JP3781687B2

JP3781687B2 - Genetic diagnostic apparatus and genetic diagnostic method

Info

Publication number: JP3781687B2
Application number: JP2002042930A
Authority: JP
Inventors: 一芳森; 英明橋本; 毅西田; 瑞夫前田; 佳樹片山
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2006-05-31
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: JP2002340857A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子異常の有無を簡単、正確に検出できる遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての疾患には、遺伝性要因と環境要因が種々の確率で関与しているが、先天性代謝異常症・癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマー・自己免疫疾患・アトピー・肥満・アルコール依存などの疾患は、遺伝性要因が非常に大きな割合を占めている。一方、環境要素の寄与が大きい疾患は感染症や外傷の後遺症から誘因される疾患等である。
【０００３】
ところで、近年分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素、すなわち遺伝子の関与がかなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。現在、最も注目されているのはＳＮＰｓ（スニップス）と呼ばれるものである。これは、ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、個人間の遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。
【０００４】
人を含め地球上の全ての生命体遺伝子（または遺伝子の全集合体を意味するゲノム）は、共通の４つの塩基から成り立っており、この塩基の配列によって様々なタンパク質が作られ、各生物特有の生命活動が行われている。全ての生物に共通する４つの塩基とは、アデニン（Ａと表記される）、グアニン（Ｇと表記される）、チミン（Ｔと表記される）、シトシン（Ｃと表記される）である。人の遺伝子は、約３０〜３２億塩基配列で構成されているといわれているが、各個人で数百から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で他の人と１つの塩基が異なっている場所が存在する。通常、この１塩基の変化が、あるヒト集団の全人口中１％以上の頻度で存在しているものを、ＳＮＰｓと呼んでいる。
【０００５】
従って、全遺伝子（ゲノム）中には、３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しているといわれ、現在世界中でＳＮＰｓの探索が続けられている。ＳＮＰｓが注目されている理由は、ＳＮＰｓの分類により、統計的に各個人の遺伝子が関与しているといわれている多くの疾患に対する罹患率が推測できると考えられているからである。例えば、乳がんを例にとると、乳がんにかかった患者群と正常な群とのＳＮＰｓの比較により、乳がんにかかりやすい人に共通のＳＮＰｓを特定することができる。そして、健康診断時に、遺伝子を調査しそのＳＮＰｓを持った人、すなわち現在は正常でも将来乳がんにかかりやすい体質の人を見つけることが可能になる。
【０００６】
この診断によって、乳がんにかかりやすい体質の人は、頻繁に検査をすることで万一癌に罹患しても、超早期に治療が行え生存の可能性が向上する。それと同様のことが、糖尿病や高血圧などの生活習慣病についても言え、世界中で多くの人が苦しんでいる病気に対して発病の前から食事や生活指導を正確にすることが可能になる。
【０００７】
また、病気の治療に用いている薬剤に関してもＳＮＰｓは重要な役割を期待されている。治療の際に用いられる薬剤は全ての人に均等に効果を示すものではない。一般に薬剤は、ある割合の人には効果があっても他の人には全く効果が無く、かえって副作用等で逆の結果を招くことがあることも広く知られている。因みに、アメリカにおける死亡原因の中で薬剤による副作用が上位に位置しているのは周知のことである。薬剤の効果はその人がもつ体質に深く関与しており、その体質もＳＮＰｓの分類によって区別可能であると言われている。すなわち、ＳＮＰｓの解析による分類で、ある薬剤に対してあらかじめ効果や感受性が予測でき適正な処方をすることが可能になり、患者個々人の体質に合わせた最適な薬剤の投与や副作用の危険性の回避が期待されている。このような医療のことをテーラーメイド医療またはオーダーメイド医療と呼び、将来の実用化が確実視されている。
【０００８】
また癌は、正常な細胞においては重要な役割をする遺伝子上の特定の部位に例えば紫外線や変異原性物質の作用によって突然変異が生じることによって引き起こされることがわかっている。ある特定の遺伝子上の変異を読み取ることで細胞が癌化しているか否かを早い段階から診断できるようになる。そして、犯罪捜査における犯人の特定や曖昧な親子関係の確定さらには本人であるか否かの識別にもＳＮＰｓは、威力を発揮する。前述したように、各個人には３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しており、両親からそれぞれ別々のＳＮＰｓを引き継ぐため、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓをもつ人間は絶対に存在しないと言われている。これが個人の完全な特定を可能にする理由である。
【０００９】
このように、特定の遺伝子中の１塩基に起きた変異を観察することで医療をはじめ様々の事柄に多大な貢献をもたらす可能性がある。しかしながら現在、特定の遺伝子の変異を観察する方法は以下に述べるような非常に複雑な操作あるいは高価な装置を必要とし、ランニングコストも非常に嵩むため、広く利用されるまでには至っていない状況にある。
【００１０】
現在最も一般的に用いられているＳＮＰｓを調べる方法は、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）と呼ばれている方法である。遺伝子は１種類のタンパク質を形成するための塩基配列情報をもったＤＮＡの単位であるから、塩基配列を端から読んでいけばＳＮＰｓが解明することができる。シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、最も一般的に行われているのは以下に述べるジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。この方法を含めいずれの方法も、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動かキャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別できる技術が基になって成り立っている。
【００１１】
ジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）は、酵素的シーケンシングとも呼ばれ、１本鎖鋳型ＤＮＡの相補的鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを用い、さらに人工的につくった特殊な４種類のジデオキシヌクレオチドを利用するのが特徴である。シーケンシング操作としては、塩基配列を行いたい１本鎖ＤＮＡの３’末端を相補する合成塩基配列をプライマーとして用い、そのプライマーからＤＮＡポリメラーゼと均等に加えられたデオキシヌクレオチドを酵素反応によって伸長させる操作を行うが、この時同時に４つの反応容器を準備しておき、それぞれにＡＴＧＣ４つの塩基の３’末端に水酸基を持たない、従ってこれ以上ＤＮＡ伸長反応を続けることができない塩基アナログであるジデオキシヌクレオチドを別々に少量混入させておく。これにより、伸長中のＤＮＡの末端にジデオキシヌクレオチドが付加された時点でＤＮＡ合成がストップし、それぞれの反応容器中に様々な長さを持った、しかし端は必ず加えた塩基アナログである２本鎖ＤＮＡが形成される。この反応容器にＳ１エンドヌクレアーゼを反応させ、１本鎖ＤＮＡを全て消化し２本鎖ＤＮＡのみとする。こうして得られた４つの反応容器のＤＮＡ鎖をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動し、分離されたＤＮＡを短い方（速く移動したもの）から順に読めば、鋳型鎖と相補的なＤＮＡの塩基配列がわかる。この際、泳動結果の識別は、例えば加えるジデオキシヌクレオチドのリンまたはイオウを放射性標識したり蛍光を発する化学物質を結合させたりして行う。放射性標識の場合はフィルムへの露光での検出、蛍光化学物質の場合はレーザービームを照射し蛍光を検出する。最近では、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種類の塩基アナログを、それぞれ４種類の蛍光波長の異なる試薬により標識し、その４色の蛍光を同時に検出する方法も開発されている。
【００１２】
このように、従来は被験者から分離・精製した遺伝子の正確な塩基配列をこのジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）あるいはその他の塩基配列決定法により決定し、正常あるいは標準的な塩基配列と比較することによってＳＮＰｓの有無や突然変異の有無の確認、個人の識別等を行っている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、従来からの遺伝子配列決定法を利用した、遺伝子診断や遺伝子による個人の識別は、ターゲットとする遺伝子を単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行っていたため、実験に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要していた。また塩基配列決定のための自動化した装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、しかも高価な試薬を大量に必要とするものであった。
【００１４】
そこで、従来のこのような問題を解決するため本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判定できる遺伝子診断方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子診断装置は、密閉流路には、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、該第２の塩基配列が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとに対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートと、さらにＤＮＡ試料とが充填され、定電圧を印加することにより密閉流路内のＤＮＡが電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする。
【００１７】
これにより、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子診断方法は、密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとが該第２の塩基配列に対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、さらにＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加して、密閉流路内のＤＮＡを電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡの定量または異常ＤＮＡの定量、または、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率、もしくは、異常ＤＮＡを検出することを特徴とする。
【００１９】
これにより、一塩基違いの遺伝子異常でも短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、安価に、非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載された発明は、緩衝液を収容し第１電極が浸漬された第１容器と、緩衝液を収容し第２電極が浸漬された第２容器と、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして連絡した密閉流路と、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加する電源部と、電源部を制御して第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加する制御部と、密閉流路に設けられ、内部を通過するＤＮＡの通過量を検出する検出部を備え、密閉流路には、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、該第２の塩基配列が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとに対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートと、さらにＤＮＡ試料とが充填され、定電圧を印加することにより密閉流路内のＤＮＡが電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする遺伝子診断装置であるから、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００２１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００２２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００２３】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。
【００２４】
請求項２に記載された発明は、密閉流路が、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液で充たされ、且つ該緩衝液の中に分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とが分離状態で、リニアポリマーを挟んでこの順序で充填された分離用密閉流路カートリッジであって、該分離用密閉流路カートリッジを交換可能に装着する分離部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子診断装置であるから、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００２５】
請求項３に記載された発明は、密閉流路が１以上設けられたことを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子診断装置であるから、密閉流路ごとに遅延用ＤＮＡコンジュゲートと分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００２６】
請求項４に記載された発明は、遅延用ＤＮＡコンジュゲートが１種類以上含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、泳動速度を遅延用ＤＮＡコンジュゲートの比率を変えることで変化させることができる。
【００２７】
請求項５に記載された発明は、分離用ＤＮＡコンジュゲート及び／または遅延用ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００２８】
請求項６に記載された発明は、密閉流路内の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００２９】
請求項７に記載された発明は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００３０】
請求項８に記載された発明は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００３１】
請求項９に記載の発明は、前記密閉流路を加熱し、２重螺旋のＤＮＡ試料を引き離して１本鎖のＤＮＡ試料とする高温部を設けたことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料を１重鎖とする前処理を行うことなくそのまま用いることができるので、更に診断の自動化を図ることが可能である。
【００３２】
請求項１０に記載された発明は、第１容器に緩衝液を収容して第１電極を浸漬するとともに第２容器にも緩衝液を収容して第２電極を浸漬し、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして密閉流路で連絡し、次いで、該密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、第２の塩基配列と高分子化合物とが結合し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとが該第２の塩基配列に対して同等の結合力を備えてノイズＤＮＡだけを区別する遅延用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、さらにＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加して、密閉流路内のＤＮＡを電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡの定量または異常ＤＮＡの定量、または、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率、もしくは、異常ＤＮＡを検出することを特徴とする遺伝子診断方法であるから、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００３３】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００３４】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００３５】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。
【００３６】
以下、本発明の実施の形態における遺伝子診断装置と遺伝子診断方法について、図面を参照しながら説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図、図２は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図、図３は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図、図４は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図、図５は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図である。
【００３８】
図１において、１は遺伝子診断装置の電源スイッチ、２は装置の種々の操作を行うための操作ボタン、３は表示パネル、４は上蓋、５は装置の筐体である。図２、図３、図４において、６は電気泳動を行うための電気泳動部、７は電気泳動部６を支える支持台、８は電気泳動を行うための制御や後述する吸引ポンプ２０、検出部１５の制御を行い、検出したデータを演算する基板からなる制御演算部である。９は電源ボックス、９ａは電源ボックス９内に設けられた電源部である。電源部９ａは、本遺伝子診断装置ではＤＮＡの種類や濃度、処理条件ごとに異なった最適印加電圧値が存在するため、後述のＤＮＡ試料２３から異常ＤＮＡと正常ＤＮＡを分離するのに最も適した泳動が行えるように所定の電圧を制御演算部８の制御により印加する。１０はＤＮＡの２重螺旋（以下、２本鎖）を引き離すための高温部、１１は高温部１０と後記する分離部１２の温度を独立にするための断熱部、１２は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡとを分離するための所定温度に調整するとともに、この部分で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離する分離部、１３は高温部１０の温度を調整する第１温調器、１４は分離部１２の温度を調整する第２温調器である。
【００３９】
この分離部１２内の構成の詳細については後述するが、測定開始時には、図５に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が分離部１２の位置、また遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が断熱部１１付近、ＤＮＡ試料２３が高温部１０付近になるように配置する。そして、このように設定された配置と電圧制御、濃度調整、温度制御等を行うことにより、電気泳動させながら本遺伝子診断装置はＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに数分〜十数分で分離するものである。
【００４０】
このうちＤＮＡ試料２３は、本実施の形態１においては２本鎖を備えたまま高温部１０に充填、配置され、第１温調器１３を用いて（９０℃以上の所定温度±５℃）の温度になるように加熱、制御される。この加熱により導入されたＤＮＡの２本鎖が１本鎖に自動的に分離される。続いて、分離部１２では分離用ＤＮＡコンジュゲート２１（場合によっては一部の遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２も）が泳動作用を受けながら水素結合の結合力の差によってＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より少なくとも１０℃低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離するためにはＤＮＡの分離に適したこの所定の温度から±１℃の範囲で制御するのがよい。さらに、断熱部１１は、本来、分離部１２と高温部１０の間を熱的に遮断して温度調整するために設けられるものであるが、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２はこの付近に配置され、温度的には高温部１０の９０°以上の温度と分離部１２の２０℃〜６０℃の温度との中間温度に置かれ、この温度下での水素結合の結合力差により泳動作用を受けながら正常ＤＮＡと異常ＤＮＡをノイズＤＮＡから分離することができる。
【００４１】
１５は電気泳動するＤＮＡ試料の通過量を測定する検出部である。図４に基づいて検出部１５について説明すると、１５ａは紫外線を照射するＤ₂ランプ、１５ｂは紫外線を受光するフォトダイオード、１５ｃはフォトダイオード１５ｂが検出した微弱電流を増幅するプリアンプ、１５ｄはデジタル量に変換するＡ／Ｄコンバータである。これらの詳細は後述する。１６は電気泳動のときに正電位を印加する電極（本発明の第２電極）、１７は電気泳動のときに負電位を印加する電極（本発明の第１電極）であり、制御演算部８が電源部９ａを制御し、電極１６と電極１７との間に所定の定電圧を印加し、最も適当な電気泳動を生じさせる。図３、図４、図５において、１８は電気泳動のときの電荷の運搬とＤＮＡ試料のｐＨを安定させるための緩衝液、１８ａは緩衝液１８を収容する陰極側の容器（本発明の第１容器）、１８ｂは緩衝液１８を収容する陽極側の容器（本発明の第２容器）、１８ｄはＤＮＡ結合制御剤とリニアポリマーを緩衝液１８に添加したリニアポリマーゲルであり、電気泳動時にＤＮＡ試料２３が早い速度で泳動しないように泳動を邪魔する働きを持つものである。この働きにより、ＤＮＡ試料２３は遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２や分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とキャピラリー管１９内で充分遭遇する機会を持つことが可能となる。なお、１９は電気泳動のときにＤＮＡ試料２３を泳動するためのキャピラリー管（本発明の密閉流路）、２０はキャピラリー管１９の中に緩衝液１８やＤＮＡ試料２３、リニアポリマーゲル１８ｄなどの試薬を注入するための吸引ポンプである。容器１８ａの緩衝液１８の中には電極１７が浸漬され、容器１８ｂの緩衝液１８の中に電極１６が浸漬される。容器１８ａと容器１８ｂ内の緩衝液１８は、キャピラリー管１９内の緩衝液１８によって連通される。従って、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２にも緩衝液１８が液のベースとして混入しており、キャピラリー管１９中全ての部分で同じ濃度の緩衝液１８が存在している。電極１６と電極１７間に電圧を印加すると、キャピラリー管１９内に電気泳動が誘発され、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３は負に帯電しているため、容器１８ａ側から容器１８ｂ側へ分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３が移動するが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２には分子量が大きい高分子がついているため、電気泳動によってＤＮＡ試料２３の移動量と比較するとほとんど移動はしない。
