JP3767755B2

JP3767755B2 - Anti-JC virus antibody

Info

Publication number: JP3767755B2
Application number: JP22335895A
Authority: JP
Inventors: 直人青木; 眞由美森
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: JPH0967397A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＪＣウイルスの診断や予防・治療に有効な抗ＪＣウイルス抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
〈発明の背景〉
かつては、免疫不全患者でまれにしか見ることのできなかった進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ：Progressive multifocal leukoencephalopathy）が、近年の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired immune deficiency syndrome）の発生の増加と共に増えてきている。
ＰＭＬは脳神経組織の脱ミエリン病理像を特徴とし、その原因はJCウイルス（ＪＣＶ：JC polyomavirus）の感染によりミエリン生成細胞である寡突起神経膠細胞（oligodendrocyte）が損傷をうけることに起因すると考えられている。また最近では痴呆症の原因の一部としてＪＣＶとの関係が指摘されている。
【０００３】
ＪＣＶは、ヒトのＤＮＡウイルスでパポーバウイルス科ポリオーマウイルス属の一種で、幼・小児期に過半数の人が感染し一生の持続感染を起こす。
FrisqueらはＰＭＬ患者の脳組織よりＪＣＶ（Mad-1株）を分離し、このウイルスのＤＮＡ配列などを解析したところ、polyomavirusであるＢＫウイルス（ＢＫＶ）やＳＶ４０とその構造が類似し、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列とも高いホモロジーを有していることを報告している(Frisque,R.J.et al.,J.Virol.,51,458-469,1984)。
【０００４】
これまでに、脳組織中に存在するＪＣＶを同定するために、多くの方法が応用・検討されてきた。
近年ＰＭＬの診断法はコンピュータ断層撮影（ＣＴ：Computed tomography）や磁気共鳴映像法（ＭＲＩ：Magnetic resonance imaging）などの技術の発達により大きく進歩したが、ＰＭＬの確定診断には脳組織中のＪＣＶの存在を証明する必要があり、患者の血中の抗ＪＣＶ抗体の検査の他、脳組織からのＪＣＶそのものの確認のため、ＤＮＡ解析、抗ＪＣＶ抗体を用いる抗原の検出・免疫組織染色法など様々な方法が試みられている(E.O.Major et al.,Clin. Microbiol. Rev.,5,49-73,1992)。
【０００５】
これらの診断法のうち、サザンブロット解析法やin situハイブリダイゼイション法などによるＤＮＡ解析手法は、特異性、感度、擬陽性の頻度などが原因で、解析データが変化するなど、信頼性・簡便性の観点から問題があると考えられている。
一方免疫組織化学的手法は簡便で信頼性のある方法であるが、ＪＣＶの構成タンパク質のアミノ酸配列がＢＫＶやＳＶ４０のそれと高い相同性を有するゆえ、使用する抗体の特異性がその信頼性を左右する重要なポンイトとなる。
【０００６】
〈従来の技術〉
Knowlesらは分離したＪＣＶをマウスに免疫し、抗ＪＣＶモノクロナール抗体を初めて作成した(W.A.Knowels et al.,J.Med.Viol.,34,127-131,1991)。
Bollagらも同様に、ＪＣＶ株をマウスに免疫し、ＪＣＶのlarge T protein・small t proteinに反応性を有し、ＢＫＶおよびＳＶ４０のそれとは反応性を有しないモノクロナール抗体（monoclonal antibody) Pab2000を作成した(B.Bollag et al.,Virus Res.,25,223-239,1992)。
ここでlarge T proteinやsmall t proteinはＴ抗原と呼ばれ、パポーバウイルスおよびアデノウイルスなどＤＮＡ型腫瘍ウイルスの遺伝子産物で、細胞の形態学的あるいは造腫瘍性トランスフォーメーションに寄与するタンパク質の総称である。それぞれのウイルスはlarge T、small tなどの２〜３種のＴ抗原を有している。
次にStonerらはＪＣＶのキャプシド（頭殻）タンパク質に対して家兎ポリクロナール抗体を作成し、抗T proteinモノクロナール抗体とこの抗キャプシドタンパク質ポリクロナール抗体を用いて、免疫組織化学的二重染色を行い、ＰＭＬ患者脳組織切片で陽性を示したと報告している(G.L.Stoner et al.,J.Neuroimmunol.,19,223-236,1988)。
