ４９は８−１６−２２または１４−１６−１６を示し、Ｃ５１は１６−１６−１６を示し、Ｃ５５は８−２２−２２または１４−１６−２２を示し、Ｃ５７は１６−１６−２２を示し、そしてＣ６３は１６−２２−２２を示す。（ここで、８はカプリル酸、１４はミリスチン酸、１６はパルミチン酸、２２はＤＨＡまたはＤＰＡを示す。ただし、数字の順序はトリグリセリドにおける結合位置とは無関係である。）これらのピークの積分強度比を、以下の表６に示す。
【表６】

【００８４】
図３および表６により、Lipozymeを用いた場合、望ましい構造脂質を含むＣ４１化合物の含有量は約１９％であり、他にＣ４９、Ｃ５５の化合物が大量に残存していることがわかる。これに対して、固定化PSLを用いた場合、Ｃ４１化合物の含有量は約３８％であり、Ｃ４９、Ｃ５５はそれぞれ、約７〜８％まで減少した。またＣ２７（8-8-8）の含有量が約２９％に増加した。このことから、Lipozymeを用いた場合に比べて、固定化PSLを用いた場合、同じ油脂を出発原料として、目的とするＣ４１化合物が約２倍多い構造脂質を製造し得ることが示される。
【００８５】
＜実施例４＞ＨＰＬＣによる構造脂質の分子種分析
実施例３で得られた構造脂質を、銀イオン結合型カラムを用いたＨＰＬＣにより、トリグリセリドの分子種について分析した。
【００８６】
(1)分析条件
１）カラム：CHROMSPHER 5 LIPIDS(250×4.6mm)
CHROMAPACK社製
２）流速：0.65ml/分
３）溶離液（容量比）：
Ａ）ヘキサン：プロパノール：アセトニトリル＝350:100:2.75
Ｂ）ヘキサン：プロパノール：アセトニトリル＝350:100:10
０〜３分Ａ１００％
３〜１３分Ａ１００→０％／Ｂ０％→１００％
１３〜３３分Ｂ１００％
４）検出：UV206nm
結果を図４に示す。図４ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いて144時間反応させた結果を示す。図４ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いて144時間反応させた結果を示す。図４において、符号を付したピークは、それぞれ以下のトリグリセリドを示す：
1＝飽和脂肪酸のみを有する 9＝ 16-DPA-DPA
トリグリセリド 10＝ 8-DPA-DPA
2＝ 8-16-DPA 11＝ 16-DHA-DPA
3＝ 8-DPA-8 12＝ 8-DHA-DPA
4＝ 8-8-DPA 13＝ 16-DHA-DHA
5＝ 8-DHA-16 14＝ 8-DHA-DHA
6＝ 8-16-DHAまたは16-8-DHA 15＝ DPA-DPA-DHA
7＝ 8-DHA-8 16＝ DPA-DHA-DHA
8＝ 8-8-DHA 17＝ DHA-DHA-DHA
（ここで、８はカプリル酸、１６はパルミチン酸を示す。ピーク９〜16については、位置異性体の区別はない。）
【００８７】
図４から、固定化PSLを用いることにより、Lipozymeを用いた場合に比べて、２位にＤＰＡまたはＤＨＡを有し、かつ１および３位にカプリル酸が取り込まれた分子種である構造油脂（ピーク３および７）が多量に得られることが示される。
【００８８】
＜実施例５＞（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡ含有ミルクの調製
実施例３で得られた油脂組成物1.2ｇを、粉末ミルク100ｇに混合することにより、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡ含有ミルクを調製した。このミルクの全脂肪酸に対する（ｎ−６）系ＤＰＡの割合は0.27％、ＤＨＡの割合は0.84％となった。従って、従来の調製乳に不足していた（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡを構造脂質として含有した調製乳が得られた。
【００８９】
＜実施例６＞（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡ含有カプセルの調製
【表７】