【００４２】
次に、本発明の遺伝子診断装置で測定を行うために必要な詳細について説明する。本遺伝子診断装置で測定するＤＮＡ試料２３は、人の細胞や血液等から入手したＤＮＡである。約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの方法を利用して目的の部分を目的の長さに切り出して測定用に数を増加させる作業が必要である。ただ、このＰＣＲに関しては本遺伝子診断装置の説明に必要がないため具体的な説明を省略する。
【００４３】
ＰＣＲなどで取り出した目的のＤＮＡは塩基数でいうと６個程度〜１０００個程度であるが、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡの中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数としては、５０個程度であればよい。しかし、これは総数が５０個程度あればよいということであるから、数回に分けてＤＮＡを切り取る場合は６個〜１２個ずつに分けるのでもよい。そして、本発明者らの実験によると、本遺伝子診断装置で正常ＤＮＡと１塩基違いの異常ＤＮＡを分離する場合、塩基の個数は６個〜１２個が最も効率よく分離できるという結果を得ている。ただ、この異常ＤＮＡの分離はＤＮＡ試料２３の濃度（μＭ、但し、Ｍ＝モル／リットル）、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡの濃度（モル％）、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のＤＮＡの濃度（モル％）、測定温度、その他と密接な関係があるため、適正な条件にしないと分離が起こらないから、このような条件を設定することができるか否かに留意する必要がある。例えば、ＤＮＡ試料２３の濃度は１〜１０（μＭ）が適当であり、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に含まれるＤＮＡが、基本となるリニアポリマーのモルに対して０．０００２〜０．０５（モル％）程度が適当であるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のそれぞれのＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料２３の濃度の２０〜６００倍とするのが望ましい。以上説明したように本遺伝子診断装置のＤＮＡ試料は上述のＰＣＲなどにより前処理によって得られる６個程度〜１０００個程度の塩基配列を持つＤＮＡ試料が必要であり、適正な条件設定が必要である。
【００４４】
次に、図３、図４、図５のキャピラリー管１９について説明すると、キャピラリー管１９にゲルを入れて電気泳動を行うと、電気浸透流と呼ばれる液の流れが発生してしまうため、本遺伝子診断装置ではこの現象が起きないようにする必要がある。このためキャピラリー管１９の内壁をアクリルアミドなどでコーティングするのがよい。電気浸透流の発生が阻止できるならコーティング方法は他の方法でもよい。例えば、一般に販売されているコーティングキャピラリー管を使用するのでもよい。なお、キャピラリー管１９としては内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管が、紫外線を９０％以上透過でき、且つ後述するように紫外線を利用してＤＮＡを検出するとき、紫外線の通過量を容易に検出できるから最も適当である。そして、溝のある板と、紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせでキャピラリー管１９に相当する密閉流路を構成するのでも、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出を容易に行うことができる。なお、溝のある板を紫外線が透過可能な板にした場合は透過光を検出し、溝のある板を紫外線が不透過の板にした場合は、異常ＤＮＡを反射光で検出する。反射光を検出する場合には溝形状を均一な反射面とするため矩形断面にする等の工夫が必要である。
【００４５】
容器１８ａ，１８ｂの中やキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８は、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．２〜ｐＨ８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。このうちキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８に必要に応じて混入されるＤＮＡ結合制御剤としては、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に対するＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤と、離脱を促す尿素等の離脱剤の２種類が存在する。この２種類のＤＮＡ結合制御剤は、２種類の混合割合や、物質（例えば、結合促進剤として他の電解質）を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。リニアポリマーゲル１８ｄに含まれるリニアポリマーとしては、ポリアクリルアミドを用いることができ、これは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のコンジュゲート作成にも利用されるため、相性がよく適当である。
【００４６】
次に、キャピラリー管１９への充填順序であるが、図５に示すように先ずキャピラリー管１９内にリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液１８を含んだリニアポリマーゲル１８ｄを導入し、続いて以下詳述する分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を加える。分離用ＤＮＡコンジュゲート２１導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよい。図５の場合導入後に分離状態で導入している。続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と分離状態で遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を加える。分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と同様に、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよい。図５の場合導入後に分離状態で導入している。その後、緩衝液１８もしくは純水で希釈したＤＮＡ試料２３を導入して電気泳動する。
【００４７】
本実施の形態１では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を作成するのにアクリルアミドとＤＮＡを重合させているため、ＤＮＡとの重量差、構造差は大きく、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の泳動速度（０．６ｃｍ／分〜０．７ｃｍ／分）は、ＤＮＡの最適の泳動速度（１３ｃｍ／分〜２０ｃｍ／分）の１／２０〜１／３０程度であって、非常に動きが鈍く相対的に擬似的に固定されているといってもよいような状態が実現される。従って、測定開始時、充填物を収容したキャピラリー管１９を高温部１０、断熱部１１、分離部１２の間で位置を調整しながら、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を分離部１２内付近にし、断熱部１１付近から高温部１０にかけて遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を置くようにし、高温部１０には後述のＤＮＡ試料２３を配置する。このようにすることにより、高温部１０でＤＮＡ試料２３の２本鎖を１本鎖に分離できる。そして、高温部１０から断熱部１１にかけて遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２を充填したので速度差でノイズＤＮＡを分離でき、分離部１２で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することができる。
【００４８】
なお、遺伝子診断装置のキャピラリー管１９にＤＮＡ試料２３や分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液を交換的に導入する機構、例えば図３に示した吸引ポンプ２０のほかに、各ＤＮＡ試料２３や分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液をそれぞれ保管する容器と、その容器を自動的に交換し、それをキャピラリー管１９に接続する機構を装備するのが望ましい。
【００４９】
さらに、キャピラリー管１９を１本または複数本単位でユニット化し、これを交換用の分離用密閉流路カートリッジとして、分離部１２と高温部１０、断熱部１１に装着可能にし、分離部１２内の第２温調器１４、あるいは高温部１０内の第１温調器１３で温度制御するようにするのも適当である。キャピラリー管１９内に、予めリニアポリマーゲル１８ｄとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液１８を充填し、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３を分離状態で充填して分離用密閉流路カートリッジとして用意しておくことが可能になる。このように構成することで、測定を行うたびに分離用密閉流路カートリッジごと交換するため、分離用密閉流路カートリッジごとに分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２、ＤＮＡ試料２３の配置を予め設定できるから、測定が簡単に行え、且つ正確な測定が行える。なお、この分離用密閉流路カートリッジでは、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３を分離状態にするため、その間にリニアポリマーゲル１８ｄを挟んで充填している。それぞれの中にリニアポリマーゲル１８ｄを混合させて充填するのでもよい。
【００５０】
続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２について説明する。図６（ａ）は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図、図６（ｂ）は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図である。図６（ａ），（ｂ）において、２１は分離用ＤＮＡコンジュゲート、２２は遅延用ＤＮＡコンジュゲートである。ＤＮＡは二本鎖を形成するものとこれを分離した一本鎖のものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合し易い性質をもち、ＤＮＡの二本鎖においてはＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一本鎖のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）と配列されている場合、残りの鎖のＤＮＡは、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）という塩基配列をもっている。この関係は相補的関係と呼ばれるもので、この相補関係を充たす限り、ＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合により結合し、二本鎖を形成する。本発明ではこの関係を利用するために、図６（ａ）に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分にはＤＮＡ試料の正常ＤＮＡに相補的な塩基配列を持たせている。従って、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの塩基配列がＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）を含み、異常ＤＮＡがＡＴＣＡ^*ＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号３に記載）で、＊で示した部分で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの塩基が異なっている場合、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分の配列（本発明の第１の塩基配列）をＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）とすると、異常ＤＮＡはＡ^*において分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と相補的ではなくなるため水素結合せず、水素結合全体の結合力はＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより１塩基分の結合力分だけ大きくなる。その結果、後で説明する電気泳動時に正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより強い結合力で長い時間分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と結合するため、正常ＤＮＡは異常ＤＮＡより相対的に遅延するようになる。というのは、電気泳動時結合力だけでなく電気泳動による引離力も作用するから、多数のＤＮＡが断続的に結合と離脱を繰り返すような結合状態となるからである。そして、この泳動速度を平均的にみると、長い時間結合する正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより泳動速度が低下することになる。ＤＮＡ試料の中には、２本鎖のＤＮＡのうち測定対象ではない分離した残りの１本鎖ＤＮＡのように正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ以外のＤＮＡも含まれており、このＤＮＡが後で説明する電気泳動時にノイズとして作用するが、このノイズＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡとはほとんど無反応で結合しないから、最も速い泳動速度をもち分離されることになる。
【００５１】
そして、あらかじめノイズＤＮＡを正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群から確実に分離するために、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２に正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの両方が共通にもつ塩基配列に相補的な塩基配列（本発明の第２の塩基配列）を持たせれば、電気泳動時に正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群の方だけが遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と水素結合し、この分だけノイズＤＮＡより泳動速度が低下する。従って、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群がノイズＤＮＡより相対的に遅延し、ノイズＤＮＡを区別してその影響を排除することが可能となる。ノイズＤＮＡが結合するのは偶然に塩基が水素結合する場合であり、確率的にきわめて低い。なお、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の塩基配列（本発明の第２の塩基配列）は、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの両方を遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と水素結合させてノイズＤＮＡから分離するから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ双方がもつ塩基配列と相補的でなければならず、図６（ｂ）に示すように、例えばＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号４に記載）にするのが望ましい。なお、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡだけに確実に結合できる塩基配列を選ぶためには、両者に対してだけ結合する確率を高くするため、塩基配列の長さは長い方がよい。また、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のそれぞれのＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料の濃度の２０〜６００倍とするのが適当である。
【００５２】
次に、このような分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の作成・合成方法について説明する。ビニル化ＤＮＡを合成するために、ＰＣＲによって、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２用のＤＮＡを切り出す。上述の例では、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）が分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡであり、ＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号４に記載）が遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２のＤＮＡとなる。
【００５３】
次に、目的の塩基配列を有するＤＮＡの５’末端をアミノ化（通常は、ヘキシル基を介してアミノ化）する。このようにして得られたアミノ化ＤＮＡを２．６ｍＭになるように滅菌した超純水を加えて希釈する。次いで、ＭＯＳＵ（メタクリロイドオキシスクシンイミド）を７１．３８８ｍＭになるようにＤＭＳＯ（ディメチルスルオキシド）で希釈する。そして、このようにして得たアミノ化ＤＮＡとＭＯＳＵを１：５０の比率になるように加えて調整する。さらに、この調整溶液に対して、ｐＨ調整用としてｐＨ９になるように炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムで調整した溶液を、アミノ化ＤＮＡの量と等量加える。
【００５４】
そして、得られた溶液を一晩振とうする。その後、ＨＰＬＣ（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速液体クロマトグラフィー）を使用して、振とうした溶液中のビニル化ＤＮＡを、アミノ化ＤＮＡ，ＭＯＳＵ，その他と分離する。ビニル化ＤＮＡは溶離液（ＴＥＡＡ；トリエチルアミンー酢酸とアセトニトリルの混合溶液）を含んでいるため、さらに真空乾燥機能を持った遠心エバポレーターで減圧濃縮する。
【００５５】
次いで、重合溶液である１０％のＡＡＭ（アクリルアミド）を５３μｍｏｌ窒素置換する。さらに、重合開始剤である１．３４％のＴＥＭＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。これを重合開始剤である１．３４％のＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を同じく超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。さらに濃縮したビニル化ＤＮＡを滅菌した超純水で希釈する。そして、１００μｌのＤＮＡコンジュゲートを合成するために、上記のＡＡＭを３４μｌ、上記のＴＥＭＤとＡＰＳを各々５μｌ、ビニル化ＤＮＡがＡＡＭに対して０．０１％モル〜０．０５％モルになるように加え、１００μｌになるように滅菌超純水を追加して、６０分程度放置しておくとアクリルアミド化されたＤＮＡコンジュゲートが得られる。
【００５６】
なお、未反応のビニル化ＤＮＡを除去するために、適当な大きさの孔径選択したゲルろ過を数十回に分けて行うと、純度の高いＤＮＡコンジュゲートが得られる。本実施の形態１では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２の間で合成法は同じであるが、両者異なる合成法にすることもできる。
【００５７】
続いて、本実施の形態１の遺伝子診断装置の動作について説明する。先ず遺伝子診断装置内に、ＤＮＡ試料や各溶液を導入したキャピラリー管１９をセットし、図３、図４に示すように両端に容器１８ａ，１８ｂ内の緩衝液１８を浸す。この電極１６と電極１７間に電源部９ａによって後述する所定電圧を印加する。適当な電圧幅としては、望ましくは１０〜２０キロボルトが好ましいが、電解質や電極の状態により１００ボルト〜３０キロボルトでもよい。例えば、低電解質濃度の場合や、電極面積が大きな場合は電圧を低電圧にする。そして、最初から所定電圧を印加するのでなく、定電圧を印加する前に準備用の３０キロボルト以上の高電圧を印加し、ノイズＤＮＡをいち早く分離すれば、測定を迅速に行うことができる。
【００５８】
ここで、所定の電圧を印加する理由を説明すると、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に対するＤＮＡ試料の結合力と、電気泳動力による引離力との差が、ＤＮＡの泳動速度や移動差に大きな影響を与えるため、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの分離が最も効果的に行われる所定の定電圧を印加して電気泳動する必要があるからである。すなわち、この電圧は最も泳動しにくい正常ＤＮＡを電気泳動することができるという条件と、高電圧にすると正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分解能が低下するので、分解能を上げるため、できるだけ低電圧でなければならないという条件の２つを充たす電圧である。従って、予め印加する電圧として最適な電圧をＤＮＡごと、条件ごとに調べておき、当初３０キロボルト程度以上の準備電圧を短時間印加した後、この電圧を印加するようにする。なお、キャピラリー管１９内のＤＮＡは負に帯電しており陽極側に進むため、電源部９ａは電極１６を正電位、電極１７を負電位になるように印加する必要がある。また、電気泳動に当たっては、泳動時間を長くしすぎると、キャピラリー管１９内で緩衝液１８が乾燥するので、必要以上に長い時間泳動を行うのは避けなければならない。
【００５９】
電圧が印加されるとＤＮＡ試料は泳動され、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群は遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２との結合力が同等であるから、断続的な結合と離脱を繰り返しながらまったく同様に泳動していくため、ノイズＤＮＡと、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの群との間に大きな移動差が生じる。そして、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとの結合力に一塩基分の差があり、泳動されていくとき両者間に移動速度差が生じ、両者の間で移動差を生じる。
【００６０】
次に、分離が行われる高温部１０と分離部１２、断熱部１１の説明を行う。上述したように、高温部１０でＤＮＡの２本鎖を離すために９０℃以上の（所定温度±５℃）になるように第１温調器１３を用いて制御する。また、分離部１２では、ＤＮＡ試料の状態によっても異なるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１や遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料の結合力の差に基づいて、正常ＤＮＡや異常ＤＮＡ、あるいはノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より１０℃程度低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保たなければならない。実施の形態１の遺伝子診断装置では、キャピラリー管１９を覆っている分離部１２の下部に、シリコンラバーヒーターやニクロム線等と熱電対やサーマル等の温度センサーを配置し、第２温調器１４で所定の温度±１℃以下になるように管理する。ただ、環境温度によっては室温が目的の所定温度を超える場合もあり、シリコンラバーヒーターやニクロム線等に代えて、ペルチェ等の暖・冷可能な部品を使うのがよい。また、断熱部１１はガラスウールや発砲剤、雲母、多孔質セラミックス等の断熱材もしくは、中身を真空にしたものを使用するのでもよい。断熱部１１付近では遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が、高温部１０と分離部１２の中間温度となるから、これを利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとをノイズＤＮＡから分離することができる。
