JP4120002B2

JP4120002B2 - Cancer prognosis determination method using miRNA, cancer gene therapy vector, and cancer therapeutic pharmaceutical composition

Info

Publication number: JP4120002B2
Application number: JP2004002307A
Authority: JP
Inventors: 隆高橋
Original assignee: Aichi Prefecture
Current assignee: Aichi Prefecture
Priority date: 2004-01-07
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2024-01-07
Also published as: JP2005192484A

Description

本発明は、miRNAを用いた癌の予後判定方法、癌の遺伝子治療ベクター及び癌治療用医薬組成物に関する。 The present invention relates to a method for determining prognosis of cancer using miRNA, a gene therapy vector for cancer, and a pharmaceutical composition for cancer treatment.

マイクロRNA(以下、「miRNA」という)は、タンパク質に翻訳されない約22ヌクレオチドの小さな非コードRNAである。miRNAは、ヒトを含む生物に多数存在することが確認されており、系統的に十分に保存されている(非特許文献１〜３)。これまで、ヒトを含む様々な生物において、約300種類のmiRNAが発見されている(非特許文献４〜８)。 MicroRNA (hereinafter “miRNA”) is a small non-coding RNA of about 22 nucleotides that is not translated into protein. Many miRNAs have been confirmed to exist in organisms including humans, and are well preserved systematically (Non-Patent Documents 1 to 3). So far, about 300 types of miRNA have been discovered in various organisms including humans (Non-Patent Documents 4 to 8).

miRNAは、単一又はクラスター化されたmiRNA前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず、遺伝子から一次転写産物であるpri-miRNAが転写される。次いで、pri-miRNAから成熟型miRNAへの段階的プロセシングにおいて、pri-miRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のpre-miRNAが生成される。さらに、Dicer介在プロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成される(非特許文献９〜１１)。 miRNAs are generated from genes that are transcribed into single or clustered miRNA precursors. That is, first, pri-miRNA, which is a primary transcription product, is transcribed from a gene. Next, in a stepwise process from pri-miRNA to mature miRNA, about 70 bases of pre-miRNA having a characteristic hairpin structure is generated from pri-miRNA. Furthermore, mature miRNA is produced from pre-miRNA by Dicer-mediated processing (Non-Patent Documents 9 to 11).

今日、シーエレガンス(C. elegans)のlet-7 miRNA及びlin-4 miRNAが、最も研究が進んでいる(非特許文献１２〜１５)。これらlet-7 miRNA及びlin-4 miRNAは、発生タイミングに欠陥がある突然変異体線虫の遺伝的分析により同定された。線虫において、let-7 miRNAは後期発生段階の間に発現し始める。そして、let-7 miRNAは、lin-41などの標的遺伝子の転写後リプレッサーとして作用する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNAの3’非翻訳領域上にあるlet-7 miRNAに相補的な配列にlet-7 miRNAが結合することで、その後のmRNAからタンパク質への翻訳を阻害する。 Today, C. elegans let-7 miRNA and lin-4 miRNA are most studied (Non-Patent Documents 12 to 15). These let-7 and lin-4 miRNAs were identified by genetic analysis of mutant nematodes that are defective in developmental timing. In nematodes, let-7 miRNA begins to be expressed during late developmental stages. And let-7 miRNA acts as a post-transcriptional repressor of target genes such as lin-41. Specifically, let-7 miRNA binds to a sequence complementary to let-7 miRNA on the 3 'untranslated region of mRNA transcribed from the target gene, allowing subsequent translation from mRNA to protein. Inhibit.

一方、ヒトlet-7遺伝子は、様々な成体組織において確認されている。ヒトlet-7遺伝子の発現レベルは、組織により異なる。発現レベルが高い組織としては、肺が報告されている(非特許文献１６)。 On the other hand, the human let-7 gene has been confirmed in various adult tissues. The expression level of the human let-7 gene varies depending on the tissue. Lung has been reported as a tissue with a high expression level (Non-patent Document 16).

少数のmiRNA(非特許文献１２〜１５及び１７〜１８)を除いては、miRNAの生理学的及び病理学的役割はほとんど知られていない。しかしながら、miRNAの発癌を含む疾患への関与が現在研究されている。例えば、Gemin3及びGemin4は、miRNAを含有するリボ核タンパク質(以下、「マイクロRNP」という)の構成要素であることが知られている(非特許文献７)。またGemin3及びGemin4は、脊髄性筋萎縮症に関与するタンパク質複合体の構成要素でもある。一方、fragile X mental retardation protein(FMRP)は、脆弱X症候群に関与するタンパク質である。FMRPのショウジョウバエ相同体は、RISC/マイクロRNPの構成要素であることが示されている(非特許文献１９及び２０)。このように、miRNAを含む複合体においては、脊髄性筋萎縮症や脆弱X症候群などの神経筋変性疾患に関与するタンパク質が存在する。従って、確たる証拠はないものの、miRNAの脊髄性筋萎縮症や脆弱X症候群などの疾患への関与の可能性が示唆されている。また、癌とmiRNAとの関連について、Calinらは、リンパ性白血病において、miRNAであるmiR15及びmiR16が頻繁にダウンレギュレーションしていることを報告している(非特許文献２１)。また、最近では、Michaelらは、ヒト大腸癌においてmiRNAであるmiR-143及びmiR-145の発現が低下していることを報告している(非特許文献２２)。しかしながら、let-7 miRNAの発現は、大腸癌では変化していないと報告されている(非特許文献２２)。さらに、これらの文献においてmiRNAの発現低下が臨床病理学的特性に影響を及ぼすか否かについては示されていない。 Except for a small number of miRNAs (12-15 and 17-18), little is known about the physiological and pathological roles of miRNAs. However, the involvement of miRNA in diseases including carcinogenesis is currently being studied. For example, Gemin3 and Gemin4 are known to be components of a ribonucleoprotein containing miRNA (hereinafter referred to as “micro-RNP”) (Non-patent Document 7). Gemin3 and Gemin4 are also components of a protein complex involved in spinal muscular atrophy. On the other hand, fragile X mental retardation protein (FMRP) is a protein involved in fragile X syndrome. The Drosophila homologue of FMRP has been shown to be a component of RISC / microRNP (Non-patent Documents 19 and 20). Thus, in a complex containing miRNA, there are proteins involved in neuromuscular degenerative diseases such as spinal muscular atrophy and fragile X syndrome. Therefore, although there is no definite evidence, it has been suggested that miRNA may be involved in diseases such as spinal muscular atrophy and fragile X syndrome. Regarding the relationship between cancer and miRNA, Calin et al. Have reported that miR15 and miR16, which are miRNAs, are frequently down-regulated in lymphocytic leukemia (Non-patent Document 21). Recently, Michael et al. Have reported that miR-143 and miR-145, which are miRNAs, are reduced in human colon cancer (Non-patent Document 22). However, let-7 miRNA expression has been reported to be unchanged in colorectal cancer (Non-patent Document 22). Furthermore, these documents do not indicate whether or not miRNA expression reduction affects clinicopathological characteristics.