【００９０】
表７に示す成分からなるソフトカプセル剤の中に、実施例３で得られた（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡを含有する構造脂質を含む油脂300mgを常法により充填し、ソフトカプセル剤を得た。このソフトカプセルは、それ自体栄養補助食品として、または栄養補助食品の原材料として有用である。
【００９１】
＜実施例７＞（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡを含有する飲料の調製
容器中に市販のプレーンヨーグルト50ｇ、実施例３で得られた、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を含有する構造脂質を含む油脂50ｇ、ならびにβ−シクロデキストリン１ｇを入れた。これを約３分間撹拌して乳化させ、Ｗ／Ｏ／Ｗ、Ｏ／Ｗ／Ｏ型などが混在する、エマルジョンを得た。このエマルジョンを水で500倍に希釈することにより、機能性飲料を得た。
【００９２】
【発明の効果】
本発明の製造方法では、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を多量に含有する油脂を、中鎖脂肪酸の存在下で、細菌由来のリパーゼを用いて処理する工程を含む。アシドリシス反応の触媒活性が高い細菌由来のリパーゼを用いることにより、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を主として２位に含む構造脂質を、効率良く製造することができる。
【００９３】
本発明の油脂組成物は、生体内で重要な生理活性を果たし得る高度不飽和脂肪酸である（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を、特に生体内での吸収性の高い構造脂質として含んでいる。そのため、本発明の油脂組成物は、これらの高度不飽和脂肪酸の少なくとも一方を必要とする各種製品（乳児用調製乳、未熟児用調製乳、幼児用食品、老人用食品、栄養補助食品、機能性食品、経腸栄養剤、動物用飼料または動物用飼料添加物、微小餌料生物用餌料など）に、（ｎ−６）系ＤＰＡおよびＤＨＡの少なくとも一方を、構造脂質として、安定的にかつ効率よく供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、油脂とカプリル酸との重量比による、カプリル酸取り込み量への影響を示すグラフである。図１ａは、固定化PSLを用いた場合の結果を示し、図１ｂは、Lipozymeを用いた場合の結果を示す。
【図２】図２は、アシドリシス反応の進行に伴う、油脂に含まれる脂肪酸組成の変化を示すグラフである。図２ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いた場合の結果を示す。図２ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いた場合の結果を示す。
【図３】図３は、ＧＣによるクロマトグラムである。図３ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いて144時間反応させた結果を示す。図３ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いて144時間反応させた結果を示す。図３ｃは、未処理の油脂についての結果を示す。
【図４】図４は、ＨＰＬＣによるクロマトグラムである。図４ａは、油脂とカプリル酸との重量比を１：３とし、固定化PSLを用いて144時間反応させた結果を示す。図４ｂは、油脂とカプリル酸との重量比を１：２とし、Lipozymeを用いて144時間反応させた結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a structured lipid containing (n-6) -based docosapentaenoic acid and / or a structured lipid containing docosahexaenoic acid, an oil / fat composition containing the structured lipid obtained by this method, and this oil / fat composition About the use of.
[0002]
[Prior art]
From recent research in the field of physiochemistry, fats and oils in which medium-chain fatty acids (C8 to C12) are bonded to the 1- and 3-positions of fats and oils in which long-chain fatty acids (C18 or higher) are bonded to the 1- and 3-positions of triglycerides It has been found that it is easily degraded by in vivo pancreatic lipase and therefore easily absorbed in the intestine [Oil Chemistry, Vol. 37, p781, 1995]. Among fatty acids, highly unsaturated fatty acids such as docosahexaenoic acid (DHA) and docosapentaenoic acid (DPA) are considered to have various physiological activities in the animal body. Therefore, structural lipids in which medium-chain fatty acids are bonded to the 1st and 3rd positions and highly unsaturated fatty acids are bonded to the 2nd position are combined with the highly unsaturated fatty acids that are useful fatty acids and are easily absorbed in the intestine. It attracts attention.
[0003]
Polyunsaturated fatty acids are classified into (n-3) highly unsaturated fatty acids and (n-6) highly unsaturated fatty acids, depending on the position of the unsaturated bond contained.
In animals, (n-3) highly unsaturated fatty acids and (n-6) highly unsaturated fatty acids belong to different metabolic pathways. Linoleic acid having 18 carbon atoms [18: 2 (n-6)] and α-linolenic acid [18: 3 (n-3)] are widely present as main components of vegetable oils. On the other hand, animals do not have the ability to biosynthesize linoleic acid and α-linolenic acid. Therefore, animals require these (n-3) and (n-6) polyunsaturated fatty acids as essential fatty acids. Ingested polyunsaturated fatty acids such as linoleic acid are further converted to polyunsaturated fatty acids having a higher degree of unsaturation and a higher carbon number through repeated desaturation and carbon chain extension. However, in adult patients, infants, elderly people, etc., the function of the desaturation reaction in biosynthesis often decreases, and therefore, highly unsaturated fatty acids with a high degree of unsaturation and a high carbon number tend to be deficient.
[0004]
Examples of (n-3) highly unsaturated fatty acids include eicosapentaenoic acid [20: 5 (n-3)], docosahexaenoic acid [22: 6 (n-3)], and the like. These (n-3) polyunsaturated fatty acids are known to have physiological activities such as anti-inflammatory activity and antithrombotic activity, and are therefore attracting attention as materials for functional foods and pharmaceuticals.
[0005]
On the other hand, examples of (n-6) highly unsaturated fatty acids include γ-linolenic acid [18: 3 (n-6)], dihomo-γ-linolenic acid [20: 3 (n-6)], and arachidone. Acid [20: 4 (n-6)] and the like are included. These (n-6) series polyunsaturated fatty acids are attracting attention as intermediate metabolites to group 1 or group 2 of eicosanoids such as prostaglandins and leukotrienes called local hormones.
[0006]
In the animal body, although it varies depending on tissues, in general, docosahexaenoic acid is used as the (n-3) series highly unsaturated fatty acid, and arachidonic acid is used as the final metabolite as the (n-6) series highly unsaturated fatty acid. It has become. In the animal body, the content of (n-6) docosapentaenoic acid is extremely small.
[0007]
Docosahexaenoic acid (DHA), the final metabolite of the (n-3) system, is specifically present in the brain and retina of animals. DHA is thought to perform some function in these organs. In recent years, the discovery of raw materials containing high concentrations of DHA, such as tuna orbital fat, and the development of advanced purification technology for fatty acids has led to research on the elucidation and practical application of DHA's bioactive functions. It is being actively promoted. Physiologically active functions of DHA include blood cholesterol lowering action, anti-coagulant action, anticancer action, and action on improving memory learning ability and preventing senile dementia in relation to brain metabolic system, etc. Became clear. For these reasons, DHA is also expected as a therapeutic agent for Alzheimer's disease. It was also revealed that DHA is a growth essential fatty acid for fry. For practical use, DHA is used as a material for health food, baby milk, and the like.
[0008]
When the content of (n-6) docosapentaenoic acid (DPA) in the fatty acid composition in the animal body is large, the (n-3) essential fatty acid is often deficient. This is considered that the (n-6) highly unsaturated fatty acid compensates for the function of the deficient (n-3) highly unsaturated fatty acid. In particular, as a compensation for DHA, a plurality of examples in which (n-6) DPA is produced in vivo have been reported. This suggests that (n-6) -based DPA has some physiological role. (N-6) DPA can also be expected as an antagonist of arachidonic acid.
[0009]
(N-6) -based DPA is not present at all in oils and fats generally supplied, and is slightly contained in fish oil together with (n-3) -based DPA. However, because the content of (n-6) DPA in fish oil is as small as about 1%, it is not easy to efficiently separate and concentrate (n-6) DPA.
[0010]
