JP3737518B2

JP3737518B2 - Water-soluble paclitaxel prodrug

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Publication number: JP3737518B2
Application number: JP53273497A
Authority: JP
Inventors: リー，チュン; ウォーレス，シドニー; ユー，ドング―ファング; ヤング，デーヴィッド・ジェイ
Original assignee: PG TXL Co LP
Current assignee: PG TXL Co LP
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 2006-01-18
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: CN101028259A; NO984210L; AU2580697A; EP1683520B1; EP0932399A4; ES2258790T3; EA199800817A1; CN1217662A; EP0932399A1; CZ297979B6; DE69735057D1; NO324461B1; CN1304058C; KR20000067033A; CA2250295C; NO20072562L; KR100561788B1; HUP9903952A3; US5977163A; ATE314843T1

Abstract

Disclosed are water soluble compositions of paclitaxel and docetaxel formed by conjugating the paclitaxel or docetaxel to a water soluble chelator, polyethylene glycol or polymer such as poly (1-glutamic acid) or poly (1-aspartic acid). Also disclosed are methods of using the compositions for treatment of tumors, autoimmune disorders such as rheumatoid arthritis and for prediction of paclitaxel uptake by tumors and radiolabeled DTPA-paclitaxel tumor imaging. Other embodiments include the coating of implantable stents for prevention of restenosis.

Description

発明の分野
本発明は一般に、癌、自己免疫疾患および再狭窄の処置に使用する薬剤組成物の分野に関する。本発明はまた、抗癌薬、たとえばパクリタキセル（paclitaxel）（タキソール（Taxol））およびドセタキセル（docetaxel）（タキソテレ（taxotere））の製剤の分野、特にパクリタキセルを水溶性部分に結合させることにより、この薬物を水溶性にすることに関する。
発明の背景
太平洋岸産イチイ（タキサス・ブレビフォリア、Taxus brevifolia）の針葉および樹皮から抽出した微小管形成抑制剤（anti-microtubule agent）であるパクリタキセルは、ヒトの癌に顕著な抗腫瘍効果をもつことがＩ相実験ならびに初期IIおよびIII相試験で示された（Horwitz et al.,1993）。これは主に、進行した卵巣癌および胸部癌において報告された。小細胞性肺癌（small-cell lung cancer）および非小細胞性肺癌、頭頚部癌、ならびに転移性黒色腫において、有意の活性が述べられている。しかし、臨床試験用パクリタキセルを開発する際の主な難点は、それが水に不溶性である点であった。
ドセタキセルは、１０−デアセチルバッカチンIII、すなわちタキサス・バッカタ（Taxus baccata）の針葉から抽出し、化学合成した側鎖でエステル化した非細胞毒性前駆物質から、半合成により製造される（Cortes and Pazdur,1995）。胸部癌、肺癌、卵巣癌、ならびに結腸直腸癌および黒色腫を含めた種々の癌細胞系が、ドセタキセルに反応性であることが示された。臨床試験において、ドセタキセルを用いて胸部癌、卵巣癌、頭頚部癌、および悪性黒色腫において完全または部分的な反応が達成された。
パクリタキセルは一般に、クレモフォア（Cremophor）ＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）および脱水アルコール（５０％ｖ／ｖ）１ｍｌ当たり６ｍｇのパクリタキセルを含有する濃縮液として配合され、投与前にさらに希釈されなければならない（Goldspiel,1994）。要求量のパクリタキセルを送達するのに必要なクレモフォアＥＬの量は、クレモフォア中に配合される他のいかなる薬物の場合より著しく高い。血管拡張、呼吸困難および血圧低下を含めた幾つかの毒性が、クレモフォアに起因するとされている。このビヒクルは、実験動物およびヒトに重篤な過敏症を起すことも示された（Weiss et al.,1990）。事実、静脈内ボーラス注射によりマウスに投与できるパクリタキセルの最大量は、クレモフォアビヒクルの急性致死毒性により決定される（Eiseman et al.,1994）。さらに、界面活性剤であるクレモフォアＥＬは、ポリ塩化ビニル製のバッグや静脈投与管からフタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）などのフタレート系可塑剤を滲出させることが知られている。ＤＥＨＰは動物に肝毒性を生じ、げっ歯類において発癌性であることが知られている。このパクリタキセル製剤は、経時的に粒状物を生成することも示されており、したがって投与中にろ過する必要がある（Goldspiel,1994）。したがって患者への安全な薬物送達を保証するためには、パクリタキセル溶液の調製および投与に特別な設備が必要であり、これらの設備は必然的に経費を増大させる。
水溶性パクリタキセルを得るためのこれまでの試みには、２′−ヒドロキシル基または７−ヒドロキシルの位置にスクシネートおよびアミノ酸などの可溶化部分を装入することによりパクリタキセルのプロドラッグを調製することが含まれる（Deutsch et al.,1989;Mathew et al.,1992）。しかしこれらのプロドラッグは、開発に十分なほど化学的に安定ではないことが分かった。たとえばDeutschら（1989）はパクリタキセルの２′−スクシネート誘導体を報告しているが、ナトリウム塩の水溶解度はわずか約０．１％であり、トリエタノールアミン塩およびＮ−メチルグルカミン塩は約１％が溶解しうるにすぎなかった。さらに、アミノ酸エステルは不安定であると報告された。同様な結果をMathewら（1992）が報告した。Greenwaltらは、水溶性の高いタキソール２′および７−ポリエチレングリコールエステルの合成を報告している。（Greenwalt et al.,1994）が、これらの化合物のインビボ抗腫瘍活性に関するデータは全く報告されていない（Greenwalt et al.,1995）。
これらの問題を解決するための他の試みは、パクリタキセルをリポソームおよびナノスフェアの両方にマイクロカプセル封入することを伴うものであった（Bartoni and Boitard,1990）。リポソーム配合物は遊離パクリタキセルと同程度に有効であると報告されたが、２％未満のパクリタキセルを含有するリポソーム配合物のみが物理的に安定であった（Sharma and Staubinger,1994）。残念ながら、ナノスフェア配合物は毒性を示すことが分かった。したがって、有効量のパクリタキセルおよびドセタキセルを、薬物の不溶性に伴う欠点なしに送達しうる水溶性パクリタキセル配合物が、依然として求められている。
パクリタキセルの広範な使用に対する他の障害は、パクリタキセルを生産する供給源が限られており、その結果パクリタキセル療法が高価になることである。たとえば１コースの処置に数千ドルかかる可能性がある。さらに、必ずしもすべての腫瘍がパクリタキセル療法に反応するわけではないという欠点があり、これはパクリタキセルが腫瘍内へ進入しないためであると思われる。したがって、腫瘍、自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチの処置のための、ならびに血管形成術およびステント挿入（stenting）などの外傷を受ける血管の再狭窄防止のための、血清中半減期の長い水溶性パクリタキセルおよび関連薬物の有効な配合物が早急に求められている。
発明の概要
本発明は、水溶性ポリマー、たとえばポリグルタミン酸もしくはポリアスパラギン酸に、または水溶性の金属キレート剤に結合した、化学療法薬および抗血管形成薬(antiangiogenic drug）、たとえばパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物の提供により、従来の技術がもつこれらの欠点や他の欠点を克服することを目的とする。これらの組成物は、例示した腫瘍モデルに対し抗腫瘍剤として予想外に有効であることが本明細書において示され、タキサン（taxane）類またはタキソイド(taxoid）類が有効であることが知られているいかなる疾患や状態に対しても、パクリタキセルまたはドセタキセルと少なくとも同程度に有効であると期待される。本発明の組成物は、水溶性タキソイド類を提供してこれらの薬物自体の水不溶性に伴う欠点を克服し、かつ制御放出という利点を備え、このため動物モデルにおいて１回の静脈内投与後に腫瘍が根絶されることが本明細書において示される。
