JP4166496B2

JP4166496B2 - Novel gene involved in neuralization induction, protein thereof, and method of use thereof

Info

Publication number: JP4166496B2
Application number: JP2002116378A
Authority: JP
Inventors: 眞規平良; 真一長田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2002-04-18
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2022-04-18
Also published as: JP2003304881A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経化誘導に関与する新規タンパク質、およびその遺伝子、並びにその利用方法に関し、より詳細には、当該タンパク質、若しくはその遺伝子を含有する神経化誘導剤、神経化誘導方法、並びに骨形成因子ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アフリカツメガエルの胚の胞胚期から原腸胚期にかけて動物極側に位置する、予定外胚葉組織（アニマル・キャップ）は多分化能を有しており、種々の因子に反応して外、中、内胚葉由来の様々な組織、器官に分化することが知られている。
【０００３】
近年、このアニマル・キャップの性質を利用して、脊椎動物における神経誘導のメカニズムを解明するための研究が盛んに行われており、これまでの研究成果として、脊椎動物における神経誘導には、骨形成因子ＢＭＰ(Bone Morphogenetic Protein)を介するシグナル伝達の経路を阻害することが重要であるとの報告も多数なされている（例えば、文献Harland, R.(2000). Neural induction, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, pp357-62.参照）。
【０００４】
この骨形成因子として、ヒトでは現在までに９種類のＢＭＰ（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−９）がクローニングされている。このＢＭＰは骨形成ばかりでなく、受精卵から分裂増殖、細胞分化により新しい組織、器官が形成されてくる、いわゆる形態形成にも関与していることが知られている（例えば、文献Hogan, BL.(1996). Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, pp1580-94.参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
脊椎動物における神経誘導のメカニズムは、様々な因子が関与していることから非常に複雑であり、そのメカニズムは未だ十分に解明されているとはいえず、神経誘導と密接に関与していると考えられる骨形成因子ＢＭＰのシグナル伝達経路の詳細についても明らかにはなっていない。
【０００６】
他方、もし脊椎動物における神経誘導に関与する未知の遺伝子や未知のタンパク質が明らかにされれば、当該遺伝子およびタンパク質の機能解析を通じ、神経誘導による形態形成の分子機構やＢＭＰシグナル伝達経路の詳細がより一層明らかにされるといった学術的意義もさることながら、例えば神経系の異常により引き起こされる疾病の病態機序の研究や治療薬、治療法等の開発にも利用できる可能性があり、医学的領域への幅広い利用が期待できる。
【０００７】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、脊椎動物における神経誘導に関与する新規遺伝子、およびそのタンパク質を提供するとともに、これらの利用方法を提案することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、アフリカツメガエルのアニマル・キャップを神経化させる因子をクローニングし、新規神経化誘導因子ＸＭＡＮ１（Xenopus ＭＡＮ１）を同定した。さらに、その機能を詳細に解析することにより、この新規神経化誘導因子ＸＭＡＮ１が、骨形成因子ＢＭＰを介するシグナル伝達経路を阻害し神経化を誘導する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経化誘導因子としての活性を持つタンパク質。
【００１０】
上記タンパク質の具体的な一例として、アフリカツメガエル由来の神経化誘導因子ＸＭＡＮ１が挙げられる。具体的には、上記ＸＭＡＮ１タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する７８１アミノ酸からなる、分子量約８８０００のタンパク質である。
【００１１】
上記ＸＭＡＮ１タンパク質は、後述のように、骨形成因子ＢＭＰのシグナル伝達を阻害し、神経化を誘導する活性を有する。従って、ＸＭＡＮ１タンパク質の構造、機能を詳細に解析することにより、脊椎動物における神経化誘導のメカニズムが明らかにされるだけでなく、例えば神経系の異常により引き起こされる疾病の病態機序の研究や治療薬等にも利用できる可能性がある。
【００１２】
ここで、上記「タンパク質」とは、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【００１３】
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のヒスチジンタグ等の付加配列を末端に含ませてもよい。
【００１４】
上記のように変異を導入すれば、神経化誘導因子として高い活性を持つタンパク質や精製の容易な組替えタンパク質等を人為的に得られる可能性がある。
【００１５】
また、本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１６】
本発明に係る上記構成の遺伝子として、例えば、ＸＭＡＮ１遺伝子が挙げられる。具体的には、上記ＸＭＡＮ１遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列をｃＤＮＡとして有している。
【００１７】
上記ＸＭＡＮ１遺伝子は、後述のように、アフリカツメガエルのアニマル・キャップの多分化能を利用して、アニマル・キャップを神経化する活性（神経化誘導活性）を指標に発現クローニング法とシブ・セレクション法を用いて単離された。上記遺伝子は、アフリカツメガエルにおける神経誘導に関与する遺伝子である。従って、上記遺伝子は、ＸＭＡＮ１タンパク質と同様な目的に利用することができる。さらに、上記ＸＭＡＮ１遺伝子を用いて、他の動物から相同性を有する、より有用な遺伝子を単離することも可能である。
【００１８】
なお、本発明に係る「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれるものとする。また、ＤＮＡには少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡが含まれ、ＲＮＡには、ｍＲＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは２本鎖のみならず、それを構成するセンス鎖、アンチセンス鎖といった１本鎖でもよい。さらに、上記「遺伝子」は、上記（ａ）、（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００１９】
また、本発明に係る神経化誘導剤は、上記（ａ）、（ｂ）のタンパク質、上記（ａ）タンパク質（即ち、ＸＭＡＮ１タンパク質）のヒトホモログであるタンパク質、または、これらタンパク質（即ち、上記（ａ）タンパク質、上記（ｂ）タンパク質、もしくは上記（ａ）タンパク質のヒトホモログ）をコードする遺伝子のいずれか一つを含有する神経化誘導剤である。
【００２０】
上記（ａ）タンパク質のヒトホモログの具体的な一例である、ヒトＭＡＮ１タンパク質は、後述のように、上記ＸＭＡＮ１タンパク質と相同性が高く、神経化を誘導する活性を有していると推定され、従って、ＸＭＡＮ１タンパク質と同様の利用可能性があると考えられる。なお、「上記（ａ）タンパク質のヒトホモログ」には、ヒトＭＡＮ１タンパク質以外に、このヒトＭＡＮ１タンパク質と一部のアミノ酸配列が異なるものの、その相違部分が機能上重要な領域ではなく、実質的にヒトＭＡＮ１タンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。
【００２１】
従って、例えば、上記ヒトＭＡＮ１タンパク質をコードする遺伝子である、ヒトＭＡＮ１遺伝子（アクセッションNo.AF112299）を本発明の神経化誘導剤に用いることも可能である。
【００２２】
本発明の神経化誘導剤の利用法としては、▲１▼脊椎動物の未分化細胞に作用させることにより、その未分化細胞を神経化することへの利用、▲２▼神経系の疾患を有する脊椎動物に用いることにより、その個体における神経系の疾患を治療若しくは緩和することへの利用、等が挙げられる。
【００２３】
本発明に係る神経化誘導方法は、上記（ａ）、（ｂ）のタンパク質、上記（ａ）タンパク質のヒトホモログであるタンパク質、または、これらタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一つを用いて細胞又は組織の神経化を誘導する方法である。また、本発明に係る骨形成因子ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、上記（ａ）、（ｂ）のタンパク質、上記（ａ）タンパク質のヒトホモログであるタンパク質、または、これらタンパク質をコードする遺伝子のいずれか一つを含有するものである。
【００２４】
