JP4090092B2 - Novel Fas ligand-like protein and its DNA - Google Patents

Novel Fas ligand-like protein and its DNA Download PDF

Info

Publication number
JP4090092B2
JP4090092B2 JP19211997A JP19211997A JP4090092B2 JP 4090092 B2 JP4090092 B2 JP 4090092B2 JP 19211997 A JP19211997 A JP 19211997A JP 19211997 A JP19211997 A JP 19211997A JP 4090092 B2 JP4090092 B2 JP 4090092B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
dna
present
amino acid
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP19211997A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH10271997A (en
Inventor
一紀 西
由紀子 引地
靖 新谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP19211997A priority Critical patent/JP4090092B2/en
Publication of JPH10271997A publication Critical patent/JPH10271997A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4090092B2 publication Critical patent/JP4090092B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＦａｓリガンド様タンパク質およびそのＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多細胞生物は、その恒常性を保つために細胞の増殖と死を巧妙にコントロールしている。個体発生の過程では、多くの細胞が細胞死によって除去され、また、成体においても臓器、組織を構成する細胞は常に増殖と死のバランスを保ちながら、その機能を維持している。こうした際の細胞死は、予め予定された死、"Programmed Cell Death"であるとされており、物理的・化学的要因で不慮に起こる細胞死であるネクローシス（Necrosis、壊死）とは形態学的に明確に区別されたアポトーシス（Apoptosis）の過程を経て起こることが知られている。アポトーシスによる細胞死の特徴は、細胞膜の湾曲、核の凝縮や断片化が起こり、最終的にマクロファージのような貪食細胞によって取り込まれ、再利用される機構として論じられている（インターナショナル・レビュー・オブ・サイトロジー（INTERNATIONAL REVIEW OF CYTOLOGY）68，251-306，1980）。
これまでにアポトーシスが関与する多くの生理的、病理的現象が明らかにされてきており、細胞のアポトーシスを誘導あるいは抑制することにより、各種疾患の診断、予防および治療を図る試みも盛んに行われている（サイエンス（SCIENCE）267, 1456-1462, 1995）。アポトーシスは当業界で特に注目されている生命現象の一つである。
【０００３】
アポトーシスは種々の生理的条件下で誘導されるが、中でもＦａｓ抗原（ＣＤ９５，ＡＰＯ−１）は免疫系の細胞に死を誘導する分子として近年注目を集めている（サイエンス（SCIENCE）267, 1449-1456, 1995）。Ｆａｓ抗原は分子量４５ｋＤａのＴＮＦ（腫瘍細胞壊死因子，tumor necrosis factor）レセプターファミリーに属するＩ型膜タンパク質であり、Ｆａｓリガンドと結合することにより、細胞死を誘導する。Ｆａｓ抗原の発現が各種血球系細胞や、肝臓、心臓、小腸など多くの組織や細胞で見られるのに対して、分子量４０ｋＤａのII型膜タンパク質であるＦａｓリガンドの発現は活性化Ｔリンパ球やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、精巣、角膜などに限られる。最近、マウスにおける遺伝子の解析から、Ｆａｓ抗原遺伝子は、ｌｐｒ（lymphoproliferation）マウスと呼ばれる自己免疫疾患発症マウスにおいて変異が起きているｌｐｒ構造遺伝子そのものであること、またｌｐｒマウスと同様の症状を呈するｇｌｄ（generalized-lymphoproliferative disease）マウスではＦａｓリガンドに変異が起きていることが明らかにされた。ヒトにおいてもＦａｓ抗原遺伝子に変異を有する自己免疫疾患患者が報告されており、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の機能不全が自己免疫疾患を惹起することが強く示唆されている（サイエンス（SCIENCE）268, 1347-1349, 1995）。
また、ヒトＦａｓリガンドがマトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinase）により切断され、可溶型Ｆａｓリガンドとして遊離されうることが判明し、Ｆａｓリガンドが細胞間の接触による相互作用だけでなく、より広範に免疫応答を調節している可能性も示唆されている（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（JOUNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE）182, 1777-1783, 1995）。
【０００４】
Ｆａｓリガンド以外にも、多彩な生物活性を有するＴＮＦファミリーに属するタンパク質の中で、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（Lymphotoxin−α、ＬＴ−α）およびリンホトキシン−β（Lymphotoxin−β、ＬＴ−β）にアポトーシスを誘導する活性があることが報告されている（ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE）334, 1717-1725, 1996）。ＴＮＦ−αは腫瘍壊死活性を持った因子として１９７５年に発見されたが、最近では、むしろ炎症反応のメディエーターとしての免疫機能の賦活因子として、またウイルス感染や細菌感染をはじめ種々の侵襲に対する防御因子としての作用の重要性が認識されてきている。また、ＬＴ−αは当初、リンパ球が産生する細胞傷害因子として報告され、ＴＮＦ−αと同様にホモ三量体を形成し、５５ｋＤａと７５ｋＤａの２つのＴＮＦレセプターに結合し、Ｂリンパ球の増殖促進以外は活性の強弱はあるもののＴＮＦと同様な生物活性スペクトラムを示す。ＬＴ−βはＬＴ−αと相同性の高い分子量３３ｋＤａの膜結合型タンパク質で、ＬＴ−αとヘテロ三量体を形成し、２種のＴＮＦレセプターとは異なる新たに見いだされたＬＴ−βレセプターに結合し、リンパ節形成というＴＮＦ、ＬＴ−α三量体にはない生物活性を有する。また最近、アポトーシス誘導活性を有しかつＦａｓリガンドと相同性が高い分子（ＡＰＯ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）が新たに発見され、本タンパク質がＴＮＦレセプターやＦａｓ抗原とは異なる別のレセプターＤＲ４に結合して細胞傷害活性を発揮することが示されている（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY）271, 12687-12690, 1996；サイエンス（SCIENCE), 276, 111-113, 1997）。従って、このようなリガンド、レセプターの発現特異性が異なるお互いのＴＮＦ（ＴＮＦレセプター）ファミリーのタンパク質間でも、アポトーシス誘導活性における生理的に明確な機能分担があることが考えられる。
【０００５】
最近、アポトーシスと疾病との関連性について詳細な報告がされている（日本臨床、第５４巻、第７号、1996年７月１日発行）。例えば、アポトーシス減少に起因する疾患としては、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌）、ウイルス感染（例、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎）が例示されており、一方、アポトーシス増加に起因する疾患としては、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中）、中毒性肝疾患（例、アルコール）が例示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規Ｆａｓリガンド様タンパク質，その部分ペプチドまたはその塩、該タンパク質をコードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、該タンパク質の製造法、該タンパク質またはＤＮＡを含有する医薬、該タンパク質に対する抗体、レセプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法並びにスクリーニング用キット、該スクリーニングで得られるレセプターアゴニスト／アンタゴニスト並びにその医薬、該タンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進／阻害する化合物のスクリーニング方法並びにスクリーニング用キット、該スクリーニングで得られる化合物並びにその医薬、該タンパク質と該タンパク質が結合し得るレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物のクリーニング方法並びにスクリーニング用キット、該スクリーニングで得られる化合物並びにその医薬等を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
新たなＦａｓリガンド様タンパク質の単離は、ＴＮＦファミリー、ＴＮＦレセプターファミリーを介した新たなアポトーシス経路を明らかにし、またそれが臓器あるいは細胞特異的に発現していれば、臓器別各種疾患とアポトーシスとの関連について、一層詳細な究明を可能にし、新たなＦａｓリガンド様タンパク質に対して阻害活性あるいは促進活性を発揮し、種々の疾患の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発ができる。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝臓、マウス胚およびラット肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーからそれぞれ新規な塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。そして、本発明者らは、得られたｃＤＮＡにコードされるタンパク質が有用なＦａｓリガンド様タンパク質であることを見いだし、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列である第（１）項記載のタンパク質、
（３）アポトーシス誘導活性を有するタンパク質である第（１）項または第（２）項記載のタンパク質、
（４）第（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）第（１）項記載のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（６）配列番号：４〜配列番号：１０のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、
（７）第（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（８）第（７）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（９）第（８）項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方法、
（１０）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医薬、
（１１）第（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１２）癌、ウイルス感染症、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（１０）項または第（１１）項記載の医薬、
（１３）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
【０００９】
（１４）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１５）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１６）第（１４）項記載のスクリーニング方法または第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１７）第（１４）項記載のスクリーニング方法または第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１８）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）第（１８）項記載のスクリーニング方法または第（１９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２１）第（１８）項記載のスクリーニング方法または第（１９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
【００１０】
（２２）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のクリーニング方法、
（２３）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２４）第（２２）項記載のスクリーニング方法または第（２３）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２５）第（２２）項記載のスクリーニング方法または第（２３）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩と第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２６）外来性の第（５）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト哺乳動物、
（２７）第（５）項記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２８）第（５）項記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（２９）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が第（５）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現し得る第（２８）項記載の非ヒト哺乳動物、
（３０）第（２９）項記載の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする第（５）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３１）第（３０）項記載のスクリーニング方法を用いて得られる、第（５）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、および
（３２）第（３０）項記載のスクリーニング方法を用いて得られる第（５）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【００１１】
また、本発明は、
（１）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列である第（１）項記載のタンパク質、
（３）配列番号：１または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列である第（１）項記載のタンパク質、
（４）アポトーシス誘導活性を有するタンパク質である第（１）項〜第（３）項のいずれかに記載のタンパク質、
（５）第（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（６）第（１）項記載のタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（７）配列番号：４〜配列番号：１０のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を有する第（６）項記載のＤＮＡ、
（８）第（６）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（９）第（８）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）第（９）項記載の形質転換体を培養し、第（１）項記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質またはその塩の製造方法、
（１１）第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医薬、
（１２）癌、ウイルス感染症、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（１１）項記載の医薬、
（１３）第（６）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（１４）癌、ウイルス感染症、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（１３）項記載の医薬、
（１５）第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、
【００１２】
（１６）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターまたはその部分ペプチドに、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を接触させた場合と、（ii）該レセプターまたはその部分ペプチドに、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩および試験化合物を接触させた場合における、該レセプターまたはその部分ペプチドと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合量を測定し、比較することを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を接触させた場合と、（ii）該レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩および試験化合物を接触させた場合における、該レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分と第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合量を測定し、比較することを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞を接触させた場合と、（ii）該レセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞および試験化合物を接触させた場合における、該レセプターを含有する細胞におけるアポトーシス誘導活性または細胞傷害活性を測定して、比較することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９）第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）第（１６）項〜第（１８）項のいずれかに記載のスクリーニング方法または第（１９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（２１）第（１６）項〜第（１８）項のいずれかに記載のスクリーニング方法または第（１９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターに対するアゴニストを含有してなる医薬、
（２２）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（２１）項記載の医薬、
（２３）第（１６）項〜第（１８）項のいずれかに記載のスクリーニング方法または第（１９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターに対するアンタゴニストを含有してなる医薬、
（２４）エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎または潰瘍性大腸炎の治療・予防剤である第（２３）項記載の医薬、
【００１３】
（２５）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質またはその塩を分解するプロテイナーゼ（ただし、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞が、該タンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）の存在下で第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合と、（ii）第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼ（ただし、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞が、第（１）項記載のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）および試験化合物の存在下で第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性、またはレセプターを含有する細胞のアポトーシスもしくは細胞傷害を測定または観察して、比較することを特徴とする第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２６）第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２７）第（２５）項記載のスクリーニング方法または第（２６）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２８）第（２５）項記載のスクリーニング方法または第（２６）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２９）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（２８）項記載の医薬、
（３０）第（２５）項記載のスクリーニング方法または第（２６）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（１）項記載のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３１）エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎または自己免疫性疾患の治療・予防剤である第（３０）項記載の医薬、
【００１４】
（３２）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を接触させた場合と、（ii）該レセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩および試験化合物を接触させた場合における、該レセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を測定し、比較することを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のクリーニング方法、
（３３）（ｉ）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞を接触させた場合と、（ii）該レセプターを含有する細胞に、第（１）項記載のタンパク質を含有する細胞および試験化合物を接触させた場合において、該レセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を測定し、比較することを特徴とする、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のクリーニング方法、
（３４）第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３５）第（３２）項または第（３３）項記載のスクリーニング方法または第（３４）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩、
（３６）第（３２）項または第（３３）項記載のスクリーニング方法または第（３４）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３７）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防である第（３６）項記載の医薬、
（３８）第（３２）項または第（３３）項記載のスクリーニング方法または第（３４）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターと第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩との結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３９）エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎または潰瘍性大腸炎の治療・予防剤である第（３８）項記載の医薬、
【００１５】
（４０）ヒトまたは哺乳動物に第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を有効量投与することを特徴とするヒトまたは哺乳動物における癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症または痛みを治療または予防する方法、
（４１）ヒトまたは哺乳動物に第（６）項記載のＤＮＡを有効量投与することを特徴とするヒトまたは哺乳動物における癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みを治療または予防する方法、
（４２）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤を製造するための第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の使用、
（４３）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤を製造するための第（６）項記載のＤＮＡの使用、
（４４）外来性の第（６）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト哺乳動物、
（４５）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（４４）項記載の非ヒト哺乳動物、
（４６）ゲッ歯動物がマウスである第（４４）項記載の非ヒト哺乳動物、
（４７）ＤＮＡが配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（マウス由来ゲノムＤＮＡ）である第（４６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（４８）外来性の第（６）項記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、非ヒト哺乳動物において発現し得る組換えベクター、
（４９）ＤＮＡが配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（マウス由来ゲノムＤＮＡ）である第（４８）項記載の組換えベクター、
（５０）第（６）項記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（５１）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（５０）項記載の非ヒト動物胚幹細胞、
（５２）ネオマイシン耐性である第（５０）項記載の非ヒト動物胚幹細胞、
（５３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（５０）項記載の非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（５４）ゲッ歯動物がマウスである第（５３）項記載の非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（５５）ＤＮＡが配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（マウス由来ゲノムＤＮＡ）である第（５４）項記載の非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
【００１６】
（５６）第（６）項記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（５７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現し得る第（５６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（５８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（５６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（５９）ゲッ歯動物がマウスである第（５８）項記載の非ヒト哺乳動物、
（６０）ＤＮＡが配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ（マウス由来ゲノムＤＮＡ）である第（５９）項記載の非ヒト哺乳動物、
（６１）第（５６）項記載の非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（６２）第（５１）項記載のスクリーニング方法を用いて得られる、第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩、
（６３）第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（６４）癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、骨疾患、動脈硬化症または痛みの治療・予防剤である第（６３）項記載の医薬、
（６５）第（５１）項記載のスクリーニング方法を用いて得られる、第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を阻害する化合物またはその塩、
（６６）第（６）項記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（６７）エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎または潰瘍性大腸炎の治療・予防剤である第（６６）項記載の医薬、
【００１７】