Ambros V, ハエ及び線虫におけるマイクロRNA経路：成長、死、脂肪、ストレス及びタイミング(MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing), Cell, 2003年, 113巻, p.673-6Ambros V, MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing, Cell, 2003, 113, p .673-6 Grosshans H, Slack FJ, マイクロRNA：小さいものは豊富である(Micro-RNAs: small is plentiful), J Cell Biol, 2002年, 156巻, p.17-21Grosshans H, Slack FJ, Micro-RNAs: small is plentiful, J Cell Biol, 2002, 156, p.17-21 Nelson P, Kiriakidou M, Sharma A, Maniataki E, Mourelatos Z, マイクロRNAワールド：小さいことはすばらしい(The microRNA world: small is mighty), Trends Biochem Sci, 2003年, 28巻, p.534-40Nelson P, Kiriakidou M, Sharma A, Maniataki E, Mourelatos Z, The MicroRNA world: Small is mighty, Trends Biochem Sci, 2003, 28, p.534-40 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T, 発現される小さいRNAをコードする新規遺伝子の同定(Identification of novel genes coding for small expressed RNAs), Science, 2001年, 294巻, p.853-8Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T, Identification of novel genes coding for small expressed RNAs, Science, 2001, 294, p.853- 8 Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP, カエノラブディティス・エレガンスにおける調節的役割の可能性を有する小さいRNAの豊富なクラス（An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans）, Science, 2001年, 294巻, p.858-62Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP, An abundant class of small RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans, Science , 2001, 294, 858-62 Lee RC, Ambros V, カエノラブディティス・エレガンスにおける小さいRNAの広範なクラス（An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans）, Science, 2001年, 294巻, p.862-4Lee RC, Ambros V, An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans, Science, 2001, 294, p.862-4 Mourelatos Z, Dostie J, Paushkin Sら, miRNP：多数のマイクロRNAを含有するリボ核タンパク質の新規なクラス(miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs), Genes Dev, 2002年, 16巻, p.720-8Mourelatos Z, Dostie J, Paushkin S et al., MiRNP: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs (MiRNPs), Genes Dev, 2002, 16, p. 720-8 Lim LP, Glasner ME, Yekta S, Burge CB, Bartel DP, 脊椎動物マイクロRNA遺伝子(Vertebrate microRNA genes), Science, 2003年, 299巻, p.1540Lim LP, Glasner ME, Yekta S, Burge CB, Bartel DP, Vertebrate microRNA genes, Science, 2003, 299, p.1540 Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zamore PD, let-7の小さな一時的RNAの成熟におけるRNA干渉酵素Dicerの細胞機能(A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA), Science, 2001年, 293巻, p.834-8A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation in maturation of small transient RNA in Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zamore PD, let-7 of the let-7 small temporal RNA), Science, 2001, 293, p.834-8 Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RH, シーエレガンスにおける、RNA干渉及び発生タイミングに関与する小さいRNAの合成におけるDicer機能(Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans), Genes Dev, 2001年, 15巻, p.2654-9Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RH, Sea Elegance in developmental timing in C. elegans), Genes Dev, 2001, 15, p.2654-9 Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN, マイクロRNA成熟：段階的プロセシング及び細胞小器官局在化(MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization), Embo J, 2002年,21巻, p.4663-70Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN, MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization, Embo J, 2002, 21, p. .4663-70 Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V, シーエレガンス異時性遺伝子lin-4はlin-14に対するアンチセンス相補性を有する小さいRNAをコードする(The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14), Cell, 1993年, 75巻, p.843-54Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V, The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14), Cell, 1993, 75, p.843-54 Wightman B, Ha I, Ruvkun G. lin-4による異時性遺伝子lin-14の転写後調節はシーエレガンスにおいて一時的なパターン形成を介在する(Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans), Cell, 1993年, 75巻, p.855-62Post-transcriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 Wightman B, Ha I, Ruvkun G. lin-4 post-transcriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans), Cell, 1993, 75, p.855-62. Reinhart BJ, Slack FJ, Basson Mら, 21ヌクレオチドlet-7 RNAはカエノラブディティス・エレガンスにおいて発生タイミングを調節する(The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans), Nature, 2000年, 403巻, p.901-6Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al., 21 nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans, Nature, 2000 , 403, 901-6 Slack FJ, Basson M, Liu Z, Ambros V, Horvitz HR, Ruvkun G, lin-41 RBCC遺伝子はlet-7調節RNAとLIN-29転写因子との間のシーエレガンス異時性経路において作用する(The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor), Mol Cell, 2000年, 5巻, p.659-69Slack FJ, Basson M, Liu Z, Ambros V, Horvitz HR, Ruvkun G, lin-41 RBCC genes act in the sea elegance heterochronous pathway between let-7 regulatory RNA and LIN-29 transcription factor (The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor), Mol Cell, 2000, 5, p.659-69 Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack Fら, let-7異時性調節RNAの配列保存及び一時的発現(Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA), Nature, 2000年, 408巻, p.86-9Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F et al., Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA, Nature, 2000, 408, p.86-9 Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB, Cohen SM, bantamは細胞増殖を制御する発生調節マイクロRNAをコードし、またショウジョウバエにおいて隠されたプロアポトーシス遺伝子を調節する(bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila), Cell, 2003年, 113巻, p.25-36Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB, Cohen SM, and bantam encode developmental regulatory microRNAs that control cell growth and also regulate hidden pro-apoptotic genes in Drosophila (bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila), Cell, 2003, 113, p.25-36 Xu P, Vernooy SY, Guo M, Hay BA, ショウジョウバエマイクロRNA Mir-14は細胞死を抑制し、または正常な脂肪代謝に必要とされる(The Drosophila MicroRNA Mir-14 Suppresses Cell Death and Is Required for Normal Fat Metabolism), Curr Biol, 2003年, 13巻, p.790-5The Drosophila MicroRNA Mir-14 Suppresses Cell Death and Is Required for Normal Xu P, Vernooy SY, Guo M, Hay BA, Drosophila MicroRNA Mir-14 Suppresses Cell Death and Is Required for Normal Fat Metabolism), Curr Biol, 2003, 13, 790-5 Caudy AA, Myers M, Hannon GJ, Hammond SM, Fragile X関連タンパク質とVIGはRNA干渉機構に関連する(Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery), Genes Dev 2002年, 16巻, p.2491-6Caudy AA, Myers M, Hannon GJ, Hammond SM, Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery, Genes Dev 2002, 16, p. .2491-6 Ishizuka A, Siomi MC, Siomi H, ショウジョウバエfragile Xタンパク質はRNAiの構成要素及びリボソームタンパク質と相互作用する(A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins) Genes Dev, 2002年, 16巻, p.2497-508Ishizuka A, Siomi MC, Siomi H, Drosophila fragile X protein interacts with RNAi components and ribosomal proteins (A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins) Genes Dev, 2002, 16, p. .2497-508 Calin GA, Dumitru CD, Shimizu Mら, 慢性リンパ球白血病における13q14に位置するマイクロRNA遺伝子miR15及びmiR16の頻繁な欠失及びダウンレギュレーション(Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia), Proc Natl Acad Sci U S A, 2002年, 99巻, p.15524-9Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M et al., Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia), Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, p.15524-9 Michael MZ, SM OC, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ, 結腸直腸新生物における特異的なマイクロRNAの蓄積低下(Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia) Mol Cancer Res, 2003年, 1巻, p.882-91Michael MZ, SM OC, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ, Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia Mol Cancer Res, 2003, Vol. 1, p.882-91

上述したように、miRNAの生理学的及び病理学的役割はほとんど知られていない。さらに、特定の癌において、miRNAの発現低下が見られるものの(非特許文献２１及び２２)、miRNAの発現低下が癌の臨床病理学的特性に影響を及ぼすか否かについては定かではない。 As mentioned above, little is known about the physiological and pathological roles of miRNAs. Furthermore, although miRNA expression reduction is observed in specific cancers (Non-Patent Documents 21 and 22), it is not clear whether miRNA expression reduction affects the clinicopathological characteristics of cancer.

そこで、本発明は、miRNAと癌の関連を分析し、例えばmiRNAを用いた癌患者の予後判定方法を提供することを目的とする。 Thus, an object of the present invention is to analyze the association between miRNA and cancer, and provide a prognosis determination method for cancer patients using, for example, miRNA.

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、let-7 miRNAの発現が肺癌において低下しており、このlet-7 miRNAの発現低下が肺癌の有意な予後因子であることを見出した。さらに、let-7 miRNAが肺癌の増殖抑制効果を有すること見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
（１）癌患者由来の生物学的サンプルにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つの発現量を測定することを特徴とする癌患者の予後判定方法。
（２）上記癌患者が肺癌患者であることを特徴とする、（１）記載の癌患者の予後判定方法。
（３）上記癌患者由来の生物学的サンプルが癌組織であることを特徴とする、（１）記載の癌患者の予後判定方法。
（４）上記miRNAが、配列番号２〜７に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１）記載の癌患者の予後判定方法。
（５）上記pre-miRNAが、配列番号８〜１６に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１）記載の癌患者の予後判定方法。
（６）上記pri-miRNAが、配列番号１７〜２５に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１）記載の癌患者の予後判定方法。
（７）配列番号１に示される塩基配列を含むDNAを有する、癌の遺伝子治療ベクター。
（８）上記配列番号１に示される塩基配列を含むDNAが、配列番号２〜２５に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAであることを特徴とする、（７）記載の癌の遺伝子治療ベクター。
（９）治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、（７）記載の癌の遺伝子治療ベクター。
（１０）（７）〜（９）のいずれか１記載の癌の遺伝子治療ベクターを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
（１１）治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、（１０）記載の癌治療用医薬組成物。
（１２）配列番号１に示される塩基配列を含むDNAを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
（１３）上記配列番号１に示される塩基配列を含むDNAが、配列番号２〜２５に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAであることを特徴とする、（１２）記載の癌治療用医薬組成物。
（１４）治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、（１２）記載の癌治療用医薬組成物。
（１５）配列番号１に示される塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
（１６）上記miRNAが、配列番号２〜７に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１５）記載の癌治療用医薬組成物。
（１７）上記pre-miRNAが、配列番号８〜１６に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１５）記載の癌治療用医薬組成物。
（１８）上記pri-miRNAが、配列番号１７〜２５に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、（１５）記載の癌治療用医薬組成物。
（１９）治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、（１５）記載の癌治療用医薬組成物。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors have found that the expression of let-7 miRNA is decreased in lung cancer, and that this decreased expression of let-7 miRNA is a significant prognostic factor for lung cancer. Furthermore, the inventors have found that let-7 miRNA has an effect of suppressing the growth of lung cancer, and have completed the present invention. The present invention includes the following.
(1) In a biological sample derived from a cancer patient, any one expression level selected from the group consisting of miRNA, pre-miRNA and pri-miRNA transcribed from DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A method for determining the prognosis of a cancer patient, comprising measuring
(2) The cancer patient prognosis determination method according to (1), wherein the cancer patient is a lung cancer patient.
(3) The method for determining the prognosis of a cancer patient according to (1), wherein the biological sample derived from the cancer patient is a cancer tissue.
(4) The cancer according to (1), wherein the miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7. How to determine the prognosis of a patient.
(5) The pre-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 16, (1) For prognosis of cancer patients in Japan.
(6) The pri-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 25. (1) For prognosis of cancer patients in Japan.
(7) A cancer gene therapy vector having a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(8) The DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 25 ( 7) The gene therapy vector for cancer according to the above.
(9) The cancer gene therapy vector according to (7), wherein the cancer to be treated is lung cancer.
(10) A pharmaceutical composition for treating cancer comprising the cancer gene therapy vector according to any one of (7) to (9) as an active ingredient.
(11) The cancer therapeutic pharmaceutical composition according to (10), wherein the cancer to be treated is lung cancer.
(12) A pharmaceutical composition for treating cancer comprising a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
(13) The DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2-25. 12) The pharmaceutical composition for cancer treatment as described in 12).
(14) The cancer therapeutic pharmaceutical composition according to (12), wherein the cancer to be treated is lung cancer.
(15) A pharmaceutical composition for treating cancer comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of miRNA, pre-miRNA and pri-miRNA transcribed from DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 .
(16) The cancer according to (15), wherein the miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7. A therapeutic pharmaceutical composition.
(17) The pre-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 16, (15) A pharmaceutical composition for treating cancer.
(18) The pri-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 25. (15) A pharmaceutical composition for treating cancer.
(19) The pharmaceutical composition for cancer treatment according to (15), wherein the cancer to be treated is lung cancer.