上記骨形成因子ＢＭＰは、生体内で多彩な生理作用を引き起こすことが知られているが、未だＢＭＰのシグナル伝達経路の詳細は明らかにされていない。従って、本発明に係る阻害剤を脊椎動物の細胞に用いることにより、脊椎動物の生体内で多彩な生理作用を引き起こすＢＭＰのシグナル伝達経路を阻害することができ、分子生物学的、細胞生物学的、発生生物学的にＢＭＰのシグナル伝達経路の詳細を解析する上での有効な手段となる。例えば、ＢＭＰのシグナル伝達経路の研究用アッセイキットや試薬の開発を行うことができる。また、本発明に係る阻害剤は、ＢＭＰのシグナル伝達経路に関係する種々の疾患の治療薬としても利用できる可能性がある。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明に係るタンパク質は、脊椎動物において胚の神経化を誘導する活性を有するタンパク質である。本実施の形態では、アフリカツメガエル由来のＸＭＡＮ１タンパク質を挙げて説明する。後述する実施例に示すように、このＸＭＡＮ１タンパク質は、骨形成因子ＢＭＰのシグナル伝達経路を阻害し、アフリカツメガエルのアニマル・キャップの神経化を誘導する活性（神経化誘導活性）を有しているタンパク質である。上記ＸＭＡＮ１は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、７８１アミノ酸からなる、分子量約８８０００のタンパク質である。
【００２６】
上記ＸＭＡＮ１タンパク質は、ＸＭＡＮ１遺伝子にコードされている。このＸＭＡＮ１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号２に示すように、２６４５塩基対（約２．６５ｋｂｐ）のサイズを有しており、１０番目から１２番目の塩基配列が開始コドン（ＡＴＧ）であり、２３５３番目から２３５５番目の塩基配列が終止コドン（ＴＧＡ）である。従って、上記ＸＭＡＮ１遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列のうち、１０番目から２３５２番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、２３４３塩基対（約２．３４ｋｂｐ）のサイズを有している。
【００２７】
また、本発明にかかるＸＭＡＮ１遺伝子としてのＤＮＡは、動物のゲノム中に含まれる形態、すなわちイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００２８】
また、本発明にかかるＸＭＡＮ１遺伝子としてのＤＮＡには、コードされているＸＭＡＮ１タンパク質の形成に悪影響を与えないか妨げない限りにおいて、他のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、遺伝子組み換え等に用いるために、リンカーを末端に含ませることもできる。
【００２９】
本発明にかかるＸＭＡＮ１遺伝子のクローニング方法としては、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。本発明においては、その目的が、従来知られていないアフリカツメガエルにおける神経誘導に関与する遺伝子をクローニングすることであったので、後述する実施例で説明するように、アフリカツメガエルのアニマル・キャップの多分化能を利用して、神経化誘導活性を指標に発現クローニング法とシブ・セレクション法とを用いて単離している。
【００３０】
本発明では、アフリカツメガエル由来の上記ＸＭＡＮ１遺伝子を用いて、他の動物からＸＭＡＮ１遺伝子と相同性を有するＤＮＡをクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００３１】
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている動物の場合には、上記ＸＭＡＮ１遺伝子の塩基配列、若しくはアミノ酸配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴによる塩基配列及びアミノ酸配列レベルの相同性検索を好適に用いることができる。
【００３２】
また、ゲノムがデータベース化されていない動物の場合には、例えば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニング・ベクターを使用して対象となる動物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、上記ＸＭＡＮ１遺伝子の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出するステップとを含む方法を用いることができる。このように本発明のＸＭＡＮ１遺伝子のうち、少なくとも一部の領域はプローブとして有用である。プローブに用いる領域には、ＸＭＡＮ１遺伝子とそのヒトホモログＭＡＮ１遺伝子間で保存性の高い配列が含まれることが好ましく、例えば、ＰＣＲ法にてこのような領域を増幅させてプローブとして用いることが可能である。
【００３３】
本発明に係るＸＭＡＮ１遺伝子の一部を改変することによって、変異型ＸＭＡＮ１遺伝子が得られる。この変異型ＸＭＡＮ１遺伝子は、動物生体内にて発現することで、野性型と比べてより優れた神経化誘導活性を有するものであってもよいし、野性型と同じ神経化誘導活性を有しているサイレント突然変異（アミノ酸配列は変わらず、塩基配列のみが変化する変異）であってもよい。
【００３４】
つまり、本発明に係る変異ＸＭＡＮ１タンパク質は、神経化誘導因子としての活性が野生型ＸＭＡＮ１タンパク質と略同等であってもよいし、より優れていてもよい。
【００３５】
また、変異の様式は特に限定されるものではなく、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／または付加されていればよい。
【００３６】
例えば、本発明者らは、後述する実施例に示すように、種々のＸＭＡＮ１欠失変異タンパク質を作製し、その機能解析を行うことにより、ＸＭＡＮ１タンパク質の活性発現に必要な領域として、ＸＭＡＮ１タンパク質のカルボキシル末端領域（Ｃ末端領域；５８２番目から７８１番目のアミノ酸残基）を同定した。このＣ末端領域のみで、ＢＭＰのシグナル伝達経路を阻害しアフリカツメガエルのアニマル・キャップの神経化を誘導することができる。
【００３７】
つまり、本発明には、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＸＭＡＮ１タンパク質の変異体であって、神経化誘導因子として野生型と略同等の活性を持つ変異タンパク質が含まれていてもよく、具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端側（Ｎ末端側）のＬＥＭドメインを含む４３個のアミノ酸が欠失された変異タンパク質ΔＬＥＭ、Ｎ末端側の４４９個のアミノ酸が欠失された変異タンパク質ΔＴＭ１、Ｎ末端側の５８１個のアミノ酸が欠失され、Ｃ末端領域のみからなる変異タンパク質ＣＴ（５８２番目から７８１番目のアミノ酸残基）を挙げることができる。勿論、変異タンパク質はこれに限られず、神経化誘導活性の発現に重要な領域と考えられる後述のＲＮＰ１領域（７０１番目から７０８番目のアミノ酸残基）以外の領域に変異が導入され、野生型と略同等またはより優れた神経化活性誘導を有する変異タンパク質も含まれる。また、本発明には、上記変異タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
【００３８】
このように、本発明に係るＸＭＡＮ１遺伝子としては、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質か、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経化誘導因子としての活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であればよい。
【００３９】
また、後述する実施例に示すように、相同性検索の結果、ＸＭＡＮ１遺伝子はヒトＭＡＮ１遺伝子と高い相同性を有している。しかしながら、本発明完成時までヒトＭＡＮ１遺伝子は機能未知であり、今回、ＸＭＡＮ１遺伝子は、ヒトＭＡＮ１遺伝子とは無関係にクローニングされたものである。
【００４０】
さらに、後述する実施例に示すように、ＸＭＡＮ１タンパク質のＣ末端領域とヒトＭＡＮ１タンパク質のＣ末端領域とは、アミノ酸レベルで相同性９４％を示している。従って、ヒトＭＡＮ１タンパク質もＸＭＡＮ１タンパク質と同様に、神経化を誘導し、ＢＭＰのシグナル伝達経路の阻害活性を有すると推定できる。つまり、本発明は、ヒトＭＡＮ１タンパク質がＢＭＰのシグナル伝達経路を阻害すると共に、脊椎動物において神経誘導に関与する機能を持つことを最初に明らかにしたものである。
【００４１】
ヒトＭＡＮ１タンパク質は、ヒトの核内膜に局在する膜タンパク質であることが知られており(文献 Lin, F. et al. (2000).MAN1, an inner nuclear membrane protein that shares the LEM domain with lamina-associated polypeptide 2 and emerin. J. Biol. Chem. 275, pp4840-4847参照)、ＸＭＡＮ１タンパク質も構造上の類似性から核内膜タンパク質であると推定される。
【００４２】
また、ヒト膠原病患者の血清中に、ヒトＭＡＮ１タンパク質に対する自己抗体が現れることがこれまで報告されている(文献 Paulin-Levasseur, M. et al. (1996). The MAN antigens are non-lamin constituents of the nuclear lamina in vertebrate cells. Chromosoma, 104, pp367-79参照)。ヒト膠原病は、一種の自己免疫疾患であると考えられており、その原因は未だ明らかにされておらず、治療法等も十分ではない。
【００４３】
本発明を用いることにより、ヒトＭＡＮ１タンパク質の機能（ＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性、神経化誘導活性）とヒト膠原病の病態との関係を調べるための診断薬や診断方法等を開発することが可能である。さらに、ヒト膠原病の病態機序を解明するための有効な手段となり、ＢＭＰシグナル伝達経路を標的とした治療薬を開発することも可能である。即ち、ヒト膠原病の病態機序の解明という基礎研究的な利用だけでなく、治療薬や治療法等の医学的な利用も可能である。
