JP3761734B2

JP3761734B2 - Optical measurement method and apparatus

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Publication number: JP3761734B2
Application number: JP03374199A
Authority: JP
Inventors: 和男袴田
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: JP2000230903A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光計測方法および装置、詳しくは試料に光を照射することにより試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光を測定する光計測方法および装置に関し、特に照明光等の背景光によるノイズを除去する光計測方法および装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、試料に光を照射することにより試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光を測定する光計測装置が知られている。このような装置においては、外光または照明光等がノイズとして測定対象光と共に測定装置の光検出器に入射すると正確な測定ができない。そこで、背景光が光検出器に入射する前に、特定の波長領域の光強度を減衰させるフィルタあるいはピンホールを用いた空間フィルタ等を配置して背景光を除く工夫がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特定の波長領域の光強度を減衰させるフィルタあるいはピンホールを用いた空間フィルタ等では、背景光の波長領域が測定対象となる光の波長領域の一部に含まれる場合には背景光と測定対象光とを分離することができないので、背景光の一部が測定対象光に混入して計測され、測定の精度を劣化させるという問題が依然として残る。
【０００４】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、試料に光を照射することにより試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光と同じ波長領域を含む背景光が存在する環境下であっても高い精度で光を測定する方法および装置を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の光計測方法は、背景光の存在下で、試料に光を照射することにより試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光を測定する光計測方法であって、
試料に光を照射しているときに測定を行う第１の測定と試料に光を照射していないときに測定を行う第２の測定とを前記背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔で同一の測定時間に亘って行い、前記第１の測定により測定された値から第２の測定により測定された値を差し引くことにより背景光が除去された光を測定することを特徴とするものである。
【０００６】
また、本発明のもう一つの光計測方法は、試料に光を照射しているときに測定を行う第１の測定と試料に光を照射していないときに測定を行う第２の測定とをそれぞれ前記背景光の強度変化の周期の整数倍の時間に亘って行い、前記第１の測定により測定された値から第２の測定により測定された値を差し引くことにより背景光が除去された光を測定することを特徴とするものである。
【０００７】
前記背景光の強度変化の周期は、その強度を測定することにより求めることができる。
【０００８】
本発明の光計測装置は、試料に光を照射する手段と、試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光を測定する手段とを備えた光計測装置であって、
試料に光を照射しているときに測定を行う第１の測定手段と、試料に光を照射していないときに測定を行う第２の測定手段と、前記第１の測定と第２の測定の測定間隔を背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔で同一の測定時間に亘って行うように前記測定手段のタイミングを制御する制御手段と、前記第１の測定により測定された値から第２の測定により測定された値を差し引くことにより背景光が除去された光を求める演算手段とを備えたことを特徴とするものである。
【０００９】
本発明のもう一つの光計測装置は、試料に光を照射する手段と、試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光を測定する手段とを備えた光計測装置であって、
試料に光を照射しているときに測定を行う第１の測定手段と、試料に光を照射していないときに測定を行う第２の測定手段と、前記第１の測定時間と第２の測定時間とをそれぞれ背景光の強度変化の周期の整数倍の時間に亘って行うように前記測定手段のタイミングを制御する制御手段と、前記第１の測定により測定された値から第２の測定により測定された値を差し引くことにより背景光が除去された光を求める演算手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１０】
前記背景光の強度変化の周期は、背景光の強度を測定する手段により求めることができる。
【００１１】
なお、前記「背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔で同一の測定時間に亘って行う測定」および「周期の整数倍の時間に亘って行う測定」とは測定が背景光の周期に同期して行われる必要がないことを意味するが、結果として同期して測定することを排除するものではない。
【００１２】
また、前記「試料に光を照射することにより試料から発せられる光」とは、蛍光、ラマン光、燐光等の再放射光を意味する。
【００１３】
また、前記「試料により反射される光」とは照射光が試料で反射するときに偏光を受けた光、照射光が試料で反射するときにそのスペクトル（波長領域）の一部が試料により吸収された光または照射光が試料で反射するときに試料の反射率に従って光強度が減衰した光あるいは前記の影響が複合された光を意味する。
【００１４】
また、前記「試料を透過する光」とは、照射光が試料を透過射するときに偏光を受けた光、照射光が試料を透過するときにそのスペクトル（波長領域）の一部が試料により吸収された光、照射光が試料を透過するときに試料の透過率に従って光強度が減衰した光あるいは前記の影響が複合された光を意味する。
【００１５】
また、前記「光計測」とは、光の分光測定、光の強度の定量測定または光の強度の定性測定を指し、さらにそれらの測定が一つの観測ポイントに関して測定することまたは多数の観測ポイントをＣＣＤ等を用いた撮像装置により画像として測定すること等を広く含むものを意味する。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の第１の光計測方法および第１の光計測装置は、背景光の存在下において、試料に光を照射しているときに測定対象光（試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光）のスペクトルまたは強度を点情報または画像（面情報）として測定する第１の測定と試料に光を照射していないときに前記測定と同様に行われる背景光を測定する第２の測定とを前記背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔で同一の測定時間に亘って行い、第１の測定の光の測定値から第２の測定の光の測定値を差し引き背景光の影響を除去した光の計測を行うものである。ここで、第１の測定と第２の測定は背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔をおいて測定が行われるので、第１の測定、第２の測定共に背景光の強度変化の周期の同一位相位置から測定が開始される。従って、第１の測定の測定値に含まれる背景光の値と背景光のみを測定する第２の測定で得られる値は、その分光分布（スペクトル）と強度が一致し、前記第１の測定の測定値から第２の測定の測定値を差し引くことにより背景光の影響を除去することができ、試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光と同じ波長領域を含む背景光が存在する環境下であっても高い精度で前記光のスペクトルおよび強度を点情報または画像（面情報）として計測することができる。
なお、前記背景光の強度変化を測定することによりその周期を求め、その値を前記背景光の強度変化の周期の整数倍の時間間隔で同一の測定時間に亘って行う測定の時間の基準として採用すれば、より正確な背景光の強度変化の周期に基づき前記測定を行うことができるので、より高い精度で前記光の計測を行うことができる。
本発明の第２の光計測方法および第２の光計測装置は、背景光の存在下において、試料に光を照射しているときに測定対象光（試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光）のスペクトルまたは強度を点情報または画像（面情報）として測定する第１の測定と、試料に光を照射していないときに前記測定と同様に行われる背景光のみを測定する第２の測定とを前記背景光の強度変化の周期の整数倍の時間に亘って行い、第１の測定の光の測定値から第２の測定の光の測定値を差し引き背景光の影響を除去した光の計測を行うものである。ここで、第１の測定の測定値に含まれる背景光の値と背景光のみを測定する第２の測定で得られる背景光の値は共に背景光の強度変化の周期の整数倍の同一な時間に亘って行われるのでどのような位相位置において測定が開始されても測定される光に含まれる背景光の値は同一となる。従って、前記第１の測定の測定値から第２の測定の測定値を差し引くことにより背景光の影響を除去することができ、試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光と同じ波長領域を含む背景光が存在する環境下であっても高い精度で前記光のスペクトルおよび強度を点情報または画像（面情報）として計測することができる。