本明細書に記載した方法は、他の療法薬、造影剤および薬物の水溶性ポリマー結合体の製造にも利用できる。これには、エトプシド（etopside）、テニポシド（teniposide）、フルダラビン（fludarabine）、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エモジン、５−フルオロウラシル、ＦＵＤＲ、エストラジオール、カンプトテシン（camptothecin）、レチノイン酸、ベラパミル（verapamil）、エポチロン（epothilone）類およびサイクロスポリンが含まれる。特に、遊離ヒドロキシル基をもつ薬剤を、パクリタキセルに関して本明細書に記載したものと同様な化学反応でポリマーに結合させることができるであろう。このような結合は化学技術の当業者が容易になしうるものであり、本発明の範囲に含まれる。それらの薬剤にはエトプシド、テニポシド、カンプトテシンおよびエポチロン類が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において用いる、水溶性ポリマーへの結合とは、ポリマーまたはキレート剤への薬物の共有結合を意味する。
また本発明の水溶性結合体は、他の抗腫瘍薬または抗癌薬を含めた他の薬物と組み合わせて投与しうると解釈される。そのような組み合わせは当技術分野で知られている。本発明の水溶性パクリタキセルまたはドセタキセルは、特定の種類の処置においては白金系薬物、抗生物質、たとえばドキソルビシンもしくはダウノルビシン、またはタキソールと併用される他の薬物と組み合わせることができる。
ポリマーへの化学療法薬の結合は、全身毒性を低下させ、治療指数を改善するための魅力的方法である。３０ｋＤａより大きな分子量をもつポリマーは、正常な毛細血管および糸球体内皮を通して容易に拡散することはなく、したがって正常な組織を、薬物が仲介する無関係な毒性から免れさせる（Maeda and Matsumura,1989;Reynolds,1995）。他方、悪性腫瘍がしばしば毛細血管内皮障害を伴い、正常組織の血管より高い透過性を示すことは、十分に確認されている（Maeda and Matsumura,1989;Fidler et al.,1987）。したがって、正常な状態では血管内に留まるポリマー−薬物結合体が血管から腫瘍中へ選択的に漏出し、その結果、有効な療法薬を腫瘍に蓄積させることができる。さらに、ポリマー−薬物結合体は持続放出のための薬物溜めとして作用し、腫瘍細胞を長期間薬物暴露させることができる。最後に、水溶性ポリマーは、他の場合には不溶性である成分を可溶化するほか、薬物を安定化するためにも利用できる。現在、多様な合成ポリマーおよび天然ポリマーにつき、それらが腫瘍特異性薬物送達を高める効力が試験されている（Kopecek,1990;Maeda and Matsumura,1989）。しかし、日本のＳＭＡＮＣＳおよび英国のＨＰＭＡ−Ｄｏｘを含めた数種類につき現在臨床評価が行われているにすぎない（Maeda,1991;Kopecek and Kopeckova,1993）。
本明細書においてタキソイドは、パクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにタキセン骨格をもつ他の化学物質を含めた化合物を意味すると解釈され（Cortes and Pazdur,1995）、イチイの木などの天然源もしくは細胞培養物から単離でき、または化学合成した分子であってもよい。好ましいものは一般式Ｃ₄₇Ｈ₅₁ＮＯ₁₄の化合物であり、これには［２ａＲ−［２ａα，４β，４αβ，６β，９α(αＲ*，βＳ*)，１１α，１２α，１２ａα，１２ｂα］］−β−（ベンゾイルアミノ）−α−ヒドロキシベンゼンプロパン酸６，１２ｂ−ビス（アセチルオキシ）−１２−（ベンゾイルオキシ）−２ａ，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１１，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４，１１−ジヒドロキシ−４ａ，８，１３，１３−テトラメチル−５−オキソ−７，１１−メタノ−１Ｈ−シクロデカ［３，４］ベンズ［１，２−ｂ］オキシエト−９−イルエステルが含まれる。パクリタキセルおよびドセタキセルはそれぞれ特定のタイプの腫瘍に対し他の薬剤より有効であり、また本発明の実施に際しては、特定のタキソイドに対しより感受性である腫瘍がこの水溶性タキソイド結合体で処置されると解釈される。
パクリタキセルを水溶性の金属キレート剤に結合させる態様においては、組成物はキレートした金属イオンをさらに含むであろう。本発明のキレートした金属イオンは、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ガリウム、ゲルマニウム、ホルミウム、インジウム、イリジウム、鉄、マグネシウム、マンガン、ニッケル、白金、レニウム、ルビジウム、ルテニウム、サマリウム、ナトリウム、テクネチウム、タリウム、スズ、イットリウムまたは亜鉛のうちいずれかのイオン形であってもよい。特定の好ましい態様においては、キレートした金属イオンは上記に挙げた金属のうちいずれかの放射性核種、すなわち放射性同位体であろう。好ましい放射性核種には⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、¹¹¹Ｉｎ、^99mＴｃ、⁹⁹Ｙ、^114mＩｎ、および^193mＰｔが含まれるが、これらに限定されない。
本発明を実施する際に用いられる好ましい水溶性キレート剤には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−テトラアセテート（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシエチリデンジホスホネート（ＨＥＤＰ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミンテトラメチレンホスホン酸（ＤＴＴＰ）、および１−（ｐ−アミノベンジル）−ＤＴＰＡ、１，６−ジアミノヘキサン−Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ′″−四酢酸、ＤＰＤＰ、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸。ＤＴＰＡが最も好ましい。本発明の好ましい態様は、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを含む組成物でもありうる。
本発明の特定の態様においては、パクリタキセルまたはドセタキセルを水溶性ポリマーに結合させ、好ましくはポリマーはパクリタキセルまたはドセタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合する。したがって前記のように、薬物とパクリタキセルのＣ２′−ヒドロキシルとの結合のために官能基を用いる場合、有効薬物がポリマー性キャリヤーから確実に放出されるように、分解性結合（この場合はエステル）を用いる。好ましいポリマーには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリエチレングリコール、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｄｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）、ポリエチレングリコール、上記に挙げたポリアミノ酸とポリエチレングリコールのコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸およびポリ酢酸、ならびにポリアクリル酸、ポリ（２−ヒドロキシエチル−１−グルタミン）、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸、ヒト血清アルブミン、およびアルギン酸。ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸類およびポリグルタミン酸類が特に好ましい。本発明のポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類は、好ましくは約５，０００〜約１００，０００の分子量をもち、約２０，０００〜約８０，０００、さらに約３０，０００〜約６０，０００がより好ましい。
本発明の組成物を下記の薬剤学的に許容できるキャリヤー溶液に分散させてもよいと解釈される。そのような溶液は滅菌され、または無菌であり、水、緩衝剤、等張化剤、そのほか、対象動物またはヒトに投与した際にアレルギー反応その他の有害な反応を起さない。当業者に既知の成分を含むことができる。したがって本発明は、高分子量水溶性ポリマーまたはキレート剤に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬または抗癌薬を含む薬剤組成物であると記載することもできる。この薬剤組成物は、ポリエチレングリコール、ポリグルタミン酸類、ポリアスパラギン酸類、またはキレート剤、好ましくはＤＴＰＡを含有することができる。抗腫瘍薬または薬物として放射性核種を使用でき、また本発明の薬剤組成物は療法に有効な量のキレートした放射性同位体を含有してもよいと解釈される。