【００４４】
また、核膜の消失・生成は、細胞分裂（癌化を含む）、細胞周期、遺伝子の発現制御と密接に関係している。この核膜の消失・生成と核内膜タンパク質であるＭＡＮ１、ＸＭＡＮ１のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性との関連性を調べるためのアッセイ法の確立、試薬の開発等も可能である。
【００４５】
以上、アフリカツメガエルの神経化誘導因子ＸＭＡＮ１やヒトＭＡＮ１タンパク質について、それぞれ利用可能性を述べてきたが、これら２つのタンパク質は高い相同性を有していることから、同様な機能があると推定される。従って、いずれのタンパク質、若しくはこれらのタンパク質をコードするいずれの遺伝子を用いても、本発明は、脊椎動物における神経化のメカニズム、骨形成因子ＢＭＰのシグナル伝達経路、ヒト膠原病の病態機序等の解明に役立つと考えられる。
【００４６】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例では、アフリカツメガエルの新規神経化誘導因子ＸＭＡＮ１のクローニングとその機能解析を行った結果を概略説明する。
【００４８】
〔実施例１〕新規神経化誘導因子のクローニング
アフリカツメガエルの胚の胞胚期から原腸胚期にかけての予定外胚葉組織（アニマル・キャップ）の多分化能を利用して、将来脳組織となる前方神経外胚葉から作製したｃＤＮＡライブラリーからアニマル・キャップを神経化する活性（神経化誘導活性）を有する因子を、発現クローニング法とシブ・セレクション法を用いて単離した。具体的には、アフリカツメガエルの体外受精と胚の培養は、Kay and Pengの方法(Xenopus Laevis: practical uses in cell and molecular biology, Methods in Cell Biology, Volume 36, Academic Press,1991)に従った。胚のステージは、Nieuwkoop and Faber(Normal table of Xenopus Laevis, Garland Publishing,1994)に基づいて決定した。前方神経外胚葉特異的ｃＤＮＡライブラリーは、Shingaらの報告(Mech. Of Dev., Vol. 109, pp225-239, 2001)に基づいて、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GibcoBRL)を用いて作製し、pCS105ベクター（カリフォルニア大学 Richard Harland博士からの供与）に導入した。シブ・セレクション法は、Lustigらの報告(Methods in Enzymology, Vol. 283, pp83-99, 1997)を参考にした。
【００４９】
即ち、ｃＤＮＡライブラリーを２００クローンからなるプールに分割し、プールごとにｃＤＮＡから合成したＲＮＡをアニマル・キャップに微量注入した。その後、アニマル・キャップにおける汎神経マーカーnrp-1の誘導の有無を、ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。ＲＴ−ＰＣＲ法は、２細胞期にｍＲＮＡを胚の動物極に微量注入し、胞胚期にアニマル・キャップを切り出した後、原腸胚期、尾芽胚期のそれぞれにおいてアニマル・キャップを回収した。ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ＰＣＲ反応は、Wilson and Melton(Curr. Biol., Vol.4, pp676-686, 1994)に基づいて、非ラジオアイソトープ存在下で行った。以下、ＲＴ−ＰＣＲ法はこの方法を用いた。なお、ＲＴ−ＰＣＲ法の替わりに、in situハイブリダイゼーション法を用いることも可能である。次いで、nrp-1の発現を誘導する活性をもつプールに関して、プールサイズを順次小さくしていき、最終的に神経化誘導活性を有する単一のクローンＡ１２４を得た。
【００５０】
次いで、図１（ａ）に示すように、２細胞期の胚の動物極にクローンＡ１２４のｍＲＮＡを微量注入した後、図１（ｂ）に示すように、胞胚期にアニマル・キャップを切り出した。その後、図２に示すように、原腸胚期、尾芽胚期のアニマル・キャップそれぞれにおいて、種々のマーカーの発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。なお、注入したクローンＡ１２４のｍＲＮＡ量は、１胚あたり１００ｐ（ピコ）ｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇである。また、β-globin（５００）は、ネガティブコントロールとしてβ-globinのｍＲＮＡを５００ｐｇ注入したことを示す。また、ＲＴ（＋）、ＲＴ（−）は、それぞれポジティブコントロール、ネガティブコントロールを示す。ＥＦ−１αは反応に用いたｃＤＮＡ量のコントロールである。
【００５１】
ＲＴ−ＰＣＲの結果、中胚葉マーカーとして知られるXbra、actinの発現誘導なしに、汎神経マーカーであるnrp-1、前方神経マーカーであるXAG-1、otx-2の発現が誘導された。しかし、後方神経マーカーであるHoxB-9は発現誘導されなかった。この結果により、クローンＡ１２４にコードされている因子は、前方神経の誘導に関わる新規因子であることが示唆された。また、その神経誘導化活性は、中胚葉の誘導を介した２次的なものではないことを意味している。
【００５２】
〔実施例２〕クローンＡ１２４の構造解析
次に、クローンＡ１２４の全長を含むｃＤＮＡを単離した。具体的には、クローンＡ１２４をプローブとしてアフリカツメガエルのステージ３０期の頭部ｃＤＮＡライブラリーを用いてスクリーニングし、得られたポジティブクローンのうち、インサートの最も長いクローンＰＣ１１の塩基配列を決定した。しかし、このクローンＰＣ１１も開始コドンを欠いていたので、5'-Full RACE Core Set(TAKARA)を用いて、開始コドンを含む上流領域を増幅し、この遺伝子の全長を決定した。その全構造を決定したところ、図３に示すように、７８１アミノ酸からなる分子量約８８０００のタンパク質をコードしていることがわかった。
【００５３】
この遺伝子の相同性検索を行ったところ、ヒトＭＡＮ１遺伝子と高い相同性を示すことがわかった。ヒトＭＡＮ１遺伝子は、９１０アミノ酸からなり、核内膜に存在する機能未知のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５４】
従って、ヒトＭＡＮ１遺伝子と相同性が高かったことから、この遺伝子をＸＭＡＮ１（Xenopus ＭＡＮ１）と命名した。
【００５５】
このＸＭＡＮ１タンパク質とヒトＭＡＮ１タンパク質とは、構造上の特徴も非常に類似していることが明らかとなった。ＸＭＡＮ１タンパク質は、ヒトＭＡＮ１タンパク質と同様に、Ｎ末端側にクロマチンと結合すると考えられるＬＥＭドメイン（５番目から４３番目のアミノ酸残基）を有している。なお、これら２つのタンパク質間における、このＬＥＭドメインの相同性は７４％であった。
【００５６】
また、ＸＭＡＮ１タンパク質は、疎水性アミノ酸に富む２つの膜貫通領域ＴＭ１、ＴＭ２（ＴＭ１；３４９番目から３７２番目のアミノ酸残基、ＴＭ２；４９７番目から５１９番目のアミノ酸残基）を有しており、この点でもヒトＭＡＮ１タンパク質と類似している。ヒトＭＡＮ１タンパク質はこの２つの膜貫通領域を介して核内膜に埋め込まれており、Ｎ末端とＣ末端は共に核の内側に存在する膜タンパク質である事が知られている。従って、ＸＭＡＮ１タンパク質も生体内でヒトＭＡＮ１タンパク質と同様の局在性を示すと考えられる。
【００５７】
さらに、ＸＭＡＮ１タンパク質はＣ末端領域（５８２番目から７８１番目のアミノ酸残基）に、ＲＮＡ結合タンパク質に多く見られるＲＮＰ２（６６１番目から６６６番目のアミノ酸残基）、ＲＮＰ１（７０１番目から７０８番目のアミノ酸残基）と呼ばれる保存配列を含むＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ；６５６番目から７３３番目のアミノ酸残基）を有することがわかった。また、ヒトＭＡＮ１タンパク質も非常に類似しているＣ末端領域を有していることがわかった。即ち、これら２つのタンパク質間における、このＣ末端領域の相同性は、アミノ酸レベルで９４％であった。これまで、ヒトＭＡＮ１タンパク質にＲＲＭが存在することは文献的にも指摘されておらず、今回初めてその存在を明らかにした。
【００５８】
〔実施例３〕新規神経化因子ＸＭＡＮ１の活性発現に必須な領域の特定
ＸＭＡＮ１タンパク質のどの領域に神経化誘導活性があるのかを調べるために、図４に示すように、ＸＭＡＮ１タンパク質の欠失変異タンパク質ΔＬＥＭ、ΔＴＭ１、ΔＣＴ、ＣＴをそれぞれ作製した。欠失変異タンパク質ΔＬＥＭ、ΔＴＭ１、ΔＣＴとは、野生型ＸＭＡＮ１タンパク質ＷｔからそれぞれＬＥＭドメイン、ＴＭ１領域、Ｃ末端領域を欠失させた変異タンパク質であり、欠失変異タンパク質ＣＴとは、Ｃ末端領域のみ残存させ、この領域以外を欠失させた変異タンパク質である。なお、Δ（デルタ）とは、欠失変異体を意味する記号である。
【００５９】
具体的には、ＸＭＡＮ１タンパク質の種々の変異タンパク質は、ＰＣＲ法を用いて作製し、pCS+MTベクターに導入した。微量注入に用いたｍＲＮＡは、MEGAscript IN Vitro Transcription Kits(Ambion)を用いて合成した。
【００６０】
それぞれの欠失変異タンパク質のｍＲＮＡを２細胞期の胚の動物極に微量注入し、胞胚期にアニマル・キャップを切り出した後、尾芽胚期におけるアニマル・キャップでの汎神経マーカーnrp-1の発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。
【００６１】
