JP4236323B2

JP4236323B2 - Novel esterolytic enzyme

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Publication number: JP4236323B2
Application number: JP05382299A
Authority: JP
Inventors: 靖宙山田; 卓也仁平
Original assignee: Nagase and Co Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 1999-03-02
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2019-03-02
Also published as: JP2000245455A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なエステル分解酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エステル分解酵素は、種々の微生物に広く分布する酵素であり、エステル結合を分解する。中でも、リパーゼはトリグリセリドをモノ−及びジ−グリセリドと脂肪酸とに分解するだけでなく、非水溶媒系でエステル交換反応、エステル化反応等を触媒する。非水溶媒系におけるこのような反応は有機合成には非常に有用であることから、エステル分解酵素（特にリパーゼ）が種々の工業生産プロセスに用いられるようになってきており（Andreeら、J. Appl. Biochem. 2: 218-219 (1980)及びBlokingら、Trends Biotechnol. 9: 360-363 (1991)）、パーム油のエステル交換反応によるカカオ代用脂の製造に利用されている。
【０００３】
他方で、エステル分解酵素（リパーゼ）の基質特異性を利用して、油脂あるいは種々の薬剤を改変し、新たな付加価値を持たせる研究も進展しつつある。例えば、脂質は人体内では、２−モノグリセリドの状態で吸収されることから、トリグリセリドの２位に一定の機能を有する置換基を導入できれば、パーム油等の油脂を機能性食品に変換することができる。
【０００４】
しかし、一般に、エステル分解酵素（リパーゼ）はエステル結合近傍の官能基により著しく影響を受け、官能基が嵩高い場合には加水分解されにくいという問題がある。
【０００５】
そこで、近傍に嵩高い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエステル分解酵素（リパーゼ）が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、近傍に嵩高い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエステル分解（リパーゼ）活性を有する酵素を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、以下の性質を有する酵素を提供することにより、達成される。すなわち、本発明のエステル分解酵素は、トリベンゾイルグリセロールを加水分解し得る。
【０００８】
好ましい態様では、本発明のエステル分解酵素は、以下の性質：
基質特異性：トリベンゾイルグリセロールを加水分解する、
分子量：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa及び
非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa、
至適ｐH ：約8.0、
ｐH安定性：約6.0〜8.0、
至適温度：約45℃、及び
熱安定性：35℃以下、
という性質を有する。
【０００９】
本発明のエステル分解酵素は、さらに、ｐ−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性がｐ−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よりも、少なくとも３倍以上高いという性質を有している。
【００１０】
好ましくは、本発明の酵素は、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物から得られる。
【００１１】
上記性質を有する本発明の酵素は、エステル結合近傍で嵩高い官能基を有する化合物の合成、新機能付与等の用途に用いられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のエステル分解酵素は、実施例で詳しく記載するが、まず、嵩高い基質、例えば、オレイルベンゾエート（以下、ＯＢという）を唯一の炭素源として生育する微生物を選択し、ついで、トリベンゾイルグリセロール（以下、ＴＢＧという）を分解し得るか否かをスクリーニングすることにより得られる。
【００１３】
ＴＢＧ分解活性を有するエステル分解酵素（以下、本酵素ということがある）を生産する微生物としては、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物が挙げられ、例えば、本発明者等が単離した、Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM109株（工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号がＦＥＲＭＰ−17224である）（以下、単にKM109株ということがある）が、本酵素を生産する。
【００１４】
本酵素は、本酵素を生産する微生物から、当業者が用いる適切な方法を組合せて得ることができる。アシネトバクター属の微生物を用いて取得する例を挙げると、アシネトバクター属に属する微生物をＮＢ培地（肉エキス１％、ポリペプトン１％、NaCl 0.2％）あるいは、ＬＢ培地（イーストエキス 0.5％、バクトトリプトン 1.0％、NaCl １％）等の炭素源、窒素源、各種ミネラル等を含む培地で培養する（ただし、マルト培地では活性が低いので、使用しない方がよい）。培養に際して、ＯＢと界面活性剤とを添加しておくと、活性の誘導及び活性の向上が図れる。
【００１５】
適切な温度と時間（例えば、30℃、42時間）培養後、菌体を遠心分離して除き、例えば、上清にイソプロパノールを最終濃度60％となるように加えて、粗酵素を回収し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理、HPLC処理、限外濾過による濃縮、透析等を単独でもしくは組合せて、本発明の酵素が精製される。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。
【００１７】
Ａ：基質及び基質の合成