特定の態様においては、本発明は腫瘍組織によるパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬の取込みを測定する方法であると記載することができる。この方法は、キレートした金属イオンを含む、薬物と金属キレート剤の結合体を調製し、腫瘍組織をこの組成物と接触させ、腫瘍組織中のキレートした金属イオン存在を測定することを含みうる。腫瘍組織中にキレートした金属イオンが存在することは、その腫瘍組織が取り込んだことを示す。キレートした金属イオンは放射性核種であってもよく、検出がシンチグラフによるものであってもよい。腫瘍組織は対象動物またはヒトの体内にあってもよく、その場合組成物はその対象に投与される。
本発明は、特定の態様においては対象における癌を処置する方法であると記載することもできる。この方法は、水溶性ポリマーまたはキレート剤に結合させ、かつ薬剤学的に許容できる溶液に分散したパクリタキセルまたはドセタキセルなどの化学療法薬を含む組成物を調製し、この溶液を腫瘍の処置に有効な量で対象に投与することを含む。好ましい組成物は、ポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類、より好ましくはポリ（ｌ−グルタミン酸）またはポリ（ｌ−アスパラギン酸）に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む。本発明の組成物は、結合していないタキソイドが有効であることが示されているいかなるタイプの癌に対しても有効であると解釈される。これには胸部癌、卵巣癌、悪性黒色腫、肺癌、胃癌、結腸癌、頭頚部癌または白血病が含まれるが、これらに限定されない。
腫瘍の処置方法には、療法に有効な量の薬物またはプロドラッグを投与する前に、腫瘍へのパクリタキセルまたはドセタキセルの取込みをある程度推測することが含まれてもよい。この方法には、パクリタキセル−キレート剤−キレートした金属を対象に投与し、腫瘍中に検出する、前記の造影法がいずれも含まれる。この工程は、薬物が腫瘍に進入しない場合はその腫瘍はＤＴＰＡ−パクリタキセル療法に反応すると期待されないであろうということを判定する、経費的に有効な方法を提供する。造影法を利用してパクリタキセルに対する反応を推測し、反応しないと思われる患者を確認することができれば、その患者にとって多大な出費と重大な時間を節約できると考えられる。妥当な量の化学療法薬が腫瘍中に蓄積しなければ、その薬剤に対する腫瘍の反応は比較的小さいと予想される。
特定の態様において本発明は、対象の身体画像を得る方法であると記載できる。身体画像は、パクリタキセル−キレート剤結合体にキレートした有効量の放射性金属イオンを対象に投与し、放射性金属のシンチグラフ信号を測定して画像を得ることにより得られる。
特定の広義の態様において本発明は、全身性自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を軽減する方法であって、全身性自己免疫疾患を伴う対象に、ポリ−ｌ−グルタミン酸またはポリ−ｌ−アスパラギン酸に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む有効量の組成物を投与することを含む方法であると記載することもできる。本発明の開示に関して特に重要なものは、標準的クレモフォア配合物（米国特許第5,583,153号）で投与したときタキソールに反応することが若干の症例で知られている、慢性関節リウマチの処置である。腫瘍の処置と同様に、本発明の水溶性タキソイドの有効性は水溶性部分への結合によって低下することはなく、この水溶性プロドラッグは有効薬物を一定期間にわたって放出する制御放出配合物として作用しうると考えられる。したがって本発明の組成物は、たとえば慢性関節リウマチに対しタキソールと同程度に有効であると期待され、ただし制御放出という利点をもたらすであろう。また本発明のタキソイド組成物は、他の薬物、たとえば血管形成阻害薬（ＡＧＭ−１４７０）（Oliver et al.,1994）またはメトトレキセートと併用できると解釈される。
パクリタキセルがバルーン血管形成術後の再狭窄をも阻止するという知見は、本発明の水溶性パクリタキセルおよびドセタキセルが直接的な非経口投与より多様な用途をもつことを示す（国際特許出願公開第WO 9625176号）。たとえば、水溶性パクリタキセルは、植え込み型医療器具、たとえばチューブ、シャント、カテーテル、人工インプラント、ピン、電気的インプラント（たとえばペースメーカー）、特に動脈または静脈ステント（バルーン膨張式ステントを含む）のコーティングとして有用であろう。これらの態様においては、水溶性パクリタキセルを植え込み型医療器具に結合させてもよく、あるいは水溶性パクリタキセルを植え込み型器具の表面に受動的に付着させてもよい。たとえば、ステントをポリマー−薬物溶液に浸漬するか、またはステントにそのような溶液を吹き付けることにより、ステントをポリマー−薬物結合体でコーティングできる。植え込み型器具に適した材料は、生体適合性かつ無毒性でなければならず、ニッケル−チタン合金、鋼などの金属、または生体適合性ポリマー、ヒドロゲル、ポリウレタン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニルコポリマーなどから選択できる。好ましい態様においては、水溶性パクリタキセル、特にＰＧ−パクリタキセル結合体をバルーン血管形成術後の動脈または静脈に挿入するためのステントにコーティングする。したがって本発明は特定の広義の態様においては、血管外傷を受けた後の動脈再狭窄または動脈閉塞を阻止する方法であって、その必要がある対象に、ポリ−ｌ−グルタミン酸またはポリ−ｌ−アスパラギン酸に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物を投与することを含む方法であると記載することができる。本方法の実施に際し、対象はたとえば冠動脈バイパス形成術、血管外科処置、臓器移植、または冠動脈もしくは動脈形成術を受けた患者であり、前記組成物を直接に静脈内投与するか、またはステントにコーティングし、このステントを血管外傷部位に植え込むことができる。
したがって本発明の１態様は、平滑筋細胞の増殖を阻害するのに有効な量の、ポリグルタミン酸類またはポリアスパラギン酸類に結合したパクリタキセルまたはドセタキセルを含む組成物で器具をコーティングした、植え込み型医療器具である。好ましい器具は前記の本発明組成物でコーティングしたステントであり、特に好ましい態様においてステントはバルーン血管形成術後に使用するのに適したものであり、コーティングは再狭窄を阻止するのに有効である。
特定の好ましい態様において本発明は、パクリタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合したポリグルタミン酸類を含む組成物、あるいはパクリタキセルの２′もしくは７−ヒドロキシルまたは両方に結合したポリアスパラギン酸類を含む組成物であると記載することができる。本明細書において用いる“ポリグルタミン酸”または“ポリグルタミン酸類”という用語には、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）およびポリ（ｄｌ−グルタミン酸）が含まれ、“ポリアスパラギン酸”または“ポリアスパラギン酸類”という用語には、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）およびポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）が含まれる。
別途定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。本発明の実施または試験に際し本明細書に記載したものと類似または均等であるいかなる方法および材料をも使用できるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ．パクリタキセル、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルの化学構造。
図１Ｂ．ＰＧ−パクリタキセルの化学構造とその製造のための反応式。
図２．パクリタキセル、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルがＢ１６黒色腫細胞の増殖に及ぼす影響。
図３．ＤＴＰＡ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳房腫瘍に及ぼす抗腫瘍効果。
図４．パクリタキセル、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびＰＥＧ−パクリタキセルで処置した後に腫瘍直径１２ｍｍに達する中央時間（日）。
図５．¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよび¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡを静脈注射した後のＭＣａ−４腫瘍保有マウスのガンマ−シンチグラフ。矢印は腫瘍を示す。
図６．ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で測定したＰＧ−パクリタキセルの加水分解。−□−は可溶性ＰＧに結合して残存するパクリタキセルの％を表し、−△−は放出されたパクリタキセルの％を表し、−○−は生成した代謝産物−１の％を表す。