このように、免疫学的組織染色を利用した診断については、Ｔ抗原を抗原として用いたものや、ポリオーマウイルスキャプシド抗原を用いたものが開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように免疫学的組織染色によってＪＣＶ抗原を検出しようとする試みがなされてきたが、１）ポリクロナール抗体または高力価のヒト血清を使用するとＪＣＶとウイルスの性状が酷似するＢＫＶなどと交差反応を起こしてしまうこと、２）また、一般的にポリクロナール抗体は、同一抗原の複数の抗原決定基と反応するため強い親和性（染色性）を示すが、モノクロナール抗体は抗原の一つの抗原決定基と特異的に反応するため、ポリクロナール抗体に比較すると親和性は低いことなどから、実際に免疫組織化学的染色を行う上で、特異性を高めようとすれば染色性が得られず、染色性を高めようとすれば特異性が得られないという問題があった。
【０００８】
Knowlesらの作成した抗体はＪＣＶに対し強く反応するもののＢＫＶにも弱いながら反応し、特異性の点で満足しえるものではなかった。Bollagらの作成した抗体はＴ抗原の一部のみを認識するため、検出できるのはＴ抗原のサブポピュレイション(Subpopulation)だけであり、臨床応用には不十分であった。
また、これらのモノクロナール抗体は上述のように、実際の組織染色性の低さなどの点からも臨床応用には十分ではなかった。
Stonerらの作成した抗キャプシドタンパク質ポリクロナール抗体は、ＪＣＶのみならず、ＢＫＶやＳＶ４０とも反応し特異性がなく、ＪＣＶの検出などには使用できない。
【０００９】
さらに以下のような問題もあった。通常、生体組織はホルマリン固定パラフィン埋設により機械的に保存されているが、従来の抗体では、ホルマリン固定パラフィン埋設組織切片では染色しえなかった(G.L.Stoner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2271-2275,1986)ためアセトン固定組織を用いていたが、アセトン固定では組織的に不安定であり、ホルマリン固定パラフィン埋設組織で染色しえないのが大きな欠点となっていた。
また、従来作成された抗体は感染細胞を培養し、そこから抽出した抗原を用いているため、正常な脳組織と交差反応を生じる可能性を除去することができなかった。
本発明者等はこれらの問題点を解決すべく抗ＪＣＶ抗体について鋭意研究した結果、ＢＫＶやＳＶ４０とは反応せず、組織染色性に優れる抗ＪＣＶ抗体を見出し本発明を完成した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号１、配列番号２または配列番号３記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体、詳細に述べればＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部であるLys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu(配列番号１)、Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met(配列番号２)、またはVal His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr(配列番号３)のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体であり、さらにＢＫウイルスと交差反応を起こさないことを特徴とするＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質の一部である配列番号１記載のペプチド断片を抗原として得られた抗ＪＣウイルス抗体、およびこれらの抗ＪＣウイルス抗体を含有するＪＣウイルス検出試薬に関する。
【００１１】
【発明の実施形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
抗原としてはＪＣＶのキャプシドを構成するＶＰ−１タンパク質の部分ペプチドを用いた。なぜなら、Ｔ抗原はウイルスの感染初期（ＤＮＡ合成開始前）に合成される初期タンパク質であり、これを抗原とする抗体（Ｐａｂ2000など）を用いるよりもウイルスが活性化し、増殖するときに生合成される後期構造タンパク質のキャプシドを抗原として調製した抗体の方が、疾患の発症とあいまって正確にウイルスの活性化を判断することができると考えられるからである。
この抗原ペプチドの選定は以下のように行った。
ＪＣＶのＶＰ−１タンパク質は３５４個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列はＢＫＶのＶＰ−１タンパク質と７８％の相同性をもっている。それゆえＪＣＶ特異的抗体を調製するためにＢＫＶと相同性の低い３つの範囲を抗原ペプチドとした（表１参照）。
【００１２】
【表１】