本発明に用いた酵素の基質は、ｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）、ｐ−ニトロフェニルカプロエート（ｐＮＰＣ）、ｐ−ニトロフェニルベンゾエート（ｐＮＰＢ）、オレイルベンゾエート（ＯＢ）、トリベンゾイルグリセロール（ＴＢＧ）である。ｐＮＰＡは、東京化成工業（株）から購入し、ｐＮＰＣは東洋紡（株）から購入した。その他の基質は、以下のようにして合成した。
【００１８】
（ｐＮＰＢの合成）
ｐ−ニトロフェノール4.7g（Mw.139.11、0.0338mol）、ピリジン5.0ml（0.0618mol）、４‐ジメチルアミノピリジン0.21g（Mw.140.57、0.00149 mol）および溶媒としてヘキサン150 ml、ベンゼン50 mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル5.0 g（Mw.140.57、0.0356mol）を滴下した。滴下終了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、ＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝20：１）、ＵＶ吸収で生成物の確認し、生成物は^１Ｈ−ＮＭＲ（HITACHI R-24B）、ＩＲ（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００１９】
（ＯＢの合成）
オレイルアルコール43.5ｇ（Mw.268.48、0.162mol）、トリエチルアミン16.4ｇ（Mw.101.19、0.162mol）、４−ジメチルアミノピリジン0.59ｇ（Mw.122.17、0.0048mol）および溶媒としてヘキサン300mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル25.0ｇ（Mw.140.57、0.178mol）を滴下した。滴下終了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、シリカゲル300ｇを用いたクロマトグラフィーにより、ヘキサン８Ｌで溶出して精製した。生成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝9.1）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-54）、ＫＭｎＯ_４発色で確認し、生成物は^１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００２０】
（ＴＢＧの合成）
グリセロール2.18g（Mw92.07、0.0237mol）、４−ジメチルアミノピリジン２g（Mw.122.17、0.0163mol）および溶媒としてジクロロメタン：ピリジン＝１：１の400mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル10ｇ（Mw.140.57、0.0711 mol）を滴下した。滴下終了後、徐々に室温に戻し、一晩反応させた。反応終了後、酢酸エチルに溶かし、ヘキサンを加え室温で再結晶を行い精製した。生成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-50）で確認し、生成物は^１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００２１】
Ｂ．加水分解活性の測定
加水分解活性の測定は、以下のように行った。
50mM リン酸カリウム（KPB、ｐH6.5）、2.5mM ｐ−ニトロフェニルエステル、５％アセトニトリル、酵素を含む３mlの反応液を、予め、37℃に加温しておき、これにドライアセトニトリルに溶解したｐ−ニトロフェニルエステル（50mM）150μ１を加えることによって反応を開始した。反応は、エタノールを３ml加えて停止した。反応により生成したｐ−ニトロフェノール量を、400ｎｍにおける吸光度（ε_{４００ｎｍ}＝11,670）から求めた。１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットと定義した。
【００２２】
（スクリーニング用培地）
一次スクリーニング培地として、0.5％（NH_４)_２SO_４、0.1％KH_２PO_４、0.05％MgSO_４、0.5％NaCl、及び1.0％ＯＢを含む培地（ｐH7.2）を用いた。固形一次スクリーニング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。なお、ＯＢは、植菌時に加えた。
【００２３】
二次スクリーニング培地として、一次スクリーニング培地に0.2％ β‐サイクロデキストリン（日本食品加工株式会社）を加え、よく攪拌することによってＯＢを乳化させたものを用いた。固形二次スクリーニング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。
【００２４】
（スクリーニング）
大阪府下より得られた土壌・水サンプルを、試験管中で一次スクリーニング培地（液体：３ml）にて30℃、48時間集積培養を行った。培地が白濁したものは、その１％を２度、同じ培地に植え継いだ後、固形ＮＢ培地（ＮＢ培地に1.5％寒天を添加したもの）上にて30℃、24時間培養し、シングルコロニーを形成させた。シングルコロニーとして得られた菌株は、固形スクリーニング培地上で30℃、24時間培養し、その成育を確認した。成育の認められた菌株については、ＬＢ培地（３ml）で30℃、８時間培養し、培養液を20％グリセロール溶液としたのち、使用まで−80℃で保存した。
【００２５】
一次スクリーニングで得られた菌株を、固形二次スクリーニング培地上に植菌し、30℃、７日間培養した。培養２日目での生育状態と、７日目でのＯＢを分解することによって生じるクリアゾーンの形成能を見た。
【００２６】
明瞭なクリアゾーンを形成した菌株を、500ml容坂口フラスコを用いてＯＢ0.5％を含むＬＢ培地（50ml）で30℃、120s.p.m,46時間培養し、遠心分離（５，500×ｇ、10分、４℃）により、菌体と培養上清を得た。菌体は、１mM MgCl_２を含むKPB（50mM、ｐH6.5）に懸濁後、30秒×２回超音波（海上電機（株）、4280型振動子）で破砕した。これを、再度遠心分離（12,000×ｇ、20分、４℃）して破砕菌体を取り除き、細胞抽出液を得た。ｐＮＰＢを基質として、この細胞抽出液と培養上清液の加水分解活性の測定をおこなった。
【００２７】
このスクリーニングにおいて、ｐＮＰＢに高い活性を示した株を選択し、さらに、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢおよびＯＢを基質としてスクリーニングした。このなかから、ｐＮＰＢおよびｐＮＰＡに対して高い活性を有する６株（ＫＭ016、ＫＭ069、ＫＭ083、ＫＭ109、ＫＭ252、およびＫＭ264）が得られた。表１に結果を示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