図７Ａ．ＰＧ−パクリタキセルがネズミ胸部腫瘍（１３７６２Ｆ）を保有するラットに及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＧ（０．３ｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はパクリタキセル（４０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｂ．ＰＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルがＯＣａ−１腫瘍を保有するマウスに及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＧ（０．８ｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はパクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−●−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル８０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｃ．ＰＧ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳癌腫を保有するマウスに及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、−△−はＰＧ（０．６ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−◆−はＰＧ−パクリタキセル（４０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−◇−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（１２０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｄ．ＰＧ−パクリタキセルがマウスの軟組織肉腫（ＦＳａ−ＩＩ）に及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、−◇−はＰＧ（０．８ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−○−はパクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、−△−はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図７Ｅ．ＰＧ−パクリタキセルがマウスの同系肝癌腫（ＨＣａ−１）に及ぼす抗腫瘍効果。−□−は食塩液１回静脈投与に対する反応を表し、--△--はＰＧ（０．８ｍｇ／ｋｇ）１回静脈投与に対する反応を表し、−○−はＰＧ−パクリタキセル（８０ｍｇ／ｋｇ）に対する反応を表し、・・△・・はＰＧ−パクリタキセル（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）に対する反応を表す。
図８．リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるＰＥＧ−パクリタキセルからのパクリタキセルの放出プロフィル。パクリタキセル，−Ｘ−；ＰＥＧ−パクリタキセル，−○−。
図９．ＰＥＧ−パクリタキセルがＭＣａ−４乳房腫瘍に及ぼす抗腫瘍効果。−□−はＰＥＧの食塩溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）１回静脈注射に対する反応を表し、−■−はクレモフォア／アルコールビヒクルに対する反応を表し、−○−は４０ｍｇ／ｋｇ（体重）のパクリタキセル１回投与を表し、−●−はパクリタキセル４０ｍｇ相当／ｋｇ（体重）のＰＥＧ−パクリタキセルを表す。
本発明は、パクリタキセルおよびドセタキセルの新規な水溶性配合物、ならびに腫瘍細胞に対するインビボでのこれらの配合物の意外な効果を見出したことに基づく。卵巣癌（ＯＣａ−Ｉ）を保有するマウスに投与したポリ（ｌ−グルタミン酸）結合−パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル）が、ＰＧを含まない同量のパクリタキセルと比較して有意に腫瘍の増殖を遅延させた。パクリタキセル単独、または遊離パクリタキセルとＰＧの組合わせは、最初は腫瘍の増殖遅延を示したが、１０日後には非処置対照群に匹敵する水準にまで腫瘍が再増殖した。さらに、ＰＧ−パクリタキセル結合体の最大耐容量（ＭＴＤ）（パクリタキセル１６０ｍｇ相当／ｋｇ）では、腫瘍の増殖は完全に抑制され、腫瘍が収縮し、処置後２カ月間観察したマウスが腫瘍のない状態を維持した（ＭＴＤ：１回静脈注射後２週間以内に生じた体重減少が１５％未満である最大用量と定義）。平行した試験で、ラット乳腺癌（１３７６２Ｆ）を伴うラットにおいてＰＧ−パクリタキセルの抗腫瘍活性を調べた。この場合も、パクリタキセル４０〜６０ｍｇ相当／ｋｇのＰＧ−パクリタキセルで完全な腫瘍根絶がみられた。これらの意外な結果は、ポリマー−薬物結合体であるＰＧ−パクリタキセルがマウスとラットの両方において１回静脈注射後に、十分に樹立した充実性腫瘍の根絶に成功したことを証明する。さらに、ｐＨ７．４で４０日の半減期をもつＰＧ−パクリタキセルは、知られているうちでは最も安定な水溶性パクリタキセル誘導体のひとつである（Deutsch et al.,1989;Mathew et al.,1992;Zhao and Kingston,1991）。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルがＢ１６黒色腫細胞系を用いたインビトロ抗腫瘍効力検定でパクリタキセルと同程度に有効であることも、本明細書に示される。ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、４０ｍｇ／ｋｇ（体重）量の１回注射で、ＭＣａ−４乳房腫瘍に対しパクリタキセルと比較して抗腫瘍効果に有意差を示さなかった。さらに、¹¹¹インジウム標識ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、ガンマシンチグラフィーにより証明されるように、ＭＣａ−４腫瘍に蓄積することが示された。これは、本発明のキレート剤結合した抗腫瘍薬が腫瘍造影に有用かつ有効であることを証明する。
パクリタキセルに基づく抗癌療法の効果を改善するために水溶性パクリタキセルが提案され、本発明の新規な化合物および方法は、水溶性かつ制御放出性のパクリタキセルから誘導された組成物を提供することにより、従来の方法および組成物を越える著しい前進をもたらす。このような組成物では、従来のパクリタキセル組成物にみられた副作用をもたらす溶剤が不必要になる。そのほか、放射性標識パクリタキセルは抗腫瘍活性を保持することが示され、これは腫瘍の造影にも有用であろう。さらに本発明によれば、パクリタキセルが特定の腫瘍に取り込まれるか否かを、シンチグラフィー、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放射型コンピューター断層撮影法（ＰＥＴ）により測定できる。次いでこの測定を利用して、抗腫瘍療法の効率を判定できる。この情報は、医師がパクリタキセル療法を行う患者を選択する指針を得るのに有用であろう。
パクリタキセルは２方法で水溶性にすることができる：薬物キャリヤーとして作用する水溶性ポリマーにパクリタキセルを結合させる方法、および水溶性キレート剤で誘導体にする方法。後者の方法は、核造影試験および／または放射線療法のために放射性核種（たとえば¹¹¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁶⁸Ｇａ、^99mＴｃ）で標識する機会をも提供する。パクリタキセル、ポリエチレングリコール−パクリタキセル（ＰＥＧ−パクリタキセル）、ポリグルタミン酸−パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル）およびジエチレントリアミン五酢酸−パクリタキセル（ＤＴＰＡ−パクリタキセル）の構造を図１に示す。
本発明の特定の態様においては、ＤＴＰＡ−パクリタキセルまたは他のパクリタキセル−キレート剤結合体、たとえばＥＤＴＡ−パクリタキセル、ＤＴＴＰ−パクリタキセルまたはＤＯＴＡ−パクリタキセルを、水溶性塩（ナトリウム塩、カリウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、カルシウム塩、鉄（III）塩など）の形で製造できる。これらの塩類は、腫瘍処置のための療法薬として有用であろう。第２に、ＤＴＰＡ−パクリタキセルまたは他のパクリタキセル−キレート剤は、診断薬として有用であり、これらを¹¹¹Ｉｎまたは^99mＴｃのような放射性核種で標識すると、核造影法と組み合わせて特定の腫瘍を検知するのに利用できる。パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテレ）のほか、他のタキサン誘導体を本発明の組成物および方法に適合させることができ、このような組成物および方法のすべてが請求の範囲に含まれると解釈される。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの毒性試験、薬物動態、および組織内分布は、マウスにおいて１回静脈注射により観察したＤＴＰＡ−パクリタキセルのＬＤ₅₀（５０％致死量）が約１１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であることを示した。パクリタキセルの溶解度が限られていることによる用量−容量制限があり、かつ静脈内投与にはビヒクル毒性が伴うので、パクリタキセルとの直接比較を行うのは難しい。しかし化学療法の担当者は、本発明の開示を考慮して、臨床試験で対象者に用いるための有効量および最大耐容量を決定するであろう。