〔表中「・」はＪＣＶとＢＫＶで異なるアミノ酸残基部を示し、「＊」はＪＣＶとＢＫＶで同一のアミノ酸残基部を示す。〕
【００１３】
ペプチド＃１（配列番号１）は⁶⁰Lysから⁶⁹Glu（Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu）の１０残基で、対応するＢＫＶペプチドと２つの共通アミノ酸を有する。ペプチド＃２（配列番号２）は⁶⁰Lysから⁷⁷Met（Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met）の１８残基で、末端の１０残基がペプチド＃１とオーバーラップしており、対応するＢＫＶペプチドと比較すると８つの共通アミノ酸を有する。ペプチド＃３（配列番号３）は¹²¹Valから¹⁴⁰Thr（Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr）の２０残基で、対応するＢＫＶペプチドと９つの共通アミノ酸を有する。これらのペプチド配列は、以前から報告されているコンピュータープログラムから予測される抗原性も考慮して選択した（Hopp and Woods,PNAS USA,78,3824,1981;Hopp,Methods in Enzymol.,178,571,1989;Chou and Fasman,Ann Rev Biochem,47,251,1978;Krch'n et al.,Methods in Enzymol.,178,586,1989;Westhof et al.,Nature,311,123,1984;Tainer et al.,Nature,312,127,1984;Karplus and Schulz,Naturwissenschaften,72,212,1985）。さらに、その合成にあたっては、高い抗原性を示すことが期待されるTam JPによって開発されたＭＡＰ系（Maltiple antigen peptide system）を使用して行った（Tam JP,Synthetic Peptide:Approaches to Biological Problems,p3-18,1989;Tam JP,PNAS USA,85,5409,1988;Tam et al.,J.Exp.Med.,171,299,1990;Tam and Lu.,PNAS USA,86,9084,1989）。それぞれのペプチド断片の合成は常法により、ペプチドシンセサイザーを用いて行った。
【００１４】
抗体の調製は、上記のように合成したペプチド＃１〜３を抗原として、常法により行った。
この結果得られた抗体は、ＪＣＶ感染細胞およびＰＭＬ患者の脳組織で優れた免疫学的組織染色性を示した。特に上記ペプチド＃１を抗原として得られた抗体は、ＪＣＶにのみ反応し、ＢＫＶ，ＳＶ４０と交差反応を生じなかった。また、ペプチド＃２，３を抗原として得られた抗体は、ＪＣＶのみならずＢＫＶとも反応するがＳＶ４０とは反応しなかった。従って、ＢＫＶ特異的な抗体とこれらの抗体を併用することによりＪＣＶの感染であるかＢＫＶの感染であるかの判断が可能となる。
また、従来のように感染細胞抽出物を抗原とせず、短いポリペプチド断片を抗原に用いているため、ＪＣＶとの特異性が高く正常脳組織などとは交差反応を生じない。
【００１５】
本発明抗体は特に染色性に優れ、当該抗体によれば通常用いられているホルマリン固定パラフィン埋設組織でも、免疫組織化学的検定に利用することができ、ＪＣＶ感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などの確定診断が可能となる。また、キャプシドタンパク質の一部を抗原としているのでホールウイルスで診断することができ、ウイルスが活性化したときに陽性検出ができる。
さらに、本願発明抗体を中和抗体として使用することにより、ＪＣＶ感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などを予防・治療することができ、非常に有用である。
【００１６】
本願発明抗体を、予防・治療薬として使用する場合は、注射剤などとして用時調製用の凍結乾燥製剤などとすることができる。
投与量は患者の年齢、症状の程度などの条件により異なるが、例えば1mg〜10g／kg、好ましくは10mg〜１g／kg、さらに好ましくは50mg〜500mg／kgであるが、この範囲には特に限定されず目的とする薬理効果を発揮するのに必要な量を配合すればよい。
本発明に係る予防・治療剤の剤型は本発明の目的を達成できる限り特に限定されないが、通常用いられる方法により、注射剤，輸液などの液体剤、軟膏剤，クリーム剤，ゲルなどの半固形製剤、錠剤，カプセル剤，坐剤などの固形剤、その他ソフトカプセル、リポソームの他、徐放性の製剤などとすることができる。