【００１７】
なお、前記背景光の強度変化を測定することによりその周期を求め、その値を前記背景光の強度変化の周期の整数倍の同一な時間に亘って行う測定の時間の基準として採用すれば、より正確な背景光の強度変化の周期に基づき前記測定を行うことができるので、より高い精度で前記光の計測を行うことができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１９】
図１は本発明の光計測方法を実施する光計測装置の第１の実施形態として蛍光スペクトルを測定する装置の概略を示す図である。
【００２０】
本実施形態のスペクトル測定装置は、試料10に励起光Ｌａを照射する光源20と、該照射により試料10から発せられる蛍光を受光する集光光学系40と、該受光した光を分光的に測定しその測定値をコントローラ100に出力する分光測定器50と、背景光の強度変化を測定しその測定値をコントローラ100に出力する光強度測定器60と、前記光源20から射出される励起光Ｌａの光路を開閉するシャッタ30と、該シャッタ30の開閉と分光測定器50の測定開始と終了とを制御し、分光測光器50および光強度測定器60から出力される測定値を入力するコントローラ100とから構成されている。
【００２１】
光源20には励起光源として水銀ランプ21が備えられ、射出窓には特定波長を透過させる帯域フィルタ22が設置されている。
【００２２】
集光光学系40には試料10に照射される励起光Ｌａの反射光を除去し蛍光を透過させる長波長透過フィルタ41が配置されている。
【００２３】
分光測光器50は、光を分光する分光部51と分光された光を測光するダイオードアレー等を用いた測光部52で構成されている。
【００２４】
コントローラ100は、光強度測定器60から背景光の強度変化の測定値を入力し該強度変化の周期を算出してその値を出力する周期算出器110と、前記周期算出器110から入力した背景光の強度変化の周期の値と選択され内部に記憶されている整数の値とを乗算し測定時間間隔の値として出力する測定間隔算出器120と、前記測定間隔算出器120から入力した測定時間間隔の値および予め記憶されている測定時間の値に基づき分光測光器50、マルチチャンネルアナライザ140およびシャッタ30に対して照射測定および非照射測定の開始と終了の信号を出力し、試料10へ励起光Ｌａを照射して測定を行う照射測定および試料10へ励起光Ｌａを照射しないで測定を行う非照射測定とのタイミングを制御するタイミングコントローラ130と、前記タイミングコントローラ130のタイミング制御信号に従って、照射測定で得られたスペクトル強度分布の値および非照射測定で得られたスペクトル強度分布の値を入力し記憶して、照射測定のスペクトル強度分布の値から非照射測定のスペクトル強度分布の値を差し引く演算を行いその結果を出力するマルチチャンネルアナライザ140と、前記マルチチャンネルアナライザ140から入力したスペクトル強度分布の演算結果を表示する表示器150とから構成される。
【００２５】
次に、本実施形態のスペクトル測定装置を蛍光測定に適用したときの作用について説明する。
【００２６】
まず、本スペクトル測定装置の測定時間間隔設定の作用について説明する。
【００２７】
スペクトル測定装置の測定前の状態では光源20の水銀ランプ21は点灯しており、その光は帯域フィルタ22を透過することにより中心波長４０５ｎｍのｈ線の輝線スペクトルの励起光Ｌａとして射出されるが、シャッタ30が閉じているので試料10には励起光Ｌａが照射されていない。また光強度測定器60は光強度の測定を開始し測定値をコントローラ100に出力している。
【００２８】
上記測定前の状態では照射光Ｌａはシャッタ30で遮光されているので、光強度測定器60では照明光に起因する背景光のみが測定され、測定された背景光の強度変化はコントローラ100に出力されて周期算出器110により前記強度変化の周期の値Ｓが算出される。該算出された背景光の強度変化の周期の値Ｓは、測定間隔算出器120によって、すでに選択され測定間隔算出器120の内部に記憶されている整数の値と乗算され測定時間間隔の算出値ＴＫとしてタイミングコントローラ130に出力される。タイミングコントローラ130は前記算出値を照射測定と非照射測定の時間間隔の値ＴＫとして記憶し測定時間間隔の設定が終了する。なお、本実施形態においては前記すでに選択され測定間隔算出器120の内部に記憶されている整数の値は２とし、時間間隔の値ＴＫは周期の値Ｓの２倍とする。
【００２９】
次に、照射測定と非照射測定の作用について説明する。
【００３０】
タイミングコントローラ130は、測定間隔算出器120から入力した照射測定と非照射測定の時間間隔の値ＴＫおよびあらかじめ内部に記憶されている照射測定および非照射測定に費やすそれぞれの時間の値ＴＳに基づき図２のタイミングチャートに示すようなタイミングで分光測定器50、マルチチャンネルアナライザ140およびシャッタ30に対して照射測定および非照射測定の開始と終了の信号を出力しスペクトルの測定を行う。
【００３１】
すなわち、時刻ｔ1において照射測定が開始されると、シャッタ30は開放され、励起光Ｌａが試料10に照射され、励起光Ｌａの照射により試料から蛍光が発せられる。分光測定器50は測定を開始し、集光光学系40を透過した背景光と試料10から発せられた蛍光は分光部51で分光され、測光部52において前記分光された光のスペクトルの強度が測定される。照射測定開始から時間ＴＳ経過後の時刻ｔ2に照射測定は終了し、分光測定器50は測定されたスペクトルの測定値を保持したまま測定を停止して、シャッタ30は閉じられ励起光Ｌａの試料10への照射も停止する。分光測定器50に保持されている測定値である背景光ＨＡと蛍光ＫＡの和に相当する照射測定におけるスペクトルの測定値は時刻ｔ3においてマルチチャンネルアナライザ140に出力され記憶される。
【００３２】
ここで、試料10に照射される励起光Ｌａの反射光は試料10が発する蛍光と共に集光光学系40に入射するが、蛍光の波長はその励起光の波長よりも長波長側にあるので長波長透過フィルタ41により励起光は除去される。
【００３３】
次に、照射測定開始の時刻ｔ1から背景光の強度変化の周期の値Ｓの整数倍である２倍経過した時刻ｔ4において非照射測定が開始されると、シャッタ30は閉じられたままで分光測定器50は測定を開始する。しかし、試料10には励起光Ｌａが照射されていないので蛍光ＫＢの強度はゼロとなり背景光ＨＢのみのスペクトルが測定される。照射測定開始から時間ＴＳ経過後の時刻ｔ6に測定が終了し、シャッタ30は引き続き閉じられたままで、分光測定器50はスペクトルの測定値を保持したまま測定を停止する。分光測定器50に保持されている背景光ＨＢの測定値に相当する背景光のスペクトル強度分布の値は時刻ｔ7において照射測定のときと同様にマルチチャンネルアナライザ140に出力され記憶される。
【００３４】
次に、スペクトル強度分布の演算と表示の作用について説明する。
【００３５】
前記マルチチャンネルアナライザ140に記憶された照射測定で得られたスペクトル強度分布の値と非照射測定で得られたスペクトル強度分布の値はマルチチャンネルアナライザ140によって除算され蛍光スペクトル強度分布の値が求められる。
【００３６】
ここで、図３ａ（照射測定により得られたスペクトル強度分布）図３ｂ（非照射測定により得られたスペクトル強度分布）図３ｃ（照射測定で得られたスペクトル強度分布から非照射測定により得られたスペクトル強度分布）に示すように前記測定で得られた照射測定の測定値に含まれる背景光のスペクトル強度分布の値ＳＨＡ（図３ａ）と非照射測定の測定値である背景光のスペクトル強度分布の値ＳＨＢ（図３ｂ）とは測定された時刻は異なるが一定の周期のある位相からある位相まで同一の位相領域を測定したものなので、スペクトル強度分布も同一となる。
【００３７】
従って、照射測定における測定値である背景光のスペクトル強度分布の値ＳＨＡと蛍光のスペクトル強度分布の値ＳＫＡの和（図３ａ）から非照射測定における測定値である背景光のスペクトル強度分布の値ＳＨＢ（図３ｂ）を差し引くことにより背景光のスペクトル成分を除去した蛍光のスペクトル強度分布の値ＳＫＡ（図３ｃ）を求めることができる。
【００３８】
前記のように求められた蛍光のスペクトル強度分布ＳＫＡの値は表示器150によって画像として表示される。
【００３９】
なお、図２に示すように背景光が一定の定常成分ｅと周期成分ｆの和であっても、周期成分ｆまたは定常成分ｅだけから成るものであっても上記演算により背景光のスペクトル成分を除去した蛍光スペクトル強度分布の値を求めることができることは上記の説明より明らかである。
【００４０】
また、前記照射測定および非照射測定におけるシャッタ30の開放時間すなわち励起光Ｌａの試料10への照射時間は分光測定器50の測定時間範囲と異なる範囲でも同様の測定を行うことが可能であり、励起光をパルス状に照射してもよいし、励起光の強度を照射中に変化させてもよい。
【００４１】
また、測定の順序は、照射測定の後に非照射測定を行うことも非照射測定の後に照射測定を行うことも可能である。
また、外乱光の周期があらかじめわかっていれば背景光の周期の測定は必ずしも行う必要はなく、周期算出器110に既知の背景光周期の値を記憶させておき、その値を用いて測定を行うこともできる。
また、すでに選択され測定間隔算出器120の内部に記憶されている整数の値を２としたが整数であれば他の値とすることもできる。
また、前記照射測定および非照射測定背景光の強度変化と同期をとる必要はないが、同期することを排除するものではない。
【００４２】
また、上記実施の形態は本発明を蛍光スペクトル測定に適用したものについて説明されているが、集光光学系40の透過フィルタ特性、光源20のランプの波長特性および帯域フィルタの特性、照射測定および非照射測定の測定時間および測定時間間隔等を変更することにより、蛍光のスペクトル測定に限らず、燐光スペクトル測定、吸収スペクトル測定および偏光スペクトル測定等にも適用することができる。
