JP4059454B2

JP4059454B2 - Liquor, food production method

Info

Publication number: JP4059454B2
Application number: JP5572798A
Authority: JP
Inventors: 忠男浅野; 直孝黒瀬; 信次平岡; 貞夫川北; 輝也中村
Original assignee: 宝ホールディングス株式会社
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2018-02-23
Also published as: JPH11235170A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の酵素活性が低減又は消失した酵母を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に実用酵母を用いて製造される酒類、食品（清酒、ワイン、紹興酒、ビール、醤油、味噌又はパン等）に含有される有機酸の組成は、使用する微生物（酵母、麹菌、乳酸菌等）及び原材料の影響が大きくこれらに依存している。その微生物の中で酵母が有機酸生成に関し、重要な役割をしている。
清酒の場合、有機酸は乳酸、コハク酸及びリンゴ酸が大部分を占め、酵母は主にリンゴ酸及びコハク酸を代謝産物として生成することが知られている。
【０００３】
酵母を用いて清酒中の有機酸を変化させた例として以下の方法が報告されている。
エチルメチルスルホン酸（ＥＭＳ）、紫外線処理等の変異処理により薬剤耐性株又は感受性株を取得し清酒中の有機酸組成を変化させる方法（特開平６−１２１６７０号公報、特開平３−１７５９７５号公報、及び日本醸造協会誌、第８８巻、第６４５〜６４７頁、１９９３年）がある。該方法にはリンゴ酸を多量に生成する清酒酵母の取得方法が報告されている。
また、２，４−ジニトロフェノール耐性突然変異株からグリセロール資化能が高い株を分離する方法（特開平６−１７８６８２号公報）がある。該方法にはコハク酸とリンゴ酸濃度が親株より低いことが報告されている。
【０００４】
遺伝子レベルで酵母を改良し清酒中の有機酸組成変化を行っている例としては以下の報告がなされている。
クエン酸回路中のフマラーゼ遺伝子を破壊した結果、親株と比較して培養液中のコハク酸が減少し、フマル酸が増加したという報告〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering) 、第８０巻、第３５５〜３６１頁、１９９５年〕がある。また、フマラーゼ遺伝子（ＦＵＭ１）及び／又はコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＤＨ１）を破壊し、有機酸組成への影響を報告している例（平成９年度農芸化学会大会講演要旨集、ｐ３４６、４Ｙａ７）もある。
この他にもアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（ＡＣＯ１）、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＨＧＤ１）、ＳＤＨ１、ＦＵＭ１、イソクエン酸リアーゼ遺伝子（ＩＣＬ１）、フマレートリダクターゼ遺伝子２種の遺伝子破壊を行い有機酸生成機構の解明を報告している例（平成９年度日本生物工学会大会講演要旨集、ｐ２００、５６０）もある。
クエン酸回路以外の酵素では、ウラシル合成酵素遺伝子（Ｕｒａ３）を破壊することにより、親株と比較しコハク酸及びリンゴ酸が増加したという報告（特公平７−１１４６８９号公報）がある。
【０００５】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体は３種類の酵素、すなわち２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼにより構成されており、それぞれＫＧＤ１、ＫＧＤ２、ＬＰＤ１遺伝子にコードされている。このうちリポアミドデヒドロゲナーゼは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成酵素でもある。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＫＧＤ１、ＫＧＤ２遺伝子の塩基配列はそれぞれ公知の配列であり、ＫＧＤ１の遺伝子破壊酵母による、又は変異処理後グリセロール培地での選択による、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損酵母、並びにＫＧＤ２遺伝子破壊酵母による、又は変異処理しグリセロール培地での選択による、ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ欠損酵母は取得されている。
各々、下記文献に記載されている。ＫＧＤ１〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology) 、第９巻、第２６９５〜２７０５頁、１９８９年〕、ＫＧＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第１０巻、第４２２１〜４２３２頁、１９９０年〕。
しかしながら、上記酵母は栄養要求性をもった生化学実験に主に供されている酵母を使用しており、すべて酵素又は遺伝子の細胞内での生理的役割を解明する目的の手段として作製されたものである。酒類、食品の酸度、有機酸組成を変化させることにより酒類、食品の製造に適するように改良し嗜好に不適な有機酸含量が減少した酵母の取得並びにその酵母を用いた酒類、食品の製造は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、前記のような方法で有機酸組成を変化させようとしているが、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失した酵母を用いて、従来にない有機酸組成をもつ酒類、食品の製造方法を開発していくことが課題として残されている。
本発明の目的は、特定酵素の酵素活性が低減又は消失した酵母を用いて、従来にない有機酸組成の酒類、食品の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、酒類、食品を製造する方法において、遺伝子破壊法により２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母であって、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＫＧＤ１遺伝子を破壊した二倍体の酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧ３（ＦＥＲＭＰ−１６６２８）を用いることを特徴とする酒類、食品の製造方法に関する。
【０００８】
本発明者らは、酵母を遺伝子レベルで操作することにより、酒類、食品（清酒、ワイン、紹興酒、ビール、醤油、味噌又はパン等）の有機酸組成を変化させようとした。