ＫＭ109株は、ｐＮＰＢ活性がｐＮＰＡ活性よりも３倍以上も高く、そして、唯一トリベンゾイルグリセロールを分解した。この株が生産するエステル分解酵素は、嵩高い基質に対して作用できると考えられたので、以下、まず、この株を同定し、エステル分解酵素を単離精製した。
【００３０】
（ＫＭ109株の同定）
ＫＭ109株の菌学的性質を以下に示す。
【００３１】
Ａ．形態
（１）細胞の形球桿菌
（２）細胞の大きさ 0.9-1.6×1.5-2.5μm
（３）運動性の有無 −
（４）胞子の有無 −
（５）グラム染色 −
（６）抗酸性染色 −
【００３２】
Ｂ．各培地における生育状態
(１）標準寒天平板培養薄茶色、光沢あり、スム−ズ、正円
（２）標準寒天斜面培養薄茶色、光沢あり、スムーズ
（３）標準液体培養上層部がやや濃く、液面に薄い被膜
（４）標準ゼラチン穿刺培養穿刺線に沿って弱い発育、液化は見られず
（５）リトマスミルク変化なし
【００３３】

【００３４】
以上の菌学的性質から、単離した株はアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus）と同定された。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（寄託番号ＦＥＲＭＰ−17224）
【００３５】
（本発明の酵素の精製）
Ａ．粗酵素の調製
Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM109株をＬＢ培地６mlに植菌し、30℃、120s.p.m.で４時間培養した。得られた培養液５mlを、同じＬＢ培地500mlに加え、30℃、１20s.p.m.、８時間培養し、前培養液を得た。ＬＢ培地40Ｌを含む100Ｌ容ジャーファーメンター（（株）丸菱バイオエンジ、ＭＰＦ型）に、前培養液を400ml添加して、200rpm、１vvm、30℃で、40時間、培養した。
【００３６】
培養終了後、直ちに培養液を４℃ にまで冷却し、混合塩（CaCl_２：Na_２HPO_４＝１：２）を１％（W／V〉となるように加え、よく攪拌した。菌体および生じた不溶物は、連続遠心分離（15,000rpm：関西遠心分離機製作所、Ｓ型超高速遠心分離機）で取り除き、培養上清液を得た。
【００３７】
得られた培養上清液を、限外濾過モジュール（分子量カットオフ 6,000、旭化成工業株式会社、ラボモジュールSIP 1013）を用いて3.5Ｌまで濃縮し、ドライアイスで−20℃にまで冷却したイソプロパノールを、最終濃度30％となるように加え、タンパク質を不溶化させた後、遠心分離（7,000×ｇ、20分、４℃）により除いた。上清液に対し、さらに同様のイソプロパノールを最終濃度60％となるように加え、タンパク質を不溶化させ、遠心分離（12,000×ｇｍ、20分、４℃）により回収し、−80℃にて凍結後、凍結乾燥（Refrigeration for Science Inc.、RFS 200B）により残留イソプロパノール、水分を除去し、粗酵素粉末を得て、以下の精製に用いた。以下の精製は、４℃で行った。
【００３８】
Ｂ．ゲル濾過による精製
凍結乾燥により得られた粉末1.0 g を、ノイゲンHCを０．１％含む50mMリン酸バッファー（KPB、ｐH6.5）100 ml に溶解した。次に、同バッファーであらかじめ平衡化させたセファローズＣＬ−68ゲル濾過クロマトグラフィー（50×630mm：Pharmacia LKB Biotechnology lnc．）にアプライし、同バッファーで溶出し、18mlずつ、80フラクションに分画し、ｐＮＰＡ及びｐＮＰＢを用いて加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢ活性を有する画分を回収、濃縮（分子量カット20、000、東洋濾紙株式会社、UP-20）し、ノイゲンＨＣを0.1％含む10mM トリス−塩酸（ｐH8.0）に対し、透析をおこなった。
【００３９】
Ｃ．イオン交換樹脂による精製
次に、同バッファーで予め平衡化したDEAE Sephacel 陰イオン交換クロマトグラフィー（25×90mM、Pharmacia Biotechnology inc．）に吸着させ、バッファー中のNaClの０〜0.5Ｍの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出し、５mlずつ60フラクションに分画した。溶出画分のｐＮＰＡ、ｐＮＰＢに対する加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活性が認められる画分を回収・濃縮した。
【００４０】
Ｄ．HPLCによる精製
次に、0.1％ノイゲンＨＣ及び200mM NaClを含む50mM KPB（ｐH6.5）で予め平衡化させたG2000SWXL（7.8×300ｍｍ、東ソー株式会社）を用いた高速液体ゲル濾過クロマトグラフィー（日本分光株式会社、TRI ROTOR-V）にアプライし、同バッファーにより0.5ml／分で溶出した。タンパク質は280ｎｍにおける吸光度として検出した（日本分光株式会社、UVIDEC-100-V）。11〜33分の保持時間のものを30秒毎に分取し、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢを基質として加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活性が認められる画分を回収し、10mMトリス塩酸（ｐH8.0）に対し、透析した。
【００４１】
Ｅ．ＭｏｎｏＱによる精製
次に、同バッファーであらかじめ平衡化させたMONO Q PC1.6／５（1.6×50ｍｍ）を用いたＳＭＡＲＴ^ＴＭシステム(Pharmacia LKB Biotechnology lnc.）に吸着させ、バッファー中の NaCl濃度を０〜0.125Ｍおよび0.125Ｍ〜0.5Ｍの二段階の直線濃度勾配により酵素を溶出した。タンパク質は280ｎｍ、254ｎｍの吸光度として検出した。15〜22分の保持時間の画分を15秒ごとに集め、ｐＮＰＢによる加水分解活性測定を行い、活性画分を集めた。
【００４２】
Ｆ．SDS-PAGEによる精製度の測定
得られた酵素を10−20％ ready mixed gradient gel（第一化学薬品株式会社、マルチゲル 10/20）を用いたSDS-PAGEによって展開し、銀染色キット（和光純薬株式会社、Silver stain II Kit Wako）を用いてプロトコルに従い、染色・検出した。SDS-PAGEでは、単一の蛋白質にまで精製されていた。以上の精製工程により、精製酵素0.03mgが回収された。なお、以下にのべる酵素の特性の決定には、0.71unit/mlの酵素を用いた。
【００４３】
（本発明の酵素の特性）
Ａ．SDS-PAGEによる分子量測定
