JP4025394B2

JP4025394B2 - Tissue plasminogen activator pharmaceutical composition

Info

Publication number: JP4025394B2
Application number: JP23838197A
Authority: JP
Inventors: 和幸中島; 義高田嶋; 真一古川; 寛溝上
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-03
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2017-09-03
Also published as: JPH1112194A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ- ＰＡとも称する）含有医薬組成物に関する。より詳細には、ｔ- ＰＡ又はその改変型組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、改変型ｔ- ＰＡとも称する）及びニコチン酸アミド又はその誘導体を配合したことを特徴とする、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ含有医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ｔ- ＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、該プラスミンが血栓の蛋白質基質の主成分であるフィブリンを溶解する。心筋梗塞や、脳梗塞の原因となる血栓症に対する血栓溶解療法において、より血栓選択的な血栓溶解剤としてｔ- ＰＡ製剤が開発された。また、天然型ｔ- ＰＡに比較してフィブリン親和性及び血中半減期を高める目的で、種々の改変型ｔ- ＰＡが遺伝子工学的に製造されてきた。その際、原核生物からの改変型ｔ- ＰＡは、天然型ｔ- ＰＡとは対照的に非グリコシル型で生産される。一般的にｔ- ＰＡは水に極めて難溶性の蛋白質であるが、とりわけ当該改変型ｔ- ＰＡは、前述のフィブリン親和性の増加、血中半減期の延長等種々の長所を有するものの、水に対して、天然型ｔ- ＰＡよりも難溶であり、調製時の困難性は、言うに及ばず、水に溶解して投与する注射剤等としての製剤化を極めて困難なものにしている。
【０００３】
ところで、最近の急性心筋梗塞の治療で基本になっている考えは、冠動脈の閉塞が生じた場合、可及的速やかに血流を回復し、心臓の受ける障害を最小限に抑えることである。この考えに沿えば、高濃度且つ短時間で安全に投与できる薬剤が好ましい。従って、種々の長所を有する改変型ｔ- ＰＡの適用において早期の冠動脈再開通及び梗塞領域の拡大防止を期待する場合には、ｔ- ＰＡ高濃度製剤の単回急速投与が好適である。そのため、ｔ- ＰＡ、特に非グリコシル化ｔ- ＰＡは前述のごとく水に対して難溶性且つ蛋白構造的に不安定であるにも拘らず、臨床的使用においては水溶性の高められたより高濃度且つ蛋白構造的に安定なｔ- ＰＡ製剤の開発が望まれている。
また、ｔ- ＰＡは一般に熱に不安定であり、改変型ｔ- ＰＡもまた例外ではない。このような物質を医薬品として開発するためには安定化の技術が不可欠である。
【０００４】
ｔ- ＰＡを可溶化させるための従来の技術としては、アルギニン塩酸塩又はその塩を添加し、中性〜弱アルカリ性においてｔ- ＰＡを溶解安定化する技術が公知である（特公平6-72105 号及び特公平6-99324 号公報）。しかしながら、この技術の欠点は、中性〜弱アルカリ性条件下では、高濃度ｔ- ＰＡの蛋白構造的な安定性が低下することにある。更に、溶解性においても非グリコシル化ｔ- ＰＡ及び改変型非グリコシル化ｔ- ＰＡにおいては、その溶解特性が天然型ｔ- ＰＡと異なり、自己会合したｔ- ＰＡを当該方法により再溶解させることは困難であった。
また、溶液の液性をｐＨ２〜５に調整して、ｔ- ＰＡを可溶化する方法が知られている（特公昭63-38327号及び特公平3-69332 号公報）が、凍結乾燥状態及び溶液状態において速やかに分解し、失活するため、製剤化にはなお克服すべき問題を伴っていた。
【０００５】
一方で、ｔ- ＰＡを安定化させるための従来の技術として、アルブミンを添加する方法（特公平3-29390 号公報）、アルブミン分解物を添加する方法（特開平1-221325号公報）及び酸処理ゼラチンを添加する方法（特公平5-27607 号公報）が知られている。しかしながら、これらの方法では、高濃度ｔ- ＰＡにおける効果が不充分であり、特にアルブミン添加によりクエン酸緩衝液中のｔ- ＰＡの溶解性が低下することが確認されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の課題は、溶解性及び安定性の低いｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ組成物の溶解性を増加させる方法を提供すること、並びに該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを臨床使用に適した濃度の溶液で含有し且つ製剤学的に充分に安定化されたｔ- ＰＡ医薬品製剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、先ずｔ- ＰＡ及び改変型ｔ- ＰＡの溶解性について、驚くべきことに、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含有する製剤組成において著しく溶解度が向上することを見出した。一方、凍結乾燥状態及び液状においても、ニコチン酸アミドを含有する製剤によってｔ- ＰＡの安定性が大幅に向上することを発見し、これら知見に基づき、ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡの溶解性を増加させるための新規な溶解方法、及び該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡと、ニコチン酸アミドもしくはその誘導体とを含有するｔ- ＰＡ組成物を提供する本願発明を完成させるに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、詳細に説明する。
本願発明で使用されるｔ- ＰＡとしては、ヒト由来の天然型ｔ- ＰＡだけでなく、遺伝子工学的手法により得られたグリコシル化、非グリコシル化ｔ- ＰＡ等各種のｔ- ＰＡを使用することができる。
本願発明で使用される改変型ｔ- ＰＡは、ｔ- ＰＡをポイントミューテーション法などにより改良し、あるいはｔ- ＰＡの有する生物学的活性等を高めるために改変されたｔ- ＰＡであり、本願発明の溶解性増加効果及び安定化効果を達成するものであればいずれの改変型ｔ- ＰＡであってもよい。例えば、このような改変型ｔ- ＰＡとしては、特開昭61-243024 号、特開昭62-24 号、特開昭63-133988 号、特表昭63-501335 号、特表平2-504102号及び特表平3-500843号等公報に示された改変型ｔ- ＰＡ等が好適に挙げられる。
【０００９】
具体的には、本願発明で使用される改変型ｔ- ＰＡとしては、例えば、以下の改変ｔ- ＰＡを挙げることができる。
（1) ｔ- ＰＡの２４５位のＶａｌがＭｅｔに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（2) ｔ- ＰＡの８４位のＣｙｓがＳｅｒに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（3) ｔ- ＰＡのＦ領域及びＧ領域の一部が欠失し、１１７位のＡｓｎがＧｌｕに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（4) ｔ- ＰＡのＫ１領域が欠落し、２７５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された変異ｔ- ＰＡ、及び
（5) ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及びＫ１領域が欠落した変異ｔ- ＰＡ。
ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡは、本願発明の医薬組成物の重量に基づいて、例えば、0.005 〜１重量％、好ましくは、0.01〜0.5 重量％、特に好ましくは、0.1 〜0.2 重量％の量で配合することが適当である。
【００１０】
なお、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの安全性については、これまでの臨床的な使用実績により問題はない。
本願発明で使用されるニコチン酸アミドは、水溶性ビタミンＢ₂複合体の一因子であって、一般成人一日当り１０〜２０ｍｇ以上の摂取が必要とされている。ニコチン酸アミドは、日本薬局方に収載されており、臨床的にはニコチン酸欠乏症の予防及び治療に用いられる。ニコチン酸アミドの毒性に関しては、致死量はマウスに対して２〜３ｇ／ｋｇ、ヒトには１日５００ｍｇを連日非経口投与しても毒性は認められず、大量投与することができることが報告されている。