【００６１】
続いて、遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と分離用ＤＮＡコンジュゲート２１の作用で泳動速度に差が生じ、移動差が生じた正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡを、どのようにして検出するか説明する。図７は、泳動開始からの経過時間を横軸にして吸光度を縦軸にしたときの経過時間と吸光度の関係図である。検出は紫外線の照射が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡによって遮光されたときの吸光度を測定することで行う。実施の形態１においては、図５に示すようにキャピラリー管１９の一部でガラス部を露出させ、Ｄ₂ランプ１５ａから波長２６０ｎｍの紫外線を照射し、このとき得られる紫外線照射光をフォトダイオード１５ｂで検出し、吸光度を測定している。制御演算部８によって電源部９ａを制御してＤ₂ランプ１５ａを発光させ、フォトダイオード１５ｂで検出した電流はプリアンプ１５ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５ｄでデジタル量として吸光度に制御演算部８で換算される。制御演算部８はタイマ（図示しない）を内蔵し、泳動開始時間からの経過時間を測定することができる。図７において、時間的に早い方（Ｉ）が、ＤＮＡコンジュゲートと結合しないノイズＤＮＡ、時間が中位の（ＩＩ）が異常ＤＮＡ、時間が遅い（ＩＩＩ）が正常ＤＮＡである。
【００６２】
この関係図よりピークの高さと時間とピークの数を読み取れば、ピークの数からＤＮＡ試料に異常ＤＮＡが含まれていることが分かる。すなわち、ピークの数から異常ＤＮＡが存在するか否かが判定できる。なお、印加する電圧やＤＮＡ濃度、ＤＮＡの長さ（塩基の個数）によってはピークの数を異常ＤＮＡとノイズＤＮＡだけにすることができるから、このときは異常ＤＮＡの通過量だけを測定する。また、ピークの高さを比べるのは、同じ条件下で電気泳動されたＤＮＡ中の泳動速度差のある２つの集合の吸光度差を示すから、異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの存在比率に相当し、存在比率の判定が可能になる。異常ＤＮＡの存在量の判定は、標準ＤＮＡ試料の検出ピーク波形から得られた標準データを制御演算部８に予め入力しておき、そのデータと測定したデータを比較して換算すればよい。
【００６３】
以上説明したように、本実施の形態１の遺伝子診断装置と遺伝子診断方法によれば、細胞や血液等から取り出したＤＮＡの中で、特定のＤＮＡを制限酵素などで取り出したＤＮＡ試料中に含まれる正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの存在比率等が分かることにより、遺伝子診断、判定ができる。
【００６４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法について図１，図２，図４〜図８に基づいて説明する。図８は本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図である。実施の形態２の遺伝子診断装置は、実施の形態１の遺伝子診断装置をＤＮＡ試料としてＤＮＡの１本鎖のものに対応させたものであり、基本的に実施の形態１の遺伝子診断装置と同一であるから、特徴部分の説明を行うにとどめ、詳細な説明は実施の形態１に譲って省略する。
【００６５】
図８に示すように、実施の形態２の遺伝子診断装置では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２と１本鎖のＤＮＡ試料２３を直接分離部１２内に導入する。すなわち、電気泳動部６を基本的に分離部１２だけで構成している。実施の形態１の高温部１０、断熱部１１は存在しない。分離用密閉流路カートリッジの形式で導入する場合は、この順序で分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２とＤＮＡ試料２３が充填されたキャピラリー管１９を、測定ごとに交換して分離部１２に装着する。
【００６６】
実施の形態１においては、２本鎖のＤＮＡ試料２３が供給され、これを自動的に１本鎖にするために高温部１０が設けられている。しかし、実施の形態２においてはＤＮＡ試料２３として供給されるのが１本鎖のＤＮＡであり、２本鎖のＤＮＡを分離する必要がないため高温部１０と断熱部１１が不要になっている。従って、測定開始時には、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２が分離部１２付近、ＤＮＡ試料２３が分離部１２の入口付近になるように配置さえすれば、測定を直ちに実行できる。そして、分離部１２の第２温調器１４は、実施の形態１と同様に１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。このように温度制御することで、ＤＮＡ試料２３を、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と遅延用ＤＮＡコンジュゲート２２によって、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離することができる。
【００６７】
このように、実施の形態２の遺伝子診断装置は、高温部１０と断熱部１１が不要であるから、診断装置の構成が簡単化でき、制御も容易で、扱い易いものとすることができる。
【００６８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、以下のような有利な効果が得られる。
【００６９】
請求項１に記載された遺伝子診断装置は、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００７０】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００７１】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。これにより、癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマーなどの様々な遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、発症前の予防あるいは極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、突然変異が起き癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定して利用することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を遺伝子診断装置によって付与することができる。
【００７２】
請求項２に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が分離用密閉流路カートリッジであるから、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００７３】
請求項３に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が１以上設けられたから、密閉流路ごとに遅延用ＤＮＡコンジュゲートと分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００７４】
請求項４に記載された遺伝子診断装置は、遅延用ＤＮＡコンジュゲートが１種類以上含まれているから、泳動速度を遅延用ＤＮＡコンジュゲートの比率を変えることで変化させることができる。
【００７５】
請求項５に記載された遺伝子診断装置は、分離用ＤＮＡコンジュゲート及び／または遅延用ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであるから、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００７６】
請求項６に記載された遺伝子診断装置は、分離部が内部の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離するから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００７７】
請求項７に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７８】
請求項８に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７９】
請求項９に記載の発明は、２重螺旋のＤＮＡ試料を引き離して１本鎖のＤＮＡ試料とすることを特徴とする請求項１〜８に記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料を１重鎖とする前処理を行うことなくそのまま用いることができるので、更に診断の自動化を図ることが可能である。
【００８０】
請求項１０に記載された遺伝子診断方法は、第２電極と第１電極間に所定の定電圧を印加し、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート、遅延用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、遅延用ＤＮＡコンジュゲート、次いで、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させ、更に、分離用ＤＮＡコンジュゲートにより正常ＤＮＡの泳動速度を異常ＤＮＡの泳動速度に対して低下させることができる。
【００８１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、両コンジュゲートや試料の各濃度調整および両コンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００８２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながら、まず遅延用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧を印加したとき一番先に泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、遅延用ＤＮＡコンジュゲートのほか、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、コンジュゲートとの作用をなかなか振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ所定の電圧を印加するだけで良いから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。この遺伝子診断方法によれば、遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、予防と極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し、各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を与えることができる。
【００８３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図
【図２】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図
【図３】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の装置構成図
【図４】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図
【図５】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートと遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図
【図６】（ａ）本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図
（ｂ）本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の遅延用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図
【図７】経過時間と吸光度の関係図
【図８】本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図
【符号の説明】
１電源スイッチ
２操作ボタン
３表示パネル
４上蓋
５筐体
６電気泳動部
７支持台
８制御演算部
９電源ボックス
９ａ電源部
１０高温部
１１断熱部
１２分離部
１３第１温調器
１４第２温調器
１５検出部
１５ａＤ₂ランプ
１５ｂフォトダイオード
１５ｃプリアンプ
１５ｄＡ／Ｄコンバータ
１６，１７電極
１８緩衝液
１８ａ，１８ｂ容器
１８ｄリニアポリマーゲル
１９キャピラリー管
２０吸引ポンプ
２１分離用ＤＮＡコンジュゲート
２２遅延用ＤＮＡコンジュゲート
２３ＤＮＡ試料[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a genetic diagnostic apparatus and a genetic diagnostic method that can easily and accurately detect the presence or absence of a genetic abnormality.
[0002]
[Prior art]
All diseases involve genetic factors and environmental factors with various probabilities, but diseases such as congenital metabolic disorders, cancer, diabetes, hypertension, Alzheimer, autoimmune diseases, atopy, obesity, and alcoholism Hereditary factors account for a very large proportion. On the other hand, diseases that have a large contribution of environmental factors include diseases caused by infections and aftereffects of trauma.
[0003]
By the way, due to the rapid development of molecular biology in recent years, genetic elements, that is, gene involvement in various diseases have been elucidated fairly accurately, and attention has been focused on gene-targeted medicine. Yes. At present, what is attracting the most attention is SNPs (snips). This is an abbreviation for single nucleotide polymorphism, which is generally translated as “single nucleotide polymorphism”, and is a general term for differences in one code (one base) in genes between individuals.
[0004]
All life-form genes on earth, including humans (or the genome that means the entire collection of genes), are composed of four common bases, and various proteins are created by the sequence of these bases. Life activities are taking place. The four bases common to all organisms are adenine (denoted as A), guanine (denoted as G), thymine (denoted as T), and cytosine (denoted as C). Human genes are said to be composed of about 3 to 3.2 billion base sequences, but each individual has a base that is different from other people at a rate of about one in several hundred to 1000 bases. Exists. Usually, this single base change is present at a frequency of 1% or more in the total population of a certain human population, and is called SNPs.
[0005]
Therefore, it is said that there are 3 to 10 million SNPs in all genes (genome), and the search for SNPs is currently continued all over the world. The reason why SNPs are attracting attention is that it is considered that the morbidity rate for many diseases, which are said to be statistically related to the genes of each individual, can be estimated by the classification of SNPs. For example, taking breast cancer as an example, SNPs common to those who are likely to have breast cancer can be identified by comparing SNPs between a group of patients with breast cancer and a normal group. At the time of a health examination, it becomes possible to find a person who has investigated the gene and has the SNPs, that is, a person who is normal but is likely to have breast cancer in the future.
[0006]
With this diagnosis, a person with a constitution that is likely to have breast cancer can be treated very early, and the possibility of survival can be improved even if he / she suffers from cancer. The same can be said for lifestyle-related diseases such as diabetes and hypertension, and it is possible to accurately diet and guide living before the onset of diseases that many people around the world suffer.
[0007]
In addition, SNPs are expected to play an important role regarding drugs used for treatment of diseases. Drugs used during treatment are not equally effective for everyone. In general, it is well known that drugs are effective for a certain proportion of people but not for others at all, and may cause adverse results due to side effects. Incidentally, it is well known that drug side effects are at the top of the causes of death in the United States. The effect of the drug is deeply related to the constitution of the person, and the constitution is said to be distinguishable by the classification of SNPs. That is, the classification based on the analysis of SNPs makes it possible to predict the effect and sensitivity of a certain drug in advance and make an appropriate prescription, and the optimal drug administration and risk of side effects according to the individual patient's constitution. Avoidance is expected. Such medical care is called tailor-made medical care or tailor-made medical care, and future practical use is surely expected.
[0008]
In addition, it is known that cancer is caused by a mutation occurring at a specific site on a gene that plays an important role in normal cells, for example, by the action of ultraviolet rays or mutagenic substances. By reading a mutation on a specific gene, it becomes possible to diagnose from an early stage whether or not a cell is cancerous. SNPs are also effective in identifying criminals in criminal investigations, determining ambiguous parent-child relationships, and identifying whether or not they are individuals. As described above, there are 3 to 10 million SNPs in each individual, and since there are separate SNPs from parents, there are absolutely no humans on the planet who have the same SNPs even if they are parents and siblings. It is said not to. This is the reason why complete identification of individuals is possible.
[0009]
In this manner, observing a mutation that occurs at one base in a specific gene may greatly contribute to various matters including medical treatment. However, at present, the method of observing a mutation of a specific gene requires a very complicated operation or an expensive apparatus as described below, and the running cost is very high, so that it has not yet been widely used. is there.
[0010]