Figure 0004090092
Figure 0004090092
〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示し、欠失していてもよい〕で表わされるアミノ酸配列（配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列）を有する第（１）項記載のタンパク質、
【００１８】
（６９）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する第（５）項記載の部分ペプチド、
（７０）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する第（５）項記載の部分ペプチド、
（７１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を有する第（５）項記載の部分ペプチド、
（７２）配列番号：４〜配列番号：１０のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（７３）第（７２）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（７４）第（７３）項記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（７５）第（７４）項記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第（７２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩の製造方法、
（７６）第（７５）項記載の製造法で製造される、第（７２）項記載のＤＮＡにコードされるタンパク質またはその塩、
【００１９】
（７７）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターが、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプター（例、ＴＮＦレセプター、リンホトキシン−βレセプター、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＤＲ３／ＷＳＬ−１、ＴＲ２）または第（１）項記載のタンパク質に対するレセプターである第（１６）項〜第（１８）項のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７８）第（１）項記載のタンパク質が結合し得るレセプターが、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプター（例、ＴＮＦレセプター、リンホトキシン−βレセプター、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＤＲ３／ＷＳＬ−１、ＴＲ２）または第（１）項記載のタンパク質に対するレセプターである第（１９）項記載のスクリーニング用キット、
（７９）第（１５）項記載の抗体と、被検液および標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
（８０）被検液と担体上に不溶化した第（１５）項記載の抗体および標識化された別の第（１４）項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の第（１）項記載のタンパク質、第（５）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の定量法、
（８１）第（１５）項記載の抗体（好ましくは、第（１）項記載のタンパク質活性を中和する活性を有する第（１５）項記載の抗体）を含有してなる医薬、
（８２）エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎または潰瘍性大腸炎の治療・予防剤である第（８１）項記載の医薬、
（８３）第（６）項または第（７２）項記載のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ、
（８４）第（６）項または第（７２）項記載のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約４０％以上（好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有する塩基配列である第（８３）項記載のアンチセンスＤＮＡ、
（８５）第（８３）項記載のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬、および
（８６）エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎または潰瘍性大腸炎の治療・予防剤である第（８５）項記載の医薬を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質は、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【００２１】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のうち第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のうち第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列のうち第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する場合が好ましい。
また、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３と実質的に同一のアミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列なども好ましい。これらのアミノ酸配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列である。
また、配列番号：１または配列番号：２と実質的に同一のアミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列なども好ましい。これらのアミノ酸配列は、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９番目のアミノ酸配列に対応し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質としては、上記のとおり配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的（例、生理化学的または薬理学的）に同質であることを示す。したがって、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性が同等（例、約０．０１〜２０倍、好ましくは約０．２〜５倍、より好ましくは約０.５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、後述するスクリーニング方法で記載されている方法などを用いて測定することができる。
また、本発明のタンパク質には、▲１▼配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
【００２３】
上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されている場合、その欠失または置換の位置としては、特に限定されないが、例えば、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目（または第５４〜５９番目）、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目または第２２８〜２３９番目（または第２２８〜２４０番目）のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目または第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列以外の位置、▲２▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第６〜１９番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３９番目のアミノ酸配列以外の位置、▲３▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第６〜１９番目、５３〜５７番目（または第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３９番目のアミノ酸配列以外の位置などが挙げられる。
【００２４】
さらには、具体的には、一般式、
Figure 0004090092
Figure 0004090092
〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示す〕で表わされるアミノ酸配列〔配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列〕を有するタンパク質なども好ましく用いられる。
また、上記の一般式（Ｉ）において、１個または２個以上（例えば１〜５６、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜９個、最も好ましくは数個）の位置でＸａａが欠失していてもよい。
【００２５】
Ｘａａで示されるアミノ酸としては、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸のいずれでもよく、また、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸のいずれでもよい。具体的には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどが用いられる。
一般式（Ｉ）中、第３番目のＸａａとしては、Ｇｌｕが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。
第２２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＡｒｇが好適である。
第２５番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＧｌｕが好適である。
第２６番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。
第２７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。
第３１番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。
第３２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｒｇが好適である。
第３４番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＧｌｙが好適である。
第３５番目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適である。
第３６番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｌａまたはＶａｌが好適である。
【００２６】
第３７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。
第３９番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＳｅｒが好適である。
第４１番目のＸａａとしては、例えば、ＧｌｙまたはＡｌａが好適である。
第４３番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＶａｌが好適である。
第４７番目のＸａａとしては、Ｍｅｔが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第５３番目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適である。
第６０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。
第６３番目のＸａａとしては、例えば、ＴｒｐまたはＧｌｎが好適である。
第６７番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適である。
第６８番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＭｅｔまたはＩｌｅが好適である。
第７０番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＡｌａが好適である。
第７１番目のＸａａとしては、例えば、塩基性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＨｉｓが好適である。
第７６番目のＸａａとしては、例えば、ＰｒｏまたはＧｌｙが好適である。
第７７番目のＸａａとしては、例えば、ＡｌａまたはＬｙｓが好適である。
第８２番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＬｙｓが好適である。
第８６番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適である。
第８７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。
【００２７】
第９１番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＧｌｎが好適である。
第９２番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＶａｌまたはＡｌａが好適である。
第１０３番目のＸａａとしては、例えば、ＳｅｒまたはＡｌａが好適である。
第１０６番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＩｌｅが好適である。
第１０８番目のＸａａとしては、例えば、ＳｅｒまたはＩｌｅが好適である。
第１１７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。
第１２７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＴｈｒが好適である。
第１３５番目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適である。
第１３６番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＭｅｔが好適である。
第１３７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適である。
第１３８番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｌａまたはＰｒｏが好適である。
第１４３番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＩｌｅまたはＶａｌが好適である。
第１５０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＳｅｒが好適である。
第１５６番目のＸａａとしては、例えば、ＬｅｕまたはＧｌｎが好適である。
第１６０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。
【００２８】
第１６１番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＧｌｙが好適である。
第１６２番目のＸａａとしては、Ｌｅｕが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第１６３番目のＸａａとしては、Ｐｒｏが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第１７３番目のＸａａとしては、例えば、ＰｒｏまたはＳｅｒが好適である。
第１７８番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＬｙｓが好適である。
第１８５番目および１８６番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。
第１９３番目のＸａａとしては、Ｔｈｒが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第１９４番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。
第２１６番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適である。
第２２２番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。
第２２３番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｓｐまたはＧｌｙが好適である。
第２２４番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｎが好適である。
第２２９番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。
【００２９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステル基のＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
より具体的には、本発明のタンパク質としては、例えば、配列番号：１〔図１または図２〕で表わされるアミノ酸配列を有するヒト肝臓由来のタンパク質、配列番号：２〔図３または図４〕で表わされるアミノ酸配列を有するマウス胚由来のタンパク質、配列番号：３〔図６〕で表わされるアミノ酸配列を有するラット肝臓由来のタンパク質などが好適である。
【００３０】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質と同質の活性、例えば、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性を有するペプチドであれば何れのものであってもよい。例えば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約７０個以上、さらに好ましくは約１００個以上、最も好ましくは約２００個以上のアミノ酸残基を有するペプチドなどが好ましく用いられる。
例えば、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５３〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド）、（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド）などが用いられる。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドなどが好ましく用いられる。
【００３１】
さらに、本発明の部分ペプチドとしては、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、▲２▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、▲３▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
【００３２】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられる。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用いられる。
「実質的に同質の活性」とは、前記と同意義を示す。
アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、後述するスクリーニング方法で記載されている方法などを用いて測定することができる。
【００３３】
また、本発明の部分ペプチドには、▲１▼配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチド、▲２▼配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチド、▲３▼配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチドなども含まれる。
上記のように欠失または置換されている場合、具体的には、一般式（Ｉ）で表わされるアミノ酸配列から第１〜８２番目のアミノ酸を取り除いたアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましく用いられる。
【００３４】
また、本発明の部分ペプチドのＣ末端は通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、上記した部分ペプチドにおいて、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミル化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜第２４０番目のアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好適である。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後述するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００３６】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、DMF、ジメチルスルホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることがしられている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ターシャリーアミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどに導くことによって保護することができる。
【００３７】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００３８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００３９】
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精製単離することができる。上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００４０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性（例、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４１】
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００４２】
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。また、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５〔図１〕または配列番号：６〔図２〕で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。また、本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８〔図３〕または配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ〔図４〕などが用いられる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４３】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目（または第５４〜５９番目）、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目（または第２２８〜２４０番目）のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２２〜６３番目、第１６３〜１７７番目（または第１６０〜１７７番目）、第２７７〜３０６番目、第３２５〜３４８番目、第３５２〜３７８番目、第３８２〜４０２番目、第４３０〜４４７番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番目、第５５０〜５６７番目、第５７７〜６３９番目、第６４３〜６５７番目および第６８２〜７１７番目（または第６８２〜７２０番目）の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第１５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、第２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４６〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４４１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（または第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第１５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、第２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４６〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４４１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（または第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４４】
また、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：４で表わされる塩基配列の第２４７番目〜第７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：４で表わされる塩基配列の第２４７番目〜第７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用いられる。
配列番号：４で表わされる塩基配列の第２４７番目〜第７２０番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２４７番目〜第７２０番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用いられる。
配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、▲１▼配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡ、▲２▼配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの活性）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用いられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は、前記と同様である。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８３番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２４７番目〜第７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８１番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４１番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４６】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付加・置換）は、公知のキット、例えば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００４７】
ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＡＯＸ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００４８】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が用いられる。ｄｈｆｒ遺伝子はメソトレキセート（ＭＴＸ）耐性を、ＮｅｏはＧ４１８耐性を付与する。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても目的とする遺伝子を選択することができる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入することによって形質転換体を製造することができる。
【００４９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
【００５０】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞、２９３細胞などが好ましい。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞や昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
【００５１】
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等が用いられる。
このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択することができる。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を製造することができる。
【００５２】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００５３】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
【００５４】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００５５】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する）を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する）は、本発明のタンパク質等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００５６】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質等は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施することができる。
【００５７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質等抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００５８】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５９】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質等抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリクローナル抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００６０】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質等のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００６１】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、例えば、アポトーシス誘導活性、ウイルス感染細胞等に対する細胞傷害活性などの作用を有している。したがって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩はさまざまな用途に用いることができる。
以下に、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質等と略記する場合がある）、本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質等に対する抗体（本発明の抗体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００６２】
（１）各種疾病の治療・予防剤などの医薬
例えば、生体内においてＦａｓリガンドが減少あるいは欠損しているために、細胞における、Ｆａｓリガンドの機能が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質等を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質等を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、（ハ）本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質等の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
したがって、本発明のタンパク質等および本発明のＤＮＡは、例えば、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌（結腸／直腸癌）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染、水痘-帯状疱疹ウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染など）、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染肝炎（例、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、腎炎、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、骨疾患（例、リウマチ関節炎（例、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖）など）、動脈硬化症、痛みなどの疾病、好ましくは、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染など）、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）などの疾病の治療・予防剤などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００６３】
本発明のタンパク質等を上記の医薬として使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等あるいはＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００６４】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６５】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができる。したがって、本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質等が関与する各種疾病の遺伝子診断剤として有用である。
例えば、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするｍＲＮＡが増加し、あるいはタンパク質の発現が増加していることが検出された場合は、例えば、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中など）、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎（例、劇症肝炎）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、心筋症（例、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患である、または罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡが損傷し、欠損し、あるいはタンパク質の発現が減少していることが検出された場合は、例えば、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患などの疾病であると診断することができる。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、癌、ウイルス感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００６６】
（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００６７】
また、本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００６８】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量等を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００６９】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００７０】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量することができる。
【００７１】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質が関与する各種疾病の診断を行なうことができる。
例えば、本発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合は、例えば、癌、ウイルス感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、本発明のタンパク質等の濃度の増加が検出された場合は、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾病などの疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
このように、本発明の抗体は上記疾患の診断剤として有用である。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。さらに、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質等の検出、被検細胞における本件タンパク質の挙動の検出などのために使用することができる。
【００７２】
（４）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体のうち、本発明のタンパク質等の活性を中和することができる抗体は、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾病などの疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人のエイズの治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００７３】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００７４】
（５）医薬候補化合物のスクリーニング
（Ａ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明のタンパク質等は、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプター（以下、レセプターと略記する）に特異的に結合することができるので、本発明のタンパク質等と該レセプターを用いたリガンド・レセプター結合アッセイ系を構築することによって、ＴＮＦリガンドファミリー（例えば、ＴＮＦ、リンホトキシン−α、リンホトキシン−β、Ｆａｓリガンド、神経成長因子など）と同様の作用を有する医薬候補化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質等の作用を阻害する医薬候補化合物のスクリーニングを行なうことができる。すなわち、本発明は、本発明のタンパク質等を用いる、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
このような本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物には、（イ）該レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導作用、細胞傷害活性などの活性を有する化合物（いわゆるアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性、アポトーシス誘導作用、細胞傷害活性などの活性を有しない化合物（いわゆるアンタゴニスト）、（ハ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物は、前記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい）。
【００７５】
すなわち、本発明は、
（１）（ｉ）レセプターまたはその部分ペプチドに、本発明のタンパク質等を接触させた場合と（ii）レセプターまたはその部分ペプチドに、本発明のタンパク質等および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）（ｉ）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパク質等を接触させた場合と（ii）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパク質等および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（３）（ｉ）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分を接触させた場合と（ii）レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００７６】
具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、レセプターまたはレセプターを含有する細胞等に対する本発明のタンパク質等の結合量、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定して、比較することを特徴とするものである。
より具体的には、本発明は、
（１ａ）（ｉ）標識した本発明のぺプチド等を、レセプターまたはその部分ペプチドに接触させた場合と、（ii）標識した本発明のタンパク質等および試験化合物を、レセプターまたはその部分ペプチドに接触させた場合における、標識した本発明のタンパク質等の該レセプターまたはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２ａ）（ｉ）標識した本発明のタンパク質等を、レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）標識した本発明のタンパク質等および試験化合物を、レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のタンパク質等の該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｂ）（ｉ）本発明のタンパク質等を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質および試験化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００７７】
（３ａ）（ｉ）本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分および試験化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、レセプターに結合して、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合を阻害する化合物が、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる化合物として選択できる。
上記（２ｂ）または（３ａ）のスクリーニング方法において、レセプターに結合し、該レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を有する化合物をレセプターアゴニストとして選択することができ、一方、レセプターと結合するが、該細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性などの活性を有しない化合物をレセプターアンタゴニストとして選択することができる。
また、上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる活性が認められた試験化合物の中で、該アポトーシス誘導活性等を有する化合物をレセプターアゴニストとして選択することができ、該アポトーシス誘導活性等を有しない化合物をレセプターアンタゴニストとして選択することができる。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプターとしては、本発明のタンパク質等が結合し得るレセプターであればいずれのものでもよく、例えば、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターや本発明のタンパク質等に対するレセプターが用いられる。ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターとしては、例えば、ＴＮＦレセプター（５５ｋＤａ：セル（Cell）61, p351-359, 1990；７５ｋＤａ：サイエンス（Science）248, 1019-1023, 1990）、リンホトキシン−βレセプター、Ｆａｓ（セル（Cell）66, p233-243, 1991）、ＣＤ２７（ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（The Journal of Immunology）147, p3165-3169, 1991）、ＣＤ３０（セル（Cell）68, p421-427, 1992）、ＣＤ４０（ザ・エンボ・ジャーナル（The EMBO Journal）8, p1403-1410, 1989）、ＯＸ４０（ヨーロッピアン・ジャーナル・イムノロジー（European Journal Immunology）24/3, p677-683, 1994）、ＤＲ４（サイエンス（Science）276, 111-113, 1997）、ＤＲ３／ＷＳＬ−１（ネイチャー（NATURE）384, 372-375, 1996；サイエンス（Science）274, 990-992, 1996）、ＴＲ２（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）272, p14272-14276, 1997）などが用いられる。
これらのレセプターおよび本発明のタンパク質等に対するレセプターは、自体公知のタンパク質の精製方法に従って入手することができ、また、自体公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコードするＤＮＡをクローニングした後、前記した本発明のタンパク質等の発現方法に従って目的とするレセプターを入手することもできる。
該レセプターの部分ペプチドとしては、全長レセプターを適当に切断して得られる部分ペプチドを用いることができる。
標識した本発明のタンパク質等としては、例えば、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識した本発明のタンパク質等などを用いることができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプターを含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。
レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。また、上記レセプターを含有する細胞として、Jurkat細胞株、Ｕ９３７細胞株（以上、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY）271, 12691-12694, 1996））、ＨｅｐＧ２細胞株、ＴＨＰ−１細胞株などの株化細胞を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる本発明のタンパク質等を含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、レセプターを含有する細胞または本発明のタンパク質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができる。固定化方法は、それ自体公知の方法に従って行なうことができる。また、本発明のタンパク質等を含有する組織として、各種動物の肝臓、脾臓等またはそれらの膜画分を用いることができる。
【００８０】
上記レセプターを含有する細胞または本発明のタンパク質等を含有する細胞の細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプターまたは本発明のタンパク質等と、細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプターを含有する細胞やその細胞膜画分中のレセプターの量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００８１】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質等とレセプターとの反応は、通常約３７℃で数時間（例えば、２０分〜２４時間、好ましくは３０分〜３時間）行なうことができる。
具体的には、上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分、あるいはレセプターまたはその部分ペプチドを、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（タンパク質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。一方、細胞が固定化細胞の場合、培養器に固定化させたまま、つまり細胞を生育させた状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドで固定した細胞を用いて、本発明のタンパク質等とレセプターを結合させることができる。
【００８２】
この場合、該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられる。そして、０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（例えば、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００００００ｃｐｍ）の標識した本発明のタンパク質等（例えば、〔125Ｉ〕で標識した本発明のタンパク質等）を添加し、同時に１０-4Ｍ〜１０-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のタンパク質等を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性（例えば、〔125Ｉ〕の量）を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで測定する。濾過には、マニホールドやセルハーベスターを用いることができるが、セルハーベスターを用いることが効率を上げるために望ましい。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えばカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）の５０％以下になる試験化合物をアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
【００８３】
また、上記（２ｂ）または（３ａ）のスクリーニング方法を実施するためには、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
具体的には、まず、レセプターを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれ自体公知の方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００８４】
アポトーシスとは、例えば、細胞縮小、クロマチン凝縮、核濃縮、細胞表面微絨毛消失、大小突起の出現（blebbing）、アポトーシス小体形成、細胞縮小に伴う周辺細胞との間隙、隣接細胞による貧食除去などをいう（日本臨床，第５４巻，第７号（1996））。
アポトーシス誘導活性は、例えば、細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ，アポトーシス実験プロトコール（1994年12月20日発行、秀潤社）などに従って、アポトーシスの形態学的解析または生化学的解析を行なうことによって測定することができる。アポトーシスの形態学的解析法としては、例えば、光学顕微鏡によるアポトーシス観察（例、位相差顕微鏡による観察，色素染色による浮遊または接着細胞の観察，蛍光染色による観察などの細胞形態の観察、パラフィン切片の作製，ヘマトキシリン・エオジン染色標本の作製などの組織形態の観察など）、電子顕微鏡によるアポトーシスの観察（例、薄片作製および電子染色法など）などが用いられる。アポトーシスの生化学的解析法としては、例えば、ＤＮＡ断片化の解析（例、アガロースゲル電気泳動法など）、細胞死の判定法（例、クリスタルバイオレット法、ＭＴＴ法、ＬＤＨ法など）などが用いられる。
細胞障害活性の測定は、ルービエ E.(Rouvier E.）等の方法に準じて行なうことができる（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）177巻、195-200頁、1993年）。
上記（２ｂ）または（３ａ）のスクリーニング方法において、試験化合物を添加した際にレセプターを含有する細胞がアポトーシス、細胞傷害などを起こした場合、該試験化合物をレセプターアゴニスト候補化合物として選択することができる。一方、試験化合物を添加した際にレセプターを含有する細胞のアポトーシス、細胞傷害などが抑制された場合、該試験化合物をレセプターアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
【００８５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質等、好ましくはさらに、レセプターを含有する細胞もしくはその細胞膜画分等を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプターまたはＴＮＦレセプターなどを含有するＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識した本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したもの。
▲４▼本発明のタンパク質等標準液
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００８６】
〔測定法〕
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養した組換え型レセプターを含有するＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、５ｎＭの標識した本発明のタンパク質等を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０-4Ｍの本発明のタンパク質等を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識した本発明のタンパク質等を０．５ｍｌの０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。なお、〔125Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレーターと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定できる。
【００８７】
【数１】
Figure 0004090092
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0 ：最大結合量
【００８８】
以上のとおり、本発明のタンパク質等は、本件タンパク質とレセプターとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明おタンパク質等とレセプターとの結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの作用を有する化合物（いわゆる、アゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの作用を有しない化合物（いわゆる、アンタゴニスト）、（ハ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を減少させる化合物である。
該化合物は、前述した試験化合物（例、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）から得られるものであり、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００８９】
レセプターアゴニストは、本発明のタンパク質等が有する生理活性の全部または一部を有しているので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。例えば、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌（結腸／直腸癌）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染、水痘-帯状疱疹ウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染など）、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎（例、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、腎炎、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、骨疾患（例、リウマチ関節炎（例、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖）など）、動脈硬化症、痛みなどの疾病、好ましくは、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染など）、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）などの疾病の予防・治療剤などの医薬として有用である。
レセプターアンタゴニストは、本発明のタンパク質等が有する生理活性の全部または一部を抑制することができるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。例えば、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中など）、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎（例、劇症肝炎）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、心筋症（例、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、好ましくは、例えば、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患の予防・治療剤などの医薬として有用である。
【００９０】
本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を増強する化合物は、本発明のタンパク質等の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。該化合物は、上記アゴニストと同様に、例えば、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症、痛みなどの疾病などの治療・予防剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質等とレセプターとの結合力を減少させる化合物は、本発明のタンパク質等の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。該化合物は、上記アンタゴニストと同様に、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患などの治療・予防剤などの医薬として有用である。
上記スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金属）との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００９１】
該化合物を上記の疾患の治療・予防剤として用いる場合、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして製剤化し、使用することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
上記スクリーニングで得られた化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で該レセプターアゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該アゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該アゴニストの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で該アゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該アゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、エイズ治療の目的で該レセプターアンタゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該アンタゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該アンタゴニストの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、エイズ治療の目的で該アンタゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該アンタゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９２】
また、癌治療の目的で本発明のタンパク質等の生理活性を増強する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、エイズ治療の目的で本発明のタンパク質等の生理活性を減少する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、エイズ治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９３】
（Ｂ）本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法およびスクリーニング用キット
本発明のタンパク質またはその塩は膜結合型タンパク質であり、（ｉ）膜に結合したまま、あるいは（ii）生体内に存在するプロテイナーゼによって膜結合部位が切断され、細胞外部分が放出され、レセプターと結合することによって、その機能を発揮すると考えられる。したがって、本発明のタンパク質等および本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼを用いることによって、本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物を選択することができる。
該プロテイナーゼの活性を促進する活性を有する化合物は、生体内における本発明のタンパク質等の細胞外部分の放出を促進することにより、細胞間接触に依存しない発明のタンパク質等の活性を促進することができるので、例えば、癌、ウイルス感染症、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症、痛みなどの疾患の予防・治療剤などの医薬として期待できる。
一方、該プロテイナーゼの活性を阻害する活性を有する化合物は、生体内における本発明のタンパク質等の細胞外部分の放出を阻害することにより、細胞間接触に依存しない発明のタンパク質等の活性を阻害することができるので、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患の予防・治療剤などの医薬として期待できる。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質等を用いることを特徴とする本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００９４】
より具体的には、本発明は、
（１）（ｉ）本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ（ただし、本発明のタンパク質を含有する細胞が、本発明のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合と、（ii）該プロテイナーゼおよび試験化合物の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、レセプターを介する細胞刺激活性、レセプターを含有する細胞のアポトーシスや細胞傷害などを測定（観察）して、比較することを特徴とするものである。
より具体的には、本発明は、
（１ａ）（ｉ）本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ（ただし、本発明のタンパク質を含有する細胞が、本発明のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ（ただし、本発明のタンパク質を含有する細胞が、本発明のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）および試験化合物の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を培養して得られる培養上清と、レセプターを含有する細胞とを接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００９５】
上記のスクリーニング方法において、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を抑制する試験化合物を本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプターとしては、本発明のタンパク質等が結合し得るレセプターであればいかなるものであってもよいが、例えば、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターや本発明のタンパク質等に対するレセプターが用いられる。ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターとしては、例えば、前記したＴＮＦレセプター（５５ｋＤａまたは７５ｋＤａ）、リンホトキシン−βレセプター、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＤＲ３／ＷＳＬ−１、ＴＲ２などが用いられる。
これらのレセプターおよび本発明のタンパク質等に対するレセプターは、自体公知のタンパク質の精製方法に従って入手することができ、また、自体公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコードするＤＮＡをクローニングした後、前記した本発明のタンパク質等の発現方法に従って目的とするレセプターを入手することもできる。
本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼとしては、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３など）、アダマリシン類（adamalysinsまたはＡＤＡＭＳ）（例、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）など）などが用いられる。
【００９６】
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプターを含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。また、上記レセプターを含有する細胞として、Jurkat細胞株、Ｕ９３７細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、ＴＨＰ−１細胞株などの株化細胞を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる本発明のタンパク質を含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができる。固定化方法は、それ自体公知の方法に従って行うことができる。また、本発明のタンパク質を含有する組織として、各種動物の肝臓、脾臓等またはそれらの膜画分を用いることができる。
本発明のタンパク質等を含有する細胞の細胞膜画分としては、前記したものと同様のものを用いることができる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、プロテイナーゼ存在下における本発明のタンパク質を含有する細胞の培養は、通常数時間（例、約０．５〜２４時間、好ましくは約１〜６時間）、約３７℃で行なうことができる。また、この培養で得られる培養上清とレセプターを含有する細胞との反応は、通常数時間（例、約０．５〜２４時間、好ましくは約１〜６時間）、約３７℃で行なうことができる。
レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの測定は前記と同様にして行なうことができる。
【００９８】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質等および本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼを、好ましくはさらに、レセプターを含有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプターまたはＴＮＦレセプターなどを含有するＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質を含有する細胞
▲４▼本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ標品
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ただし、本発明のタンパク質を含有する細胞が、本発明のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は不要である。）
【００９９】
〔測定法〕
▲１▼本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼ（ただし、本発明のタンパク質を含有する細胞が、本発明のタンパク質を分解する活性を有する細胞外プロテイナーゼを産生・分泌する場合は、該細胞が産生・分泌する該細胞外プロテイナーゼでもよい）の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を約３７℃で数時間培養して培養上清を得る。
▲２▼該プロテイナーゼおよび試験化合物の存在下で本発明のタンパク質を含有する細胞を約３７℃で数時間培養して培養上清を得る。
▲３▼上記▲１▼および▲２▼で得られる培養上清を、それぞれ本発明のタンパク質に対するレセプターを含有する細胞と約３７℃で数時間培養する。
▲４▼次いで、アポトーシス誘導活性を細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ、アポトーシス実験プロトコール（1994年12月20日発行、秀潤社）に記載の方法に従って測定する。
【０１００】
以上のとおり、本発明のタンパク質等は本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬として有用である。
上記スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進する化合物は、該プロテイナーゼによる本発明のタンパク質の細胞外部分の放出・遊離を促進するので、細胞間接触に依存しない本発明のタンパク質に対するレセプターを介する細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を促進することができ、例えば、癌、ウイルス感染症、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症、痛みなどの疾患の予防・治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
一方、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を阻害する化合物は、該プロテイナーゼによる本発明のタンパク質の細胞外部分の放出・遊離を阻害するので、細胞間接触に依存しない本発明のタンパク質に対するレセプターを介する細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を抑制することができ、例えば、エイズ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患、心筋症、糖尿病、糖尿病性合併症、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、特に、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患の予防・治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などに製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０１０１】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、自己免疫性疾患治療の目的で本発明のタンパク質を分解するプロテイナーゼの活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、自己免疫性疾患治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０２】
（Ｃ）本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のタンパク質等は、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプター（以下、レセプターと略記する）または本発明のタンパク質等に対するレセプターに特異的に結合することができるので、本発明のタンパク質等と該レセプターを用いたリガンド・レセプター結合アッセイ系を構築することによって、本発明のタンパク質等が該レセプターに結合した後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングを行なうことができる。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質等を用いることを特徴とする本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（１）（ｉ）レセプターを含有する細胞に、本発明のタンパク質等を接触させた場合と（ii）レセプターを含有する細胞に、本発明のタンパク質等および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のクリーニング方法、および
（２）（ｉ）レセプターを含有する細胞に、本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分を接触させた場合と（ii）レセプターを含有する細胞に、本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１０３】
具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達などを測定して、比較することを特徴とするものである。
より具体的には、本発明は、
（１ａ）（ｉ）本発明のタンパク質等を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質および試験化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（２ａ）（ｉ）本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合と、（ii）本発明のタンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画分および試験化合物を、レセプターを含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ＤＮＡ合成促進、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など）、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を測定し、比較することを特徴とする本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１０４】
上記（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合を阻害せず、該レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を促進する化合物を、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩として選択することができる。一方、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合を阻害せず、該細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性などの活性を阻害する作用を有する化合物を、本発明のタンパク質等とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
すなわち、本スクリーニング方法は、本発明のタンパク質とレセプターとの結合に影響を与えず、レセプター結合後の細胞内シグナル伝達を調節（促進または抑制）する化合物を選択する方法であるので、本スクリーニング方法に用いる試験化合物としては、前記したレセプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法において、レセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして選択されなかった化合物を用いるのが望ましい。
【０１０５】
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプターとしては、本発明のタンパク質等が結合し得るレセプターであればいかなるものでもよく、例えば、ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターや本発明のタンパク質等に対するレセプターが用いられる。ＴＮＦレセプターファミリーに属するレセプターとしては、例えば、前記したＴＮＦレセプター（５５ｋＤａまたは７５ｋＤａ）、リンホトキシン−βレセプター、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＤＲ４、ＤＲ３／ＷＳＬ−１、ＴＲ２などが用いられる。
これらのレセプターおよび本発明のタンパク質等に対するレセプターは、自体公知のタンパク質の精製方法に従って入手することができ、また、自体公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコードするＤＮＡをクローニングした後、前記した本発明のタンパク質等の発現方法に従って目的とするレセプターを入手することもできる。
該レセプターの部分ペプチドとしては、全長レセプターを適当に切断して得られる部分ペプチドを用いることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプターを含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。また、上記レセプターを含有する細胞として、例えば、Jurkat細胞株、Ｕ９３７細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、ＴＨＰ−１細胞株などの株化細胞を用いることもできる。
【０１０６】
本発明のスクリーニング方法に用いられる本発明のタンパク質を含有する細胞としては、前記した本発明のタンパク質等を発現させるために用いる宿主細胞として列記したものと同様のものを用いることができるが、なかでも、ＣＨＯ細胞などが好ましい。レセプターを含有する細胞は、レセプターをコードするＤＮＡを用いて、自体公知の方法、例えば、前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、レセプターを含有する細胞または本発明のタンパク質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができる。固定化方法は、それ自体公知の方法に従って行うことができる。また、本発明のタンパク質を含有する組織として、各種動物の肝臓、脾臓等またはそれらの膜画分を用いることができる。
上記レセプターを含有する細胞または本発明のタンパク質を含有する細胞の細胞膜画分としては、前記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えば、タンパク質、タンパク、非タンパク質性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質等とレセプターを含有する細胞との反応は、通常約３７℃で数時間行なうことができる。
上記（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、レセプターを介する細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの測定は前記と同様にして行なうことができる。
上記（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、試験化合物を添加した際に、レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などが促進された場合、該試験化合物をレセプター結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩として選択することができる。一方、試験化合物を添加した際に、レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などが阻害された場合、該試験化合物をレセプター結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物またはその塩化合物として選択することができる。
【０１０７】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質等を、好ましくはさらに、レセプターを含有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプターまたはＴＮＦレセプターなどを含有するＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
〔測定法〕
アポトーシス誘導活性を細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ、アポトーシス実験プロトコール（1994年12月20日発行、秀潤社）に記載の方法に従って測定する。
【０１０８】
以上のとおり、本発明のタンパク質等はレセプター結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬として有用である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達、具体的には、レセプターを介した細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を促進する化合物またはその塩、あるいは該細胞刺激活性、アポトーシス誘導活性、細胞傷害活性などの活性を阻害する化合物またはその塩である。
本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩は、例えば、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌（結腸／直腸癌）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染、水痘-帯状疱疹ウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染など）、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎（例、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、腎炎、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、骨疾患（例、リウマチ関節炎（例、リウマチにおける関節組織の破壊）など）、動脈硬化症、痛みなどの疾病、好ましくは、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎、動脈硬化症、自己免疫性疾患などの疾病の予防・治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１０９】
本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物またはその塩は、例えば、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中など）、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎（例、劇症肝炎）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、心筋症（例、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、好ましくは、例えば、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患の予防・治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などに製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、エイズ治療の目的で本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、エイズ治療の目的で本発明のタンパク質等とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１１０】
（６）アンチセンスＤＮＡを含有するＤＮＡ
本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡもしくはｍＲＮＡや本発明のタンパク質等の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内において上記の作用を発揮する本発明のタンパク質等またはそれらをコードするＤＮＡの機能を抑制することができる。したがって、該アンチセンスＤＮＡは、例えば、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中など）、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎（例、劇症肝炎など）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、心筋症（例、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、好ましくは、例えば、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾患の予防・治療剤として使用することができる。
該アンチセンスＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様にして製造することができる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１１１】
（７）ＤＮＡ転移動物の作製
さらに、本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の非ヒト哺乳動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスである第（２）記載の非ヒト哺乳動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
【０１１２】
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
【０１１３】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。特に、配列番号：９で表わされる塩基配列を有するマウス由来ゲノムＤＮＡなどが好適である。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【０１１４】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のものとしては、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどを用いることができる。
【０１１５】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明のＤＮＡを有する。
【０１１６】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【０１１７】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来性ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【０１１８】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移哺乳動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患の遺伝子治療法を検討、開発することが可能である。
【０１１９】
（８）ノックアウト動物の作製
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載のヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載のヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載のヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のノックアウト動物の作製には、配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するマウス由来のゲノムＤＮＡを含有するＤＮＡ〔図４〕が好適である。
【０１２０】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【０１２１】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させるために用いられる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【０１２２】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０１２３】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【０１２４】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のタンパク質発現不全マウスは、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１２５】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、前記した本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、癌など）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該非ヒト哺動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、癌に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の体重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の体重が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を癌に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０１２６】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患、例えば、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症、痛みなどの疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩（例、アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する治療・予防剤は、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして製造することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１２７】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【０１２８】
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部が大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で不活性化されている場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【０１２９】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）または塩（例、アルカリ金属）などとの塩が好ましくは、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、エイズ、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、脳卒中など）、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎（例、劇症肝炎）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎など）、心筋症（例、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ感染、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎などの疾患、好ましくは、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫性疾患などの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、癌、ウイルス感染、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎、腎炎、自己免疫性疾患、骨疾患、動脈硬化症、痛みのなどの疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１３０】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にして製造し、ヒトまたは哺乳動物に投与することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、癌治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、エイズ治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、エイズ治療の目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１３１】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【０１３２】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【０１３３】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Figure 0004090092
【０１３４】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
本発明のヒト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
本発明のラット由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
プラスミドｐＴＢ１９３９に挿入されている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
プラスミドｐＴＢ１９４０に挿入されている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
プラスミドｐＴＢ１９５８に挿入されている、本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードするゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するラット由来タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【０１３５】
〔配列番号：１１〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０１３６】
〔配列番号：１６〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使用したマウス染色体ＤＮＡ断片の両末端結合しているアダプターの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
本発明のヒト由来タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
本発明のヒト由来タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
本発明のラット由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
本発明のラット由来タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするために使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
本発明のタンパク質のアミノ酸配列の一般式を示す。
【０１３７】
後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９３９およびエシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０は、それぞれ平成８年７月１７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９５およびＦＥＲＭ ＢＰ−５５９６として、また平成８年７月１１日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １５９９７およびＩＦＯ １５９９８として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐＴＢ１９５８は、平成９年１月３０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０５として、また平成９年１月３１日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６０５４として寄託されている。
後述の実施例３で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１１は、平成９年７月８日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０１２として、また平成９年７月７日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ１６１０９として寄託されている。
後述の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１２は、平成９年７月８日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０１３として、また平成９年７月７日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ１６１１０として寄託されている。
【０１３８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【０１３９】
【実施例１】
ヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパー（GENETRAPPERTM）ｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコビーアールエル社）を用いて行なった。
スーパースクリプトTMヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/ml アンピシリン含有Terrific Broth（１２g/l Bacto-tryptone（ディフコ社）、２４g/l Bacto-yeast extract（ディフコ社）、２.３g/l リン酸一カリウム、１２.５g/l リン酸二カリウム、０．４％ グリセロール）で３０℃で１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミドキット（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを調製した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコビーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビーアールエル社）を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３７℃で１時間、室温でハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・ストレプトアビジンビーズ（ギブコビーアールエル社）を加えて、室温で２分ごとに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・マグネットラック（ギブコビーアールエル社）中に入れ、２分間放置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・ウオッシュバッファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて放置し、上清を捨て、ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。
【０１４０】
取得したＤＮＡ溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）を入れ、９５℃で１分間処理した。ジーントラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・修復酵素を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。
得られた形質転換株を用いて２種のオリゴヌクレオチド（配列番号：１２、配列番号：１３）をプライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを行なった。ＰＣＲにより４３４ｂｐの増幅断片が形成されたコロニーを陽性クローンとして３株（＃９、＃３３、＃８１）選択した。
選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイクルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、ABI PRISMTM ３７７ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。取得した３クローンのうち、クローン＃９とクローン＃３３は同一のＤＮＡ断片を含んでおり、poly(Ａ)+鎖を含む配列番号：５で表される１４９１個の塩基配列を有していた〔図１〕。また、クローン＃８１は poly(Ａ)+鎖、並びに poly(Ａ)+付加シグナル（ＡＡＴＡＡ）を含む配列番号：６で表される１３５３個の塩基配列を有していた〔図２〕。これら３クローンのｃＤＮＡ断片には同一遺伝子が含まれており、配列番号：１で表される２４０個のアミノ酸からなる新規Ｆａｓリガンド様蛋白質がコードされていた。また Kyte−Doolittle解析から、３５番バリン（Ｖａｌ）から６３番トリプトファン（Ｔｒｐ）にかけての疎水性領域が本タンパク質の膜貫通領域と予想された。本タンパク質はヒトリンホトキシンβと最も相同性が高かったが、アミノ酸レベルで３３％の相同性が見られた。また、ヒトＦａｓリガンドとはアミノ酸レベルで３１％の相同性が見られたが、J. Hein法（PAM250 residue weight table に基づく）による系統樹解析では、ヒトリンホトキシンβよりもヒトＦａｓリガンドとのより高い相同性が見られた。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのうちクローン＃９を保持するプラスミドｐＴＢ１９３９並びにクローン＃８１を含むプラスミドｐＴＢ１９４０を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９３９並びに大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０を得た。
【０１４１】
【実施例２】
マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡのクローニングは、ＰＣＲ法によって行なった。スーパースクリプトTMマウス８.５日胚由来ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/ml アンピシリン含有Super Broth（３２g/l Bacto-tryptone（ディフコ社）、２０g/l Bacto-yeast extract（ディフコ社）、０.２g/l NaCl）で３０℃、１６時間培養した後、キアジェンプラスミドキット（キアジェン社）を用いてプラスミドｃＤＮＡライブラリーを調製し、鋳型として用いた。
プライマーとして、次の２つの合成オリゴヌクレオチドを用いた。
Figure 0004090092
ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造（株））を含む系で、サーマルサークラー（GeneAmpR PCR System 2400，パーキンエルマー社）を用いて９４℃，１分を１サイクル、９４℃，２０秒→５５℃，３０秒→７２℃，２分を３０サイクル、４℃放置の条件で行なった。
得られた増幅断片をpT7Blue T-vector（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。
得られた形質転換菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、ダイターミネーターサイクルシークエンスＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社）によりｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
取得したクローンは、配列番号：７で表わされる７１７個の塩基配列を含む配列番号：８で表される７９５個の塩基配列を有しており、配列番号：２で表わされる２３９個のアミノ酸からなるマウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードしていた〔図３〕。このマウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質と実施例１で得られた配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質とは、アミノ酸レベルで７８％の相同性を有しており、また、それをコードするＤＮＡは、塩基レベルで７７％の相同性を有していた。
得られたマウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９５８を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ１９５８を得た。
【０１４２】
次に、プロモーターファインダーＤＮＡウォーキングキット（クローンテック社）を用いて、本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドン付近の配列の解析を行なった。
使用したマウスゲノムＤＮＡは、予めＳｃａＩの制限酵素で消化され、その５'および３'末端に、プライマーＡＰ１（クローンテック社）やプライマーＡＰ２（クローンテック社）が結合可能なアダプター配列が連結されている。
▲１▼プライマーＡＰ１：（配列番号：１６）
５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３'
▲２▼プライマーＡＰ２：（配列番号：１７）
５'−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３'
▲３▼アダプター配列：（配列番号：１８）
５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴ−３'
第１ＰＣＲ反応は、このマウスゲノムＤＮＡ溶液とＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝酒造（株））、ＡＰ１、合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１を用い、サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 2400，パーキンエルマー社）で、９４℃，２秒、７２℃，３分を７サイクル、９４℃，２秒、６８℃，３分を３７サイクル、６８℃，４分、４℃放置の条件で行なった。
▲４▼合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１：（配列番号：１９）
５'−ＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧ−３'
【０１４３】
次に、この反応液を滅菌水で５０倍希釈し、第２ＰＣＲ反応に用いた。第２ＰＣＲ反応は、この第１ＰＣＲ反応液、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝酒造（株））、前記プライマーＡＰ２、合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ２を用い、サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 2400，パーキンエルマー社）で、９４℃，２秒、７２℃，３分を５サイクル、９４℃，２秒、６８℃，３分を２５サイクル、６８℃，４分、４℃放置の条件で行なった。
▲５▼合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ２：（配列番号：２０）
５'−ＧＣＣＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＴＧＴＣ−３'
ＳｃａＩで消化したゲノムＤＮＡ溶液から得られた約１.１ｋｂｐの増幅断片をｐＴ７ブルーＴ−ベクター（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換株を得た。
得られた形質転換株から、プラスミドＤＮＡを抽出し、ダイターミネーターサイクルシークエンスＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社）により増幅断片の塩基配列の一部を決定した。取得したクローンには、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のマウス由来タンパク質の１番Ｍｅｔ（開始コドン）から１３番Ａｓｐをコードする塩基配列（配列番号：７で表わされる塩基配列の第１〜３９番目の塩基配列）と完全に一致する配列が存在したことから、本発明のマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングに用いた合成オリゴヌクレオチド（配列番号：１４）の配列は、実際の本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの配列の一部であることが確認された。
【０１４４】
【実施例３】
マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質遺伝子のコード領域を含む染色体遺伝子のクローニング
マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質遺伝子のオープンリーディングフレーム部分を含む領域をコードする染色体ＤＮＡ断片の取得は、１２９ＳＶＪマウス染色体ＤＮＡ Ｓａｕ３ＡＩ部分消化断片を組み込んだラムダＦＩＸRIIライブラリー（ストラタジーン社）を用いて、標識したマウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質ｃＤＮＡをプローブとしたプラークハイブリダイゼーション法により単離した。まず、１−１０×１０4pfu（plaque-forming unit）/mlになるように希釈したファージ溶液に、０.２％マルトース，１０mM ＭｇＳＯ4を添加したＬＢ培地で３０℃一晩培養した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡの培養液を同量混ぜ、３７℃、１０分間インキュベートした。該混合液２００μｌに対して、あらかじめ５０℃に温めておいた５mlのトップアガロース（０.７％になるようアガロースを添加したＮＺＹ培地〔５g/l ＮａＣｌ、２g/l ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５g/l yeast extract、１０g/l ＮＺアミン（ｐＨ７.５に調整）〕を加え、ＮＺＹプレート（１.５％ アガロース、９cmディッシュ）に均一になるように重曹した後、９時間、３７℃で静置した。あらかじめプレートの位置がわかるように印をつけたナイロントランスファーメンブレン HybondTM−Ｎ＋（アマシャム社）を該プレート上に１分間密着させることにより、出現したファージ粒子をメンブレン上に移した。該メンブレンを変性溶液（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ ＮａＯＨ）を染み込ませたワットマン３ＭＭペーパー濾紙（ワットマンインターナショナル社）上に、ファージのついた面を上にして７分間置いた後、中和溶液（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７.２）、１mM ＥＤＴＡ）を染み込ませた濾紙上に、ファージのついた面を上にして３分間放置した。再度この中和処理を繰り返した後、２×ＳＳＣ溶液（０.３Ｍ ＮａＣｌ、０.０３Ｍ クエン酸ナトリウム）で洗浄した。該メンブレンを自然乾燥させた後、０.４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませた濾紙上に、ファージのついた面を上にして２０分間置き、５×ＳＳＣ溶液（０.７５Ｍ ＮａＣｌ、７５mM クエン酸ナトリウム）で洗浄し、ハイブリダイゼーションパックにつめた。このパックにＥＣＬ遺伝子検出システム（アマシャム社）のハイブリダイゼーションバッファーを５ml加えて１時間、４２℃でプレハイブリダイゼーションを行なった。
【０１４５】
一方、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム部分（７２０ｂｐ）をＰＣＲ反応により増幅させたＤＮＡ断片を熱変性後に、ＥＣＬ遺伝子検出システムのラベリング試薬とグルタルアルデヒドを同量ずつ添加して５分間３７℃でインキュベートし標識した後、これを１０μlずつプレハイブリダイゼーションパックに添加し、４２℃で１時間インキュベートした。その後パックよりメンブレンを取り出し、あらかじめ４２℃に保温させた一次洗浄バッファー（６Ｍ 尿素、４g/l ＳＤＳ、２５ml/l ２０×ＳＳＣ）で２０分間洗浄した。これを再度繰り返した後、室温で二次洗浄バッファー（２×ＳＳＣ）で５分間洗浄した。これを再度繰り返した後、ＥＣＬ遺伝子検出システムの検出試薬に１分間浸した後、メンブレンをＸ線フィルムに重ね、感光させた。１時間後に該メンブレンを取り出して現像を行ない、ポジティブクローンを選択した。ここで選択したクローンをさらに先と同様の方法により二次スクリーニングに供し、最終的に５つの候補クローン（＃２，３，４，５，６）を得ることができた。ＰＣＲ反応を行なった結果から、これら５つの候補クローンのうち、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードする遺伝子の全領域を包含しているクローンは＃１クローン及び＃６クローンであることがわかった。
【０１４６】
次に、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質遺伝子のコード領域を含む染色体ＤＮＡの塩基配列を明らかにする目的でサブクローニングを行なった。まず得られた＃６クローンを制限酵素ＸｂａＩで消化した後、０.７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質遺伝子のコード領域を含むことが考えられた約９kbのＤＮＡ断片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）を用いて回収・精製を行なった。一方、クローニングベクターｐＵＣ１９は制限酵素ＸｂａＩで消化した後、１.０％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、２.７kbに相当するＤＮＡ断片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（キアジェン社）を用いて回収・精製を行なった後、ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼＣＩＡＰ（宝酒造）を用いて末端の脱リン酸化を行なった。このＣＩＡＰ処理ｐＵＣ１９に、先に調製した＃６クローン由来のＤＮＡ断片をＤＮＡ Ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入して得られたアンピシリン耐性株より目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択・単離した。クローン化された＃６クローン由来のＸｂａＩ ＤＮＡ断片の塩基配列については、種々の合成オリゴＤＮＡをプライマーとし、ダイターミネーターサイクルシークエンスＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用いたシークエンス反応を、添付資料の条件に従ってGeneAmpR PCR System 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー社）で決定した。得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で確認した。その結果、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードする染色体遺伝子は４つのエクソンから成ることが分かった〔図４〕。
以上のようにして取得した、マウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質のコード領域を含む＃６クローン由来のＸｂａＩ ＤＮＡ断片を保持するプラスミドはｐＴＢ２０１１と命名し、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに導入して得た形質転換体は、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１１とした。
【０１４７】
【実施例４】
Pichia酵母を宿主としたヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域の発現とウエスタンブロット解析
本発明のヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域を酵母Pichia pastorisで発現させるためのベクターとしてはｐＰＩＣＺαＡ（インビトロジェン社）を用いた。本ベクターには該酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のプロモーターの下流にPichia酵母でも機能的な出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの分泌シグナルα−因子をコードする遺伝子とそれに続くマルチクローニングサイトが含まれており、組換え蛋白質を培地中に分泌させることが可能である。
まず本発明のヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片はＰＣＲ法により調製するが、その際用いる次の２種のプライマーをＤＮＡ合成機（Oligo1000M、ベックマン社）で合成した。
▲１▼５'−プライマー：（配列番号：２１）
５'−ＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣ−３'
（このプライマーは、ＥｃｏＲＩ認識配列とその３'側にヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域のうち、Ｎ末端側の８５番Ｇｌｎから８アミノ酸をコードする２４塩基を有する）
▲２▼３'−プライマー：（配列番号：２２）
５'−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣ−３'
（このプライマーは、ＸｂａＩ認識配列とその３'側に終止コドン（ＴＧＡ）とヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域Ｃ末端５アミノ酸をコードする１５塩基に相補的な配列を有する）
【０１４８】
得られたプライマーをそれぞれ５０pmol、実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９３９を１００ng、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各１０nmol、２.５ユニットのネイティブＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社）とネイティブＰｆｕバッファー（ストラタジーン社）５μｌを含む５０μｌの溶液を調製し、サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 2400、パーキンエルマー社）を用いて、９４℃、１分、続いて９８℃、２０秒→５５℃、３０秒→６８℃、２分を１サイクルとする反応を３０サイクル、最後に７２℃、５分の条件でＰＣＲ反応を行なった。反応終了液からＰＣＲ産物を回収し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化後、予めＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化・線状化したｐＰＩＣＺαＡに連結し、環状化プラスミドを得た。該プラスミドＤＮＡを再びＡＯＸ１座位のＳａｃＩユニーク切断部位で切断し、線状化後、エレクトロポレーション法によりPichia pastoris ＫＭ７１株に導入した。そこで得られた１００μg/ml ZeocinTM（インビトロジェン社）含有ＹＰＤ寒天培地（１％ yeast extract（ディフコ（Difco）社）、２％ Bactopeptone（ディフコ（Difco）社）、２％ glucose（和光純薬）、２％ 寒天末（和光純薬））上で生育可能なZeocinTM耐性株の中から数クローンを選択し、各染色体ＤＮＡを調製後、それを鋳型に用いた、導入プラスミドＤＮＡの染色体への組み込みを確認するためのＰＣＲ反応を行ない、組み込みが確認されたクローンを目的とする組換え蛋白質発現用形質転換株として選択した。
組換え蛋白質の発現は以下の手順で行なった。まず、１白金耳のヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の発現用形質転換株のコロニーをＢＭＧＹ培地（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００mM リン酸カリウム（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids（ディフコ（Difco）社）、４×１０-5％ ビオチン、１％ グリセロール）２５mlに接種し、３０℃、２０時間培養した。菌体を遠心で集め、次にＯＤ600＝１.０になるようにＢＭＭＹ（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００mM リン酸カリウム（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids（ディフコ（Difco）社）、４×１０-5％ ビオチン、０.５％ メタノール）培地に再懸濁後、３０℃で培養し、１日、または２日後に該培養液をサンプリングし、遠心して培養上清を得た。
【０１４９】
本培養上清を用いたウエスタンブロッティングは以下の通りに行なった。まず、ヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列の一部（配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１６６番目〜第１８０番目までのアミノ酸配列）を含むペプチドを合成し、該合成ペプチドを認識するウサギ抗血清を公知の方法に従って作製した。次に上述の培養上清５μｌをサンプル処理液（０.２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ ＳＤＳ、３０％ glycerol、１０％ β−mercaptoethanol，０.０１％ bromophenol blue，ｐＨ６.８）５μｌと混合し９５℃で５分処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０−２０％グラジエントゲル）を用い、泳動終了後タンパク質ブロッティング装置（SemiPhorTM、ホーファ・ファルマシア・バイオテック（Hoefer Pharmacia BioTech）社）を用いてニトロセルロース膜（ファルマシア社）に泳動タンパク質を転写した。３％ ゼラチン含有ＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉｓ，５００mM ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）で膜をブロッキングして、次にＴＴＢＳ（０.０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で洗浄後、１.０％ ゼラチン含有ＴＴＢＳで２０００倍に希釈された上述のウサギ抗血清と室温で２時間反応させた。反応終了後、膜をＴＴＢＳで２回洗浄して、次に１.０％ゼラチン含有ＴＴＢＳで３０００倍に希釈されたアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と室温で１時間反応させた。膜をＴＴＢＳで２回洗浄してさらにＴＢＳで１回洗浄後、ＡＰ発色キット（バイオラッド社）を用いて検出した。
〔図５〕にそのウエスタンブロッティングの結果を示した。発現ベクターを導入した株の培養上清では約２０ｋＤ付近に主たるバンドが認められ、そのシグナルの強さは経時的に増加していたが、対照のｐＰＩＣＺαＡ導入株の培養上清では全くシグナルが認められなかった。
【０１５０】
【実施例５】
ラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングは、ＰＣＲ法によって行なった。
スーパースクリプトTMラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/mlアンピシリン含有Terrific Broth（１２g/l Bacto-tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto-yeast extract（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５g/l リン酸二カリウム，０.４％ グリセロール）で３０℃で１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミドキット（キアジェン社）を用いてプラスミドｃＤＮＡライブラリーを調製した。該ＤＮＡを鋳型として、また、下記の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮＡとして、またTaKaRa LA Taq（宝酒造（株））をＤＮＡポリメラーゼとして用いた反応系でＰＣＲ反応を行なった。
Figure 0004090092
反応はサーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 2400，パーキンエルマー社）を用いて、９４℃・１分を１サイクル、９８℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・３分を３５サイクル、７２℃・２分を１サイクル、４℃・放置のプログラムで行なった。反応終了液の一部を１.０％アガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ反応で増幅された単一のＤＮＡ断片に対応するバンドを確認の後、キアクィックゲルエキストラクションキット（キアジェン社）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し、その塩基配列を決定するためにpT7Blue T-vector（ノバジェン社）のＴクローニングサイトにＤＮＡライゲーションキットバージョン２（宝酒造（株））を用いて挿入・連結した。該ライゲーション液を大腸菌ＤＨ５α株に導入後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現してきたアンピシリン耐性形質転換株のコロニー群の中から２クローンを選択し、各々からプラスミドＤＮＡを調製した。両クローンの各挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するため、各プラスミドＤＮＡを鋳型に、２種（ＰＲＭ−００７、ＰＲＭ−００８）の市販プライマーＤＮＡ（東洋紡績（株））の他、ＤＮＡ合成装置（Oligo1000M、ベックマン社）で合成したオリゴＤＮＡをプライマーＤＮＡとして用い、Thermo SequenaseTM dye terminator cycle sequencing pre-mix kit（アマシャム社）を用いたサイクルシークエンス反応を添付資料の条件に従ってGeneAmpR PCR System 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー社）で分析した。
【０１５１】
得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で解析した。その結果、両クローンとも、Ｔクローニングサイトには、配列番号：３で表される２３９個のアミノ酸からなるラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードする配列番号：１０で表される７１７個の塩基配列からなるオープンリーディングフレーム（Open reading frame）を含む７８４塩基対の塩基配列のＤＮＡ断片が含まれていた〔図６〕。このラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質と実施例１で得られた配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒト由来Ｆａｓリガンド様タンパク質とはアミノ酸レベルで７５％の相同性を有しており、それらをコードするＤＮＡは塩基レベルで７４％の相同性を有していた。また、このラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質と実施例２で得られた配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するマウス由来Ｆａｓリガンド様タンパク質とはアミノ酸レベルで９６％の相同性を有しており、それらをコードするＤＮＡは塩基レベルで９４％の相同性を有していた。
得られたラット由来Ｆａｓリガンド様タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ２０１２を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに導入して形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１２を得た。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、アポトーシス活性、細胞傷害活性などの作用を有している。したがって、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、および本発明のＤＮＡは、例えば、癌（例、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ろ胞性リンパ球腫、ｐ５３変異を伴う癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌（結腸／直腸癌）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌など）、ウイルス感染（例、エイズウイルス感染初期、ヘルペスウイルス感染、アデノウイルス感染、ボックスウイルス感染、水痘-帯状疱疹ウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染など）、ヘリコバクター・ピロリ感染、侵襲性ブドウ状球菌感染、肝炎（例、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、腎炎、骨疾患（例、リウマチ関節炎（例、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖）など）、動脈硬化症、痛みなどの疾病の予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明のＤＮＡは、例えば、癌、ウイルス感染、肝炎、腎炎、リウマチ関節炎などの疾患の遺伝子診断剤として有用である。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質等の定量などに使用することができる。また、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を中和することができる抗体は、例えば、エイズ、リウマチにおける関節組織の破壊、炎症、肝炎、自己免疫疾患などの予防・治療剤などとして使用することができる。
さらに、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、本発明のタンパク質とレセプターとの結合性を変化させる化合物，プロテイナーゼ促進もしくは阻害作用を有する化合物，またはレセプター結合後の細胞内シグナル伝達を促進もしくは阻害する化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。
【０１５３】
【配列表】
【配列番号：１】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１５４】
【配列番号：２】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１５５】
【配列番号：３】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１５６】
【配列番号：４】
Figure 0004090092
【０１５７】
【配列番号：５】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１５８】
【配列番号：６】
Figure 0004090092
【０１５９】
【配列番号：７】
Figure 0004090092
【０１６０】
【配列番号：８】
Figure 0004090092
【０１６１】
【配列番号：９】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１６２】
【配列番号：１０】
Figure 0004090092
【０１６３】
【配列番号：１１】
Figure 0004090092
【０１６４】
【配列番号：１２】
Figure 0004090092
【０１６５】
【配列番号：１３】
Figure 0004090092
【０１６６】
【配列番号：１４】
Figure 0004090092
【０１６７】
【配列番号：１５】
Figure 0004090092
【０１６８】
【配列番号：１６】
Figure 0004090092
【０１６９】
【配列番号：１７】
Figure 0004090092
【０１７０】
【配列番号：１８】
Figure 0004090092
【０１７１】
【配列番号：１９】
Figure 0004090092
【０１７２】
【配列番号：２０】
Figure 0004090092
【０１７３】
【配列番号：２１】
Figure 0004090092
【０１７４】
【配列番号：２２】
Figure 0004090092
【０１７５】
【配列番号：２３】
Figure 0004090092
【０１７６】
【配列番号：２４】
Figure 0004090092
【０１７７】
【配列番号：２５】
Figure 0004090092
Figure 0004090092
【０１７８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９３９に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９４０に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】実施例２で得られたプラスミドｐＴＢ１９５８に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードするゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５】実施例４でPichia酵母を宿主とした本発明のヒトＦａｓリガンド様タンパク質の細胞外領域組換えタンパク質の発現を該タンパク質に対する抗血清を用いたウエスタンブロット解析で調べた結果を示す。レーン１〜３はヒトＦａｓリガンド様タンパク質発現ベクターを導入した株の培養上清を用いた場合の結果を、レーン４〜６はベクターｐＰＩＣＺαＡを導入した株の培養上清を用いた場合の結果を示す（レーン１、４はＢＭＭＹ培地での培養開始直後、レーン２、５は培養１日後、レーン３、６は培養２日後）。バンドは目的の組換えタンパク質の発現を示す。
【図６】実施例５で得られたプラスミドｐＴＢ２０１２に含まれる本発明のラット由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のラット由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel Fas ligand-like protein and its DNA.
[0002]
[Prior art]
Multicellular organisms cleverly control cell growth and death to maintain their homeostasis. In the process of ontogeny, many cells are removed by cell death, and even in adults, cells constituting organs and tissues always maintain their functions while maintaining a balance between proliferation and death. Cell death at this time is said to be a pre-scheduled death, “Programmed Cell Death”, and necrosis (necrosis), a cell death that occurs unexpectedly due to physical and chemical factors, is morphologically It is known to occur through the process of apoptosis (Apoptosis) that is clearly distinguished. The characteristics of cell death due to apoptosis are discussed as a mechanism in which cell membrane curvature, nuclear condensation and fragmentation occur, and are eventually taken up and reused by phagocytic cells such as macrophages (International Review of -Cytology (INTERNATIONAL REVIEW OF CYTOLOGY) 68, 251-2306, 1980).
Many physiological and pathological phenomena related to apoptosis have been clarified so far, and various attempts have been made to diagnose, prevent and treat various diseases by inducing or suppressing apoptosis of cells. (SCIENCE 267, 1456-1462, 1995). Apoptosis is one of the life phenomena that has attracted particular attention in the industry.
[0003]
Apoptosis is induced under various physiological conditions. Among them, Fas antigen (CD95, APO-1) has recently attracted attention as a molecule that induces death in cells of the immune system (SCIENCE 267, 1449). -1456, 1995). The Fas antigen is a type I membrane protein belonging to the TNF (tumor necrosis factor) receptor family having a molecular weight of 45 kDa, and induces cell death by binding to a Fas ligand. The expression of Fas antigen is observed in various blood cells and many tissues and cells such as liver, heart and small intestine, whereas the expression of Fas ligand which is a type II membrane protein having a molecular weight of 40 kDa is expressed in activated T lymphocytes and Limited to natural killer (NK) cells, macrophages, testis, cornea and the like. Recently, from the analysis of genes in mice, the Fas antigen gene is an lpr structural gene that is mutated in an autoimmune disease-onset mouse called lpr (lymphoproliferation) mouse, and gld that exhibits symptoms similar to those of lpr mice. (Generalized-lymphoproliferative disease) It has been clarified that the Fas ligand is mutated in mice. In humans, patients with autoimmune diseases having mutations in the Fas antigen gene have been reported, and it is strongly suggested that dysfunction of the Fas / Fas ligand system causes autoimmune diseases (SCIENCE 268, 1347). -1349, 1995).
It was also found that human Fas ligand can be cleaved by matrix metalloproteinase and released as soluble Fas ligand, and Fas ligand not only interacts by contact between cells but also a broader immune response It has also been suggested that it may regulate (JOUNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 182, 1777-1783, 1995).
[0004]
Among the proteins belonging to the TNF family having various biological activities other than Fas ligand, TNF-α, lymphotoxin-α (Lymphotoxin-α, LT-α) and lymphotoxin-β (Lymphotoxin-β, LT-β) Has been reported to have an activity to induce apoptosis (THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 334, 1717-1725, 1996). TNF-α was discovered in 1975 as a factor having tumor necrosis activity, but recently, it is rather an activator of immune function as a mediator of inflammatory reaction, and defense against various invasions including viral infection and bacterial infection. The importance of action as a factor has been recognized. LT-α was first reported as a cytotoxic factor produced by lymphocytes, formed a homotrimer, similar to TNF-α, and bound to two TNF receptors of 55 kDa and 75 kDa. A biological activity spectrum similar to that of TNF is exhibited although the activity is strong and weak except for promotion of growth. LT-β is a membrane-bound protein having a molecular weight of 33 kDa, which is highly homologous to LT-α, forms a heterotrimer with LT-α, and is a newly found LT-β receptor that is different from the two TNF receptors. And has a biological activity of lymph node formation that is not found in TNF and LT-α trimers. Recently, a molecule (APO-2L / TRAIL) having apoptosis-inducing activity and high homology with Fas ligand was newly discovered, and this protein binds to another receptor DR4 different from TNF receptor and Fas antigen. It has been shown to exert cytotoxic activity (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY) 271, 12687-12690, 1996; SCIENCE, 276, 111-113, 1997 ). Therefore, it can be considered that there is a physiologically clear function sharing in apoptosis-inducing activity between proteins of the TNF (TNF receptor) family, which have different expression specificities of ligand and receptor.
[0005]
Recently, a detailed report has been made on the relationship between apoptosis and disease (Japanese Clinical, Vol. 54, No. 7, issued July 1, 1996). For example, diseases caused by decreased apoptosis include cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation), virus infection (eg, herpes virus infection, adenovirus infection, box Virus infection), autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), while diseases caused by increased apoptosis include AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson) Disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration), myelodysplastic disease (eg, aplastic anemia), ischemic disease (eg, myocardial infarction, stroke), toxic liver disease (eg , Alcohol).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a novel Fas ligand-like protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, a DNA encoding the protein, a recombinant vector, a transformant, a method for producing the protein, a drug containing the protein or the DNA, and the protein Antibody, receptor agonist / antagonist screening method and screening kit, receptor agonist / antagonist obtained by the screening and pharmaceutical agent thereof, screening method for compound that promotes / inhibits the activity of proteinase that degrades the protein, and screening kit, Cleaning method of compound obtained by screening and its pharmaceutical, compound that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein to a receptor to which the protein can bind And screening kit, and an object thereof is to provide compounds and their pharmaceutically like obtained by the screening.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
Isolation of a new Fas ligand-like protein reveals a new apoptotic pathway through the TNF family and TNF receptor family, and if it is expressed specifically in organs or cells, various organ-specific diseases and apoptosis This makes it possible to investigate in more detail, develop inhibitory or promoting activity against new Fas ligand-like proteins, and develop new drugs useful for the prevention and treatment of various diseases.
As a result of intensive studies, the present inventors succeeded in cloning cDNAs having novel base sequences from human liver, mouse embryo and rat liver-derived cDNA libraries. The present inventors have found that the protein encoded by the obtained cDNA is a useful Fas ligand-like protein, and based on these findings, as a result of further studies, the present invention has been completed. It came.
[0008]
That is, the present invention
(1) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a salt thereof,
(2) The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is the 8th to 21st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 55th 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th, 144th to 149th, 162nd to 170th, 176th to 182nd, 184th to 189th The protein according to item (1), which is an amino acid sequence having the amino acid sequence of Nos. 193-213, 215-219, and 228-239,
(3) The protein according to item (1) or (2), which is a protein having apoptosis-inducing activity,
(4) a partial peptide of the protein according to item (1) or a salt thereof,
(5) DNA containing DNA having a base sequence encoding the protein according to item (1),
(6) the DNA according to item (5) having a base sequence represented by any one of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10,
(7) a recombinant vector containing the DNA according to item (5),
(8) A transformant transformed with the recombinant vector according to (7),
(9) The transformant according to item (8) is cultured, the protein according to item (1) is produced, accumulated, and collected; or the protein according to item (1) Salt production method,
(10) A pharmaceutical comprising the protein according to (1), the partial peptide according to (4) or a salt thereof,
(11) A medicament comprising the DNA according to (5),
(12) Item (10) or (11) which is a therapeutic or preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain The medicine described in the paragraph,
(13) an antibody against the protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or a salt thereof,
[0009]
(14) The protein according to (1), the protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof, the portion according to (4) A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property of a peptide or a salt thereof to a receptor to which the protein described in (1) can bind;
(15) The protein according to (1), the partial peptide according to (4), or the partial peptide according to (4), which contains the protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property of a salt to a receptor to which the protein described in (1) can bind;
(16) The protein according to item (1), the partial peptide according to item (4), or the partial peptide obtained by using the screening method according to item (14) or the screening kit according to item (15) A compound that changes the binding property between the salt and a receptor to which the protein according to item (1) can bind, or a salt thereof,
(17) The protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof obtained by using the screening method according to (14) or the screening kit according to (15) And a pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof that changes the binding property with a receptor to which the protein according to item (1) can bind,
(18) Promoting or inhibiting the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1), wherein the protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or a salt thereof is used A method for screening a compound or a salt thereof,
(19) A compound that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to (1), comprising the protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof, or The salt screening kit,
(20) A compound that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to (1), obtained by using the screening method according to (18) or the screening kit according to (19), or Its salt,
(21) A compound that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (18) or the screening kit according to item (19), or a compound thereof A medicine comprising a salt,
[0010]
(22) The protein according to (1), the protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof, the moiety according to (4) A method for cleaning or inhibiting a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of a peptide or a salt thereof to a receptor to which the protein described in (1) can bind;
(23) The protein according to (1), the partial peptide according to (4), or the partial peptide according to (4), which contains the protein according to (1), the partial peptide according to (4), or a salt thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding between the salt and a receptor to which the protein described in (1) can bind;
(24) The protein according to item (1), the partial peptide according to item (4) or the partial peptide thereof obtained by using the screening method according to item (22) or the screening kit according to item (23) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding between the salt and a receptor to which the protein described in (1) can bind;
(25) The protein according to item (1), the partial peptide according to item (4), or a salt thereof obtained by using the screening method according to item (22) or the screening kit according to item (23) A compound comprising a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding to a receptor to which the protein described in (1) can bind,
(26) a non-human mammal comprising the exogenous DNA according to (5) or a mutant DNA thereof,
(27) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to (5) is inactivated,
(28) The DNA expression-deficient non-human mammal, wherein the DNA according to (5) is inactivated,
(29) The non-human mammal according to (28), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA according to (5) ,
(30) The test compound is administered to the non-human mammal according to (29) and the expression of the reporter gene is detected, thereby promoting or inhibiting the activity of the promoter for the DNA according to (5) Screening method for compound or salt thereof,
(31) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA according to (5), obtained by using the screening method according to (30)
(32) A pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA according to (5) obtained by using the screening method according to (30).
[0011]
The present invention also provides:
(1) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a salt thereof,
(2) The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is the 8th to 21st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 55th 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th, 144th to 149th, 162nd to 170th, 176th to 182nd, 184th to 189th The protein according to item (1), which is an amino acid sequence having the amino acid sequence of Nos. 193-213, 215-219, and 228-239,
(3) The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is the 8th to 21st, 54th to 59th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 93-102, 109-116, 118-126, 128-134, 144-149, 162-170, 176-182, 184-189, 193 The protein according to item (1), which is an amino acid sequence having the amino acid sequence of the 213rd, 215th to 219th and 228th to 240th positions,
(4) the protein according to any one of (1) to (3), which is a protein having apoptosis-inducing activity;
(5) the partial peptide of the protein according to item (1) or a salt thereof,
(6) DNA containing DNA having a base sequence encoding the protein according to item (1),
(7) DNA according to item (6) having a base sequence represented by any of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10,
(8) a recombinant vector containing the DNA according to item (6),
(9) A transformant transformed with the recombinant vector according to item (8),
(10) The protein according to item (1) or the protein thereof, comprising culturing the transformant according to item (9), producing and accumulating the protein according to item (1), and collecting the protein. Salt production method,
(11) A pharmaceutical comprising the protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof,
(12) The medicament according to (11), which is a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(13) A pharmaceutical comprising the DNA according to (6),
(14) The medicament according to (13), which is a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(15) the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or an antibody thereof,
[0012]
(16) (i) contacting the protein described in (1), the partial peptide described in (5), or a salt thereof with the receptor or partial peptide thereof to which the protein described in (1) can bind. And (ii) the receptor or a partial peptide thereof when the protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof and a test compound are contacted, The protein according to (1), wherein the binding amount of the partial peptide and the protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof is measured and compared. , A screening method for a compound or its salt that changes the binding property of the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and a receptor,
(17) (i) the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or the partial peptide thereof or the cell membrane fraction containing a receptor to which the protein according to item (1) can bind; And (ii) the protein containing the receptor or the cell membrane fraction thereof, the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and a test compound The amount of the binding between the receptor-containing cell or its cell membrane fraction and the protein described in (1), the partial peptide described in (5) or a salt thereof is compared and compared. A protein that changes the binding property between the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and a receptor, or a saltin of the salt Method,
(18) (i) a cell containing a receptor capable of binding to the protein described in (1) is contacted with a cell containing the protein described in (1), (ii) the receptor Measuring and comparing the apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity in the cell containing the receptor when the cell containing the protein according to item (1) and the test compound are contacted with the containing cell. A screening method for a protein or a salt thereof that changes the binding property of the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and a receptor;
(19) The receptor according to item (1), which contains the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5), or a salt thereof, to which the protein according to item (1) can bind. A kit for screening a protein, a compound that changes the binding property to the partial peptide according to (5) or a salt thereof, or a salt thereof;
(20) The protein according to (1) obtained by using the screening method according to any of (16) to (18) or the screening kit according to (19) binds. A compound or a salt thereof that alters the binding property between the receptor to be obtained and the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof;
(21) The protein described in (1) obtained by using the screening method described in any of (16) to (18) or the screening kit described in (19) can bind. A medicament comprising an agonist for a receptor,
(22) The medicament according to (21), which is a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(23) The protein according to item (1) obtained by using the screening method according to any of items (16) to (18) or the screening kit according to item (19) can be bound. A medicament comprising an antagonist to the receptor,
(24) AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic disease, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis Or the medicament according to item (23), which is a therapeutic / preventive agent for ulcerative colitis,
[0013]
(25) (i) a proteinase that degrades the protein according to item (1) or a salt thereof (provided that the cell containing the protein according to item (1) has an extracellular proteinase having an activity to degrade the protein) In the case of production / secretion, the culture supernatant obtained by culturing the cell containing the protein described in (1) in the presence of the extracellular proteinase produced / secreted by the cell, and a receptor And (ii) a proteinase that degrades the protein described in (1) (provided that the cell containing the protein described in (1) is a cell that contains the protein described in (1)). The presence of a test compound and the extracellular proteinase produced and secreted by the cell when producing or secreting an extracellular proteinase having the activity of degrading a protein) Cell-stimulating activity via the receptor, or cells containing the receptor, when the culture supernatant obtained by culturing the cell containing the protein of item (1) is contacted with the cell containing the receptor A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1), which comprises measuring or observing and comparing apoptosis or cytotoxicity of
(26) a compound that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to (1), which comprises the protein according to (1), the partial peptide according to (5), or a salt thereof; The salt screening kit,
(27) A compound that promotes or inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (25) or the screening kit according to item (26), or a compound thereof salt,
(28) A compound or a salt thereof that promotes the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (25) or the screening kit according to item (26). A pharmaceutical comprising,
(29) The medicament according to item (28), which is a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(30) A compound or a salt thereof that inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (25) or the screening kit according to item (26). A pharmaceutical comprising,
(31) The medicament according to (30), which is a therapeutic / preventive agent for joint tissue destruction, inflammation, hepatitis or autoimmune disease in AIDS and rheumatism,
[0014]
(32) (i) contacting the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof with a cell containing a receptor to which the protein according to item (1) can bind. And (ii) when the cell containing the receptor is contacted with the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and a test compound, Intracellular signal transduction after binding to the protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof is measured and compared, according to (1) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of a receptor to which a protein can bind to the protein described in (1), the partial peptide described in (5), or a salt thereof Cleaning method,
(33) (i) a cell containing a receptor capable of binding to the protein described in (1) is contacted with a cell containing the protein described in (1), and (ii) the receptor When the cell containing the protein described in (1) and a test compound are contacted with the cell, the receptor and the protein described in (1), the partial peptide described in (5), or the same A receptor capable of binding to the protein described in (1), the protein described in (1), and (5) characterized in that intracellular signal transduction after binding to the salt of A method for cleaning a compound or a salt thereof which promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding to the partial peptide or the salt thereof according to Item 2.
(34) The receptor according to item (1), which contains the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5) or a salt thereof and capable of binding to the protein according to item (1). A kit for screening a protein, a compound that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding to the partial peptide according to item (5) or a salt thereof, or a salt thereof;
(35) A receptor capable of binding to the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (32) or (33) or the screening kit according to item (34); A protein according to (1), a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signaling after binding to the partial peptide according to (5) or a salt thereof,
(36) A receptor capable of binding to the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (32) or (33) or the screening kit according to item (34); A protein comprising the protein according to (1), the compound that promotes intracellular signal transduction after binding with the partial peptide according to (5) or a salt thereof, or a salt thereof;
(37) The medicament according to (36), which is treatment / prevention of cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(38) A receptor capable of binding to the protein according to item (1) obtained by using the screening method according to item (32) or (33) or the screening kit according to item (34); A protein comprising the protein according to (1), a compound that inhibits intracellular signal transduction after binding to the partial peptide according to (5) or a salt thereof, or a salt thereof;
(39) AIDS, neurodegenerative diseases, myelodysplastic diseases, ischemic diseases, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis Or the medicament according to item (38), which is a therapeutic / preventive agent for ulcerative colitis,
[0015]
(40) Cancer, viral infection in a human or mammal, characterized by administering an effective amount of the protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof to a human or mammal. A method of treating or preventing Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, autoimmune disease, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(41) Cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis in human or mammal, characterized by administering an effective amount of the DNA according to item (6) to human or mammal. A method of treating or preventing nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(42) The protein according to item (1) for producing a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain , Use of the partial peptide according to item (5) or a salt thereof,
(43) DNA according to item (6) for producing a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain Use of,
(44) a non-human mammal comprising the exogenous DNA according to (6) or a mutant DNA thereof,
(45) The non-human mammal according to item (44), wherein the non-human mammal is a rodent,
(46) The non-human mammal according to item (44), wherein the rodent is a mouse,
(47) The non-human mammal according to item (46), wherein the DNA is DNA (mouse-derived genomic DNA) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
(48) A recombinant vector containing the exogenous DNA according to (6) or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a non-human mammal
(49) the recombinant vector according to item (48), wherein the DNA is a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (a mouse-derived genomic DNA);
(50) A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to (6) is inactivated,
(51) The non-human animal embryonic stem cell according to (50), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, E. coli-derived β-galactosidase gene),
(52) The non-human animal embryonic stem cell according to item (50), which is neomycin-resistant,
(53) The non-human mammal embryonic stem cell according to item (50), wherein the non-human mammal is a rodent.
(54) A non-human mammal embryonic stem cell according to item (53), wherein the rodent is a mouse, (55) a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (mouse-derived genomic DNA) (54) the non-human mammalian embryonic stem cell according to item,
[0016]
(56) The DNA expression-deficient non-human mammal, wherein the DNA according to (6) is inactivated,
(57) The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, E. coli-derived β-galactosidase gene), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA described in (6). (56) the non-human mammal according to item
(58) The non-human mammal according to (56), wherein the non-human mammal is a rodent.
(59) The non-human mammal according to item (58), wherein the rodent is a mouse,
(60) The non-human mammal according to item (59), wherein the DNA is a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (genomic DNA derived from a mouse),
(61) The test compound is administered to the non-human mammal according to (56) and the expression of the reporter gene is detected, and the promoter activity for DNA according to (6) is promoted or inhibited A method for screening a compound or a salt thereof,
(62) A compound or a salt thereof that is obtained by using the screening method according to item (51), and that promotes the activity of the promoter for the DNA according to item (6),
(63) A pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a promoter for DNA according to (6),
(64) The medicament according to item (63), which is a therapeutic / preventive agent for cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, bone disease, arteriosclerosis or pain,
(65) A compound or a salt thereof that is obtained by using the screening method according to item (51) and inhibits the activity of the promoter against the DNA according to item (6),
(66) A pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the promoter for the DNA according to (6),
(67) AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic disease, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis Or the medicament according to item (66), which is a therapeutic / preventive agent for ulcerative colitis,
[0017]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[Wherein Xaa represents an arbitrary amino acid residue and may be deleted], the protein according to item (1) having the amino acid sequence represented by (SEQ ID NO: 25);
[0018]
(69) 8th to 21st, 55th to 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 144-149th, 162-170th, 176-182nd, 184-189th, 193-213th, 215-219th and 228-239th amino acid sequence The partial peptide according to item (5) having the amino acid sequence of:
(70) 8th to 21st, 54th to 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 144-149th, 162-170th, 176-182nd, 184-189th, 193-213th, 215-219th and 228-240th amino acid sequence The partial peptide according to item (5) having the amino acid sequence of:
(71) The amino acid sequence having the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5) The partial peptide according to item,
(72) DNA containing a DNA having a base sequence that hybridizes under high stringency conditions with the base sequence represented by any one of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10,
(73) A recombinant vector containing the DNA according to item (72),
(74) A transformant transformed with the recombinant vector according to item (73),
(75) The transformant according to (74) is cultured, the protein is produced, accumulated, and collected; and the protein encoded by the DNA according to (72) or a salt thereof Production method,
(76) A protein encoded by the DNA according to (72) or a salt thereof produced by the production method according to (75)
[0019]
(77) The receptor to which the protein according to item (1) can bind is a receptor belonging to the TNF receptor family (eg, TNF receptor, lymphotoxin-β receptor, Fas, CD27, CD30, CD40, OX40, DR4, DR3 / WSL). -1, TR2) or the screening method according to any one of (16) to (18), which is a receptor for the protein according to (1),
(78) The receptor to which the protein according to item (1) can bind is a receptor belonging to the TNF receptor family (eg, TNF receptor, lymphotoxin-β receptor, Fas, CD27, CD30, CD40, OX40, DR4, DR3 / WSL). -1, TR2) or the screening kit according to item (19), which is a receptor for the protein according to item (1),
(79) The antibody according to (15) is allowed to react competitively with the test solution and the labeled protein according to (1), the partial peptide according to (5) or a salt thereof. Wherein the ratio of the labeled protein (1), the partial peptide of (5) or a salt thereof bound to the antibody is measured (1) ) The protein according to paragraph (5), the partial peptide according to paragraph (5) or a salt thereof,
(80) The test solution and the antibody according to item (15) insolubilized on the carrier and the labeled antibody according to item (14) are reacted at the same time or successively, and then on the insolubilized carrier. A method for quantifying the protein according to item (1), the partial peptide according to item (5), or a salt thereof, characterized in that the activity of the labeling agent is measured
(81) A medicament comprising the antibody according to item (15) (preferably the antibody according to item (15) having an activity of neutralizing the protein activity according to item (1)),
(82) AIDS, neurodegenerative diseases, myelodysplastic diseases, ischemic diseases, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis Or the medicament according to item (81), which is a therapeutic / preventive agent for ulcerative colitis,
(83) An antisense DNA having a base sequence complementary or substantially complementary to the DNA according to item (6) or (72) and having an action capable of suppressing the expression of the DNA,
(84) The base sequence substantially complementary to the DNA of item (6) or (72) is about 40% or more of the total or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA ( The antisense DNA according to item (83), which is a base sequence having a homology of preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. ,
(85) A medicament comprising the antisense DNA according to (83), and
(86) AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic disease, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis Or the pharmaceutical of the (85) description which is a therapeutic / preventive agent for ulcerative colitis is provided.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protein of the present invention has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
The protein of the present invention can be used, for example, in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial) of a human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, horse, monkey, etc.). Cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or Stromal cells, or progenitor cells of these cells, stem cells or cancer cells), or any tissue in which these cells exist, such as the brain, brain regions (eg, olfactory bulb, amygdala, large Basal ganglia, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract ( Eg, large intestine, small intestine, duodenum), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testes, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc. Or a synthetic protein.
[0021]
The amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is, for example, about 40% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. The amino acid sequences having homology of 60% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more are mentioned. In particular, among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 83rd to 240th amino acid sequence, among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the 81st to 239th amino acid sequence or SEQ ID NO: 3 When the amino acid sequence represented by the amino acid sequence has a homology of about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the 81st to 239th amino acid sequences Is preferred.
Moreover, as an amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, the 8th to 21st and 55th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are used as constituent amino acids. 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th, 144th to 149th, 162nd to 170th, 176th to 182nd, 184th to 189th Also preferred are amino acid sequences having the 193rd to 213rd, 215th to 219th and 228th to 239th amino acid sequences. These amino acid sequences are amino acid sequences common to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
Moreover, as an amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as constituent amino acids, the 8th to 21st, 54th to 59th, and 93th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are used. -102, 109-116, 118-126, 128-134, 144-149, 162-170, 176-182, 184-189, 193-213 The amino acid sequences having the amino acid sequences of the 215th, 215th to 219th and 228th to 240th positions are also preferred. These amino acid sequences are the 6th to 20th, 52nd to 57th, 91st to 100th, 107th to 114th, 116th to 124th, 126th to 132rd amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2. , 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th and 227-239th amino acid sequences, This is an amino acid sequence common to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0022]
As described above, the protein of the present invention containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 includes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or It has substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and is substantially the same quality as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. A protein having activity is preferred.
Examples of substantially the same activity include activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells. Substantially homogeneous indicates that their activities are qualitatively homogeneous (eg, physiochemical or pharmacological). Accordingly, activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells are equivalent (eg, about 0.01 to 20 times, preferably about 0.2 to 5 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
Activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells can be measured using a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in the screening method described later.
The protein of the present invention includes (1) 1 or 2 or more (for example, 1 to 80, preferably 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence in which about 1 amino acid, more preferably about 1 to 9 amino acids, more preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted, (2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 1 or 2 (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably a number (eg, 1 to 5)) in the amino acid sequence represented by 3. Amino acid sequence added with amino acids, (3) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. , More preferably 1-9 Degrees, and more preferably several (e.g., 1-5) pieces amino acids) are included so-called muteins such as proteins containing the amino acid sequence, or ▲ 4 ▼ amino acid sequence comprising a combination thereof are substituted by other amino acids.
[0023]
When the amino acid sequence is deleted or substituted as described above, the position of the deletion or substitution is not particularly limited, but for example, (1) Nos. 8 to 21 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , 55-59th (or 54-59th), 93-102th, 109-116th, 118-126th, 128-134th, 144-149th, 162-170 , 176-182nd, 184-189th, 193-213th, 215-219th or 228-239th (or 228-240th) other than the amino acid sequence, preferably the sequence Numbers 93 to 102, 109 to 116, 118 to 126, 128 to 134, 144 to the amino acid sequence represented by No. 1 Positions other than the 49th, 162nd to 170th, 176th to 182nd, 184th to 189th, 193th to 213th, 215th to 219th or 228th to 240th amino acid sequences, (2) SEQ ID NO: : 6-19th amino acid sequence represented by 2, 53-57th (or 52-57th), 91-100th, 107-114th, 116-124th, 126-132 , 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th or 227-238th (or 227-239th) ) Other than the amino acid sequence, preferably the 91st to 100th positions, the 107th to 114th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 116-124th, 126-132th, 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th or 227- Positions other than the 239th amino acid sequence, (3) 6th to 19th, 53rd to 57th (or 52nd to 57th), 91st to 100th, 107th to 107th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 114th, 116-124th, 126-132th, 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th Or a position other than the 227-238th (or 227-239th) amino acid sequence, preferably the amino acid represented by SEQ ID NO: 3 91-100th, 107-114, 116-124, 126-132, 142-147, 162-170, 176-182 and 184-189 of the acid sequence , Positions other than the 192nd to 212nd, 214th to 218th, or 227th to 239th amino acid sequences.
[0024]
Furthermore, specifically, the general formula,
Figure 0004090092
Figure 0004090092
A protein having an amino acid sequence represented by [wherein Xaa represents an arbitrary amino acid residue] [amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25] is also preferably used.
In the general formula (I), one or two or more (for example, 1 to 56, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 9, most preferably a number). Xaa may be deleted at the position).
[0025]
The amino acid represented by Xaa may be either a hydrophilic amino acid or a hydrophobic amino acid, and may be an acidic amino acid, a basic amino acid, or a neutral amino acid. Specifically, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Glu, Asp, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Pro, Asn, Gln, and the like are used.
In the general formula (I), as the third Xaa, Glu is preferable or may be deleted.
The seventh Xaa is preferably a hydrophilic amino acid, specifically, Arg or Gln is preferred.
The 22nd Xaa is preferably a hydrophilic amino acid, specifically, Thr or Arg is preferred.
The 25th Xaa is preferably a hydrophilic amino acid and specifically, Gly or Glu is preferred.
The 26th Xaa is preferably a hydrophilic amino acid and specifically, Arg or Gln is preferred.
The 27th Xaa is preferably a hydrophilic amino acid and specifically, Ser or Asn is preferred.
The 31st Xaa is preferably a hydrophilic amino acid and specifically, Gln or Arg is preferred.
The 32nd Xaa is preferably a hydrophilic amino acid, specifically, Ser or Arg is preferred.
The 34th Xaa is preferably a hydrophilic amino acid and specifically, Ser or Gly is preferred.
The 35th Xaa is preferably, eg, Val or Thr.