ｔ- ＰＡそのものの安全性はこれまでの臨床的な使用実績により問題はなく、従って、ニコチン酸アミドを含有した該製剤組成は極めて安全性の高いｔ- ＰＡ製剤であると考えられる。また、これまで知られているニコチン酸アミドの薬理作用は殆どはニコチン酸と同等であるが、ニコチン酸のように血管透過性を亢進させることはない。従って、これまで知られているニコチン酸アミドの薬理作用においては、ニコチン酸アミドの血液系に及ぼす影響は殆どなく、ｔ- ＰＡの薬理作用に対して相互作用を及ぼすことのない理想的な医薬品添加剤であると考えられる。
【００１１】
本願発明に用いられるニコチン酸アミドは、その誘導体であってもよく、例えばＮ- メチルニコチン酸アミドや、Ｎ, Ｎ−ジエチルニコチン酸アミド等のN-アルキル置換ニコチン酸アミド（例えば、置換アルキル基は、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の直鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができる）や、１- メチルニコチン酸アミド等の環置換アルキル基を有するニコチン酸アミドの誘導体（アルキル基としては、例えば、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の直鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができる）、イソニコチン酸アミドなどを用いることができる。なお、日本薬局方に収載されているニコチン酸アミドが最適な態様である。
ニコチン酸アミド又はその誘導体は、本願発明の医薬組成物に基づいて、通常、0.1 〜50％（ｗ／ｖ％、以下の％表示も同様である）、好ましくは0.3 〜５％、実用上更に好ましくは、１〜３％が適当である。この範囲内で、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの溶解性を増加させることができる。
【００１２】
本願発明の医薬組成物には、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ及びニコチン酸アミド又はその誘導体とともに、必要に応じて、更に、塩化ナトリウムや、塩化カリウム等の等張化剤や、マンニトールや、アルブミンなどの賦形剤、安定化剤、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商品名））などの非イオン性界面活性剤などの、医薬品製剤化において通常使用される添加剤を随時配合することができる。
本願発明の医薬組成物は、固形組成物や、水性組成物として、更には、例えば、用時調製注射剤としてｔ- ＰＡ含有凍結乾燥バイアルと、ニコチン酸アミド又はその誘導体とを含有する溶解液バイアルの組み合せのようなｔ- ＰＡ並びにニコチン酸アミド又はその誘導体が別個に包装された形態として使用してもよい。
【００１３】
本願発明の医薬組成物は、各種の方法によって製造することができる。例えば、本願発明の医薬組成物は、適当な媒体中において、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡにニコチン酸アミド又はその誘導体を添加することによって製造することができる。このような媒体としては、好適には、各種の緩衝液を使用することができる。このような緩衝液としては、例えば、トリス塩酸や、リン酸、炭酸、ホウ酸、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸、アミノ酸などを含有する緩衝液を用いることができる。
本願発明の医薬組成物においては、特に、媒体として、クエン酸を含有するクエン酸緩衝液が、相乗的にニコチン酸アミド又はその誘導体の可溶化効果を改善することができるので好適である。
【００１４】
本願発明の医薬組成物において、クエン酸緩衝液を配合する場合には、好ましくは、クエン酸（クエン酸又はクエン酸塩としてのクエン酸の全量）の含有量（濃度）は、10〜500 mM、実際上、特に好ましくは、10〜50mMが好適である。
本願発明における医薬組成物において、通常、ｐＨ４〜6.5 、好ましくはｐＨ５〜６が適当である。特に、ｐＨ５〜６においては、ｔ- ＰＡ及び改変型ｔ- ＰＡの安定性が向上し、加熱やエージング(aging) によるアミノ酸レベルでの修飾を受けにくいことが判明している。
本願発明の製剤組成物は、具体的には、クロマトグラフィーで溶出したｔ- ＰＡ含有画分を、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、例えば、クエン酸緩衝液で置換する方法や、ｔ- ＰＡ含有画分を水に対して透析し、ｔ- ＰＡの沈殿を生ぜしめた後、これをニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、例えばクエン酸緩衝液で再溶解する方法などを採用することができる。いずれの方法においても、最終的にニコチン酸アミド又はその誘導体、及び必要により添加されるその他のクエン酸緩衝液等の製剤用基剤を配合し、これを、無菌的に所望のｔ- ＰＡ濃度に調製した液剤とするか、あるいはこの液体の凍結乾燥品を製造することも可能である。特に、本願発明によれば、ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを臨床使用するのに適した濃度で含有し、且つ製剤学的に十分に安定したｔ- ＰＡ凍結乾燥製剤が容易に得られる。
【００１５】
このような凍結乾燥製剤を製造する場合には、上記のｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ含有溶液は、次いで、常法により凍結乾燥する。例えば、当該溶液を濾過滅菌等により滅菌し、次いで、アンプル又はバイアルのような無菌ガラス容器に所望の容量で分注する。これらを、例えば、−50〜−10℃の温度で冷凍し、冷凍溶液は、真空乾燥を開始するまで適当な温度（例えば、−50℃）で保持される。
冷凍溶液の真空乾燥は、適宜に実施でき、例えば、通常、0.01〜0.1 トールで実質的に全ての冷凍液の除去が達成されるまで充分な時間、部分的真空又は完全真空下に乾燥させる。真空乾燥を行なう温度は、通常、溶液が実質的に又は完全に凍結した形態で維持されるように、処理の開始時点で、通常、−40〜０℃である。処理が進行し、水分が除去されるにつれて、温度は室温に達するまで次第に上昇することがある。最後の痕跡量の水分をできるだけ除去するために、処理の終了時点において室温又はそのすぐ上の温度で約0.01トールの実質的真空下に真空乾燥を行なうことが好ましい。得られるｔ- ＰＡ凍結乾燥製剤の水分含有量（含湿度）は、好ましくは2.5 ％以下である。真空乾燥が完了したならば、凍結乾燥させたｔ- ＰＡ製剤を含有する無菌のガラス容器を減圧状態のままあるいは窒素ガス充填の後に密封する。
【００１６】
本願発明によって、高濃度でｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを含有する凍結乾燥医薬製剤を好適に得ることができる。投与用のｔ- ＰＡ含有溶液を調製するには、本願発明のｔ- ＰＡ凍結乾燥医薬製剤を中性又は酸性のｐＨを有する水で再構成する。ｔ- ＰＡ凍結乾燥医薬製剤が得られる水溶液が実質的に等張である場合には、再構成用の水は、実質的に等張であることが好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下、本願発明について、調製例や、実施例等を参照しながら、更に詳細に説明するが、本願発明の範囲は、これらの調製例や実施例等によって何ら限定されるものではない。
調製例１（改変型ｔ - ＰＡの調製）
ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及びＫ１領域が欠失し、２７５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された精製改変型ｔ- ＰＡを、Biotechnology Progress, 10(5): 472-479 (1994) に記載されている方法に従い調製した。当該精製改変型ｔ- ＰＡは精製水に対して透析し、遠心処理した後得られた沈澱を−８０℃にて保存した。
調製例２（天然型ｔ - ＰＡの調製）
組換えＣＨＯ細胞に由来する完全分子からなる天然型ｔ- ＰＡ（田辺製薬製「グルトパ」）を準備した。この天然型ｔ- ＰＡは、精製水に対して透析し、遠心処理した後、沈殿を−８０℃で保存した。用時は、約８mg／mlの濃度で所定の濃度のニコチン酸アミド又はその誘導体とともに使用した。
試験例１（溶解性試験１）
調製例１に示した改変型ｔ- ＰＡを約８ｍｇ試験管に取り、以下の表１に示す各組成の緩衝液を添加し、撹拌した後、遠心して得られた上清中のｔ- ＰＡが、プラスミノーゲンを活性化し、生成したプラスミンに特異的な合成基質（Ｓ- ２２８８）の水解活性により、ｔ- ＰＡ活性を測定し、濃度既知のｔ- ＰＡ標準品によりｔ- ＰＡの溶解度を求めた。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】