本発明の特定の態様においては、ポリマー−パクリタキセル結合体でコーティングしたステントを用いて、再狭窄、すなわちバルーン血管形成術後の動脈閉塞を防止することができる。バルーン膨張式ステントを冠動脈血管形成術に用いた臨床試験での最近の結果は、標準的バルーン血管形成術と比較して、開存性および再狭窄減少において有意の利点を示した（Serruys et al.,1994）。対損傷反応仮説（response-to-injury hypothesis）によれば、細胞増殖に伴って血管内膜新生（neointima formation）が起きる。現在、自然発症性および進行性アテローム性動脈硬化症の両方とも血管病変に至る臨床経過は平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖であるというのが、一般に支持されている考えである（Phillips-Hughes and Kandarpa,1996）。動脈損傷後のＳＭＣ表現型増殖は新生細胞のものと似ているので、抗癌薬が血管内膜新生によるＳＭＣ蓄積を阻止するのに有用となる可能性がある。したがって、これらの薬剤を長期間にわたって十分な濃度で放出しうるポリマー結合−抗増殖薬でコーティングしたステントは、過形成した血管内膜および中膜が内腔中へ増殖侵入するのを阻止し、これにより再狭窄を減少させるであろう。
パクリタキセルはマウスモデルでコラーゲン誘発性関節炎を抑制することが示されているので（Oliver et al.,1994）、本発明の配合物は自己免疫疾患および／または炎症性疾患、たとえば慢性関節リウマチの処置にも有用であると考えられる。パクリタキセルがチューブリンに結合すると、安定な微小管ポリマーの方へ平衡が移行し、この薬物はＧ２有糸分裂後期の細胞をブロックすることにより真核細胞増殖の強力な阻害薬となる。パクリタキセルによる関節炎抑制には幾つかの機構が関与していると思われる。たとえば、パクリタキセルの位相特異性細胞毒性は急速に増殖している炎症細胞に作用するであろう。さらにパクリタキセルは、細胞の有糸分裂、遊走、化学走性、細胞内輸送および好中性Ｈ₂Ｏ₂を産生を阻害する。さらにパクリタキセルは、内皮細胞遊走協調を遮断することにより、抗血管形成活性をもつであろう（Oliver et al.,1994）。したがって本発明のポリマー結合プロドラッグは、慢性関節リウマチの処置に際し遊離パクリタキセルと同程度に有用であると考えられる。本明細書に開示したポリマー結合配合物はまた、薬物の遅延放出または持続放出および溶解度増大という利点をもたらす。本発明の配合物を関節領域に直接に注入し、または植え込むのも、関節炎処置の１態様である。
注射用に適したパクリタキセルまたはドセタキセルの製剤には、無菌の水性液剤または分散液剤、および無菌の液剤または分散液剤を調製するための無菌散剤が含まれる。注射用としてはすべての場合、製剤は無菌かつ液体でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対し防腐されていなければならない。キャリヤーは溶剤または分散媒であってもよく、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセリロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油が含まれる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、たとえばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖類または塩化ナトリウムを含有することが好ましいであろう。
無菌の注射液は、必要量の有効成分を、前記に挙げた他の種々の成分が含まれた適切な溶剤に含有させ、次いで無菌的にろ過することにより調製される。一般に分液散剤は、滅菌した種々の有効成分を、基本的分散媒および前記に挙げたものから選択される他の必要成分が含まれた無菌のビヒクルに含有させることにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は予め無菌的にろ過したその溶液からの真空乾燥法および凍結乾燥法であり、これにより有効成分および他の目的成分を含む散剤が得られる。
本明細書中で用いる“薬剤学的に許容しうるキャリヤー”には、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤などがいずれもすべて含まれる。薬剤有効物質に対しこのような媒質および薬剤を用いることは、当技術分野で周知である。ただし慣用される媒質または薬剤が有効成分と不適合である場合、それを療法用組成物中に使用することを考慮する。補助的な有効成分を組成物に含有させてもよい。
“薬剤学的に許容しうる”という句は、動物またはヒトに投与した場合にアレルギー反応またはこれに類する有害な反応を生じない分子形態および組成物をも表す。
たとえば水性液剤中において非経口投与するためには、液剤は必要ならば適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は十分量の食塩水またはグルコースでまず等張にされる。これらの水性液剤は静脈内および腹腔内投与に特に適している。これに関して使用できる無菌の水性媒質は、本発明の開示を考慮すれば当業者に自明であろう。
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために提示される。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実施に際して良好に機能することを本発明者らが見出した技術であり、したがって本発明の好ましい実施態様をなすとみなしうるのは自明である。ただし本発明の開示を考慮して、提示した具体的態様において多くの変更を行い、なおかつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様な、または類似の結果を得ることができるのは、当業者には自明であろう。
実施例１
ＤＴＰＡ−パクリタキセル
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの合成：
無水ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡＡ）（２１０ｍｇ、０．５８５ｍｍｏｌ）を、パクリタキセル（１００ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２．２ｍｌ）溶液に０℃で添加した。反応混液を４℃で一晩撹拌した。懸濁液を濾過し（０．２μｍミリポアフィルター）、未反応の無水ＤＴＰＡを除去した。濾液を蒸留水に注入し、４℃で２０分間撹拌し、沈殿物を回収した。Ｃ₁₈シリカゲルプレートを用いた分離用ＴＬＣをアセトニトリル／水（１：１）で展開して、粗生成物を精製した。パクリタキセルのＲ_f値は０．３４であった。パクリタキセルの上部にあるＲ_f値０．６５から０．７５のバンドをかき取り、アセトニトリル／水（１：１）混液で溶出し、溶媒を除去して１５ｍｇのＤＴＰＡ−パクリタキセルを生成物として得た（収率１０．４％）：ｍｐ；＞２２６℃分解。ＵＶスペクトル（ナトリウム塩の水溶液）は、パクリタキセルにも特徴的である２２８ｎｍに最大吸収を示した。マススペクトル；（ＦＡＢ）ｍ／ｅ１２２９（Ｍ＋Ｈ）⁺、１２５１（Ｍ＋Ｎａ）、１２６７（Ｍ＋Ｋ）。¹ＨＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ₆）では、ＤＴＰＡのＮＣＨ₂ＣＨ₂Ｎの共鳴が複雑な一連のシグナルとしてδ２．７１−２．９６ｐｐｍに、そしてＣＨ₂ＣＯＯＨの共鳴が多重線としてδ３．４２ｐｐｍに、それぞれ観測された。パクリタキセルの４．１０ｐｐｍにあるＣ７−Ｈの共鳴シグナルは５．５１ｐｐｍにシフトしたが、これは７−位がエステル化されていることを示唆する。残りのスペクトルはパクリタキセルの構造と矛盾しないものであった。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルのナトリウム塩は、ＤＴＰＡ−パクリタキセルのエタノール溶液を等量の０．０５ＭＮａＨＣＯ₃に添加し、凍結乾燥をして水溶性の固形粉末（溶解度＞２０ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ）を生成することによって得られた。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性：
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性の検討は促進条件下で実施した。すなわち、１ｍｇのＤＴＰＡ−パクリタキセルを１ｍｌの０．５ＭＮａＨＣＯ₃水溶液（ｐＨ９．３）に溶解し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの装置は、Waters社１５０ｘ３．９（内径）ｍｍノバパック（Nova-Pac）カラム（Ｃ１８４μｍシリカゲルを充填したもの）、Perkin-Elmer社イソクラティックＬＣポンプ、PE社ネルソン９００シリーズインターフェース、Spectra-Physics社ＵＶ−Ｖｉｓ検出器、およびデータステーションからなる。溶離液（アセトニトリル／メタノール／０．０２Ｍ酢酸アンモニウム＝４：１：５）を１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器（２２８ｎｍ）で検出した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの保持時間は、それぞれ１．３８および８．８３分であった。ピーク面積を定量し、標準曲線と比較して、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの濃度を測定した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルの０．５ＭＮａＨＣＯ₃水溶液中での半減期は、室温で約１６日と推定される。