【００４３】
以上のように本発明の本実施形態のスペクトル測定装置によれば、試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光と同じ波長領域を含む背景光が存在する環境下であっても高い精度でスペクトルを測定することができる。
【００４４】
次に図４および図５を参照して本発明のスペクトル測定方法を実施するスペクトル測定装置の第２の実施形態である蛍光スペクトル強度分布を測定する装置について説明する。なお図４においては、第１の実施形態の概略を示す図１中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する。
【００４５】
図４は、本発明のによるスペクトル測定方法を実施するスペクトル測定装置を適用した蛍光スペクトルを測定する装置の概略を示す図である。
【００４６】
本発明の第２の実施形態のスペクトル測定装置のコントローラ200は、光強度測定器60から背景光の強度変化の測定値を入力し該強度変化の周期を算出してその値を出力する周期算出器110と、前記周期算出器110から入力した背景光の強度変化の周期の値と選択され内部に記憶されている整数の値とを乗算し測定時間間隔の値として出力する測定時間算出器220と、前記測定時間算出器120から入力した測定時間の値および予め記憶されている測定時間間隔の値に基づき分光測光器50、マルチチャンネルアナライザ140およびシャッタ30に対して照射測定および非照射測定の開始と終了の信号を出力し、試料10へ励起光Ｌａを照射して測定を行う照射測定および試料10へ励起光Ｌａを照射しないで測定を行う非照射測定のタイミングを制御するタイミングコントローラ230と、前記タイミングコントローラ230のタイミング制御信号に従って、照射測定で得られたスペクトル強度分布の値および非照射測定で得られたスペクトル強度分布の値を入力し記憶して、照射測定のスペクトル強度分布の値から非照射測定のスペクトル強度分布の値を差し引く演算を行いその結果を出力するマルチチャンネルアナライザ140と、前記マルチチャンネルアナライザ140から入力したスペクトル強度分布の演算結果を表示する表示器150とから構成される。
【００４７】
その他の構成は第１の実施形態と同様であり、第２の実施形態のスペクトル測定装置はコントローラ200の測定時間算出器220およびタイミングコントローラ230の構成および作用が前記第１の実施形態のスペクトル測定装置と異なるものである。
【００４８】
以下、本第２の実施形態のスペクトル測定装置を蛍光測定に適用したときの作用について説明する。
【００４９】
まず、本スペクトル測定装置の測定時間設定の作用について説明する。
【００５０】
スペクトル測定装置の測定前の状態では光源20の水銀ランプ21は点灯しており、その光は帯域フィルタ22を透過することにより中心波長４０５ｎｍのｈ線の輝線スペクトルの励起光Ｌａとして射出されるが、シャッタ30が閉じているので試料10には励起光Ｌａが照射されていない。また光強度測定器60は光強度の測定を開始し測定値をコントローラ200出力している。
【００５１】
上記測定前の状態では照射光Ｌａはシャッタ30で遮光されているので、照明光に起因する背景光のみが光強度測定器60で測定され、測定された背景光の強度変化はコントローラ200に出力されて周期算出器110により前記強度変化の周期の値ＳＳが算出される。該算出された背景光の強度変化の周期の値ＳＳは、測定時間算出器220によって、すでに選択され測定時間算出器220の内部に記憶されている整数の値と乗算され測定時間の算出値ＴＳＳとしてタイミングコントローラ230に出力される。タイミングコントローラ230は前記算出値を照射測定および非照射測定にそれぞれ費やす時間の値ＴＳＳとして記憶し測定時間の設定が終了する。なお、本第２の実施形態においては、前記すでに選択され測定時間算出器220の内部に記憶されている整数の値は２し測定に費やす時間の値ＴＳＳは周期の値ＳＳの２倍とする。
【００５２】
次に、照射測定と非照射測定の作用について説明する。
【００５３】
タイミングコントローラ230は、測定時間算出器220から入力した前記測定時間の値ＴＳＳおよびあらかじめ内部に記憶されている照射測定終了から非照射測定開始までの時間間隔の値ＴＫＫに基づいて、図５のタイミングチャートに示すようなタイミングで分光測定器50、マルチチャンネルアナライザ140およびシャッタ30に対して照射測定および非照射測定の開始と終了の信号を出力しスペクトルの測定を行う。
【００５４】
すなわち、時刻ｔ1において照射測定が開始されると、シャッタ30は開放となり励起光Ｌａが試料10に照射され、励起光Ｌａの照射により試料から蛍光が発せられる。分光測定器50は測定を開始し集光光学系40を透過した背景光と試料10から発せられる蛍光は分光部51で分光され測光部52において前記分光された蛍光のスペクトルの強度が測定される。照射測定開始の時刻ｔ1から背景光の強度変化の周期ＳＳの整数倍である２倍のＴＳＳの時間が経過した時刻ｔ2で照射測定が終了し、分光測定器50は測定されたスペクトルの測定値を保持したまま測定を停止して、シャッタ30は閉じられ励起光Ｌａの試料10への照射も停止する。分光測定器50に保持されている測定値である背景光ＨＡＡと蛍光ＫＡＡの和に相当する照射測定のスペクトルの値は時刻ｔ3においてマルチチャンネルアナライザ140に出力され記憶される。
ここで、試料10に照射される励起光Ｌａの反射光は試料10が発する蛍光と共に集光光学系40に入射するが蛍光の波長はその励起光の波長よりも長波長側にあるので長波長透過フィルタ41により励起光は除去される。
【００５５】
次に、照射測定終了の時刻ｔ2から時間ＴＫＫが経過した時刻ｔ4において非照射測定が開始されると、シャッタ30は閉じられたままで分光測定器50は測定を開始するが、試料10には励起光Ｌａが照射されていないので蛍光ＫＢＢの強度はゼロとなり背景光ＨＢＢのみのスペクトルが測定される。照射測定開始からＴＳＳ時間後の時刻ｔ6に測定が終了されるとシャッタ30は引き続き閉じられたままで、分光測定器50はスペクトルの測定値を保持したまま測定を停止する。分光測定器50に保持されている背景光ＨＢＢに相当する背景光のスペクトル強度分布の値は時刻ｔ7においてマルチチャンネルアナライザ140に出力され記憶される。
【００５６】
次に、スペクトル強度分布の演算と表示の作用について説明する。
【００５７】
前記マルチチャンネルアナライザ140に記憶された照射測定で得られたスペクトル強度分布の値と非照射測定で得られたスペクトル強度分布の値はマルチチャンネルアナライザ140によって除算され蛍光スペクトル強度分布の値が求められる。
【００５８】
前記測定で得られた照射測定に含まれる背景光のスペクトル強度分布と非照射測定における背景光のスペクトル強度分布とは測定時刻は異なるが一定の周期の背景光の整数倍の領域を測定したものであるので、すなわち図５に示される背景光ＨＡＡとＨＢＢはまったく同一のスペクトルとその強度変化を含むものとみなすことができるので、測定されるスペクトル強度分布も同一のものとなる。
【００５９】
従って、第１の実施形態と同様にマルチチャンネルアナライザ140によって、照射測定によって得られたスペクトル強度分布の値から非照射測定によって得られたスペクトル強度分布の値を差し引くことにより背景光のスペクトル成分を除去した蛍光のスペクトル強度分布の値を求めることができる。
【００６０】
前記マルチチャンネルアナライザ140によって求められた蛍光スペクトル強度分布の値は表示器150に出力され画像として表示される。
【００６１】
なお、図５に示すように背景光が一定の定常成分ｅｅと周期成分ｆｆの和であっても、周期成分ｆｆまたは定常成分ｅｅだけから成るものであっても上記演算により背景光のスペクトル成分を除去した蛍光スペクトル強度分布の値を求めることができることは上記の説明より明らかである。
【００６２】
また、前記照射測定および非照射測定におけるシャッタ30の開放時間すなわち励起光Ｌａの試料10への照射時間は分光測定器50の測定時間範囲と異なる範囲でも同様の測定を行うことが可能であり、励起光をパルス状に照射してもよいし、励起光の強度を照射中に変化させてもよい。
【００６３】
また、測定の順序は、照射測定の後に非照射測定を行うことも非照射測定の後に照射測定を行うことも可能である。
【００６４】
また、外乱光の周期があらかじめ解っていれば背景光の周期の測定を行うことは必ずしも必要ではなく、周期算出器110に既知の背景光周期の値を記憶させておき、その値を用いて測定を行うこともできる。
また、すでに選択され測定時間算出器220の内部に記憶されている整数の値を２としたが整数であれば他の値とすることもできる。
また、前記照射測定および非照射測定背景光の強度変化と同期をとる必要はないが、同期することを排除するものではない。
【００６５】
また、上記説明による実施の形態は本発明を蛍光スペクトル測定に適用したものについて説明したが、分光測定器50の分光特性、集光光学系40の透過フィルタ特性、光源20のランプの波長特性および帯域フィルタの特性、照射測定および非照射測定の測定時間および測定時間間隔等を変更することにより、試料から発せられる蛍光のスペクトル測定に限らず、試料から発せられるラマン光または燐光あるいは試料で反射することにより偏光、吸収または減衰される光のスペクトルおよび強度を計測することができる。
【００６６】
また、光源20およびシャッタ30を試料10を挟んで集光光学系40の反対側に配置することにより、光源から射出される光を試料に照射し、試料を透過した光を集光光学系40で集光して、前記と同様に試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料を透過することにより偏光、吸収または減衰される光のスペクトルおよび強度を計測することができる。
【００６７】