The most commonly used method for examining SNPs at present is a method called sequencing (determining the base sequence) in which the base sequence of DNA is directly read from the end. Since a gene is a unit of DNA having base sequence information for forming one kind of protein, SNPs can be elucidated by reading the base sequence from the end. There are several reports on the sequencing method, but the most commonly performed method is dideoxy sequencing (Sanger method) described below. All of these methods, including this method, are based on a technique that can separate and identify the difference in length of one base length by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis with high resolution.
[0011]
The dideoxy sequencing (Sanger method), also called enzymatic sequencing, uses DNA polymerase to synthesize complementary strands of single-stranded template DNA, and then produces four special types of dideoxynucleotides artificially created. The feature is to use. As a sequencing operation, a synthetic base sequence that complements the 3 'end of the single-stranded DNA to be sequenced is used as a primer, and deoxynucleotides added equally from the primer to DNA polymerase are extended by an enzymatic reaction. At this time, four reaction vessels were prepared at the same time, and each did not have a hydroxyl group at the 3 'end of the ATGC four bases, and therefore dideoxynucleotide, a base analog that could not continue the DNA extension reaction any more. Mix a small amount separately. As a result, DNA synthesis was stopped when dideoxynucleotide was added to the end of the extending DNA, and each reaction vessel had various lengths, but the ends were always added base analogs. Stranded DNA is formed. The reaction vessel is reacted with S1 endonuclease to digest all the single-stranded DNA into only double-stranded DNA. If the DNA strands of the four reaction vessels thus obtained are subjected to gel electrophoresis or capillary electrophoresis, and the separated DNA is read in order from the shorter one (moved faster), the base sequence of the DNA complementary to the template strand will be Recognize. At this time, the electrophoresis results are identified by, for example, radioactively labeling the added dideoxynucleotide phosphorus or sulfur or binding a fluorescent chemical substance. In the case of a radioactive label, detection is performed by exposure to a film. In the case of a fluorescent chemical substance, fluorescence is detected by irradiating a laser beam. Recently, a method has been developed in which four types of base analogs A, T, G, and C are labeled with four types of reagents having different fluorescence wavelengths, and the four colors of fluorescence are simultaneously detected.
[0012]
In this way, the conventional base sequence of a gene isolated and purified from a subject is determined by this dideoxy sequencing (Sanger method) or other base sequence determination method, and compared with a normal or standard base sequence. Confirmation of the presence of SNPs and mutations, identification of individuals, etc.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, genetic diagnosis and identification of individuals by gene using conventional gene sequencing methods are performed by isolating the target gene, then amplifying and purifying it, and using a device for determining the base sequence of the gene. Since it was performed by reading the base sequence of the target gene, the experiment required a huge amount of work, a very long time, and a great running cost. In addition, an automated apparatus for determining a base sequence is very expensive, occupies a large space, and requires a large amount of expensive reagents.
[0014]
Therefore, in order to solve such a conventional problem, the present invention can detect a genetic abnormality of one or more nucleotides in a short time, easily and accurately, and is small, light and inexpensive, and has a very low running cost. An object of the present invention is to provide a genetic diagnosis apparatus capable of automating diagnosis.
[0015]
Furthermore, an object of the present invention is to provide a genetic diagnosis method that can easily and accurately determine a gene abnormality of one or more nucleotides in a short time.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the genetic diagnosis apparatus of the present invention has a binding channel in which a first base sequence capable of hydrogen bonding to a DNA sample and a polymer compound are bound in a buffer channel in a buffer. A DNA conjugate for separation that separates a DNA sample into normal DNA and abnormal DNA from the difference between the second base sequence and the polymer compound, and the second base sequence is different from normal DNA and abnormal DNA. In addition, a delay DNA conjugate that distinguishes only noise DNA with an equivalent binding force and a DNA sample are filled, and by applying a constant voltage, the DNA in the sealed channel is electrophoresed, and the detection unit The amount of passage of normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA is measured, respectively.
[0017]
Thereby, a genetic abnormality of one base or more can be detected easily and accurately in a short time, and the diagnosis can be automated with a small size, light weight, low cost, and very low running cost.
[0018]
In the genetic diagnosis method of the present invention, the first base sequence capable of hydrogen bonding to the DNA sample and the polymer compound are bound in the buffer solution in the sealed channel, and the DNA sample is determined from the difference in binding strength. Filled with a DNA conjugate for separation that separates normal DNA and abnormal DNA, followed by binding of the second base sequence and the polymer compound, and normal DNA and abnormal DNA to the second base sequence Fill with a delaying DNA conjugate that has equivalent binding force to distinguish only noise DNA, add a DNA sample, and then apply a positive potential to the second electrode and a negative potential to the first electrode, A predetermined constant voltage is applied between the second electrode and the first electrode, the DNA in the sealed channel is electrophoresed, normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA are separated, normal DNA quantification or abnormal DNA Quantitative or The ratio of normal DNA and abnormal DNA, or, and detects the abnormal DNA.
[0019]
Thereby, even a single base difference gene abnormality can be detected easily and accurately in a short time, and the diagnosis can be automated at a low cost with a very low running cost.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The invention described in claim 1 includes a first container in which a buffer solution is stored and the first electrode is immersed, a second container in which the buffer solution is stored and the second electrode is immersed, a first container, and a second container. A sealed channel that is connected by filling a buffer containing a linear polymer and a DNA binding controller between the containers, a power supply unit that applies a positive potential to the second electrode and a negative potential to the first electrode, and a power supply unit A control unit that controls and applies a predetermined constant voltage between the second electrode and the first electrode, and a detection unit that is provided in the sealed channel and detects the amount of DNA passing through the interior, Is a DNA conjugate for separation in which a first base sequence capable of hydrogen bonding to a DNA sample and a polymer compound are bound in a buffer solution, and the DNA sample is separated into normal DNA and abnormal DNA from the difference in binding strength. And the second base sequence and the polymer compound are combined, and the second base sequence A DNA conjugate for delay that has only the same binding force to normal DNA and abnormal DNA and distinguishes only noise DNA, and a DNA sample are filled, and DNA in a closed channel is applied by applying a constant voltage. Is applied to the second electrode and the first electrode, so that a predetermined constant voltage is applied between the second electrode and the first electrode. However, since the DNA sample can be electrophoresed, the separation DNA conjugate and the delay DNA conjugate are combined with the polymer compound, so the migration speed is only a few percent compared to the DNA sample ( However, depending on the type and length of the polymer compound, it can be relatively fixed in a pseudo state. Thus, the DNA sample is electrophoretically passed through the retarding DNA conjugate and then the separating DNA conjugate portion. At that time, first, by using the difference in hydrogen bond strength with the DNA conjugate for delay, the migration speed of normal DNA and abnormal DNA group is reduced with respect to noise DNA, and further, the migration of normal DNA is performed with the DNA conjugate for separation. The speed can be reduced relative to the migration speed of abnormal DNA.
[0021]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is very easy to adjust the concentration of both conjugates and samples and the mixing ratio of both conjugates and samples. .
[0022]
While normal DNA and abnormal DNA move, they are first subjected to the action of the binding force of the delay DNA conjugate, and noise DNA that does not receive this action is migrated first when a voltage is applied and detected by the detector. The However, the binding force with the DNA conjugate for separation as well as the DNA conjugate for separation acts on the abnormal DNA (however, it is weaker by one base compared with normal DNA), and the action with the conjugate cannot be easily shaken off. Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on normal DNA, and it migrates later than abnormal DNA as well as noise DNA, and is finally detected by the detection unit. Thereby, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs.
[0023]
In this way, DNA and DNA can be separated in a short time of several minutes to tens of minutes because of the use of electrophoresis and DNA hydrogen bonding, and it is only necessary to apply a predetermined voltage, making it extremely easy to achieve an optimum voltage with high resolution. Therefore, it is possible to accurately detect the presence / absence of DNA abnormality, to be a small, lightweight, low running cost, and very easy to automate diagnosis.
[0024]
In the invention described in claim 2, the sealed flow path is filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, and a separation DNA conjugate and a delay DNA conjugate are contained in the buffer solution. A separation sealed flow path cartridge filled in this order with a linear polymer in a separated state from a DNA sample, and having a separation section for mounting the separation closed flow path cartridge in a replaceable manner 2. The genetic diagnosis apparatus according to claim 1, wherein the separation sealing is preliminarily filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, a separation DNA conjugate, a delay DNA conjugate, and a DNA sample. A flow path cartridge can be prepared, and it is only necessary to replace and attach the separation closed flow path cartridge to the separation section for each measurement, making measurement simple and easy It can be carried out.
[0025]
Since the invention described in claim 3 is the genetic diagnostic apparatus according to