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体は、３種類の酵素、すなわち２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼにより構成されており、それぞれＫＧＤ１、ＫＧＤ２、ＬＰＤ１遺伝子にコードされている。
本発明者らは、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失した酵母を取得し、この株を用いて清酒小仕込み試験を行った結果、酸度が減少し有機酸組成が変化することを見出した。すなわち嗜好に不適なコハク酸含量が減少し及び酸度が減少することを見出し本発明の完成に至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
使用する酵母は特に限定はなく醸造、食品に用いられる実用酵母であればよく例えば清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、醤油酵母又はパン酵母等が挙げられサッカロミセス（Saccharomyces)属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces)属がありサッカロミセス属が香味の点から好ましい。
本発明においては一倍体、二倍体又は二倍体以上の高次倍数体の酵母を使用することができ、例えば二倍体実用酵母から一倍体実用酵母を作製してもよい。
二倍体株からの一倍体株の取得方法は、特に限定はなく常法に従って行えばよい。例えば特開平５−３１７０３５号公報に記載されている製造方法にて取得した株、すなわち、日本醸造協会７０１号（以下、Ｋ７０１と略記する）を麹汁培地にて胞子形成させた後、アルコール処理にて胞子を分離し、色素培地にて一倍体を選別するという方法を用いて取得したα型の一倍体株α４１（以下、α４１と略記する）又はａ型の一倍体株ａ１０（以下、ａ１０と略記する）を用いてもよい。
【００１０】
本発明における２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失した酵母を取得する方法としては、特に限定はなく遺伝子破壊法、変異処理法でもよい。変異処理としては酵母に公知の変異誘導法、例えば、変異誘発の物理的手段としては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的手段としては、エチルメチルスルホン酸、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン等の変異剤を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を特異的に破壊された株を得るには遺伝子工学的手法の遺伝子破壊法を用いるのが好ましい。目的とする有機酸の生成酵母の選択方法は、通常用いられる方法でよく、特に限定はない。
酵母での遺伝子破壊の方法は、３通りの方法、すなわち化学と生物、第３１巻、第８号、第５２４〜５３０頁、１９９３年記載のＡ：破壊しようとする遺伝子の翻訳領域のＮ末端とＣ末端を欠失させた遺伝子と選択マーカー遺伝子からなるプラスミドを使用する方法、Ｂ：翻訳領域の真ん中に選択マーカー遺伝子を導入することにより目的遺伝子を破壊する方法、Ｃ：Ｎ末端とＣ末端の方向を逆にもつ破壊用プラスミドにより破壊する方法が存在するが、いずれの方法においても目的とする遺伝子破壊株は得られる。なお、酵母育種用の選択マーカーとしては酵母由来の選択マーカーが好適であり、該選択マーカーとしては本発明で使用したオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挙げられる。この選択マーカーはオーレオバシジンＡ耐性酵母形質転換システム〔宝酒造（株）製〕として市販されており、該システムを使用することにより簡便に目的酵母の形質転換を行うことができる。
【００１１】
通常、清酒、ワイン、紹興酒、ビール等の実用酵母においては二倍体あるいは、二倍体以上の高次倍数体である。
【００１２】
二倍体の遺伝子破壊株の取得方法としては、以下の３つの方法がある。
（１）マーカー遺伝子（本発明で用いたオーレオバシジンＡ耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドを用いて一回の形質転換で染色体の二本両方共破壊された株を取得する方法。この方法は形質転換後、選択培地にて大きなコロニーを選択することで染色体の二本両方共破壊された株が取得可能である。
（２）異なったマーカー遺伝子を含む二種類の破壊用プラスミドを用いて一本ずつ染色体を破壊する方法。まず最初に、あるマーカー遺伝子（例えばオーレオバシジンＡ耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドで一本の染色体を破壊後、次に別のマーカー遺伝子（例えばセルレニン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子等）を含む破壊用プラスミドを用いて残りの染色体を破壊する方法である。
（３）一倍体（ａ型及びα型）の遺伝子破壊株を各々取得後、交雑を行い二倍体株にする方法。この方法は異なったマーカー遺伝子を含む二種類の破壊用プラスミドを用いてａ型及びα型を各々破壊後、その破壊株を交雑し、二種類の選択培地にて順次二倍体株を取得する方法である。この場合、マーカー遺伝子を含む一種類の破壊用プラスミドを用いて各一倍体株（ａ型及びα型）を破壊後、交雑を行い、一種類の選択培地で二倍体株を取得することも可能である。
【００１３】
本発明で破壊した２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体破壊株の効果は、ＫＧＤ１遺伝子だけに限定されず、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体を構成する酵素タンパク質の遺伝子であるＫＧＤ２遺伝子を破壊しても同様の効果が得られる。
【００１４】
以下にその取得方法の１例を示す。
（遺伝子破壊によるＫＧＤ１遺伝子破壊株の取得）
遺伝子破壊用プラスミド（ｐＫＧＤ１）（図１）は以下のように作製した。
Ｋ７０１の染色体ＤＮＡを精製後、これを鋳型として配列表の配列番号１、配列番号２でそれぞれ表される２５残基のプライマー（５’末端リン酸化）を用いてＰＣＲにてＫＧＤ１遺伝子部分配列〔６８６番目から１２９９番目（既述のモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第９巻、第２６９５〜２７０５頁、１９８９年の記載による）〕６１４残基を増幅した。ＰＣＲ増幅ＫＧＤ１遺伝子部分配列を末端平滑化処理後、電気泳動にて精製した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片とＳｍａＩ消化、脱リン酸化したプラスミドｐＡＵＲ１０１〔宝酒造（株）製〕とをリガーゼにて連結した。
得られた遺伝子破壊用プラスミド（ｐＫＧＤ１）の挿入遺伝子の塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサーにて行った。