以上のような製剤を調製するためには、上記成分の他に、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して目的とする剤形にすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加することができる。
【００１７】
本発明抗体は、ヒト，マウス，家兎の他あらゆる動物などにも応用可能であり、本発明の目的を達成しうる限り、抗体の部分構造、例えば（Ｆab')₂やＦab部分だけでも構わない。本発明抗体を診断に応用する場合は、通常使用されている、例えばＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法などに応用が可能である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１．抗体の調製
前述のように設計し常法により製造したペプチド＃１：Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu（配列番号１）、ペプチド＃２：Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met（配列番号２）およびペプチド＃３：Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr（配列番号３）のそれぞれのペプチド断片に対する抗体は２匹の家兎（日本白色種）を使用して調製した。まず、０日目に、免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、家兎に200μｇのペプチドを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：complete Freund's adjuvant）と共に皮下に注入した。次いで１４，２８および４２日目に100μｇのペプチドと不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ：incomplete Freund's adjuvant）を皮下に注入した。
４９日目に注入したペプチドに対する抗体を含む血液サンプルが得られた。さらに５６日目に100ｍｇのＩＦＡを皮下に注入し、６３日目に家兎から高力価抗体を含む30から50ｍｌの血清を得た。
血清の力価検定はＥＬＩＳＡ法によって、抗体を得るときに使用したペプチド断片に対して行った。ペプチド＃１，＃２および＃３を抗原として得られた抗体は、それぞれＪＣＡｂ１，ＪＣＡｂ２およびＪＣＡｂ３とした。
【００２０】
実施例２．抗体による組織の免疫学的染色
（実験方法）
これらの抗体の特異性は、ＪＣＶおよびＢＫＶ感染培養細胞並びにＰＭＬ患者の脳組織を免疫学的に染色することにより決定した。
ＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞，ＢＫＶ感染２９３細胞およびＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞をカバーグラス上で培養しアセトンで固定した後、使用するまで−８０℃で保存した。対象としてホルマリン固定したＰＭＬ患者の脳組織のパラフィン埋設断片を使用した。
これらの細胞の免疫学的染色には、ＬＳＡＢキット（Dako社）および上述の高力価血清を５０倍希釈の第一抗体として使用した。
【００２１】
（結果）
ＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞をＪＣＡｂ１，２および３で染色すると、３−４％の細胞の核が染色された。この結果は、これらの細胞について以前報告された結果を支持するものである。また、ＪＣＶ感染細胞の細胞質は染色されなかった。
ＢＫＶ感染２９３細胞をＪＣＡｂ２および３で染色すると、数％の細胞の核が染色されたが、ＪＣＡｂ１では染色されなかった。また、ＢＫＶ感染細胞においても細胞質は染色されなかった。
ＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞をＪＣＡｂ１，２および３で染色しても、どの抗体でも染色はみられなかった。
今回のホルマリン固定パラフィン埋設したＰＭＬ患者脳組織のＪＣＡｂ１，２および３での免疫学的組織染色の結果は、ＰＭＬ患者脳組織においてＪＣＶが特定の部分に集中するという報告と一致しており、オリゴデンドロサイト（oligodendrocytes:寡突起神経膠細胞）と幾つかのアストロサイト（astrocytes:神経膠星状細胞）では典型的な核の染色が見られた。
また、コントロールとしてウイルスに感染していないＩＭＲ３２細胞，２９３細胞でも染色を試みたが、染色はみられなかった。
上記の実験の結果を以下の表２にまとめて示す。
【００２２】
【表２】