具体的には、尾芽胚期のアニマル・キャップからＲＮＡを単離し、公知の手法に従いｃＤＮＡを合成して、ＰＣＲ法による増幅を行った。なお、Uninj,はＲＮＡを注入していないアニマル・キャップを示す。そのＲＴ−ＰＣＲの結果、欠失変異タンパク質ΔＬＥＭ、ΔＴＭ１、ＣＴは野生型タンパク質Ｗｔと略同等のnrp-1の発現を誘導した。しかし、欠失変異タンパク質ΔＣＴは、ほとんどnrp-1の発現を誘導しなかった。従って、ＸＭＡＮ１タンパク質のＣ末端領域が神経化誘導活性に必須であることがわかった。このＣ末端領域は、ヒトＭＡＮ１タンパク質のＣ末端領域と高い相同性を示しており、進化上もこの領域が重要な機能を有していることが示唆された。従って、このＸＭＡＮ１タンパク質のＣ末端領域を神経化誘導活性ドメインＣＴと呼ぶこととした。
【００６２】
さらに、この神経化誘導活性ドメインＣＴについて、欠失変異タンパク質ＣＴΔＲＲＭ、ＲＲＭ、ＣＴΔＲＮＰ１を作製して詳細に検討した。欠失変異タンパク質ＣＴΔＲＲＭ、ＣＴΔＲＮＰ１は、神経化誘導活性ドメインＣＴからそれぞれＲＲＭ、ＲＮＰ１を欠失させた変異タンパク質である。欠失変異タンパク質ＲＲＭは、神経化誘導活性ドメインＣＴのＲＲＭのみ残存させて、Ｎ末端からＲＲＭまでの領域を欠失させた変異タンパク質である。
【００６３】
これらの欠失変異体のｍＲＮＡを用いて、上記と同様の方法でnrp-1の誘導を指標に、神経化誘導活性ドメインの機能に重要な部位を調べた結果、図４に示すように、欠失変異タンパク質ＣＴΔＲＲＭ、ＲＲＭ、ＣＴΔＲＮＰ１は、いずれもnrp-1の発現を誘導しなかった。この結果から、ＲＲＭ、特にその中のＲＮＰ１配列が神経化誘導活性に重要な役割を果たしていることがわかった。これまで、ヒトＭＡＮ１タンパク質にＲＲＭの存在のみならず、その機能についても全くわかっていなかったが、今回初めてその存在意義を示すことができた。
【００６４】
〔実施例４〕神経活性化ドメインによるＢＭＰシグナル伝達経路の阻害
さらに、ＸＭＡＮ１タンパク質は骨形成因子ＢＭＰのシグナル伝達経路を阻害することにより、アニマル・キャップを神経化するのか否か検討した。ＢＭＰのシグナルは細胞表面のＢＭＰI型受容体、ＢＭＰII型受容体の２種類の受容体と細胞内因子Smad（特にSmad１，４，５，８）とを介して核に伝えられた後、そこで標的因子の発現誘導、活性化を通して多様な生理作用を引き起こすと考えられている。これら、ＢＭＰシグナル伝達経路の直接的な標的因子として、アフリカツメガエルではXmsx-1、Xhox-3、Xvent-2等が知られている。
【００６５】
そこで、２細胞期の胚の動物極にＢＭＰ−４、若しくは活性化型ＢＭＰI型受容体（ＡＬＫ３^*）のｍＲＮＡを単独で微量注入し、胞胚期にアニマル・キャップを切り出した後、原腸胚期に種々のマーカーの発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。具体的には、原腸胚期のアニマル・キャップからＲＮＡを単離し、公知の手法に従いｃＤＮＡを合成して、ＰＣＲ法による増幅を行った。なお、図５に示すように、注入したＢＭＰ−４のｍＲＮＡ量は、胚１個あたり、２００ｐｇ、ＡＬＫ３^*は５００ｐｇであり、ＣＴは注入していない。コントロールとして、ＣＴのｍＲＮＡのみを５００ｐｇ注入したものを示した。そのＲＴ−ＰＣＲの結果は図５に示すように、ＢＭＰ−４またはＡＬＫ３^*のｍＲＮＡのみを注入した場合、標的因子Xmsx-1、Xhox-3の発現は誘導された。また、ＣＴのｍＲＮＡを単独で注入した場合、標的因子Xmsx-1、Xhox-3の発現は誘導されなかった。なお、活性化型ＢＭＰI型受容体（ＡＬＫ３^*）とは、ＢＭＰを受容しなくても活性型として機能し、恒常的にシグナルを細胞内に伝達する受容体である。
【００６６】
しかし、同様にＢＭＰ−４のｍＲＮＡと、若しくはＡＬＫ３^*のｍＲＮＡと神経化誘導活性ドメインＣＴのｍＲＮＡとを一緒に微量注入した場合（注入したＢＭＰ−４、ＡＬＫ３^*のｍＲＮＡ量はそれぞれ、胚１個あたり、２００ｐｇ、５００ｐｇ、またＣＴのｍＲＮＡ量はそれぞれ、１００，５００，１０００ｐｇである。）、標的因子Xmsx-1、Xhox-3の発現誘導は、注入したＣＴのｍＲＮＡ量に依存して著しく阻害された。なお、中胚葉マーカーXbraの発現誘導はＣＴのｍＲＮＡの注入量によって、ほとんど変化しなかった。これらの結果から、神経化誘導活性ドメインＣＴがＢＭＰのシグナル伝達経路を受容体より下流で阻害することが示された。
【００６７】
〔実施例５〕新規神経化因子ＸＭＡＮ１によるＢＭＰ標的因子の転写抑制
さらに、ＸＭＡＮ１がＢＭＰの標的因子の発現誘導を転写レベルで抑制しているか否かをルシフェラーゼ・アッセイ法を用いて調べた。
【００６８】
具体的には、ルシフェラーゼ活性は、Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いて測定した。まず、ＢＭＰの標的因子の一つ、Xvent-2のプロモーターの下流にリポーター遺伝子としてfireflyルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ(Xvent2-Luc、カリフォルニア大学 Ken Cho博士からの供与)を用いた。その後、このプラスミドＤＮＡ(Xvent2-Luc)を１００ｐｇ、Renillaルシフェラーゼ遺伝子を持つコントロールプラスミドＤＮＡ(pRL-TK)を２ｐｇ、ＢＭＰ−４のｍＲＮＡ並びにＷｔ、ＣＴのいずれか１つのｍＲＮＡを混合して、２細胞期の胚の動物極に微量注入した。胞胚期にアニマル・キャップを切り出した後、原腸胚期に５個ずつ、３本のチューブに集め、各チューブに５０μｌのルシフェラーゼ反応液を加えて、fireflyルシフェラーゼ活性を測定した。その後、Gro & Stop溶液を加えてRenillaルシフェラーゼ活性を測定した。測定には、ルミノメーター(Berthold)を用いた。Fireflyルシフェラーゼ活性値をRenillaルシフェラーゼ活性値で割った値を補正値とし、３本のチューブの平均値を算出した。また、ＢＭＰ−４の替わりにＡＬＫ３^*を用いて、同様にルシフェラーゼ活性を測定した。なお、注入したＢＭＰ−４のｍＲＮＡ量は、１胚あたり２００ｐｇ、ＡＬＫ３^*は５００ｐｇ、ＸＭＡＮ１のｍＲＮＡは野生型Ｗｔ、欠失変異体ＣＴともに５００ｐｇである。また、コントロールとして、ＢＭＰ−４のｍＲＮＡと、若しくはＡＬＫ３^*のｍＲＮＡと、ルシフェラーゼ遺伝子をXvent-2のプロモーターと異なるプロモーター(GL-3)の下流に組み込んだプラスミドＤＮＡ(GL3-Luc)とを注入した場合、Xvent2-Lucのみを注入した場合を示す。
【００６９】
これらのルシフェラーゼ・アッセイの結果、図６に示すように、ＢＭＰ−４若しくはＡＬＫ３^*のｍＲＮＡとXvent2-Lucとを注入した場合、ルシフェラーゼ活性は上昇した。しかし、この活性上昇は、野生型ＸＭＡＮ１タンパク質Ｗｔ、神経化誘導活性ドメインＣＴにより著しく抑制された。従って、ＸＭＡＮ１タンパク質、特にその神経化誘導活性ドメインＣＴは、ＢＭＰの標的因子の転写活性化を抑制することがわかった。
【００７０】
なお、ＢＭＰ−４若しくはＡＬＫ３^*非存在下でも、ある程度のルシフェラーゼ活性が見られるのは、アニマル・キャップ内に存在する内在性のＢＭＰの働きによるものと考えられる。
【００７１】
【発明の効果】
以上のように、本発明のタンパク質、遺伝子、神経化誘導剤、神経化誘導方法並びにＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、脊椎動物における神経化のメカニズムの解明という基礎研究上の利用のみならず、神経系の疾患等に対する治療薬や治療法の開発等への応用が可能であるという効果を奏する。
【００７２】
また、本発明は、▲１▼ヒト膠原病患者血清中の抗ヒトＭＡＮ１抗体の存在の有無やヒト膠原病の病態機序を調べるための診断法、診断薬の開発並びにＢＭＰシグナル伝達経路を標的とした治療薬への利用可能性、さらには、▲２▼癌化を含む細胞分裂、細胞周期、遺伝子発現制御らと密接に関係している核膜の消失・生成を調べるためのアッセイ法や試薬への利用可能性を有するものである。
【００７３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明の実施例におけるアフリカツメガエルの２細胞期の胚へのｍＲＮＡの注入操作を示した概略説明図であり、（ｂ）は、胞胚期におけるアニマル・キャップの切り出し操作を示した概略説明図である。
【図２】図１で切り出したアニマル・キャップの原腸胚期、尾芽胚期における各種マーカーの発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた結果を示す電気泳動図である。
【図３】本発明の実施例におけるヒトＭＡＮ１並びにＸＭＡＮ１タンパク質の各構造を概略的に示す模式図である。
【図４】ＸＭＡＮ１の各種欠失変異タンパク質を示す概略模式図、並びに各種変異ｍＲＮＡを注入したアニマル・キャップの尾芽胚期における各種マーカーの発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた結果を示す電気泳動図である。
【図５】各種ｍＲＮＡを注入したアニマル・キャップの原腸胚期における各種マーカーの発現誘導をＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた結果を示す電気泳動図である。
【図６】ＸＭＡＮ１の各種変異タンパク質によるＢＭＰの標的因子の転写活性の抑制を、ルシフェラーゼ・アッセイ法により調べた結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel protein involved in neurization induction, a gene thereof, and a method of using the same, and more specifically, a neurization inducer, a neurization induction method, and bone formation containing the protein or the gene thereof. Factor BMP signaling pathway inhibitors.