得られた精製酵素の分子量を、変性−還元条件下のSDS-PAGEで測定した。キャリブレーションの結果を図１に示す。なお、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼｂ：分子量94,000、ウシ血清アルブミン：分子量67,000、オバルブミン：分子量43,000、及び、carbonic anhydrase：分子量30,000を用いた。
【００４４】
変性−還元条件下におけるSDS-PAGEによる分子量は、62kDa±１kDaであった。
【００４５】
Ｂ．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量測定
精製酵素の分子量を、Superdex 75 PC 3.2/30を用いるＳＭＡＲＴ^ＴＭシステムで測定した。溶出は、200mM NaClを含む50mM トリス塩酸（ｐH8.0）を用いて50μｌ／分で行い、280ｎｍ、254ｎｍにおける吸光度として検出した。マーカータンパク質としては、アルブミン：分子量65,000、オバルブミン：分子量46,800、キモトリプシノーゲンＡ：分子量20,600、及び、リボヌクレアーゼＡ：分子量15,700を用いた。結果を図２に示す。
【００４６】
この結果から、非変性条件下のゲル濾過クロマトグラフィーで、精製酵素の分子量は、50±１kDaであると推定された、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量がSDS-PAGEより若干低いが、これは、精製酵素がカラム担体と相互作用した結果、溶出位置にずれが生じたためと考えられる。
【００４７】
Ｃ．至適ｐH
酵素液10μlにKPBバッファー（ｐH６〜８）又はクエン酸バッファー（ｐH３〜６）465μlを加え、これにｐＮＰＢ(50mM)25μlを加えて反応を開始し、37℃、10分、反応を行った。500μlのエタノールを加えて反応を停止し、14,000rpm、５分の遠心分離を行い、その上清10μlをHPLCでの分析に供した。分解活性は、アセトニトリル：酢酸アンモニウム溶液（50mM、ｐH5.5）(1:1)を展開溶媒として使用し、吸光度303nmで検出されるp-ニトロフェノールの量を測定した。検量線はp-ニトロフェノールを用いて作製した。ｐH8.0付近で最大の分解活性が測定された。この結果は、至適ｐHが約8.0であることを示している。
【００４８】
Ｄ．ｐH安定性
ｐHを4.5から8.5まで0.5ずつ変化させた50mM KPBに110量の酵素溶液を加えてｐHを変化させ、30分間４℃で保持後、37℃において、ｐＮＰＢ加水分解活性を測定し、ｐH安定性を測定した。結果を図３に示す。本酵素は、ｐH6.0〜8.0の間で、安定である。
【００４９】
Ｅ．反応至適温度
20℃、28℃、37℃、40℃、45℃、52℃の各温度条件下、ｐH7.0でｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。図４に、37℃での活性を１とした相対活性を示す。この結果から、至適反応温度は約45℃とした。
【００５０】
Ｆ．熱安定性
４℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃の各温度に酵素液を30分間処理し、４℃に冷却後、直ちに37℃においてｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。４℃で処理した酵素活性を１として、各処理温度における相対活性を図５に示す。35℃までの温度では、ほぼコントロールの４℃と同等の活性を保持していたが、それ以上の温度では次第に失活し、50℃で処理した酵素は、40％しか残存していなかった。本酵素は35℃以下の温度では安定であると言える。
【００５１】
（市販酵素との比較）
本発明の酵素を市販の酵素と比較した。比較した酵素は、リパーゼＯＦ（名糖産業株式会社：Candida cylindrace由来）、リパーゼLP-051-1S（東洋醸造株式会社：Pseudomonas sp由来）、ノボザイム435（ノボノルディスク工業：Candida antractica由来）、リポプロテインリパーゼ（タイプＡ）（東洋紡株式会社：Pseudomonas sp由来）である。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】

【００５３】
本発明の酵素のみが、トリベンゾイルグリセロール分解活性を有しており、さらに、ｐＮＰＢ対して、高い特異性を有していることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の酵素は、嵩高い基質の加水分解に有用であり、医薬品の中間原料に必要な光学活性な物質の製造等に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 SDS-PAGEによる分子量測定を示す図である。
【図２】ゲル濾過による分子量の測定を示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐH安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の至適反応温度を示す図である。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel esterolytic enzyme.
[0002]
[Prior art]
An esterolytic enzyme is an enzyme widely distributed in various microorganisms and degrades an ester bond. Among them, lipase not only decomposes triglycerides into mono- and di-glycerides and fatty acids, but also catalyzes transesterification and esterification reactions in a non-aqueous solvent system. Since such reactions in non-aqueous solvent systems are very useful for organic synthesis, esterolytic enzymes (particularly lipases) have been used in various industrial production processes (Andree et al., J. Biol. Appl. Biochem. 2: 218-219 (1980) and Bloking et al., Trends Biotechnol. 9: 360-363 (1991)), have been used for the production of cocoa substitutes by transesterification of palm oil.