〔表中、（＋）は免疫学的に染色されたことを、（−）は染色されなかったことをそれぞれ示す。併せて、染色の様子を図面代用写真で示す。〕
【００２３】
ＪＣＡｂ１は特異的にＪＣＶ感染細胞と反応し（図１）、ＢＫＶ感染細胞およびＳＶ４０感染細胞とは交差反応を生じなかった（図４，７）。
ＪＣＡｂ２および３はＳＶ４０感染細胞とは反応しなかったが、ＪＣＶおよびＢＫＶ感染細胞と反応した（図２，３，５，６）。
また、ＪＣＡｂ１〜３のどの抗体もＰＭＬ脳組織と反応し（図８，９，１０）、コントロールとした未感染細胞とは反応しなかった（図１１，１２）。また、非感染家兎血清とＪＣＡｂ１は反応しなかった。
【００２４】
実施例３．希釈抗体によるＰＭＬ感染脳組織の免疫学的染色
（実験方法）
実施例２の方法にならい、段階的に希釈したＪＣＡｂ１を用いてＰＭＬ患者の脳組織を免疫学的に染色した。対照として正常家兎血清を用いた。
（結果）
上記の実験の結果を以下の表３にまとめて示す。
【００２５】
【表３】

〔表中、＊は高バックグラウンド下での測定であることを、ＮＤは実施しなかったことをそれぞれ示す。〕
【００２６】
ＪＣＡｂ１は１：５から１：２５００倍の希釈で陽性細胞を認めた。正常家兎血清は１：５、１：２５００倍では陰性であった。
【００２７】
実施例４．希釈抗体によるＪＣＶ感染細胞及びＢＫＶ感染細胞の免疫学的染色
（実験方法）
実施例３の方法と同様にして、段階的に希釈したＪＣＡｂ１を用いてＪＣＶ感染細胞及びＢＫＶ感染細胞を免疫学的に染色した。対照として正常家兎血清を用いた。
（結果）
上記の実験の結果を以下の表４にまとめて示す。
【００２８】
【表４】

〔表中、＊は高バックグラウンド下での測定であることを、ＮＤは実施しなかったことをそれぞれ示す。〕
【００２９】
ＪＣＡｂ１は高濃度下（１：５）でもＢＫＶに交差反応を示さなかった。
以上のように本願発明にかかるＪＣＡｂ１，ＪＣＡｂ２およびＪＣＡｂ３は、ホルマリン固定パラフィン埋設した組織でも反応し、臨床応用可能な十分な免疫学的組織染色性を示すためＪＣＶの確定診断に有用である。特に、ＪＣＡｂ１はＢＫＶやＳＶ４０とは反応せずに、特異的にＪＣＶと反応するためＪＣＶの検出試薬として有用である。
また、これらの抗体はＪＣＶに特異的に反応するため、抗ＪＣＶ抗体としてＪＣＶが引き起こす感染症、例えばＰＭＬや痴呆症などの予防・診断・治療薬としても有用である。
【００３０】
【配列表】