As described above, fish oil has DHA and (n-6) -based DPA having remarkable physiological functions, and a lot of knowledge about the purification method has been obtained. Fish oil, on the other hand, has a low content of (1) DHA and (n-6) DPA; (2) migratory fish is mainly used as a raw material, but the catch of migratory fish varies depending on the season, so it is stable. (3) Has a peculiar odor; and (4) Polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA) are included, so that they are easily oxidized and have a stable quality. There are drawbacks such as being difficult to obtain.
[0011]
Examples of a source other than fish oil of at least one of DPA and DHA include fats and oils (microbial oil) accumulated in cultured cells of microorganisms capable of producing these highly unsaturated fatty acids. Examples of these microorganisms include bacteria Vibrio marinus ATCC 15381 isolated from the deep sea, Vibrio bacteria isolated from the intestines of deep sea fish, Thraustochytrium aureum ATCC 34304, Thraustochytrium sp. ATCC 28211, ATCC 20890 and ATCC 20891, Schizochytrium sp. ATCC 20888 and ATCC 20889 (US Patent No. 5,340,742), Thraustochytrium sp. SR21 Stock [Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, Vol. 69, Special Issue, July 5, 1995], Japonochytrium sp. ATCC 28207 (Japanese Patent Laid-Open No. 1-195988), Cycloterra, a microalgae・ Cyclotella cryptica, Crypthecodinium cohnii [Special Table Hei 5-503425 Distribution], etc. Emiriania [Hei 5-308978 Patent Publication] are known.
[0012]
Any of the above microorganisms has drawbacks such as a low production rate of DHA and / or DPA, a long culture time, and a special medium or culture conditions required for production. In particular, when using algae such as Emilia, there is a drawback that even if the amount of DHA produced is high, the process is complicated because it requires light for culturing and is not suitable for industrial production.
[0013]
Furthermore, regardless of which of the above fats and oils is used, conventionally, a structural lipid containing at least one of DPA and DHA, in particular, a structure in which any of these polyunsaturated fatty acids is mainly bound only to the 2-position of triglyceride. It has been difficult to produce lipids efficiently.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is intended to solve the above-mentioned problems, and is used for industrial scale use for efficiently producing a structured lipid containing at least one of (n-6) docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. The object is to provide a suitable method. Another object of the present invention is to provide an oil / fat composition containing the structured lipid obtained by this method, and a food using the oil / fat composition.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent efforts to solve such problems, the inventors of the present invention have developed a lipase derived from bacteria using an oil containing at least one of (n-6) docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, particularly an oil produced by microorganisms. It was found that a structured lipid containing at least one of (n-6) -based docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid can be produced in a good yield by the treatment with the use of, and the present invention has been completed.
[0016]
The present invention relates to a method for producing a structural lipid containing at least one of (n-6) -based docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, and (n-6) an oil containing at least one of docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid Is provided with a lipase derived from bacteria in the presence of medium chain fatty acids.
[0017]
In one embodiment, the lipase is a lipase derived from Pseudomonas. In a preferred embodiment, the lipase is a lipase derived from Pseudomonas strain KWI-56.
[0018]
In another embodiment, the fats and oils are obtained from a culture of microorganisms capable of producing at least one of (n-6) -based docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. In a preferred embodiment, the microorganism is a microorganism belonging to the Thraustochytrium family. In an even more preferred embodiment, the microorganism is a microorganism belonging to the genus Urkenia, Schizochytrium, or Thraustochytrium. In an even more preferred embodiment, the microorganism is a microorganism belonging to the genus Urkenia. In an even more preferred embodiment, the microorganism is Urkenia SAM2179.
[0019]
The present invention also provides an oil / fat composition containing a structured lipid obtained by any of the methods described above.
[0020]
In one embodiment, the structured lipid is a triglyceride in which medium-chain fatty acids are bound only at position 1, only position 3, or only positions 1 and 3. In a preferred embodiment, the medium chain fatty acid is caprylic acid.
[0021]
The present invention further provides nutritional supplements, health foods or functional foods, infant foods, infant formulas or formulas for premature infants, and foods for the elderly, containing any of the above oil compositions. To do.
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the following, the present invention will be described in detail.
[0023]
1. Definition of terms
In this specification, “docosapentaenoic acid” refers to (n-6) -based docosapentaenoic acid [22: 5 (n-6)] unless otherwise specified. DPA is an abbreviation for docosapentaenoic acid.
[0024]
In this specification, “docosahexaenoic acid” refers to (n-3) -based docosahexaenoic acid [22: 6 (n-3)] unless otherwise specified. DHA is an abbreviation for docosahexaenoic acid.
[0025]
In the present specification, the “lipid” refers to a simple lipid containing a compound in which a fatty acid and an alcohol are ester-linked (for example, glyceride) or an analog thereof (for example, cholesterol ester), and the like, and in addition, phosphoric acid, sulfuric acid, sugar , A complex lipid containing an amino group and the like, and a lipid hydrolyzate and a derived lipid that does not dissolve in water.
[0026]
In the present specification, the terms “oil”, “oil” and “triglyceride” are used interchangeably.
[0027]
As used herein, “structured lipid” refers to a non-natural triglyceride that has been modified to include a mixture of short and / or medium chain fatty acids and long chain fatty acids. Here, the short chain fatty acid refers to a fatty acid having about 7 or less carbons, the medium chain fatty acid refers to a fatty acid having about 8 to 12 carbons, and the long chain fatty acid is about 13 or more. Refers to a fatty acid having a carbon.
[0028]
In the present specification, the “oil composition” refers to a composition containing oil. The oil / fat composition usually contains about 10% or more by weight of oil or fat based on the total weight of the composition, preferably about 20% or more, more preferably about 50% or more, even more preferably about 70%. % Of fats and oils are contained.
[0029]
2. material
2.1 Lipase
Lipases catalyze various reactions such as ester hydrolysis, ester synthesis, transesterification (acidolysis, alcoholysis, transesterification, aminolysis). In the present invention, a lipase derived from bacteria can efficiently produce structured lipids by utilizing the ability to catalyze an acidolysis reaction with high activity. The acidolysis reaction is represented by the following reaction formula 1.
[Chemical 1]