claim

1 or 2 characterized in that one or more sealed channels are provided, a delay DNA conjugate and The separation environment of normal DNA and abnormal DNA of the DNA sample can be changed for each sealed flow path by changing the separation DNA conjugate and the DNA binding control agent.
[0026]
The invention described in claim 4 is the genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 3, characterized in that one or more types of DNA conjugates for delaying are included, so that the migration speed is delayed. It can be changed by changing the ratio of the DNA conjugate for use.
[0027]
The invention described in claim 5 is the genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the DNA conjugate for separation and / or the DNA conjugate for delay is vinylated DNA. Therefore, it is possible to clearly separate normal DNA and abnormal DNA of a DNA sample for measurement.
[0028]
The invention described in claim 6 is characterized in that the normal DNA and the abnormal DNA are separated by adjusting the liquid in the closed flow path to 20 ° C to 60 ° C. Because it is a genetic diagnostic device, normal DNA and abnormal DNA can be bound to or detached from the DNA conjugate for separation and the DNA conjugate for delay by adjusting the temperature. Thereafter, each can be measured by the detection unit.
[0029]
The invention described in claim 7 is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm. One of Therefore, the detection of abnormal DNA can be facilitated by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough.
[0030]
The invention described in claim 8 is characterized in that the closed flow path is a combination of a grooved plate and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays. One of 6 Therefore, the detection of abnormal DNA can be facilitated by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough.
[0031]
The invention according to claim 9 is: Heating the closed channel; Separate the double helix DNA sample into a single-stranded DNA sample A high temperature part was provided. Claims 1 to 8 characterized in that One of Since it can be used as it is without performing the pretreatment which makes a DNA sample a single chain, it is possible to further automate the diagnosis.
[0032]
According to the tenth aspect of the present invention, the buffer solution is accommodated in the first container and the first electrode is immersed, the buffer solution is also accommodated in the second container and the second electrode is immersed, and the first container and the first container are immersed in the first container. Between the two containers, a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent is filled and communicated through a sealed channel, and then the first base capable of hydrogen bonding to the DNA sample is placed in the buffer in the sealed channel. The sequence and polymer compound are combined, and a DNA conjugate for separation that separates the DNA sample into normal DNA and abnormal DNA from the difference in binding force is filled, and then the second base sequence and polymer compound are combined. Then, normal DNA and abnormal DNA are packed with a delay DNA conjugate that has an equivalent binding force to the second base sequence and discriminates only noise DNA, and further a DNA sample is added. Apply a positive potential to the electrode and A negative potential is applied to the electrode, a predetermined constant voltage is applied between the second electrode and the first electrode, the DNA in the sealed channel is electrophoresed, and normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA are separated, Since it is a genetic diagnosis method characterized by detecting normal DNA quantification or abnormal DNA quantification, or the ratio of normal DNA to abnormal DNA, or abnormal DNA, a predetermined amount between the second electrode and the first electrode A DNA sample can be electrophoresed by applying a constant voltage. However, since the separation DNA conjugate and the delay DNA conjugate are combined with a polymer compound, the migration speed is several percent compared to the DNA sample. However, it depends on the type and length of the polymer compound, and can be relatively fixed in a pseudo state. Thus, the DNA sample is electrophoretically passed through the retarding DNA conjugate and then the separating DNA conjugate portion. At that time, first, by using the difference in hydrogen bond strength with the DNA conjugate for delay, the migration speed of normal DNA and abnormal DNA group is reduced with respect to noise DNA, and further, the migration of normal DNA is performed with the DNA conjugate for separation. The speed can be reduced relative to the migration speed of abnormal DNA.
[0033]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is very easy to adjust the concentration of both conjugates and samples and the mixing ratio of both conjugates and samples. .
[0034]
While normal DNA and abnormal DNA move, they are first subjected to the action of the binding force of the delay DNA conjugate, and noise DNA that does not receive this action is migrated first when a voltage is applied and detected by the detector. The However, the binding force with the DNA conjugate for separation as well as the DNA conjugate for separation acts on the abnormal DNA (however, it is weaker by one base compared with normal DNA), and the action with the conjugate cannot be easily shaken off. Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on normal DNA, and it migrates later than abnormal DNA as well as noise DNA, and is finally detected by the detection unit. Thereby, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs.
[0035]
In this way, DNA and DNA can be separated in a short time of several minutes to tens of minutes because of the use of electrophoresis and DNA hydrogen bonding, and it is only necessary to apply a predetermined voltage, making it extremely easy to achieve an optimum voltage with high resolution. The presence or absence of DNA abnormality can be accurately detected.
[0036]
Hereinafter, a genetic diagnostic apparatus and a genetic diagnostic method according to embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0037]
(Embodiment 1)
FIG. 1 is an external view of a genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention, FIG. 2 is an external view of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention, and FIG. 3 is a gene according to Embodiment 1 of the present invention. FIG. 4 is a main part diagram of the control circuit of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention, and FIG. 5 is a diagram for separation in the sealed flow path of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention. It is an introduction state figure of a DNA conjugate, a DNA conjugate for delay, and a DNA sample.
[0038]
In FIG. 1, 1 is a power switch of the genetic diagnosis apparatus, 2 is an operation button for performing various operations of the apparatus, 3 is a display panel, 4 is an upper lid, and 5 is a casing of the apparatus. 2, 3, and 4, 6 is an electrophoresis unit for performing electrophoresis, 7 is a support base that supports the

electrophoresis unit

6, 8 is a control for performing electrophoresis, a suction pump 20 described later, and detection. It is a control calculation part which consists of a board | substrate which controls the part 15 and calculates the detected data. Reference numeral 9 denotes a power supply box, and 9a denotes a power supply unit provided in the power supply box 9. The power supply unit 9a is most suitable for separating abnormal DNA and normal DNA from a DNA sample 23, which will be described later, because there is an optimum applied voltage value that differs depending on the type, concentration, and processing conditions of DNA in this genetic diagnosis apparatus. A predetermined voltage is applied under the control of the control calculation unit 8 so that electrophoresis can be performed. 10 is a high temperature part for separating the double helix (hereinafter, double strand) of DNA, 11 is a heat insulating part for making the temperature of the high temperature part 10 and the separation part 12 described later independent, and 12 is normal DNA and abnormal DNA And a separation unit that separates normal DNA and abnormal DNA in this part, 13 is a first temperature controller that regulates the temperature of the