The 36th Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Ala or Val is preferred.
[0026]
The 37th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Arg or Gln is preferred.
The 39th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Gly or Ser is preferred.
As the 41st Xaa, for example, Gly or Ala is suitable.
The 43rd Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Leu or Val is preferred.
The 47th Xaa is preferably Met or may be deleted.
The 53rd Xaa is preferably, eg, Val or Thr.
The 60th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Gln or Arg is preferred.
The 63rd Xaa is preferably Trp or Gln, for example.
The 67th Xaa is preferably, eg, an acidic amino acid and specifically, Glu or Asp is preferred.
The 68th Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Met or Ile is preferred.
The 70th Xaa is preferably, for example, Thr or Ala.
The 71st Xaa is preferably, eg, a basic amino acid and specifically, Arg or His is preferred.
As the 76th Xaa, for example, Pro or Gly is preferred.
The 77th Xaa is preferably, eg, Ala or Lys.
The 82nd Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Gln or Lys is preferred.
The 86th Xaa is preferably, eg, an acidic amino acid and specifically, Glu or Asp is preferred.
The 87th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Arg or Gln is preferred.
[0027]
The 91st Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Glu or Gln is preferred.
The 92nd Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Val or Ala is preferred.
The 103rd Xaa is preferably, eg, Ser or Ala.
The 106th Xaa is preferably, for example, Thr or Ile.
The 108th Xaa is preferably, eg, Ser or Ile.
The 117th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Gln or Arg is preferred.
The 127th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Ser or Thr is preferred.
The 135th Xaa is preferably, eg, Val or Thr.
The 136th Xaa is preferably, for example, Thr or Met.
The 137th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Lys or Glu is preferred.
The 138th Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Ala or Pro is preferred.
The 143rd Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Ile or Val is preferred.
The 150th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Gly or Ser is preferred.
As the 156th Xaa, for example, Leu or Gln is preferable.
The 160th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Ser or Asn is preferred.
[0028]
The 161st Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Thr or Gly is preferred.
The 162nd Xaa is preferably Leu or may be deleted.
The 163rd Xaa is preferably Pro or may be deleted.
As the 173rd Xaa, for example, Pro or Ser is preferable.
The 178th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Glu or Lys is preferred.
The 185th and 186th Xaa are preferably, for example, hydrophilic amino acids, and specifically, Gln or Arg is preferred.
The 193rd Xaa is preferably Thr or may be deleted.
The 194th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Ser or Asn is preferred.
The 216th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Lys or Glu is preferred.
The 222nd Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Leu or Pro is preferred.
The 223rd Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Asp or Gly is preferred.
The 224th Xaa is preferably, eg, a hydrophilic amino acid and specifically, Glu or Asn is preferred.
The 229th Xaa is preferably, eg, a hydrophobic amino acid and specifically, Leu or Pro is preferred.
[0029]
The protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. The protein of the present invention, including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminus that is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO). - ) But the C-terminus is an amide (-CONH 2 ) Or ester (—COOR).
Here, R of the ester group is, for example, C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 A cycloalkyl group such as phenyl, α-naphthyl and the like 6-12 Aryl groups such as phenyl-C such as benzyl, phenethyl and the like 1-2 Alkyl groups or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as alkyl group 7-14 In addition to the aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group that is widely used as an oral ester is used.
When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Further, in the protein of the present invention, in the above-described protein, the amino group of the amino acid residue at the N-terminal is a protecting group (for example, a C group such as a formyl group or an acetyl group). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 An acyl group and the like, a glutamyl group produced by cleaving the N-terminal side in vivo, and pyroglutamylated, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C such as formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 Examples thereof include those protected with an acyl group or the like, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
More specifically, examples of the protein of the present invention include a human liver-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [FIG. 1 or FIG. 2], SEQ ID NO: 2 [FIG. 3 or FIG. 4]. A protein derived from a mouse embryo having an amino acid sequence represented by the following: a protein derived from a rat liver having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 [FIG.
[0030]
The partial peptide of the protein of the present invention is any peptide as long as it has an activity equivalent to that of the above-described protein of the present invention, such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells. Also good. For example, in the amino acid sequence of the protein of the present invention, at least about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 70 or more, more preferably about 100 or more, and most preferably about 200 or more amino acids. Peptides having a residue are preferably used.
For example, (1) 8th to 21st, 55th to 59th, 93rd to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. , 144-149th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 193-213th, 215-219th and 228-239th amino acid sequence A partial peptide having one or more amino acid sequences (i.e., 6th to 20th, 53th to 57th, 91st to 100th, 107th to 114th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3) 116-124th, 126-132th, 142-147th, 162-170th, 176-182th, 18th A partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the 189th, 192nd to 212th, 214th to 218th and 227 to 238th amino acid sequences), and (2) represented by SEQ ID NO: 1. 8th to 21st, 54th to 59th, 93th to 102nd, 109th to 116th, 118th to 126th, 128th to 134th, 144th to 149th, 162th to 170th of the amino acid sequence A partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of 176 to 182, 184 to 189, 193 to 213, 215 to 219, and 228 to 240 (that is, 6th to 20th position, 52nd to 57th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, 91st to 100th, 107th to 114th, 116th to 124th, 126th to 132nd, 142nd to 147th, 162nd to 170th, 176th to 182nd, 184th to 189th, 192nd to 192nd And a partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the 212th, 214th to 218th and 227th to 239th amino acid sequences).
More specifically, a partial peptide having the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 81st to 239th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A partial peptide having the sequence, a partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like are preferably used.
[0031]
Furthermore, the partial peptide of the present invention has (1) an amino acid sequence substantially identical to the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A peptide having substantially the same activity as the peptide containing the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented, (2) the 81st to 239th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A peptide having substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of and having substantially the same quality of activity as a peptide containing the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. (3) It has substantially the same amino acid sequence as the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, Such as a peptide having a peptide substantially equivalent activity containing 81 th to 239 th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by in are preferred.
[0032]
Examples of the amino acid sequence substantially the same as the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are, for example, the 83rd to 240th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence having a homology of about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
Examples of the amino acid sequence substantially identical to the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, the 81st to 239th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2. An amino acid sequence having a homology of about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
The amino acid sequence substantially the same as the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is, for example, the 81st to 239th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence having a homology of about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
“Substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above.
Activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells can be measured using a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in the screening method described later.
[0033]
In addition, the partial peptide of the present invention includes (1) one or more (for example, 1 to 80, preferably 1) of the 83rd to 240th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 20 amino acids, more preferably about 1 to 9 amino acids, more preferably a number (eg, 1 to 5) of amino acids deleted from the 83rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. One or two or more (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably a number (eg, 1 to 5)) in the 240th amino acid sequence 1 or 2 or more (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20 or more) in the amino acid sequence added with amino acids, the 83rd to 240th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Like Or a partial peptide containing an amino acid sequence in which about 1 to 9, more preferably several (eg, 1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or an amino acid sequence combining them, ▼ 1 or 2 or more (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably 1 to 9) in the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 1 or 2 or more in the amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence in which the number, more preferably several (eg, 1 to 5) amino acids have been deleted. An amino acid sequence to which amino acids (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably several (eg, 1 to 5)) are added, SEQ ID NO: 2 1 or 2 or more (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably a number in the 81st to 239th amino acid sequences of the represented amino acid sequence) A partial peptide containing an amino acid sequence in which (for example, 1 to 5) amino acids have been substituted with other amino acids, or an amino acid sequence obtained by combining them, (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 One or two or more (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably a number (eg, 1 to 5) in the 81st to 239th amino acid sequences. ) Amino acid sequence deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, one or more (for example, 1 to 80 amino acids) in the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Preferably, about 1-20, more preferably about 1-9, and still more preferably a number (eg, 1-5) amino acid sequence, the 81st of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 1 to 2 or more (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably a number (eg, 1 to 5) in the amino acid sequence of No. to 239th A partial peptide containing an amino acid sequence in which amino acids are substituted with other amino acids, or an amino acid arrangement obtained by combining these amino acids.
When deleted or substituted as described above, specifically, a peptide having an amino acid sequence obtained by removing the 1st to 82nd amino acids from the amino acid sequence represented by the general formula (I) is preferably used.
[0034]
In addition, the C-terminus of the partial peptide of the present invention is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO). - However, as in the protein of the present invention described above, the C-terminus is an amide (-CONH 2 ) Or ester (—COOR).
Furthermore, the partial peptide of the present invention includes, in the same manner as the above-described protein of the present invention, a peptide in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is in vivo. Glutamyl group cleaved by pyroglutamyl, a peptide whose side chain of amino acid in the molecule is protected with a suitable protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide with a sugar chain attached Etc. are also included.
The partial peptide of the present invention includes the 83rd to 240th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A peptide having the amino acid sequence of the 81st to 239th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is preferred.
As a salt of the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal) is used, and particularly physiologically acceptable. Preferred acid addition salts are: Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the aforementioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method, or a transformant containing a DNA encoding the protein described below. It can also be produced by culturing. Moreover, it can also manufacture according to the protein synthesis method mentioned later or this.
When producing from tissues or cells of humans or warm-blooded animals, homogenize the tissues or cells of humans or warm-blooded animals, and then perform extraction with acid, etc., and extract the extracted solution using reverse-phase chromatography, ion-exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
[0035]
For the synthesis of the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various condensation methods known per se according to the sequence of the target protein. At the end of the reaction, the protein is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein, its partial peptide, or their amides.
[0036]
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOOBt ester. It can later be added to the resin. The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions. For example, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, chloroform, trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, DMF, dimethyl sulfoxide, pyridine, chloroform, dioxane, methylene chloride, tetrahydrofuran, acetonitrile, ethyl acetate, N-methylpyrrolidone or these An appropriate mixture of these is used. The reaction temperature is appropriately selected from the range that can be used for the protein bond-forming reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even if the reaction is repeated, acetylation of the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthalyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, an alkyl ester (for example, an ester group such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl), benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester , 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl ester, phenacin ester, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
[0037]
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include groups derived from carbon such as lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane. Acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4 -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the above 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0038]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain is extended to the desired chain length on the amino group side. A protein from which only the protecting group of the α-amino group at the N-terminus of the peptide chain is removed and a protein from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus has been removed are produced, and both proteins are condensed in a mixed solvent as described above. Let The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method, and the desired crude protein can be obtained. This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide form of the desired protein.
To obtain a protein ester, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein ester is obtained in the same manner as the protein amide. it can.
[0039]
The partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention and the remaining part, and removing the protecting group when the product has a protecting group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(5) Supervised by Haruaki Yajima, Development of follow-up medicines Volume 14 Peptide synthesis Hirokawa Shoten
Further, after the reaction, the protein of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method equivalent thereto, and conversely, when obtained by a salt, a known method or a method equivalent thereto Can be converted to the free form or other salts.
[0040]
The DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the protein of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the aforementioned cells / tissues.
Specifically, examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and (2) SEQ ID NO: : Hybridizes to DNA having the base sequence represented by 4 under highly stringent conditions and has the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, against apoptosis-inducing activity, virus-infected cells, etc.) A DNA encoding a protein having an activity such as a cytotoxic activity) is used.
The DNA capable of hybridizing under high stringency conditions with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. More preferably, DNA containing a base sequence having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
[0041]
Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and (2) represented by SEQ ID NO: 7. A DNA that hybridizes to a DNA having a base sequence under highly stringent conditions and encodes a protein having the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 under highly stringent conditions is, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 Is DNA containing a base sequence having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
Examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the present invention include (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and (2) represented by SEQ ID NO: 10. A DNA that hybridizes to a DNA having a base sequence under highly stringent conditions and encodes a protein having the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is used.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 under highly stringent conditions is, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 Is DNA containing a base sequence having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
[0042]
More specifically, as a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is used. In addition, as a DNA containing a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, for example, represented by SEQ ID NO: 5 [FIG. 1] or SEQ ID NO: 6 [FIG. 2]. DNA having a base sequence that can be used is used.
As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 is used. In addition, as a DNA containing a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 [FIG. 3] or SEQ ID NO: 9 is used. The possessed DNA [FIG. 4] is used.
As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 is used.
[0043]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can be directly amplified by RT-PCR using an mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
Specifically, the 8th to 21st, 55th to 59th (or 54th to 59th), 93th to 102nd, 109th to 116th, 118th to 118th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 126th, 128-134th, 144-149th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 193-213th, 215-219th and 228-239th Examples of DNA encoding a partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the (or 228th to 240th) amino acid sequences include, for example, the 22nd to 63rd and 163rd nucleotide sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. -177th (or 160-177th), 277-306th, 325-348th, 352-378th, third 2-402, 430-447, 484-510, 526-546, 550-567, 577-639, 643-657, and 682-717 (or 682) DNA having at least one base sequence selected from the (˜720th) base sequence is used.
6th to 20th, 53rd to 57th (or 52nd to 57th), 91st to 100th, 107th to 114th, 116th to 124th, 126th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 -132th, 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th and 227-238th (or 227-238) As the DNA encoding the partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the 154 to 171), 271 to 300, 319 to 342, 346 to 372, and 376 to 396. 424th to 441th, 484th to 510th, 526th to 546th, 550th to 567th, 574th to 636th, 640th to 654th, and 678th to 714th (or 678th to 717th) DNA having at least one base sequence selected from the base sequences of
6th to 20th, 53rd to 57th (or 52nd to 57th), 91st to 100th, 107th to 114th, 116th to 124th, 126th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 -132th, 142-147th, 162-170th, 176-182th, 184-189th, 192-212th, 214-218th and 227-238th (or 227-238) DNA encoding a partial peptide having at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the 154 to 171), 271 to 300, 319 to 342, 346 to 372, and 376 to 39. , 424 to 441, 484 to 510, 526 to 546, 550 to 567, 574 to 636, 640 to 654, and 678 to 714 (or 678 to 717) DNA having at least one base sequence selected from the base sequences of
[0044]
In addition, as a DNA encoding a partial peptide having the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, (1) the 247th nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 ~ DNA having the 720th base sequence, (2) hybridizing under high stringency conditions to the DNA having the 247th to 720th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, A partial peptide having the same activity (eg, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity against virus-infected cells, etc.) as the partial peptide having the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by No. 1 Encoding DNA is also used.
Examples of DNA that can hybridize with the 247th to 720th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 under highly stringent conditions include, for example, the 247th position of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. A base sequence having a homology of about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the 720th base sequence. The contained DNA is used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, (1) the 241st to the 241nd nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. DNA having the 717th base sequence, (2) hybridizing to DNA having the 241st to 717th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A DNA encoding a partial peptide having the same quality as the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequences (eg, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity against virus-infected cells, etc.) is also used.
Examples of DNA that can hybridize with the 241st to 717th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 under highly stringent conditions include, for example, the 241st base sequence represented by SEQ ID NO: 7. A base sequence having a homology of about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more with the 717th base sequence The contained DNA is used.
[0045]
Examples of the DNA encoding the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 include, for example, (1) the 241nd to the 241st nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 10. DNA having the 717th base sequence, (2) hybridizing to DNA having the 241st to 717th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 A DNA encoding a partial peptide having the same quality as the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequences (eg, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity against virus-infected cells, etc.) is also used.
Examples of DNA that can hybridize with the 241st to 717th nucleotide sequences of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 under highly stringent conditions include, for example, the 241nd nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10. A base sequence having a homology of about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more with the 717th base sequence The contained DNA is used.
The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
More specifically, the DNA encoding the partial peptide having the 83rd to 240th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the 247th to the 4th base sequence represented by SEQ ID NO: 4. A DNA having the 720th base sequence is used. The DNA encoding the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes the 241st to 717th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7. The DNA having As the DNA encoding the partial peptide having the 81st to 239th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, the 241st to 717th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 are used. The DNA having
[0046]
As a means for cloning of the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the DNA encoding the protein of the present invention is used to obtain the target from the DNA library or the like by PCR. Can be selected by hybridization with DNA labeled with a DNA fragment or synthetic DNA having a part or the entire region of the protein of the present invention. . The hybridization method can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
DNA base sequence conversion (deletion / addition / substitution) can be carried out by using known kits such as Mutan TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) can be used according to a method known per se, such as the Gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
Examples of the expression vector for the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof include (a) cutting out the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention, and (b) using the DNA fragment as an appropriate expression vector. It can be produced by linking to the downstream of the promoter.
[0047]
Examples of vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage In addition to animal viruses such as bacteriophages, retroviruses, vaccinia viruses, and baculoviruses, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, the CMV promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is Bacillus, the promoter, lpp promoter, etc. are SPO1, SPO2, promoter, etc. When the host is yeast, AOX1, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. Is preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0048]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene, ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r And neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like. The dhfr gene confers resistance to methotrexate (MTX), and Neo confers resistance to G418. In particular, when the dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO is used as a selection marker, the target gene can be selected even with a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein. When the host is Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, for example, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc. can be used when the host is an animal cell, such as an MFα signal sequence or SUC2 signal sequence.
A transformant can be produced by introducing a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed into a cell.
[0049]
As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 • DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology] ], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. It is done.
Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). )] Etc. are used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R. - NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71, and the like.
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, silkworm-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vitro, 13, 213-217, (1977)).
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
[0050]
Examples of animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr). - Abbreviated as cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB3T3 cells, Sp-2 cells and the like. Among these, CHO cells, CHO (dhfr - ) Cells, 293 cells, etc. are preferred.
For transforming Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982), and the like.
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of The method can be carried out according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
Insect cells and insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973).
[0051]
Examples of methods for introducing expression vectors into cells include the calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology 52, 456-467 (1973)], and electroporation [Nuemann, E. et al. Embo Journal (EMBO J.) 1, 841-845 (1982)] is used.
In this way, a transformant transformed with an expression vector containing a DNA encoding the protein of the present invention can be obtained.
In addition, as a method for stably expressing the protein of the present invention using animal cells, there is a method of selecting a cell in which the expression vector introduced into the animal cell is incorporated into a chromosome by clone selection. Specifically, transformants can be selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly selecting clones for the animal cells obtained using the selection marker. In addition, when the dhfr gene is used as a selection marker, the MTX concentration is gradually increased and cultured, and by selecting a resistant strain, the DNA encoding the protein of the present invention is amplified in the cell together with the dhfr gene, Furthermore, animal cell lines with high expression can be obtained.
The transformant described above is cultured under conditions that allow expression of the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and the protein of the present invention or the partial peptide thereof is produced and accumulated, whereby the protein of the present invention, its Partial peptides or their salts can be produced.
[0052]
When culturing a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, in order to make the promoter work efficiently, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
[0053]
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of Science. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proceedings of the National -Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an insect cell, as a medium, an additive such as 10% bovine serum that has been immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) Those added as appropriate are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When culturing a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal calf serum [Seience, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Jounal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
In particular, CHO (dhfr - ) When using cells and the dhfr gene as selectable markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal bovine serum that contains little thymidine.
[0054]
Separation and purification of the protein of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. For example, a method of obtaining a crude extract of the protein of the present invention by centrifugation or filtration after destroying cells or cells by the method can be appropriately used. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer, Triton X-100 TM A surfactant such as may be contained.
When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the protein of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used.
When the protein of the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or other salt by a method similar to that.
In addition, the protein of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody.
[0055]
The antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof is polyclonal as long as it is an antibody capable of recognizing the protein of the present invention, the partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention). Either an antibody or a monoclonal antibody may be used.
An antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter abbreviated as the antibody of the present invention) can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using the protein or the like of the present invention as an antigen.
[0056]
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The protein or the like of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or a diluent, at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration can be usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of warm-blooded animals include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, with mice and rats being preferred.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with allogeneic or xenogeneic myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495 (1975)). Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. Preferably, PEG is used.
As myeloma cells, for example, myeloma cells derived from warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc. are used, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be efficiently carried out by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes.
[0057]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as a protein is adsorbed directly or together with a carrier, and then radioactive material is added. An anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or an enzyme (when the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A to detect a monoclonal antibody bound to a solid phase, A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which an immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
[0058]
(B) Purification of monoclonal antibody
Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which only the antibody is collected with an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody. Can do.
[0059]
[Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as protein) and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method, and the polyclonal antibody-containing product of the present invention is collected from the immunized animal. Thus, the antibody can be produced by separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that the antibody is effective against hapten immunized by crosslinking to carrier. As long as it can, what kind of thing may be bridge | crosslinked by what ratio, For example, about 0.1-20, Preferably about 1 with respect to hapten 1 with respect to hapten 1 by weight ratio of bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin etc. A method of coupling at a rate of ˜5 is used.
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
[0060]
The antisense DNA having a base sequence substantially complementary to the DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes the base sequence of DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention or a part thereof. Any antisense DNA may be used as long as it is an oligonucleotide or a derivative thereof having a base sequence substantially complementary to the base sequence and having an action capable of suppressing the expression of the protein or partial peptide.
The base sequence substantially complementary to the DNA or mRNA is, for example, about 40 of the total base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA or mRNA (ie, the complementary strand of the DNA or mRNA). % Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more of a nucleotide sequence. In particular, of the total base sequence of the complementary strand of the DNA or mRNA of the present invention, about 40 of the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, the base sequence near the start codon, etc.) % Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more of the antisense DNA. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
[0061]
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof has, for example, effects such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity against virus-infected cells. Therefore, the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof can be used for various applications.
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the DNA of the present invention). In some cases, the use of an antibody against the protein of the present invention (sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) and antisense DNA will be described.
[0062]
(1) Pharmaceuticals such as therapeutic / preventive agents for various diseases
For example, when there is a patient whose Fas ligand function in cells is not fully or normally exerted because Fas ligand is decreased or lost in vivo, (a) the DNA of the present invention is given to the patient. (B) by inserting the DNA of the present invention into a cell, expressing the protein of the present invention, and the like, and then transplanting the cell into a patient. (C) By administering the protein or the like of the present invention to the patient, the role of the protein or the like of the present invention in the patient can be exhibited sufficiently or normally.
Therefore, the protein and the like of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation, brain tumor, bladder cancer, cervical cancer, Colorectal cancer (colon / rectal cancer), non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, etc.), viral infection (eg, AIDS virus early infection, herpes virus infection, adenovirus infection, box virus infection, varicella-zoster virus infection) , Human papillomavirus infection), Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal hepatitis (eg, hepatitis A, C), nephritis, autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis) Etc.), bone diseases (eg, rheumatoid arthritis (eg, abnormal proliferation of synovial cells in rheumatism)), diseases such as arteriosclerosis, pain, preferably , Cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation), viral infection (eg, early AIDS virus infection, herpes virus infection, adenovirus infection, box virus infection, etc.) It is useful as a pharmaceutical agent for treating or preventing diseases such as hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, and autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis, etc.).
When the DNA of the present invention is used as the above therapeutic / prophylactic agent, the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. Or it can be administered to warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the protein or the like of the present invention is used as the above therapeutic / prophylactic agent, it is preferable to use a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and further preferably 99% or more. preferable.
[0063]
When the protein or the like of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical, for example, it is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., with sugar coating as necessary, or water or other pharmaceuticals It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution with an acceptable liquid or a suspension. For example, in a unit dosage form required for practicing a generally accepted formulation together with a physiologically recognized carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. It can be produced by mixing. The amount of active ingredients in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained. When the DNA of the present invention is used, it can be carried out according to conventional means after inserting the DNA alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80) TM , HCO-50, etc.). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with preservatives (for example, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The adjusted injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
A vector into which the DNA of the present invention has been inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
[0064]
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the protein of the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the protein of the present invention is orally administered for the purpose of cancer treatment, generally an adult (as 60 kg) In this case, the protein or the like is administered at about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, the target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the protein etc. As for administration, the protein and the like are administered by injecting about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg into the affected area per day. It is convenient to do. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0065]
(2) Gene diagnostic agent
By using the DNA of the present invention as a probe, the present invention in humans or warm-blooded mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.) An abnormality (gene abnormality) of DNA encoding the protein or its partial peptide can be detected. Therefore, the DNA of the present invention is useful as a genetic diagnostic agent for various diseases involving the protein of the present invention.
For example, when it is detected that the mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof is increased or the expression of the protein is increased, for example, AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease) , Amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration, etc., myelodysplastic diseases (eg, aplastic anemia), ischemic diseases (eg, myocardial infarction, stroke, etc.), joint tissues in rheumatism Destruction, inflammation, hepatitis (eg, fulminant hepatitis), autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (Eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), diseases such as influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, especially AIDS, rheu Destruction of articular tissues in Ji, inflammation, hepatitis, it can be diagnosed that it is highly likely that a disease such as autoimmune disease or diseased.
On the other hand, when it is detected that the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide is damaged, deleted, or decreased in protein expression, for example, cancer, viral infection, Helicobacter pylori It can be diagnosed as a disease such as infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmune disease and the like.
The above gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processings of. The National Academy of Sciences of USA (Proceedings of the Natinal Academy of Sciences of the United States of America), Vol. 86, 2766-2770 (1989)).
For example, if excessive expression of the mRNA is detected by Northern hybridization, for example, AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic disease, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease Diseases such as cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, especially joint tissue destruction in AIDS, rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease or the future It can be diagnosed that there is a high possibility of being affected.
On the other hand, when a decrease in the expression of the mRNA is detected by Northern hybridization, for example, cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmunity It can be diagnosed that it is a disease such as a sexually transmitted disease or is likely to be affected in the future.
When a DNA mutation is detected by the CR-SSCP method, for example, cancer, viral infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmune disease, AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplasia Disease, ischemic disease, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, etc. or likely to suffer in the future Can be diagnosed.
[0066]
(3) Quantification of the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention and the like, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) Competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and the labeled protein of the present invention, and measuring the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody. A method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test liquid, and
(Ii) The test solution and the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention are reacted simultaneously or successively, and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. A method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test solution is provided.
In the quantification method (ii) above, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the protein of the present invention. desirable.
[0067]
In addition to quantification of the protein of the present invention using a monoclonal antibody (hereinafter sometimes referred to as a monoclonal antibody) against the protein of the present invention, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) of the antibody molecule. 2 , Fab ′, or Fab fractions may be used.
The method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, the amount of protein) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by a chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. Examples of radioisotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ Three H], [ 14 C] and the like are preferably stable and large in specific activity, such as β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, and the like, Fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like, and as the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
[0068]
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, react the test solution with the insolubilized monoclonal antibody (primary reaction), react with the labeled monoclonal antibody (secondary reaction), and then measure the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. Thus, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site for the protein of the present invention. It is done. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody used in the primary reaction when, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of the protein of the present invention. For example, an antibody that recognizes the N end other than the C end is used.
[0069]
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( B / F separation), the labeled amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble one is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
[0070]
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system, such as protein of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continue Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid. )) (From Academic Press ) And the like can be referred to.
As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
[0071]
Furthermore, various diseases involving the protein of the present invention can be diagnosed by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention.
For example, when a decrease in the concentration of the protein or the like of the present invention is detected, it is a disease such as cancer, viral infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmune disease, or will be affected in the future. Can be diagnosed as likely.
On the other hand, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic disease, joint tissue destruction in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease Diseases such as cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, especially joint tissue destruction, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases in AIDS and rheumatism Or can be diagnosed as likely to be affected in the future.
Thus, the antibody of the present invention is useful as a diagnostic agent for the above diseases.
In addition, the antibody of the present invention can be used to detect the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. Furthermore, it is used for the production of the antibody column used for purifying the protein of the present invention, the detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, the detection of the behavior of the protein in the test cell, etc. can do.
[0072]
(4) Medicament containing the antibody of the present invention
Among the antibodies of the present invention, antibodies capable of neutralizing the activity of the protein of the present invention include, for example, AIDS, neurodegenerative diseases, myelodysplastic diseases, ischemic diseases, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, Hepatitis, autoimmune diseases, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis and other diseases, especially AIDS, joint tissue destruction in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmunity It can be used as a medicine such as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as diseases.
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, Dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. For example, when used for treatment / prevention of AIDS in adults, the dose of the antibody of the present invention is usually 0 About 0.01-20 mg / kg body weight, preferably about 0.1-10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1-5 mg / kg body weight, about 1-5 times a day, preferably 1-3 times a day It is convenient to administer about several times by intravenous injection. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules). Syrups, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
[0073]
As a composition for parenteral administration, for example, an injection, a suppository and the like are used, and the injection is a dosage form such as an intravenous injection, a subcutaneous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection, or an infusion. Is included. Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-described antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and appropriate solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with a normal suppository base.
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for injections, for each dosage unit dosage form. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
[0074]
(5) Screening for drug candidate compounds
(A) Screening method for compounds that change the binding between the protein of the present invention and the receptor
Since the protein of the present invention can specifically bind to a receptor belonging to the TNF receptor family (hereinafter abbreviated as receptor), a ligand / receptor binding assay system using the protein of the present invention and the receptor is provided. By constructing, screening of drug candidate compounds having the same action as the TNF ligand family (for example, TNF, lymphotoxin-α, lymphotoxin-β, Fas ligand, nerve growth factor, etc.) and the action of the protein of the present invention, etc. Screening for drug candidate compounds to inhibit can be performed. That is, the present invention provides a screening method for a compound that changes the binding property of the protein of the present invention and the receptor using the protein of the present invention.
Such compounds that change the binding property of the protein of the present invention and the receptor include (i) cell stimulating activity via the receptor (for example, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or suppress pH reduction, etc.), A compound having an activity such as apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity (so-called agonist), (b) a compound having no activity such as cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity (so-called antagonist), (c) the present invention (D) a compound that decreases the binding force between the protein of the present invention and the receptor, etc. It is preferable to screen by a ligand determination method).
[0075]
That is, the present invention
(1) (i) Comparison of the case where the protein of the present invention is brought into contact with the receptor or its partial peptide and (ii) the case where the protein of the present invention and a test compound are brought into contact with the receptor or its partial peptide A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property of the protein or the like of the present invention to a receptor,
(2) (i) When the protein of the present invention is brought into contact with a cell containing the receptor or a cell membrane fraction thereof, and (ii) The protein of the present invention is added to the cell containing the receptor or the cell membrane fraction thereof, and A method for screening a compound or its salt that changes the binding property of the protein or the like of the present invention to a receptor, which is compared with a case where a test compound is contacted; and
(3) When (i) a cell containing a receptor or a cell membrane fraction thereof is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof; and (ii) a cell containing the receptor or a cell membrane fraction thereof. Or a compound containing the protein of the present invention, or a cell membrane fraction thereof, and a test compound, which is compared with the test compound. Methods for screening for the salts are provided.