[0030]
In the present invention, lipase derived from any bacteria can be used. Bacterial lipases are usually not regioselective in the acidolysis reaction with triglycerides and have a very low activity of catalyzing the acidolysis reaction of long chain fatty acids having about 20 or more carbons. This is probably because bacteria themselves do not synthesize long chain fatty acids having about 20 or more carbons, and thus it is difficult to catalyze the reaction of such long chain fatty acids. Therefore, when triglyceride containing DPA and / or DHA is used as a substrate for the acidolysis reaction, the reaction for shorter chain fatty acids can be selectively catalyzed while substantially maintaining these DPA and / or DHA. Examples of bacteria for collecting lipase are classified into genera such as Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Staphylococcus, and Acinetobacter. Bacteria are mentioned, preferably bacteria classified as Pseudomonas, more preferably Pseudomonas sp. KWI-56 strain.
[0031]
The lipase may be a lipase collected by culturing bacteria or a commercially available lipase. When collecting lipase from bacteria, methods known in the art can be used. Purified lipase is preferred, and its purity may preferably be about 40% or higher, more preferably about 60% or higher, but may be unpurified lipase.
[0032]
The lipase may be used without being immobilized. However, an immobilized enzyme is preferable because it is advantageous in that the enzyme reaction can be performed continuously and the enzyme can be recovered and reused after the reaction. Any method can be used for immobilization as long as the activity of the lipase is not significantly reduced. Examples of immobilization methods include carrier binding methods, cross-linking methods, entrapment methods, and combinations thereof known in the art.
[0033]
When lipase is immobilized by a carrier binding method, examples of carriers include calcium carbonate (CaCO _Three ) Powders, ion exchange resins, polyurethane foams, ceramics, derivatives of polysaccharides (for example, cellulose, dextran, agarose, etc.), polyacrylamide, activated carbon, bentonite, diatomaceous earth, chitin, chitosan and the like. The carrier is preferably calcium carbonate powder, ion exchange resin, diatomaceous earth, ceramic, bentonite, or chitosan, and more preferably calcium carbonate powder.
[0034]
When lipase is immobilized by a crosslinking method, a water-soluble bifunctional reagent having two or more functional groups is usually used for crosslinking. Examples of such a reagent include glutaraldehyde, isocyanate derivatives, bisdiazobenzidine, N, N′-polymethylenebisiodoacetamide, N, N′-ethylenebismaleimide and the like. As the bifunctional reagent, glutaraldehyde and isocyanate derivatives are preferred.
[0035]
When fixing lipase by the inclusion method, for example, polyacrylamide gel, polyvinyl alcohol gel, silicon resin, starch matrix, konjac powder, urethane resin polymer, calcium alginate, agar, etc., as well as nylon, polyurea, phenyl It can be immobilized by a microcapsule-type inclusion method using a ladder polymer of siloxane, polystyrene, ethyl cellulose, collodion, cellulose nitrate, butyl cellulose acetate or the like. As a comprehensive method, a method using polyacrylamide gel, urethane resin polymer, calcium alginate, and agar is preferable. The enzyme immobilization method is described in detail in, for example, edited by Ichiro Chibata, “Immobilized Enzyme”, Kodansha Co., Ltd., pages 9-85, 1975.
[0036]
2.2 Fats and oils containing (n-6) DPA and / or DHA
In the present invention, any oil containing a desired amount of these highly unsaturated fatty acids can be used as the oil containing at least one of (n-6) docosapentaenoic acid (DPA) and docosahexaenoic acid (DHA). . In oils and fats, that is, triglycerides, (n-6) -based DPA or DHA is preferably bound to at least the 2-position. Accordingly, oils containing DPA or DHA at the 1st and 2nd positions, or the 2nd and 3rd positions only at the 2nd position are preferable.
[0037]
Examples of such fats and oils include fats and oils obtained from a culture of microorganisms having the ability to produce at least one of (n-6) -based DPA and DHA. However, the present invention is not limited to microorganism-derived oils and fats, and fish oil collected from sardines, mackerel, saury, salmon and the like, and animal oil collected from seals and the like can also be used.
[0038]
Examples of microorganisms cultured for collecting fats and oils include microorganisms classified as Thraustochytiidae, preferably Urkenia, having the ability to produce at least one of (n-6) series DPA and DHA. Examples include microorganisms classified into the genus, Schizochytrium, or Thraustochytrium, more preferably microorganisms classified into the genus Urkenia. Preferred examples of microorganisms belonging to the genus Urkenia are the genus Urkenia SAM2179 and SAM2180 which were isolated from seawater by the present inventors (WO 98/03671). Among these strains, SAM2179 strain can produce (n-6) -based DPA and DHA with particularly high content. The Urkenia SAM2179 strain was deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on July 23, 1996, and has received the deposit number FERMBP-5601.
[0039]
The bacteriological properties of Urkenia sp. SAM2179 and SAM2180 are as follows: These microorganisms were transformed into KMV liquid medium [Fuller. M. and A. Jaworski (ed.): Zoosporic Fungi in Teaching & Research VII + 303 pp. , 1987, Southeastern Publishing Corporation, Athens], when cultured in the dark at 20 ° C., spherical or oval cells are observed, and zoospores with two flagella are also observed. However, a net-like naked protoplasm is not observed. Therefore, these microorganisms are judged to be fungi belonging to Thraustochytriales, based on Yoshio Kobayashi and Kazuko Konno: Japanese Minamata Fungi Illustration (page 169, 1986, self-published by the author). Furthermore, these microorganisms are judged to be fungi belonging to the genus Urkenia because they form temporary roots, lack alveoli, and form amoeba-like cells in a KMV liquid medium.
[0040]
The microorganism used in the present invention may be not only a microorganism belonging to the genus Urkenia (wild strain) isolated from nature, but also a mutant or recombinant strain thereof. That is, it is within the scope of the present invention to use mutants and recombinant strains designed to produce oils and fats containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA at a higher level. Such a mutant or recombinant strain has at least one of (n-6) -based DPA and DHA in fats and oils compared to the amount produced by the original wild strain when cultured using the same substrate. Those designed to increase the content and / or the total amount of fats and oils are included. Also included are microorganisms designed to efficiently use cost-effective substrates to produce the same amount of (n-6) -based DPA and DHA as the corresponding wild strain.
[0041]
In order to culture the microorganism used in the present invention, a preculture solution obtained by culturing the strain in advance is inoculated into an appropriate liquid medium or solid medium and cultured. Medium components such as a carbon source, a nitrogen source, and a micronutrient source added to the medium, and culture conditions such as pH and temperature are selected from known conditions. These conditions are not particularly limited as long as the content of at least one of (n-6) -based DPA and DHA is not adversely affected.
[0042]