in vitroにおけるマウスのＢ１６黒色腫細胞の増殖に対するＤＴＰＡ−パクリタキセルの効果：
細胞は２．５ｘ１０⁴細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種し、１０％の子牛血清を含有する、ダルベッコの修飾型最少必須培養液（Dulbecco modified minimal essential medium）（ＤＥＭ）およびＦ１２培養液（５０：５０）中で、５．５％のＣＯ₂を含有する９７％に加湿した大気中、３７℃で２４時間培養した。その後培養液を、５ｘ１０^-9Ｍから７５ｘ１０^-9Ｍの濃度域のパクリタキセルもしくはＤＴＰＡ−パクリタキセルを含有する新鮮な培養液に交換した。４０時間後、トリプシン処理により細胞を遊離させ、コールター計数器で計測した。細胞培養液中のＤＭＳＯ（パクリタキセルを溶解するために使用）、および、０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ＤＴＰＡ−パクリタキセルを溶解するために使用）の最終濃度は０．０１％より低かった。対照実験で測定したところ、この量の溶媒は、細胞増殖にいかなる影響も及ぼさなかった。
Ｂ１６黒色腫細胞の増殖に対するＤＴＰＡ−パクリタキセルの影響を図２に示す。種々の濃度で４０時間培養した後、ＤＴＰＡ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの細胞障害性を比較した。パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルのＩＣ₅₀値は、それぞれ１５ｎＭおよび７．５ｎＭである。
乳ガン（ＭＣａ−４）腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果：
メスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉中に、乳ガン（ＭＣａ−４）を接種した（５ｘ１０⁵細胞／マウス）。腫瘍が８ｍｍに達した時点で（約２週間）、体重１ｋｇあたり１０、２０、および、４０ｍｇパクリタキセル相当量のパクリタキセルもしくはＤＴＰＡ−パクリタキセルを単一投与（single dose）した。対照実験には、生理食塩水、および、無水アルコール／クレモフォア（Chremophor）（５０／５０）を生理食塩水で希釈した溶液（１：４）を使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した。腫瘍の大きさが直径１２ｍｍに達した時点で、腫瘍の増殖の遅延を算定した。マウスは、腫瘍が約１５ｍｍに達した時点で殺した。
腫瘍の増殖曲線を図３に示す。対照実験に比較し、パクリタキセルおよびＤＴＰＡ−パクリタキセルは共に、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で抗腫瘍効果を示した。さらにデータを分析して、腫瘍が直径１２ｍｍに達するのに要する平均日数も測定した。統計学的な解析により、ＤＴＰＡ−パクリタキセルは、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で、生理食塩水で処理した対照に比較して有意に腫瘍の増殖を遅延することが明らかとなった（ｐ＜０．０１）。腫瘍が直径１２ｍｍに達するのに要する平均時間は、パクリタキセルで９．４日であるのに比較し、ＤＴＰＡ−パクリタキセルでは１２．１日であった（図４）。
ＤＴＰＡ−パクリタキセルの¹¹¹Ｉｎ標識：
０．６Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）４０μｌ、０．０６Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０μｌ、ＤＴＰＡ−パクリタキセルのエタノール溶液（２％Ｗ／Ｖ）２０μｌ、および、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した¹¹¹ＩｎＣｌ₃溶液（１．０ｍＣｉ）２０μｌを、２ｍｌのＶ−バイアルに逐次添加した。室温で３０分間インキュベートした後、移動相として生理食塩水、次いでエタノールを用いたＣ１８セップパック（Sep-Pac）カートリッジに反応混液を通過させ、標識された¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを精製した。遊離の¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ（＜３％）は生理食塩水によって除去され、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルはエタノール洗浄によって回収された。エタノールを窒素ガス下で蒸発させ、標識された生成物を生理食塩水に再溶解した。放射化学的収率；８４％。
¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの分析：
ＨＰＬＣを用いて反応混液を分析し、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの純度を分析した。装置はＬＤＣバイナリーポンプ、Waters社１００ｘ８．０ｍｍ（内径）カラム（ＯＤＳ５μｍシリカゲルを充填したもの）からなる。カラムは、水およびエタノールのグラジエント混液（１５分間で、メタノール０％から８５％へのグラジエント）を用いて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。グラジエントの系は、ＮａＩ結晶検出器およびSpectra-Physics社ＵＶ／Ｖｉｓ検出器で測定した。ＨＰＬＣの分析により、セップパックカートリッジによる精製で、保持時間が２．７分である¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡのほとんどが除去されることが明らかとなった。¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡは、ＤＴＰＡ−パクリタキセル中の痕跡量の汚染物質であるＤＴＰＡから誘導されたものと考えられる。¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルのラジオクロマトグラムは、そのＵＶクロマトグラムと相関関係があり、１２．３分のピークが標的化合物であることを示唆した。同様のクロマトグラフィーの条件下で、パクリタキセルの保持時間は１７．１分であった。最終調製品の放射化学的な純度は、ＨＰＬＣ分析による測定で、９０％であった。
全身のシンチグラフィー：
メスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉中に乳ガン（ＭＣａ−４）を接種した（５ｘ１０⁵細胞）。腫瘍が直径１２ｍｍに達した時点で、マウスを２つの群に分離した。Ｉ群では、ペントバルビタールナトリウムを腹膜内に注射してマウスに麻酔をかけ、次いで¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセル（１００−２００ｍＣｉ）を尾部の静脈を介して注入した。中間エネルギーコリメーター（medium energy collimator）を搭載したγ−カメラをマウス（群あたり３匹）の上部に設置した。注射後、５、３０、６０、１２０、２４０分、および、２４時間における、一連の５分の捕捉情報（acquisitions）を回収した。II群では、マウスに対照として¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡを注射した以外は、同様の方法を行った。図５に、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡおよび¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを注射したマウスのガンマ−シンチグラフを示す。¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡは、血漿から速やかに除去され、腎臓中に最小限しか停留せずに尿中に迅速かつ高度に排泄され、腫瘍、肝臓、腸、および、他の臓器もしくは身体の部位にごくわずかしか停留しないという特徴があった。これと対照的に、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルはパクリタキセルと類似した薬理学的なプロフィールを示した（Eisemanら，1994）。脳内の放射能はごくわずかであった。肝臓および腎臓は最大の組織：血漿比を有する。放射能で標識したＤＴＰＡ−パクリタキセルもしくはその代謝物の肝胆汁性の排泄は、薬剤が血液中から除去される主な経路の一つであった。パクリタキセルとは異なり、有意な量の¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルが腎臓を通しても排泄されたが、腎臓はパクリタキセルの除去では小さな役割を果たすに過ぎなかった。腫瘍は¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを有意に取り込んだ。これらの結果から、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルによる腫瘍の検出、および、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルの腫瘍への取り込みの定量が可能であり、さらに、パクリタキセル治療の患者を選択するために¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡ−パクリタキセルを使用してもよいことが明らかになった。