[0003]
On the other hand, research is being advanced to modify fats and oils or to add new added value by utilizing the substrate specificity of esterase (lipase). For example, lipids are absorbed in the human body in the form of 2-monoglycerides, so if a substituent having a certain function can be introduced at the 2-position of triglycerides, oils such as palm oil can be converted into functional foods. it can.
[0004]
However, in general, an esterolytic enzyme (lipase) is significantly affected by a functional group in the vicinity of an ester bond, and there is a problem that hydrolysis is difficult when the functional group is bulky.
[0005]
Therefore, a highly specific esterase (lipase) is required even for an ester having a bulky functional group in the vicinity.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an enzyme having esterase (lipase) activity with high specificity even for an ester having a bulky functional group in the vicinity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
This object is achieved by providing an enzyme having the following properties. That is, the esterolytic enzyme of the present invention can hydrolyze tribenzoylglycerol.
[0008]
In a preferred embodiment, the esterolytic enzyme of the present invention has the following properties:
Substrate specificity: hydrolyzes tribenzoylglycerol,
Molecular weight: 62 ± 1 kDa by SDS-PAGE under denaturing-reducing conditions and 50 ± 1 kDa by HPLC gel filtration under non-denaturing conditions,
Optimum pH: about 8.0,
pH stability: about 6.0 to 8.0,
Optimal temperature: about 45 ° C and thermal stability: 35 ° C or less,
It has the property.
[0009]
The esterolytic enzyme of the present invention further has the property that the hydrolysis activity for p-nitrophenyl benzoate is at least three times higher than the hydrolysis activity for p-nitrophenyl acetate.
[0010]
Preferably, the enzyme of the present invention is obtained from a microorganism belonging to the genus Acinetobacter.
[0011]
The enzyme of the present invention having the above properties is used for applications such as synthesis of a compound having a bulky functional group in the vicinity of an ester bond and imparting a new function.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The esterolytic enzyme of the present invention is described in detail in the Examples. First, a microorganism that grows using a bulky substrate, for example, oleyl benzoate (hereinafter referred to as OB) as the sole carbon source, and then tribenzoylglycerol is selected. It is obtained by screening whether or not (hereinafter referred to as TBG) can be decomposed.
[0013]
Examples of the microorganism that produces an esterolytic enzyme having TBG-degrading activity (hereinafter sometimes referred to as the present enzyme) include microorganisms belonging to the genus Acinetobacter. For example, Acinetobacter calcoaceticus isolated by the present inventors. subsp. antiratus KM109 strain (deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, deposit number is FERM P-17224) (hereinafter sometimes simply referred to as KM109 strain) produces this enzyme.
[0014]
The present enzyme can be obtained from a microorganism producing the present enzyme by combining appropriate methods used by those skilled in the art. To give an example using microorganisms belonging to the genus Acinetobacter, microorganisms belonging to the genus Acinetobacter are NB medium (1% meat extract, 1% polypeptone, NaCl 0.2%) or LB medium (0.5% yeast extract, bactotryptone 1.0). %, NaCl 1%), etc., in a medium containing a carbon source, nitrogen source, various minerals, etc. (however, it is better not to use it because malt medium has low activity). When OB and a surfactant are added at the time of culture, activity induction and activity improvement can be achieved.
[0015]
After cultivation at an appropriate temperature and time (for example, 30 ° C., 42 hours), the cells are removed by centrifugation. For example, isopropanol is added to the supernatant to a final concentration of 60% to recover the crude enzyme, The enzyme of the present invention is purified by gel filtration chromatography, ion exchange resin treatment, HPLC treatment, concentration by ultrafiltration, dialysis and the like alone or in combination.
[0016]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to this Example.
[0017]
A: Substrate and synthesis of substrate The substrate of the enzyme used in the present invention is p-nitrophenyl acetate (pNPA), p-nitrophenyl caproate (pNPC), p-nitrophenyl benzoate (pNPB), oleyl benzoate (OB) ), Tribenzoylglycerol (TBG). pNPA was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., and pNPC was purchased from Toyobo Co., Ltd. Other substrates were synthesized as follows.
[0018]
(Synthesis of pNPB)
p-Nitrophenol 4.7 g (Mw.139.11, 0.0338 mol), pyridine 5.0 ml (0.0618 mol), 4-dimethylaminopyridine 0.21 g (Mw.140.57, 0.00149 mol) and hexane 150 ml, benzene 50 ml below freezing While stirring well, 5.0 g (Mw. 140.57, 0.0356 mol) of benzoyl chloride was added dropwise. After 2 hours from the end of dropping, the temperature was gradually returned to room temperature and allowed to react overnight. After completion of the reaction, the reaction product was developed on TLC (hexane: ethyl acetate = 20: 1), and the product was confirmed by UV absorption. The product was ¹ H-NMR (HITACHI R-24B), IR (HORIBA FT-210- IR) to confirm the structure.
[0019]
(Synthesis of OB)
43.5 g (Mw.268.48, 0.162 mol) of oleyl alcohol, 16.4 g (Mw.101.19, 0.162 mol) of triethylamine, 0.59 g (Mw.122.17, 0.0048 mol) of 4-dimethylaminopyridine and 300 ml of hexane as a solvent under freezing, well stirred Then, 25.0 g of benzoyl chloride (Mw. 140.57, 0.178 mol) was added dropwise. After 2 hours from the end of dropping, the temperature was gradually returned to room temperature and allowed to react overnight. After completion of the reaction, the product was purified by chromatography using 300 g of silica gel, eluting with 8 L of hexane. The purity of the product was confirmed on TLC (hexane: ethyl acetate = 9.1), UV absorption (San Gabriel, CA91778 USA, UVG-54), and KMnO ₄ coloration. The product was ¹ H-NMR (HITACHI R -24B), IR (HORIBA FT-210-IR) confirmed the structure.