【００３１】

【００３２】

【００３３】
【図面の簡単な説明】
【図１】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図２】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図３】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＪＣＶ感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図４】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【００３４】
【図５】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図６】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＢＫＶ感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図７】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＳＶ４０感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図８】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【００３５】
【図９】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ２で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【図１０】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ３で免疫学的に染色したＰＭＬ感染脳組織の組織学的構造を示す写真である。
【図１１】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色した非感染ＩＭＲ３２細胞の組織学的構造を示す写真である。
【図１２】生物の形態を示す図面の代用写真であり、具体的にはＪＣＡｂ１で免疫学的に染色した非感染２９３細胞の組織学的構造を示す写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an anti-JC virus antibody effective for diagnosis, prevention and treatment of JC virus.
[0002]
[Prior art]
<Background of the invention>
In the past, progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), which was rarely seen in immunocompromised patients, has been the cause of the recent acquisition of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Increasing with increase.
PML is characterized by demyelin pathology of cranial nerve tissue, which is thought to be caused by damage to myelin-producing oligodendrocytes by infection with JC virus (JCV: JC polyomavirus). ing. Recently, a relationship with JCV has been pointed out as part of the cause of dementia.
[0003]
JCV is a human DNA virus that belongs to the family of polyomaviruses of the family Paporaviridae, and a majority of people infect children during childhood and childhood and cause persistent infections throughout their lives.
Frisque et al. Isolated JCV (Mad-1 strain) from brain tissue of PML patients and analyzed the DNA sequence of this virus. The structure was similar to that of polyomavirus BK virus (BKV) and SV40. It has also been reported that the amino acid sequence has high homology (Frisque, RJ et al., J. Virol., 51 , 458-469, 1984).
[0004]
So far, many methods have been applied and studied in order to identify JCV present in brain tissue.
In recent years, diagnostic methods for PML have greatly advanced due to the development of techniques such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), but for the definitive diagnosis of PML, JCV in brain tissue In addition to examining anti-JCV antibodies in patient blood, DNA analysis, antigen detection using anti-JCV antibodies, immunohistochemical staining methods, etc. Various methods have been tried (EOMajor et al., Clin. Microbiol. Rev., 5 , 49-73, 1992).
[0005]
Among these diagnostic methods, DNA analysis methods such as Southern blot analysis and in situ hybridization methods are reliable and simple because analysis data changes due to specificity, sensitivity, and frequency of false positives. It is thought that there is a problem from the viewpoint of sex.
On the other hand, the immunohistochemical method is a simple and reliable method. However, since the amino acid sequence of the constituent protein of JCV is highly homologous to that of BKV or SV40, the specificity of the antibody used affects its reliability. Become an important ponit.
[0006]
<Conventional technology>
Knowles et al. Immunized mice with isolated JCV and first produced anti-JCV monoclonal antibodies (WAKnowels et al., J. Med. Viol., 34 , 127-131, 1991).
Similarly, Bollag et al. Immunized mice with the JCV strain, and reacted with the monoclonal antibody Pab2000, which is reactive to JCV large T protein and small t protein, but not BKV and SV40. (B. Bollag et al., Virus Res., 25 , 223-239, 1992).
Here, large T protein and small t protein are called T antigens, which are gene products of DNA-type tumor viruses such as papovavirus and adenovirus, and are generic names for proteins that contribute to morphological or tumorigenic transformation of cells. Each virus has 2-3 types of T antigens such as large T and small t.
Next, Stoner et al. Produced rabbit polyclonal antibody against the capsid protein of JCV, and performed immunohistochemical double staining using anti-T protein monoclonal antibody and this anti-capsid protein polyclonal antibody. Reported positive in PML patient brain tissue sections (GLStoner et al., J. Neuroimmunol., 19 , 223-236, 1988).
Thus, about the diagnosis using immunological tissue staining, those using T antigen as an antigen and those using polyomavirus capsid antigen are disclosed.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Attempts have been made to detect JCV antigens by immunohistochemical staining as described above. 1) When polyclonal antibodies or high-titer human sera are used, JCV and BKV, which have very similar virus characteristics, intersect. 2) In general, polyclonal antibodies react with a plurality of antigenic determinants of the same antigen, and thus exhibit strong affinity (staining properties). Monoclonal antibodies are one antigen Since it reacts specifically with determinants, its affinity is low compared to polyclonal antibodies, so when actually performing immunohistochemical staining, if you try to increase specificity, staining will not be obtained, There was a problem that specificity could not be obtained if it was attempted to increase the dyeability.
[0008]
Although the antibody produced by Knowles et al. Reacted strongly with JCV, it reacted with BKV although it was weak, and was not satisfactory in terms of specificity. Since the antibody produced by Bollag et al. Recognizes only a part of the T antigen, only T antigen subpopulation can be detected, which is insufficient for clinical application.
In addition, as described above, these monoclonal antibodies are not sufficient for clinical application from the viewpoint of low actual tissue staining.
The anti-capsid protein polyclonal antibody prepared by Stoner et al. Reacts not only with JCV, but also with BKV and SV40, has no specificity, and cannot be used for detection of JCV.
[0009]
There were also the following problems. Normally, biological tissue is mechanically preserved by embedding formalin-fixed paraffin, but conventional antibodies could not be stained on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections (GLStoner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 , 2271-2275, 1986), acetone-fixed tissue was used. However, acetone-fixed tissue was unstable in structure, and it was a major drawback that it could not be stained with formalin-fixed paraffin-embedded tissue.
Moreover, since the antibody produced conventionally culture | cultivates an infected cell and uses the antigen extracted from there, the possibility of producing a cross reaction with normal brain tissue was not able to be removed.
As a result of intensive studies on the anti-JCV antibody to solve these problems, the present inventors have found an anti-JCV antibody that does not react with BKV or SV40 and has excellent tissue staining properties, and has completed the present invention.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention relates to an anti-JC virus antibody obtained using a peptide fragment of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 which is a part of the VP-1 protein of JC virus as an antigen. Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu (SEQ ID NO: 1), Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro As Ar Arg Asp Met (SEQ ID NO: 2), Alternatively, it is an anti-JC virus antibody obtained using a peptide fragment of Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr (SEQ ID NO: 3) as an antigen, and further cross-reacts with BK virus. An anti-JC virus antibody obtained using the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 which is a part of the VP-1 protein of JC virus as an antigen, and a JC virus containing these anti-JC virus antibodies On the scan detection reagent.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
As the antigen, a partial peptide of VP-1 protein constituting the capsid of JCV was used. This is because the T antigen is an early protein synthesized at the early stage of virus infection (before the start of DNA synthesis) and is biosynthesized when the virus is activated and proliferated rather than using an antibody (Pab2000, etc.) using this as an antigen. This is because it is considered that an antibody prepared using a capsid of a late structural protein as an antigen can accurately determine virus activation in combination with the onset of a disease.
Selection of this antigen peptide was performed as follows.
The JCV VP-1 protein consists of 354 amino acids, and its amino acid sequence has 78% homology with the BKV VP-1 protein. Therefore, in order to prepare JCV-specific antibodies, three regions having low homology with BKV were designated as antigen peptides (see Table 1).
[0012]
[Table 1]