high temperature part

10, and 14 is a separation part. It is the 2nd temperature controller which adjusts the temperature of 12.
[0039]
The details of the configuration in the separation unit 12 will be described later. At the start of measurement, as shown in FIG. 5, the separation DNA conjugate 21 is located at the separation unit 12, and the delay DNA conjugate 22 is near the heat insulation unit 11. The DNA sample 23 is arranged so as to be in the vicinity of the high temperature part 10. Then, by performing the arrangement, voltage control, concentration adjustment, temperature control, and the like set in this way, the present gene diagnosis apparatus converts the DNA sample 23 into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA for several minutes to 10 minutes while performing electrophoresis. It will separate in minutes.
[0040]
Among them, the DNA sample 23 is filled and arranged in the high temperature part 10 with double strands in the first embodiment, and the first temperature controller 13 is used (predetermined temperature of 90 ° C. or higher ± 5 ° C.). It is heated and controlled so that the temperature becomes. The double strands of DNA introduced by this heating are automatically separated into single strands. Subsequently, in the separation unit 12, the DNA sample 23 is abnormally treated as normal DNA due to a difference in hydrogen bonding strength while the separation DNA conjugate 21 (and in some cases, some of the retardation DNA conjugates 22) is subjected to an electrophoretic action. In order to be able to separate DNA from noise DNA, the temperature is controlled to be at least 10 ° C. lower than the temperature of the high temperature portion 10, that is, at a predetermined temperature in the temperature range of 15 ° C. to 80 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C. In order to separate normal DNA from abnormal DNA, it is preferable to control within a range of ± 1 ° C. from this predetermined temperature suitable for DNA separation. Further, the heat insulating part 11 is originally provided to adjust the temperature by thermally blocking between the separating part 12 and the high temperature part 10, but the delaying DNA conjugate 22 is disposed in the vicinity thereof, In terms of temperature, it is placed at an intermediate temperature between the temperature of 90 ° or higher of the high temperature part 10 and the temperature of 20 ° C. to 60 ° C. of the separation part 12, while undergoing the electrophoretic action due to the difference in hydrogen bond strength at this temperature. Normal DNA and abnormal DNA can be separated from noise DNA.
[0041]
Reference numeral 15 denotes a detection unit that measures the passing amount of the DNA sample to be electrophoresed. The detection unit 15 will be described with reference to FIG. ₂ A lamp, 15b is a photodiode that receives ultraviolet light, 15c is a preamplifier that amplifies a weak current detected by the photodiode 15b, and 15d is an A / D converter that converts it into a digital quantity. Details of these will be described later. Reference numeral 16 denotes an electrode that applies a positive potential during electrophoresis (second electrode of the present invention), and 17 denotes an electrode that applies a negative potential during electrophoresis (first electrode of the present invention). Controls the power supply unit 9a and applies a predetermined constant voltage between the electrode 16 and the electrode 17 to cause the most appropriate electrophoresis. 3, 4, and 5, 18 is a buffer solution for carrying charge during electrophoresis and stabilizing the pH of the DNA sample, and 18 a is a cathode-side container containing the buffer solution 18 (the first embodiment of the present invention). 1 container), 18b is a container on the anode side (second container of the present invention) containing the buffer solution 18, and 18d is a linear polymer gel in which a DNA binding control agent and a linear polymer are added to the buffer solution 18. The DNA sample 23 has a function of hindering migration so that it does not migrate at a high speed. This function makes it possible for the DNA sample 23 to have sufficient opportunity to encounter the delay DNA conjugate 22 or the separation DNA conjugate 21 in the capillary tube 19. Reference numeral 19 denotes a capillary tube (a sealed channel of the present invention) for electrophoresis of the DNA sample 23 during electrophoresis, and 20 denotes a buffer solution 18, a DNA sample 23, a linear polymer gel 18 d, etc. in the capillary tube 19. A suction pump for injecting a reagent. The electrode 17 is immersed in the buffer solution 18 of the container 18a, and the electrode 16 is immersed in the buffer solution 18 of the container 18b. The buffer 18 in the container 18a and the container 18b is communicated with the buffer 18 in the capillary tube 19. Therefore, the buffer solution 18 is mixed as a base of the solution into the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22, and the buffer solution 18 having the same concentration exists in all portions in the capillary tube 19. When a voltage is applied between the electrode 16 and the electrode 17, electrophoresis is induced in the capillary tube 19, and the separation DNA conjugate 21, the delaying DNA conjugate 22, and the DNA sample 23 are negatively charged. The separation DNA conjugate 21, the delay DNA conjugate 22, and the DNA sample 23 move from the 18a side to the container 18b side. The separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22 have a high molecular weight. Therefore, there is almost no movement compared to the movement amount of the DNA sample 23 by electrophoresis.
[0042]
Next, details necessary for performing measurement with the genetic diagnosis apparatus of the present invention will be described. The DNA sample 23 measured by this genetic diagnostic apparatus is DNA obtained from human cells, blood, or the like. It is necessary to cut out the target portion from the human genomic DNA, which is said to have about 3 billion base pairs, to a target length using a method such as PCR (polymerase chain reaction) and increase the number for measurement. However, since this PCR is not necessary for the description of the present gene diagnostic apparatus, a specific description is omitted.
[0043]
The target DNA extracted by PCR or the like is about 6 to 1000 in terms of the number of bases, but it is probable that the same DNA sequence does not exist in human genomic DNA which is said to have about 3 billion base pairs. The number considered is about 50. However, this means that the total number should be about 50. Therefore, when the DNA is cut out in several times, it may be divided into 6 to 12 pieces. According to the experiments of the present inventors, when separating normal DNA and abnormal DNA having one base difference with this genetic diagnosis apparatus, the result is that the number of bases can be separated most efficiently from 6 to 12. Yes. However, the abnormal DNA is separated by the concentration of the DNA sample 23 (μM, where M = mol / liter), the concentration of the DNA of the separating DNA conjugate 21 (mol%), and the concentration of the DNA of the delaying DNA conjugate 22. (Mole%), measurement temperature, and other factors have a close relationship with each other, and separation does not occur unless appropriate conditions are used. It is necessary to pay attention to whether such conditions can be set. For example, the concentration of the DNA sample 23 is suitably 1 to 10 (μM), and the DNA contained in the separation DNA conjugate 21 and the delaying DNA conjugate 22 has a concentration of 0.1 to the molar amount of the basic linear polymer. Although about 0002 to 0.05 (mol%) is appropriate, the total DNA amount of the separation DNA conjugate 21 and the delaying DNA conjugate 22 should be 20 to 600 times the concentration of the DNA sample 23. desirable. As described above, the DNA sample of this genetic diagnostic apparatus requires a DNA sample having a base sequence of about 6 to about 1000 obtained by pretreatment by the above-described PCR or the like, and appropriate conditions must be set. .
[0044]
Next, the capillary tube 19 shown in FIGS. 3, 4 and 5 will be described. When a gel is placed in the capillary tube 19 and electrophoresis is performed, a liquid flow called electroosmotic flow is generated. It is necessary to prevent this phenomenon from occurring in the diagnostic apparatus. For this reason, it is preferable to coat the inner wall of the capillary tube 19 with acrylamide or the like. As long as the generation of the electroosmotic flow can be prevented, another coating method may be used. For example, a commercially available coated capillary tube may be used. As the capillary tube 19, a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm can transmit ultraviolet rays of 90% or more, and when DNA is detected using ultraviolet rays as will be described later, the amount of passing ultraviolet rays is easy. It is most suitable because it can be detected. Further, even if a closed channel corresponding to the capillary tube 19 is configured by a combination of a plate with a groove and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays, it can transmit 90% or more of ultraviolet rays and detect the amount of passing ultraviolet rays. Thus, abnormal DNA can be easily detected. When the grooved plate is made a plate that can transmit ultraviolet rays, transmitted light is detected. When the grooved plate is made a plate that does not transmit ultraviolet rays, abnormal DNA is detected by reflected light. When detecting the reflected light, it is necessary to devise a rectangular cross section to make the groove shape a uniform reflecting surface.
[0045]
As the buffer solution 18 accommodated in the

containers

18a and 18b or the capillary tube 19, it is appropriate to use a Tris-Borate (pH 7.2 to pH 8) buffer solution or the like. Among these, as a DNA binding control agent mixed as necessary in the buffer solution 18 accommodated in the capillary tube 19, magnesium chloride or the like that promotes DNA binding to the separation DNA conjugate 21 or the delaying DNA conjugate 22 is used. There are two types: binding promoters and release agents such as urea that promote release. These two types of DNA binding control agents can control various migration speeds for DNA by selecting two types of mixing ratios and substances (for example, other electrolytes as binding promoters). As the linear polymer contained in the linear polymer gel 18d, polyacrylamide can be used. Since this is also used for the preparation of the conjugate of the separation DNA conjugate 21 and the delaying DNA conjugate 22, the compatibility is good and appropriate. It is.
[0046]
Next, the order of filling the capillary tube 19 is as follows. First, as shown in FIG. 5, a linear polymer gel 18d containing a linear polymer, a DNA binding control agent and a buffer solution 18 is introduced into the capillary tube 19, and then Add the DNA conjugate for separation 21 detailed below. The linear polymer gel 18d may be introduced after the DNA conjugate 21 for separation is introduced. In the case of FIG. 5, it is introduced in a separated state after introduction. Subsequently, the DNA conjugate for separation 21 and the DNA conjugate for delay 22 are added in a separated state. Similarly to the separation DNA conjugate 21, the linear polymer gel 18d may be introduced after the introduction of the retardation DNA conjugate 22. In the case of FIG. 5, it is introduced in a separated state after introduction. Thereafter, DNA sample 23 diluted with buffer 18 or pure water is introduced and electrophoresed.
[0047]
In the first embodiment, since acrylamide and DNA are polymerized to produce the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22, the weight difference and the structure difference from the DNA are large, and the separation DNA conjugate. The migration speed of the gate 21 and the delay DNA conjugate 22 (0.6 cm / min to 0.7 cm / min) is 1/20 to 1/30 of the optimal DNA migration speed (13 cm / min to 20 cm / min). A state is realized in which the movement is very slow and it may be said that it is relatively fixed in a pseudo manner. Therefore, at the start of measurement, the capillary tube 19 containing the packing is adjusted between the high temperature part 10, the heat insulation part 11 and the separation part 12, while the separation DNA conjugate 21 is placed in the vicinity of the separation part 12 to insulate the capillary tube 19. A delaying DNA conjugate 22 is placed from the vicinity of the portion 11 to the high temperature portion 10, and a DNA sample 23 described later is placed in the high temperature portion 10. By doing so, the double strands of the DNA sample 23 can be separated into single strands in the high temperature part 10. Since the delay DNA conjugate 22 is filled from the high temperature part 10 to the heat insulation part 11, noise DNA can be separated by a speed difference, and normal DNA and abnormal DNA can be separated by the separation part 12.
[0048]
In addition, a mechanism for exchanging DNA sample 23, DNA conjugate for separation, DNA conjugate for delay, and linear polymer into the capillary tube 19 of the genetic diagnosis apparatus, such as the suction pump 20 shown in FIG. In addition, a container for storing each solution of each DNA sample 23, DNA conjugate for separation, DNA conjugate for delay, and linear polymer, and a mechanism for automatically exchanging the container and connecting it to the capillary tube 19 are provided. It is desirable to equip.
[0049]
Furthermore, the capillary tube 19 is unitized in units of one or a plurality of units, and this can be attached to the separation unit 12, the high temperature unit 10, and the heat insulation unit 11 as a separation sealed channel cartridge for replacement. It is also appropriate to control the temperature with the second temperature controller 14 or the first temperature controller 13 in the high temperature part 10. The capillary tube 19 is previously filled with a linear polymer gel 18d and a buffer solution 18 containing a DNA binding control agent, and the separation DNA conjugate 21, the delaying DNA conjugate 22 and the DNA sample 23 are filled in a separated state and separated. It becomes possible to prepare as a closed flow path cartridge for use. With this configuration, each separation sealed flow path cartridge is replaced every time measurement is performed. Therefore, the separation DNA conjugate 21, the delay DNA conjugate 22, and the DNA sample 23 are separated for each separation sealed flow path cartridge. Since the arrangement can be set in advance, the measurement can be performed easily and accurately. In this separation sealed flow path cartridge, the separation DNA conjugate 21, the delay DNA conjugate 22 and the DNA sample 23 are separated and filled with a linear polymer gel 18d therebetween. The linear polymer gel 18d may be mixed and filled in each of them.
[0050]
Next, the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22 will be described. FIG. 6 (a) is a conceptual diagram of the relationship between the DNA conjugate for separation and the DNA sample in the closed flow path of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention, and FIG. 6 (b) is the first embodiment of the present invention. It is a conceptual diagram of the relationship between the DNA conjugate for delay and the DNA sample in the closed flow path of the genetic diagnosis apparatus in FIG. 6 (a) and 6 (b), 21 is a DNA conjugate for separation, and 22 is a DNA conjugate for delay. There are two types of DNA: one that forms a double strand and one that separates the DNA, but the four bases A, T, C, and G of DNA have hydrogen bonds A and T and G and C, respectively. It has an easy property, and the double strand of DNA is paired with AT and GC. Therefore, when the single-stranded DNA is arranged as ATCGCGTCTAGC (described in SEQ ID NO: 1), the remaining DNA has a base sequence of TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2). This relationship is called a complementary relationship. As long as this complementary relationship is satisfied, A and T and G and C are bonded by hydrogen bonds to form a double strand. In the present invention, in order to utilize this relationship, as shown in FIG. 6A, the DNA portion of the separating DNA conjugate 21 has a base sequence complementary to the normal DNA of the DNA sample. Therefore, the normal DNA base sequence of the DNA sample contains ATCGCGTCTAGC (described in SEQ ID NO: 1), and the abnormal DNA is ATCA. ^* In CGTTAGAGC (described in SEQ ID NO: 3), when the bases of normal DNA and abnormal DNA are different in the part indicated by *, the DNA part sequence of the DNA conjugate for separation 21 (first base sequence of the present invention) Is TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2), the abnormal DNA is A ^* In FIG. 2, hydrogen bonds do not occur because they are no longer complementary to the separation DNA conjugate 21, and the binding force of the entire hydrogen bond is larger by the binding force of one base than the abnormal DNA in the normal DNA of the DNA sample. As a result, during electrophoresis described later, normal DNA binds to separation DNA conjugate 21 for a longer time with a stronger binding force than abnormal DNA, so normal DNA is delayed relatively than abnormal DNA. This is because not only the binding force during electrophoresis but also the pulling force due to electrophoresis acts, so that a large number of DNAs are in a binding state that repeats binding and detachment intermittently. When this migration speed is viewed on average, the migration speed of normal DNA that binds for a long time is lower than that of abnormal DNA. The DNA sample includes DNAs other than normal DNA and abnormal DNA, such as the remaining separated single-stranded DNA that is not the target of measurement, out of double-stranded DNA, and this DNA will be described later. Although it acts as noise during electrophoresis, the noise DNA is hardly reacted with the DNA of the DNA conjugate for separation 21 and binds with the fastest migration speed.
[0051]
In order to reliably separate the noise DNA from the group of normal DNA and abnormal DNA in advance, a base sequence complementary to the base sequence common to both normal DNA and abnormal DNA in the delay DNA conjugate 22 (the present invention). 2), only the normal DNA group and the abnormal DNA group hydrogen bond with the delay DNA conjugate 22 during electrophoresis, and the migration speed is lower than that of the noise DNA. Therefore, the group of normal DNA and abnormal DNA is relatively delayed from the noise DNA, and it becomes possible to distinguish the noise DNA and eliminate its influence. Noise DNA is bound by chance when a base is hydrogen-bonded by chance, which is very low stochastically. Note that the base sequence of the delay DNA conjugate 22 (second base sequence of the present invention) is normal because both normal DNA and abnormal DNA are hydrogen-bonded to the delay DNA conjugate 22 and separated from the noise DNA. It must be complementary to the base sequence possessed by both DNA and abnormal DNA, and is preferably, for example, GCAGATCG (described in SEQ ID NO: 4) as shown in FIG. In order to select a base sequence that can be reliably bound only to normal DNA and abnormal DNA, the base sequence should be long in order to increase the probability of binding only to both. The total DNA amount of the delay DNA conjugate 22 and the separation DNA conjugate 21 is suitably 20 to 600 times the concentration of the DNA sample.
[0052]
Next, a method for producing and synthesizing such a separation DNA conjugate 21 and a delaying DNA conjugate 22 will be described. In order to synthesize vinylated DNA, DNA for separation DNA conjugate 21 and delay DNA conjugate 22 is cut out by PCR. In the above-described example, TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2) is the DNA of the separation DNA conjugate 21, and GCAGATCG (described in SEQ ID NO: 4) is the DNA of the delay DNA conjugate 22.
[0053]
Next, the 5 ′ end of the DNA having the desired base sequence is aminated (usually aminated via a hexyl group). The aminated DNA thus obtained is diluted by adding ultrapure water sterilized to 2.6 mM. Next, MOSU (methacryloid oxysuccinimide) is diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) to 71.388 mM. Then, the aminated DNA thus obtained and MOSU are added and adjusted so as to have a ratio of 1:50. Further, a solution adjusted with sodium hydrogen carbonate and sodium hydroxide so as to have a pH of 9 for pH adjustment is added to this adjusted solution in an amount equal to the amount of aminated DNA.
[0054]
The resulting solution is then shaken overnight. Thereafter, the vinylated DNA in the shaken solution is separated from the aminated DNA, MOSU, and others using HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Since vinylated DNA contains an eluent (TEAA; mixed solution of triethylamine-acetic acid and acetonitrile), it is further concentrated under reduced pressure by a centrifugal evaporator having a vacuum drying function.
[0055]
Then, 53 μmol of nitrogen is substituted for 10% AAM (acrylamide) as a polymerization solution. Further, 1.34% of TEMD (N, N, N′N′-tetramethylethylenediamine) which is a polymerization initiator is diluted with sterilized ultrapure water deaerated by ultrasonic waves. This is diluted with sterilized ultrapure water in which 1.34% APS (ammonium persulfate), which is a polymerization initiator, is similarly degassed by ultrasonic waves. Furthermore, the concentrated vinylated DNA is diluted with sterilized ultrapure water. Then, in order to synthesize 100 μl of DNA conjugate, 34 μl of the above AAM, 5 μl each of the above TEMD and APS, and 0.01% to 0.05% mol of vinylated DNA with respect to AAM In addition, sterilized ultrapure water is added to 100 μl and left for about 60 minutes to obtain an acrylamideated DNA conjugate.
[0056]
In addition, in order to remove the unreacted vinylated DNA, a DNA conjugate having a high purity can be obtained by performing gel filtration with an appropriate pore size selected in several tens of times. In the first embodiment, the synthesis method is the same between the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22, but different synthesis methods can be used.
[0057]
Subsequently, the operation of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment will be described. First, a capillary tube 19 into which a DNA sample or each solution has been introduced is set in the genetic diagnosis apparatus, and the buffer solution 18 in the