ｐＫＧＤ１をＡｏｒ５１ＨＩで切断直線化後、Ｋ７０１由来の一倍体株（ａ１０、α４１）を酢酸リチウム法にて形質転換した。０．５μｇ／ｍｌオーレオバシジンＡ〔宝酒造（株）製〕含有ＹＰＤ培地にて選択することにより一倍体のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇａ−７及びＧα−１１（以下、Ｇａ−７及びＧα−１１と略記する）を取得した。遺伝子破壊の確認は、サザン解析及びＳＧ培地〔非発酵性炭素源配置：０．６７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸不含）、２％グリセロール及び２％寒天〕で生育しないことにより行った。
【００１５】
（交雑方法）
一倍体株をＹＰＤ液体培地（２％Ｇｌｃ）にて一夜、３０℃にて振とう培養後、各１５μｌをＹＰＤ平板培地（２％Ｇｌｃ）上、十字に植菌し、２日間、３０℃にて静置培養した。交雑個所を採取し水に懸濁後、ＹＰＤ平板培地あるいはオーレオバシジンＡ含有ＹＰＤ平板培地に植菌し２日間、３０℃にて静置培養を行い、大きいコロニーを形成する株を選択した。選択した株の二倍体の確認は顕微鏡観察にて行い、ＫＧＤ１遺伝子破壊の確認はサザン解析並びにＳＧ培地に生育しないことにより行った。上記の方法により二倍体のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇ３（以下、Ｇ３と略記する）を取得した。
【００１６】
（サザン解析）
遺伝子破壊株の染色体ＤＮＡを精製後、ＨｐａＩ、ＡｃｃＩＩＩ消化し、電気泳動にて分離、ナイロンメンブレンにブロッティングした。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを鋳型としてＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ〔宝酒造（株）製〕を用いて³²Ｐ標識したプローブを作製後、ハイブリダイゼーション、洗浄、フィルムへの感光、現像を行った。
ＫＧＤ１遺伝子破壊のサザン解析の結果のパターンを図２に写真で示した。横はｌａｎｅ（レーン）、縦は分子量の大きさを意味する。
図２に示すようにｌａｎｅ１のＫ７０１、ｌａｎｅ２のａ１０、ｌａｎｅ３のα４１では、約１ｋｂｐのＫＧＤ１遺伝子のバンドが検出された。ｌａｎｅ４のＧａ−７、ｌａｎｅ５のＧα−１１、ｌａｎｅ６のＧ３には、約１ｋｂｐのＫＧＤ１遺伝子のバンドが検出されず、ＫＧＤ１遺伝子内にオーレオバシジンＡ耐性遺伝子が挿入されたことを示す約８ｋｂｐのバンドが検出された。このことからＫＧＤ１遺伝子は、機能をもたない二つの遺伝子に分断され破壊されたことが確認された。
【００１７】
（ＳＧ培地での生育）
Ｋ７０１、ａ１０、α４１をコントロールとしてＧａ−７、Ｇα−１１、Ｇ３をＳＧ平板培地に植菌し３０℃にて３日間培養した結果Ｋ７０１、ａ１０、α４１は生育したがＧａ−７、Ｇα−１１、Ｇ３は生育しなかった。グリセロールを資化できないことは、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が消失したことを裏付ける〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第９巻、第２６９５〜２７０５頁、１９８９年〕。
【００１８】
かくして本発明者らは、ａ型（一倍体）のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇａ−７とα型（一倍体）のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇα−１１の交雑株Ｇ３を取得した。
【００１９】
上記のように、本発明による菌株（Ｇ３）はＫ７０１由来の一倍体（ａ１０、α４１）遺伝子破壊株の交雑株であるが、その菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した後顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．３〜６．１μｍ、幅４．１〜５．５μｍ
２．増殖の形態：出芽
３．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）をダーラム管入り試験管に分注して当該２菌株を接種し、３０℃で７日間培養してその炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース（＋）ガラクトース（＋）
スクロース（＋）マルトース（＋）
ラクトース（−）メリビオース（−）
ラフィノース（＋）
ｂ）糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いてオキザノグラフ法により、３０℃、１４日間後の生育を観察した。
グルコース（＋）ガラクトース（＋）
スクロース（＋）マルトース（＋）
ラクトース（−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いてオキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：赤
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
４．高泡の形成
清酒の小仕込を行ったところ、高泡の形成は観察されなかった。
５．オーレオバシジンＡに対する耐性
オーレオバシジンＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を含むＹＰＤ培地を用いて、３０℃で２日間培養した結果、Ｋ７０１、ａ１０、α４１は生育しなかったが、当該菌株Ｇ３は生育した。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明に用いられる酵母菌株Ｇ３がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、かつ清酒の小仕込において高泡の形成も認められないことから当該菌株Ｇ３は、Ｋ７０１株由来の交雑株であることを示すものである。
【００２０】
かくして、本発明によりＫＧＤ１遺伝子を破壊した二倍体株が得られ、この株を用いることにより親株と比較し従来にない有機酸組成の酒類、食品例えば清酒が得られることが判明した。本発明においては、二倍体株に限定されず、一倍体、二倍体又は二倍体以上の高次倍数体の酵母を使用することができる。
【００２１】
ａ型（一倍体）のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇａ−７、α型（一倍体）のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇα−１１、Ｋ７０１由来のＧａ−７とＧα−１１の交雑株Ｇ３のうちＧ３を代表的菌株として、 Saccharomyces cerevisiae Ｇ３と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１６６２８として寄託してある。