本発明により、簡単で、かつ高い信頼性を有する癌患者の予後判定方法が提供される。さらに、本発明により、癌の治療に使用することができるmiRNAを用いた遺伝子治療ベクター及び医薬組成物が提供される。 The present invention provides a method for determining the prognosis of a cancer patient that is simple and highly reliable. Furthermore, the present invention provides gene therapy vectors and pharmaceutical compositions using miRNA that can be used for the treatment of cancer.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明に係る癌患者の予後判定方法によれば、癌患者由来の生物学的サンプルにおいて、特定のmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAの発現量を測定することで、癌患者の予後を判定することできる。 According to the method for determining the prognosis of a cancer patient according to the present invention, the prognosis of the cancer patient is determined by measuring the expression level of a specific miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA in a biological sample derived from the cancer patient. Can do.

本発明に係る癌患者の予後判定方法は、手術後の肺癌患者に関して、カプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)法を用いてlet-7 miRNAの発現低下と当該患者の生存期間との相関性を分析したところ、let-7 miRNAの発現低下と当該患者の生存期間との間に有意な相関性があることを見出し、また、コックス回帰分析により分析したところ、let-7 miRNAの発現低下が肺癌患者の生存に対する独立した予後因子であるという知見に基づく。ここで、「予後」とは、癌の経過及び結末を予め知ることをいう。 The prognosis determination method for cancer patients according to the present invention uses a Kaplan-Meier method to analyze the correlation between let-7 miRNA expression reduction and the survival time of lung cancer patients after surgery. As a result, we found that there was a significant correlation between let-7 miRNA expression decline and the patient's survival time, and analyzed by Cox regression analysis. Based on the finding that it is an independent prognostic factor for survival. Here, “prognosis” refers to knowing in advance the progress and outcome of cancer.

本発明に係る癌患者の予後判定方法により、予後を判定することができる癌としては、特に限定されないが、例えば、肺癌、肝臓癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等が挙げられる。特に肺癌が好ましい。肺癌としては、いずれの組織型の肺癌であってもよいが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、大細胞神経内分泌癌及び腺扁平上皮癌などの非小細胞癌並びに小細胞癌が挙げられる。 The cancer whose prognosis can be determined by the method for determining the prognosis of a cancer patient according to the present invention is not particularly limited. For example, lung cancer, liver cancer, glioblastoma, myeloma, gastric cancer, pancreatic cancer, brain tumor, Examples include colorectal cancer, renal cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, and leukemia. Lung cancer is particularly preferable. The lung cancer may be any tissue type of lung cancer, for example, non-small cell cancer such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell cancer, large cell neuroendocrine cancer and adenosquamous cell carcinoma, and small cell cancer Is mentioned.

なお、癌患者由来の生物学的サンプルとは、例えば、癌患者から採取した癌組織または血漿及び血清などの血液を意味する。特に癌患者から採取した癌組織が好ましい。生物学的サンプルが癌組織である場合には、例えば手術中に摘出される癌部の組織が挙げられる。なお、比較として用いる健常者由来の生物学的サンプルとは、健常者から採取した正常な肺組織または血漿及び血清などの血液を意味する。 The biological sample derived from a cancer patient means, for example, cancer tissue collected from a cancer patient or blood such as plasma and serum. In particular, cancer tissue collected from cancer patients is preferable. In the case where the biological sample is a cancer tissue, for example, a tissue of a cancerous part removed during surgery. The biological sample derived from a healthy person used for comparison means normal lung tissue or blood such as plasma and serum collected from a healthy person.

本発明に係る癌患者の予後判定方法における測定対象は、特定のmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAである。miRNAは、タンパク質に翻訳されない小さな非コードRNAである。miRNAの生成段階は、以下の通りである。遺伝子から一次転写産物であるpri-miRNAが転写される。次いで、pri-miRNAから成熟型miRNAへの段階的プロセシングにおいて、pri-miRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のpre-miRNAが生成される。さらに、Dicer介在プロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成される。 The measurement target in the cancer patient prognosis determination method according to the present invention is a specific miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA. miRNAs are small non-coding RNAs that are not translated into protein. The production stage of miRNA is as follows. The primary transcript pri-miRNA is transcribed from the gene. Next, in a stepwise process from pri-miRNA to mature miRNA, about 70 bases of pre-miRNA having a characteristic hairpin structure is generated from pri-miRNA. In addition, mature miRNA is generated from pre-miRNA by Dicer-mediated processing.

ここで、特定のmiRNA(以下、「本発明に係るmiRNA」という)とは、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAから転写されるmiRNAを意味する。なお、配列番号１において、nはt又は塩基なしを表す(存在位置：22)。具体的には、本発明に係るmiRNAは、let-7 miRNAである。let-7 miRNAは6種のアイソフォーム(let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e及びlet-7f)が存在する。これらlet-7 miRNAアイソフォームは、それぞれ配列番号２〜７に示される塩基配列からなるDNAから転写されるものである。なお、本発明に係る癌患者の予後判定方法において測定する本発明に係るmiRNAは、配列番号１に示される塩基配列からなるDNAから転写されるいずれのmiRNA、すなわち、上述した6種のアイソフォームのうちいずれでもよい。 Here, the specific miRNA (hereinafter referred to as “miRNA according to the present invention”) means a miRNA transcribed from the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In SEQ ID NO: 1, n represents t or no base (location: 22). Specifically, the miRNA according to the present invention is a let-7 miRNA. There are six isoforms of let-7 miRNA (let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, and let-7f). These let-7 miRNA isoforms are transcribed from DNA consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7, respectively. The miRNA according to the present invention measured in the method for determining the prognosis of cancer patients according to the present invention is any miRNA transcribed from the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the six isoforms described above. Any of these may be used.

一方、特定のpre-miRNA及びpri-miRNA（以下、それぞれ「本発明に係るpre-miRNA」及び「本発明に係るpri-miRNA」という）とは、配列番号１に示される塩基配列を含むDNAによって転写されるものを意味する。具体的には、本発明に係るpre-miRNA及びpri-miRNAは、let-7 miRNAに対応するlet-7 pre-miRNA及びpri-miRNAである。各let-7 miRNAアイソフォームに対応するlet-7 pre-miRNA及びpri-miRNAが存在する。各let-7 miRNAアイソフォームに対応するlet-7 pre-miRNA及びpri-miRNAは、以下の表１に示す配列番号に示される塩基配列からなるDNAから転写されるものである。 On the other hand, specific pre-miRNA and pri-miRNA (hereinafter referred to as “pre-miRNA according to the present invention” and “pri-miRNA according to the present invention”, respectively) are DNAs containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Means what is transcribed by Specifically, the pre-miRNA and pri-miRNA according to the present invention are let-7 pre-miRNA and pri-miRNA corresponding to let-7 miRNA. There are let-7 pre-miRNA and pri-miRNA corresponding to each let-7 miRNA isoform. Let-7 pre-miRNA and pri-miRNA corresponding to each let-7 miRNA isoform are transcribed from DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: shown in Table 1 below.

let-7 miRNAアイソフォームのうち、let-7a及びlet-7fは、複数のpri-miRNA又はpre-miRNAからプロセシングにより生成される。 Among the let-7 miRNA isoforms, let-7a and let-7f are produced from multiple pri-miRNAs or pre-miRNAs by processing.

なお、本発明に係る癌患者の予後判定方法において測定する本発明に係るpre-miRNA又はpri-miRNAは、配列番号１に示される塩基配列を含むDNAから転写されるいずれのpre-miRNA又はpri-miRNAであってよい。 The pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention, which is measured in the method for determining the prognosis of cancer patients according to the present invention, is any pre-miRNA or pri transcribed from the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. -It may be miRNA.

本発明に係る癌患者の予後判定方法では、まず、癌患者由来の生物学的サンプルから全RNAを抽出する。全RNAの抽出方法としては、例えば、グアニジン-塩化セシウム超遠心法やAGPC(Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform)法が挙げられる。 In the cancer patient prognosis determination method according to the present invention, first, total RNA is extracted from a biological sample derived from a cancer patient. Examples of the method for extracting total RNA include guanidine-cesium chloride ultracentrifugation and AGPC (Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform).