[0002]
[Prior art]
The planned ectoderm tissue (animal cap), located on the polar side of the animal from the blastocyst stage to the gastrulation stage of Xenopus laevis, has pluripotency and responds to various factors in the outer, middle, It is known to differentiate into various tissues and organs derived from the endoderm.
[0003]
In recent years, research has been actively conducted to elucidate the mechanism of nerve induction in vertebrates using the properties of this animal cap. As a result of previous research, There are many reports that it is important to inhibit the pathway of signal transduction through the formation factor BMP (Bone Morphogenetic Protein) (for example, Harland, R. (2000). Neural induction, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, pp357-62.)
[0004]
Nine types of BMPs (BMP-1 to BMP-9) have been cloned as human osteogenic factors in humans. It is known that this BMP is involved not only in bone formation but also in so-called morphogenesis in which new tissues and organs are formed from fertilized eggs through division proliferation and cell differentiation (for example, the literature Hogan, BL (1996). Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. See Genes Dev. 10, pp1580-94.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The mechanism of nerve induction in vertebrates is very complicated because various factors are involved, and the mechanism has not been fully elucidated, and it is closely related to nerve induction. The details of the possible signal transduction pathway of the bone morphogenetic factor BMP are not clear.
[0006]
On the other hand, if an unknown gene or an unknown protein involved in nerve induction in a vertebrate is clarified, through the functional analysis of the gene and protein, details of the molecular mechanism of morphogenesis by nerve induction and the details of the BMP signaling pathway can be obtained. In addition to its academic significance, it may be used for research of pathologic mechanisms of diseases caused by abnormalities in the nervous system, and development of therapeutic drugs and treatment methods. A wide range of usage in the field can be expected.
[0007]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel gene involved in nerve induction in vertebrates and a protein thereof, and to propose a method for using them.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have cloned a factor that neurizes the animal cap of Xenopus laevis and identified a novel neurization-inducing factor XMAN1 (Xenopus MAN1). Furthermore, by analyzing the function in detail, it was found that this novel neuralization-inducing factor XMAN1 has an effect of inhibiting the signal transduction pathway via the bone morphogenetic factor BMP and inducing neuralization, thereby completing the present invention. It came to.
[0009]
That is, the protein according to the present invention is the following protein (a) or (b).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an activity as a neurogenization factor.
[0010]
A specific example of the protein is Xenopus-derived neuronal induction factor XMAN1. Specifically, the XMAN1 protein is a protein having a molecular weight of about 88000 and comprising 781 amino acids having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0011]
As described later, the XMAN1 protein has an activity of inhibiting the signal transduction of the bone morphogenetic factor BMP and inducing neurization. Therefore, by analyzing the structure and function of the XMAN1 protein in detail, not only the mechanism of neuralization induction in vertebrates is clarified, but also the research and treatment of the pathological mechanism of diseases caused by abnormalities in the nervous system, for example. It may be used for medicine.
[0012]
Here, the “protein” may be in a state isolated and purified from cells, tissues, etc., or a state in which a protein-encoding gene is introduced into a host cell and the protein is expressed in the cell. It may be. The protein according to the present invention may contain an additional polypeptide.
[0013]
In addition, the above “one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” means substitution, deletion, insertion, and the like by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. It means that a sufficient number of amino acids can be substituted, deleted, inserted, and / or added. Thus, in other words, the protein of (b) above is a mutant protein of the protein of (a) above, and the “mutation” mentioned here was artificially introduced mainly by known methods for producing mutant proteins. Although it means a mutation, it may be a product obtained by isolating and purifying a similar naturally occurring mutant protein. In order to easily purify and detect the protein, an additional sequence such as a known histidine tag may be included at the end.
[0014]
If mutations are introduced as described above, it is possible to artificially obtain a protein having high activity as a neurogenesis-inducing factor or a recombinant protein that can be easily purified.
[0015]
The gene according to the present invention is a gene encoding the protein (a) or (b).
[0016]
Examples of the gene having the above configuration according to the present invention include the XMAN1 gene. Specifically, the XMAN1 gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as cDNA.
[0017]
As described later, the XMAN1 gene utilizes the pluripotency of Xenopus animal caps, and uses an expression cloning method and a sieve selection method using the activity to neurolize animal caps (neurogenesis-inducing activity) as an index. Was isolated using The gene is a gene involved in nerve induction in Xenopus. Therefore, the gene can be used for the same purpose as the XMAN1 protein. Furthermore, it is possible to isolate a more useful gene having homology from other animals using the XMAN1 gene.
[0018]
The “gene” according to the present invention includes DNA and RNA. Further, DNA includes at least genomic DNA and cDNA, and RNA includes mRNA and the like. Further, the DNA may be not only double stranded but also single stranded such as a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. Further, the “gene” includes sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences) in addition to the sequences encoding the proteins (a) and (b) above. There may be.
[0019]
In addition, the neurization-inducing agent according to the present invention includes the proteins (a) and (b), the protein (a) the human homologue of the protein (ie, XMAN1 protein), or these proteins (ie, the above (a) A neurization-inducing agent containing any one of a gene encoding a protein, the protein (b), or the human homologue of the protein (a).
[0020]
The human MAN1 protein, which is a specific example of the human homologue of the protein (a), is presumed to have a high homology with the XMAN1 protein and an activity to induce neurization, as described later. , It is considered that there is the same availability as the XMAN1 protein. In addition to the human MAN1 protein, the “(a) human homologue of the protein” differs from the human MAN1 protein in part of the amino acid sequence, but the difference is not a functionally important region, and is substantially human. A protein having a function equivalent to that of MAN1 protein is also included.
[0021]
Therefore, for example, the human MAN1 gene (Accession No. AF112299), which is a gene encoding the human MAN1 protein, can be used as the neurization-inducing agent of the present invention.
[0022]
The method of using the neurization-inducing agent of the present invention includes (1) use of vertebrate undifferentiated cells to cause them to become neuralized, and (2) diseases of the nervous system. By using it for vertebrates, it can be used for treating or alleviating nervous system diseases in the individual.
[0023]
The method for inducing neurization according to the present invention comprises the use of any one of the proteins (a) and (b), a protein that is a human homolog of the protein (a), or a gene encoding these proteins, It is a method of inducing tissue neuralization. Further, the bone morphogenetic factor BMP signaling pathway inhibitor according to the present invention is any one of the proteins (a) and (b), a protein that is a human homologue of the protein (a), or a gene encoding these proteins. It contains one.