[0076]
Specifically, in the screening method of the present invention, in the cases (i) and (ii), for example, the binding amount of the protein of the present invention to a receptor or a cell containing the receptor, apoptosis-inducing activity, cytotoxicity It is characterized by measuring and comparing activities such as activity.
More specifically, the present invention provides:
(1a) (i) When a labeled peptide or the like of the present invention is brought into contact with a receptor or a partial peptide thereof; and (ii) A labeled protein or the like of the present invention and a test compound are brought into contact with the receptor or a partial peptide thereof. The amount of binding of the labeled protein of the present invention to the receptor or a partial peptide thereof or a salt thereof is measured and compared, and the binding property between the protein of the present invention and the receptor is measured. A method for screening a compound to be changed or a salt thereof, (2a) (i) a case where a labeled protein of the present invention is brought into contact with a cell containing a receptor or a cell membrane fraction thereof; Standards when a protein or the like and a test compound are contacted with a cell containing a receptor or a cell membrane fraction thereof. Screening for a compound or its salt that changes the binding property of the protein or the like of the present invention to a receptor, characterized by measuring the amount of binding of the identified protein or the like of the present invention to the cell or its cell membrane fraction Method,
(2b) (i) a receptor when the protein of the present invention is contacted with a cell containing the receptor, and (ii) a receptor when the protein of the present invention and a test compound are contacted with a cell containing the receptor Cell stimulating activity (eg, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property of the protein or the like of the present invention to a receptor, which comprises measuring and comparing activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity. ,
[0077]
(3a) (i) a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof in contact with a cell containing a receptor; (ii) a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof; When a test compound is brought into contact with a receptor-containing cell, cell-stimulating activity via the receptor (for example, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property of the protein or the like of the present invention to a receptor, which comprises measuring and comparing activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity. I will provide a.
In the screening method of (1a) or (2a) above, a compound that binds to a receptor and inhibits the binding between the protein of the present invention and the receptor changes the binding property between the protein of the present invention and the receptor. It can be selected as a compound.
In the screening method of (2b) or (3a) above, cell binding activity via the receptor (eg, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. Or a compound having an activity such as apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity can be selected as a receptor agonist, while it binds to a receptor, but has an activity such as cell-stimulating activity or apoptosis-inducing activity. Compounds that do not have can be selected as receptor antagonists.
In addition, in the screening method of (1a) or (2a) above, a compound having the apoptosis-inducing activity or the like among the test compounds recognized to have the activity of changing the binding property between the protein of the present invention and the receptor. A compound that can be selected as a receptor agonist and does not have the apoptosis-inducing activity or the like can be selected as a receptor antagonist.
[0078]
The receptor used in the screening method of the present invention may be any receptor that can bind to the protein of the present invention. For example, a receptor belonging to the TNF receptor family or a receptor for the protein of the present invention is used. . Examples of receptors belonging to the TNF receptor family include TNF receptor (55 kDa: Cell 61, p351-359, 1990; 75 kDa: Science 248, 1019-1023, 1990), lymphotoxin-β receptor, Fas ( Cell 66, p233-243, 1991), CD27 (The Journal of Immunology 147, p3165-3169, 1991), CD30 (Cell 68, p421-427, 1992) ), CD40 (The EMBO Journal 8, p1403-1410, 1989), OX40 (European Journal Immunology 24/3, p677-683, 1994), DR4 (Science ( Science) 276, 111-113, 1997), DR3 / WSL-1 (NATURE 384, 372-375, 1996; Science 274, 990-992, 1996), TR2 (The Journal of Bio Radical chemistry (The Journal of Biological Chemistry) 272, p14272-14276, 1997) and the like can be used.
These receptors and the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to per se known protein purification methods, and after cloning the DNA encoding the receptor according to per se known genetic engineering techniques, the above-described methods are used. The target receptor can also be obtained according to the expression method of the protein or the like of the present invention.
As the partial peptide of the receptor, a partial peptide obtained by appropriately cleaving the full-length receptor can be used.
Examples of the labeled protein of the present invention include, for example, [ Three H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 The protein of the present invention labeled with S] or the like can be used.
[0079]
As the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention, the same cells as listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. CHO cells are preferred.
Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention. In addition, as a cell containing the above receptor, Jurkat cell line, U937 cell line (the above-mentioned THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 271, 12691-12694, 1996)), HepG2 cell line A cell line such as a THP-1 cell line can also be used.
As cells containing the protein of the present invention used in the screening method of the present invention, the same cells as those listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. Of these, CHO cells are preferred. Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
In the screening method of the present invention, when a cell containing a receptor or a cell containing the protein of the present invention is used, the cell can be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. Moreover, as a tissue containing the protein of the present invention, livers, spleens, etc. of various animals or their membrane fractions can be used.
[0080]
The cell membrane fraction of the cell containing the receptor or the cell containing the protein of the present invention refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after disrupting the cell. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing by causing them to occur. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of the expressed receptor or the protein of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of the receptor in the cell containing the receptor and its membrane fraction is 10 per cell. Three -10 8 Preferably it is a molecule. Five -10 7 It is preferably a molecule. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .
[0081]
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and these compounds are novel compounds. It may be a known compound.
In the screening method of the present invention, the reaction between the protein of the present invention and the receptor can be usually carried out at about 37 ° C. for several hours (for example, 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours).
Specifically, in order to carry out the above screening method (1a) or (2a), first, a receptor-containing cell or a cell membrane fraction thereof, or a receptor or a partial peptide thereof is used as a buffer suitable for screening. A receptor preparation is prepared by suspending. As the buffer, any buffer that does not inhibit the binding between the protein of the present invention and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a Tris-HCl buffer. Good. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), surfactants such as digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, bacitracin, aprotinin, E-64 (manufactured by Protein Research Institute), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by protease. On the other hand, when the cell is an immobilized cell, the protein of the present invention and the receptor can be immobilized with the cell immobilized, that is, in a state where the cell is grown, or using a cell fixed with glutaraldehyde or paraformaldehyde. Can be combined.
[0082]
In this case, a medium or Hanks' solution is used as the buffer solution. Then, 0.01 to 10 ml of the receptor solution is labeled with a certain amount (for example, about 10,000 cpm to 1000000 cpm in the case of 2000 Ci / mmol) of the labeled protein of the present invention (for example, [ 125 I] and the like, and the like. -Four M-10 -Ten M test compound is allowed to coexist. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled protein of the present invention is added is also prepared. The reaction is carried out at 0 ° C. to 50 ° C., preferably 4 ° C. to 37 ° C. for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the solution is filtered through glass fiber filter paper, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper (for example, [ 125 The amount of I] is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. For filtration, a manifold or a cell harvester can be used, but it is desirable to use a cell harvester in order to increase efficiency. Count when there is no antagonist (B 0 ) Minus non-specific binding (NSB) (B 0 -NSB) is defined as 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, counted (B 0 A test compound that is 50% or less of -NSB) can be selected as an agonist or antagonist candidate compound.
[0083]
Further, in order to carry out the screening method of (2b) or (3a) above, cell stimulation activity (for example, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. Activity), apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity and the like can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
Specifically, first, cells containing the receptor are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate Each product is quantified according to a method known per se. When the production of a substance (for example, arachidonic acid, etc.) used as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production inhibitory action on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
[0084]
Apoptosis is, for example, cell shrinkage, chromatin condensation, nuclear concentration, loss of cell surface microvilli, blebbing, formation of apoptotic bodies, gaps with surrounding cells due to cell shrinkage, removal of prey by neighboring cells (Japanese Clinical, Vol. 54, No. 7 (1996)).
Apoptosis-inducing activity is measured, for example, by conducting morphological analysis or biochemical analysis of apoptosis according to the Cell Engineering Separate Volume Experimental Protocol Series, Apoptosis Experiment Protocol (published on December 20, 1994, Shujunsha), etc. be able to. Examples of morphological analysis of apoptosis include observation of apoptosis with an optical microscope (eg, observation with a phase-contrast microscope, observation of floating or adherent cells with dye staining, observation of cell morphology such as observation with fluorescence staining, paraffin section observation) Preparation, observation of tissue morphology such as preparation of hematoxylin / eosin-stained specimens, etc.), observation of apoptosis with an electron microscope (eg, preparation of slices, electron staining, etc.), and the like. Examples of biochemical analysis methods for apoptosis include DNA fragmentation analysis (eg, agarose gel electrophoresis method), cell death determination method (eg, crystal violet method, MTT method, LDH method). It is done.
Cytotoxic activity can be measured according to a method such as Rouvier E. (Journal of Experimental Medicine) 177, 195-200, 1993 Year).
In the screening method of (2b) or (3a) above, when a test compound is added and the cell containing the receptor undergoes apoptosis, cytotoxicity, etc., the test compound can be selected as a receptor agonist candidate compound. . On the other hand, when apoptosis or cytotoxicity of cells containing the receptor is suppressed when the test compound is added, the test compound can be selected as a receptor antagonist candidate compound.
[0085]
The screening kit of the present invention contains the protein of the present invention and the like, preferably further contains cells containing the receptor or cell membrane fractions thereof.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
[Reagent for screening]
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) Receptor preparation
CHO cells containing a receptor for the protein of the present invention or a TNF receptor are placed in a 12-well plate at 5 × 10 5. Five Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO 2 Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Labeled protein preparation of the present invention
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof [ Three H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 Labeled with S].
(4) Standard solution for protein of the present invention
The protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof is dissolved to 0.1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0086]
[Measurement method]
{Circle around (1)} CHO cells containing a recombinant receptor cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
▲ 2 ▼ 10 -3 -10 -Ten After adding 5 μl of the test compound solution of M, 5 μl of 5 nM of the labeled protein of the present invention is added and reacted at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, instead of the test compound, 10 -Four Add 5 μl of M protein of the present invention.
(3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled protein of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.5 ml of 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
{Circle around (4)} Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation [Formula 1]. In addition, [ 125 When labeled with I], it can be measured directly with a gamma counter without mixing with a liquid scintillator.
[0087]
[Expression 1]
Figure 0004090092
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific binding
B 0 : Maximum binding amount
[0088]
As described above, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening for a compound that changes the binding property between the present protein and the receptor.
The compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the binding property of the protein or the like of the present invention to the receptor. (B) a compound having no action such as cell stimulation activity, apoptosis induction activity, cytotoxic activity (so-called agonist), (b) a compound having action such as cell stimulation activity, apoptosis induction activity, cytotoxic activity via An antagonist), (c) a compound that enhances the binding force between the protein of the present invention and the receptor, or (d) a compound that decreases the binding force between the protein of the present invention and the receptor.
The compound is obtained from the aforementioned test compound (eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.), These compounds may be novel compounds or known compounds.
[0089]
Since the receptor agonist has all or part of the physiological activity of the protein of the present invention, it is useful as a safe and low toxic pharmaceutical according to the physiological activity. For example, cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation, brain tumor, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer (colon / rectal cancer), non-small cell lung cancer, Small cell lung cancer, stomach cancer, etc.), viral infection (eg, AIDS virus early infection, herpes virus infection, adenovirus infection, box virus infection, varicella-zoster virus infection, human papillomavirus infection, etc.), Helicobacter pylori infection, invasiveness Staphylococcal infection, hepatitis (eg, hepatitis A, hepatitis C, etc.), nephritis, autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis, etc.), bone disease (eg, rheumatoid arthritis (eg, Diseases such as arteriosclerosis, pain, preferably cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, p) Cancer with 53 mutations), viral infection (eg, early AIDS virus infection, herpes virus infection, adenovirus infection, box virus infection, etc.), hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmune disease (eg, It is useful as a medicament for preventing and treating diseases such as systemic lupus erythematosus and immune-related glomerulonephritis).
Since the receptor antagonist can suppress all or part of the physiological activity of the protein of the present invention and the like, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that suppresses the physiological activity. For example, AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration), myelodysplastic diseases (eg, aplastic anemia), ischemic Disease (eg, myocardial infarction, stroke, etc.), destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis (eg, fulminant hepatitis), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), cardiomyopathy (Eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis It is useful as a medicament for preventing and treating diseases such as AIDS, destruction of joint tissues in rheumatism, diseases such as inflammation, hepatitis, and autoimmune diseases.
[0090]
The compound that enhances the binding force between the protein and the like of the present invention and the receptor is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for enhancing the physiological activity of the protein and the like of the present invention. The compound is similar to the above agonist, for example, diseases such as cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, autoimmune disease, bone disease, arteriosclerosis, pain, etc. It is useful as a medicine such as a therapeutic / preventive agent.
The compound that decreases the binding force between the protein and the like of the present invention and the receptor is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for decreasing the physiological activity of the protein and the like of the present invention. The compound is similar to the above antagonist, for example, AIDS, neurodegenerative diseases, myelodysplastic diseases, ischemic diseases, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases, cardiomyopathy, diabetes, diabetic It is useful as a medicine for treating and preventing complications, diseases such as influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis and the like.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound includes a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal). In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
[0091]
When the compound is used as a therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases, it can be formulated and used in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention described above.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). .
The dose of the compound obtained by the above screening or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the receptor agonist is administered orally for the purpose of cancer treatment, In a body weight of 60 kg, the agonist is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the agonist varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the agonist is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, it is convenient to administer the agonist by intravenous injection in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
When the receptor antagonist is orally administered for the purpose of treating AIDS, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the antagonist is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg per day, More preferably, about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the antagonist varies depending on the subject of administration, target disease, etc. For example, for the purpose of AIDS treatment, the antagonist is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, the antagonist is conveniently administered by intravenous injection in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0092]
In addition, when a compound that enhances physiological activity such as the protein of the present invention is orally administered for the purpose of cancer treatment, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg per day, Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the compound is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, it is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
In addition, when orally administering a compound that decreases the physiological activity such as the protein of the present invention for the purpose of AIDS treatment, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg per day, Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of AIDS treatment, the compound is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, it is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0093]
(B) Screening method and screening kit for compounds that promote or inhibit the activity of proteinase that degrades the protein of the present invention
The protein of the present invention or a salt thereof is a membrane-bound protein, and (i) remains bound to the membrane, or (ii) the membrane-bound site is cleaved by a proteinase present in the living body, and the extracellular portion is released, and the receptor It is thought that the function is demonstrated by combining with. Therefore, by using the protein of the present invention and the proteinase that degrades the protein of the present invention, a compound having an activity of promoting or inhibiting the activity of the proteinase that degrades the protein of the present invention can be selected.
The compound having the activity of promoting the activity of the proteinase may promote the activity of the protein of the invention that does not depend on cell-cell contact by promoting the release of extracellular components such as the protein of the invention in vivo. Because, for example, cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, autoimmune disease, bone disease, arteriosclerosis, pain, etc. Expected as a medicine.
On the other hand, a compound having an activity that inhibits the activity of the proteinase inhibits the activity of the protein of the invention that does not depend on cell-cell contact by inhibiting the release of the extracellular portion of the protein of the invention in the living body. Can, for example, AIDS, neurodegenerative diseases, myelodysplastic diseases, ischemic diseases, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection It can be expected to be used as a medicine for preventing and treating diseases such as glomerulonephritis and ulcerative colitis, especially diseases such as joint tissue destruction, inflammation, hepatitis, and autoimmune diseases in AIDS and rheumatism.
That is, this invention provides the screening method of the compound which has the activity which promotes or inhibits the activity of the proteinase which decomposes | disassembles the protein of this invention characterized by using the protein of this invention, etc., or its salt.
[0094]
More specifically, the present invention provides:
(1) (i) Proteinase that degrades the protein of the present invention (provided that a cell containing the protein of the present invention produces or secretes an extracellular proteinase having the activity of degrading the protein of the present invention) A culture supernatant obtained by culturing a cell containing the protein of the present invention in the presence of the extracellular proteinase produced and secreted by the cell containing the receptor; and (ii) A comparison between a culture supernatant obtained by culturing cells containing the protein of the present invention in the presence of the proteinase and the test compound and cells containing the receptor. Provided is a screening method for a compound having an activity of promoting or inhibiting the activity of a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof. .
Specifically, in the screening method of the present invention, in the cases of (i) and (ii), for example, cell stimulating activity via a receptor, apoptosis or cytotoxicity of a cell containing the receptor are measured (observed). And comparing.
More specifically, the present invention provides:
(1a) (i) a proteinase that degrades the protein of the present invention (in the case where a cell containing the protein of the present invention produces and secretes an extracellular proteinase having an activity of degrading the protein of the present invention) A culture supernatant obtained by culturing a cell containing the protein of the present invention in the presence of the extracellular proteinase produced and secreted by the cell containing the receptor; and (ii) ) Proteinase that degrades the protein of the present invention (however, when a cell containing the protein of the present invention produces and secretes an extracellular proteinase having an activity of degrading the protein of the present invention, the cell produces and secretes it) Obtained by culturing cells containing the protein of the present invention in the presence of the test compound. And Youe Qing, in the case of contacting the cell containing the receptor, cell stimulating activity via the receptor (e.g., promoting DNA synthesis, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. Or a suppressive activity, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity, and the like, and a compound or salt thereof having an activity to promote or inhibit the activity of a proteinase that degrades the protein of the present invention A screening method is provided.
[0095]
In the above screening method, cell stimulating activity via receptors (for example, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. A test compound that suppresses activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity may be selected as a compound having an activity that promotes or inhibits the activity of the proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof. it can.
The receptor used in the screening method of the present invention may be any receptor as long as it can bind to the protein of the present invention. For example, the receptor belonging to the TNF receptor family and the receptor of the protein of the present invention. Is used. Examples of the receptor belonging to the TNF receptor family include the TNF receptor (55 kDa or 75 kDa), lymphotoxin-β receptor, Fas, CD27, CD30, CD40, OX40, DR4, DR3 / WSL-1, TR2, and the like.
These receptors and the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to per se known protein purification methods, and after cloning the DNA encoding the receptor according to per se known genetic engineering techniques, the above-described methods are used. The target receptor can also be obtained according to the expression method of the protein or the like of the present invention.
Examples of proteinases that degrade the protein of the present invention include matrix metalloproteinases (eg, MMP-1, MMP-2, MMP-3, etc.), adamalisins (adamalysins or ADAMS) (eg, TNF-α converting enzyme (TACE). ) Etc.) are used.
[0096]
As the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention, the same cells as listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. CHO cells are preferred. Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention. In addition, cell lines such as Jurkat cell line, U937 cell line, HepG2 cell line, and THP-1 cell line can also be used as cells containing the receptor.
As the cells containing the protein of the present invention used in the screening method of the present invention, the same cells as those listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. However, CHO cells are preferred. Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
[0097]
In the screening method of the present invention, when cells containing the protein of the present invention are used, the cells can be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. Moreover, as a tissue containing the protein of the present invention, livers, spleens and the like of various animals or their membrane fractions can be used.
As the cell membrane fraction of cells containing the protein of the present invention, the same ones as described above can be used.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc., and these compounds are novel compounds. It may also be a known compound.
In the screening method of the present invention, cells containing the protein of the present invention in the presence of proteinase are usually cultured for several hours (eg, about 0.5 to 24 hours, preferably about 1 to 6 hours) at about 37 ° C. Can be done. In addition, the reaction between the culture supernatant obtained in this culture and the cell containing the receptor is usually performed at about 37 ° C. for several hours (eg, about 0.5 to 24 hours, preferably about 1 to 6 hours). Can do.
Measurements of cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity, etc. via the receptor can be performed in the same manner as described above.
[0098]
The screening kit of the present invention contains a protein containing the protein of the present invention and a proteinase that degrades the protein of the present invention, preferably a cell containing a receptor.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
[Reagent for screening]
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) Receptor preparation
CHO cells containing a receptor for the protein of the present invention or a TNF receptor are placed in a 12-well plate at 5 × 10 5. Five Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO 2 Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Protein preparation of the present invention
Cells containing the protein of the present invention
(4) Proteinase preparation that degrades the protein of the present invention
Matrix metalloproteinase (However, this is unnecessary when cells containing the protein of the present invention produce and secrete extracellular proteinase having the activity of degrading the protein of the present invention.)
[0099]
[Measurement method]
(1) Proteinase that degrades the protein of the present invention (However, when a cell containing the protein of the present invention produces and secretes an extracellular proteinase having the activity of degrading the protein of the present invention, Cells containing the protein of the present invention are cultured for several hours at about 37 ° C. in the presence of the secreted extracellular proteinase) to obtain a culture supernatant.
(2) Cells containing the protein of the present invention in the presence of the proteinase and test compound are cultured at about 37 ° C. for several hours to obtain a culture supernatant.
(3) The culture supernatant obtained in (1) and (2) above is cultured for several hours at about 37 ° C. with cells containing the receptor for the protein of the present invention.
(4) Next, the apoptosis-inducing activity is measured according to the method described in the cell engineering separate volume experimental protocol series, apoptosis test protocol (issued on December 20, 1994, Shujunsha).
[0100]
As described above, the protein or the like of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof having an activity of promoting or inhibiting the activity of the proteinase that degrades the protein of the present invention.
The compound obtained by the above screening method may form a salt, and as the salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or salt (eg, alkali metal), etc. And physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
Since the compound that promotes the activity of the proteinase that degrades the protein of the present invention obtained using the screening method or screening kit of the present invention promotes the release / release of the extracellular portion of the protein of the present invention by the proteinase, It can promote activities such as cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity, and cytotoxic activity via the receptor for the protein of the present invention independent of cell-cell contact, such as cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasiveness It is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical such as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, autoimmune disease, bone disease, arteriosclerosis and pain.
On the other hand, the compound that inhibits the activity of the proteinase that degrades the protein of the present invention using the screening method or screening kit of the present invention inhibits the release / release of the extracellular portion of the protein of the present invention by the proteinase. It is possible to suppress cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity, etc. through the receptor for the protein of the present invention that does not depend on cell-cell contact, such as AIDS, neurodegenerative disease, myelodysplastic disease, ischemic Diseases, destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis, autoimmune disease, cardiomyopathy, diabetes, diabetic complications, influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, especially joints in AIDS, rheumatism It is a preventive / therapeutic agent for diseases such as tissue destruction, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases It is useful as safe and low toxic pharmaceuticals.
When the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention described above, tablets, capsules, elixirs are used. , Microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). .
[0101]
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, a compound that promotes the activity of a proteinase that degrades the protein of the present invention for the purpose of cancer treatment is orally administered. In general, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the compound is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, it is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, when a compound that inhibits the activity of a proteinase that degrades the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating an autoimmune disease, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is reduced to about 0 per day. 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of treating an autoimmune disease, the compound is usually administered in the form of an injection (60 kg). The compound is administered at about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection per day. It is. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0102]
(C) Screening method for compound or salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of protein or the like of the present invention and receptor
Since the protein of the present invention can specifically bind to a receptor belonging to the TNF receptor family (hereinafter abbreviated as receptor) or a receptor for the protein of the present invention, the protein of the present invention and the receptor are used. By constructing a ligand / receptor binding assay system, a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after the protein of the present invention binds to the receptor can be screened.
That is, the present invention provides a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention and a receptor, characterized by using the protein or the like of the present invention.
More specifically, the present invention provides:
(1) Comparison between the case where (i) the receptor-containing cell is contacted with the protein of the present invention and the case where (ii) the receptor-containing cell is contacted with the protein of the present invention and a test compound A method of cleaning a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention and the receptor to the receptor, and
(2) (i) When a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof is brought into contact with a cell containing the receptor, and (ii) A cell containing the protein of the present invention in a cell containing the receptor Or screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention to a receptor, wherein the cell membrane fraction and a test compound are contacted Provide a method.
[0103]
Specifically, in the screening method of the present invention, in the cases of (i) and (ii), for example, intracellular signal transduction after the binding of the protein of the present invention and the receptor is measured and compared. It is characterized by.
More specifically, the present invention provides:
(1a) (i) a receptor when the protein of the present invention is brought into contact with a cell containing the receptor, and (ii) a receptor when the protein of the present invention and a test compound are brought into contact with a cell containing the receptor Cell stimulating activity (eg, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. A compound that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention to a receptor, characterized by measuring and comparing activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity. Or a screening method thereof, and
(2a) (i) a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof in contact with a cell containing a receptor; (ii) a cell containing the protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof; When a test compound is brought into contact with a receptor-containing cell, cell-stimulating activity via the receptor (for example, DNA synthesis promotion, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Activity to promote concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cell migration activity, etc. A compound that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention to a receptor, characterized by measuring and comparing activities such as apoptosis-inducing activity and cytotoxic activity. Alternatively, a method for screening a salt thereof is provided.
[0104]
In the screening method of (1a) or (2a) above, the binding of the protein of the present invention and the receptor is not inhibited, and the activity such as cell stimulating activity, apoptosis inducing activity and cytotoxic activity via the receptor is promoted. The compound can be selected as a compound or a salt thereof that promotes intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention and the receptor. On the other hand, a compound that does not inhibit the binding of the protein or the like of the present invention to the receptor but has the activity of inhibiting the cell stimulating activity, apoptosis-inducing activity or the like is treated with the cell after the binding of the protein or the like of the present invention to the receptor. It can be selected as a compound that inhibits internal signal transduction or a salt thereof.
That is, since this screening method is a method of selecting a compound that does not affect the binding between the protein of the present invention and the receptor and regulates (promotes or suppresses) intracellular signal transduction after receptor binding, As the test compound used in the above, it is desirable to use a compound that was not selected as a receptor agonist or antagonist in the above-described screening method for receptor agonist / antagonist.
[0105]
The receptor used in the screening method of the present invention may be any receptor to which the protein of the present invention can bind, for example, a receptor belonging to the TNF receptor family or a receptor for the protein of the present invention. Examples of the receptor belonging to the TNF receptor family include the TNF receptor (55 kDa or 75 kDa), lymphotoxin-β receptor, Fas, CD27, CD30, CD40, OX40, DR4, DR3 / WSL-1, TR2, and the like.
These receptors and the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to per se known protein purification methods, and after cloning the DNA encoding the receptor according to per se known genetic engineering techniques, the above-described methods are used. The target receptor can also be obtained according to the expression method of the protein or the like of the present invention.
As the partial peptide of the receptor, a partial peptide obtained by appropriately cleaving the full-length receptor can be used.
As the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention, the same cells as listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. CHO cells are preferred. Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention. Moreover, as a cell containing the said receptor, cell lines, such as a Jurkat cell line, U937 cell line, HepG2 cell line, THP-1 cell line, can also be used, for example.
[0106]
As the cells containing the protein of the present invention used in the screening method of the present invention, the same cells as those listed above as host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. However, CHO cells are preferred. Cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
In the screening method of the present invention, when a cell containing a receptor or a cell containing the protein of the present invention is used, the cell can be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. Moreover, as a tissue containing the protein of the present invention, livers, spleens and the like of various animals or their membrane fractions can be used.
As the cell membrane fraction of the cell containing the receptor or the cell containing the protein of the present invention, the same as described above can be used.
Examples of the test compound include proteins, proteins, non-protein compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
In the screening method of the present invention, the reaction between the protein of the present invention and a cell containing a receptor can be usually carried out at about 37 ° C. for several hours.
In the screening method of (1a) or (2a) above, measurement of the cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity, etc. via the receptor can be performed in the same manner as described above.
In the screening method of (1a) or (2a) above, when a test compound is added and cell stimulation activity, apoptosis-inducing activity, cytotoxic activity, etc. mediated by the receptor are promoted, the test compound is bound to the receptor after binding. It can be selected as a compound or a salt thereof that promotes intracellular signal transduction. On the other hand, when a test compound is added and cell stimulation activity, apoptosis induction activity, cytotoxic activity, etc. mediated by the receptor are inhibited, the test compound is a compound that inhibits intracellular signal transduction after receptor binding or its It can be selected as a salt compound.
[0107]
The screening kit of the present invention contains the protein or the like of the present invention, preferably further containing cells containing a receptor.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
[Reagent for screening]
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) Receptor preparation
CHO cells containing a receptor for the protein of the present invention or a TNF receptor are placed in a 12-well plate at 5 × 10 5. Five Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO 2 Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Protein preparation of the present invention
Protein of the present invention, partial peptide thereof or salt thereof
[Measurement method]
Apoptosis-inducing activity is measured according to the method described in the separate cell engineering experiment protocol series, apoptosis experiment protocol (issued on December 20, 1994, Shujunsha).
[0108]
As described above, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after receptor binding.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal), etc. And physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
A compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used for intracellular signal transduction after the binding of the protein of the present invention and the receptor, specifically, cell stimulating activity via the receptor, It is a compound or a salt thereof that promotes an activity such as apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity, or a compound or a salt thereof that inhibits such an activity such as cell-stimulating activity, apoptosis-inducing activity or cytotoxic activity.
The compound or its salt that promotes intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention to a receptor is, for example, cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation) , Brain tumor, bladder cancer, cervical cancer, colon cancer (colon / rectal cancer), non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, etc., virus infection (eg, early AIDS virus infection, herpes virus infection, adenovirus infection) , Box virus infection, varicella-zoster virus infection, human papilloma virus infection, etc.), Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis (eg, hepatitis A, hepatitis C, etc.), nephritis, autoimmune disease (Eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), bone disease (eg, rheumatoid arthritis (eg, destruction of joint tissue in rheumatism)), Prevention or prevention of diseases such as arteriosclerosis and pain, preferably cancer, viral infection, Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, autoimmune disease, etc. It is useful as a safe and low toxic pharmaceutical such as a therapeutic agent.
[0109]
The compound or its salt that inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein or the like of the present invention to a receptor is exemplified by AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, pigment) Retinitis, cerebellar degeneration, etc., myelodysplastic diseases (eg, aplastic anemia), ischemic diseases (eg, myocardial infarction, stroke, etc.), joint tissue destruction, inflammation, hepatitis (eg, play) in rheumatism Hepatitis), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (eg, diabetic complications, diabetic) Diseases such as nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, preferably joint tissue destruction, inflammation, for example, AIDS, rheumatism , Hepatitis, are useful as safe and low toxic pharmaceuticals such as prophylactic or therapeutic agent for diseases such as autoimmune diseases.
When the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention described above, tablets, capsules, elixirs are used. , Microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). .
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., but, for example, promotes intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention to the receptor for the purpose of cancer treatment. When the compound to be administered is orally administered, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, intracellular signal after binding of the protein of the present invention and the receptor for the purpose of cancer treatment When a compound that promotes transmission is administered in the form of an injection to a normal adult (as 60 kg), the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about 1 day. It is convenient to administer about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, when orally administering a compound that inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention and the receptor for the purpose of AIDS treatment, generally in adults (weight 60 kg), the compound per day Of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, intracellular signal after binding of the protein of the present invention and the receptor for the purpose of AIDS treatment. When a compound that inhibits transmission is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about 1 day. It is convenient to administer about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0110]
(6) DNA containing antisense DNA
An antisense DNA that binds complementarily to DNA or mRNA encoding the protein or the like of the present invention and can suppress the expression of the DNA or mRNA or the protein of the present invention exhibits the above action in vivo. The function of the protein of the present invention or the DNA encoding the same can be suppressed. Therefore, the antisense DNA can be used for, for example, AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration, etc.), myelodysplastic diseases (eg, regeneration). Aplastic anemia), ischemic disease (eg, myocardial infarction, stroke, etc.), destruction of joint tissue in rheumatism, inflammation, hepatitis (eg, fulminant hepatitis, etc.), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune) Related glomerulonephritis), cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetic complications (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), influenza infection , Glomerulonephritis, ulcerative colitis, etc., preferably used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as joint tissue destruction, inflammation, hepatitis, autoimmune diseases in AIDS, rheumatism, etc. It can be.
When the antisense DNA is used as the above therapeutic / prophylactic agent, it can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the DNA of the present invention. For example, the antisense DNA can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
[0111]
(7) Production of DNA transfer animals
Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) The non-human mammal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent.
(3) The non-human mammal according to (2), wherein the rodent is a mouse, and
(4) Provided is a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in mammals.
[0112]
A non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as a DNA-transferred animal of the present invention) can be used for embryos including unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and primordial cells thereof. Preferably, at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally prior to the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, It can be produced by transferring the target DNA by the microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like. Further, by the DNA transfer method, the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and can be used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a cell fusion method known per se.
Examples of non-human mammals include cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like. Among them, rodents, especially mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains) are relatively short in terms of ontogeny and biological cycle from the viewpoint of creating a disease animal model system, and are easy to reproduce. As a system, B6C3F 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferred.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include human and the like in addition to the non-human mammal described above.
[0113]
The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal. In particular, mouse-derived genomic DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is preferred.
Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation or the like) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. The resulting DNA is used, and abnormal DNA is also included.
The abnormal DNA means DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, expression of DNA derived from various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology with the human DNA of the present invention. The DNA of the present invention is highly expressed by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, such as a mouse fertilized egg. DNA transfer mammals can be created.
[0114]
Examples of the expression vector for the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus and baculovirus. Etc. are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
Examples of promoters that regulate DNA expression include promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), various mammals (humans) , Rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase , Platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, tartrate resistance Alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 Tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α and β Myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, preproe Promoters such as kephalin A and vasopressin are used, but preferably a cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, a promoter of human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), a human and chicken β-actin promoter Etc. can be used.