上記表１から、ニコチン酸アミドを含有した医薬組成物において、アルギニン（Ａｒｇ）含有医薬組成物よりも、約５０倍以上可溶化することが分かる。従って、本願発明の医薬組成物により、ニコチン酸アミドが改変型ｔ- ＰＡの溶解度を著しく高める効果を有することが明らかとなった。
同様に、クエン酸緩衝液におけるクエン酸の濃度を40mMとしたことを除いて、上記と同様に溶解性試験１を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。
【００１９】
試験例２（溶解性試験２）
上記溶解性試験１において、試料３及び４のニコチン酸アミドの濃度を、以下の表２に示すように変化させたことを除いて、上記溶解性試験１を繰り返すことにより、ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】

上記表２の結果から、本願発明の医薬組成物において、ニコチン酸アミド濃度の上昇に伴い、改変型ｔ- ＰＡの溶解度が増大することが明らかとなった。また、この結果から、ニコチン酸アミドを、溶液中に実用上0.3 ％以上の濃度で共存させることにより、臨床的使用を充分満足するｔ- ＰＡの溶解度が達成されることが明らかとなった。
【００２１】
試験例３（溶解性試験）
５％ニコチン酸アミド、１％マンニトール及び0.01％Ｔween８０を含有した緩衝液において、併用する緩衝液の種類を変えることによって、試験例１と同様に、改変型ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を以下の表３に示す。
【００２２】
【表３】

上記表３の結果から、クエン酸緩衝液を使用すると、それ以外の緩衝液を使用する場合に比べて、ｔ- ＰＡの溶解度が大幅に増強されることが明らかである。
【００２３】
試験例４（溶解性試験４）
ｔ- ＰＡ溶解緩衝液（2.5 ％ニコチン酸アミド／１％マンニトール／0.01％Ｔween８０／クエン酸緩衝液、ｐＨ5.6 ）で使用されるクエン酸緩衝液のクエン酸の濃度を変化させて、試験例１と同様にｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を以下の表４及び図１に示す。
【００２４】
【表４】

この試験例４の結果から、ニコチン酸アミドによるｔ- ＰＡ溶解度の増加効果は、500mM までの濃度のクエン酸イオン源の存在により濃度依存的に高められることが明らかとなった。
【００２５】
試験例５（溶解性試験５）
上記溶解性試験１において、改変型ｔ- ＰＡの代わりに、調製例２の天然型ｔ- ＰＡを使用し、且つ40mMのクエン酸を含有する緩衝液を使用したことを除いて、組み合わせるニコチン酸アミドの濃度を変化させた場合の、天然型ｔ- ＰＡの溶解性を上記と同様にして求めた。その結果を表５に示す。なお、ここで使用した基礎緩衝液の組成は以下の通りである。
基礎緩衝液の組成：40mMクエン酸緩衝液／0.01％Tween80 (pH7.2)
この緩衝液を、緩衝液Ａとする。
【００２６】
【表５】

【００２７】
上記表５の結果から、天然型ｔ- ＰＡにおいても、ニコチン酸アミドの添加により、ｔ- ＰＡの溶解性が向上したことが分かる。また、全体的に、改変型ｔ- ＰＡに比べて、天然型ｔ- ＰＡの方が、溶解性が優れていることが分かる。
【００２８】
試験例６（凍結乾燥試験１）
溶解性試験例１〜５によって得られた結果に基づき、以下の成分からなる組成物を用いて、改変型ｔ- ＰＡの凍結乾燥製剤を調製した。
凍結保存しておいた改変型ｔ- ＰＡの沈澱を２倍濃度の組成緩衝液で溶解し、ｔ- ＰＡ濃度を３mg／mlになるように調整し、濾過滅菌した後、ガラス製バイアルに分注して、以下の工程で凍結乾燥した。
（1) 常圧で、棚温度−５０℃で２時間、引続き棚温度−２４℃で１時間凍結の後、−５０℃で１５時間予備凍結した。
（2) 0.1 トールの減圧下で棚温度を−５℃まで上昇させ、一次乾燥を行なった。
（3) 一次乾燥後、棚温度を３０℃まで上昇させ、二次乾燥を行なった。
（処方例）
クエン酸緩衝液 100 mM
ニコチン酸アミド 1.25 ％
マンニトール１％
Ｔｗｅｅｎ８０ 0.01 ％
改変型ｔ- ＰＡ 1.5 mg／ml
（ｐＨ5.6 ）
得られた凍結乾燥製剤を注射用水で溶解した。その結果、この凍結乾燥製剤は極めて速やかに注射用水に溶解し、透明な液となった。また、得られた注射剤では、改変型ｔ- ＰＡの活性及び正常な蛋白構造が保持されていた。従って、試験例６から、高濃度の改変型ｔ- ＰＡの凍結乾燥製剤を製造することが可能であることが示された。
また、40mMのクエン酸緩衝液を使用したことを除いて、上記と同様に試験を行ったが、上記と同様の効果が得られた。
【００２９】
試験例７（凍乾標品の安定性試験１）
試験例６で得られた凍結乾燥標品を所定時間６０℃中に放置し、安定性を調べた。安定性については、合成基質（Ｓ- ２２８８）水解活性の減衰及び、陰イオン交換（ＤＥＡＥ）ＨＰＬＣ分析におけるメインピークの残存率で評価を行なった。
合成基質水解活性の測定は、Pharmacopeial Previews, p.1223, Ｎov.-Ｄec., (1990) に基づいて行なった。陰イオン交換ＨＰＬＣによる分析は、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ- ５ＰＷ：東ソー( 株) ）に対して、２Ｍ尿素を含む10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を移動相として用い、本移動相に0.2 Ｍ塩化ナトリウムを含有する溶離液でグラジエント溶出した。
その結果を以下の表６に示す。
【００３０】
【表６】

上記表６の結果から分かるように、ニコチン酸アミドは、ｔ- ＰＡの可溶化効果だけではなく、凍結乾燥状態での安定性に対しても有効であり、ニコチン酸アミドを含有した医薬組成物によって、安定性の高い製剤を製造することが可能である。
【００３１】
試験例８（液状製剤の安定性試験１）
改変型ｔ- ＰＡを、ニコチン酸アミドを含んだ緩衝液に溶解した後、４０℃中に放置し、安定性を調べた。
安定性の評価については試験例７と同様に行なった。その結果、以下の表７に示す。
【００３２】
【表７】

上記表７の結果から、ニコチン酸アミドを含んだ医薬組成物においては、液状においても、安定的に性状が保持されることが示された。特に、陰イオン交換ＨＰＬＣ分析では、加熱による修飾体の増加が抑制され、メインピークが保持されることが確認された。
この効果は、更に、クエン酸緩衝液を併用した場合でも、同様であった。
【００３３】
【発明の効果】
本願発明によれば、ｔ- ＰＡにニコチン酸アミド又はその誘導体を併用することにより、ｔ- ＰＡの溶解度及び安定性を向上させる。従って、本願発明は、ｔ- ＰＡの臨床上使用し得る、例えば、凍結乾燥製剤等の製剤を提供できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔ- ＰＡの溶解度に対するクエン酸濃度の影響を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a pharmaceutical composition containing a tissue plasminogen activator (hereinafter also referred to as t-PA). More specifically, t-PA or a modified tissue plasminogen activator thereof (hereinafter also referred to as modified t-PA) and nicotinamide or a derivative thereof are blended. The present invention relates to a modified t-PA-containing pharmaceutical composition.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
t-PA activates plasminogen to plasmin, which dissolves fibrin, which is the main component of the thrombotic protein substrate. In thrombolytic therapy for thrombosis causing myocardial infarction and cerebral infarction, a t-PA preparation has been developed as a thrombolytic agent more selective for thrombosis. In addition, various modified t-PAs have been produced by genetic engineering for the purpose of increasing fibrin affinity and blood half-life as compared to natural t-PA. In so doing, modified t-PA from prokaryotes is produced in non-glycosylated form as opposed to natural t-PA. In general, t-PA is a very poorly soluble protein in water. In particular, the modified t-PA has various advantages such as an increase in fibrin affinity and an increase in blood half-life. On the other hand, it is less soluble than natural t-PA, and the difficulty during preparation is, of course, extremely difficult to formulate as an injection or the like that is dissolved in water for administration. .
[0003]
By the way, the idea that is fundamental in the treatment of recent acute myocardial infarction is to restore the blood flow as quickly as possible when the occlusion of the coronary artery occurs and to minimize the damage to the heart. In accordance with this idea, a drug that can be safely administered in a high concentration and in a short time is preferable. Therefore, in the application of modified t-PA having various advantages, single rapid administration of a high-concentration t-PA preparation is preferred when early coronary artery recanalization and prevention of infarct area expansion are expected. Therefore, t-PA, in particular non-glycosylated t-PA, is slightly soluble in water and unstable in protein structure as described above, but has a higher water solubility in clinical use. In addition, development of a t-PA preparation that is stable in terms of protein structure is desired.
Also, t-PA is generally unstable to heat, and modified t-PA is no exception. Stabilization techniques are indispensable for developing such substances as pharmaceuticals.
[0004]
As a conventional technique for solubilizing t-PA, a technique is known in which arginine hydrochloride or a salt thereof is added to dissolve and stabilize t-PA in neutral to weakly alkaline conditions (Japanese Patent Publication No. 6-72105). No. and Japanese Patent Publication No. 6-99324). However, the disadvantage of this technique is that the protein structural stability of high-concentration t-PA decreases under neutral to weakly alkaline conditions. Furthermore, in terms of solubility, the non-glycosylated t-PA and the modified non-glycosylated t-PA are different from natural t-PA in their solubility characteristics, and the self-associated t-PA is redissolved by this method. Was difficult.
In addition, a method for adjusting the liquidity of the solution to pH 2 to 5 to solubilize t-PA (Japanese Patent Publication No. 63-38327 and Japanese Patent Publication No. 3-69332) is known. Since it rapidly decomposes and deactivates in a solution state, the formulation still has problems to be overcome.
[0005]
On the other hand, as conventional techniques for stabilizing t-PA, a method of adding albumin (Japanese Patent Publication No. 3-29390), a method of adding an albumin degradation product (Japanese Patent Laid-Open No. 1-221325), and an acid A method of adding treated gelatin (Japanese Patent Publication No. 5-27607) is known. However, in these methods, the effect at a high concentration of t-PA is insufficient, and it has been confirmed that the solubility of t-PA in a citrate buffer is lowered particularly by addition of albumin.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to provide a method for increasing the solubility of t-PA or modified t-PA composition having low solubility and stability, and clinical use of the t-PA or modified t-PA. It is an object of the present invention to provide a t-PA pharmaceutical preparation which is contained in a solution having a concentration suitable for the preparation and is pharmacologically sufficiently stabilized.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present application surprisingly found that the solubility of t-PA and modified t-PA is surprisingly remarkable in the pharmaceutical composition containing nicotinamide or a derivative thereof. It has been found that the solubility is improved. On the other hand, it was found that the stability of t-PA is greatly improved by the preparation containing nicotinamide in the lyophilized state and in the liquid state, and based on these findings, dissolution of t-PA or modified t-PA is found. The present invention has been completed to provide a novel dissolution method for increasing the property and a t-PA composition containing the t-PA or modified t-PA and nicotinamide or a derivative thereof. .
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As t-PA used in the present invention, not only natural t-PA derived from human but also various t-PA such as glycosylated and non-glycosylated t-PA obtained by genetic engineering techniques are used. be able to.
The modified t-PA used in the present invention is t-PA modified to improve t-PA by a point mutation method or the like, or to enhance biological activity etc. possessed by t-PA, Any modified t-PA may be used as long as it achieves the solubility increasing effect and the stabilizing effect of the present invention. For example, as such modified t-PA, JP-A 61-243024, JP-A 62-24, JP-A 63-133988, JP-A 63-501335, JP-T 2- Preferable examples include modified t-PA and the like disclosed in Japanese Patent No. 504102 and Japanese National Publication No. 3-500843.
[0009]
Specifically, examples of the modified t-PA used in the present invention include the following modified t-PA.
(1) Mutant t-PA in which Val at position 245 of t-PA is replaced with Met,
(2) Mutant t-PA in which Cys at position 84 of t-PA is replaced with Ser,
(3) Mutant t-PA in which part of the F region and G region of t-PA is deleted and Asn at position 117 is replaced with Glu;
(4) Mutant t-PA in which the K1 region of t-PA is missing and Arg at position 275 is replaced with Glu; and (5) Mutant t-PA in which the F region, G region and K1 region of t-PA are missing. PA.
The t-PA or modified t-PA is, for example, 0.005 to 1% by weight, preferably 0.01 to 0.5% by weight, particularly preferably 0.1 to 0.2% by weight, based on the weight of the pharmaceutical composition of the present invention. It is appropriate to mix by quantity.
[0010]
The safety of t-PA or modified t-PA is not a problem due to the past clinical use.
Nicotinamide used in the present invention is a factor of a water-soluble vitamin B ₂ complex, and needs to be taken in an amount of 10 to 20 mg or more per day for general adults. Nicotinamide is listed in the Japanese Pharmacopoeia and is clinically used for the prevention and treatment of nicotinic acid deficiency. Regarding the toxicity of nicotinic acid amide, the lethal dose is 2 to 3 g / kg for mice, and it is reported that 500 mg a day for humans can be administered in large doses without any toxicity even after daily parenteral administration. ing.
The safety of t-PA itself is not problematic due to the clinical use so far, and therefore, the preparation composition containing nicotinamide is considered to be a highly safe t-PA preparation. Moreover, the pharmacological action of nicotinic acid amides known so far is almost the same as that of nicotinic acid, but does not enhance vascular permeability like nicotinic acid. Therefore, in the pharmacological action of nicotinamide known so far, there is almost no influence on the blood system of nicotinamide, and it is an ideal pharmaceutical that does not interact with the pharmacological action of t-PA. It is considered an additive.
[0011]
The nicotinic acid amide used in the present invention may be a derivative thereof. For example, N-alkyl nicotinic acid amide, N-alkyl substituted nicotinic acid amide such as N, N-diethylnicotinic acid amide (for example, substituted alkyl group) Nicotinic acid amide having a ring-substituted alkyl group such as 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 to 3 linear or branched alkyl groups, and 1-methylnicotinic acid amide. (As the alkyl group, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 to 3 carbon atoms can be preferably exemplified), isonicotinic acid amide and the like can be used. . Note that nicotinamide, which is listed in the Japanese Pharmacopoeia, is the optimal mode.
Based on the pharmaceutical composition of the present invention, nicotinamide or a derivative thereof is usually 0.1 to 50% (w / v%, the following% is also the same), preferably 0.3 to 5%, and practically further. Preferably, 1 to 3% is appropriate. Within this range, the solubility of t-PA or modified t-PA can be increased.
[0012]
The pharmaceutical composition of the present invention includes t-PA or modified t-PA and nicotinic acid amide or a derivative thereof, if necessary, further, isotonic agents such as sodium chloride and potassium chloride, mannitol, Additives usually used in pharmaceutical preparations such as excipients such as albumin, stabilizers, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (Tween 80 (trade name)) can be blended as needed.
The pharmaceutical composition of the present invention is a solid composition, an aqueous composition, or a solution containing, for example, a lyophilized vial containing t-PA as an injection preparation prepared at the time of use and nicotinamide or a derivative thereof. T-PA, such as a combination of vials, and nicotinamide or derivatives thereof may be used in separately packaged forms.
[0013]
The pharmaceutical composition of the present invention can be produced by various methods. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by adding nicotinamide or a derivative thereof to t-PA or modified t-PA in a suitable medium. As such a medium, various buffer solutions can be preferably used. As such a buffer solution, for example, a buffer solution containing Tris hydrochloric acid, phosphoric acid, carbonic acid, boric acid, citric acid, acetic acid, tartaric acid, succinic acid, amino acid, or the like can be used.
In the pharmaceutical composition of the present invention, a citrate buffer containing citric acid as a medium is particularly preferable because it can synergistically improve the solubilizing effect of nicotinamide or its derivative.
[0014]
In the pharmaceutical composition of the present invention, when a citrate buffer solution is blended, the content (concentration) of citric acid (the total amount of citric acid as citric acid or citrate) is preferably 10 to 500 mM. In practice, 10 to 50 mM is particularly preferred.
In the pharmaceutical composition of the present invention, the pH is usually 4 to 6.5, preferably 5 to 6. In particular, at pH 5-6, it has been found that the stability of t-PA and modified t-PA is improved and is not easily modified at the amino acid level by heating or aging.
Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention includes a method in which a fraction containing t-PA eluted by chromatography is replaced with, for example, a citrate buffer containing nicotinamide or a derivative thereof, Use a method in which the PA-containing fraction is dialyzed against water to cause precipitation of t-PA and then redissolved in citrate buffer containing nicotinamide or its derivative. Can do. In any method, nicotinamide or a derivative thereof, and other pharmaceutical bases such as citrate buffer added as necessary are finally blended, and this is aseptically added to a desired t-PA concentration. It is also possible to prepare a liquid preparation prepared as described above, or to produce a lyophilized product of this liquid. In particular, according to the present invention, a t-PA lyophilized preparation containing t-PA or modified t-PA at a concentration suitable for clinical use and sufficiently pharmaceutically stable can be easily obtained. .
[0015]
In the case of producing such a lyophilized preparation, the above t-PA or modified t-PA-containing solution is then lyophilized by a conventional method. For example, the solution is sterilized by filtration sterilization or the like and then dispensed in a desired volume into a sterile glass container such as an ampoule or vial. These are frozen at a temperature of, for example, −50 to −10 ° C., and the frozen solution is kept at an appropriate temperature (for example, −50 ° C.) until vacuum drying is started.
Vacuum drying of the frozen solution can be performed as appropriate, for example, usually under a partial or full vacuum for a sufficient time until removal of substantially all of the frozen liquid is achieved at 0.01 to 0.1 Torr. The temperature at which the vacuum drying is carried out is usually −40 to 0 ° C. at the beginning of the treatment so that the solution is maintained in a substantially or completely frozen form. As processing proceeds and moisture is removed, the temperature may gradually increase until room temperature is reached. In order to remove as much of the last traces of moisture as possible, vacuum drying is preferably performed at the end of the process at or near room temperature under a substantial vacuum of about 0.01 Torr. The water content (humidity) of the resulting t-PA lyophilized preparation is preferably 2.5% or less. When vacuum drying is complete, the sterile glass container containing the lyophilized t-PA formulation is sealed under vacuum or after filling with nitrogen gas.
[0016]
According to the present invention, a freeze-dried pharmaceutical preparation containing t-PA or modified t-PA at a high concentration can be suitably obtained. To prepare a t-PA containing solution for administration, the t-PA lyophilized pharmaceutical formulation of the present invention is reconstituted with water having a neutral or acidic pH. When the aqueous solution from which the t-PA lyophilized pharmaceutical preparation is obtained is substantially isotonic, the water for reconstitution is preferably substantially isotonic.
[0017]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preparation examples and examples, but the scope of the present invention is not limited by these preparation examples and examples.
Preparation Example 1 (Preparation of modified t - PA)
Purified modified t-PA in which the F region, G region and K1 region of t-PA are deleted and Arg at position 275 is replaced with Glu is described in Biotechnology Progress, 10 (5): 472-479 (1994). Prepared according to the method described. The purified modified t-PA was dialyzed against purified water and centrifuged, and the resulting precipitate was stored at -80 ° C.
Preparation Example 2 (Preparation of natural t - PA)
A natural t-PA (“Gurtopa” manufactured by Tanabe Seiyaku) consisting of a complete molecule derived from recombinant CHO cells was prepared. The natural t-PA was dialyzed against purified water, centrifuged, and the precipitate was stored at -80 ° C. In use, it was used with a predetermined concentration of nicotinamide or its derivative at a concentration of about 8 mg / ml.
Test Example 1 (Solubility Test 1)
About 8 mg of the modified t-PA shown in Preparation Example 1 is taken in a test tube, added with a buffer solution having each composition shown in Table 1 below, stirred, and centrifuged in the supernatant obtained by centrifugation. Activated plasminogen, measured t-PA activity by hydrolytic activity of a synthetic substrate (S-2288) specific for plasmin produced, and dissolved t-PA with a t-PA standard of known concentration. Asked. The results are shown in Table 1.
[0018]
[Table 1]

From Table 1 above, it can be seen that the pharmaceutical composition containing nicotinic acid amide solubilizes about 50 times or more than the pharmaceutical composition containing arginine (Arg). Therefore, it has been clarified that nicotinamide has the effect of significantly increasing the solubility of modified t-PA by the pharmaceutical composition of the present invention.
Similarly, when the solubility test 1 was performed in the same manner as described above except that the concentration of citrate in the citrate buffer was 40 mM, the same result as above was obtained.
[0019]
Test Example 2 (Solubility Test 2)
By repeating the solubility test 1 except that the concentration of nicotinamide in samples 3 and 4 was changed as shown in Table 2 below in the solubility test 1, the solubility of t-PA was Asked. The results are shown in Table 2.
[0020]
[Table 2]

From the results in Table 2 above, it was revealed that the solubility of the modified t-PA increases with increasing nicotinamide concentration in the pharmaceutical composition of the present invention. Also, from this result, it has been clarified that the solubility of t-PA sufficiently satisfying clinical use is achieved by allowing nicotinamide to coexist in the solution at a practical concentration of 0.3% or more.
[0021]
Test Example 3 (Solubility test)
In a buffer containing 5% nicotinamide, 1% mannitol and 0.01% Tween 80, the solubility of the modified t-PA was determined in the same manner as in Test Example 1 by changing the type of the buffer used together. The results are shown in Table 3 below.
[0022]
[Table 3]

From the results in Table 3 above, it is clear that the use of a citrate buffer greatly enhances the solubility of t-PA compared to the use of other buffers.
[0023]
Test Example 4 (Solubility Test 4)
Test example by changing the concentration of citrate in the citrate buffer used in t-PA lysis buffer (2.5% nicotinamide / 1% mannitol / 0.01% Tween 80 / citrate buffer, pH 5.6) The solubility of t-PA was determined in the same manner as in 1. The results are shown in Table 4 below and FIG.
[0024]
[Table 4]

From the results of Test Example 4, it was clarified that the effect of increasing the solubility of t-PA by nicotinamide was enhanced in a concentration-dependent manner by the presence of a citrate ion source having a concentration of up to 500 mM.
[0025]
Test Example 5 (Solubility test 5)
In the above solubility test 1, nicotinic acid to be combined is used except that natural t-PA of Preparation Example 2 is used instead of modified t-PA and a buffer containing 40 mM citric acid is used. The solubility of natural t-PA when the amide concentration was changed was determined in the same manner as described above. The results are shown in Table 5. The composition of the basal buffer used here is as follows.
Composition of basal buffer: 40 mM citrate buffer / 0.01% Tween80 (pH 7.2)
This buffer solution is referred to as buffer solution A.
[0026]
[Table 5]