[0020]
(Synthesis of TBG)
Glycerol 2.18 g (Mw 92.07, 0.0237 mol), 4-dimethylaminopyridine 2 g (Mw. 122.17, 0.0163 mol) and 400 ml of dichloromethane: pyridine = 1: 1 as solvent 10 g of benzoyl chloride (Mw 140.57, 0.0711 mol) was added dropwise. After completion of the dropwise addition, the temperature was gradually returned to room temperature and allowed to react overnight. After completion of the reaction, the reaction mixture was dissolved in ethyl acetate, hexane was added, and recrystallization was performed at room temperature for purification. The purity of the product was developed on TLC (hexane: ethyl acetate = 9: 1) and confirmed by UV absorption (San Gabriel, CA91778 USA, UVG-50). The product was analyzed by ¹ H-NMR (HITACHI R-24B ) And IR (HORIBA FT-210-IR) to confirm the structure.
[0021]
B. Measurement of hydrolysis activity The hydrolysis activity was measured as follows.
3 ml of a reaction solution containing 50 mM potassium phosphate (KPB, pH 6.5), 2.5 mM p-nitrophenyl ester, 5% acetonitrile, and enzyme is preheated to 37 ° C. and dissolved in dry acetonitrile. The reaction was started by adding 150 μl of p-nitrophenyl ester (50 mM). The reaction was stopped by adding 3 ml of ethanol. The amount of p-nitrophenol produced by the reaction was determined from the absorbance at _{400 nm} (ε _{400 nm} = 11,670). The amount of enzyme that produces 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 unit.
[0022]
(Screening medium)
As a primary screening medium, a medium (pH 7.2) containing 0.5% (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.1% KH ₂ PO ₄ , 0.05% MgSO ₄ , 0.5% NaCl, and 1.0% OB was used. The solid primary screening medium is obtained by adding 1.5% agar to the above composition. OB was added at the time of inoculation.
[0023]
As the secondary screening medium, 0.2% β-cyclodextrin (Nippon Food Processing Co., Ltd.) was added to the primary screening medium, and OB was emulsified by stirring well. The solid secondary screening medium is obtained by adding 1.5% agar to the above composition.
[0024]
(screening)
Soil / water samples obtained from Osaka Prefecture were cultured in a test tube in a primary screening medium (liquid: 3 ml) at 30 ° C. for 48 hours. If the medium becomes cloudy, 1% of the medium is planted twice on the same medium, then cultured on a solid NB medium (NB medium with 1.5% agar added) at 30 ° C for 24 hours. Formed. The strain obtained as a single colony was cultured on a solid screening medium at 30 ° C. for 24 hours, and its growth was confirmed. The grown strain was cultured in LB medium (3 ml) at 30 ° C. for 8 hours, and the culture solution was made into a 20% glycerol solution and stored at −80 ° C. until use.
[0025]
The strain obtained by the primary screening was inoculated on a solid secondary screening medium and cultured at 30 ° C. for 7 days. The growth state on the second day of culture and the ability to form a clear zone caused by decomposing OB on the seventh day were observed.
[0026]
The strain that formed a clear zone was cultured in a LB medium (50 ml) containing 0.5% OB at 30 ° C., 120 sp., 46 hours using a 500 ml Sakaguchi flask, and centrifuged (5,500 × g, The cells and the culture supernatant were obtained by 10 minutes and 4 ° C. The cells were suspended in KPB (50 mM, pH 6.5) containing 1 mM MgCl ₂ and then crushed with ultrasonic waves (Kaijo Electric Co., Ltd., 4280 type vibrator) for 30 seconds × 2 times. This was centrifuged again (12,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.) to remove crushed cells, and a cell extract was obtained. Using pNPB as a substrate, the hydrolysis activity of the cell extract and the culture supernatant was measured.
[0027]
In this screening, strains showing high activity for pNPB were selected, and further screened using pNPA, pNPB and OB as substrates. Among these, 6 strains (KM016, KM069, KM083, KM109, KM252, and KM264) having high activity against pNPB and pNPA were obtained. Table 1 shows the results.
[0028]
[Table 1]

[0029]
KM109 strain had pNPB activity more than 3 times higher than pNPA activity and only degraded tribenzoylglycerol. Since the esterolytic enzyme produced by this strain was considered to be able to act on a bulky substrate, the strain was first identified and the esterolytic enzyme was isolated and purified.
[0030]
(Identification of KM109 strain)
The mycological properties of the KM109 strain are shown below.