また、集光光学系40を結像光学系に、分光測定器50を撮像ユニットに、分光部51をＣＣＤ等を用いた撮像デバイスに、測光部52を撮像ドライバに、マルチチャンネルアナライザ140を画像処理ユニットに変更することにより、測定対象光（試料10から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光）の試料面上の強度分布を結像光学系により撮像デバイス上に結像し、撮像デバイス上の各画素で検出される光の強度を撮像ドライバにより画像信号に変換して画像処理ユニットに出力し、前記画像信号を入力した画像処理ユニット内にこの画像信号を記憶する。ここで、前記と同様にタイミングコントローラから出力される測定タイミングに従って試料に光を照射しているときおよび試料に光を照射していないときに撮像ユニットによる測定を行い測定され変換された画像信号を画像処理ユニットに出力し、画像ユニットにおいて２つの画像信号を差し引く演算を行うことにより、測定対象光（試料から発せられる蛍光、ラマン光または燐光あるいは試料により偏光、吸収または減衰される光）の強度を画像（面情報）として前記と同様に計測することができる。
【００６８】
以上のように本発明の光計測方法および光計測装置によれば、試料から発せられる光または試料により反射される光または試料を透過する光と同じ波長領域を含む背景光が存在する環境下であっても高い精度でスペクトルおよび強度あるいはその画像（面情報）の計測を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の光計測装置を蛍光スペクトルの測定に適用した概略構成図
【図２】スペクトル測定のタイミングチャート図
【図３】照射測定で得られたスペクトル強度分布の値から非照射測定で得られたスペクトル強度分布の値を差し引く演算の原理説明図
【図４】本発明の光計測装置を蛍光スペクトルの測定に適用した第２の実施形態の概略構成図
【図５】第２の実施形態のスペクトル測定のタイミングチャート図
【符号の説明】
１０試料
２０光源
２１水銀ランプ
２２帯域フィルタ
３０シャッタ
４０集光光学系
４１長波長透過フィルタ
５０分光測定器
５１分光部
５２測光部
６０光強度測定器
１００コントローラ
１１０周期算出器
１２０測定間隔算出器
１３０タイミングコントローラ
１４０マルチチャンネルアナライザ
２００コントローラ
２２０測定時間算出器
２３０タイミングコントローラ
Ｌａ励起光
ＫＡ照射測定における蛍光
ＫＢ非照射測定における蛍光
ＨＡ照射測定における背景光
ＨＢ非照射測定における背景光
Ｓ背景光の強度変化の周期
ＴＳ照射測定および非照射測定に費やす時間の値
ＴＫ照射測定開始から非照射測定開始までの時間間隔の値
ＳＫＡ照射測定における蛍光のスペクトル強度分布
ＳＨＡ照射測定における背景光のスペクトル強度分布
ＳＨＢ非照射測定における背景光のスペクトル強度分布
ｆ背景光の周期成分
ｅ背景光の定常成分
ＫＡＡ照射測定における蛍光
ＫＢＢ非照射測定における蛍光
ＨＡＡ照射測定における背景光
ＨＢＢ非照射測定における背景光
ＳＳ背景光の強度変化の周期
ＴＳＳ照射測定および非照射測定それぞれに費やす時間の値
ＴＫＫ照射測定終了から非照射測定開始までの時間間隔の値
ｆｆ背景光の周期成分
ｅｅ背景光の定常成分[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an optical measurement method and apparatus, and more particularly, to an optical measurement method and apparatus for measuring light emitted from a sample by being irradiated with light, light reflected by the sample, or light transmitted through the sample, and particularly illumination light. The present invention relates to an optical measurement method and apparatus for removing noise caused by background light such as the above.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art Conventionally, an optical measurement device that measures light emitted from a sample, light reflected from the sample, or light transmitted through the sample by irradiating the sample with light is known. In such an apparatus, when external light, illumination light, or the like is incident on the photodetector of the measuring apparatus together with the measurement target light as noise, accurate measurement cannot be performed. Therefore, before the background light is incident on the photodetector, a device for attenuating the background light by arranging a filter for attenuating the light intensity in a specific wavelength region or a spatial filter using a pinhole has been devised.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, in a filter that attenuates the light intensity in a specific wavelength region or a spatial filter that uses a pinhole, if the wavelength region of the background light is included in a part of the wavelength region of the light to be measured, Since the measurement target light cannot be separated, there still remains a problem that a part of the background light is mixed and measured in the measurement target light and the measurement accuracy is deteriorated.
[0004]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and there is background light including the same wavelength region as the light emitted from the sample, the light reflected by the sample, or the light transmitted through the sample by irradiating the sample with light. It is an object of the present invention to provide a method and an apparatus for measuring light with high accuracy even in an environment where the above is performed.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The optical measurement method of the present invention is an optical measurement method for measuring light emitted from a sample, reflected by the sample, or transmitted through the sample in the presence of background light. ,
The first measurement that is performed when the sample is irradiated with light and the second measurement that is performed when the sample is not irradiated with light are times of integral multiples of the period of intensity change of the background light. The measurement is performed over the same measurement time at intervals, and the light from which background light is removed is measured by subtracting the value measured by the second measurement from the value measured by the first measurement. Is.