【００２２】
本発明の酒類とは、清酒、ワイン、紹興酒又はビール等があり、食品とは醤油、味噌又はパン等がある。
清酒、ワイン、紹興酒の製造は原料処理、仕込、糖化及び発酵、熟成、上槽及び精製工程からなる。蒸留酒の製造は原料処理、仕込、糖化及び発酵（糖化、発酵）、蒸留及び熟成工程からなる。醤油の製造は原料処理、仕込、発酵、上槽、精製工程からなる。味噌の製造は原料処理、仕込、発酵工程からなる。ここでいう原料処理は製麹工程も含む。
【００２３】
本発明の酒類、食品の製造方法は、遺伝子破壊法により２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母であって、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＫＧＤ１遺伝子を破壊した二倍体の酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧ３（ＦＥＲＭＰ−１６６２８）を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
本発明の酒類、食品製造の実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２５】
実施例１
ＫＧＤ１遺伝子を破壊した一倍体株２株（Ｇａ−７、Ｇα−１１）を用いて麹汁発酵試験を行った。
麹汁培地は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の麹米に蒸留水を加え５５℃、一夜自己消化し、ブリックス度１０．０に調製したのを使用した。酵母は、３ｍｌ中に６×１０⁸個含むものを添加した。発酵は、１５℃一定で行い、留後１５日目で上槽した。対照株としてＫ７０１、親株ａ１０、親株α４１、ｐＡＵＲ１０１をＢｓｔＰＩで切断後ａ１０を形質転換した株ｐａ−１（以下、ｐａ−１と略記する）及びｐＡＵＲ１０１をＢｓｔＰＩで切断後α４１を形質転換した株ｐα−１（以下、ｐα−１と略記する）を用いた。有機酸組成分析は、イオン排除クロマトグラフィーを利用した島津高速液体クロマトグラフの有機酸分析システムにて行った。上槽液の分析結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】
この結果、一倍体のＫＧＤ１遺伝子破壊株Ｇａ−７及びＧα−１１は各々の親株ａ１０、α４１と比較し、嗜好に適さぬコハク酸が低くなる傾向を示し、さわやかな味となり官能的にも良好な結果となった。また、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子を持つプラスミドのみを導入した株ｐａ−１及びｐα−１は、各々親株ａ１０、α４１の有機酸組成とほぼ同じであり、プラスミド導入により有機酸組成には影響を与えなかった。
【００２８】
実施例２
ＫＧＤ１遺伝子を破壊した一倍体の２株（Ｇａ−７、Ｇα−１１）及び交雑により取得した二倍体株（Ｇ３）を用いて表２に示す仕込配合で清酒の製造を行った。掛米は精米歩合７７ｗ／ｗ％のα化米〔セブンライス工業（株）製〕を使用した。麹は、精米歩合７５ｗ／ｗ％の白米を用いて製造した。酵母は５ｍｌ中に１×１０⁹個含むものを添加した。発酵は、１５℃一定で行い、留後１５日目で上槽した。対照株として二倍体株は、Ｋ７０１、ａ１０とα４１の交雑株である１０−４１−２（以下、１０−４１−２と略記する）、及びｐα−２はｐａ−１の交雑株である１０ｐ−４１ｐ−１５（以下、１０ｐ−４１ｐ−１５と略記する）を用いた。一倍体の対照株としてａ１０、α４１、ｐａ−１及びｐα−１を用いた。上槽液の分析結果を表３に示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
【表３】

【００３１】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で示した。
【００３２】
この結果、ＫＧＤ１遺伝子を破壊した一倍体株（Ｇａ−７，Ｇα−１１）は親株のａ１０、α４１株と比較し酸度は低くなり、異なる有機酸組成を示した。すなわち、嗜好に不適なコハク酸が減少する傾向を示した。交雑により取得したＫＧＤ１遺伝子破壊の二倍体株（Ｇ３）も同様にＫ７０１、交雑の二倍体株である１０−４１−２、１０ｐ−４１ｐ−１５と比較し酸度は低く、コハク酸は親株と比較し約半分に減少した。また、オーレオバシジンＡ耐性遺伝子を含んだｐａ−１、ｐα−１は親株（ａ１０、α４１）と比較し、一般分析値、有機酸組成には影響を与えなかった。官能検査の結果より２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊した清酒酵母（二倍体）の上槽清酒は、二倍体の対照株として用いた３株中で最も官能的に優れたＫ７０１と比較し、すっきりし、爽快な酸味を示し良好な結果を示した。
【００３３】
実施例３
通常のパンを調製するにあたり当該遺伝子破壊株Ｇ３をシクロデキストリンに充分含有させ、各々をパンのドウ当り１．０％〜２．０％添加した。また、Ｋ７０１も同時に調製した。常法に従い発酵させ焙焼した。得られたパンについて官能検査を行った結果、当該遺伝子破壊株で作製したパンは、Ｋ７０１で作製したパンに比べ、すっきりした、爽快な酸味を示し従来にない優れた味覚に改良されたことが認められた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の酒類、食品を製造する方法において、遺伝子破壊法により２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の酵素活性が低減又は消失したサッカロミセス属に属する酵母であって、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＫＧＤ１遺伝子を破壊した二倍体の酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧ３（ＦＥＲＭＰ−１６６２８）を用いることにより、酒類の製造において酸度を減少させることが可能となった。また従来とは全く異なった有機酸組成をもつ酒類、食品を製造することが可能になった。すなわち、この酵素活性を低減又は消失させることによりさわやかな酸味を与え、嗜好に不適なコハク酸含量のみが減少した新規な酒類、食品の製造方法を提供することができる。
【００３５】
【配列表】
【００３６】

【００３７】

【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子破壊用プラスミド（ｐＫＧＤ１）の構造を示す図である。
【図２】ＫＧＤ１遺伝子破壊のサザン解析のパターンを示す写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing alcoholic beverages and foods characterized by using a yeast in which a specific enzyme activity has been reduced or eliminated.