[0024]
The bone morphogenetic factor BMP is known to cause various physiological actions in vivo, but details of the signal transduction pathway of BMP have not been clarified yet. Therefore, by using the inhibitor according to the present invention for vertebrate cells, it is possible to inhibit the BMP signal transduction pathway that causes various physiological actions in the vertebrate organism, and the molecular biology and cell biology. It is an effective means for analyzing the details of the BMP signal transduction pathway in terms of developmental and developmental biology. For example, it is possible to develop assay kits and reagents for research on BMP signal transduction pathways. In addition, the inhibitor according to the present invention may be used as a therapeutic agent for various diseases related to the BMP signal transduction pathway.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protein according to the present invention is a protein having an activity of inducing embryonic neurization in vertebrates. In the present embodiment, XMAN1 protein derived from Xenopus will be described. As shown in Examples described later, this XMAN1 protein has an activity (neurogenesis-inducing activity) that inhibits the signal transduction pathway of the bone morphogenetic factor BMP and induces the neuralization of the Xenopus animal cap. It is a protein. The XMAN1 is a protein having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of 781 amino acids and having a molecular weight of about 88000.
[0026]
The XMAN1 protein is encoded by the XMAN1 gene. As shown in SEQ ID NO: 2, the XMAN1 gene cDNA has a size of 2645 base pairs (about 2.65 kbp), the 10th to 12th base sequences are start codons (ATG), and 2353 The 2nd to 2355th nucleotide sequence is a stop codon (TGA). Therefore, the XMAN1 gene has the 10 to 2352 base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an open reading frame (ORF), and this ORF has 2343 base pairs (about 2.34 kbp). ).
[0027]
Further, the DNA as the XMAN1 gene according to the present invention may be a form contained in the genome of an animal, that is, a “genomic” form DNA containing a non-coding sequence such as an intron, or a reverse transcriptase or a polymerase is used. Thus, cDNA obtained through mRNA, that is, “transcribed” DNA that does not contain non-coding sequences such as introns may be used.
[0028]
In addition, the DNA as the XMAN1 gene according to the present invention may contain other DNA sequences as long as they do not adversely affect the formation of the encoded XMAN1 protein. For example, a linker can be included at the end for use in gene recombination and the like.
[0029]
As a method for cloning the XMAN1 gene according to the present invention, a conventionally known method can be used and is not particularly limited. In the present invention, since the purpose was to clone a gene involved in nerve induction in Xenopus, which has not been known so far, as explained in the examples described later, It is isolated using expression cloning method and sibu selection method using neurization activity as an index, using the ability of aging.
[0030]
In the present invention, DNA having homology with the XMAN1 gene can be cloned from other animals using the XMAN1 gene derived from Xenopus. As a cloning method in this case, a conventionally known method can be used and is not particularly limited.
[0031]
Specifically, in the case of an animal in which at least a part of the genome is stored in a database, a homologous base sequence may be searched from the database based on the base sequence or amino acid sequence of the XMAN1 gene. For example, a homology search at the base sequence and amino acid sequence level by BLAST, which is a widely used homology search algorithm, can be suitably used.
[0032]
In addition, in the case of an animal whose genome is not databased, for example, a conventionally known hybridization method using a DNA library can be used. Specifically, a step of preparing a genomic library or cDNA library from an animal of interest using an appropriate cloning vector, hybridization is performed using at least a part of the XMAN1 gene as a probe, and live And a step of detecting a fragment positive for the probe from a rally. Thus, at least a part of the XMAN1 gene of the present invention is useful as a probe. The region used for the probe preferably contains a highly conserved sequence between the XMAN1 gene and its human homolog MAN1 gene. For example, such a region can be amplified by PCR and used as a probe. .
[0033]
A modified XMAN1 gene can be obtained by modifying a part of the XMAN1 gene according to the present invention. This mutant XMAN1 gene may be expressed in vivo in an animal body, and may have a better neuralization-inducing activity than the wild type, or it may have the same neuralization-inducing activity as the wild type. Silent mutation (mutation in which the amino acid sequence does not change and only the base sequence changes) may be used.
[0034]
That is, the mutant XMAN1 protein according to the present invention may be substantially the same as or better than the wild-type XMAN1 protein in activity as a neurogenesis inducing factor.
[0035]
The mode of mutation is not particularly limited, and it is sufficient that one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0036]
For example, as shown in the examples described later, the present inventors have prepared various XMAN1 deletion mutant proteins and analyzed their functions, so that the region necessary for the expression of the activity of the XMAN1 protein can be expressed as the XMAN1 protein. The carboxyl terminal region (C-terminal region; amino acids 582 to 781) was identified. Only this C-terminal region can inhibit the BMP signal transduction pathway and induce the neuralization of Xenopus animal caps.
[0037]
That is, the present invention may include a mutant of the XMAN1 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a mutant protein having substantially the same activity as the wild type as a neurization inducer. Specifically, for example, as shown in Examples described later, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a mutant protein ΔLEM in which 43 amino acids including the LEM domain on the amino terminal side (N terminal side) are deleted , Mutant protein ΔTM1 in which 449 amino acids on the N-terminal side are deleted, mutant protein CT in which 581 amino acids on the N-terminal side are deleted and consisting only of the C-terminal region (amino acids residues 582 to 781) ). Of course, the mutant protein is not limited to this, and a mutation is introduced into a region other than the RNP1 region (the 701st to 708th amino acid residues) described later, which is considered to be an important region for the expression of neurization-inducing activity. Also included are mutant proteins that have approximately the same or better induction of neuralization activity. The present invention also includes a gene encoding the above mutant protein.
[0038]
Thus, the XMAN1 gene according to the present invention includes (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or (b) one or more amino acids substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Any gene that encodes a protein consisting of an amino acid sequence deleted, inserted, and / or added, and having activity as a neurogenesis-inducing factor.
[0039]
Moreover, as shown in the Example mentioned later, as a result of the homology search, the XMAN1 gene has high homology with the human MAN1 gene. However, the function of the human MAN1 gene is unknown until the completion of the present invention, and this time, the XMAN1 gene was cloned regardless of the human MAN1 gene.
[0040]
Furthermore, as shown in the Examples described later, the C-terminal region of the XMAN1 protein and the C-terminal region of the human MAN1 protein show 94% homology at the amino acid level. Therefore, it can be estimated that the human MAN1 protein also induces neurization and has an inhibitory activity on the BMP signal transduction pathway, similarly to the XMAN1 protein. That is, the present invention is the first to show that human MAN1 protein inhibits the BMP signaling pathway and has a function involved in nerve induction in vertebrates.
[0041]
Human MAN1 protein is known to be a membrane protein localized in the human inner nuclear membrane (Li, F. et al. (2000). MAN1, an inner nuclear membrane protein that shares the LEM domain with lamina-associated polypeptide 2 and emerin. J. Biol. Chem. 275, pp4840-4847), the XMAN1 protein is also presumed to be a nuclear membrane protein from the structural similarity.
[0042]
In addition, it has been reported that autoantibodies against human MAN1 protein appear in the serum of human collagen disease patients (Literature Paulin-Levasseur, M. et al. (1996). The MAN antigens are non-lamin constituents. of the nuclear lamina in vertebrate cells. See Chromosoma, 104, pp367-79). Human collagen disease is considered to be a kind of autoimmune disease, the cause of which has not yet been clarified, and the treatment method is not sufficient.
[0043]
By using the present invention, it is possible to develop diagnostic agents and diagnostic methods for examining the relationship between the function of human MAN1 protein (BMP signal transduction pathway inhibitory activity, neurization-inducing activity) and the pathology of human collagen disease It is. Furthermore, it becomes an effective means for elucidating the pathological mechanism of human collagen disease, and it is also possible to develop a therapeutic drug targeting the BMP signaling pathway. That is, not only the basic research use of elucidating the pathological mechanism of human collagen disease, but also medical use such as therapeutic drugs and treatment methods is possible.
[0044]
In addition, the disappearance / generation of the nuclear membrane is closely related to cell division (including canceration), cell cycle, and gene expression control. It is also possible to establish an assay method and develop a reagent for investigating the relationship between the disappearance / generation of this nuclear membrane and the BMP signaling pathway inhibitory activity of MAN1 and XMAN1 which are nuclear membrane proteins.
[0045]
As described above, the availability of the Xenopus neuralization-inducing factor XMAN1 and the human MAN1 protein has been described. However, these two proteins have high homology, so it is estimated that they have similar functions. The Therefore, no matter which protein or any gene encoding these proteins is used, the present invention can be applied to the mechanism of neuralization in vertebrates, the signaling pathway of bone morphogenetic factor BMP, the pathogenic mechanism of human collagen disease, etc. It is thought that it is useful for elucidation of.