[0006]
Further, another optical measurement method of the present invention includes a first measurement that performs measurement when the sample is irradiated with light and a second measurement that performs measurement when the sample is not irradiated with light. Light obtained by removing background light by subtracting the value measured by the second measurement from the value measured by the first measurement, which is performed over an integral multiple of the period of intensity change of the background light. Is measured.
[0007]
The period of the intensity change of the background light can be obtained by measuring the intensity.
[0008]
The optical measurement device of the present invention is an optical measurement device comprising means for irradiating a sample with light, and means for measuring light emitted from the sample, light reflected by the sample or light transmitted through the sample,
First measurement means for performing measurement when the sample is irradiated with light, second measurement means for performing measurement when the sample is not irradiated with light, the first measurement and the second measurement A control means for controlling the timing of the measuring means so as to be performed over the same measuring time at a time interval that is an integral multiple of the period of intensity change of the background light, and the value measured by the first measurement. And calculating means for obtaining light from which background light has been removed by subtracting the value measured in the second measurement.
[0009]
Another optical measurement apparatus of the present invention is an optical measurement apparatus comprising means for irradiating a sample with light, and means for measuring light emitted from the sample, light reflected by the sample, or light transmitted through the sample. There,
A first measuring means for measuring when the sample is irradiated with light; a second measuring means for measuring when the sample is not irradiated with light; the first measuring time and the second measuring time; Control means for controlling the timing of the measurement means so that the measurement time is performed over an integral multiple of the period of intensity change of the background light, and a second measurement based on the value measured by the first measurement. And calculating means for obtaining light from which background light has been removed by subtracting the value measured in step (1).
[0010]
The period of the intensity change of the background light can be obtained by means for measuring the intensity of the background light.
[0011]
The “measurement performed over the same measurement time at a time interval that is an integral multiple of the period of intensity change of the background light” and “measurement performed over a time that is an integral multiple of the period” mean that the measurement is the period of the background light. Does not need to be performed synchronously, but as a result does not exclude synchronous measurement.
[0012]
Further, the “light emitted from the sample by irradiating the sample with light” means re-radiated light such as fluorescence, Raman light, and phosphorescence.
[0013]
The “light reflected by the sample” means light polarized when the irradiated light is reflected by the sample, and a part of its spectrum (wavelength region) is absorbed by the sample when the irradiated light is reflected by the sample. When the reflected light or irradiated light is reflected by the sample, it means light whose intensity is attenuated according to the reflectance of the sample or light in which the above effects are combined.
[0014]
The “light that passes through the sample” means light that is polarized when the irradiation light is transmitted through the sample, and a part of the spectrum (wavelength region) of the irradiation light that passes through the sample depends on the sample. It means light in which light intensity is attenuated according to the transmittance of the sample when absorbed light or irradiated light passes through the sample, or light in which the above effects are combined.
[0015]
The “optical measurement” refers to light spectroscopic measurement, light intensity quantitative measurement, or light intensity qualitative measurement, and the measurement is performed with respect to one observation point or a number of observation points. It means that widely includes measuring as an image by an imaging device using a CCD or the like.
[0016]
【The invention's effect】
The first optical measurement method and the first optical measurement apparatus according to the present invention provide measurement target light (fluorescence, Raman light, phosphorescence or light emitted from a sample, when the sample is irradiated with light in the presence of background light. A first measurement that measures the spectrum or intensity of light polarized, absorbed, or attenuated by the sample) as point information or an image (surface information), and a background that is performed in the same manner as the above measurement when the sample is not irradiated with light The second measurement for measuring light is performed over the same measurement time at a time interval that is an integral multiple of the period of intensity change of the background light, and the second measurement light is obtained from the measurement value of the first measurement light. The measurement of the light from which the influence of the background light is removed by subtracting the measured value is performed. Here, since the first measurement and the second measurement are performed at a time interval that is an integral multiple of the period of the intensity change of the background light, the intensity change of the background light is performed in both the first measurement and the second measurement. Measurement is started from the same phase position of the period. Accordingly, the value of the background light included in the measurement value of the first measurement and the value obtained by the second measurement for measuring only the background light have the same spectral distribution (spectrum) and intensity, and the first measurement. By subtracting the measurement value of the second measurement from the measurement value of the sample, the influence of the background light can be removed, and the same wavelength as the fluorescence, Raman light or phosphorescence emitted from the sample, or the light polarized, absorbed or attenuated by the sample Even in an environment where background light including a region exists, the spectrum and intensity of the light can be measured as point information or images (surface information) with high accuracy.
In addition, the period is obtained by measuring the intensity change of the background light, and the value is used as a reference for the measurement time over the same measurement time at an integer multiple of the period of the intensity change of the background light. If it is adopted, the measurement can be performed based on a more accurate period of intensity change of the background light, so that the light can be measured with higher accuracy.
The second optical measurement method and the second optical measurement apparatus according to the present invention provide light to be measured (fluorescence, Raman light, phosphorescence emitted from a sample, or light emitted from a sample when the sample is irradiated with light in the presence of background light. First measurement for measuring spectrum or intensity of light polarized, absorbed or attenuated by the sample) as point information or image (surface information), and the same as the above measurement when the sample is not irradiated with light The second measurement of measuring only the background light is performed over a time that is an integral multiple of the period of the intensity change of the background light, and the measurement value of the second measurement light is obtained from the measurement value of the first measurement light. The measurement of the light from which the influence of the subtraction background light is removed is performed. Here, both the background light value included in the measurement value of the first measurement and the background light value obtained in the second measurement for measuring only the background light are the same as an integer multiple of the period of intensity change of the background light. Since the measurement is performed over time, the value of the background light included in the measured light is the same regardless of the phase position where the measurement is started. Accordingly, the influence of background light can be removed by subtracting the measurement value of the second measurement from the measurement value of the first measurement, and the fluorescence, Raman light or phosphorescence emitted from the sample, or polarized light, absorption or Even in an environment where background light including the same wavelength region as the attenuated light exists, the spectrum and intensity of the light can be measured as point information or image (surface information) with high accuracy.
[0017]
In addition, if the period is obtained by measuring the intensity change of the background light, and the value is adopted as a reference for the time of measurement performed over the same time as an integral multiple of the period of the intensity change of the background light, Since the measurement can be performed based on a more accurate period of intensity change of the background light, the light can be measured with higher accuracy.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0019]
FIG. 1 is a diagram showing an outline of an apparatus for measuring a fluorescence spectrum as a first embodiment of an optical measurement apparatus for carrying out the optical measurement method of the present invention.
[0020]
The spectrum measuring apparatus of the present embodiment includes a light source 20 that irradiates the sample 10 with the excitation light La, a condensing optical system 40 that receives fluorescence emitted from the sample 10 by the irradiation, and spectroscopically measures the received light. A spectrophotometer 50 for outputting the measured value to the controller 100, a light intensity measuring device 60 for measuring a change in the intensity of background light and outputting the measured value to the controller 100, and an excitation light La emitted from the light source 20. A shutter 30 that opens and closes the optical path of the light source, and a controller 100 that controls opening and closing of the shutter 30 and measurement start and end of the spectrophotometer 50 and inputs measurement values output from the spectrophotometer 50 and the light intensity measuring device 60. It consists of and.
[0021]
The light source 20 is provided with a mercury lamp 21 as an excitation light source, and a band-pass filter 22 that transmits a specific wavelength is installed at the exit window.
[0022]
The condensing optical system 40 is provided with a long wavelength transmission filter 41 that removes reflected light of the excitation light La irradiated on the sample 10 and transmits fluorescence.
[0023]
The spectrophotometer 50 includes a spectroscopic unit 51 that splits light and a photometric unit 52 that uses a diode array or the like that measures the split light.