containers

18a and 18b is immersed at both ends as shown in FIGS. A predetermined voltage described later is applied between the electrode 16 and the electrode 17 by the power supply unit 9a. The appropriate voltage width is preferably 10 to 20 kilovolts, but may be 100 to 30 kilovolts depending on the state of the electrolyte and electrodes. For example, when the electrolyte concentration is low or the electrode area is large, the voltage is lowered. Then, instead of applying a predetermined voltage from the beginning, if a high voltage of 30 kilovolts or more for preparation is applied before applying a constant voltage and noise DNA is quickly separated, the measurement can be performed quickly.
[0058]
Here, the reason why the predetermined voltage is applied will be explained. The difference between the binding force of the DNA sample to the delaying DNA conjugate 22 and the separating DNA conjugate 21 and the separation force due to the electrophoretic force is the migration of DNA. This is because it has a great influence on the speed and movement difference, and it is necessary to perform electrophoresis by applying a predetermined constant voltage at which separation of normal DNA, abnormal DNA and noise DNA is most effectively performed. That is, this voltage must be as low as possible in order to increase the resolution, since the normal DNA that is most difficult to migrate can be electrophoresed, and the resolution of normal DNA and abnormal DNA decreases when high voltage is applied. The voltage satisfies the two conditions. Accordingly, an optimum voltage to be applied in advance is examined for each DNA and for each condition, and after initially applying a preparation voltage of about 30 kilovolts or more for a short time, this voltage is applied. Since the DNA in the capillary tube 19 is negatively charged and proceeds to the anode side, the power supply unit 9a needs to apply the electrode 16 so as to have a positive potential and the electrode 17 have a negative potential. In addition, in electrophoresis, if the migration time is too long, the buffer solution 18 is dried in the capillary tube 19, so it is necessary to avoid running for a longer time than necessary.
[0059]
When a voltage is applied, the DNA sample migrates, and the normal DNA group and the abnormal DNA group have the same binding strength with the DNA conjugate 22 for delay, and thus migrate in exactly the same way while repeating intermittent binding and detachment. Therefore, a large movement difference occurs between the noise DNA and the group of normal DNA and abnormal DNA. The separation DNA conjugate 21 has a difference of one base in the binding force between normal DNA and abnormal DNA. When the DNA conjugate 21 is migrated, a difference in movement speed occurs between the two, and a difference in movement occurs between the two.
[0060]
Next, the high temperature part 10 where the separation is performed, the separation part 12, and the heat insulating part 11 will be described. As described above, in order to release the double strands of DNA in the high temperature part 10, the temperature is controlled using the first temperature controller 13 so that the temperature becomes 90 ° C. or higher (predetermined temperature ± 5 ° C.). In the separation unit 12, although depending on the state of the DNA sample, normal DNA, abnormal DNA, or noise DNA is determined based on the difference in binding force between the separation DNA conjugate 21 or the delay DNA conjugate 22 and the DNA sample. Must be kept at a predetermined temperature in the temperature range of about 15 ° C. to 80 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C., about 10 ° C. lower than the temperature of the high temperature section 10. In the genetic diagnosis apparatus of the first embodiment, a silicon rubber heater, a nichrome wire, etc., and a temperature sensor such as a thermocouple, thermal, etc. are disposed below the separation unit 12 covering the capillary tube 19, and the second temperature controller 14. The temperature is controlled to be a predetermined temperature ± 1 ° C. or less. However, depending on the environmental temperature, the room temperature may exceed the target predetermined temperature, and it is better to use a component that can be heated and cooled such as Peltier instead of a silicon rubber heater or nichrome wire. Further, the heat insulating part 11 may be made of a heat insulating material such as glass wool, a foaming agent, mica, porous ceramics or the like whose contents are evacuated. In the vicinity of the heat insulating portion 11, the delaying DNA conjugate 22 has an intermediate temperature between the high temperature portion 10 and the separation portion 12, and thus normal DNA and abnormal DNA can be separated from noise DNA.
[0061]
Next, how to detect normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA in which the migration speed is different due to the action of the delay DNA conjugate 22 and the separation DNA conjugate 21 and the migration difference is generated will be described. . FIG. 7 is a graph showing the relationship between the elapsed time and the absorbance when the elapsed time from the start of electrophoresis is plotted on the horizontal axis and the absorbance is plotted on the vertical axis. The detection is performed by measuring the absorbance when ultraviolet irradiation is shielded by normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA. In the first embodiment, as shown in FIG. 5, the glass portion is exposed at a part of the capillary tube 19, and D ₂ An ultraviolet ray having a wavelength of 260 nm is irradiated from the lamp 15a, and the ultraviolet irradiation light obtained at this time is detected by a photodiode 15b, and the absorbance is measured. The control operation unit 8 controls the power supply unit 9a to ₂ The current detected by the photodiode 15b by causing the lamp 15a to emit light is amplified by the preamplifier 15c, and converted into the absorbance as a digital amount by the A / D converter 15d by the control calculation unit 8. The control calculation unit 8 has a built-in timer (not shown), and can measure the elapsed time from the migration start time. In FIG. 7, the earliest in time (I) is the noise DNA that does not bind to the DNA conjugate, the middle time (II) is abnormal DNA, and the late time (III) is normal DNA.
[0062]
From this relationship diagram, if the peak height, time, and number of peaks are read, it can be seen from the number of peaks that the DNA sample contains abnormal DNA. That is, it can be determined from the number of peaks whether abnormal DNA exists. Since the number of peaks can be limited to abnormal DNA and noise DNA depending on the applied voltage, DNA concentration, and DNA length (number of bases), only the passing amount of abnormal DNA is measured at this time. In addition, comparing peak heights shows the difference in absorbance between two groups with different migration speeds in DNA electrophoresed under the same conditions, which corresponds to the abundance ratio of abnormal DNA and normal DNA. The ratio can be determined. To determine the abundance of abnormal DNA, standard data obtained from the detection peak waveform of a standard DNA sample may be input in advance to the control calculation unit 8, and the data may be compared with the measured data for conversion.
[0063]
As described above, according to the genetic diagnosis apparatus and the genetic diagnosis method of the first embodiment, among DNA extracted from cells, blood, etc., a specific DNA is included in a DNA sample extracted with a restriction enzyme or the like. By knowing the abundance ratio of normal DNA and abnormal DNA to be detected, genetic diagnosis and determination can be made.
[0064]
(Embodiment 2)
A genetic diagnostic apparatus and a genetic diagnostic method according to Embodiment 2 of the present invention will be described with reference to FIGS. 1, 2, and 4 to 8. FIG. 8 is an apparatus configuration diagram of the genetic diagnosis apparatus according to the second embodiment of the present invention. The genetic diagnostic apparatus of the second embodiment corresponds to the single-stranded DNA of the DNA diagnostic apparatus of the first embodiment as a DNA sample and is basically the same as the genetic diagnostic apparatus of the first embodiment. Therefore, only the characteristic part will be described, and the detailed description will be omitted to the first embodiment.
[0065]
As shown in FIG. 8, in the genetic diagnosis apparatus of the second embodiment, the separation DNA conjugate 21, the delay DNA conjugate 22, and the single-stranded DNA sample 23 are directly introduced into the separation unit 12. That is, the electrophoresis unit 6 is basically composed of only the separation unit 12. The high temperature part 10 and the heat insulation part 11 of Embodiment 1 do not exist. In the case of introduction in the form of a separation sealed flow path cartridge, the capillary tube 19 filled with the separation DNA conjugate 21, the delaying DNA conjugate 22 and the DNA sample 23 in this order is replaced and separated for each measurement. Attach to part 12.
[0066]
In the first embodiment, a double-stranded DNA sample 23 is supplied, and a high-temperature unit 10 is provided to automatically make this a single-stranded DNA. However, in the second embodiment, the single-stranded DNA is supplied as the DNA sample 23 and there is no need to separate the double-stranded DNA, so that the high temperature part 10 and the heat insulating part 11 are not required. . Therefore, at the start of measurement, if the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22 are arranged in the vicinity of the separation unit 12 and the DNA sample 23 is in the vicinity of the entrance of the separation unit 12, the measurement can be immediately executed. And the 2nd temperature controller 14 of the isolation | separation part 12 is controlled so that it may maintain at the predetermined temperature of 15 to 80 degreeC similarly to Embodiment 1, desirably 20 to 60 degreeC. By controlling the temperature in this manner, the DNA sample 23 can be separated into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA by the separation DNA conjugate 21 and the delay DNA conjugate 22.
[0067]
Thus, since the genetic diagnostic apparatus of Embodiment 2 does not require the high temperature part 10 and the heat insulating part 11, the configuration of the diagnostic apparatus can be simplified, can be easily controlled, and can be handled easily.
[0068]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the following advantageous effects can be obtained.
[0069]
In the genetic diagnostic apparatus according to claim 1, although a predetermined constant voltage is applied between the second electrode and the first electrode and the DNA sample can be electrophoresed, the DNA conjugate for separation, the DNA conjugate for delay Since the gate is bound to the polymer compound, the migration speed is only a few percent compared to the DNA sample (however, it depends on the type and length of the polymer compound), and is relatively in a pseudo-fixed state. can do. Thus, the DNA sample is electrophoretically passed through the retarding DNA conjugate and then the separating DNA conjugate portion. At that time, first, by using the difference in hydrogen bond strength with the DNA conjugate for delay, the migration speed of normal DNA and abnormal DNA group is reduced with respect to noise DNA, and further, the migration of normal DNA is performed with the DNA conjugate for separation. The speed can be reduced relative to the migration speed of abnormal DNA.
[0070]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is very easy to adjust the concentration of both conjugates and samples and the mixing ratio of both conjugates and samples. .
[0071]
While normal DNA and abnormal DNA move, they are first subjected to the action of the binding force of the delay DNA conjugate, and noise DNA that does not receive this action is migrated first when a voltage is applied and detected by the detector. The However, the binding force with the DNA conjugate for separation as well as the DNA conjugate for separation acts on the abnormal DNA (however, it is weaker by one base compared with normal DNA), and the action with the conjugate cannot be easily shaken off. Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on normal DNA, and it migrates later than abnormal DNA as well as noise DNA, and is finally detected by the detection unit. Thereby, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs. Since electrophoresis and DNA hydrogen bonding are used, DNA can be separated in a short time of several minutes to several tens of minutes, and it is only necessary to apply a predetermined voltage, so it can be adjusted very easily to an optimum voltage with high resolution. Therefore, it is possible to accurately detect the presence or absence of DNA abnormality, and to make the device small, light, and low in running cost, and it is extremely easy to automate diagnosis. As a result, with respect to diseases caused by mutations in various genes such as cancer, diabetes, hypertension, and Alzheimer, it is possible to predict the risk of onset for the disease and prevent it before onset or detect it at an extremely early stage. In addition, by investigating the diversity of genes possessed by each individual, it becomes possible to presume in advance the presence or absence of side effects and effects of the drug, and to provide a drug most suitable for each individual. Furthermore, it is possible to quickly determine and use gene mutations collected from tissues that have undergone mutation and have become cancerous. The genetic diagnostic device can be used to identify individuals, identify criminal investigations, identify parent-child relationships, and ensure the security of each individual.