[0002]
[Prior art]
In general, the composition of organic acids contained in alcoholic beverages, foods (sake, wine, Shaoxing liquor, beer, soy sauce, miso or bread, etc.) produced using practical yeasts is the microorganisms used (yeasts, koji molds, lactic acid bacteria, etc.) and The influence of raw materials is greatly dependent on these. Among these microorganisms, yeast plays an important role in organic acid production.
In the case of sake, it is known that organic acids are mostly lactic acid, succinic acid and malic acid, and yeast mainly produces malic acid and succinic acid as metabolites.
[0003]
The following method has been reported as an example of changing the organic acid in sake using yeast.
Methods for obtaining drug-resistant strains or sensitive strains by mutation treatment such as ethylmethylsulfonic acid (EMS) and ultraviolet treatment and changing the organic acid composition in sake (Japanese Patent Laid-Open Nos. 6-121670 and 3-175975) , And Japan Brewing Industry Journal, Vol. 88, pp. 645-647, 1993). In this method, a method for obtaining sake yeast that produces a large amount of malic acid has been reported.
There is also a method (Japanese Patent Laid-Open No. 6-178682) for separating a strain having a high glycerol utilization ability from a 2,4-dinitrophenol-resistant mutant strain. The method is reported to have lower succinic and malic acid concentrations than the parent strain.
[0004]
The following report has been made as an example of improving yeast at the gene level and changing the organic acid composition in sake.
As a result of disrupting the fumarase gene in the citrate cycle, succinic acid in the culture broth decreased and fumaric acid increased compared to the parent strain [Journal of Fermentation and Bioengineering (Journal of Fermentation and Bioengineering), 80, 355-361, 1995]. In addition, examples in which the fumarase gene (FUM1) and / or the succinate dehydrogenase gene (SDH1) are disrupted and the effect on the organic acid composition is reported (1997 Annual Meeting of the Agricultural Chemistry Society, p346, 4Ya7) is there.
In addition, the aconitate hydratase gene (ACO1), 2-oxoglutarate dehydrogenase gene (HGD1), SDH1, FUM1, isocitrate lyase gene (ICL1), and two types of fumarate reductase genes were disrupted to produce an organic acid production mechanism. There is also an example that reports clarification (Abstracts of Annual Meeting of the Biotechnology Society of Japan, p200, 560).
In enzymes other than the citrate cycle, there is a report (Japanese Patent Publication No. 7-114689) that succinic acid and malic acid increased by destroying the uracil synthase gene (Ura3) compared to the parent strain.
[0005]
The 2-oxoglutarate dehydrogenase complex is composed of three types of enzymes, namely 2-oxoglutarate dehydrogenase, dihydrolipoamide succinyltransferase, and lipoamide dehydrogenase, and is encoded by KGD1, KGD2, and LPD1 genes, respectively. Of these, lipoamide dehydrogenase is also a constituent enzyme of the pyruvate dehydrogenase complex. The base sequences of the KGD1 and KGD2 genes of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex are known sequences, respectively, and 2-oxoglutarate dehydrogenase-deficient yeast by KGD1 gene disruption yeast or by selection in a glycerol medium after mutation treatment, and Dihydrolipoamide succinyltransferase-deficient yeast has been obtained by KGD2 gene disrupted yeast or by mutation treatment and selection in glycerol medium.
Each is described in the following documents. KGD1 [Molecular and Cellular Biology, Vol. 9, pp. 2695-2705, 1989], KGD2 [Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, 4221-2432 Page, 1990].
However, the yeasts are mainly used for biochemical experiments with auxotrophy, and all yeasts were produced as a means of elucidating the physiological roles of enzymes or genes in cells. Is. Acquisition of yeast with reduced organic acid content unsuitable for preference by changing the acidity and organic acid composition of alcoholic beverages and foods to make them suitable for production of alcoholic beverages and foods, and production of alcoholic beverages and foods using the yeasts unknown.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Currently, the organic acid composition is being changed by the method as described above, but alcohol and food having an unprecedented organic acid composition using yeast in which the enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex has been reduced or eliminated. Development of a manufacturing method is still a problem.
An object of the present invention is to provide an unprecedented method for producing alcoholic beverages and foods having an organic acid composition using yeast in which the enzyme activity of a specific enzyme has been reduced or eliminated.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
Briefly, in the method for producing alcoholic beverages and foods, the yeast belonging to the genus Saccharomyces, wherein the enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex has been reduced or eliminated by the gene disruption method, the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex liquor, which comprises using a body KGD 1 heritage yeast Saccharomyces cerevisiae diploid that destroyed gene G3 (FERM P-16628), a process for the production of food.
[0008]
The present inventors tried to change the organic acid composition of alcoholic beverages, foods (sake, wine, Shaoxing liquor, beer, soy sauce, miso or bread) by manipulating yeast at the genetic level.
The 2-oxoglutarate dehydrogenase complex is composed of three types of enzymes, namely 2-oxoglutarate dehydrogenase, dihydrolipoamide succinyltransferase, and lipoamide dehydrogenase, and is encoded by the KGD1, KGD2, and LPD1 genes, respectively.
The present inventors obtained yeast in which the enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex has been reduced or eliminated, and as a result of conducting a sake preparation test using this strain, the acidity decreased and the organic acid composition changed. I found out. That is, the present inventors have found that the succinic acid content unsuitable for preference decreases and the acidity decreases, and the present invention has been completed.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be specifically described below.
The yeast to be used is not particularly limited as long as it is a practical yeast used for brewing and foods, for example, sake yeast, wine yeast, beer yeast, soy sauce yeast, baker's yeast and the like, and the genus Saccharomyces, Zygosaccharomyces There is a genus, and the genus Saccharomyces is preferable from the viewpoint of flavor.