[0024]
The controller 100 receives the measured value of the background light intensity change from the light intensity measuring device 60, calculates the period of the intensity change and outputs the value, and the background input from the period calculator 110 A measurement interval calculator 120 that multiplies the value of the light intensity change period by an integer value that is selected and stored internally, and outputs the value as a measurement time interval value, and the measurement time input from the measurement interval calculator 120 Based on the interval value and the pre-stored measurement time value, signals for the start and end of irradiation measurement and non-irradiation measurement are output to the spectrophotometer 50, multichannel analyzer 140, and shutter 30, and excited to the sample 10 A timing controller 130 for controlling the timing of irradiation measurement in which measurement is performed by irradiating light La and non-irradiation measurement in which measurement is performed without irradiating the sample 10 with excitation light La; and the timing controller According to the 130 timing control signal, the value of the spectral intensity distribution obtained by irradiation measurement and the value of the spectral intensity distribution obtained by non-irradiation measurement are input and stored, and the non-irradiation measurement is performed from the value of the spectral intensity distribution of irradiation measurement. The multi-channel analyzer 140 that performs an operation of subtracting the value of the spectral intensity distribution and outputs the result, and the display 150 that displays the operation result of the spectral intensity distribution input from the multi-channel analyzer 140.
[0025]
Next, an operation when the spectrum measuring apparatus of the present embodiment is applied to fluorescence measurement will be described.
[0026]
First, the effect | action of the measurement time interval setting of this spectrum measuring device is demonstrated.
[0027]
In the state before the measurement by the spectrum measuring apparatus, the mercury lamp 21 of the light source 20 is lit, and the light passes through the band filter 22 and is emitted as the excitation light La of the bright line spectrum of the h-line having the center wavelength of 405 nm. Since the shutter 30 is closed, the sample 10 is not irradiated with the excitation light La. The light intensity measuring device 60 starts measuring the light intensity and outputs the measured value to the controller 100.
[0028]
Since the irradiation light La is shielded by the shutter 30 in the state before the measurement, the light intensity measuring device 60 measures only the background light caused by the illumination light, and the measured intensity change of the background light is output to the controller 100. The period calculator 110 calculates the intensity change period value S. The calculated value S of the period of intensity change of the background light is multiplied by an integer value already selected by the measurement interval calculator 120 and stored in the measurement interval calculator 120 to obtain a calculated value of the measurement time interval. It is output to the timing controller 130 as TK. The timing controller 130 stores the calculated value as the value TK of the time interval between irradiation measurement and non-irradiation measurement, and the setting of the measurement time interval is completed. In this embodiment, the integer value already selected and stored in the measurement interval calculator 120 is 2, and the time interval value TK is twice the period value S.
[0029]
Next, the effects of irradiation measurement and non-irradiation measurement will be described.
[0030]
The timing controller 130 is a diagram based on the time interval value TK of irradiation measurement and non-irradiation measurement input from the measurement interval calculator 120 and the value TS of each time spent for irradiation measurement and non-irradiation measurement stored in advance. Signals for starting and ending irradiation measurement and non-irradiation measurement are output to the spectrometer 50, the multi-channel analyzer 140, and the shutter 30 at the timing shown in the timing chart 2 to measure the spectrum.
[0031]
That is, when irradiation measurement is started at time t1, the shutter 30 is opened, the excitation light La is irradiated on the sample 10, and fluorescence is emitted from the sample by irradiation of the excitation light La. The spectrophotometer 50 starts measurement, and the background light transmitted through the condensing optical system 40 and the fluorescence emitted from the sample 10 are dispersed by the spectroscopic unit 51, and the intensity of the spectrum of the light separated by the photometric unit 52 is determined. Measured. Irradiation measurement ends at time t2 after the elapse of time TS from the start of irradiation measurement, the spectrophotometer 50 stops the measurement while holding the measured value of the measured spectrum, the shutter 30 is closed, and the sample of the excitation light La Irradiation to 10 is also stopped. The spectrum measurement value in the irradiation measurement corresponding to the sum of the background light HA and the fluorescence KA, which is the measurement value held in the spectrometer 50, is output to the multichannel analyzer 140 and stored at time t3.
[0032]
Here, the reflected light of the excitation light La irradiated on the sample 10 is incident on the condensing optical system 40 together with the fluorescence emitted from the sample 10, but the wavelength of the fluorescence is longer than the wavelength of the excitation light. The excitation light is removed by the wavelength transmission filter 41.
[0033]
Next, when non-irradiation measurement is started at time t4 when two times as an integral multiple of the period value S of the intensity change of the background light has elapsed from the time t1 when irradiation measurement starts, the shutter 30 remains closed and the spectroscopic measurement is performed. The instrument 50 starts the measurement. However, since the sample 10 is not irradiated with the excitation light La, the intensity of the fluorescent KB becomes zero and the spectrum of only the background light HB is measured. The measurement ends at time t6 after the elapse of time TS from the start of the irradiation measurement, the shutter 30 continues to be closed, and the spectrometer 50 stops the measurement while holding the spectrum measurement value. The value of the spectral intensity distribution of the background light corresponding to the measured value of the background light HB held in the spectrometer 50 is output and stored in the multichannel analyzer 140 at the time t7 as in the case of the irradiation measurement.
[0034]
Next, the operation of the calculation and display of the spectral intensity distribution will be described.
[0035]
The value of the spectral intensity distribution obtained by the irradiation measurement stored in the multichannel analyzer 140 and the value of the spectral intensity distribution obtained by the non-irradiation measurement are divided by the multichannel analyzer 140 to obtain the value of the fluorescence spectrum intensity distribution. .
[0036]
Here, Fig. 3a (spectrum intensity distribution obtained by irradiation measurement) Fig. 3b (spectral intensity distribution obtained by non-irradiation measurement) Fig. 3c (obtained by non-irradiation measurement from spectrum intensity distribution obtained by irradiation measurement) The spectral intensity distribution SHA (FIG. 3a) of the background light included in the measurement value of the irradiation measurement obtained by the measurement and the spectral intensity distribution of the background light which is the measurement value of the non-irradiation measurement as shown in FIG. Since the same phase region is measured from a phase having a constant period to a certain phase, although the measured time is different from the value SHB (FIG. 3b), the spectral intensity distribution is also the same.
[0037]
Therefore, the value of the spectral intensity distribution of the background light, which is the measurement value in the non-irradiation measurement, from the sum (FIG. 3a) of the spectral intensity distribution value SHA of the background light, which is the measurement value in the irradiation measurement, and the spectral intensity distribution value SKA of the fluorescence. By subtracting SHB (FIG. 3b), the value SKA (FIG. 3c) of the fluorescence spectral intensity distribution from which the spectral components of the background light have been removed can be obtained.
[0038]
The value of the spectral intensity distribution SKA of fluorescence obtained as described above is displayed as an image by the display 150.
[0039]
As shown in FIG. 2, even if the background light is a sum of a constant steady component e and a periodic component f, or even if it consists only of the periodic component f or the steady component e, the spectral component of the background light is obtained by the above calculation. It is clear from the above explanation that the value of the fluorescence spectrum intensity distribution from which the light is removed can be obtained.
[0040]
Further, in the irradiation measurement and the non-irradiation measurement, the opening time of the shutter 30, that is, the irradiation time of the excitation light La on the sample 10 can be measured in a range different from the measurement time range of the spectrometer 50, Excitation light may be irradiated in pulses, or the intensity of excitation light may be changed during irradiation.
[0041]
Further, the measurement order may be non-irradiation measurement after irradiation measurement or irradiation measurement after non-irradiation measurement.
Further, if the period of disturbance light is known in advance, it is not always necessary to measure the period of the background light. The period calculator 110 stores a known background light period value, and measurement is performed using that value. It can also be done.
Further, the integer value already selected and stored in the measurement interval calculator 120 is set to 2, but other values may be used as long as they are integers.
Further, it is not necessary to synchronize with the intensity change of the irradiation measurement and non-irradiation measurement background light, but it does not exclude the synchronization.