次いで、上記生物学的サンプルから得られた全RNA中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAを検出する。検出方法は、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAの発現量を測定できる方法である限り特に限定されないが、例えば、ノーザンブロット分析及びリアルタイムRT-PCR検出法などが挙げられる。ノーザンブロット分析では、電気泳動により、全RNAを鎖長に応じて分離し、ニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンに転写する。このメンブランを、本発明に係るmiRNA、pre-mRNA又はpri-miRNAと相補的な配列を有し、かつ放射性標識(例えば、³²P)などにより標識されたプローブとバッファー中でインキュベートする。その結果、プローブに付した標識に基づいて、プローブとハイブリダイズした本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAを検出することができる。なお、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション並びに洗浄ステップは、ストリンジェントな条件で行う。ここで、ストリンジェンな条件とは、例えば、³²P標識したDNAをプローブとして用いる場合には、0.25M リン酸ナトリウム(pH7.2)、7％SDS及び0.5％ピロリン酸ナトリウムからなるハイブリダイゼーションバッファー中で温度37℃である。また洗浄ステップにおいては、2 X SSC及び1％SDSからなる洗浄バッファー中で温度37℃、さらに0.1 X SSCからなる洗浄バッファー中で温度が室温である。その他の場合にはその検出法の標準的な条件であってよい。放射性標識したプローブを用いた場合には、オートラジオグラフィーを用いて、バンド密度に基づいて、プローブとハイブリダイズした本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAを定量することができる。 Next, miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention is detected in the total RNA obtained from the biological sample. The detection method is not particularly limited as long as it can measure the expression level of miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention, and examples thereof include Northern blot analysis and real-time RT-PCR detection method. In Northern blot analysis, total RNA is separated according to chain length by electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane or nylon membrane. This membrane is incubated in a buffer with a probe having a sequence complementary to the miRNA, pre-mRNA or pri-miRNA according to the present invention and labeled with a radioactive label (for example, ³² P). As a result, the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention hybridized with the probe can be detected based on the label attached to the probe. The prehybridization, hybridization, and washing step are performed under stringent conditions. Here, the stringent condition is, for example, a hybridization buffer comprising 0.25 M sodium phosphate (pH 7.2), 7% SDS, and 0.5% sodium pyrophosphate when ³² P-labeled DNA is used as a probe. The temperature is 37 ° C. In the washing step, the temperature is 37 ° C. in a washing buffer composed of 2 × SSC and 1% SDS, and the temperature is room temperature in a washing buffer composed of 0.1 × SSC. In other cases, it may be standard conditions for the detection method. When a radiolabeled probe is used, the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention hybridized with the probe can be quantified based on the band density using autoradiography.

また、リアルタイムRT-PCR検出法によれば、全RNAに対応するランダムプライミングcDNA及び本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAに相補的なプライマーを用いたPCRにより、例えばSYBR Greenなどの二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素を介して、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAを定量的に検出することができる。リアルタイムRT-PCR検出法は、公知の方法又は検出機器や試薬の製造業者のマニュアル(例えば、ABI Prism 7900 Sequence Detection System(Perkin-Elmer Applied Biosystems)やSYBR Green PCR マスターミックス(Perkin-Elmer Applied Biosystems)など)に従って実施することができる。 In addition, according to the real-time RT-PCR detection method, PCR using a random priming cDNA corresponding to total RNA and a primer complementary to the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention, for example, SYBR Green, etc. The miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention can be quantitatively detected through a fluorescent dye that specifically binds to double-stranded DNA. Real-time RT-PCR detection can be performed using known methods or manufacturer's manuals (e.g., ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems) or SYBR Green PCR Master Mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems)). Etc.).

次いで、癌患者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAを、健常者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAの発現量と比較する。比較により、癌患者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAが、健常者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAの発現量よりも有意に低下している場合に、予後不良であると判定することができる。例えば、予後不良な癌患者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAは、健常者由来の生物学的サンプル中の本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAの発現量よりも50％、より好ましくは80％低下している。 Next, miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a cancer patient is converted into miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a healthy subject. Compared to the expression level. By comparison, miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a cancer patient is different from miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a healthy subject. When the expression level is significantly lower than the miRNA expression level, it can be determined that the prognosis is poor. For example, the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a cancer patient with a poor prognosis is the miRNA, pre-miRNA or the miRNA according to the present invention in a biological sample derived from a healthy subject. It is 50%, more preferably 80% lower than the expression level of pri-miRNA.

以上に説明した本発明に係る癌患者の予後判定方法によれば、癌患者の治療後(例えば、手術後)の予後が良好か否か、再発がないか否かを、簡単にかつ高い信頼性をもって判断することができる。さらに、治療前(例えば、手術前)の癌患者由来の生物学的サンプルに対して本発明に係る癌患者の予後判定方法を適用することで、手術を含む治療そのものの方針、手術後の治療方針の決定に対する重要な情報が提供される。 According to the cancer patient prognosis determination method according to the present invention described above, whether or not the prognosis after treatment of the cancer patient (for example, after surgery) is good and whether there is no recurrence is easily and highly reliable. Judgment can be made with gender. Furthermore, by applying the cancer patient prognosis determination method according to the present invention to a biological sample derived from a cancer patient before treatment (for example, before surgery), the policy of treatment itself including surgery, treatment after surgery Important information for policy decisions is provided.

一方、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターは、配列番号１に示される塩基配列を含むDNAを有する遺伝子治療ベクターである。換言すれば、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターは、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA又はpri-miRNAに転写されるDNA(配列番号１〜２５に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNA)(以下、「本発明に係るDNA」という)を有する遺伝子治療ベクターである。 On the other hand, the gene therapy vector for cancer according to the present invention is a gene therapy vector having a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. In other words, the cancer gene therapy vector according to the present invention is a DNA transcribed into the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention (from the group of DNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 25). It is a gene therapy vector having any one selected DNA (hereinafter referred to as “DNA according to the present invention”).

本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを用いた治療対象となる癌は、特に限定されないが、例えば、肺癌、肝臓癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等が挙げられる。特に肺癌が好ましい。肺癌としては、いずれの組織型の肺癌であってもよいが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、大細胞神経内分泌癌及び腺扁平上皮癌などの非小細胞癌並びに小細胞癌が挙げられる。 The cancer to be treated using the gene therapy vector for cancer according to the present invention is not particularly limited. For example, lung cancer, liver cancer, glioblastoma, myeloma, gastric cancer, pancreatic cancer, brain tumor, colon cancer, kidney Examples include cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, and leukemia. Lung cancer is particularly preferable. The lung cancer may be any tissue type of lung cancer, for example, non-small cell cancer such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell cancer, large cell neuroendocrine cancer and adenosquamous cell carcinoma, and small cell cancer Is mentioned.

適当なベクターに本発明に係るDNAを挿入することにより、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを得ることができる。本発明に係るDNAを挿入するためのベクターは、非ウイルスベクターとウイルベクターに大別される。例えば、非ウイルスベクターとしては、pCAGGS、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラタジーン社)、及びH1-RNAプロモーター又はU6プロモーターなどを有するベクター（例えば、pSilencer3.0-H1及びpSilencer2.0-U6(アンビオン社)など）が挙げられる。 By inserting the DNA according to the present invention into an appropriate vector, the gene therapy vector for cancer according to the present invention can be obtained. Vectors for inserting the DNA according to the present invention are roughly classified into non-viral vectors and viral vectors. For example, examples of non-viral vectors include pCAGGS, pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene), and vectors having an H1-RNA promoter or a U6 promoter (for example, pSilencer3.0-H1 and pSilencer2.0-U6 (Ambion) etc.).

一方、ウイルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40及び免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNA又はRNAウイルスのウイルスベクターが挙げられる。 On the other hand, examples of viral vectors include recombinant adenoviruses and retroviruses. More specifically, for example, detoxified retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, vaccinia viruses, poxviruses, polioviruses, synbisviruses, Sendai viruses, SV40 and immunodeficiency viruses (HIV), etc. And viral vectors of DNA or RNA viruses.

ベクターに本発明に係るDNAを挿入するには、まず適当な制限酵素で本発明に係るDNAを切断し、次いで適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が用いられる。 In order to insert the DNA according to the present invention into a vector, first, the DNA according to the present invention is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of an appropriate vector and ligated to the vector. Used.

本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターの癌患者への導入法としては、直接癌患者の癌組織に導入するin vivo法、及び、癌患者から標的細胞、すなわち癌細胞を取り出して体外で本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある。 The cancer gene therapy vector according to the present invention can be introduced into cancer patients directly by in vivo methods, and target cells, that is, cancer cells are taken out of cancer patients in vitro. There is an ex vivo method in which a gene therapy vector for cancer is introduced into the cells and the cells are returned to the body.

本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターの投与量は、癌患者の病期、年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、有効量として1〜20mg、より好ましくは10〜20mgであることが望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。 The dosage of the cancer gene therapy vector according to the present invention can be adjusted as appropriate according to the stage, age, weight, etc. of the cancer patient, and is, for example, 1-20 mg as an effective dose, more preferably 10-20 mg. Is desirable. It is desirable to administer such a dose 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.

一方、本発明に係る癌治療用医薬組成物は、有効成分として本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを含有する医薬組成物である。さらに、本発明に係る癌治療用医薬組成物は、有効成分として本発明に係るDNA又は本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを含有する医薬組成物である。 On the other hand, the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention is a pharmaceutical composition containing the gene therapy vector for cancer according to the present invention as an active ingredient. Furthermore, the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention is a pharmaceutical composition containing the DNA according to the present invention or the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention as an active ingredient.

本発明に係る癌治療用医薬組成物を用いた治療対象となる癌は、特に限定されないが、例えば、肺癌、肝臓癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等が挙げられる。特に肺癌が好ましい。肺癌としては、いずれの組織型の肺癌であってもよいが、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、大細胞神経内分泌癌及び腺扁平上皮癌などの非小細胞癌並びに小細胞癌が挙げられる。 The cancer to be treated using the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention is not particularly limited. For example, lung cancer, liver cancer, glioblastoma, myeloma, gastric cancer, pancreatic cancer, brain tumor, colon cancer, Examples include kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cervical cancer, prostate cancer, and leukemia. Lung cancer is particularly preferable. The lung cancer may be any tissue type of lung cancer, for example, non-small cell cancer such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell cancer, large cell neuroendocrine cancer and adenosquamous cell carcinoma, and small cell cancer Is mentioned.