[0115]
The vector preferably has a sequence (generally referred to as a terminator) that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA-transferred mammal. For example, the sequences of DNAs derived from viruses and various mammals are used. Preferably, a simian virus SV40 terminator or the like is used.
In addition, for the purpose of further expressing the target DNA, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc., 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region It is possible depending on the purpose.
The normal translation region of the protein of the present invention includes liver, kidney, thyroid cell, fibroblast-derived DNA derived from various mammals (eg, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, human, etc.) and commercially available DNA. As a raw material, complementary DNA prepared by a known method as a whole or a part of genomic DNA or from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblasts can be obtained. Further, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal protein translation region obtained from the cells or tissues described above by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
Transfer of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
[0116]
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the DNA is stably retained by mating.
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the germ cells of the produced animal after DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and finally promotes the function of the endogenous normal DNA, thereby finally causing hyperfunction of the protein of the present invention. It can develop and can be used as a disease model animal. For example, the normal DNA-transferred animal of the present invention can be used to elucidate the hyperfunction of the protein of the present invention, the pathological mechanism of the disease associated with the protein of the present invention, and the therapeutic method for these diseases. Is possible.
Further, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can also be used in screening tests for therapeutic agents for diseases related to the protein of the present invention. is there.
[0117]
On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. Furthermore, the desired exogenous DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material. A DNA construct with a promoter can be prepared by a normal DNA engineering technique. The abnormal DNA transfer of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA.
In the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and finally the functional inactive form of the protein of the present invention is inhibited by inhibiting the function of the endogenous normal DNA. It may become refractory and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific applicability, the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention exhibits the function inhibition (dominant negative action) of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the functional inactive refractory disease of the protein of the present invention. It becomes a model to elucidate. In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can also be used in screening screening for therapeutic drugs for the functional inactive refractory of the protein of the present invention. It is.
[0118]
Further, as other applicability of the above-mentioned two kinds of DNA transfer animals of the present invention, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) DNA transfer of the present invention Specific expression or activation by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissues of mammals or by analyzing protein tissues expressed by DNA Analysis of the relationship with proteins,
(3) Cell of tissue having DNA is cultured by a standard tissue culture technique, and using these, research on the function of cells from tissue generally difficult to cultivate,
(4) Screening for drugs that enhance cell function by using the cells described in (3) above, and
(5) Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody are conceivable.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of diseases associated with the protein of the present invention, including functional inactive refractory of the protein of the present invention, can be examined. More detailed pathological findings in each organ of the relevant disease model can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
Moreover, each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells with a proteolytic enzyme such as trypsin. . Furthermore, the protein of the present invention and its action can be investigated by identifying the protein-producing cells of the present invention, examining the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and examining their abnormalities. It becomes an effective research material for.
Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for a disease related to the protein of the present invention, including the functional inactive refractory of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the above-described test method and quantification are performed. It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease using a method or the like. Moreover, it is possible to examine and develop a gene therapy method for a disease associated with the protein of the present invention using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.
[0119]
(8) Production of knockout animals
Furthermore, the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin resistant,
(4) The embryonic stem cell according to item (1), wherein the non-human mammal is a rodent.
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) the DNA expression-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention is inactivated,
(7) The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (6) The human mammal according to Item,
(8) The human mammal according to item (6), wherein the non-human mammal is a rodent.
(9) The human mammal according to item (8), wherein the rodent is a mouse, and
(10) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity for the DNA of the present invention, comprising administering a test compound to the non-human mammal according to item (7) and detecting the expression of a reporter gene A screening method is provided.
For the production of the knockout animal of the present invention, DNA containing a mouse-derived genomic DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is suitable [FIG. 4].
[0120]
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted and another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.
Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Inserting a reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the function of the exon, or inserting a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates the transcription of the gene into an intron between the exons, By making it impossible to synthesize complete mRNA, A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells are transferred onto the DNA of the present invention. Alternatively, a Southern hybridization analysis using a DNA sequence in the vicinity thereof or a PCR method using a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer, It can be obtained by sorting the knockout ES cells of the invention.
[0121]
In addition, as the original ES cells used for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method, for example, those already established as described above may be used, and well-known Evans and Kaufma. It may be newly established according to the method. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative and purely immunological genetic background For example, C57BL / 6 mice and B57 mice that have improved the number of eggs collected from C57BL / 6 by crossing with DBA / 2 (for example, C57BL / 6 and DBA / 2 Those established using F1) can also be used favorably. The BDF1 mouse has C57BL / 6 mice in the background, in addition to the advantage that the number of eggs collected is large and the eggs are strong. When ES cells obtained using these mice are used to produce pathological model mice, It can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
In addition, when establishing ES cells, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
As a method for determining the sex of male and female ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned as an example. Using this method, it has traditionally been about 10 times for karyotype analysis. 6 In contrast to the number of cells required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by male / female discrimination. Yes, the early labor of the culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
[0122]
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culturing is carried out by a method such as culturing at about 37 ° C. with carbon dioxide gas, 90% air, and at the time of passage, for example, a trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, the cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA, and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1-3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and when morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embrology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985], ES cells of the present invention. The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful for in vitro cell biology of the protein of the present invention.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
[0123]
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is a DNA in which, for example, a targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individuals thus obtained are usually individuals with deficient hetero-expression of the protein of the present invention, and individuals with deficient hetero-expression of the protein of the present invention are crossed and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Failure individuals can be obtained.
When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
[0124]
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the animal individual obtained by mating has also been knocked out.
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and a plurality of homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
Further, since the protein expression-deficient mouse of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it can be a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and for examining therapeutic methods.
[0125]
(8a) Screening method for compounds having therapeutic / preventive effects on diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for compounds having therapeutic / prophylactic effects on diseases (eg, cancer, etc.) caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention described above. .
That is, the present invention relates to a deficiency or damage of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the non-human mammal. Provided is a screening method for a compound having a therapeutic / prophylactic effect on a disease caused by the disease or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
Specifically, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptom, etc. of the animal as an index. The therapeutic / prophylactic effect of the compound can be tested.
As a method for treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
For example, when screening for a compound having a therapeutic / prophylactic effect on cancer, the test compound is administered to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and changes in the weight of the animal are measured over time.
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal, the test compound is added to cancer if the body weight of the test animal increases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. It can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect.
[0126]
The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and diseases caused by deficiency or damage of the protein of the present invention, such as cancer, viral infection, Helicobacter pylori It has a therapeutic / preventive effect on infections, invasive staphylococcal infections, hepatitis, nephritis, autoimmune diseases, bone diseases, arteriosclerosis, pain, etc. It can be used as a medicine such as a prophylactic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or salt (eg, alkali metal), etc. And physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The therapeutic / prophylactic agent containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention described above.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered orally for the purpose of cancer treatment, generally in an adult (with a body weight of 60 kg) Administer about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg of the compound per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the compound is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection. When administered, it is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0127]
(8b) Screening method for compounds that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention
The present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, and the expression of the reporter gene is detected. A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention is provided.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ) is preferable.
In the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by the reporter gene, the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention, so that the expression of the substance encoded by the reporter gene is expressed. By tracing the above, the activity of the promoter can be detected.
[0128]
For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is inactivated by a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, the protein of the present invention is originally in a tissue expressing the protein of the present invention. Instead of β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate of β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), the present invention can be easily performed. The expression state of the protein in the animal can be observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or 7 ° C. After reacting in the vicinity for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
[0129]
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or salt (eg, alkali metal), etc. And preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
Since the compound or its salt that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, for example, AIDS, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease) , Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration, etc., myelodysplastic disease (eg, aplastic anemia), ischemic disease (eg, myocardial infarction, stroke, etc.), rheumatism Joint tissue destruction, inflammation, hepatitis (eg, fulminant hepatitis), autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related glomerulonephritis), cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy), diabetes, diabetes Diseases such as sexual complications (eg, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy), influenza infection, glomerulonephritis, ulcerative colitis, preferably , Are useful as pharmaceuticals for AIDS, destruction of joint tissues in rheumatism, inflammation, hepatitis, a safe and low toxic treatment and prophylactic agent for diseases such as autoimmune diseases.
On the other hand, the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein, so that, for example, cancer, viral infection, Helicobacter pylori It is useful as a pharmaceutical for safe and low toxic therapeutic / preventive agents for diseases such as infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis, nephritis, autoimmune diseases, bone diseases, arteriosclerosis, and pain.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
[0130]
A pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the protein of the present invention described above and administered to a human or mammal.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). .
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. In particular, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of cancer treatment, the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention In general, when administered to an adult (as 60 kg), the compound is intravenously injected at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Are conveniently administered. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
On the other hand, for example, when a compound that inhibits promoter activity against the DNA of the present invention is orally administered for the purpose of treating AIDS, generally in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.1 to 100 mg per day. , Preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention for the purpose of AIDS treatment In general, when administered to an adult (as 60 kg), the compound is intravenously injected at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Are conveniently administered. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0131]
In the present specification and drawings, bases, amino acids and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there are optical isomers with respect to amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
[0132]
Gly: Glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: Cysteine
Met: Methionine
Glu: Glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: Lysine
Arg: Arginine
His: Histidine
Phe: Phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
[0133]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Figure 0004090092
[0134]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 2]
2 shows the amino acid sequence of the mouse-derived protein of the present invention.
[SEQ ID NO: 3]
The amino acid sequence of the rat-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 4]
1 shows the base sequence of cDNA encoding a human-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention.
[SEQ ID NO: 5]
1 shows the base sequence of DNA containing cDNA encoding a human-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, inserted in plasmid pTB1939.
[SEQ ID NO: 6]
1 shows the base sequence of DNA containing cDNA encoding a human-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, inserted in plasmid pTB1940.
[SEQ ID NO: 7]
2 shows the base sequence of cDNA encoding a mouse-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention.
[SEQ ID NO: 8]
The base sequence of DNA containing cDNA which codes the mouse-derived protein which has the amino acid sequence represented by sequence number: 2 of this invention inserted in plasmid pTB1958 is shown.
[SEQ ID NO: 9]
2 shows the base sequence of genomic DNA encoding a mouse-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention.
[SEQ ID NO: 10]
1 shows the base sequence of cDNA encoding a rat-derived protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the present invention.
[0135]
[SEQ ID NO: 11]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used in order to clone DNA which codes the human origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 12]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the human origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 13]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the human origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 14]
The base sequence of the oligonucleotide used in order to clone the DNA which codes the mouse origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 15]
The base sequence of the oligonucleotide used in order to clone the DNA which codes the mouse origin protein of this invention is shown.
[0136]
[SEQ ID NO: 16]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for the analysis of the base sequence near the start codon of the DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 17]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for the analysis of the base sequence near the start codon of the DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 18]
The base sequence of the adapter which has couple | bonded the both ends of the mouse | mouth chromosome DNA fragment used for the analysis of the base sequence vicinity of the start codon of DNA which codes the mouse-derived protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 19]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for the analysis of the base sequence near the start codon of the DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 20]
The base sequence of the synthetic oligonucleotide used for the analysis of the base sequence near the start codon of the DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention is shown.
[SEQ ID NO: 21]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the extracellular region of the human origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 22]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the extracellular region of the human origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 23]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the rat origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 24]
The base sequence of the primer used in order to clone DNA which codes the rat origin protein of this invention is shown.
[SEQ ID NO: 25]
The general formula of the amino acid sequence of the protein of the present invention is shown.
[0137]
The transformants Escherichia coli DH10B / pTB1939 and Escherichia coli DH10B / pTB1940 obtained in Example 1 to be described later were used from July 17, 1996, respectively. Deposited as deposit numbers FERM BP-5595 and FERM BP-5596 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH), and as deposit numbers IFO 15997 and IFO 15998 with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) from July 11, 1996. ing.
The transformant Escherichia coli DH5α / pTB1958 obtained in Example 2 described later was deposited with the deposit number FERM at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) on January 30, 1997. It has been deposited as BP-5805, and from January 31, 1997 to the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) as deposit number IFO 16054.
The transformant Escherichia coli DH5α / pTB2011 obtained in Example 3 to be described later was deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) from July 8, 1997 with a deposit number of FERM. As BP-6012, since July 7, 1997, it has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) as deposit number IFO16109.
The transformant Escherichia coli DH5α / pTB2012 obtained in Example 5, which will be described later, was deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) from July 8, 1997 with the deposit number FERM. It has been deposited as BP-6013 and from July 7, 1997 to the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO16110.
[0138]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. The genetic manipulation method using E. coli was in accordance with the method described in Molecular cloning.
[0139]
[Example 1]
Cloning of cDNA encoding human-derived Fas ligand-like protein
Cloning of cDNA can be performed using GENETRAPER. TM ) CDNA positive selection system (Gibco BRL) was used.
Super script TM Escherichia coli DH12S strain of human liver cDNA library (Gibco BRL) was prepared by using Terrific Broth (12 g / l Bacto-tryptone (Difco), 24 g / l Bacto-yeast extract (Difco)) containing 100 μg / ml ampicillin, 2 3 g / l monopotassium phosphate, 12.5 g / l dipotassium phosphate, 0.4% glycerol) at 30 ° C. for 16 hours, and after collection, using Qiagen Plasmid Kit (Qiagen) A plasmid cDNA library was prepared. The purified plasmid cDNA library was digested with Gene II and Exo III (both Gibco BRL) to prepare a single-stranded cDNA library.
On the other hand, a synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 11) was used as a probe for screening a cDNA library. The probe was labeled by biotinylating the 3 ′ end using TdT, biotin-14-dCTP (Gibco BRL). The single-stranded cDNA library was treated at 95 ° C. for 1 minute, then rapidly cooled in ice, a biotinylated probe was added, and hybridization was performed at 37 ° C. for 1 hour at room temperature. After hybridization, gene wrapper cDNA positive selection system / streptavidin beads (Gibco BRL) were added and left at room temperature for 30 minutes with stirring every 2 minutes. Thereafter, it was placed in a gene wrapper cDNA positive selection system magnet rack (Gibco BRL) and left for 2 minutes. The supernatant was discarded, and the magnetic beads were washed with a gene wrapper cDNA positive selection system wash buffer. Washing with this wash buffer was performed three times. Then, it was left in a magnet rack, the supernatant was discarded, and a gene wrapper cDNA positive selection system / elution buffer was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. After being placed in a magnet rack and allowed to stand for 5 minutes, the supernatant DNA solution was recovered.
[0140]
A synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 11) was added as a primer to the obtained DNA solution and treated at 95 ° C. for 1 minute. The gene wrapper cDNA positive selection system / repair enzyme was added and left at 70 ° C. for 15 minutes to synthesize double-stranded DNA. The synthesized double-stranded DNA was introduced into Escherichia coli DH10B using an electroporation apparatus (Bio-Rad).
Using the obtained transformant, screening by colony PCR was performed using two kinds of oligonucleotides (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13) as primers. Three strains (# 9, # 33, # 81) were selected as colonies in which an amplified fragment of 434 bp was formed by PCR.
After culturing the selected Escherichia coli, DNA is extracted and reacted using Taq dideoxy terminator cycle sequencing kit (Perkin Elmer), ABI PRISM TM The base sequence of the cDNA fragment was determined using a 377 DNA sequencer (Perkin Elmer). Among the 3 clones obtained, clone # 9 and clone # 33 contain the same DNA fragment, and poly (A) + It had 1491 base sequences represented by SEQ ID NO: 5 including the chain [FIG. 1]. Clone # 81 is poly (A). + Chains, as well as poly (A) + It had 1353 base sequences represented by SEQ ID NO: 6 including an additional signal (AATAA) [FIG. 2]. The cDNA fragment of these 3 clones contained the same gene and encoded a novel Fas ligand-like protein consisting of 240 amino acids represented by SEQ ID NO: 1. From the Kyte-Doolittle analysis, a hydrophobic region from 35th valine (Val) to 63rd tryptophan (Trp) was predicted to be a transmembrane region of this protein. This protein had the highest homology with human lymphotoxin β, but a homology of 33% was found at the amino acid level. In addition, a 31% homology with the human Fas ligand was observed at the amino acid level, but in the phylogenetic tree analysis by the J. Hein method (based on the PAM250 residue weight table), the human Fas ligand was more potent than the human lymphotoxin β. Higher homology was seen.
Among the DNAs encoding the protein of the present invention, plasmid pTB1939 carrying clone # 9 and plasmid pTB1940 containing clone # 81 were introduced into Escherichia coli DH10B, and transformant: Escherichia coli DH10B / pTB1939 In addition, Escherichia coli DH10B / pTB1940 was obtained.
[0141]
[Example 2]
Cloning of cDNA encoding mouse-derived Fas ligand-like protein
Cloning of cDNA was performed by the PCR method. Super script TM Escherichia coli DH12S strain of cDNA library derived from mouse 8.5 day embryo (Gibco BRL), 100 μg / ml ampicillin-containing Super Broth (32 g / l Bacto-tryptone (Difco), 20 g / l Bacto-yeast extract ( After culturing at 30 ° C. for 16 hours with Difco), 0.2 g / l NaCl), a plasmid cDNA library was prepared using Qiagen Plasmid Kit (Qiagen) and used as a template.
The following two synthetic oligonucleotides were used as primers.
Figure 0004090092
The PCR reaction is a system containing TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) and a thermal cycler (GeneAmp R PCR System 2400, Perkin Elmer), 94 ° C., 1 minute for 1 cycle, 94 ° C., 20 seconds → 55 ° C., 30 seconds → 72 ° C., 2 minutes for 30 cycles, 4 ° C.
The obtained amplified fragment was inserted into pT7Blue T-vector (Novagen) using DNA ligation kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and introduced into Escherichia coli DH5α strain.
Plasmid DNA was extracted from the obtained transformant, reacted using a dye terminator cycle sequence FS ready reaction kit (Perkin Elmer), and the nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined using a 373A DNA sequencer (Perkin Elmer). .
The obtained clone has 795 base sequences represented by SEQ ID NO: 8 including 717 base sequences represented by SEQ ID NO: 7, from 239 amino acids represented by SEQ ID NO: 2. The mouse-derived Fas ligand-like protein was encoded [FIG. 3]. This mouse-derived Fas ligand-like protein and the human-derived Fas ligand-like protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 have 78% homology at the amino acid level. The DNA encoding it had 77% homology at the base level.
The resulting plasmid pTB1958 carrying DNA encoding the mouse-derived Fas ligand-like protein was introduced into Escherichia coli DH5α to obtain a transformant: Escherichia coli DH5α / pTB1958.
[0142]
Next, using a promoter finder DNA walking kit (Clontech), the sequence in the vicinity of the start codon of the DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention was analyzed.
The mouse genomic DNA used was previously digested with ScaI restriction enzyme, and adapter sequences to which primer AP1 (Clontech) or primer AP2 (Clontech) can be bound were ligated to the 5 ′ and 3 ′ ends. Yes.
(1) Primer AP1: (SEQ ID NO: 16)
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3 '
(2) Primer AP2: (SEQ ID NO: 17)
5'-ACTATAGGGGCACGCGTGGT-3 '
(3) Adapter sequence: (SEQ ID NO: 18)
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACCGCGTGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3 ′
The first PCR reaction uses this mouse genomic DNA solution, TaKaRa LA PCR kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), AP1, and synthetic oligonucleotide GSP1 and a thermal cycler (GeneAmp R PCR System 2400, PerkinElmer), 7 cycles of 94 ° C, 2 seconds, 72 ° C, 3 minutes, 37 cycles of 94 ° C, 2 seconds, 68 ° C, 3 minutes, 68 ° C, 4 minutes, left at 4 ° C Performed under conditions.
(4) Synthetic oligonucleotide GSP1: (SEQ ID NO: 19)
5′-CAGCCCAGCACCTAGCAGCAGCACCAG-3 ′
[0143]
Next, this reaction solution was diluted 50-fold with sterilized water and used for the second PCR reaction. The second PCR reaction uses this first PCR reaction solution, TaKaRa LA PCR kit version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), the primer AP2 and the synthetic oligonucleotide GSP2, and a thermal cycler (GeneAmp R PCR System 2400, Perkin Elmer), 5 cycles of 94 ° C., 2 seconds, 72 ° C., 3 minutes, 25 cycles of 94 ° C., 2 seconds, 68 ° C., 3 minutes, 68 ° C., 4 minutes, left at 4 ° C. Performed under conditions.
(5) Synthetic oligonucleotide GSP2: (SEQ ID NO: 20)
5′-GCCGCCCTGAATGGGATGCCGTCCTG-3 ′
An amplified fragment of about 1.1 kbp obtained from a genomic DNA solution digested with ScaI was inserted into pT7 Blue T-vector (Novagen) using DNA Ligation Kit Version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) and inserted into Escherichia coli DH5α strain. This was introduced to obtain a transformed strain.
Plasmid DNA is extracted from the obtained transformant, reacted with Dye Terminator Cycle Sequence FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer), and the base sequence of the amplified fragment with 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer). The department was decided. The obtained clone has a base sequence (base sequence represented by SEQ ID NO: 7) encoding the 1st Met (start codon) to 13th Asp of the mouse-derived protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The sequence of the synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) used for the cloning of the cDNA encoding the mouse-derived protein of the present invention was It was confirmed to be a part of the DNA sequence encoding the actual mouse-derived protein of the present invention.
[0144]
[Example 3]
Cloning of a chromosomal gene containing the coding region of the mouse-derived Fas ligand-like protein gene
Obtaining a chromosomal DNA fragment encoding the region containing the open reading frame part of the mouse-derived Fas ligand-like protein gene is obtained by lambda FIX incorporating a 129SVJ mouse chromosomal DNA Sau3AI partial digestion fragment. R Using the II library (Stratagene), it was isolated by plaque hybridization using a labeled mouse-derived Fas ligand-like protein cDNA as a probe. First, 1-10 × 10 Four To a phage solution diluted to pfu (plaque-forming unit) / ml, 0.2% maltose, 10 mM MgSO Four The same amount of the E. coli XL1-Blue MRA culture solution cultured overnight at 30 ° C. in the LB medium supplemented with the above was mixed and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. To 200 μl of the mixed solution, 5 ml of top agarose (NZY medium supplemented with agarose to 0.7% [5 g / l NaCl, 2 g / l MgSO 4) previously warmed to 50 ° C. Four ・ 7H 2 O, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NZ amine (adjusted to pH 7.5)], and sodium bicarbonate so that it was uniformly applied to an NZY plate (1.5% agarose, 9 cm dish), Allowed to stand at ° C. Nylon transfer membrane Hybond pre-marked to show plate position TM By bringing -N + (Amersham) into close contact with the plate for 1 minute, the appeared phage particles were transferred onto the membrane. The membrane was placed on a Whatman 3MM paper filter paper (Whatman International) soaked with a denaturing solution (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) for 7 minutes with the phage-facing side up, and then neutralized solution. (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA) was left on the filter paper soaked for 3 minutes with the surface with the phages facing up. This neutralization treatment was repeated again, and then washed with 2 × SSC solution (0.3M NaCl, 0.03M sodium citrate). After the membrane was air-dried, it was placed on a filter paper soaked with 0.4 M NaOH for 20 minutes with the phage-facing side up, and 5 × SSC solution (0.75 M NaCl, 75 mM sodium citrate) was used. Washed and packed into hybridization packs. To this pack, 5 ml of hybridization buffer of ECL gene detection system (Amersham) was added and prehybridization was performed at 42 ° C. for 1 hour.
[0145]
On the other hand, after heat denaturing a DNA fragment obtained by amplifying the open reading frame part (720 bp) of mouse-derived Fas ligand-like protein cDNA by PCR reaction, the labeling reagent of the ECL gene detection system and glutaraldehyde were added in equal amounts for 5 minutes. After incubation and labeling at 37 ° C., 10 μl of this was added to the prehybridization pack and incubated at 42 ° C. for 1 hour. Thereafter, the membrane was taken out from the pack and washed with a primary washing buffer (6 M urea, 4 g / l SDS, 25 ml / l 20 × SSC) previously kept at 42 ° C. for 20 minutes. This was repeated again and then washed with a secondary wash buffer (2 × SSC) for 5 minutes at room temperature. This was repeated again, and after immersion for 1 minute in the detection reagent of the ECL gene detection system, the membrane was overlaid on the X-ray film and exposed. One hour later, the membrane was taken out and developed, and positive clones were selected. The clones selected here were further subjected to secondary screening by the same method as described above, and finally five candidate clones (# 2, 3, 4, 5, 6) could be obtained. From the results of the PCR reaction, it was found that among these five candidate clones, the clones encompassing the entire region of the gene encoding the mouse-derived Fas ligand-like protein were the # 1 clone and the # 6 clone.
[0146]
Next, subcloning was performed for the purpose of clarifying the base sequence of chromosomal DNA containing the coding region of the mouse-derived Fas ligand-like protein gene. First, the obtained # 6 clone was digested with the restriction enzyme XbaI, and then electrophoresed using a 0.7% agarose gel. It was considered to contain the coding region of the mouse-derived Fas ligand-like protein gene. The DNA fragment was excised and recovered and purified using a Qiaquick gel extraction kit (Qiagen). On the other hand, the cloning vector pUC19 was digested with the restriction enzyme XbaI, and then electrophoresed using a 1.0% agarose gel, and a DNA fragment corresponding to 2.7 kb was excised, and a Kiaquick gel extraction kit (Qiagen) was used. After recovery and purification, terminal phosphorylation was performed using bovine small intestine-derived alkaline phosphatase CIAP (Takara Shuzo). The DNA fragment derived from the # 6 clone prepared above was ligated to this CIAP-treated pUC19 using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo), and introduced into Escherichia coli DH5α. Plasmid DNA into which was inserted was selected and isolated. Regarding the base sequence of the XbaI DNA fragment derived from the cloned # 6 clone, the sequence reaction using the various terminator cycle sequence FS ready reaction kit (Perkin Elmer) with various synthetic oligo DNAs as primers was performed. GeneAmp according to requirements R After performing with PCR System 2400, the sample was determined with DNA sequencer 373A (Perkin Elmer). The obtained base sequence was confirmed by a gene analysis software Laser Gene (Lasergene, DNASTAR). As a result, it was found that the chromosomal gene encoding the mouse-derived Fas ligand-like protein consists of four exons [FIG. 4].
The plasmid carrying the XbaI DNA fragment derived from the # 6 clone containing the coding region of the mouse-derived Fas ligand-like protein obtained as described above was named pTB2011 and was obtained by introducing it into Escherichia coli DH5α. The transformant was Escherichia coli DH5α / pTB2011.
[0147]
[Example 4]
Expression and Western blot analysis of extracellular region of human-derived Fas ligand-like protein hosted in Pichia yeast
As a vector for expressing the extracellular region of the human-derived Fas ligand-like protein of the present invention in the yeast Pichia pastoris, pPICZαA (Invitrogen) was used. This vector contains a gene encoding the secretory signal α-factor of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae that is also functional in Pichia yeast downstream of the promoter of the alcohol oxidase gene (AOX1) of the yeast, and the subsequent multicloning site. The recombinant protein can be secreted into the medium.
First, a DNA fragment encoding the extracellular region of the human-derived Fas ligand-like protein of the present invention was prepared by PCR, and the following two primers used at that time were synthesized with a DNA synthesizer (Oligo1000M, Beckman).
(1) 5'-primer: (SEQ ID NO: 21)
5'-ACGAATTCCAAGAGGCGAAGGTCTCACGAGTC-3 '
(This primer has 24 bases encoding 8 amino acids from No. 85 Gln on the N-terminal side of the extracellular region of the human-derived Fas ligand-like protein on the 3 'side of the EcoRI recognition sequence)
(2) 3'-primer: (SEQ ID NO: 22)
5'-AGTCTAGACTCCCTTCCTTCACACCCATGAAAGCCCCC-3 '
(This primer has a sequence complementary to 15 bases encoding an XbaI recognition sequence, a stop codon (TGA) on the 3 ′ side thereof, and the C-terminal 5 amino acids of the extracellular region of human-derived Fas ligand-like protein)
[0148]
50 pmol each of the obtained primers, 100 ng of the plasmid pTB1939 obtained in Example 1, 10 nmol each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 2.5 units of native Pfu DNA polymerase (Stratagene) and native Pfu buffer ( Stratagene) 50 μl solution containing 5 μl was prepared and thermal cycler (GeneAmp R PCR System 2400, PerkinElmer), 94 ° C. for 1 minute, followed by 98 ° C., 20 seconds → 55 ° C., 30 seconds → 68 ° C., 2 minutes for 1 cycle, 30 cycles, and finally 72 PCR reaction was performed at 5 ° C. for 5 minutes. A PCR product was recovered from the reaction completed solution, digested with EcoRI and XbaI, and then ligated to pPICZαA previously digested and linearized with EcoRI and XbaI to obtain a circularized plasmid. The plasmid DNA was again cleaved at the SacI unique cleavage site at the AOX1 locus, linearized, and introduced into the Pichia pastoris KM71 strain by electroporation. 100μg / ml Zeocin obtained there TM (Invitrogen) YPD agar medium (1% yeast extract (Difco), 2% Bactopeptone (Difco), 2% glucose (Wako Pure Chemicals), 2% agar powder (Wako Pure Chemicals) ) Zeocin that can grow on TM After selecting several clones from the resistant strain, preparing each chromosomal DNA, using it as a template, carrying out a PCR reaction to confirm the integration of the introduced plasmid DNA into the chromosome, It was selected as an intended transformant for recombinant protein expression.
Recombinant protein was expressed by the following procedure. First, a colony of a transformant for expression of a human-derived Fas ligand-like protein with one platinum loop was transformed into BMGY medium (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 1.34% yeast nitrogen base. with ammonium sulfate without amino acids (Difco) 4 × 10 -Five % Biotin, 1% glycerol) and inoculated at 30 ° C. for 20 hours. The cells are collected by centrifugation and then OD 600 BMMY (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids (Difco), 4x10 -Five % Biotin, 0.5% methanol) and re-suspended in a medium, and cultured at 30 ° C. After 1 or 2 days, the culture was sampled and centrifuged to obtain a culture supernatant.
[0149]
Western blotting using the main culture supernatant was performed as follows. First, a peptide containing a part of the amino acid sequence of the extracellular region of the human-derived Fas ligand-like protein (the amino acid sequence from the 166th to the 180th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) is synthesized, and the synthesis is performed. A rabbit antiserum that recognizes the peptide was prepared according to a known method. Next, 5 μl of the above culture supernatant is mixed with 5 μl of sample treatment solution (0.25 M Tris-HCl, 2% SDS, 30% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue, pH 6.8). After treatment at 5 ° C. for 5 minutes, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (10-20% gradient gel) was used, and after completion of the electrophoresis, a protein blotting apparatus (SemiPhor TM The electrophoretic protein was transferred to a nitrocellulose membrane (Pharmacia) using Hoefer Pharmacia BioTech. The membrane was blocked with TBS containing 3% gelatin (20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.5), then washed with TTBS (TBS containing 0.05% Tween-20), and then 2000 with 1.0% gelatin containing TTBS. The above-mentioned rabbit antiserum diluted twice was reacted at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the membrane was washed twice with TTBS, and then reacted with alkaline phosphatase (AP) -labeled goat anti-rabbit IgG antibody diluted 3000 times with TTBS containing 1.0% gelatin at room temperature for 1 hour. The membrane was washed twice with TTBS, further washed once with TBS, and then detected using an AP coloring kit (Bio-Rad).
FIG. 5 shows the result of Western blotting. In the culture supernatant of the strain into which the expression vector was introduced, a main band was observed in the vicinity of about 20 kD, and the intensity of the signal increased with time, but no signal was observed in the culture supernatant of the control pPICZαA-introduced strain. I couldn't.
[0150]
[Example 5]
Cloning of cDNA encoding rat-derived Fas ligand-like protein
Cloning of cDNA encoding rat-derived Fas ligand-like protein was performed by PCR.
Super script TM Escherichia coli DH12S strain of rat liver cDNA library (Gibco BRL) was prepared using Terrific Broth (12 g / l Bacto-tryptone (Difco), 24 g / l Bacto-yeast extract (Difco)), 2 containing 100 μg / ml ampicillin. 3 g / l monopotassium phosphate, 12.5 g / l dipotassium phosphate, 0.4% glycerol) at 30 ° C. for 16 hours, and after harvesting, the plasmid was used using Qiagen Plasmid Kit (Qiagen). A cDNA library was prepared. PCR reaction was carried out in a reaction system using the DNA as a template, the following two synthetic oligonucleotides as primer DNA, and TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a DNA polymerase.
Figure 0004090092
The reaction is a thermal cycler (GeneAmp R PCR System 2400, Perkin Elmer), 94 ° C / min for 1 cycle, 98 ° C / 20 sec → 55 ° C / 30 sec → 72 ° C / 3 min for 35 cycles, 72 ° C / min for 1 min for 1 cycle This was carried out with a program of 4 ° C. and standing. A part of the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, and after confirming the band corresponding to the single DNA fragment amplified by the PCR reaction, using a Quierck Gel Extraction Kit (Qiagen). The DNA fragment was recovered and inserted and ligated to a T cloning site of pT7Blue T-vector (Novagen) using DNA Ligation Kit Version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) in order to determine the base sequence. After introducing the ligation solution into Escherichia coli DH5α strain, 2 clones were selected from the colony group of ampicillin resistant transformants that appeared on the ampicillin-containing LB agar medium, and plasmid DNA was prepared from each. In order to determine the base sequence of each inserted DNA of both clones, each plasmid DNA was used as a template and two types of commercially available primer DNAs (PRM-007, PRM-008) (Toyobo Co., Ltd.) as well as a DNA synthesizer ( Oligo1000M (Beckman)) was used as primer DNA and Thermo Sequenase TM Cycle sequencing reaction using dye terminator cycle sequencing pre-mix kit (Amersham) according to the conditions in the attached document R After the PCR System 2400, the sample was analyzed with a DNA sequencer 373A (Perkin Elmer).
[0151]
The obtained base sequence was analyzed with a gene analysis software Laser Gene (Lasergene, DNASTAR). As a result, in both clones, from the 717 base sequences represented by SEQ ID NO: 10 encoding the rat-derived Fas ligand-like protein consisting of 239 amino acids represented by SEQ ID NO: 3 in the T cloning site. A DNA fragment having a base sequence of 784 base pairs including the open reading frame (Open reading frame) as shown in FIG. 6 was included. The rat-derived Fas ligand-like protein and the human-derived Fas ligand-like protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 have 75% homology at the amino acid level. The DNA coding for had a homology of 74% at the base level. In addition, this rat-derived Fas ligand-like protein and the mouse-derived Fas ligand-like protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 obtained in Example 2 have 96% homology at the amino acid level. The DNAs encoding them had 94% homology at the base level.
The resulting plasmid pTB2012 carrying the DNA encoding the rat-derived Fas ligand-like protein was introduced into Escherichia coli DH5α to obtain a transformant: Escherichia coli DH5α / pTB2012.
[0152]
【The invention's effect】
The protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof has actions such as apoptotic activity and cytotoxic activity. Therefore, the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, and the DNA of the present invention can be used, for example, for cancer (eg, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, follicular lymphoma, cancer with p53 mutation, brain tumor, Bladder cancer, cervical cancer, colon cancer (colon / rectal cancer), non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, etc.), virus infection (eg, early AIDS virus infection, herpes virus infection, adenovirus infection, box virus Infection, varicella-zoster virus infection, human papillomavirus infection, etc.), Helicobacter pylori infection, invasive staphylococcal infection, hepatitis (eg, hepatitis A, hepatitis C, etc.), nephritis, bone disease (eg, rheumatoid arthritis) (Eg, abnormal proliferation of synovial cells in rheumatism)), and is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as arteriosclerosis and pain.
Further, the DNA of the present invention is useful as a genetic diagnostic agent for diseases such as cancer, viral infection, hepatitis, nephritis, rheumatoid arthritis and the like.
Since the antibody against the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof can specifically recognize the protein of the present invention, the partial peptide thereof or a salt thereof, the protein of the present invention in the test solution, etc. It can be used for quantitative determination. Further, the antibody capable of neutralizing the activity of the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is, for example, a preventive / therapeutic agent for joint tissue destruction, inflammation, hepatitis, autoimmune disease, etc. in AIDS and rheumatism Can be used as such.
Furthermore, the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof is a compound that alters the binding property between the protein of the present invention and a receptor, a compound having a proteinase promoting or inhibiting action, or intracellular signal transduction after receptor binding. It is useful as a reagent for screening for compounds that promote or inhibit.
[0153]
[Sequence Listing]
[SEQ ID NO: 1]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0154]
[SEQ ID NO: 2]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0155]
[SEQ ID NO: 3]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0156]
[SEQ ID NO: 4]
Figure 0004090092
[0157]
[SEQ ID NO: 5]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0158]
[SEQ ID NO: 6]
Figure 0004090092
[0159]
[SEQ ID NO: 7]
Figure 0004090092
[0160]
[SEQ ID NO: 8]
Figure 0004090092
[0161]
[SEQ ID NO: 9]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0162]
[SEQ ID NO: 10]
Figure 0004090092
[0163]
[SEQ ID NO: 11]
Figure 0004090092
[0164]
[SEQ ID NO: 12]
Figure 0004090092
[0165]
[SEQ ID NO: 13]
Figure 0004090092
[0166]
[SEQ ID NO: 14]
Figure 0004090092
[0167]
[SEQ ID NO: 15]
Figure 0004090092
[0168]
[SEQ ID NO: 16]
Figure 0004090092
[0169]
[SEQ ID NO: 17]
Figure 0004090092
[0170]
[SEQ ID NO: 18]
Figure 0004090092
[0171]
[SEQ ID NO: 19]
Figure 0004090092
[0172]
[SEQ ID NO: 20]
Figure 0004090092
[0173]
[SEQ ID NO: 21]
Figure 0004090092
[0174]
[SEQ ID NO: 22]
Figure 0004090092
[0175]
[SEQ ID NO: 23]
Figure 0004090092
[0176]
[SEQ ID NO: 24]
Figure 0004090092
[0177]
[SEQ ID NO: 25]
Figure 0004090092
Figure 0004090092
[0178]
[Brief description of the drawings]
1 shows the base sequence of DNA encoding the human-derived protein of the present invention contained in the plasmid pTB1939 obtained in Example 1, and the amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention deduced therefrom.
FIG. 2 shows the base sequence of DNA encoding the human-derived protein of the present invention contained in the plasmid pTB1940 obtained in Example 1 and the amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention deduced therefrom.
FIG. 3 shows the base sequence of DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention contained in the plasmid pTB1958 obtained in Example 2, and the amino acid sequence of the mouse-derived protein of the present invention deduced therefrom.
4 shows the nucleotide sequence of genomic DNA encoding the mouse-derived protein of the present invention contained in the plasmid pTB2011 obtained in Example 3, and the amino acid sequence of the mouse-derived protein of the present invention deduced therefrom. FIG.
FIG. 5 shows the results of examining the expression of the extracellular region recombinant protein of the human Fas ligand-like protein of the present invention using Pichia yeast as the host in Example 4 by Western blot analysis using antiserum against the protein. Lanes 1 to 3 show the results when the culture supernatant of the strain into which the human Fas ligand-like protein expression vector was introduced, and lanes 4 to 6 show the results when the culture supernatant of the strain into which the vector pPICZαA was introduced. Shown are (lanes 1 and 4 immediately after the start of culture in BMMY medium, lanes 2 and 5 after 1 day of culture, and lanes 3 and 6 after 2 days of culture). The band indicates the expression of the desired recombinant protein.
6 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the rat-derived protein of the present invention contained in the plasmid pTB2012 obtained in Example 5, and the amino acid sequence of the rat-derived protein of the present invention deduced therefrom. FIG.