[0031]
A. Form (1) Cell shape Staphylococcus aureus (2) Cell size 0.9-1.6 × 1.5-2.5μm
(3) Presence or absence of mobility −
(4) Presence or absence of spores-
(5) Gram staining-
(6) Anti-acid staining −
[0032]
B. Growth condition in each medium
(1) Standard agar plate culture Light brown, glossy, smooth, perfect circle (2) Standard agar slope culture Light brown, glossy, smooth (3) Standard liquid culture The upper layer is slightly darker and the coating is thin on the liquid surface (4) Standard gelatin puncture culture No weak growth or liquefaction is observed along the puncture line (5) Litmus milk No change [0033]

[0034]
Based on the above mycological properties, the isolated strain was identified as Acinetobacter calcoaceticus subsp. Antiratus. This strain has been deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (deposit number FERM P-17224)
[0035]
(Purification of the enzyme of the present invention)
A. Preparation of crude enzyme
Acinetobacter calcoaceticus subsp. Antiratus KM109 strain was inoculated into 6 ml of LB medium and cultured at 30 ° C. and 120 sp.pm for 4 hours. 5 ml of the obtained culture broth was added to 500 ml of the same LB medium and cultured at 30 ° C. and 120 sp.pm for 8 hours to obtain a preculture broth. 400 ml of the preculture was added to a 100 L jar fermenter containing 40 L of LB medium (Maruhishi Bioengine, Inc., MPF type), and cultured at 200 rpm, 1 vvm, 30 ° C. for 40 hours.
[0036]
Immediately after completion of the culture, the culture broth was cooled to 4 ° C., mixed salt (CaCl ₂ : Na ₂ HPO ₄ = 1: 2) was added to 1% (W / V>), and the cells were well stirred. The insoluble matter produced was removed by continuous centrifugation (15,000 rpm: Kansai centrifuge, S-type ultrahigh-speed centrifuge) to obtain a culture supernatant.
[0037]
The obtained culture supernatant was concentrated to 3.5 L using an ultrafiltration module (molecular weight cut-off 6,000, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., Lab Module SIP 1013), and isopropanol cooled to −20 ° C. with dry ice was added. The protein was added to a final concentration of 30% to insolubilize the protein, and then removed by centrifugation (7,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.). Add the same isopropanol to the supernatant to a final concentration of 60% to insolubilize the protein, collect it by centrifugation (12,000 x gm, 20 minutes, 4 ° C), and freeze at -80 ° C. Residual isopropanol and water were removed by lyophilization (Refrigeration for Science Inc., RFS 200B) to obtain a crude enzyme powder, which was used for the following purification. The following purification was performed at 4 ° C.
[0038]
B. Purification by gel filtration 1.0 g of the powder obtained by lyophilization was dissolved in 100 ml of 50 mM phosphate buffer (KPB, pH 6.5) containing 0.1% Neugen HC. Next, it was applied to Sepharose CL-68 gel filtration chromatography (50 x 630 mm: Pharmacia LKB Biotechnology lnc.) Pre-equilibrated with the same buffer, eluted with the same buffer, and fractionated into 18 fractions each in 80 fractions. , PNPA and pNPB were used to measure the hydrolysis activity, and the fraction having pNPB activity was collected, concentrated (molecular weight cut 20,000, Toyo Roshi Kaisha, UP-20), and 10 mM Tris containing 0.1% Neugen HC. -Dialysis was performed against hydrochloric acid (pH 8.0).
[0039]
C. Purification by ion exchange resin Next, it was adsorbed on DEAE Sephacel anion exchange chromatography (25 × 90 mM, Pharmacia Biotechnology Inc.) pre-equilibrated with the same buffer, followed by a linear concentration gradient of 0 to 0.5 M NaCl in the buffer. The protein was eluted and fractionated into 60 fractions of 5 ml each. The hydrolysis activity of the eluted fractions against pNPA and pNPB was measured, and fractions showing activity against pNPB were collected and concentrated.
[0040]
D. Purification by HPLC Next, high-performance liquid gel filtration chromatography using G2000SWXL (7.8 × 300 mm, Tosoh Corporation) pre-equilibrated with 50 mM KPB (pH 6.5) containing 0.1% Neugen HC and 200 mM NaCl (JASCO) Applied to TRI ROTOR-V) and eluted with the same buffer at 0.5 ml / min. Protein was detected as absorbance at 280 nm (JASCO Corporation, UVIDEC-100-V). A sample having a retention time of 11 to 33 minutes was collected every 30 seconds, and hydrolyzing activity was measured using pNPA and pNPB as substrates, and a fraction in which activity against pNPB was observed was collected, and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was collected. ) Was dialyzed.
[0041]
E. Purification by MonoQ Next, the solution was adsorbed on a SMART ^™ system (Pharmacia LKB Biotechnology lnc.) Using MONO Q PC1.6 / 5 (1.6 × 50 mm) pre-equilibrated with the same buffer, and the NaCl concentration in the buffer was reduced to 0. The enzyme was eluted with a two-step linear concentration gradient of .about.0.125M and 0.125M to 0.5M. Protein was detected as absorbance at 280 nm and 254 nm. Fractions having a retention time of 15 to 22 minutes were collected every 15 seconds, hydrolytic activity was measured with pNPB, and active fractions were collected.
[0042]
F. Determination of purity by SDS-PAGE The obtained enzyme was developed by SDS-PAGE using 10-20% ready mixed gradient gel (Daiichi Chemical Co., Ltd., Multigel 10/20), and a silver staining kit (Wako Jun) Yakuhin, Silver stain II Kit Wako) was used for staining and detection according to the protocol. In SDS-PAGE, it was purified to a single protein. Through the above purification steps, 0.03 mg of purified enzyme was recovered. In addition, 0.71 unit / ml enzyme was used for the determination of the enzyme characteristics described below.
[0043]
(Characteristics of the enzyme of the present invention)
A. Molecular Weight Measurement by SDS-PAGE The molecular weight of the purified enzyme obtained was measured by SDS-PAGE under denaturing-reducing conditions. The result of calibration is shown in FIG. As marker proteins, phosphorylase b: molecular weight 94,000, bovine serum albumin: molecular weight 67,000, ovalbumin: molecular weight 43,000, and carbonic anhydrase: molecular weight 30,000 were used.