本発明に係る癌治療用医薬組成物の製造に用いる本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAの生成方法において、例えば、本発明に係るDNAを大腸菌等に由来するベクターに組込み、次に得られた組換えベクターで大腸菌を形質転換する。その後、大腸菌内で合成されたRNAを抽出することで、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを得ることができる。 In the method for producing miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention used for producing the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention, for example, the DNA according to the present invention is incorporated into a vector derived from Escherichia coli, etc. E. coli is transformed with the obtained recombinant vector. Then, miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention can be obtained by extracting RNA synthesized in E. coli.

本発明に係る癌治療用医薬組成物の形態としては、例えば注射剤及びリポソーム製剤が挙げられる。例えば、本発明に係る癌治療用医薬組成物が注射剤である場合には、注射剤を常法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、場合によっては、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。一方、リポソーム製剤の場合には、HVJ-リポソーム等のリポソームにおいて、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤とすることができる。なお、本発明に係る癌治療用医薬組成物は、癌患者の癌組織に直接局所投与することができる。 Examples of the form of the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention include injections and liposome preparations. For example, when the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention is an injection, the injection can be prepared by a conventional method. For example, it can be prepared by dissolving in an appropriate solvent (buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.), and in some cases, sterilizing by filtration with a filter and then filling in an aseptic container. it can. A conventional carrier or the like may be added to the injection as necessary. On the other hand, in the case of a liposome preparation, in a liposome such as HVJ-liposome, a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent can be used. In addition, the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention can be directly administered locally to a cancer tissue of a cancer patient.

また、癌組織の周囲に本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター、本発明に係るDNA、又は本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し、癌組織近くに埋め込むことも可能である。あるいは、オスモチックポンプなどを用いて癌組織に連続的に徐々に投与することも可能である。 Further, in order to facilitate the presence of the cancer gene therapy vector according to the present invention, the DNA according to the present invention, or the miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention around the cancer tissue, a sustained-release preparation It is also possible to prepare (such as a mini-pellet formulation) and embed it near the cancer tissue. Alternatively, it can be gradually and gradually administered to the cancer tissue using an osmotic pump or the like.

本発明に係る癌治療用医薬組成物が本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを有効成分として含有する場合、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターの含量は、例えば、1〜20mg、より好ましくは10〜20mgであることが望ましい。さらに本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターを有効成分として含有する本発明に係る癌治療用医薬組成物の投与量は、癌患者の病期、年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、1〜20mg、より好ましくは10〜20mgであることが望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。 When the cancer therapeutic drug composition according to the present invention contains the cancer gene therapy vector according to the present invention as an active ingredient, the content of the cancer gene therapy vector according to the present invention is, for example, 1 to 20 mg, more preferably 10-20 mg is desirable. Furthermore, the dose of the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention containing the gene therapy vector for cancer according to the present invention as an active ingredient can be appropriately adjusted according to the stage, age, weight, etc. of the cancer patient, for example 1-20 mg, more preferably 10-20 mg. It is desirable to administer such a dose 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.

一方、本発明に係る癌治療用医薬組成物が本発明に係るDNAを有効成分として含有する場合、本発明に係るDNAの含量は、例えば、2〜50mg、より好ましくは20〜50mgであることが望ましい。さらに本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを有効成分として含有する本発明に係る癌治療用医薬組成物の投与量は、癌患者の病期、年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、2〜50mg、より好ましくは20〜50mgであることが望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。 On the other hand, when the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention contains the DNA according to the present invention as an active ingredient, the content of the DNA according to the present invention is, for example, 2 to 50 mg, more preferably 20 to 50 mg. Is desirable. Furthermore, the dosage of the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention containing miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention as an active ingredient should be appropriately adjusted according to the stage, age, weight, etc. of the cancer patient. For example, it is desirably 2 to 50 mg, more preferably 20 to 50 mg. It is desirable to administer such a dose 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.

また、本発明に係る癌治療用医薬組成物が本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを有効成分として含有する場合、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAの含量は、例えば、100〜500mg、より好ましくは300〜500mgであることが望ましい。さらに本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを有効成分として含有する本発明に係る癌治療用医薬組成物の投与量は、癌患者の病期、年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、100〜500mg、より好ましくは300〜500mgであることが望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。 Further, when the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention contains miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention as an active ingredient, the content of miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention is as follows: For example, it is desirable that it is 100-500 mg, More preferably, it is 300-500 mg. Furthermore, the dosage of the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention containing miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention as an active ingredient should be appropriately adjusted according to the stage, age, weight, etc. of the cancer patient. For example, 100 to 500 mg, more preferably 300 to 500 mg is desirable. It is desirable to administer such a dose 1 to 10 times, more preferably 5 to 10 times.

本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター又は癌治療用医薬組成物は、例えば、以下のようにin vitro又はin vivoで薬理評価を行なうことができる。 The gene therapy vector for cancer or the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention can be pharmacologically evaluated in vitro or in vivo as follows, for example.

in vitroでの薬理評価としては、例えば、癌細胞系を用いたコロニー形成アッセイが挙げられる。本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター又は本発明に係るDNAを含まない空ベクター(ベクター対照)を、A549肺腺癌細胞系などの癌細胞系にトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトした細胞を培養し、培養後、細胞をギムザ染色することで、耐性コロニー数を計数する。本発明に係るDNAを含まない空ベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターをトランスフェクトした細胞においてコロニー数が低下した場合、in vitroレベルで、癌の治療ができたことを示す指標とすることができる。 Examples of in vitro pharmacological evaluation include colony formation assays using cancer cell lines. A cancer gene therapy vector according to the present invention or an empty vector free of DNA according to the present invention (vector control) is transfected into a cancer cell line such as the A549 lung adenocarcinoma cell line. Next, the transfected cells are cultured, and after culturing, the cells are stained with Giemsa to count the number of resistant colonies. When the number of colonies in the cells transfected with the gene therapy vector for cancer according to the present invention is reduced compared to cells transfected with the empty vector not containing DNA according to the present invention, the cancer treatment is performed at an in vitro level. It can be used as an index indicating that it has been completed.

in vivoでは、癌マウスモデルに適切な用量の本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター又は癌治療用医薬組成物を適当な投与回数投与する。同時に、腫瘍径の変化を観察する。本発明に係る癌の遺伝子治療ベクターに対する対照群として、本発明に係るDNAを含まない空ベクターを投与した群を用いる。また、癌治療用医薬組成物に対する対照群として、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター、本発明に係るDNA、本発明に係るmiRNA、pre-miRNA若しくはpri-miRNAを含まない医薬組成物を投与した群を用いる。さらに投与量、投与回数などを評価する場合、適宜投与量、投与回数を変えた群を用いる。本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター又は癌治療用医薬組成物を投与した群（投与群）と対照群のそれぞれにおいて、腫瘍の形成を確認し、腫瘍サイズを測定する。これにより、投与群において、より腫瘍の退縮が見られた場合、動物実験レベルで癌の治療ができたことを示す指標となる。 In vivo, an appropriate dose of the cancer gene therapy vector or cancer therapeutic pharmaceutical composition according to the present invention is administered to a cancer mouse model in an appropriate dose. At the same time, the change in tumor diameter is observed. As a control group for the gene therapy vector for cancer according to the present invention, a group administered with an empty vector not containing DNA according to the present invention is used. In addition, as a control group for a pharmaceutical composition for cancer treatment, a cancer gene therapy vector according to the present invention, a DNA according to the present invention, a pharmaceutical composition not containing miRNA, pre-miRNA or pri-miRNA according to the present invention Group. Further, when evaluating the dose, the number of administrations, etc., a group in which the dose and the number of administrations are appropriately changed is used. In each of the group (administration group) administered with the cancer gene therapy vector or the cancer therapeutic pharmaceutical composition according to the present invention and the control group, the formation of tumor is confirmed, and the tumor size is measured. Thereby, when more regression of the tumor is observed in the administration group, it becomes an index indicating that the cancer can be treated at the animal experiment level.

以上に説明したように、本発明に係る癌の遺伝子治療ベクター又は本発明に係る癌治療用医薬組成物を癌患者に投与することで、癌細胞の増殖を抑制することができる。 As described above, the growth of cancer cells can be suppressed by administering the cancer gene therapy vector according to the present invention or the pharmaceutical composition for cancer treatment according to the present invention to a cancer patient.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

〔材料及び方法〕
実験対象集団
82人の肺非小細胞癌(以下、「NSCLC」という)組織検体(54人の腺癌の組織検体、18人の扁平上皮癌の組織検体、5人の大細胞癌の組織検体、1人の大細胞神経内分泌癌の組織検体及び4人の腺扁平上皮癌の組織検体)を、愛知県がんセンターの審査会の承認のもと取得した。 [Materials and methods]
Experimental population
82 non-small cell lung cancer (NSCLC) tissue specimens (54 adenocarcinoma tissue specimens, 18 squamous cell carcinoma tissue specimens, 5 large cell carcinoma tissue specimens, 1 person Tissue specimens of large cell neuroendocrine cancers and 4 adenosquamous carcinoma specimens) were obtained with the approval of the Aichi Cancer Center Review Board.

let-7 miRNAの予後有意性研究に使用した肺癌組織検体は、1996年1月〜1998年1月の間の2年間内に、26歳女性及び40歳男性の肺癌患者から得られたものであった。なお、これら2人の肺癌患者は、愛知県がんセンター(愛知県名古屋市)において、手術による治療的切除を受けていた。
なお、組織検体が由来する患者の平均年齢は、62歳(32〜80歳の範囲)であり、病期は37 pStageI、12 pStage II、17 pStageIIIであった。 The lung cancer tissue specimens used for the prognostic significance study of let-7 miRNA were obtained from 26-year-old female and 40-year-old male lung cancer patients within two years between January 1996 and January 1998. there were. These two lung cancer patients had undergone surgical resection at the Aichi Cancer Center (Nagoya, Aichi Prefecture).
The average age of the patient from whom the tissue specimen was derived was 62 years (range of 32 to 80 years), and the stage was 37 pStageI, 12 pStage II, and 17 pStageIII.