In order to promote production of at least one of (n-6) -based DPA and DHA, the precursor thereof can be added to the medium. Examples of the precursor include hydrocarbons such as tetradecane, hexadecane, and octadecane, fatty acids such as oleic acid, linoleic acid, and α-linolenic acid, and salts (for example, sodium salt and potassium salt) or esters thereof. it can. Furthermore, fats and oils (for example, olive oil, soybean oil, cottonseed oil, coconut oil) containing these fatty acids as components can be added. These can be used alone or in combination.
[0043]
Carbon sources, nitrogen sources, precursors, and the like can be added to the medium before or during the start of the culture. Further, these additions can be performed once or a plurality of times or continuously. In order to obtain an oil and fat containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA in a practically preferable yield, it is preferable to perform aeration and agitation culture using a liquid medium. A normal stirred fermenter or bubble column type culture apparatus can be used for the culture.
[0044]
By culturing in this way, fats and oils containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA are generated and accumulated in the microbial cells. When a liquid medium was used, the culture broth during the production of fats and oils by cell culture or the sterilized culture broth, the culture broth at the end of the culture or the sterilized culture broth, or collected from each culture broth Oils and fats containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA are collected from the cultured cells or dried products thereof. The collection of fats and oils from the cultured cells is performed, for example, as follows.
[0045]
After completion of the culture, cultured cells are obtained from the culture solution by conventional solid-liquid separation means such as centrifugation and filtration. Wash the cells thoroughly with water. Preferably, the separated cells are dried. Drying can be performed by freeze drying, air drying, or the like. The dried cells are crushed with, for example, dynomill or ultrasonic waves, and then extracted with an organic solvent, preferably in a nitrogen stream. As the organic solvent, ether, hexane, methanol, ethanol, chloroform, dichloromethane, petroleum ether, or the like can be used. Good results can also be obtained by alternate extraction of methanol and petroleum ether and extraction using a one-layer solvent of chloroform-methanol-water. By distilling off the organic solvent from the extract under reduced pressure, an oil containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA at a high concentration is obtained.
[0046]
It can replace with said method and can also extract using a wet cell. In this case, a solvent compatible with water such as methanol or ethanol, or a mixed solvent compatible with water composed of these alcohols and water and / or other solvents is used. Other procedures are the same as described above.
[0047]
In the lipid thus obtained, at least one of (n-6) -based DPA and DHA is neutral lipid (for example, triglyceride) and polar lipid (for example, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine). , Phosphatidylinositol). Purification of oils and fats containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA from this lipid can be performed by a conventional method, for example, a cooling separation method, column chromatography, or the like.
[0048]
2.3 Medium chain fatty acids
Medium chain fatty acids are saturated or unsaturated fatty acids having about 8-12 carbons. Saturated fatty acids are preferred. Examples of saturated medium chain fatty acids include caprylic acid [8: 0], capric acid [10: 0], and lauric acid [12: 0]. The medium chain fatty acid is available as a fraction derived from a natural oil / fat raw material, for example, coconut oil or palm kernel oil. In the present invention, caprylic acid is particularly preferable as the medium chain fatty acid because it can be obtained from natural fats and oils at a low price.
[0049]
3. Production of structured lipids
(N-6) An oil and fat containing at least one of docosapentaenoic acid (DPA) and docosahexaenoic acid (DHA), a lipase, and a medium chain fatty acid are mixed and stirred or shaken to advance the acidolysis reaction. To obtain a structured oil.
[0050]
The amount of the medium chain fatty acid is usually about 10 to 1000 parts by weight, preferably about 150 to 500 parts by weight, more preferably about 200 to 300 parts by weight, with 100 parts by weight of the fat. is there. The amount of lipase is usually about 100 to 100,000 U, preferably about 1000 to 50000 U, more preferably about 5000 to 10,000 U per 1 g of fat.
[0051]
Here, for lipase, the amount of enzyme that produces 1 μmol of fatty acid per minute by hydrolysis is defined as 1 U. The enzyme amount of lipase is measured, for example, by the following method. First, olive oil 2.0ml, 0.05M CaCl in a 100ml sample bottle ₂ Add 1.0 ml of aqueous solution and 10 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 5.6). This mixed solution is put into a reactor at 30 ° C. ± 0.1 ° C. and preheated for 10 minutes while stirring at 500 rpm. The enzyme sample is added to the sample bottle and stirring is continued for 1 hour. Then, 40 ml of ethanol is added to stop the reaction. After stopping the reaction, titration is performed by adding 0.05N sodium hydroxide solution to the sample bottle until the pH reaches 10. At this time, a blank test is performed simultaneously in the same procedure except that no sample is added. After the measurement, the hydrolysis activity of the enzyme is calculated by the following formula:
A = (a−b) × f × 50 × 1/60 × 1 / S
However, A: Hydrolysis activity (U / mg or U / ml)
a: 0.05N sodium hydroxide solution (ml) required for sample measurement
b: 0.05N sodium hydroxide solution (ml) required for measurement of blank test
f: Factor of 0.05N sodium hydroxide solution
S: Amount of sample (mg or ml)
50: Fatty acid equivalent to 1 ml of 0.05N sodium hydroxide solution (μmol)
60: Reaction time (minutes).
[0052]
The mixture of fat, lipase, and medium chain fatty acid may further contain other substances. For example, the mixture may be dissolved in a solvent such as hexane, ether, or ester. Since the organic solvent adversely affects the human body, it is necessary to remove it after the reaction, which is expensive and laborious. Therefore, it is preferable to carry out the reaction in a solvent-free system.
[0053]
Although the temperature which processes the mixture of fats and oils, lipase, and a medium chain fatty acid is not specifically limited, Usually, it is about 10 to 50 degreeC, Preferably it is about 20 to 40 degreeC, More preferably, it is about 25 to 35 degreeC. The time for reacting the above mixture is not particularly limited, but is usually about 1 to 500 hours, preferably about 10 to 300 hours, more preferably about 20 to 250 hours. In the reaction, it is preferable to replace the air in the container containing the reaction solution with nitrogen in order to prevent oxidation of unsaturated fatty acids and contamination of moisture. If water is mixed in the reaction system, the hydrolysis reaction proceeds in parallel with the acidolysis reaction, which is not preferable. By proceeding the acidolysis reaction between fats and oils and medium chain fatty acids under such conditions, a structured lipid containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA is produced. Depending on the degree of progress of the reaction and the amount of (n-6) system DPA and DHA contained in the oil used in the reaction, a medium chain fatty acid binds to either the 1-position or the 3-position, and the 2-position (n-6) Triglycerides bound to system DPA or DHA; and triglycerides bound to medium chain fatty acids at