[0042]
In the above embodiment, the present invention is applied to the fluorescence spectrum measurement. However, the transmission filter characteristic of the condensing optical system 40, the wavelength characteristic of the lamp of the light source 20, the band filter characteristic, the irradiation measurement, and By changing the measurement time and measurement time interval of non-irradiation measurement, the present invention can be applied not only to fluorescence spectrum measurement but also to phosphorescence spectrum measurement, absorption spectrum measurement, and polarization spectrum measurement.
[0043]
As described above, according to the spectrum measuring apparatus of the present embodiment of the present invention, in an environment where there is background light including the same wavelength region as light emitted from a sample, reflected by the sample, or transmitted through the sample. Even if it exists, a spectrum can be measured with high precision.
[0044]
Next, an apparatus for measuring a fluorescence spectrum intensity distribution, which is a second embodiment of a spectrum measuring apparatus that performs the spectrum measuring method of the present invention, will be described with reference to FIGS. In FIG. 4, elements that are the same as those in FIG. 1 showing the outline of the first embodiment are given the same reference numerals, and descriptions thereof are omitted unless particularly necessary.
[0045]
FIG. 4 is a diagram showing an outline of an apparatus for measuring a fluorescence spectrum to which a spectrum measuring apparatus for performing a spectrum measuring method according to the present invention is applied.
[0046]
The controller 200 of the spectrum measuring apparatus according to the second embodiment of the present invention inputs a measurement value of the intensity change of the background light from the light intensity measuring device 60, calculates the period of the intensity change, and outputs the value. 110 and a measurement time calculator 220 that multiplies the value of the period of intensity change of the background light input from the period calculator 110 and the integer value selected and stored therein and outputs the result as the value of the measurement time interval. In addition, based on the measurement time value input from the measurement time calculator 120 and the value of the measurement time interval stored in advance, the spectrophotometer 50, the multichannel analyzer 140, and the shutter 30 are subjected to irradiation measurement and non-irradiation measurement. A timing control that outputs the start and end signals and controls the timing of irradiation measurement in which measurement is performed by irradiating the sample 10 with the excitation light La and non-irradiation measurement in which measurement is performed without irradiating the sample 10 with the excitation light La. According to the timing control signal of the controller 230 and the timing controller 230, the spectral intensity distribution value obtained by the irradiation measurement and the spectral intensity distribution value obtained by the non-irradiation measurement are inputted and stored, and the spectral intensity of the irradiation measurement is stored. A multi-channel analyzer 140 that subtracts the value of the spectral intensity distribution of the non-irradiation measurement from the distribution value and outputs the result, and a display 150 that displays the calculation result of the spectral intensity distribution input from the multi-channel analyzer 140; Consists of
[0047]
The other configurations are the same as those of the first embodiment, and the spectrum measurement apparatus of the second embodiment is configured such that the configurations and operations of the measurement time calculator 220 and the timing controller 230 of the controller 200 are the spectrum measurement of the first embodiment. It is different from the device.
[0048]
Hereinafter, an operation when the spectrum measuring apparatus of the second embodiment is applied to fluorescence measurement will be described.
[0049]
First, the effect | action of the measurement time setting of this spectrum measuring device is demonstrated.
[0050]
In the state before the measurement by the spectrum measuring apparatus, the mercury lamp 21 of the light source 20 is lit, and the light passes through the band filter 22 and is emitted as the excitation light La of the bright line spectrum of the h-line having the center wavelength of 405 nm. Since the shutter 30 is closed, the sample 10 is not irradiated with the excitation light La. The light intensity measuring device 60 starts measuring the light intensity and outputs the measured value to the controller 200.
[0051]
In the state before the measurement, since the irradiation light La is shielded by the shutter 30, only the background light caused by the illumination light is measured by the light intensity measuring device 60, and the measured intensity change of the background light is output to the controller 200. Then, the period calculator 110 calculates the period value SS of the intensity change. The calculated value SS of the period of intensity change of the background light is multiplied by the integer value already selected by the measurement time calculator 220 and stored in the measurement time calculator 220, and the calculated value TSS of the measurement time. Is output to the timing controller 230. The timing controller 230 stores the calculated value as a value TSS of time spent for irradiation measurement and non-irradiation measurement, and the setting of the measurement time is completed. In the second embodiment, the integer value already selected and stored in the measurement time calculator 220 is 2, and the time value TSS spent for measurement is twice the cycle value SS. .
[0052]
Next, the effects of irradiation measurement and non-irradiation measurement will be described.
[0053]
The timing controller 230 determines the timing of FIG. 5 based on the measurement time value TSS input from the measurement time calculator 220 and the time interval value TKK from the end of irradiation measurement to the start of non-irradiation measurement stored in advance. At the timing shown in the chart, the start and end signals of irradiation measurement and non-irradiation measurement are output to the spectrometer 50, the multichannel analyzer 140, and the shutter 30, and the spectrum is measured.
[0054]
That is, when irradiation measurement is started at time t1, the shutter 30 is opened, the excitation light La is irradiated on the sample 10, and fluorescence is emitted from the sample by irradiation of the excitation light La. The spectrophotometer 50 starts measurement, and the background light transmitted through the condensing optical system 40 and the fluorescence emitted from the sample 10 are spectrally separated by the spectroscopic unit 51, and the intensity of the spectrum of the spectroscopic fluorescent light is measured by the photometric unit 52. . The irradiation measurement is completed at time t2 when the time of TSS, which is an integral multiple of the period SS of the intensity change of the background light, has elapsed from the time t1 when the irradiation measurement is started, and the spectrophotometer 50 measures the measured spectrum. The measurement is stopped while holding the shutter, the shutter 30 is closed, and the irradiation of the excitation light La on the sample 10 is also stopped. The spectrum value of the irradiation measurement corresponding to the sum of the background light HAA and the fluorescence KAA, which is the measurement value held in the spectrometer 50, is output and stored in the multichannel analyzer 140 at time t3.
Here, the reflected light of the excitation light La irradiated on the sample 10 is incident on the condensing optical system 40 together with the fluorescence emitted from the sample 10, but the wavelength of the fluorescence is longer than the wavelength of the excitation light. Excitation light is removed by the transmission filter 41.
[0055]
Next, when the non-irradiation measurement is started at the time t4 when the time TKK has passed from the time t2 when the irradiation measurement ends, the spectrophotometer 50 starts the measurement while the shutter 30 is closed, but the sample 10 is excited. Since the light La is not irradiated, the intensity of the fluorescent KBB becomes zero, and the spectrum of only the background light HBB is measured. When the measurement is finished at time t6 after TSS time from the start of the irradiation measurement, the shutter 30 is kept closed, and the spectrophotometer 50 stops the measurement while holding the measured value of the spectrum. The value of the spectral intensity distribution of the background light corresponding to the background light HBB held in the spectrometer 50 is output to the multichannel analyzer 140 and stored at time t7.
[0056]
Next, the operation of the calculation and display of the spectral intensity distribution will be described.
[0057]
The value of the spectral intensity distribution obtained by the irradiation measurement stored in the multichannel analyzer 140 and the value of the spectral intensity distribution obtained by the non-irradiation measurement are divided by the multichannel analyzer 140 to obtain the value of the fluorescence spectrum intensity distribution. .
[0058]
The spectral intensity distribution of the background light included in the irradiation measurement obtained in the above measurement and the spectral intensity distribution of the background light in the non-irradiation measurement are measured at an area that is an integral multiple of the background light at different measurement times. In other words, the background light HAA and HBB shown in FIG. 5 can be regarded as including exactly the same spectrum and its intensity change, so that the measured spectrum intensity distribution is also the same.
[0059]
Accordingly, as in the first embodiment, the multi-channel analyzer 140 subtracts the spectral intensity distribution value obtained by non-irradiation measurement from the spectral intensity distribution value obtained by irradiation measurement to obtain the spectral component of the background light. The value of the spectral intensity distribution of the removed fluorescence can be obtained.
[0060]
The value of the fluorescence spectrum intensity distribution obtained by the multichannel analyzer 140 is output to the display 150 and displayed as an image.