In the present invention, a haploid yeast, a diploid or a diploid or higher-order polyploid yeast can be used. For example, a haploid practical yeast may be produced from a diploid practical yeast.
The method for obtaining a haploid strain from a diploid strain is not particularly limited and may be performed according to a conventional method. For example, a strain obtained by the production method described in JP-A-5-317035, that is, the Japan Brewing Association No. 701 (hereinafter abbreviated as K701) is sporulated in a broth medium, and then treated with alcohol. Α-type haploid strain α41 (hereinafter abbreviated as α41) or a-type haploid strain a10 (which is obtained by using a method of separating spores at 1) and selecting haploids on a pigment medium. (Hereinafter abbreviated as a10) may be used.
[0010]
The method for obtaining yeast in which the enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex in the present invention is reduced or eliminated is not particularly limited, and may be a gene disruption method or a mutation treatment method. Mutation treatment includes known mutagenesis methods known to yeast, for example, physical means for mutagenesis include ultraviolet irradiation, radiation irradiation, etc., and chemical means include ethylmethylsulfonic acid, N-methyl-N′- What is necessary is just to use by using suitably the method of making a mutagen, such as nitrosoguanidine, contact. In order to obtain a strain in which the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex is specifically disrupted, it is preferable to use a gene disruption method of a genetic engineering technique. The method for selecting the target organic acid producing yeast may be a commonly used method, and is not particularly limited.
There are three methods of gene disruption in yeast, namely Chemistry and Biology, Vol. 31, No. 8, pp. 524-530, 1993 A: N-terminal of the translation region of the gene to be disrupted And a method comprising using a plasmid comprising a gene deleted from the C-terminus and a selectable marker gene, B: a method of destroying the target gene by introducing a selectable marker gene into the middle of the translation region, C: N-terminal and C-terminal Although there is a method of disrupting with a disrupting plasmid having the opposite direction, the target gene-disrupted strain can be obtained by either method. In addition, as a selection marker for yeast breeding, a yeast-derived selection marker is suitable, and examples of the selection marker include the aureobasidin A resistance gene used in the present invention. This selectable marker is commercially available as an aureobasidin A resistant yeast transformation system (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the target yeast can be easily transformed by using this system.
[0011]
Usually, in practical yeasts such as sake, wine, Shaoxing liquor and beer, it is a diploid or a higher polyploid of a diploid or higher.
[0012]
There are the following three methods for obtaining a diploid gene-disrupted strain.
(1) A method for obtaining a strain in which both of two chromosomes are destroyed by a single transformation using a disrupting plasmid containing a marker gene (such as the aureobasidin A resistance gene used in the present invention). In this method, after transformation, a large colony is selected on a selective medium, whereby a strain in which both chromosomes are destroyed can be obtained.
(2) A method of destroying chromosomes one by one using two types of disruption plasmids containing different marker genes. First, after destroying one chromosome with a disrupting plasmid containing a certain marker gene (eg, aureobasidin A resistance gene), then another marker gene (eg, cerulenin resistance gene, G418 resistance gene, etc.) is included. This is a method of destroying the remaining chromosomes using a disrupting plasmid.
(3) A method of obtaining diploid strains by crossing after obtaining haploid (a-type and α-type) gene-disrupted strains. In this method, after destroying each of a-type and α-type using two types of disruption plasmids containing different marker genes, the disrupted strains are crossed, and diploid strains are sequentially obtained using two types of selective media Is the method. In this case, after disrupting each haploid strain (a type and α type) using one type of disruption plasmid containing a marker gene, crossing and obtaining a diploid strain using one type of selective medium Is also possible.
[0013]
The effect of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex disrupted strain disrupted in the present invention is not limited to the KGD1 gene, and the same effect can be obtained by disrupting the KGD2 gene, which is the enzyme protein gene constituting the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex. The effect is obtained.
[0014]
An example of the acquisition method is shown below.
(Acquisition of KGD1 gene disruption strain by gene disruption)
A gene disruption plasmid (pKGD1) (FIG. 1) was prepared as follows.
After purifying the chromosomal DNA of K701, using this as a template, the KGD1 gene partial sequence by PCR using a 25-residue primer (5 ′ terminal phosphorylation) represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing [ From 686 to 1299 (as described in Molecular and Cellular Biology, Vol. 9, pages 2695-2705, 1989)] 614 residues were amplified. The PCR amplified KGD1 gene partial sequence was purified by electrophoresis after end blunting. This PCR-amplified DNA fragment was ligated with SmaI digested and dephosphorylated plasmid pAUR101 [Takara Shuzo Co., Ltd.].
The base sequence of the inserted gene of the obtained plasmid for gene disruption (pKGD1) was confirmed with a DNA sequencer.
After pKGD1 was cut and linearized with Aor51HI, a haploid strain derived from K701 (a10, α41) was transformed by the lithium acetate method. Selection with a YPD medium containing 0.5 μg / ml aureobasidin A [Takara Shuzo Co., Ltd.] allows haploid KGD1 gene disruption strains Ga-7 and Gα-11 (hereinafter referred to as Ga-7 and Gα-11). Abbreviated as). Confirmation of gene disruption was performed by Southern analysis and non-growth in SG medium [non-fermentable carbon source configuration: 0.67% yeast nitrogen base (no amino acids), 2% glycerol and 2% agar].