[0072]
In the genetic diagnostic apparatus according to claim 2, since the closed flow path is a separation closed flow path cartridge, a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent in advance, a separation DNA conjugate, and a delay DNA conjugate. Separation closed channel cartridge filled with gate and DNA sample can be prepared, and it is only necessary to replace and install the separation sealed channel cartridge in the separation section for each measurement, making measurement simple and easy Can be done.
[0073]
Since the genetic diagnosis apparatus according to claim 3 is provided with one or more sealed flow paths, a DNA sample is obtained by changing a delay DNA conjugate, a separation DNA conjugate, and a DNA binding control agent for each sealed flow path. The separation environment of normal DNA and abnormal DNA can be changed for each sealed channel.
[0074]
Since the genetic diagnosis apparatus described in claim 4 includes one or more types of delay DNA conjugates, the migration speed can be changed by changing the ratio of the delay DNA conjugates.
[0075]
In the genetic diagnosis apparatus according to claim 5, since the DNA conjugate for separation and / or the DNA conjugate for delay is vinylized DNA, normal DNA and abnormal DNA of the DNA sample are clearly separated and measured. It becomes possible.
[0076]
In the genetic diagnosis apparatus according to claim 6, the separation unit adjusts the liquid in the interior to 20 ° C. to 60 ° C. to separate normal DNA and abnormal DNA, so that normal DNA and abnormal DNA are separated by temperature adjustment. The conjugate can be bound to or detached from the delay DNA conjugate, the binding force can be adjusted by temperature, and each can be measured by the detection unit after separation.
[0077]
The genetic diagnosis apparatus according to claim 7 is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm, so that it can transmit ultraviolet light of 90% or more, and detect abnormal DNA by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough. Can be easily detected.
[0078]
The genetic diagnostic device according to claim 8 is a combination of a plate with a grooved groove and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays, so that it can transmit 90% or more of ultraviolet rays and detect the passing amount of ultraviolet rays. By doing so, abnormal DNA can be easily detected.
[0079]
The invention according to claim 9 is the genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 8, wherein the double-stranded DNA sample is separated to form a single-stranded DNA sample. Since it can be used as it is without pretreatment to make a heavy chain, it is possible to further automate diagnosis.
[0080]
In the genetic diagnosis method described in claim 10, a predetermined constant voltage is applied between the second electrode and the first electrode, and the DNA sample can be electrophoresed. Since the gate is bound to the polymer compound, the migration speed is only a few percent compared to the DNA sample (however, it depends on the type and length of the polymer compound), and is relatively in a pseudo-fixed state. can do. Thus, the DNA sample is electrophoretically passed through the retarding DNA conjugate and then the separating DNA conjugate portion. At that time, first, by using the difference in hydrogen bond strength with the DNA conjugate for delay, the migration speed of normal DNA and abnormal DNA group is reduced with respect to noise DNA, and further, the migration of normal DNA is performed with the DNA conjugate for separation. The speed can be reduced relative to the migration speed of abnormal DNA.
[0081]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is very easy to adjust the concentration of both conjugates and samples and the mixing ratio of both conjugates and samples. .
[0082]
While normal DNA and abnormal DNA move, they are first subjected to the action of the binding force of the delay DNA conjugate, and noise DNA that does not receive this action is migrated first when a voltage is applied and detected by the detector. The However, the binding force with the DNA conjugate for separation as well as the DNA conjugate for separation acts on the abnormal DNA (however, it is weaker by one base compared with normal DNA), and the action with the conjugate cannot be easily shaken off. Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on normal DNA, and it migrates later than abnormal DNA as well as noise DNA, and is finally detected by the detection unit. Thereby, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs. Since electrophoresis and DNA hydrogen bonding are used, DNA can be separated in a short time of several minutes to several tens of minutes, and it is only necessary to apply a predetermined voltage, so it can be adjusted very easily to an optimum voltage with high resolution. It is possible to accurately detect the presence or absence of DNA abnormality. According to this genetic diagnosis method, it is possible to predict the risk of onset of a disease caused by a gene mutation, prevent it, and detect it at an extremely early stage. In addition, by investigating the diversity of genes possessed by each individual, it is possible to presume in advance whether there are side effects and effects of the drug, and to provide the drug most suitable for each individual. Furthermore, it is possible to quickly determine a mutation of a gene collected from a tissue that has become cancerous. Individuals can be identified, and criminal investigations, identification of parent-child relationships, and the security of each individual can be given definitive reliability.
[0083]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an external view of a genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 2 is an external view of the open top lid of the genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 3 is a device configuration diagram of the genetic diagnosis device according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a main part diagram of the control circuit of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 5 is an introduction state diagram of a separation DNA conjugate, a delaying DNA conjugate, and a DNA sample in a sealed channel of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention.
6A is a conceptual diagram of the relationship between a DNA conjugate for separation and a DNA sample in a sealed channel of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention. FIG.
(B) Conceptual diagram of the relationship between the DNA conjugate for delay and the DNA sample in the closed flow path of the genetic diagnostic apparatus in Embodiment 1 of the present invention
FIG. 7 is a relationship diagram between elapsed time and absorbance.
FIG. 8 is an apparatus configuration diagram of a genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 2 of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Power switch
2 Operation buttons
3 Display panel
4 Top cover
5 Case
6 Electrophoresis part
7 Support stand
8 Control operation part
9 Power box
9a Power supply
10 High temperature part
11 Heat insulation part
12 Separation part
13 First temperature controller
14 Second temperature controller
15 detector
15a D ₂ lamp
15b photodiode
15c preamplifier
15d A / D converter
16, 17 electrodes
18 Buffer
18a, 18b container
18d linear polymer gel
19 Capillary tube
20 Suction pump
21 DNA conjugate for separation
22 DNA conjugate for delay
23 DNA samples

Claims

A first container containing a buffer solution and immersed in the first electrode;
A second container containing a buffer solution and immersed in the second electrode;
A sealed flow path in which the first container and the second container are filled and filled with a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent;
A power supply for applying a positive potential to the second electrode and applying a negative potential to the first electrode;
A control unit that controls the power supply unit to apply a predetermined constant voltage between the second electrode and the first electrode;
Provided in the closed flow path, provided with a detection unit for detecting the amount of DNA passing through the inside,
In the closed channel, in the buffer solution,
A DNA conjugate for separation in which a first base sequence capable of hydrogen bonding to a DNA sample is bonded to a polymer compound, and the DNA sample is separated into normal DNA and abnormal DNA from the difference in binding strength;
A delay DNA conjugate in which a second base sequence and a polymer compound are bonded, and the second base sequence has an equivalent binding force to normal DNA and abnormal DNA to distinguish only noise DNA;
In addition, a DNA sample is filled,
A gene diagnostic apparatus, wherein the constant voltage is applied to cause electrophoresis of DNA in the sealed channel, and the detection unit measures the passing amount of normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA, respectively.

The sealed channel is filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, and the separation DNA conjugate, the delay DNA conjugate, and the DNA sample are separated in the buffer solution. 2. A sealed flow channel cartridge for separation, which is filled in this order with a linear polymer interposed therebetween, wherein a separation unit is provided to replaceably attach the closed flow channel cartridge for separation. Genetic diagnostic equipment.

The genetic diagnosis apparatus according to claim 1, wherein one or more of the sealed flow paths are provided.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein one or more types of the delay DNA conjugates are contained.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the DNA conjugate for separation and / or the DNA conjugate for delay is vinylated DNA.

The genetic diagnostic apparatus according to any one of claims 1 to 5, wherein a normal DNA and an abnormal DNA are separated by adjusting a liquid in the sealed channel to 20 to 60 ° C.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 6 , wherein the sealed channel is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 µm.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 6, wherein the sealed flow path is a combination of a plate having a groove and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 8 , further comprising a high-temperature portion that heats the closed channel and separates a double-helix DNA sample to form a single-stranded DNA sample.

A buffer solution is stored in the first container and the first electrode is immersed, and a buffer solution is also stored in the second container and the second electrode is immersed, and a linear polymer and DNA are interposed between the first container and the second container. Filled with a buffer containing a binding control agent and communicated in a sealed channel, and then the first base sequence capable of hydrogen bonding to the DNA sample and the polymer compound are contained in the buffer in the sealed channel. The DNA sample is bound and filled with a separation DNA conjugate that separates the DNA sample into normal DNA and abnormal DNA from the difference in binding strength, and then the second base sequence and the polymer compound are combined to form normal DNA and abnormal A DNA conjugate for delaying that distinguishes only noise DNA from DNA having the same binding force with respect to the second base sequence is filled, a DNA sample is added, and then a positive potential is applied to the second electrode. And applying the first electrode A negative potential is applied, by applying a predetermined constant voltage between the second electrode and the first electrode, the DNA samples of the closed flow path are electrophoresed to separate normal DNA and abnormal DNA and noise DNA, A genetic diagnosis method comprising: quantifying normal DNA, quantifying abnormal DNA, or a ratio of normal DNA to abnormal DNA, or detecting abnormal DNA.