[0046]
Embodiments will be described below in more detail with reference to the accompanying drawings. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
[0047]
【Example】
The following examples outline the results of cloning and functional analysis of a novel Xenopus neurogenesis-inducing factor XMAN1.
[0048]
[Example 1] Cloning of a novel neuralization-inducing factor
Using the multipotency of the planned ectoderm tissue (animal cap) from the blastocyst stage to the gastrulation stage of the Xenopus laevis embryo, from a cDNA library prepared from the anterior neuroectodermal that will become the future brain tissue A factor having an activity of neurizing a cap (neurogenesis-inducing activity) was isolated using an expression cloning method and a sibu selection method. Specifically, Xenopus laevis in vitro fertilization and embryo culture followed the method of Kay and Peng (Xenopus Laevis: practical uses in cell and molecular biology, Methods in Cell Biology, Volume 36, Academic Press, 1991). Embryo stage was determined based on Nieuwkoop and Faber (Normal table of Xenopus Laevis, Garland Publishing, 1994). The anterior neuroectodermal specific cDNA library is based on the report by Shinga et al. (Mech. Of Dev., Vol. 109, pp225-239, 2001) using the SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GibcoBRL). And introduced into the pCS105 vector (provided by Dr. Richard Harland, University of California). The Shibu selection method was based on a report by Lustig et al. (Methods in Enzymology, Vol. 283, pp83-99, 1997).
[0049]
That is, the cDNA library was divided into pools of 200 clones, and a small amount of RNA synthesized from cDNA was injected into the animal cap for each pool. Thereafter, the presence or absence of induction of the pannergic marker nrp-1 in the animal cap was examined by the RT-PCR method. In the RT-PCR method, a small amount of mRNA was injected into the animal pole of the embryo at the 2-cell stage and the animal cap was excised at the blastula stage, and then the animal cap was collected at the gastrulation stage and the tail bud stage. . RNA extraction, cDNA synthesis, and PCR reaction were performed in the presence of a non-radioisotope based on Wilson and Melton (Curr. Biol., Vol. 4, pp676-686, 1994). Hereinafter, this method was used for the RT-PCR method. An in situ hybridization method can be used instead of the RT-PCR method. Subsequently, with respect to the pool having the activity of inducing nrp-1 expression, the pool size was sequentially reduced, and finally a single clone A124 having a neurization-inducing activity was obtained.
[0050]
Next, as shown in FIG. 1 (a), after microinjecting the clone A124 mRNA into the animal pole of the 2-cell stage embryo, the animal cap was excised at the blastocyst stage as shown in FIG. 1 (b). . Thereafter, as shown in FIG. 2, expression induction of various markers was examined by RT-PCR in each of the animal caps in the gastrulation stage and tail bud embryo stage. In addition, the mRNA amount of the injected clone A124 is 100 p (pico) g, 250 pg, and 500 pg per embryo. Β-globin (500) indicates that 500 pg of β-globin mRNA was injected as a negative control. RT (+) and RT (-) represent positive control and negative control, respectively. EF-1α is a control for the amount of cDNA used in the reaction.
[0051]
As a result of RT-PCR, expression of nrp-1, which is a pan-neural marker, and XAG-1, otx-2, which are anterior neural markers, were induced without inducing the expression of Xbra and actin known as mesoderm markers. However, expression of HoxB-9, a posterior nerve marker, was not induced. This result suggested that the factor encoded by clone A124 is a novel factor involved in the induction of anterior nerves. It also means that the nerve-inducing activity is not secondary through mesoderm induction.
[0052]
[Example 2] Structural analysis of clone A124
Next, a cDNA containing the full length of clone A124 was isolated. Specifically, the clone A124 was used as a probe for screening using the Xenopus stage 30 head cDNA library, and among the obtained positive clones, the base sequence of clone PC11 having the longest insert was determined. However, since this clone PC11 also lacked the start codon, the upstream region containing the start codon was amplified using 5′-Full RACE Core Set (TAKARA) to determine the full length of this gene. When the entire structure was determined, as shown in FIG. 3, it was found to encode a protein consisting of 781 amino acids and having a molecular weight of about 88000.
[0053]
As a result of homology search of this gene, it was found that it showed high homology with the human MAN1 gene. The human MAN1 gene is composed of 910 amino acids and encodes a protein of unknown function existing in the inner nuclear membrane.
[0054]
Therefore, since the homology with the human MAN1 gene was high, this gene was named XMAN1 (Xenopus MAN1).
[0055]
It was revealed that the XMAN1 protein and the human MAN1 protein are very similar in structural characteristics. Similar to the human MAN1 protein, the XMAN1 protein has a LEM domain (5th to 43rd amino acid residues) thought to bind to chromatin on the N-terminal side. The homology of this LEM domain between these two proteins was 74%.
[0056]
The XMAN1 protein has two transmembrane regions TM1 and TM2 (TM1; 349th to 372rd amino acid residues, TM2; 497th to 519th amino acid residues) rich in hydrophobic amino acids, This is also similar to the human MAN1 protein. It is known that human MAN1 protein is embedded in the inner nuclear membrane through these two transmembrane regions, and both N-terminal and C-terminal are membrane proteins existing inside the nucleus. Therefore, it is considered that XMAN1 protein also exhibits the same localization as human MAN1 protein in vivo.
[0057]
Furthermore, XMAN1 protein has RNP2 (661th to 666th amino acid residues) and RNP1 (701st to 708th amino acids) frequently found in RNA-binding proteins in the C-terminal region (582nd to 781st amino acid residues). It was found to have an RNA recognition motif (RRM; amino acid residues from 656 to 733) containing a conserved sequence called “residues”. It was also found that the human MAN1 protein has a C-terminal region that is very similar. That is, the homology of the C-terminal region between these two proteins was 94% at the amino acid level. Until now, the existence of RRM in human MAN1 protein has not been pointed out in the literature, and for the first time, its existence has been clarified.
[0058]
[Example 3] Identification of a region essential for the expression of the activity of a novel neuralization factor XMAN1
In order to examine which region of the XMAN1 protein has the neurization-inducing activity, deletion mutant proteins ΔLEM, ΔTM1, ΔCT, and CT of the XMAN1 protein were prepared as shown in FIG. Deletion mutant proteins ΔLEM, ΔTM1, and ΔCT are mutant proteins obtained by deleting the LEM domain, TM1 region, and C-terminal region from the wild-type XMAN1 protein Wt, respectively. The deletion mutant protein CT includes only the C-terminal region. It is a mutated protein that has been left and deleted except for this region. Note that Δ (delta) is a symbol that means a deletion mutant.
[0059]
Specifically, various mutant proteins of the XMAN1 protein were prepared using the PCR method and introduced into the pCS + MT vector. The mRNA used for microinjection was synthesized using MEGAscript IN Vitro Transcription Kits (Ambion).
[0060]
After microinjecting the mRNA of each deletion mutant protein into the animal pole of the embryo at the 2-cell stage, excising the animal cap at the blastula stage, the pan-neural marker nrp-1 at the animal cap at the tail embryo stage Expression induction was examined by RT-PCR method.
[0061]
Specifically, RNA was isolated from the animal cap at the tail embryo stage, cDNA was synthesized according to a known technique, and amplification was performed by PCR. Uninj, indicates an animal cap into which RNA has not been injected. As a result of the RT-PCR, the deletion mutant proteins ΔLEM, ΔTM1, and CT induced the expression of nrp-1 substantially equivalent to the wild type protein Wt. However, the deletion mutant protein ΔCT hardly induced nrp-1 expression. Therefore, it was found that the C-terminal region of the XMAN1 protein is essential for neurization-inducing activity. This C-terminal region showed high homology with the C-terminal region of human MAN1 protein, suggesting that this region has an important function in evolution. Therefore, the C-terminal region of this XMAN1 protein was referred to as the neurization-inducing active domain CT.
[0062]
Furthermore, deletion mutant proteins CTΔRRM, RRM, and CTΔRNP1 were prepared and examined in detail for this neurization-inducing active domain CT. Deletion mutant proteins CTΔRRM and CTΔRNP1 are mutant proteins obtained by deleting RRM and RNP1 from the neurogenesis-inducing active domain CT, respectively. The deletion mutant protein RRM is a mutant protein in which only the RRM of the neuralization-inducing active domain CT is left and the region from the N-terminal to the RRM is deleted.