[0061]
As shown in FIG. 5, even if the background light is a sum of a constant steady component ee and a periodic component ff, or it consists only of the periodic component ff or the steady component ee, the spectral component of the background light is calculated by the above calculation. It is clear from the above explanation that the value of the fluorescence spectrum intensity distribution from which the light is removed can be obtained.
[0062]
Further, in the irradiation measurement and the non-irradiation measurement, the opening time of the shutter 30, that is, the irradiation time of the excitation light La on the sample 10 can be measured in a range different from the measurement time range of the spectrometer 50, Excitation light may be irradiated in pulses, or the intensity of excitation light may be changed during irradiation.
[0063]
Further, the measurement order may be non-irradiation measurement after irradiation measurement or irradiation measurement after non-irradiation measurement.
[0064]
Further, if the period of disturbance light is known in advance, it is not always necessary to measure the period of the background light. The period calculator 110 stores a known background light period value and uses that value. Measurements can also be made.
In addition, the integer value already selected and stored in the measurement time calculator 220 is set to 2, but any other value can be used as long as it is an integer.
Further, it is not necessary to synchronize with the intensity change of the irradiation measurement and non-irradiation measurement background light, but it does not exclude the synchronization.
[0065]
Further, although the embodiment according to the above description has been described for the case where the present invention is applied to fluorescence spectrum measurement, the spectral characteristics of the spectrometer 50, the transmission filter characteristics of the condensing optical system 40, the wavelength characteristics of the lamp of the light source 20, and By changing the characteristics of the bandpass filter, the measurement time and measurement time interval of irradiation measurement and non-irradiation measurement, it is reflected not only in the spectrum measurement of fluorescence emitted from the sample but also by Raman light or phosphorescence emitted from the sample or reflected by the sample. Thus, the spectrum and intensity of the light that is polarized, absorbed or attenuated can be measured.
[0066]
Further, by arranging the light source 20 and the shutter 30 on the opposite side of the light collecting optical system 40 with the sample 10 interposed therebetween, the light emitted from the light source is irradiated onto the sample, and the light transmitted through the sample is irradiated with the light collecting optical system 40. In the same manner as described above, it is possible to measure the spectrum and intensity of fluorescence, Raman light, phosphorescence, or light that is polarized, absorbed, or attenuated by passing through the sample.
[0067]
In addition, the condensing optical system 40 is an imaging optical system, the spectrophotometer 50 is an imaging unit, the spectroscopic unit 51 is an imaging device using a CCD or the like, the photometry unit 52 is an imaging driver, and the multichannel analyzer 140 is an image. By changing to the processing unit, the intensity distribution on the sample surface of the light to be measured (fluorescence, Raman light or phosphorescence emitted from the sample 10, or light polarized, absorbed or attenuated by the sample) is imaged by the imaging optical system. The light intensity that is imaged above and detected by each pixel on the imaging device is converted into an image signal by the imaging driver and output to the image processing unit. This image signal is input into the image processing unit that has received the image signal. Remember. Here, as described above, when the sample is irradiated with light according to the measurement timing output from the timing controller and when the sample is not irradiated with light, the image signal measured and converted is measured and converted. The intensity of the measurement target light (fluorescence, Raman light or phosphorescence emitted from the sample, or light that is polarized, absorbed, or attenuated by the sample) by performing an operation of outputting to the image processing unit and subtracting two image signals in the image unit Can be measured as an image (surface information) in the same manner as described above.
[0068]
As described above, according to the optical measurement method and the optical measurement device of the present invention, in an environment where there is background light including the same wavelength region as the light emitted from the sample, the light reflected by the sample, or the light transmitted through the sample. Even if it exists, a spectrum and intensity | strength or its image (surface information) can be measured with high precision.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram in which an optical measurement device of the present invention is applied to measurement of a fluorescence spectrum.
FIG. 2 is a timing chart of spectrum measurement.
FIG. 3 is a diagram for explaining the principle of calculation by subtracting the value of the spectrum intensity distribution obtained by non-irradiation measurement from the value of the spectrum intensity distribution obtained by irradiation measurement.
FIG. 4 is a schematic configuration diagram of a second embodiment in which the optical measurement device of the present invention is applied to fluorescence spectrum measurement.
FIG. 5 is a timing chart of spectrum measurement according to the second embodiment.
[Explanation of symbols]
10 samples
20 Light source
21 Mercury lamp
22 Bandpass filter
30 Shutter
40 Condensing optical system
41 Long wavelength transmission filter
50 Spectrometer
51 Spectrometer
52 Metering unit
60 Light intensity measuring instrument
100 controller
110 Period calculator
120 Measurement interval calculator
130 Timing Controller
140 Multi-channel analyzer
200 controller
220 Measuring time calculator
230 Timing Controller
La excitation light
Fluorescence in KA irradiation measurement
Fluorescence in KB non-irradiation measurement
Background light in HA irradiation measurement
Background light in HB non-irradiation measurement
S Period of intensity change of background light
Value of time spent for TS irradiation measurement and non-irradiation measurement
TK Value of time interval from irradiation measurement start to non-irradiation measurement start
Fluorescence spectral intensity distribution in SKA irradiation measurement
Spectral intensity distribution of background light in SHA irradiation measurement
Spectral intensity distribution of background light in SHB non-irradiation measurement
f Periodic component of background light
e Steady state component of background light
Fluorescence in KAA irradiation measurement
KBB Fluorescence in non-irradiation measurement
Background light in HAA irradiation measurement
Background light in HBB non-irradiation measurement
SS Background light intensity change period
TSS Value of time spent for irradiation measurement and non-irradiation measurement
Value of time interval from the end of TKK irradiation measurement to the start of non-irradiation measurement
ff Periodic component of background light
ee Stationary component of background light

Claims

In an optical measurement method for measuring light emitted from a sample, reflected by the sample, or transmitted through the sample by irradiating the sample with light in the presence of background light,
The first measurement for performing the measurement when the sample is irradiated with light and the second measurement for performing the measurement when the sample is not irradiated with light are performed according to the period of intensity change of the background light. Measure the light from which the background light has been removed by subtracting the value measured by the second measurement from the value measured by the first measurement over the same measurement time at integer time intervals. An optical measurement method characterized by

In an optical measurement method for measuring light emitted from a sample, reflected by the sample, or transmitted through the sample by irradiating the sample with light in the presence of background light,
A first measurement for performing the measurement when the sample is irradiated with light and a second measurement for performing the measurement when the sample is not irradiated with light, respectively, a period of intensity change of the background light And measuring the light from which the background light has been removed by subtracting the value measured by the second measurement from the value measured by the first measurement. Measurement method.

The optical measurement method according to claim 1, wherein a period of intensity change of the background light is obtained by measuring the intensity of the background light.

An optical measurement device comprising: means for irradiating light to a sample; and means for measuring light emitted from the sample, light reflected by the sample, or light transmitted through the sample,
A first measuring means for performing the measurement when the sample is irradiated with light; a second measuring means for performing the measurement when the sample is not irradiated with light; and the first measurement; Control means for controlling the timing of the measurement means so that the measurement interval of the second measurement is performed over the same measurement time at a time interval that is an integral multiple of the period of intensity change of the background light; and by the first measurement An optical measurement apparatus comprising: an arithmetic unit that obtains light from which background light has been removed by subtracting a value measured by the second measurement from the measured value.

An optical measurement device comprising: means for irradiating light to a sample; and means for measuring light emitted from the sample, light reflected by the sample, or light transmitted through the sample,
A first measuring means for performing the measurement when the sample is irradiated with light; a second measuring means for performing the measurement when the sample is not irradiated with light; and the first measuring time. And control means for controlling the timing of the measuring means so as to perform the second measurement time over a time that is an integral multiple of the period of intensity change of the background light, and from the value measured by the first measurement. An optical measurement apparatus comprising: an arithmetic unit that obtains light from which background light has been removed by subtracting a value measured by the second measurement.

6. The optical measuring device according to claim 4, further comprising means for determining a period of intensity change of the background light by measuring the intensity of the background light.