細胞及び組織サンプルの調製
分析すべき全てのヒトNSCLC細胞系を、5％(v/v)FCS含有RPMI-1640中、37℃、5％CO₂で培養した。また、BEAS-2B細胞(不死化ヒト正常気管支上皮細胞系)及びHPL1D細胞(不死化ヒト末梢肺上皮細胞系)を、ウシインシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、10^-7Mヒドロコルチゾン、2 x 10^-10Mトリヨードチロニン、ペニシリン(100 IU/ml)及びストレプトマイシン(100μg/ml)を補足した1％FCS含有Ham’s F-12中、37℃、5％CO₂で培養した(Reddel RR, Ke Y, Gerwin BIら, Cancer Res, 1988年, 48巻, p.1904-9、及びMasuda A, Kondo M, Saito Tら, Cancer Res, 1997年, 57巻, p.4898-904参照)。腫瘍検体を、切除直後にグアニジンイソチオシアネートホモジナイゼーションバッファー中でホモジナイズし、上記審査会の承認により使用するまで-30℃で保存した。なお、RNA抽出に用いる全ての細胞系及び組織サンプルの処理は、既に記載したように実施した。 Preparation of cell and tissue samples All human NSCLC cell lines to be analyzed were cultured in RPMI-1640 containing 5% (v / v) FCS at 37 ° C., 5% CO ₂ . In addition, BEAS-2B cells (immortalized human normal bronchial epithelial cell line) and HPL1D cells (immortalized human peripheral lung epithelial cell line), bovine insulin (5 μg / ml), transferrin (5 μg / ml), 10 ⁻⁷ M Cultured in Ham's F-12 with 1% FCS supplemented with hydrocortisone, 2 x ^10-10 M triiodothyronine, penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (100 μg / ml) at 37 ° C, 5% CO ₂ (Reddel RR, Ke Y, Gerwin BI et al., Cancer Res, 1988, 48, p. 1904-9 and Masuda A, Kondo M, Saito T, et al., Cancer Res, 1997, 57, p. 4898- 904). Tumor specimens were homogenized in guanidine isothiocyanate homogenization buffer immediately after excision and stored at −30 ° C. until used with the approval of the above panel. All cell lines and tissue samples used for RNA extraction were processed as described above.

ノーザンブロッティング
RNA10μgを、15％変性ポリアクリルアミドゲル中で分離した。次いで、分離したRNAをZeta-Probe GTブロッティングメンブレンに電気泳動的に一晩転写した。 Northern blotting
10 μg of RNA was separated in a 15% denaturing polyacrylamide gel. The separated RNA was then electrophoretically transferred overnight to a Zeta-Probe GT blotting membrane.

一方、プローブ(let-7; 5’-TACTATACAACCTACTACCTCAATTTGCC-3’(配列番号２６)及び5S; 5’-AAAGCCTACAGCACCCGGTA-3’(配列番号２７))を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を介し、[γ-³²P]ATPで末端標識したDNAオリゴヌクレオチドにより作製した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションバッファー(0.25Mリン酸ナトリウム(pH 7.2)、7％ SDS及び0.5％ピロリン酸ナトリウム)を用いて実施した。次いで、最もストリンジェントな洗浄を、2 x SSC及び1％SDS中で、37.5℃で実施した。 Meanwhile, probes (let-7; 5′-TACTATACAACCTACTACCTCAATTTGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 26) and 5S; 5′-AAAGCCTACAGCACCCGGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 27)) were added to T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Beverly, MA ) To produce DNA oligonucleotides end-labeled with [γ- ³² P] ATP. Prehybridization and hybridization were performed using a hybridization buffer (0.25 M sodium phosphate (pH 7.2), 7% SDS and 0.5% sodium pyrophosphate). The most stringent wash was then performed at 37.5 ° C. in 2 × SSC and 1% SDS.

リアルタイムRT-PCR
リアルタイムRT-PCRを、ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems)、SYBR Green PCRマスターミックス(Perkin-Elmer Applied Biosystems)及びランダムプライミングcDNA (組織サンプルから抽出した全RNA20ngに対応する)を用いて実施した。 Real-time RT-PCR
Real-time RT-PCR using ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems), SYBR Green PCR master mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems) and random priming cDNA (corresponding to 20 ng of total RNA extracted from tissue samples) Carried out.

使用したプライマー対は、以下の通りである：
・let-7a-1S(センス; 5’-CCTGGATGTTCTCTTCACTG-3’)(配列番号２８)及びlet-7a-1AS(アンチセンス; 5’-GCCTGGATGCAGACTTTTCT-3’)(配列番号２９)
・let-7a-2S(センス; 5’-TTCCAGCCATTGTGACTGCA-3’)(配列番号３０)及びlet-7a-2AS(アンチセンス; 5’-CTCACCATGTTGTTTAGTGC-3’)(配列番号３１)
・let-7a-3S(センス; 5’-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3’)(配列番号３２)及びlet-7a-3AS(アンチセンス; 5’-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3’)(配列番号３３)
・let-7f-1S(センス; 5’-TGTACTTTCCATTCCAGAAG-3’)(配列番号３４)及びlet-7f-1AS(アンチセンス; 5’-TAATGCAGCAAGTCTACTCC-3’)(配列番号３５)
・let-7f-2S(センス; 5’-TGAAGATGGACACTGGTGCT-3’)(配列番号３６)及びlet-7f-2AS(アンチセンス; 5’-CAGTCGGAGAAGAAGTGTAC-3’)(配列番号３７)
・5S-S(センス; 5’-TACGGCCATACCACCCTGAA-3’)(配列番号３８)及び5S-AS(アンチセンス; 5’-TAACCAGGCCCGACCCTGCT-3’)(配列番号３９)
PCR増幅条件は、最初の変性ステップ(95℃：10分間)並びに95℃：30秒、56℃〜60℃：30秒(各プライマーセットに応じて最適化)及び72℃：15秒の55サイクルであった。 The primer pairs used are as follows:
Let-7a-1S (sense; 5'-CCTGGATGTTCTCTTCACTG-3 ') (SEQ ID NO: 28) and let-7a-1AS (antisense; 5'-GCCTGGATGCAGACTTTTCT-3') (SEQ ID NO: 29)
Let-7a-2S (sense; 5'-TTCCAGCCATTGTGACTGCA-3 ') (SEQ ID NO: 30) and let-7a-2AS (antisense; 5'-CTCACCATGTTGTTTAGTGC-3') (SEQ ID NO: 31)
Let-7a-3S (sense; 5'-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3 ') (SEQ ID NO: 32) and let-7a-3AS (antisense; 5'-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3') (SEQ ID NO: 33)
Let-7f-1S (sense; 5'-TGTACTTTCCATTCCAGAAG-3 ') (SEQ ID NO: 34) and let-7f-1AS (antisense; 5'-TAATGCAGCAAGTCTACTCC-3') (SEQ ID NO: 35)
Let-7f-2S (sense; 5'-TGAAGATGGACACTGGTGCT-3 ') (SEQ ID NO: 36) and let-7f-2AS (antisense; 5'-CAGTCGGAGAAGAAGTGTAC-3') (SEQ ID NO: 37)
5S-S (sense; 5'-TACGGCCATACCACCCTGAA-3 ') (SEQ ID NO: 38) and 5S-AS (antisense; 5'-TAACCAGGCCCGACCCTGCT-3') (SEQ ID NO: 39)
PCR amplification conditions consisted of 55 cycles of initial denaturation step (95 ° C: 10 minutes) and 95 ° C: 30 seconds, 56 ° C-60 ° C: 30 seconds (optimized for each primer set) and 72 ° C: 15 seconds Met.

let-7 pri-miRNAの発現レベルを定量するために、標準曲線を、各PCR産物をEcoRV部位に挿入したpBluescriptIISK(-)の連続希釈物を用いて作成した。また、5SリボソームRNA対照を、全RNAの初期投入量を標準化するために使用した。let-7 pri-miRNAの発現レベルは、5SリボソームRNA対照と比較した際の標的メッセージ量に基づいた。 In order to quantify the expression level of let-7 pri-miRNA, a standard curve was generated using serial dilutions of pBluescriptIISK (-) with each PCR product inserted into the EcoRV site. A 5S ribosomal RNA control was also used to normalize the initial input of total RNA. The expression level of let-7 pri-miRNA was based on the amount of target message compared to the 5S ribosomal RNA control.

階層的クラスタリング
階層的クラスタリング及びデータセットの視覚化のために、CLUSTER及びTREEVIEWプログラムを使用した(Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998年, 95巻, p.14863-8)。各発現に対する蛍光比率を対数変換し、次いで全てのサンプルに対するデータを平均センタリングした。さらに、得られたデータをクラスタリングアルゴリズムに供した。凝縮型階層的クラスタリングを、完全連結法を用いて行い、遺伝子発現プロファイル間の相関性に基づく腫瘍サンプルの本来のグルーピングの証拠が存在するか否かを調査した。 Hierarchical clustering The CLUSTER and TREEVIEW programs were used for hierarchical clustering and data set visualization (Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95 Volume, p.14863-8). The fluorescence ratio for each expression was log transformed and then the data for all samples were average centered. Furthermore, the obtained data was subjected to a clustering algorithm. Condensed hierarchical clustering was performed using the full ligation method to investigate whether there was evidence of an original grouping of tumor samples based on the correlation between gene expression profiles.