Claims (15)

配列番号：１のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩。SEQ ID NO: 1. A protein comprising the amino acid sequence of 1 or a salt thereof. 配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。SEQ ID NO: 1. A protein consisting of the amino acid sequence of 1 or a salt thereof. アポトーシス誘導活性を有するタンパク質である請求項１または２記載のタンパク質。The protein according to claim 1 or 2, which is a protein having apoptosis-inducing activity. 細胞障害活性を有するタンパク質である請求項１または２記載のタンパク質。The protein according to claim 1 or 2, which is a protein having cytotoxic activity. 請求項１記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを含有するＤＮＡ。A DNA comprising a DNA comprising a base sequence encoding the protein according to claim 1. 配列番号：４〜配列番号：６のいずれかの配列番号の塩基配列を含む請求項５記載のＤＮＡ。The DNA according to claim 5, comprising the base sequence of any one of SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 6 . 請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。A recombinant vector containing the DNA according to claim 5. 請求項７記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 7. 請求項８記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質またはその塩の製造方法。A method for producing a protein or a salt thereof according to claim 1, wherein the transformant according to claim 8 is cultured, the protein according to claim 1 is produced, accumulated, and collected. 請求項１記載のタンパク質またはその塩に対する抗体。An antibody against the protein according to claim 1 or a salt thereof. 外来性の請求項５記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト哺乳動物。A non-human mammal comprising the exogenous DNA according to claim 5 or a mutant DNA thereof. 請求項５記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA according to claim 5 is inactivated. 請求項５記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。The non-human mammal deficient in DNA expression, wherein the DNA according to claim 5 is inactivated. 該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が請求項５記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現する請求項１３記載の非ヒト哺乳動物。The non-human mammal according to claim 13, wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene, and the reporter gene is expressed under the control of a promoter for the DNA according to claim 5. 請求項１４記載の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項５記載のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA according to claim 5, wherein a test compound is administered to the non-human mammal according to claim 14, and the expression of the reporter gene is detected. .
JP19211997A 1996-07-19 1997-07-17 Novel Fas ligand-like protein and its DNA Expired - Fee Related JP4090092B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19211997A JP4090092B2 (en) 1996-07-19 1997-07-17 Novel Fas ligand-like protein and its DNA