[In the table, “·” indicates a different amino acid residue part between JCV and BKV, and “*” indicates the same amino acid residue part between JCV and BKV. ]
[0013]
Peptide # 1 (SEQ ID NO: 1) has 10 residues from ⁶⁰ Lys to ⁶⁹ Glu (Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu), and has the corresponding BKV peptide and two common amino acids. Peptide # 2 (SEQ ID NO: 2) is 18 residues from ⁶⁰ Lys to ⁷⁷ Met (Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met). It overlaps and has 8 common amino acids when compared to the corresponding BKV peptide. Peptide # 3 (SEQ ID NO: 3) is 20 residues from ¹²¹ Val to ¹⁴⁰ Thr (Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr), and has 9 commonalities with the corresponding BKV peptide. Has amino acids. These peptide sequences were selected taking into account the antigenicity predicted from previously reported computer programs (Hopp and Woods, PNAS USA, 78 , 3824, 1981; Hopp, Methods in Enzymol., 178 , 571). , 1989; Chou and Fasman, Ann Rev Biochem, 47 , 251, 1978; Krch'n et al., Methods in Enzymol., 178 , 586, 1989; Westhof et al., Nature, 311 , 123, 1984; Tainer et al., Nature, 312 , 127, 1984; Karplus and Schulz, Naturwissenschaften, 72 , 212, 1985). Furthermore, the synthesis was performed using the MAP system (Maltiple antigen peptide system) developed by Tam JP, which is expected to show high antigenicity (Tam JP, Synthetic Peptide: Approaches to Biological Problems, p3). Tam JP, PNAS USA, 85 , 5409, 1988; Tam et al., J. Exp. Med., 171 , 299, 1990; Tam and Lu., PNAS USA, 86 , 9084, 1989). Each peptide fragment was synthesized by a conventional method using a peptide synthesizer.
[0014]
The antibody was prepared by a conventional method using the peptides # 1 to # 3 synthesized as described above as antigens.
The antibody obtained as a result showed excellent immunological tissue staining in JCV-infected cells and brain tissue of PML patients. In particular, the antibody obtained using the peptide # 1 as an antigen reacted only with JCV and did not cause a cross reaction with BKV and SV40. Moreover, the antibody obtained using peptide # 2 or 3 as an antigen reacted with BKV as well as JCV, but did not react with SV40. Therefore, by using these antibodies together with BKV-specific antibodies, it is possible to determine whether the infection is JCV or BKV.
In addition, since an infected cell extract is not used as an antigen and a short polypeptide fragment is used as an antigen as in the past, it has a high specificity with JCV and does not cause a cross reaction with normal brain tissue.
[0015]
The antibody of the present invention is particularly excellent in stainability. According to the antibody, even formalin-fixed paraffin-embedded tissues that are usually used can be used for immunohistochemical assays, and can be used for JCV infections such as PML and dementia. A definitive diagnosis is possible. In addition, since a part of the capsid protein is used as an antigen, it can be diagnosed with a whole virus, and positive detection can be performed when the virus is activated.
Furthermore, by using the antibody of the present invention as a neutralizing antibody, JCV infections such as PML and dementia can be prevented and treated, which is very useful.
[0016]
When the antibody of the present invention is used as a prophylactic / therapeutic agent, it can be made into a freeze-dried preparation for use as an injection or the like.
The dose varies depending on conditions such as the age of the patient and the degree of symptoms, but is, for example, 1 mg to 10 g / kg, preferably 10 mg to 1 g / kg, more preferably 50 mg to 500 mg / kg, but this range is particularly limited. What is necessary is just to mix | blend the quantity required in order to exhibit the target pharmacological effect.
The dosage form of the preventive / therapeutic agent according to the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved. Solid preparations such as solid preparations, tablets, capsules and suppositories, other soft capsules, liposomes, and sustained release preparations can be used.
In order to prepare the preparation as described above, in addition to the above ingredients, ingredients generally used as raw materials for pharmaceutical preparations can be blended to obtain a desired dosage form. Moreover, antiseptic | preservative, antioxidant, etc. can be added as needed.
[0017]
The antibody of the present invention can be applied to all animals other than humans, mice, rabbits, and the like. As long as the object of the present invention can be achieved, only a partial structure of the antibody, for example, (Fab ′) ₂ or Fab portion may be used. Absent. When the antibody of the present invention is applied to diagnosis, it can be applied to a commonly used method such as ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
[0018]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0019]
Example 1. Preparation of antibody Peptide # 1: Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu (SEQ ID NO: 1), peptide # 2: Lys Ser Ile Ser Ile Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met (SEQ ID NO: 2) and Peptide # 3: Each peptide fragment of Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr (SEQ ID NO: 3) The antibody against was prepared using two rabbits (Japanese white species). First, on the 0th day, blood for titration measurement of serum before immunization was sampled, and then 200 μg of peptide was subcutaneously injected into rabbits together with complete Freund's adjuvant (CFA). Then, on days 14, 28 and 42, 100 μg of peptide and incomplete Freund's adjuvant (IFA) were injected subcutaneously.
A blood sample containing antibodies against the peptide injected on day 49 was obtained. Further, 100 mg of IFA was subcutaneously injected on day 56, and 30 to 50 ml of serum containing high titer antibody was obtained from rabbit on day 63.
The serum titer was determined by ELISA for the peptide fragments used to obtain the antibodies. Antibodies obtained using peptides # 1, # 2 and # 3 as antigens were designated as JCAb1, JCAb2 and JCAb3, respectively.
[0020]
Example 2 Immunological staining of tissues with antibodies (experimental method)
The specificity of these antibodies was determined by immunologically staining JCV and BKV infected cultured cells and brain tissue of PML patients.
JCV-infected IMR32 cells, BKV-infected 293 cells, and SV40-infected IMR32 cells were cultured on a cover glass, fixed with acetone, and stored at −80 ° C. until use. As a subject, a paraffin-embedded fragment of brain tissue of a formalin-fixed PML patient was used.
For immunological staining of these cells, the LSAB kit (Dako) and the above-mentioned high titer serum were used as a primary antibody diluted 50 times.
[0021]
(result)
When JCV-infected IMR32 cells were stained with JCAbs 1, 2 and 3, 3-4% of the cell nuclei were stained. This result supports the previously reported results for these cells. Moreover, the cytoplasm of JCV-infected cells was not stained.
When BKV-infected 293 cells were stained with JCAb2 and 3, several percent of the cell nuclei were stained, but not with JCAb1. Also, cytoplasm was not stained in BKV-infected cells.
When SV40-infected IMR32 cells were stained with JCAbs 1, 2 and 3, no staining was seen with any antibody.
The results of immunohistochemical staining with JCAb1, 2, and 3 of PML patient brain tissue embedded in formalin-fixed paraffin are consistent with the report that JCV is concentrated in specific parts of PML patient brain tissue. Dendrocytes (oligodendrocytes) and some astrocytes (astrocytes) showed typical nuclear staining.
As a control, staining was also attempted with IMR32 cells and 293 cells not infected with virus, but no staining was observed.
The results of the above experiments are summarized in Table 2 below.
[0022]
[Table 2]