[0015]
(Mating method)
After haploid strains were cultured overnight in YPD liquid medium (2% Glc) at 30 ° C., 15 μl of each was inoculated into a cross on YPD plate medium (2% Glc) and incubated at 30 ° C. for 2 days. And static culture. The crossing points were collected and suspended in water, and then inoculated on a YPD plate medium or an aureobasidin A-containing YPD plate medium and statically cultured at 30 ° C. for 2 days to select strains that formed large colonies. Confirmation of the diploid of the selected strain was performed by microscopic observation, and confirmation of the KGD1 gene disruption was performed by Southern analysis and by not growing on SG medium. A diploid KGD1 gene disruption strain G3 (hereinafter abbreviated as G3) was obtained by the above method.
[0016]
(Southern analysis)
Chromosomal DNA of the gene disruption strain was purified, digested with HpaI and AccIII, separated by electrophoresis, and blotted onto a nylon membrane. A ³² P-labeled probe was prepared using a PCR amplified DNA as a template and a Random Primer Labeling Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), followed by hybridization, washing, film exposure, and development.
The pattern of the results of Southern analysis of the KGD1 gene disruption is shown in the photograph in FIG. The horizontal means lane, and the vertical means the molecular weight.
As shown in FIG. 2, a band of about 1 kbp of the KGD1 gene was detected in lane1 K701, lane2 a10, and lane3 α41. A band of about 1 kbp of KGD1 gene was not detected in Ga-7 of lane4, Gα-11 of lane5, and G3 of lane6, indicating that an aureobasidin A resistance gene was inserted into the KGD1 gene. A band was detected. From this, it was confirmed that the KGD1 gene was divided into two genes having no function and destroyed.
[0017]
(Growth in SG medium)
As a result of inoculating Ga-7, Gα-11, and G3 on an SG plate medium using K701, a10, and α41 as controls and culturing at 30 ° C. for 3 days, K701, a10, and α41 grew, but Ga-7 and Gα-11. G3 did not grow. The inability to assimilate glycerol confirms that the enzyme activity of 2-oxoglutarate dehydrogenase has disappeared (Molecular and Cellular Biology, Vol. 9, pp. 2695-2705, 1989).
[0018]
Thus, the present inventors obtained a hybrid strain G3 of the a-type (haploid) KGD1 gene-disrupted strain Ga-7 and the α-type (haploid) KGD1 gene-disrupted strain Gα-11.
[0019]
As described above, the strain (G3) according to the present invention is a hybrid strain of K701-derived haploid (a10, α41) gene-disrupted strain, and its mycological properties are shown below.
(Mycological properties)
1. Morphological properties After culturing in YPD medium at 30 ° C. for 2 days, it was observed with a microscope.
a) Shape: oval b) Size: length 4.3-6.1 μm, width 4.1-5.5 μm
2. 2. Form of growth: budding 3. Biochemical observation a) Carbon fermentable Wickerham carbon compound assimilation test medium (manufactured by Difco) is dispensed into a Durham tube containing test tube, inoculated with the two strains, and cultured at 30 ° C. for 7 days. The presence or absence of the carbon dioxide gas generation was observed.
Glucose (+) Galactose (+)
Sucrose (+) Maltose (+)
Lactose (-) Melibiose (-)
Raffinose (+)
b) Sugar assimilation Wickerham's carbon compound assimilation test medium (manufactured by Difco) was used to observe growth after 30 days at 30 ° C. by the oxanograph method.
Glucose (+) Galactose (+)
Sucrose (+) Maltose (+)
Lactose (-)
c) Nitrate assimilation: (-)
The nitrate was potassium nitrate, and growth was observed by an oxanograph method using a Wickerham carbon compound assimilation test medium (manufactured by Difco).
d) TTC stainability: Red e) Growth in β-alanine medium at 35 ° C. for 3 days: (−)
4). Formation of high foam When a small amount of sake was prepared, formation of high foam was not observed.
5. As a result of culturing at 30 ° C. for 2 days using YPD medium containing aureobasidin A resistant to aureobasidin A (0.5 μg / ml), K701, a10 and α41 did not grow, but the strain G3 Growing up.
As described above, the morphological and biochemical results indicate that the yeast strain G3 used in the present invention is a yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae. In addition, since the growth at 35 ° C. is negative in β-alanine medium and the formation of high bubbles is not observed in the small charge of sake, the strain G3 is a hybrid derived from the K701 strain. .
[0020]
Thus, a diploid strain in which the KGD1 gene was disrupted was obtained according to the present invention, and it was found that by using this strain, alcoholic beverages, foods such as sake with an unprecedented organic acid composition were obtained compared to the parent strain. In the present invention, it is not limited to diploid strains, and monoploid, diploid or higher-order polyploid yeasts can be used.
[0021]
G3 of the KGD1 gene-disrupted strain Ga-7 of type a (haploid), KGD1 gene-disrupted strain Gα-11 of α-type (haploid), and the crossed strain G3 of Ga-7 and Gα-11 derived from K701 As a representative strain, it is named and displayed as Saccharomyces cerevisiae G3, and is deposited as FERM P-16628 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology.
[0022]
The liquor of the present invention includes sake, wine, Shaoxing liquor or beer, and the food includes soy sauce, miso or bread.
The production of sake, wine, and Shaoxing wine consists of raw material processing, preparation, saccharification and fermentation, ripening, upper tank, and purification process. Manufacture of distilled liquor consists of raw material processing, preparation, saccharification and fermentation (saccharification, fermentation), distillation and aging processes. The production of soy sauce consists of raw material processing, preparation, fermentation, upper tank, and purification process. The production of miso consists of raw material processing, preparation, and fermentation processes. The raw material treatment here includes a iron making process.
[0023]
The method for producing alcoholic beverages and foods of the present invention is a yeast belonging to the genus Saccharomyces whose enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex has been reduced or eliminated by the gene disruption method, and the KGD 1 residue of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex. A diploid yeast Saccharomyces cerevisiae G3 (FERM P-16628) having a disrupted gene is used, and the production method is not particularly limited.