実施例２
ポリグルタミン酸−パクリタキセル
本実施例で、パクリタキセルの、水溶性ポリマー、ポリ１−グルタミン酸（ＰＧ）への結合について記載する。薬剤のキャリアーとして使用される水溶性ポリマーの電位は十分に安定している（Kopecek,1990;MaedaおよびMatsumura,1989）。薬剤−ポリマー結合体は、他の不溶性の薬剤を可溶化する能力に加え、薬剤の遊離を制御するために、徐放性デポ（slow-release depot）としての機能も果たす。
ＰＧ−パクリタキセルの合成：
ＰＧは、リソソーム酵素による速やかな分解が可能であり、血漿中で安定であり、さらに、薬剤に付着するための官能基を十分に含有するので、パクリタキセルのキャリアーとして選択した。アドリアマイシン（Van Heeswijkら，1985;Hoesら,1985）、シクロホスファミド（Hiranoら,1979）、およびAra-C（Katoら,1984）を含む抗腫瘍剤がＰＧに結合されてきた。
ＰＧのナトリウム塩（ＭＷ３４Ｋ、Sigma社、０．３５ｇ）を水に溶解した。０．２ＭＨＣｌを用いて水溶液のｐＨを２に調整した。沈殿物を回収し、蒸留水に透析し、凍結乾燥して０．２９ｇのＰＧを得た。
ＰＧ（７５ｍｇ、反復単位ＦＷ１７０、０．４４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液に、２０ｍｇのパクリタキセル（０．０２３ｍｍｏｌ、モル比ＰＧ／パクリタキセル＝１９）、１５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０７３ｍｍｏｌ）、および痕跡量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加した。反応は室温で４時間行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカ）は、パクリタキセル（Ｒｆ＝０．５５）が完全にポリマー結合体（Ｒｆ＝０）に転換していることを示した（移動相ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ＝１０：１）。反応混液をクロロホルムに注入した。生成した沈殿物を回収し、真空乾燥して６５ｍのポリマー−薬剤結合体を得た。出発物質中のＰＧに対するパクリタキセルの重量比を変化させることにより、多様な濃度のパクリタキセルのポリマー結合体を合成することが可能である。
ＰＧ−パクリタキセル結合体のナトリウム塩は、生成物を０．５ＭＮａＨＣＯ₃に溶解して得た。ＰＧ−パクリタキセルの水溶液を蒸留水に透析し（ＭＷＣＯ１，０００）、低分子量の汚染物および過剰のＮａＨＣＯ₃塩を除去した。透析物を凍結乾燥して白色粉末８８．６ｍｇを得た。このポリマー結合体中のパクリタキセル含有量をＵＶ（後述）で測定したところ、２１％（Ｗ／Ｗ）であった。収率（ポリマー結合型のパクリタキセルへの転換率、ＵＶ）；９３％。単に使用するパクリタキセルのＰＧに対する比率を増加させることによって、より多くのパクリタキセル（３５％まで）を含有するＰＧ−パクリタキセルをこの方法で合成することが可能である。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＧＥ社モデルＧＮ５００分光計、５００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ中）：δ＝７．７５−７．３６ｐｐｍ（パクリタキセルの芳香族構成部分）；δ＝６．３８ｐｐｍ（Ｃ₁₀−Ｈ）、５．９７ｐｐｍ（Ｃ₁₃−Ｈ）、５．６３および４．７８ｐｐｍ（Ｃ₂’−Ｈ）、５．５５−５．３６ｐｐｍ（Ｃ₃’−ＨおよびＣ₂−Ｈ、ｍ）、５．１０ｐｐｍ（Ｃ₅−Ｈ）、４．３９ｐｐｍ（Ｃ₇−Ｈ）、４．１０（Ｃ₂₀−Ｈ）、１．９７ｐｐｍ（ＯＣＯＣＨ₃）、そして、１．１８−１．２０ｐｐｍ（Ｃ−ＣＨ₃）は、パクリタキセルの脂肪族成分にアサインされる。パクリタキセルの他の共鳴シグナルは、ＰＧの共鳴シグナルのために不明確であった。４．２７ｐｐｍ（Ｈ−α）、２．２１ｐｐｍ（Ｈ−γ）、および２．０４ｐｐｍ（Ｈ−β）にあるＰＧの共鳴シグナルは、純粋なＰＧのスペクトルと一致する。ポリマーが結合したパクリタキセルのカップリングは、分離が不十分なため十分な精度で測定することができない。水への溶解度は＞２０ｍｇパクリタキセル／ｍｌであった。
ＰＧ−パクリタキセルの性状決定：
紫外線スペクトル（ＵＶ）は、Beckman社ＤＵ−６４０分光光度計（Fullerton,CA)で得た。水に溶解したポリマー結合体とメタノールに溶解した遊離の薬剤が同じモル吸光係数を有し、かつ、両者がランベルト−ベールの法則に従うと仮定して、メタノールに溶解した既知の濃度のパクリタキセルで作成した標準曲線に基づき、ＰＧに結合したパクリタキセルの含有量をＵＶで測定した。（λ＝２２８ｎｍ）。ＵＶスペクトルに示されるように、ＰＧ−パクリタキセルはパクリタキセルに特徴的な吸収を有し、それは２２８ｎｍから２３０ｎｍにλシフトしていた。水に溶解したポリマー結合体（２３０ｎｍ）とメタノールに溶解した遊離の薬剤（２２８ｎｍ）が同じモル吸光を有し、かつ、両者がランベルト−ベールの法則に従うと仮定して、メタノールに溶解した既知の濃度のパクリタキセルを用いて２２８ｎｍの吸収で作成した標準曲線に基づいて、ＰＧ−パクリタキセル中のパクリタキセルの濃度を定量した。
ＰＧ−パクリタキセルのゲル侵透クロマトグラフィーの検討：
ＰＧ−パクリタキセルの相対分子量はゲル侵透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により特定した。ＧＰＣの装置は、ＬＤＣグラジエント装置で凍結した２つのＬＤＣモデルIIIポンプ、ＰＬゲルＧＰＣカラム、および、Waters社９９０フォトダイオードアーレイ検出器からなる。溶離液（ＤＭＦ）を１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器を２７０ｎｍに設定した。パクリタキセルがＰＧへ結合することによりＰＧ−パクリタキセルの分子量は増加するが、このことは、ＧＰＣによる分析で保持時間がＰＧの６．４分からＰＧ−パクリタキセル結合体の５．０分に移動することに示される。１５−２５％のパクリタキセル（Ｗ／Ｗ）を含有するＰＧ−パクリタキセルの分子量は、４５−５５ｋＤａの範囲内であると算定される。粗生成物は低分子量の汚染物質（保持時間８．０から１０．０分、および１１．３分）を含有したが、それらはＰＧ−パクリタキセルをそのナトリウム塩に転換した後、透析することによって、効果的に除去できた。
ＰＧ−パクリタキセル結合体の加水分解：
ＰＧ−パクリタキセルを、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４、およびｐＨ９．６のリン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ）に溶解し、０．４ｍＭのパクリタキセルに相当する濃度とした。溶液を緩やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。選定した時間毎に一定画分（１００μｌ）を除去し、等量のメタノールと混合し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの装置は、逆相シリカカラム（ノバパック、Waters社、ＣＡ）、メタノール−水（２：１、ｖ／ｖ）の移動相（流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）、およびフォトダイオード検出器からなる。２２８ｎｍにおけるそれぞれのピークのモル吸光係数がパクリタキセルのものと等しいと仮定し、ピーク面積を、別にパクリタキセルで作成した標準曲線と比較して、それぞれのサンプル中の、ＰＧの結合したパクリタキセル、遊離のパクリタキセル、および他の分解生成物の濃度を定量した。最小二乗法により算定した結合体の半減期は、ｐＨ６．０、ｐＨ７．４、およびｐＨ９．６でそれぞれ１３２日、４０日、および４日であった。ＨＰＬＣ分析により、ＰＧ−パクリタキセルをＰＢＳ溶液中でインキュベートすることにより、パクリタキセル、および、パクリタキセルより疎水性の高い物質（代謝物−１）を含む他の物質が生成することが明らかとなった。実際に、１００時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のＰＢＳで回収された代謝物−１（７−エピパクリタキセルの可能性が最も高い）の量は、パクリタキセルの量より多かった（図−６）。
in vitroの検討：
ｐＨ７．４のＰＢＳ溶液から得た一定画分を、チューブリン重合アッセイで分析した。チューブリン集合反応は、ＰＥＭ緩衝液（ｐＨ６．９）中、チューブリン（牛の脳、Cytoskeleton社、Boulder,CO）濃度１ｍｇ/ｍｌ（１０μＭ）で、試験サンプル（１．０μＭパクリタキセル相当量）および１．０ｍＭのＧＴＰの存在下、３２℃で行った。チューブリン重合の後、規定時間外に３４０ｎｍで溶液の吸光度を測定した。１５分後、塩化カルシウム（１２５ｍＭ）を添加し、ＣａＣｌ₂−誘導による微小管の解重合を測定した。ＰＢＳに溶解したばかりのＰＧ−パクリタキセルは生産型の微小管（producing microtubules）中で不活性であったが、３日間インキュベートしたＰＧ−パクリタキセルの画分はチューブリン重合を引き起こした。微小管はＣａＣｌ₂−誘導による解重合に対して安定であった。