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8-191204 1996-07-19
JP19120496 1996-07-19
JP8-211695 1996-08-09
JP21169596 1996-08-09
JP1933097 1997-01-31
JP9-19330 1997-01-31
JP19211997A JP4090092B2 (en) 1996-07-19 1997-07-17 Novel Fas ligand-like protein and its DNA

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007308290A Division JP4320355B2 (en) 1996-07-19 2007-11-29 Novel Fas ligand-like protein and its DNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH10271997A JPH10271997A (en) 1998-10-13
JP4090092B2 true JP4090092B2 (en) 2008-05-28

Family

ID=27457165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP19211997A Expired - Fee Related JP4090092B2 (en) 1996-07-19 1997-07-17 Novel Fas ligand-like protein and its DNA

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4090092B2 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7964190B2 (en) 1996-03-22 2011-06-21 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for decreasing T-cell activity
US6140467A (en) * 1997-07-07 2000-10-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10271997A (en) 1998-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0922099B1 (en) Fas ligand-like protein, its production and use
JP2002112772A (en) New polypeptide and its dna
KR20010081109A (en) Novel g protein-coupled receptor protein, its dna and ligand thereof
US7217808B2 (en) RFRP-3 and DNA thereof
JP4841054B2 (en) Novel insulin / IGF / relaxin family polypeptide and DNA thereof
WO2001044475A1 (en) Novel polypeptide and dna thereof
JP4090092B2 (en) Novel Fas ligand-like protein and its DNA
US7256279B2 (en) Protein having ribonucleotide reductase activity and DNA thereof
JP4320355B2 (en) Novel Fas ligand-like protein and its DNA
JP2004073182A (en) Insulin resistance-improving agent
US20040014947A1 (en) Novel human ependymin-like protein
JP4175680B2 (en) Novel protein and its DNA
JP4488720B2 (en) Apoptosis-related proteins and uses thereof
JP4344408B2 (en) Novel protein and its DNA
JP4320151B2 (en) Novel polypeptides and uses thereof
JP4579378B2 (en) Novel polypeptide and its DNA
EP1600165A1 (en) Medicinal use of mip-3alpha inhibitor and method of screening brain/nerve cell protective agent
JP4300008B2 (en) Novel protein and its DNA
JP4676608B2 (en) Novel tahikinin-like polypeptide and uses thereof
JP2000139480A (en) New protein and its dna
JP4959880B2 (en) Ligand for GPR8 and DNA thereof
JP2001299362A (en) New polypeptide and dna encoding the same
JP2004292444A (en) Preventing and treating agent for upper gastrointestinal tract disease
JP2004166699A (en) Antidiuretic
JP2004173677A (en) New protein and its dna

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040701

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20040701

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070131

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20070131

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070131

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20071002

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071129

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20071225

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080129

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080226

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120307

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120307

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120307

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130307

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130307

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130307

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140307

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140307

Year of fee payment: 6

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees