JP3980683B2

JP3980683B2 - Reagent and method for measuring reduced nicotinamide coenzyme

Info

Publication number: JP3980683B2
Application number: JP22484996A
Authority: JP
Inventors: 仁岩崎; 正志小野; 浩田村
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1996-08-27
Publication date: 2007-09-26
Anticipated expiration: 2016-08-27
Also published as: JPH09121892A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元型ニコチンアミド補酵素、すなわち還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）の測定用試薬および測定方法に関し、更に詳しくは、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを含む液体試料にスチリル色素を反応させて、可視部の吸光度の変化を測定することを特徴とするＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ並びにこれらに関連する酵素や基質の測定方法およびこの測定方法に用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定方法としては、以下のような方法が知られている：
(１)ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収または蛍光を直接測定する方法、
(２)触媒の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィンの蛍光を測定する方法、
(３)電子伝達体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとＮＴＢやＭＴＴなどのテトラゾリウム塩とを反応させてホルマザン色素を生成し、その可視部の吸収を測定する方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記測定方法の内、紫外部の吸収及び蛍光を測定する方法(１)は、尿などを測定対象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍光を有する共存物質、たとえば、リボフラビンなどのビタミンＢ₂剤、フルオレッセインナトリウムなどの蛍光造影剤によって妨害を受けるという欠点を有している。
また、上記テトラゾリウム塩を発色剤として用いる方法は、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質の影響で、不所望のブランク発色を生じるという欠点を有している。
【０００４】
また、ＮＡＤＨを用いずに生体試料中の成分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法があるが、テトラゾリウム塩を用いる方法と同様に、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けて発色が阻害されるという欠点を有している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記課題を解決すべく鋭意研究に取り組んだ結果、ある種のスチリル色素を電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと作用させると、アスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けずに、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを、高い選択性で測定できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、式：
【化２】

【０００７】
［式中、ｍは、０を表し、ｎは、２〜３の数を表す。
Ｚは、インドレニン環状構造を表す。
Ｒ_１は、炭素数１〜５のアルキル基またはヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立に水素または式：ＮＲ_４Ｒ_５で表される置換アミノ基を表す。ここで、Ｒ_４およびＲ_５は、それぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基を表す。
Ｘは、アニオンを表す。］
で示されるスチリル色素の少なくとも１種と、メルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、ジアホラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の電子伝達体を含んでなる、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの測定用試薬、並びに
電子伝達体の存在下、上記スチリル色素を、液体試料中のＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと反応させ、可視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの測定方法
を提供する。
【０００８】
スチリル色素を示す上記式（Ｉ）において、Ｚによって形成されるインドレニン環の具体例としては、３,３−ジメチルインドレニン、５−クロロ−３,３−ジメチルインドレニン、５−カルボキシ−３,３−ジメチルインドレニン、５−スルホキシ−３,３−ジメチルインドレニン、３−シクロヘキシルインドレニン、５−メチルスルホニル−３,３−ジメチルインドレニンなどが挙げられる。
【０００９】
Ｒ_１の具体例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基などのアルキル基、およびこれらに対応するヒドロキシアルキル基が挙げられる。
【００１１】
Ｘの具体例としては、塩素イオン、臭素イオン、フッ素イオン及びヨウ素イオンなどのハロゲンイオン；メタンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオンなどのスルホン酸イオン；メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオンなどの硫酸イオンが挙げられ、その他、過塩素酸イオン、硝酸イオンなどのイオンも例示できる。
【００１３】
電子伝達体は、メルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート(１−ｍＰＭＳ)、ジアホラーゼなどがあげられるが、ジアホラーゼが好ましい。
【００１４】
スチリル色素は、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ１モルに対して
好ましくは０．１〜１０．０モル、より好ましくは、０．５〜２．０モル用いればよい。電子伝達体、たとえばジアホラーゼは、触媒として作用するので、その量は触媒量でよい。たとえば、０．１〜１．０mＫat／lのような割合で用いるとよい。
また、色素の選択、例えば式（Ｉ）中のｎの選択により測定波長を４００〜９００nmまで任意に選択することが可能である。
その他の測定パラメーターは、主として電子伝達体によって制約を受けるので、例えば電子伝達体がジアホラーゼの場合、測定可能なｐＨ域は５〜９（好ましくは７〜８）、温度は２０〜４０℃（好ましくは３０〜３７℃）、測定時間は１〜３０分の間で選択が可能である。
【００１５】
本発明の測定方法が対象とする液体試料は、典型的には体液、たとえば血液またはその成分（血漿、血清など）、尿、髄液などであるが、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを含む液体試料ならいずれも本発明の測定方法の対象となる。
【００１６】
これらの試料中に含まれる酵素または酵素の基質などの成分を測定しようとする場合、その酵素と基質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチンアミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。これにより、液体試料中の成分の量、濃度を測定することが出来る。
【００１７】
また、これらの試薬を吸収可能な担体に含浸する、または担体に塗布、印刷、噴霧することにより試験片を作製し、試料中に含まれる酵素又は酵素の基質などの成分を測定することもできる。担体としては、濾紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ポリスチレンフィルム、ガラス、セラミックなどがあげられるが、吸収可能な担体としては、濾紙が好適であり、一般的な担体としては、ポリエチレンテレフタレートフイルムが好適である。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の測定方法を用いれば、試料中に共存する目的物以外の還元性物質による不所望のブランク値の発生を防止することが可能となり、試料中の測定対象成分の測定の選択性を向上させることができる。
【００１９】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【００２０】
実施例１および比較例１〜２
以下の組成の試薬を調製した：
色素：０.０５ mmol／l
ジアホラーゼ０.８３ mkat／l
トリス-ＨＣl(pＨ８.０)：０.２０ mol／l
色素として、実施例１では、Ｚ＝３,３'−ジメチル−５−カルボキシ−インドレニン、Ｒ_１＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、Ｒ_２＝Ｎ(ＣＨ_３)_２、Ｒ_３＝Ｈ、Ｘ＝Ｂr⁻である上記式で示されるスチリル色素を使用し、比較例１では、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ:２−(４−インドフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド)を使用し、比較例２では、シアニン色素(９−エチル−５,５'−ジメトキシ−３,３'−ジスルホプロピル−２,２'−チアカルボシアニンヒドロキシドトリエチルアミン塩を使用した。
【００２１】
検体
測定用検体として、以下の４種を用いた：
(１)蒸留水
(２)β−ＮＡＤＨ(２５ μmol／l)［蒸留水中]
(３)アスコルビン酸(０．５g／l)
(４)β−ＮＡＤＨ(２５μmol／l)＋アスコルビン酸(０．５g／l)
測定手順
以上の試薬と検体を用い、以下の手順で、測定を行った：
(１)反応セルにトリス−ＨＣl(pＨ８.０)を２．６５ml量りとる。
(２)色素液０．１０ml、ジアホラーゼ０．１５mlを反応セルに加え撹拌した後３０℃で５分間インキュベートする。
(３)検体を０．１０ml反応セルに加え３０℃でインキュベートしながら、２分後及び５分後の吸光度を測定する。
【００２２】
結果
試薬液と検体(１)〜(４)それぞれとの反応について得られた吸光極大波長での吸光度値を表１に示す。
【００２３】
【表１】

【００２４】
試薬液と蒸留水を混合して得られた液の吸光極大波長における吸光度値をあらかじめ測定し、この値と、試薬液と上記検体(２)〜(４)を混合して得られた液の同波長での吸光度値との差(△ＯＤ)を求めた。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】

表１および表２の結果から、本発明による測定法はアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を受けること無く基質の濃度に比例して特異的に吸光度の変化を示し、その値から基質の濃度を定量的に求めることができることが分かる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reagent and a measurement method for measuring reduced nicotinamide coenzyme, that is, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and / or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). A NADH and / or NADPH and a related enzyme or substrate characterized by measuring a change in absorbance in the visible region by reacting a liquid sample containing NADH and NADPH with a styryl dye in the presence of a transmitter. The present invention relates to a measurement method and a reagent used in the measurement method.
[0002]
[Prior art]
The following methods are known as methods for measuring NADH and NADPH:
(1) A method for directly measuring absorption or fluorescence in the ultraviolet part of NADH and NADPH,
(2) A method for measuring the fluorescence of resorufin produced by the reaction of NADH and NADPH with resazurin in the presence of a catalyst,
(3) A method in which NADH and NADPH are reacted with a tetrazolium salt such as NTB or MTT in the presence of an electron carrier to produce a formazan dye, and the absorption in the visible region is measured.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Among the measurement methods described above, the method (1) for measuring absorption and fluorescence in the ultraviolet part is, when urine or the like is used as a measurement object, coexisting substances having absorption or fluorescence in the ultraviolet part, such as riboflavin. It has the disadvantage of being disturbed by fluorescent contrast agents such as vitamin B _{2 and} sodium fluorescein.
In addition, the method using the tetrazolium salt as a color former has a disadvantage that undesired blank color development occurs due to the influence of reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin coexisting in the sample.
[0004]
In addition, as a method of measuring components in a biological sample without using NADH, there is a method using an oxidase, but, as in the method using a tetrazolium salt, reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin coexist in the sample. It has the disadvantage that the color development is inhibited due to the influence of.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a reducing substance such as ascorbic acid or bilirubin when a certain styryl dye is allowed to act on NADH and / or NADPH in the presence of an electron carrier. It was found that NADH and / or NADPH can be measured with high selectivity without being influenced by the above, and the present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention provides the formula:
[Chemical 2]

[0007]
[Wherein, m represents 0 and n represents a number of 2 to 3.
Z represents an indolenine cyclic structure.
R ₁ represents an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or a hydroxyalkyl group, and R ₂ and R ₃ each independently represent hydrogen or a substituted amino group represented by the formula: NR ₄ R ₅ . Here, R ₄ and R ₅ each independently represent an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
X represents an anion. ]
NADH comprising at least one styryl dye represented by formula (1) and at least one electron carrier selected from the group consisting of Meldola Blue, 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, and diaphorase, and Reductive nicotine comprising: reacting NADH and / or NADPH in a liquid sample with the reagent for measuring NADPH and / or NADPH, and measuring the change in absorbance in the visible region A method for measuring amide adenine dinucleotide and / or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate is provided.
[0008]
In the above formulas showing the styryl dye (I), specific examples of indolenine ring formed by Z is 3, 3-dimethyl indolenine, 5-chloro-3,3-dimethyl-indolenine, 5-carboxy -3 , 3-dimethyl indolenine, 5- sulfoxy-3,3-dimethyl-indolenine, 3-cyclohexyl indolenine and 5-methylsulfonyl-3,3-dimethyl India renin and the like.
[0009]
Specific examples of R ₁ include a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isoamyl group of which the alkyl groups, and hydroxyalkyl groups corresponding to these.
[0011]
Specific examples of X include halogen ions such as chlorine ion, bromine ion, fluorine ion and iodine ion; sulfonic acid ions such as methanesulfonic acid ion and p-toluenesulfonic acid ion; sulfuric acid such as methyl sulfate ion and ethyl sulfate ion Examples thereof include ions such as perchlorate ion and nitrate ion.
[0013]
Examples of the electron carrier include Meldola Blue, 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-mPMS), diaphorase, and the like, but diaphorase is preferable.
[0014]
The styryl dye is preferably used in an amount of 0.1 to 10.0 mol, more preferably 0.5 to 2.0 mol based on 1 mol of NADH and / or NADPH. An electron carrier, such as diaphorase, acts as a catalyst, so the amount can be a catalytic amount. For example, it may be used at a rate of 0.1 to 1.0 mKat / l.
Further, the measurement wavelength can be arbitrarily selected from 400 to 900 nm by selecting a dye, for example, by selecting n in the formula (I).
Since other measurement parameters are mainly restricted by the electron carrier, for example, when the electron carrier is diaphorase, the measurable pH range is 5 to 9 (preferably 7 to 8), and the temperature is 20 to 40 ° C. (preferably 30 to 37 ° C.), and the measurement time can be selected from 1 to 30 minutes.
[0015]
The liquid sample targeted by the measurement method of the present invention is typically a body fluid such as blood or its components (plasma, serum, etc.), urine, spinal fluid, etc., but if it is a liquid sample containing NADH and / or NADPH Both are objects of the measurement method of the present invention.
[0016]
When measuring components such as enzymes or enzyme substrates contained in these samples, reduced nicotinamide produced by reacting substances produced by the enzyme and substrate together with reductase and oxidized nicotinamide coenzyme The amount of coenzyme is measured by the method of the present invention. Thereby, the quantity and density | concentration of the component in a liquid sample can be measured.
[0017]
In addition, a test piece can be prepared by impregnating a resorbable carrier with these reagents, or by applying, printing, or spraying the carrier, and components such as enzymes or enzyme substrates contained in the sample can be measured. . Examples of the carrier include filter paper, cloth, non-woven fabric, polyethylene terephthalate film, polystyrene film, glass, ceramic, and the like. As the carrier that can be absorbed, filter paper is suitable, and as a general carrier, polyethylene terephthalate film is used. Is preferred.
[0018]
【The invention's effect】
By using the measurement method of the present invention, it is possible to prevent the generation of an undesired blank value due to a reducing substance other than the target substance coexisting in the sample, and the measurement selectivity of the measurement target component in the sample is improved. Can be made.
[0019]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0020]
Example 1 and Comparative Examples 1-2
Reagents of the following composition were prepared:
Dye: 0.05 mmol / l
Diaphorase 0.83 mkat / l
Tris-HCl (pH 8.0): 0.20 mol / l
As a dye, in Example 1, Z = 3,3′-dimethyl-5-carboxy-indolenine, R ₁ = CH ₂ CH ₂ OH, R ₂ = N (CH ₃ ) ₂ , R ₃ = H, X = br ^- and is using a styryl dye represented by the formula in Comparative example 1, a tetrazolium salt (INT: 2-(4-indophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl -2H- tetrazolium In Comparative Example 2, a cyanine dye (9-ethyl-5,5′-dimethoxy-3,3′-disulfopropyl-2,2′-thiacarbocyanine hydroxide triethylamine salt was used.
[0021]
Samples The following four types of samples were used for measurement:
(1) Distilled water
(2) β-NADH (25 μmol / l) [distilled water]
(3) Ascorbic acid (0.5g / l)
(4) β-NADH (25 μmol / l) + ascorbic acid (0.5 g / l)
Measurement procedure The measurement was performed by the following procedure using the above reagents and specimens:
(1) Weigh 2.65 ml of Tris-HCl (pH 8.0) into the reaction cell.
(2) Add 0.10 ml of dye solution and 0.15 ml of diaphorase to the reaction cell, stir and then incubate at 30 ° C. for 5 minutes.
(3) Add the sample to the 0.10 ml reaction cell, and measure the absorbance after 2 minutes and 5 minutes while incubating at 30 ° C.
[0022]
Results Table 1 shows the absorbance values at the maximum absorption wavelength obtained for the reaction between the reagent solution and each of the samples (1) to (4).
[0023]
[Table 1]

[0024]
The absorbance value at the absorption maximum wavelength of the solution obtained by mixing the reagent solution and distilled water is measured in advance, and this value and the solution obtained by mixing the reagent solution and the specimens (2) to (4) are measured. The difference (ΔOD) from the absorbance value at the same wavelength was determined. The results are shown in Table 2.
[0025]
[Table 2]

From the results shown in Tables 1 and 2, the measurement method according to the present invention shows a specific change in absorbance proportional to the substrate concentration without being affected by reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin. It can be seen that the concentration of can be determined quantitatively.

Claims

formula:

[Wherein, m represents 0 and n represents a number of 2 to 3.
Z represents an indolenine cyclic structure.
R ₁ represents an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or a hydroxyalkyl group, and R ₂ and R ₃ each independently represent hydrogen or a substituted amino group represented by the formula: NR ₄ R ₅ . Here, R ₄ and R ₅ each independently represent an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
X represents an anion. ]
And a reduced form comprising at least one electron carrier selected from the group consisting of Meldola Blue, 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, and diaphorase A reagent for measuring nicotinamide adenine dinucleotide and / or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

The reagent for measurement according to claim 1, wherein diaphorase is used as the electron carrier.

The styryl dye represented by the formula (I) according to claim 1 is reacted with reduced nicotinamide adenine dinucleotide and / or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate contained in a liquid sample in the presence of an electron carrier. A method for measuring reduced nicotinamide adenine dinucleotide and / or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, comprising developing a color of the styryl dye and measuring a change in absorbance in the visible region.

The measurement method according to claim 3, wherein the liquid sample is blood, urine, spinal fluid or saliva.

The measurement method according to claim 3, wherein diaphorase is used as the electron carrier.

A test piece comprising impregnating a resorbable carrier containing the analytical reagent according to claim 1 or applying, printing or spraying on the carrier.