[0044]
The molecular weight by SDS-PAGE under denaturing-reducing conditions was 62 kDa ± 1 kDa.
[0045]
B. Molecular Weight Measurement by Gel Filtration Chromatography The molecular weight of the purified enzyme was measured with a SMART ^™ system using Superdex 75 PC 3.2 / 30. Elution was performed at 50 μl / min using 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 200 mM NaCl, and the absorbance was detected at 280 nm and 254 nm. As marker proteins, albumin: molecular weight 65,000, ovalbumin: molecular weight 46,800, chymotrypsinogen A: molecular weight 20,600, and ribonuclease A: molecular weight 15,700 were used. The results are shown in FIG.
[0046]
From this result, it was estimated that the molecular weight of the purified enzyme was 50 ± 1 kDa by gel filtration chromatography under non-denaturing conditions. The molecular weight by gel filtration chromatography was slightly lower than that of SDS-PAGE. This is probably because the elution position has shifted as a result of the enzyme interacting with the column carrier.
[0047]
C. Optimum pH
To 10 μl of the enzyme solution, 465 μl of KPB buffer (pH 6-8) or citrate buffer (pH 3-6) was added, and 25 μl of pNPB (50 mM) was added thereto to start the reaction, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 500 μl of ethanol, centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes, and 10 μl of the supernatant was subjected to analysis by HPLC. For the decomposition activity, acetonitrile: ammonium acetate solution (50 mM, pH 5.5) (1: 1) was used as a developing solvent, and the amount of p-nitrophenol detected at an absorbance of 303 nm was measured. A calibration curve was prepared using p-nitrophenol. Maximum degradation activity was measured around pH 8.0. This result indicates that the optimum pH is about 8.0.
[0048]
D. pH stability: 110 mM enzyme solution was added to 50 mM KPB with pH changed by 0.5 from 4.5 to 8.5. The pH was changed, kept at 4 ° C for 30 minutes, and then measured for NPB hydrolysis activity at 37 ° C. The pH stability was measured. The results are shown in FIG. The enzyme is stable between pH 6.0 and 8.0.
[0049]
E. Optimal reaction temperature
The pNPB hydrolysis activity was measured at pH 7.0 under the respective temperature conditions of 20 ° C., 28 ° C., 37 ° C., 40 ° C., 45 ° C., and 52 ° C. FIG. 4 shows the relative activity assuming that the activity at 37 ° C. is 1. From this result, the optimum reaction temperature was about 45 ° C.
[0050]
F. Thermal stability The enzyme solution was treated at 4 ° C., 20 ° C., 30 ° C., 35 ° C., 40 ° C., and 50 ° C. for 30 minutes, cooled to 4 ° C., and immediately measured for pNPB hydrolysis activity at 37 ° C. The relative activity at each treatment temperature is shown in FIG. 5, where the enzyme activity treated at 4 ° C. is 1. At temperatures up to 35 ° C., the activity was almost the same as the control 4 ° C., but at temperatures higher than that, the activity was gradually inactivated, and only 40% of the enzyme treated at 50 ° C. remained. It can be said that this enzyme is stable at a temperature of 35 ° C. or lower.
[0051]
(Comparison with commercially available enzyme)
The enzyme of the present invention was compared with a commercially available enzyme. Enzymes that were compared were lipase OF (derived from Mecan Sangyo Co., Ltd .: Candida cylindrace), lipase LP-051-1S (derived from Toyo Brewing Co., Ltd .: Pseudomonas sp), Novozyme 435 (derived from Novo Nordisk Industry: Candida antractica), lipo Protein lipase (type A) (Toyobo Co., Ltd .: derived from Pseudomonas sp). The results are shown in Table 2.
[0052]
[Table 2]

[0053]
Only the enzyme of the present invention was found to have tribenzoylglycerol degrading activity and to have high specificity for pNPB.
[0054]
【The invention's effect】
The enzyme of the present invention is useful for hydrolysis of bulky substrates, and is considered useful for the production of optically active substances required for intermediate raw materials for pharmaceuticals.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing molecular weight measurement by SDS-PAGE.
FIG. 2 is a diagram showing measurement of molecular weight by gel filtration.
FIG. 3 shows the pH stability of the enzyme of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the optimum reaction temperature of the enzyme of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the thermal stability of the enzyme of the present invention.

Claims

The following properties:
Action: hydrolyzes tribenzoylglycerol,
Substrate specificity: at least 3 times higher hydrolysis activity for p-nitrophenyl benzoate than for p-nitrophenyl acetate,
Molecular weight: 62 ± 1 kDa on SDS-PAGE under denaturing-reducing conditions and
50 ± 1 kDa by HPLC gel filtration under non-denaturing conditions,
Origin of microorganisms: microorganisms belonging to the genus Acinetobacter,
Optimum pH: about 8.0,
pH stability: about 6.0 to 8.0,
Optimum temperature: about 45 ° C and thermal stability: 35 ° C or less,
An esterolytic enzyme.

Acinetobacter calcoaceticus subsp. Antiratus FERM P-17224 strain.

A method for producing the esterolytic enzyme according to claim 1, comprising the step of culturing the microorganism according to claim 2 .