統計分析
カプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）法を用いて、時間の関数として生存を評価し、生存差異を対数順位検定により分析した。また、生存に関連する可能性がある因子のコックス回帰分析を行い、独立した因子が組み合わさって生存に対して有意に影響を及ぼすか否かを確認した。 Statistical analysis Survival was assessed as a function of time using the Kaplan-Meier method and survival differences were analyzed by log-rank test. Cox regression analysis of factors that may be related to survival was performed to determine whether independent factors combined significantly affect survival.

コロニー形成アッセイ
let-7 miRNA発現構築物及び対照プラスミドを、let-7a(センス; 5’-GATCCCCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTT-3’(配列番号４０)及びアンチセンス; 5’-AGCTAAAAACTATACAACCTACTACCTCAGGG-3’(配列番号４１))、let-7f(センス; 5’-GATCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTTTT-3’(配列番号４２)及びアンチセンス; 5’-AGCTAAAAACTATACAATCTACTACCTCAGGG-3’(配列番号４３))、又は対照(センス; 5’-GATCCCCTTTTTTTTGGAAA-3’(配列番号４４)及びアンチセンス; 5’-AGCTTTTCCAAAAAAAAGGG-3’(配列番号４５))のアニーリングオリゴヌクレオチドをpH1-RNApuroにクローニングすることによって構築した。なお、pH1-RNApuroにおいては、遺伝子の発現は、ヒトゲノムDNAのPCR増幅により調製したRNAポリメラーゼIII H1-RNA遺伝子プロモーターの制御下にあった。let-7a及びlet-7f miRNA発現構築物をA549肺腺癌細胞系に、製造業者の取り扱い説明書に従い、FuGENE6試薬(Roche, Inc.)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後に、細胞をピューロマイシン(1μg/ml)添加により選択し、次いで37℃で2週間培養した。ピューロマイシン選択の2週間後に、プレートをギムザ染色し、耐性コロニー数を計数した。 Colony formation assay
let-7 miRNA expression constructs and control plasmids are let-7a (sense; 5'-GATCCCCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 40) and antisense; 5'-AGCTAAAAACTATACAACCTACTACCTCAGGG-3' (SEQ ID NO: 41)), let-7f (Sense; 5'-GATCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTTTT-3 '(SEQ ID NO: 42) and antisense; 5'-AGCTAAAAACTATACAATCTACTACCTCAGGG-3' (SEQ ID NO: 43)) or control (sense; 5'-GATCCCCTTTTTTTTGGAAA-3 '(SEQ ID NO: 44) And antisense; 5′-AGCTTTTCCAAAAAAAAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 45)) annealing oligonucleotide was constructed by cloning into pH1-RNApuro. In pH1-RNApuro, gene expression was under the control of RNA polymerase III H1-RNA gene promoter prepared by PCR amplification of human genomic DNA. The let-7a and let-7f miRNA expression constructs were transfected into A549 lung adenocarcinoma cell line using FuGENE6 reagent (Roche, Inc.) according to the manufacturer's instructions. Three days after transfection, cells were selected by adding puromycin (1 μg / ml) and then cultured at 37 ° C. for 2 weeks. Two weeks after puromycin selection, the plates were stained with Giemsa and the number of resistant colonies was counted.

〔結果〕
in vitro及びin vivoの双方におけるヒト肺癌中のlet-7 miRNA発現の低下
まず、ノーザンブロット分析を、16種のヒト肺癌細胞系並びに2種の不死化ヒト正常肺上皮細胞系(以下、「HNLEC」と呼ぶ)においてlet-7発現を分析するために実施した。代表的な9種のヒト肺癌細胞系に関する結果を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、5Sは、ローディング対照である5SリボソームRNAを示す。〔result〕
Reduced let-7 miRNA expression in human lung cancer both in vitro and in vivo.First, Northern blot analysis was performed using 16 human lung cancer cell lines and 2 immortalized human normal lung epithelial cell lines (hereinafter referred to as `` HNLEC ''). In order to analyze let-7 expression. The results for nine representative human lung cancer cell lines are shown in FIG. 1A. In FIG. 1A, 5S indicates 5S ribosomal RNA as a loading control.

図１Ａから判るように、let-7 miRNAの成熟型は、2種の不死化HNLEC双方において、正常な肺組織における発現レベルと匹敵するレベルで容易に検出できた。一方、著しく対照的に、肺癌細胞系のうち56％(18種のうち10種)において、let-7 miRNAの発現レベルの有意な低下(＞80％)が観察された。さらに、手術による外科的処置を行った患者から直接採取したヒト原発性肺癌組織におけるlet-7 miRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析により分析した。代表的な12症例に関する結果を図１Ｂに示す。図１Ｂにおいて、「5S」は、ローディング対照である5SリボソームRNAを示す。さらに、「Case XX」は症例番号であり、「N」は正常肺組織、「T」は肺癌組織を意味する。 As can be seen from FIG. 1A, the mature form of let-7 miRNA was easily detected at a level comparable to the expression level in normal lung tissue in both two immortalized HNLECs. In contrast, a significant reduction (> 80%) in the expression level of let-7 miRNA was observed in 56% (10 out of 18) of lung cancer cell lines. Furthermore, let-7 miRNA expression levels were analyzed by Northern blot analysis in human primary lung cancer tissues taken directly from patients undergoing surgical surgery. The results for 12 representative cases are shown in FIG. 1B. In FIG. 1B, “5S” indicates 5S ribosomal RNA as a loading control. Furthermore, “Case XX” is a case number, “N” means normal lung tissue, and “T” means lung cancer tissue.

図１Ｂから判るように、検査した症例のうち44％(16症例のうち7症例)が、対応する正常肺組織におけるlet-7 miRNAの発現レベルと比較して80％以上低下していることが観察された。 As can be seen from FIG. 1B, 44% of the cases examined (7 out of 16 cases) are reduced by 80% or more compared to the expression level of let-7 miRNA in the corresponding normal lung tissue. Observed.

in vitroでの細胞系におけるlet-7 miRNA発現低下の発生頻度の高さは、in vivoでの腫瘍組織における正常間質細胞/炎症性細胞の必然的な混在に関係している可能性がある。あるいは、上記発生頻度の高さは、細胞系の確立過程におけるlet-7 miRNAが低下した細胞のin vitro選択を反映している可能性がある。従って、これらの知見は、肺癌におけるlet-7 miRNA発現の有意な低下の発生頻度の高さを明確に示すものであった。 The increased frequency of let-7 miRNA expression reduction in cell lines in vitro may be related to the inevitable mix of normal stromal / inflammatory cells in tumor tissue in vivo . Alternatively, the high occurrence frequency may reflect in vitro selection of cells with reduced let-7 miRNA in the process of cell line establishment. Therefore, these findings clearly indicate the high frequency of significant decrease in let-7 miRNA expression in lung cancer.

外科的処置を行った患者におけるlet-7 miRNA発現低下の予後効果
次に、let-7 miRNA発現低下が肺癌の臨床病理学的特性と関連するか否かをpri-miRNAレベルで調査した。この目的のために、NSCLCの手術による治療的切除を受けた肺癌患者の66症例を、let-7 pri-miRNAアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたリアルタイムRT-PCR分析により検査した。その結果として、let-7 pri-miRNAの発現レベルが、肺癌の症例によりかなり変動することが示された。一方、let-7 pri-miRNAの発現レベルは、肺癌の症例の間で同様に調節されている傾向にあった。なお、最も多量のlet-7 pri-miRNAアイソフォームは、let-7a-1(let7a pri-miRNAのうちの1つ)及びlet-7f-1(let7f pri-miRNAのうちの1つ)であった。これらlet-7a-1及びlet-7f-1は、ヒトゲノムにおいて数百塩基内にクラスター化されていることが知られている(非特許文献４)。 Prognostic effect of reduced let-7 miRNA expression in surgically treated patients Next, we investigated at the pri-miRNA level whether reduced let-7 miRNA expression was associated with clinicopathological features of lung cancer. To this end, 66 lung cancer patients who underwent therapeutic excision with NSCLC surgery were examined by real-time RT-PCR analysis using let-7 pri-miRNA isoform-specific oligonucleotide primers. As a result, it was shown that the expression level of let-7 pri-miRNA varies considerably depending on lung cancer cases. On the other hand, the expression level of let-7 pri-miRNA tended to be similarly regulated among lung cancer cases. The most abundant let-7 pri-miRNA isoforms were let-7a-1 (one of let7a pri-miRNA) and let-7f-1 (one of let7f pri-miRNA). It was. These let-7a-1 and let-7f-1 are known to be clustered within several hundred bases in the human genome (Non-patent Document 4).

さらに、NSCLCの手術による治療的切除を受けた肺癌患者の66症例の階層的クラスタリング分析を行った。結果を図２に示す。図２において、「HNBE」は正常ヒト気管支上組織由来のRNAであり、「HNPL」は38種の正常ヒト末梢肺組織由来のRNA混合物である。また、「Case XX」は、症例番号である。 In addition, a hierarchical clustering analysis of 66 cases of lung cancer patients who underwent therapeutic resection by NSCLC surgery was performed. The results are shown in FIG. In FIG. 2, “HNBE” is RNA derived from normal human upper bronchial tissue, and “HNPL” is an RNA mixture derived from 38 normal human peripheral lung tissues. “Case XX” is a case number.