[0024]
【Example】
Examples of the production of alcoholic beverages and foods of the present invention will be given and the present invention will be described more specifically, but the present invention is not limited to these examples.
[0025]
Example 1
A broth fermentation test was conducted using two haploid strains (Ga-7, Gα-11) in which the KGD1 gene was disrupted.
The broth medium used was prepared by adding distilled water to 75% w / w% polished rice and adding self-digested overnight at 55 ° C. to a Brix degree of 10.0. Yeast containing 6 × 10 ⁸ in 3 ml was added. Fermentation was performed at a constant temperature of 15 ° C., and the upper tank was placed on the 15th day after the distillation. As a control strain, K701, parent strain a10, parent strain α41, pAUR101 was cut with BstPI and transformed with a10 (hereinafter abbreviated as pa-1) and pAUR101 was cut with BstPI and α41 was transformed with p41 -1 (hereinafter abbreviated as pα-1) was used. The organic acid composition analysis was performed with an organic acid analysis system of Shimadzu high performance liquid chromatograph using ion exclusion chromatography. The analysis results of the upper tank liquid are shown in Table 1.
[0026]
[Table 1]

[0027]
As a result, the haploid KGD1 gene disruption strains Ga-7 and Gα-11 tend to have lower succinic acid that is not suitable for taste compared to the parent strains a10 and α41, and the taste is refreshing and functional. Good results. In addition, the strains pa-1 and pα-1 into which only the plasmid having the aureobasidin A resistance gene was introduced are almost the same as the organic acid composition of the parent strains a10 and α41, respectively, and the introduction of the plasmid has an effect on the organic acid composition. Did not give.
[0028]
Example 2
Sake was produced using the haploid two strains (Ga-7, Gα-11) in which the KGD1 gene was disrupted and the diploid strain (G3) obtained by crossing, with the charging composition shown in Table 2. Kake rice used a rice milling rate of 77 w / w% pre-gelatinized rice (manufactured by Seven Rice Industries Co., Ltd.). Rice bran was produced using 75% w / w% polished rice. Yeast containing 1 × 10 ⁹ yeast in 5 ml was added. Fermentation was performed at a constant temperature of 15 ° C., and the upper tank was placed on the 15th day after the distillation. As a control strain, a diploid strain is a hybrid strain of K701, a10 and α41 (hereinafter abbreviated as 10-41-2), and pα-2 is a hybrid strain of pa-1. 10p-41p-15 (hereinafter abbreviated as 10p-41p-15) was used. As a haploid control strain, a10, α41, pa-1, and pα-1 were used. The analysis results of the upper tank liquid are shown in Table 3.
[0029]
[Table 2]

[0030]
[Table 3]

[0031]
The sensory test was performed by a three-point method (1: good, 2: normal, 3: bad), and indicated by the average value of 10 panelists.
[0032]
As a result, the haploid strain (Ga-7, Gα-11) in which the KGD1 gene was disrupted had a lower acidity than the parent strains a10 and α41, and showed a different organic acid composition. That is, succinic acid unsuitable for preference tended to decrease. Similarly, the KGD1 gene disruption diploid strain (G3) obtained by crossing has a lower acidity compared to K701 and the crossed diploid strains 10-41-2 and 10p-41p-15, and succinic acid is the parent strain. Compared to, it was reduced to about half. In addition, pa-1 and pα-1 containing the aureobasidin A resistance gene did not affect the general analytical values and organic acid composition as compared with the parent strains (a10, α41). From the results of the sensory test, the upper tank sake of sake yeast (diploid) that disrupted the 2-oxoglutarate dehydrogenase gene was compared to the most functionally superior K701 among the three strains used as diploid control strains. It showed a good result with a refreshing and refreshing acidity.
[0033]
Example 3
In preparing normal bread, the gene-disrupted strain G3 was sufficiently contained in cyclodextrin, and each was added at 1.0% to 2.0% per bread dough. K701 was also prepared at the same time. Fermented and roasted according to conventional methods. As a result of performing a sensory test on the obtained bread, the bread produced with the gene-disrupted strain was improved to an unprecedented superior taste with a refreshing, refreshing acidity compared to bread produced with K701. Admitted.
[0034]
【The invention's effect】
In the method for producing alcoholic beverages and foods of the present invention, the yeast belonging to the genus Saccharomyces, wherein the enzyme activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex has been reduced or eliminated by the gene disruption method, and the KGD 1 of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex by using the heritage yeast Saccharomyces cerevisiae diploid that destroyed gene G3 (FERM P-16628), it has become possible to reduce the acidity in the production of alcoholic beverages. In addition, it has become possible to produce alcoholic beverages and foods having completely different organic acid compositions. That is, it is possible to provide a novel method for producing alcoholic beverages and foods that gives a refreshing acidity by reducing or eliminating this enzyme activity and reduces only the succinic acid content unsuitable for taste.
[0035]
[Sequence Listing]
[0036]

[0037]

[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing the structure of gene disruption plasmid (pKGD1).
FIG. 2 is a photograph showing a Southern analysis pattern of KGD1 gene disruption.

Claims

Liquor, a process for the preparation of food, the enzymatic activity of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex by gene disruption method is a yeast belonging to the reduced or lost Saccharomyces, heritage KGD 1 of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex gene liquor, food manufacturing process, which comprises using the destroyed diploid yeast Saccharomyces cerevisiae G3 (FERM P-16628 ).

The method for producing alcoholic beverages and foods according to claim 1, wherein the alcoholic beverages and foods having a reduced succinic acid content are produced.