positions

1 and 3 and (n-6) system DPA or DHA bound to position 2 can be produced.
[0054]
After completion of the reaction, it is preferable to remove free fatty acid by washing the reaction solution with alkali or the like. Purification of the produced structured lipid can be performed in the same manner as the purification of fats and oils described in 2.2 above, if necessary. Therefore, the structured lipid is usually obtained as an oil composition containing other components, but the intended structured lipid can also be isolated as a pure product.
[0055]
The resulting structured lipid generally has a medium chain of about 20 to 80 mol%, preferably about 40 to 70 mol%, more preferably about 60 to 70 mol%, based on 100 mol% of all fatty acids contained in the structured lipid. Fatty acids are incorporated. The medium chain fatty acid is preferably incorporated at

positions

1 and 3 of the triglyceride. Medium chain fatty acids (MA) in the 1 and 3 positions, and medium chain fatty acids in the 1 and 2 positions of triglycerides (MA-DPA / DHA-MA) with (n-6) -based DPA or DHA bound in the 2 position. The ratio to the triglyceride (MA-MA-DPA / DHA) in which (n-6) -based DPA or DHA is bonded to the 3-position (the ratio of the former when the sum of both is 100%) is typically It may be 60% or more, preferably 65% or more, but is not limited thereto.
[0056]
4). Use of structured lipids
(N-6) Fat and oil-containing foods that can make up for the shortage of (D-6) system DPA and DHA by adding structural oils and fats containing at least one of system DPA and DHA to various foods or feeds or feeds, etc. Is provided. According to this, at least one of the (n-6) -based DPA and DHA can be ingested in a state that is easily decomposed by the in vivo pancreatic lipase and thus easily absorbed in the intestine.
[0057]
Examples of the food include nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, and elderly foods. As used herein, food is a generic term for solids, fluids and liquids and mixtures thereof that can be consumed.
[0058]
Nutritional supplements refer to foods that are enriched with specific nutritional components. The health food refers to food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like. Functional food means food for replenishing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use. Infant food refers to food for children up to about 6 years old. The food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food. Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old. Premature infant formula refers to formula that is given to premature babies until they are about 6 months old.
[0059]
Examples of these food forms include meats, fish, nuts and other natural foods (treated with oils and fats); Chinese food, ramen, soups and other foods that add oils and fats; tempura, fries, fried chicken, fried rice, Foods that use fats and oils such as donuts and sugar sugar; butters, margarines, mayonnaise, dressings, chocolates, instant ramen, caramels, biscuits, cookies, cakes, ice creams, etc. A food or the like that is sprayed or coated with fats and oils at the time of finishing of processing such as oysters, hard biscuits and bread crumbs. However, the food of the present invention is not limited to foods originally containing fats and oils. For example, bread, noodles, rice, confectionery (candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, Japanese confectionery), tofu and its tofu Agricultural foods such as processed products; fermented foods such as sake, medicinal liquor, mirin, vinegar, soy sauce and miso; livestock foods such as yogurt, ham, bacon and sausage; marine foods such as kamaboko, fried tempura, and hampen; It may be a soft drink, a sports drink, an alcoholic drink, a drink such as tea.
[0060]
The food of the present invention is also in the form of pharmaceutical preparations or proteins (proteins such as milk protein, soy protein, egg albumin with good amino acid balance and high nutritional value are most widely used as the protein source. Natural liquid foods in which the fats and oils of the present invention are blended with sugars, fats, trace elements, vitamins, emulsifiers, fragrances, etc.) Processed forms such as semi-digested nutritional foods and component nutritional foods, drinks, enteral nutrients, etc. When the food of the present invention is in the form of a pharmaceutical preparation, the food of the present invention is a powder, granule, tablet, capsule, troche, liquid for internal use, suspension, emulsion, syrup, drink, natural liquid food It may be in the form of a semi-digested nutritional diet, a component nutritional diet, an enteral nutrient, and the like.
[0061]
These foods can be produced by known methods. The oil and fat composition of the present invention is added at any stage as long as the structured lipid is not substantially denatured or decomposed. The addition amount of the oil and fat composition is not particularly limited, and is appropriately set so that the target structured lipid has a desired content.
[0062]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0063]
<Example 1> Production of fats and oils by Urkenia microorganisms (1)
The Urkenia genus SAM2179 strain and the SAM2180 strain were cultured in a jar fermenter type culture tank having a capacity of 5 L, respectively, using the medium 3 L having the following composition (1) and the following culture conditions (2).
[0064]
(1) Medium composition (g / L)
1) Glucose: 60
2) Potassium phosphate: 3
3) Ammonium sulfate: 2
4) Corn steep liquor: 0.7
5) 50% artificial seawater: 1L
6) pH: 4.0
(2) Culture conditions
1) Culture temperature (℃): 28
2) Ventilation rate (VVM): 0.5
3) Stirring speed (rpm): 300
4) pH adjustment: pH 4 was maintained with 10% (w / v) sodium hydroxide.
[0065]
After culturing for 3 days, the cells were collected by centrifugation and lyophilized to determine the amount (weight) of cells per liter of the medium. Next, a chloroform / methanol (2: 1, v / v) mixed solution is added to the dried cells at a ratio of 100 v / w to the cell weight, and homogenized in the presence of glass beads to disrupt the cells. And oil and fat were extracted. After the extract was washed by the Folch method, the solvent was distilled off to obtain a purified oil and fat, and its weight was measured.
[0066]
In order to evaluate the fatty acid composition of the obtained refined fats and oils, a part of the fats and oils was dissolved in an equal volume mixture of a methanol solution containing 10% HCl and dichloromethane, and heat treated at 60 ° C. for 2 hours to obtain fatty acid methyl esters. Was prepared. This was introduced into a gas chromatograph to analyze the fatty acid composition. The separation conditions of gas chromatography (GC) were as follows.
[0067]
(3) Separation conditions
1) Column: Capillary column, TC-70
GL Science Co., Ltd,
Inner diameter 0.25mm x length 30m
2) Flow rate: 0.8 ml / min, 100 kPa (column head pressure)
3) Carrier gas: Nitrogen gas
4) Column temperature: temperature rising mode, 170-220 ° C (4 ° C / min)
5) Detection: = FID
The results are shown in Tables 1 and 2 below.
[Table 1]

[0068]
[Table 2]