[0063]
Using the mRNA of these deletion mutants, as a result of examining sites important for the function of the neurization-inducing active domain using nrp-1 induction as an index in the same manner as described above, None of the deletion mutant proteins CTΔRRM, RRM, CTΔRNP1 induced the expression of nrp-1. From this result, it was found that RRM, particularly the RNP1 sequence therein plays an important role in neurogenesis-inducing activity. Until now, not only the existence of RRM but also the function of human MAN1 protein has not been known at all.
[0064]
[Example 4] Inhibition of BMP signaling pathway by nerve activation domain
Furthermore, it was investigated whether the XMAN1 protein could neurolize the animal cap by inhibiting the signal transduction pathway of the bone morphogenetic factor BMP. BMP signals are transmitted to the nucleus via two types of receptors, BMPI type receptors on the cell surface, BMPII type receptors, and the intracellular factor Smad (especially Smad1, 4, 5, 8), and then target there It is thought to cause various physiological actions through the induction and activation of factors. In Xenopus, Xmsx-1, Xhox-3, Xvent-2, etc. are known as direct target factors of the BMP signal transduction pathway.
[0065]
Therefore, BMP-4 or an activated BMPI receptor (ALK3) is present at the animal pole of the 2-cell stage embryo. ^* ) MRNA alone was excised and the animal cap was excised at the blastocyst stage, and then the expression induction of various markers was examined by RT-PCR method at the gastrulation stage. Specifically, RNA was isolated from an animal cap in the gastrulation stage, cDNA was synthesized according to a known technique, and amplification was performed by PCR. As shown in FIG. 5, the amount of BMP-4 mRNA injected was 200 pg, ALK3 per embryo. ^* Is 500 pg and CT is not injected. As a control, 500 pg of CT mRNA alone was shown. The RT-PCR results are shown in FIG. ^* When only 1 mRNA was injected, the expression of target factors Xmsx-1 and Xhox-3 was induced. In addition, when CT mRNA was injected alone, expression of target factors Xmsx-1 and Xhox-3 was not induced. In addition, activated BMPI type receptor (ALK3 ^* ) Is a receptor that functions as an active form without receiving BMP and constantly transmits a signal into the cell.
[0066]
However, similarly, mRNA of BMP-4 or ALK3 ^* In the case of microinjection of the mRNA of the neurogenesis-inducing activity domain CT (injected BMP-4, ALK3 ^* The amount of mRNA is 200 pg and 500 pg per embryo, respectively, and the amount of CT mRNA is 100, 500 and 1000 pg, respectively. ), Induction of expression of the target factors Xmsx-1 and Xhox-3 was significantly inhibited depending on the amount of mRNA in the injected CT. The induction of expression of the mesoderm marker Xbra hardly changed depending on the amount of CT mRNA injected. From these results, it was shown that the neurization-inducing active domain CT inhibits the BMP signaling pathway downstream from the receptor.
[0067]
[Example 5] Transcriptional repression of BMP target factor by a novel neuralization factor XMAN1
Furthermore, whether or not XMAN1 represses the induction of BMP target factor expression at the transcriptional level was examined using a luciferase assay.
[0068]
Specifically, luciferase activity was measured using Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). First, plasmid DNA (Xvent2-Luc, donated by Dr. Ken Cho, University of California) in which a firefly luciferase gene was incorporated as a reporter gene downstream of the promoter of Xvent-2, one of the target factors of BMP, was used. Thereafter, 100 pg of this plasmid DNA (Xvent2-Luc), 2 pg of the control plasmid DNA (pRL-TK) having the Renilla luciferase gene, BMP-4 mRNA, and any one of Wt and CT mRNA were mixed together. Microinjection was performed at the animal pole of the cell stage embryo. After excising the animal cap in the blastula stage, 5 pieces were collected in 3 tubes each in the gastrulation stage, 50 μl of luciferase reaction solution was added to each tube, and firefly luciferase activity was measured. Then, Groilla Stop solution was added and Renilla luciferase activity was measured. A luminometer (Berthold) was used for the measurement. The average value of the three tubes was calculated using the value obtained by dividing the Firefly luciferase activity value by the Renilla luciferase activity value as a correction value. Also, ALK3 instead of BMP-4 ^* Was used to measure luciferase activity in the same manner. The amount of BMP-4 mRNA injected was 200 pg per embryo, ALK3 ^* Is 500 pg, and XMAN1 mRNA is 500 pg for both wild type Wt and deletion mutant CT. As a control, BMP-4 mRNA or ALK3 ^* And the plasmid DNA (GL3-Luc) in which the luciferase gene is incorporated downstream of the promoter (GL-3) different from the Xvent-2 promoter are shown, and Xvent2-Luc alone is injected.
[0069]
As a result of these luciferase assays, as shown in FIG. 6, BMP-4 or ALK3 ^* When the mRNA and Xvent2-Luc were injected, luciferase activity increased. However, this increase in activity was remarkably suppressed by the wild type XMAN1 protein Wt and neurization-inducing activity domain CT. Therefore, it was found that the XMAN1 protein, particularly its neurization-inducing active domain CT, suppresses the transcriptional activation of the target factor of BMP.
[0070]
BMP-4 or ALK3 ^* The presence of some luciferase activity even in the absence is thought to be due to the action of endogenous BMP present in the animal cap.
[0071]
【The invention's effect】
As described above, the protein, gene, neurization-inducing agent, neurization-inducing method, and BMP signaling pathway inhibitor of the present invention are used not only in basic research for elucidating the mechanism of neurization in vertebrates, but also in nerves. This has the effect that it can be applied to the development of therapeutic agents and treatments for diseases of the system.
[0072]
In addition, the present invention provides (1) the development of diagnostic methods and diagnostic agents for investigating the presence or absence of anti-human MAN1 antibody in the sera of human collagen disease patients and the pathological mechanism of human collagen disease, and targeting the BMP signaling pathway (2) Assay methods for investigating the disappearance and generation of nuclear membranes that are closely related to cell division including canceration, cell cycle, and gene expression control It has applicability to reagents.
[0073]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (a) is a schematic explanatory view showing an operation of injecting mRNA into a two-cell stage Xenopus embryo in an Example of the present invention, and FIG. 1 (b) is a diagram of an animal cap at the blastula stage. It is the schematic explanatory drawing which showed cutting-out operation.
2 is an electrophoretogram showing the results of examining the expression induction of various markers in the gastrulation stage and tail bud embryo stage of the animal cap cut out in FIG. 1 by RT-PCR.
FIG. 3 is a schematic diagram schematically showing the structures of human MAN1 and XMAN1 proteins in the examples of the present invention.
FIG. 4 is a schematic diagram showing various deletion mutant proteins of XMAN1, and shows the results of investigating the expression induction of various markers by the RT-PCR method in the tail bud embryo stage of animal caps injected with various mutant mRNAs. It is an electropherogram.
FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of examining the expression induction of various markers in the gastrulation stage of an animal cap injected with various mRNAs by RT-PCR.
FIG. 6 is a graph showing the results of examining the suppression of the transcriptional activity of the target factor of BMP by various mutant proteins of XMAN1, by the luciferase assay method.

Claims

Any one protein of the following (1)- (8) .
(1) a protein comprising the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(3) a protein comprising the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(5) a protein consisting of the 450th to 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(6) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the 450 to 781 amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(7) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and
(8) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a neurization-inducing activity.

A gene encoding the protein according to claim 1.

Any one of the following genes (a) to (d) .
(A) a gene consisting of the nucleotide sequence from the 1753 to the 2355th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a gene consisting of the 139th to 2355th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(C) a gene consisting of the 1357th to 2355th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and
(D) A gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A neuralization-inducing agent containing at least one substance selected from the group consisting of the protein according to the following (1) to (8) and a gene encoding the protein.
(1) a protein comprising the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(3) a protein comprising the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(5) a protein consisting of the 450th to 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(6) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the 450 to 781 amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(7) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and
(8) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a neurization-inducing activity.

A method for inducing neuralization of a cell or tissue using at least one substance selected from the group consisting of the protein according to the following (1) to (8) and a gene encoding the protein.
(1) a protein comprising the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(3) a protein comprising the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(5) a protein consisting of the 450th to 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(6) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the 450 to 781 amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(7) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and
(8) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a neurization-inducing activity.

An osteogenesis factor BMP signal transduction pathway inhibitor comprising at least one substance selected from the group consisting of the protein according to the following (1) to (8) and a gene encoding the protein.
(1) a protein comprising the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence from 582 to 781 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(3) a protein comprising the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence from the 44th to the 781st amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(5) a protein consisting of the 450th to 781st amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(6) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the 450 to 781 amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is neuronized Proteins with inductive activity,
(7) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and
(8) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a neurization-inducing activity.