[In the table, (+) indicates immunological staining and (-) indicates no staining, respectively. At the same time, the state of the staining is shown with a drawing substitute photograph. ]
[0023]
JCAb1 specifically reacted with JCV-infected cells (FIG. 1) and did not cross-react with BKV-infected cells and SV40-infected cells (FIGS. 4 and 7).
JCAbs 2 and 3 did not react with SV40 infected cells but reacted with JCV and BKV infected cells (FIGS. 2, 3, 5, 6).
Further, any antibody of JCAb1 to 3 reacted with PML brain tissue (FIGS. 8, 9, and 10) and did not react with uninfected cells as controls (FIGS. 11 and 12). Moreover, the non-infected rabbit serum and JCAb1 did not react.
[0024]
Example 3 Immunological staining of PML-infected brain tissue with diluted antibody (experimental method)
According to the method of Example 2, the brain tissue of PML patients was immunologically stained using JCAb1 diluted in stages. Normal rabbit serum was used as a control.
(result)
The results of the above experiments are summarized in Table 3 below.
[0025]
[Table 3]

[In the table, * indicates measurement under high background, and ND indicates that the measurement was not performed. ]
[0026]
JCAb1 showed positive cells at a dilution of 1: 5 to 1: 2500 times. Normal rabbit serum was negative at 1: 5 and 1: 2500 times.
[0027]
Example 4 Immunological staining of JCV-infected cells and BKV-infected cells with diluted antibody (experimental method)
In the same manner as in Example 3, JCV-infected cells and BKV-infected cells were immunologically stained using serially diluted JCAb1. Normal rabbit serum was used as a control.
(result)
The results of the above experiments are summarized in Table 4 below.
[0028]
[Table 4]

[In the table, * indicates measurement under high background, and ND indicates that the measurement was not performed. ]
[0029]
JCAb1 showed no cross-reactivity with BKV even at high concentrations (1: 5).
As described above, JCAb1, JCAb2, and JCAb3 according to the present invention are useful for definitive diagnosis of JCV because they react even in tissues embedded with formalin-fixed paraffin and exhibit sufficient immunological tissue staining that can be applied clinically. In particular, JCAb1 is useful as a detection reagent for JCV because it reacts specifically with JCV without reacting with BKV or SV40.
Further, since these antibodies react specifically with JCV, they are useful as anti-JCV antibodies as preventive / diagnostic / therapeutic agents for infectious diseases caused by JCV, such as PML and dementia.
[0030]
[Sequence Listing]

[0031]

[0032]

[0033]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of JCV-infected IMR32 cells immunologically stained with JCAb1.
FIG. 2 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of JCV-infected IMR32 cells immunologically stained with JCAb2.
FIG. 3 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of JCV-infected IMR32 cells immunologically stained with JCAb3.
FIG. 4 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of an organism, specifically a photograph showing the histological structure of BKV-infected 293 cells immunologically stained with JCAb1.
[0034]
FIG. 5 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of an organism, specifically a photograph showing the histological structure of BKV-infected 293 cells immunologically stained with JCAb2.
FIG. 6 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing a histological structure of BKV-infected 293 cells immunologically stained with JCAb3.
FIG. 7 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of SV40-infected IMR32 cells immunologically stained with JCAb1.
FIG. 8 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of a PML-infected brain tissue immunologically stained with JCAb1.
[0035]
FIG. 9 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of PML-infected brain tissue immunologically stained with JCAb2.
FIG. 10 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of a PML-infected brain tissue immunologically stained with JCAb3.
FIG. 11 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of uninfected IMR32 cells immunologically stained with JCAb1.
FIG. 12 is a substitute photograph of a drawing showing the morphology of a living organism, specifically a photograph showing the histological structure of non-infected 293 cells immunologically stained with JCAb1.

Claims

An anti-JC virus antibody obtained using the peptide fragment of SEQ ID NO: 1 which is a part of the VP-1 protein of JC virus as an antigen.

An anti-JC virus antibody obtained using the peptide fragment of SEQ ID NO: 2 which is a part of the VP-1 protein of JC virus as an antigen.

An anti-JC virus antibody obtained using the peptide fragment of SEQ ID NO: 3 which is a part of the VP-1 protein of JC virus as an antigen.

2. The anti-JC virus antibody according to claim 1, which does not cross-react with the BK virus antigen.

A JC virus detection reagent comprising the anti-JC virus antibody according to claim 1.