[0069]
As described above, the SAM2179 strain and the SAM2180 strain produced fats and oils with a high DPA content and a high DHA content in a medium containing artificial seawater.
[0070]
<Example 2> Production of fats and oils by Urkenia microorganisms (2)
The Urkenia genus SAM2179 strain was cultured in a jar fermenter type culture tank having a capacity of 5 L using the medium 3 L having the following composition (1) and the following culture conditions (2). The test was performed twice (Tests 1 and 2).
[0071]
(1) Medium composition (g / L)
1) Glucose: 60
2) Potassium phosphate: 3
3) Ammonium sulfate: 2
4) Magnesium chloride: 1.3
5) Sodium sulfate: 1
6) Calcium chloride: 0.3
7) Corn steep liquor: 0.7
8) pH: 4.0
(2) Culture conditions
1) Culture temperature (℃): 28
2) Ventilation rate (VVM): 0.5
3) Stirring speed (rpm): 300
4) pH adjustment: maintained at pH 4 with 10% (w / v) sodium hydroxide.
[0072]
After culturing for 3 days, purified fats and oils were obtained under the same conditions as in Example 1, and their weights were measured. The fatty acid composition of the obtained refined fat was analyzed by GC in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 3 and Table 4 below.
[Table 3]

[0073]
[Table 4]

[0074]
As described above, the SAM2179 strain produced fats and oils with high DPA content and DHA content even in a medium not containing artificial seawater.
[0075]
Example 3 Production of Structured Lipid Containing (n-6) System DPA and DHA Pseudomonas sp. KWI-56 strain-derived powdered lipase (PSL) (manufactured by Kurita Kogyo Co., Ltd .: hydrolysis activity = 56.5 U / mg) 500 mg was dissolved in 5 ml of distilled water to prepare a 5600 U / ml PSL solution. In 5 ml of this PSL solution, CaCO as an immobilization carrier _Three Was added and stirred for 10 minutes while cooling with ice. The immobilized enzyme was precipitated by adding 40 ml of cold acetone to this solution, followed by centrifugation at 8000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was discarded to obtain a residue. The immobilized enzyme to be used was obtained by drying the residue. The specific activity of this immobilized enzyme was 9.3 U / mg. As a control, Rhizomucor miehei-derived lipase (Lipozyme) was used. Lipozyme (registered trademark) is an immobilized enzyme using an ion exchange resin as a carrier, and is sold by Novo Nordisk.
[0076]
1 g of purified fat and oil containing (n-6) docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, immobilized PSL 540 mg (or Lipozyme 100 mg), and caprylic acid 1, 2, or 3 g obtained in Test 2 of Example 2 Mixed. The mixture was stirred or shaken at 30 ° C. to advance the acidolysis reaction. During the reaction, the reaction solution was sampled over time. According to a conventional method, the reaction mixture was washed with an alkali to remove fatty acid, and triglyceride was recovered by silica gel chromatography. The collected triglycerides were analyzed for fatty acid composition.
[0077]
Analysis of fatty acids by GC was performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 5 below and FIGS. 1, 2 and 3.
[0078]
In Table 5, the result about immobilized PSL shows the composition of fatty acid contained in the structured lipid obtained after the reaction for 144 hours with the weight ratio of oil and fat and caprylic acid being 1: 3. The results for Lipozyme show the composition of fatty acids contained in structured lipids obtained after reaction for 144 hours at a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2.
[0079]
With Lipozyme, caprylic acid uptake was about 23%, whereas with immobilized PSL, caprylic acid uptake was about 65%. In other words, it was shown that the uptake of caprylic acid into triglycerides can be increased with immobilized PSL up to about 3 times that with Lipozyme.
[Table 5]

[0080]
FIG. 1 is a graph showing the influence on the caprylic acid uptake amount by the weight ratio of fats and oils and caprylic acid. FIG. 1a shows the results when using immobilized PSL, and FIG. 1b shows the results when using Lipozyme. In each case, the weight ratio of the oil and fat used in the reaction to caprylic acid is 1: 1 (◯), 1: 2 (Δ), and 1: 3 (□).
[0081]
FIG. 2 is a graph showing changes in the fatty acid composition contained in fats and oils as the acidolysis reaction proceeds. FIG. 2a shows the results when the weight ratio of fat and oil to caprylic acid is 1: 3 and immobilized PSL is used. FIG. 2b shows the results when Lipozyme is used with a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2.
[0082]
1 and 2, it can be seen that when Lipozyme is used, the amount of caprylic acid incorporated into fats and oils is limited to about 23%, and even when excess caprylic acid is used, the amount of incorporation is not increased. On the other hand, when immobilized PSL is used, it can be seen that the amount of caprylic acid incorporated into the oil increases remarkably. When the weight ratio of fat and caprylic acid was 1: 3, about 77% of caprylic acid was incorporated into the fat and oil in 216 hours.
[0083]
FIG. 3 is a chromatogram obtained by GC. FIG. 3a shows the result of reacting for 144 hours using immobilized PSL at a weight ratio of fat and oil to caprylic acid of 1: 3. FIG. 3 b shows the result of reaction for 144 hours using Lipozyme at a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2. FIG. 3c shows the results for the untreated fat. In FIG. 3, C27 represents 8-8-8, C35 represents 8-8-16, C41 represents 8-8-22 or 8-14-16, and C49 represents 8-16-22 or 14-. 16-16, C51 represents 16-16-16, C55 represents 8-22-22 or 14-16-22, C57 represents 16-16-22, and C63 represents 16-22-22. Indicates. (Where 8 is caprylic acid, 14 is myristic acid, 16 is palmitic acid, 22 is DHA or DPA, but the order of the numbers is independent of the binding position in the triglycerides.) Integrated intensity of these peaks The ratios are shown in Table 6 below.
[Table 6]