図２から判るように、pri-miRNAレベルでのlet-7発現に従って、2つの主要なクラスター（クラスター1及び2）が存在することが明らかにされた。クラスターと様々な臨床病理学的特徴(年齢、性別、組織型、原発性腫瘍状態(pT)、結節性併発(pN)、病期、分化グレード及び喫煙歴を含む)との有意な関連性を見出すことはできなかった。しかしながら、クラスター1は、クラスター2よりも高い病期にある患者を含む傾向にあった(p=0.104 (λ²検定による))。 As can be seen from FIG. 2, it was revealed that there are two major clusters (clusters 1 and 2) according to let-7 expression at the pri-miRNA level. Significant associations between clusters and various clinicopathological features (including age, gender, histology, primary tumor status (pT), nodular complications (pN), stage, differentiation grade and smoking history) I couldn't find it. However, cluster 1 tended to include patients at a higher stage than cluster 2 (p = 0.104 (by λ ² test)).

さらに、カプラン−マイヤー法を用いて、時間の関数として生存を評価し、生存差異を対数順位検定により分析した(図３)。また、生存に関連する可能性がある因子のコックス回帰分析を行い、独立した因子が組み合わさって生存に対して有意に影響を及ぼすか否かを確認した(表２)。 Furthermore, the Kaplan-Meier method was used to assess survival as a function of time, and survival differences were analyzed by log rank test (FIG. 3). In addition, Cox regression analysis of factors that may be related to survival was performed, and it was confirmed whether independent factors combined significantly affected survival (Table 2).

図３から判るように、カプラン−マイヤー生存曲線により、let-7発現が低下しているクラスター1に属する患者は、クラスター2として分類された患者よりも早期死のリスクが有意に高いことが示された(p=0.0005(対数順位検定による))。このように、クラスター1とクラスター2との間には、患者の手術後の生存に著しい差異が見られた。 As can be seen from FIG. 3, Kaplan-Meier survival curves show that patients belonging to cluster 1 with reduced let-7 expression are at significantly higher risk of early death than patients classified as cluster 2. (P = 0.0005 (by log-rank test)). Thus, there was a significant difference in survival after surgery between cluster 1 and cluster 2.

また、表２に示すように、1変量コックス回帰分析により、let-7発現の特徴的な低下を示すクラスター1への分類は、病期(p=0.005)に加えて予後不良の有意な予後因子(p=0.002)であることが示された。次いで、コックス比例ハザードモデルによる多変量分析を行い、独立した因子が組み合わさって生存に対して有意に影響を及ぼすか否かを確認した(表２)。可能性のある予後因子と生存との相互関連性を、変数として年齢、性別、組織型、喫煙歴、病期及び上記で規定したlet-7クラスターを用いて分析した。表２に示すように、治療的切除後の外科的処置を行ったNSCLC患者において、上記で規定したlet-7クラスターは、病期(p=0.006)に加えて、有意に独立した予後因子であることが確認された(p=0.002)。早期死のハザード率は、クラスター2に対するクラスター1において6.16(95％信頼区間：1.95-19.4)であり、またpStage Iに対するpStage II/IIIにおいて4.42(95％信頼区間：1.53-12.7)であった。従って、let-7の発現レベルは、NSCLC患者の手術後の生存に有意な影響を及ぼすと考えられた。 In addition, as shown in Table 2, the univariate Cox regression analysis shows that the classification into cluster 1 showing a characteristic decrease in let-7 expression is significant prognosis of poor prognosis in addition to stage (p = 0.005) It was shown to be a factor (p = 0.002). Next, multivariate analysis was performed using the Cox proportional hazard model to confirm whether independent factors combined significantly affected survival (Table 2). The correlation between possible prognostic factors and survival was analyzed using age, gender, tissue type, smoking history, stage of disease and let-7 cluster as defined above as variables. As shown in Table 2, in patients with NSCLC who underwent surgical treatment after therapeutic resection, the let-7 cluster defined above is a significantly independent prognostic factor in addition to stage (p = 0.006). It was confirmed that there was (p = 0.002). The hazard rate for early death was 6.16 in cluster 1 for cluster 2 (95% confidence interval: 1.95-19.4) and 4.42 in pStage II / III for pStage I (95% confidence interval: 1.53-12.7) . Therefore, the expression level of let-7 was considered to have a significant effect on survival after surgery in NSCLC patients.

外因性let-7 miRNAの過剰発現による肺癌細胞の増殖抑制
肺癌患者の生存の短さと関連して肺癌におけるlet-7の発現低下を確認したことから、肺癌発生におけるlet-7 miRNAの生物学的有意性の可能性を調べることにした。 Inhibition of lung cancer cell growth by overexpression of exogenous let-7 miRNA We confirmed a decrease in let-7 expression in lung cancer in relation to short survival in lung cancer patients. We decided to examine the possibility of significance.

まず、let-7 miRNA発現構築物を、RNAポリメラーゼIII H1-RNA遺伝子プロモーターの制御下で、2種の主要なlet-7 miRNAアイソフォーム、let-7a及びlet-7fの成熟型miRNAを合成するように設計した。次いで、let-7a及びlet-7f発現構築物をA549肺腺癌細胞系にトランスフェクトした。細胞をピューロマイシン(1μg/ml)選択後、37℃で2週間培養した。ピューロマイシン選択の2週間後に、プレートをギムザ染色し、耐性コロニー数を計数した。結果を図４A及びBに示す。なお、図４A及びBにおいて、「モック」はトランスフェクトしていない細胞、「VC」は空ベクター(ベクター対照)をトランスフェクトした細胞、「let-7a」及び「let-7f」は、それぞれlet-7a、let-7f発現構築物をトランスフェクトした細胞である。 First, let-7 miRNA expression construct is synthesized under the control of RNA polymerase III H1-RNA gene promoter to synthesize two major let-7 miRNA isoforms, let-7a and let-7f mature miRNA. Designed. The let-7a and let-7f expression constructs were then transfected into the A549 lung adenocarcinoma cell line. The cells were cultured at 37 ° C. for 2 weeks after puromycin (1 μg / ml) was selected. Two weeks after puromycin selection, the plates were stained with Giemsa and the number of resistant colonies was counted. The results are shown in FIGS. 4A and B. In FIGS. 4A and B, “mock” is a non-transfected cell, “VC” is a cell transfected with an empty vector (vector control), “let-7a” and “let-7f” are let Cells transfected with -7a, let-7f expression constructs.

図４A及びBから判るように、A549肺腺癌細胞系にlef-7fを過剰発現させることで、コロニー数が78.6％低下した。一方、let-7aを過剰発現させると、lef-7fの場合と同様にコロニー数の低下が示されたが、その増殖抑制効果はlet-7fほど大きくはなかった。なお、実験結果は、上記発現構築物の3つの独立した調製物を用いて、3重で行った5回の独立した実験において同様の結果であった。 As can be seen from FIGS. 4A and B, overexpression of lef-7f in the A549 lung adenocarcinoma cell line reduced the number of colonies by 78.6%. On the other hand, overexpression of let-7a showed a decrease in the number of colonies as in the case of lef-7f, but its growth inhibitory effect was not as great as that of let-7f. The experimental results were the same in five independent experiments performed in triplicate using three independent preparations of the expression construct.

図１Ａは、in vitroでの肺癌細胞系におけるlet-7 miRNA発現のノーザンブロット分析の結果を示す。FIG. 1A shows the results of Northern blot analysis of let-7 miRNA expression in a lung cancer cell line in vitro. 図１Ｂは、in vivoでの原発性肺癌の検体におけるlet-7 miRNA発現のノーザンブロット分析の結果を示す。FIG. 1B shows the results of Northern blot analysis of let-7 miRNA expression in primary lung cancer specimens in vivo. 図２は、let-7 pri-miRNAアイソフォームの発現に従った、原発性肺癌の66症例の階層的クラスタリングを示す。FIG. 2 shows hierarchical clustering of 66 cases of primary lung cancer according to the expression of let-7 pri-miRNA isoform. 図３は、図２に示すクラスター1又は2のいずれかに分類された肺癌患者のカプラン−マイヤー生存曲線を示す特性図である。FIG. 3 is a characteristic diagram showing Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients classified into either cluster 1 or 2 shown in FIG. 図４Ａは、外因的に導入したlet-7 miRNAの過剰発現によるA549肺腺癌細胞系の典型的なコロニー形成アッセイの結果を示す特性図である。FIG. 4A is a characteristic diagram showing the results of a typical colony formation assay of the A549 lung adenocarcinoma cell line by overexpression of exogenously introduced let-7 miRNA. 図４Ｂは、外因的に導入したlet-7 miRNAの過剰発現によるA549肺腺癌細胞系のコロニー形成の低下を示す典型的なプレートである。FIG. 4B is a typical plate showing reduced colony formation in the A549 lung adenocarcinoma cell line due to overexpression of exogenously introduced let-7 miRNA.

配列番号１において、nはt又は塩基なしを表す(存在位置：22)。
配列番号２６及び２７は、プローブである。
配列番号２８〜３９は、プライマーである。
配列番号４０〜４５は、オリゴヌクレオチドである。 In SEQ ID NO: 1, n represents t or no base (location: 22).
SEQ ID NOs: 26 and 27 are probes.
Sequence number 28-39 is a primer.
SEQ ID NOs: 40-45 are oligonucleotides.

Claims

In a lung cancer tissue sample derived from a lung cancer patient, measuring any one expression level selected from the group consisting of miRNA, pre-miRNA and pri-miRNA transcribed from DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A test method for determining a prognosis in a lung cancer patient.

The method according to claim 1, wherein the miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 7.

The method according to claim 1, wherein the pre-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 16.

The method according to claim 1, wherein the pri-miRNA is transcribed from any one DNA selected from the group of DNAs consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 25.