[0027]
From the results of Table 5 above, it can be seen that the solubility of t-PA was improved by adding nicotinamide in natural t-PA. Moreover, it can be seen that, as a whole, the natural type t-PA has better solubility than the modified type t-PA.
[0028]
Test Example 6 (Freeze drying test 1)
Based on the results obtained in Solubility Test Examples 1 to 5, a modified t-PA freeze-dried preparation was prepared using a composition comprising the following components.
The modified t-PA precipitate, which has been stored frozen, is dissolved in a double concentration buffer, adjusted to a t-PA concentration of 3 mg / ml, sterilized by filtration, and dispensed into a glass vial. Note and freeze-dried in the following steps.
(1) Under normal pressure, the shelf temperature was −50 ° C. for 2 hours, followed by freezing at a shelf temperature of −24 ° C. for 1 hour, followed by preliminary freezing at −50 ° C. for 15 hours.
(2) The shelf temperature was raised to −5 ° C. under a reduced pressure of 0.1 Torr and primary drying was performed.
(3) After the primary drying, the shelf temperature was raised to 30 ° C. and secondary drying was performed.
(Prescription example)
Citrate buffer 100 mM
Nicotinamide 1.25%
Mannitol 1%
Tween80 0.01%
Modified t-PA 1.5 mg / ml
(PH 5.6)
The resulting lyophilized formulation was dissolved in water for injection. As a result, this freeze-dried preparation dissolved very quickly in water for injection and became a transparent liquid. In addition, the obtained injection maintained the activity of the modified t-PA and the normal protein structure. Therefore, it was shown from Test Example 6 that a high-concentration modified t-PA freeze-dried preparation can be produced.
Further, a test was performed in the same manner as described above except that 40 mM citrate buffer was used, and the same effect as described above was obtained.
[0029]
Test Example 7 (Frozen Dry Standard Stability Test 1)
The freeze-dried sample obtained in Test Example 6 was allowed to stand at 60 ° C. for a predetermined time and examined for stability. The stability was evaluated by the decay rate of the synthetic substrate (S-2288) hydrolytic activity and the residual ratio of the main peak in the anion exchange (DEAE) HPLC analysis.
The synthetic substrate hydrolytic activity was measured based on Pharmacopeial Previews, p.1223, Nov.-Dec., (1990). The analysis by anion exchange HPLC was carried out using 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 2 M urea as the mobile phase for the anion exchange column (DEAE-5PW: Tosoh Corporation). Gradient elution was performed with an eluent containing 0.2 M sodium chloride.
The results are shown in Table 6 below.
[0030]
[Table 6]

As can be seen from the results of Table 6 above, nicotinamide is effective not only for the solubilizing effect of t-PA but also for stability in a lyophilized state, and a pharmaceutical composition containing nicotinamide Thus, it is possible to produce a highly stable preparation.
[0031]
Test Example 8 (Liquid formulation stability test 1)
The modified t-PA was dissolved in a buffer containing nicotinamide and then left at 40 ° C. to examine the stability.
The stability was evaluated in the same manner as in Test Example 7. The results are shown in Table 7 below.
[0032]
[Table 7]

From the results of Table 7 above, it was shown that the pharmaceutical composition containing nicotinamide can stably maintain its properties even in liquid form. In particular, in the anion exchange HPLC analysis, it was confirmed that the increase of the modified product by heating was suppressed and the main peak was retained.
This effect was the same even when the citrate buffer was used in combination.
[0033]
【The invention's effect】
According to the present invention, the solubility and stability of t-PA are improved by using nicotinamide or a derivative thereof together with t-PA. Therefore, the present invention is useful as a preparation that can be used clinically for t-PA, for example, a preparation such as a lyophilized preparation.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of citric acid concentration on the solubility of t-PA.

Claims

A tissue plasminogen activator pharmaceutical composition comprising a tissue plasminogen activator, nicotinamide or a derivative thereof, and citric acid, wherein the derivative is an N- alkyl-substituted nicotinamide (provided that The substituted alkyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), and nicotinic acid amide having a ring-substituted alkyl group of nicotinic acid amide (provided that the substituted alkyl group has 1 to 5 carbon atoms). A tissue plasminogen activator pharmaceutical composition, wherein the pharmaceutical composition is selected from the group consisting of isonicotinic acid amide) .

The tissue plasminogen activator pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the tissue plasminogen activator is a modified tissue plasminogen activator.

The tissue plasminogen activator pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein nicotinamide or a derivative thereof is blended at a concentration of 0.1 to 50% (w / v%).

The tissue plasminogen activator pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the citric acid is contained at a concentration of 10 to 500 mM.

The tissue plasminogen activator pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, which is a freeze-dried preparation.

Tissue plasminogen activator comprising nicotinamide or a derivative thereof and citric acid in a medium containing the tissue plasminogen activator in order to increase the solubility of tissue plasminogen activator Wherein the derivative is an N- alkyl substituted nicotinic acid amide (wherein the substituted alkyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), nicotinic acid amide ring substitution A tissue characterized by being selected from the group consisting of nicotinamide having an alkyl group (wherein the substituted alkyl group is a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms) and isonicotinic acid amide Dissolution method of plasminogen activator.

The method according to claim 6, wherein the amount of the nicotinic acid amide or a derivative thereof is 0.1 to 50% (w / v%).

The method of claim 6, wherein the citric acid is formulated at a concentration of 10 to 500 mM.