[0084]
FIG. 3 and Table 6 show that when Lipozyme is used, the content of the C41 compound containing the desired structured lipid is about 19%, and a large amount of other C49 and C55 compounds remain. On the other hand, when immobilized PSL was used, the content of the C41 compound was about 38%, and C49 and C55 each decreased to about 7-8%. Also, the content of C27 (8-8-8) increased to about 29%. From this, it is shown that, when immobilized PSL is used as compared with the case where Lipozyme is used, the same lipid can be used as a starting material to produce a structural lipid having about twice as many C41 compounds of interest.
[0085]
Example 4 Molecular species analysis of structured lipids by HPLC
The structured lipid obtained in Example 3 was analyzed for the molecular species of triglyceride by HPLC using a silver ion-binding column.
[0086]
(1) Analysis conditions
1) Column: CHROMSPHER 5 LIPIDS (250 x 4.6 mm)
Made by CHROMAPACK
2) Flow rate: 0.65 ml / min
3) Eluent (volume ratio):
A) Hexane: propanol: acetonitrile = 350: 100: 2.75
B) Hexane: propanol: acetonitrile = 350: 100: 10
0-3 minutes A100%
3 to 13 minutes A100 → 0% / B0% → 100%
13-33 minutes B100%
4) Detection: UV206nm
The results are shown in FIG. FIG. 4a shows the result of reacting for 144 hours using immobilized PSL at a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 3. FIG. 4b shows the result of reaction using Lipozyme for 144 hours with a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2. In FIG. 4, the peaks with the symbols each represent the following triglycerides:
1 = Has only saturated fatty acids 9 = 16-DPA-DPA
Triglyceride 10 = 8-DPA-DPA
2 = 8-16-DPA 11 = 16-DHA-DPA
3 = 8-DPA-8 12 = 8-DHA-DPA
4 = 8-8-DPA 13 = 16-DHA-DHA
5 = 8-DHA-16 14 = 8-DHA-DHA
6 = 8-16-DHA or 16-8-DHA 15 = DPA-DPA-DHA
7 = 8-DHA-8 16 = DPA-DHA-DHA
8 = 8-8-DHA 17 = DHA-DHA-DHA
(Here, 8 indicates caprylic acid and 16 indicates palmitic acid. For peaks 9 to 16, there is no distinction of positional isomers.)
[0087]
From FIG. 4, by using immobilized PSL, compared to the case of using Lipozyme, a structural oil (which is a molecular species having DPA or DHA at the 2-position and caprylic acid incorporated at the 1- and 3-positions ( It is shown that peaks 3 and 7) are obtained in large quantities.
[0088]
<Example 5> (n-6) Preparation of milk containing DPA and DHA
(N-6) system DPA and DHA-containing milk was prepared by mixing 1.2 g of the oil and fat composition obtained in Example 3 with 100 g of powdered milk. The ratio of (n-6) -based DPA to total fatty acids in this milk was 0.27%, and the ratio of DHA was 0.84%. Therefore, a formula containing (n-6) -based DPA and DHA as structural lipids, which was insufficient in conventional formula, was obtained.
[0089]
<Example 6> (n-6) Preparation of capsules containing DPA and DHA
[Table 7]

[0090]
In a soft capsule composed of the components shown in Table 7, 300 mg of fat and oil containing a structured lipid containing (n-6) -based DPA and DHA obtained in Example 3 was filled by a conventional method to obtain a soft capsule. . The soft capsules are useful as such as dietary supplements or as raw materials for dietary supplements.
[0091]
<Example 7> Preparation of beverage containing (n-6) system DPA and DHA
50 g of commercially available plain yogurt in a container and 50 g of fat containing structured lipid containing at least one of (n-6) system DPA and DHA obtained in Example 3 g As well as 1 g of β-cyclodextrin. This was stirred for about 3 minutes and emulsified to obtain an emulsion in which W / O / W, O / W / O type and the like were mixed. A functional beverage was obtained by diluting this emulsion 500 times with water.
[0092]
【The invention's effect】
The production method of the present invention includes a step of treating a fat containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA in a large amount with a lipase derived from bacteria in the presence of a medium chain fatty acid. By using a lipase derived from bacteria having a high catalytic activity in the acidolysis reaction, a structured lipid containing at least one of (n-6) -based DPA and DHA mainly at the 2-position can be efficiently produced.
[0093]
The oil-and-fat composition of the present invention uses at least one of (n-6) -based DPA and DHA, which are highly unsaturated fatty acids capable of performing important physiological activities in vivo, as a structural lipid having particularly high absorbability in vivo. Contains. Therefore, the oil and fat composition of the present invention has various products that require at least one of these polyunsaturated fatty acids (prepared milk for infants, prepared milk for premature infants, infant foods, foods for the elderly, dietary supplements, functions (N-6) at least one of (D-6) system DPA and DHA as a structural lipid in a stable and efficient manner (such as a natural food, enteral nutrient, animal feed or animal feed additive, and microfeed biological feed). Can be supplied well.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the influence of the weight ratio of fats and oils and caprylic acid on caprylic acid uptake. FIG. 1a shows the results when using immobilized PSL, and FIG. 1b shows the results when using Lipozyme.
FIG. 2 is a graph showing changes in fatty acid composition contained in fats and oils as the acidolysis reaction proceeds. FIG. 2a shows the results when the weight ratio of fat and oil to caprylic acid is 1: 3 and immobilized PSL is used. FIG. 2b shows the results when Lipozyme is used with a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2.
FIG. 3 is a chromatogram obtained by GC. FIG. 3a shows the result of reacting for 144 hours using immobilized PSL at a weight ratio of fat and oil to caprylic acid of 1: 3. FIG. 3 b shows the result of reaction for 144 hours using Lipozyme at a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2. FIG. 3c shows the results for the untreated fat.
FIG. 4 is a chromatogram by HPLC. FIG. 4a shows the result of reacting for 144 hours using immobilized PSL at a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 3. FIG. 4b shows the result of reaction using Lipozyme for 144 hours with a weight ratio of fat and caprylic acid of 1: 2.

Claims

(N-6) including a step of treating an oil or fat containing at least one of docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid with a lipase derived from Pseudomonas genus KWI-56 in the presence of a medium-chain fatty acid (n -6) A method for producing a structured lipid containing at least one of docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid.

The production method according to claim 1, wherein the fat is obtained from a culture of a microorganism having the ability to produce at least one of (n-6) -based docosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid.

The production method according to claim 2, wherein the microorganism belongs to the Thraustochytrium family.

The production method according to claim 3, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Urkenia, Schizochytrium, or Thraustochytrium.

The production method according to claim 4, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Urkenia.

The manufacturing method of Claim 5 whose said microorganisms are Urkenia genus SAM2179 strain | stump | stock (FERM BP-5601).