細胞増殖に対するＰＧ−パクリタキセルの効果は、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）アッセイでも試験した（Mosmann,1983）。ＭＣＦ−７細胞もしくは１３７６２Ｆ細胞を２ｘ１０⁴細胞／ｍｌの濃度で９６穴プレートに播種し、２４時間後に種々の濃度のＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセル、もしくはＰＧで処理し、さらに７２時間インキュベートした。その後ＭＴＴ溶液（２０μｌ、５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれの穴に添加し、４時間インキュベートした。上清を吸引し、生菌によって代謝的に生成されたＭＴＴホルマザンを、マイクロプレート蛍光リーダーを用いて５９０ｎｍの波長で測定した。３日以上の間、ＰＧ−パクリタキセルは、遊離のパクリタキセルと同程度まで、腫瘍細胞の増殖を阻害した。ヒトの胸部腫瘍の細胞系ＭＣＦ−７で得られたＩＣ₅₀値は、パクリタキセルで０．５９μＭ、ＰＧ−パクリタキセルで０．８２μＭであった（パクリタキセル当量単位で測定）。１３７６２Ｆ細胞系に対しては、ＰＧ−パクリタキセルの感受性（ＩＣ₅₀＝１．８６μＭ）は、パクリタキセルのそれ（ＩＣ₅₀＝６．７９μＭ）に匹敵するものであった。両細胞系で、ＰＧ単独のＩＣ₅₀は共に１００μＭより大きかった。
in vivoにおける抗腫瘍活性：
全ての動物実験は、アンダーソン癌センター医学部門（M.D.Anderson Cancer Center）の動物施設において、施設のガイドラインに従って実施した。放射線腫瘍学実験部門（Department of Experimental Radiation Oncology）においてＣ３Ｈ／Ｋａｍマウスを交配し、病原体のない施設で飼育した。５ｘ１０⁵のネズミの卵巣ガン細胞（ＯＣａ−Ｉ）、乳ガン（ＭＣａ−４）、肝臓ガン（ＨＣａ−Ｉ）、もしくは線維肉腫（ＦＳａ−II）を注射し、メスのＣ３Ｈ／Ｋａｍマウス（２５−３０ｇ）の右腿の筋肉に孤立性腫瘍を生成した。これと平行した実験で、メスのフィッシャー３４４ラット（１２５−１５０ｇ）に、０．１ｍｌのＰＢＳに溶解した１３７６２Ｆ腫瘍細胞の生菌１．０ｘ１０⁵を注射した。マウスの腫瘍が５００ｍｍ³（直径１０ｍｍ）に達した時点、あるいは、ラットの腫瘍が２４００ｍｍ³（直径１７ｍｍ）に達した時点で、処理を開始した。生理食塩水に溶解したＰＧ−パクリタキセルもしくはクレモフォアＥＬ媒体（vehicle）に溶解したパクリタキセルを、体重１ｋｇあたり４０から１６０ｍｇパクリタキセル相当量の範囲で投与量を変化させて、単一投与した。対照実験には、生理食塩水、クレモフォア媒体（５０／５０クレモフォア／エタノールを生理食塩水で１：４に希釈）、ＰＧ（ＭＷ３８Ｋ）の生理食塩水溶液、およびパクリタキセル／ＰＧ混液を使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、および、７Ｅ）。腫瘍の体積は式（ＡｘＢｘＣ）／２に従って算定した。マウスにおける絶対増殖遅延（absolute growth delay；ＡＧＤ）は、マウスにおいて、種々の薬剤で処理した腫瘍が５００から２０００ｍｍ³に達するのに要する日数から、生理食塩水で処理した対照の腫瘍が５００から２０００ｍｍ³に達するのに要する日数を差し引いたものと定義する。表１に、ラットにおけるＰＧパクリタキセルの急性毒性をパクリタキセル／クレモフォアと比較して要約する。表２に、マウスのＭＣａ−４、ＦＳａ−II、およびＨＣａ−Ｉ腫瘍に対するＰＧ−パクリタキセルの効果に関するデータの概要を示す。データは図７Ａ−図７Ｅにも示す。

実施例３
ポリエチレングリコール−パクリタキセル
ポリエチレングリコール−パクリタキセル（ＰＥＧ−パクリタキセル）の合成：
合成は２段階で行った。初めに、２’−スクシニル−パクリタキセルを報告されている方法（Deutschら,1989）に従って調製した。パクリタキセル（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）および無水コハク酸（２８８ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（６ｍｌ）中、室温で３時間反応させた。その後ピリジンを留去し、残渣を水で処理し、２０分間撹拌して濾過した。沈殿物をアセトンに溶解し、水を徐々に添加し、微細な結晶を回収し、１８０ｍｇの２’−スクシニル−パクリタキセルを得た。ＰＥＧ−パクリタキセルはＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を介するカップリング反応によって合成した。２’−スクシニル−パクリタキセル（１６０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびメトキシポリオキシエチレンアミン（ＰＥＧ−ＮＨ₂、ＭＷ５０００、９００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液に、ＥＥＤＱ（１８０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混液を室温で４時間撹拌した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル、次いでクロロホルム−メタノール（１０：１）で溶出した。これにより３５０ｍｇの生成物を得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）；δ ２．７６（ｍ、コハク酸、ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂）、δ ３．６３（ＰＥＧ、ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）、δ ４．４２（Ｃ７−Ｈ）、および、δ ５．５１（Ｃ２’−Ｈ）。最大ＵＶ吸収は、パクリタキセルにも特徴的な、２８８ｎｍであった。ＰＥＧへの付着により、パクリタキセルの水への溶解度が大幅に向上した（＞２０ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ水）。
ＰＥＧ−パクリタキセルの加水分解に対する安定性：
ＰＥＧ−パクリタキセルを０．４ｍＭの濃度で種々のｐＨのリン酸緩衝液（０．０１Ｍ）に溶解し、溶液を緩やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。選定した時間毎に一定画分（２００μｌ）を除去し、凍結乾燥した。生成した乾燥結晶を塩化メチレンに再溶解し、ゲル侵透クロマトグラフィー（ＧＰＣ分析）に付した。ＧＰＣの装置は、Perkin-Elmer社ＰＬゲル混合ベッドカラム、Perkin-Elmer社イソクラティックＬＣポンプ、PE社ネルソン９００シリーズインターフェース、Spectra-Physics社ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、およびデータステーションからなる。溶離液（塩化メチル）は１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、ＵＶ検出器は２２８ｎｍに調整した。ＰＥＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルの保持時間は、それぞれ６．１分および８．２分であった。ピーク面積を測定し、残存するＰＥＧ−パクリタキセルおよび遊離したパクリタキセルの百分率を算出した。ＰＥＧ−パクリタキセルの半減期をｐＨ７．４での最小二乗法で算出したところ、５４分であった。ｐＨ９．０での半減期は７．６分であった。ｐＨ７．４でのＰＥＧ−パクリタキセルからのパクリタキセルの遊離図を図８に示す。
in vitroにおけるマウスのＢ１６黒色腫細胞を用いたＰＥＧ−パクリタキセルの細胞障害性の検討：
ＤＴＰＡ−パクリタキセルを用いた細胞障害性の検討で記載した方法に次いで、黒色腫細胞を２．５ｘ１０⁴細胞／ｍｌの濃度で２４穴プレートに播種し、１０％の子牛血清を含有する、ダルベッコの修飾型最少必須培養液（ＤＭＥ）およびＦ１２培養液（５０：５０）中で、５．５％のＣＯ₂を含有する９７％に加湿した大気中、３７℃で２４時間培養した。その後培養液を、５ｘ１０^-9Ｍから７５ｘ１０^-9Ｍの濃度域のパクリタキセルもしくはその誘導体を含有する新鮮な培養液に交換した。４０時間後、トリプシン処理により細胞を遊離させ、コールター計数器で計測した。細胞培養液中のＤＭＳＯ（パクリタキセルを溶解するために使用）、および、０．０５Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液（ＰＥＧ−パクリタキセルを溶解するために使用）の最終濃度は０．０１％より低かった。対照実験で測定したところ、この量の溶媒は，細胞増殖にいかなる影響も及ぼさなかった。さらにＰＥＧについても、５ｘ１０^-9Ｍから７５ｘ１０^-9Ｍのパクリタキセル相当量の濃度を生成するのに用いられる濃度域では、細胞増殖に影響を及ぼさなかった。
マウスにおけるＭＣａ−４腫瘍に対するＰＥＧ−パクリタキセルの抗腫瘍効果：
胸部の固形腫瘍に対するＰＥＧ−パクリタキセルの抗腫瘍効果を評価するために、ＭＣａ−４細胞（５ｘ１０⁵）をメスのＣ３Ｈｆ／Ｋａｍマウスの右腿の筋肉に注射した。ＤＴＰＡ−パクリタキセルを用いた実施例１に記載したように、腫瘍が８ｍｍに達した時点（約２週間）で、体重１ｋｇあたり１０、２０、および４０ｍｇのパクリタキセル相当量のパクリタキセルもしくはＰＥＧ−パクリタキセルを単一投与した。まずパクリタキセルを、無水エタノールと等量のクレモフォアとの混合液に溶解した。この貯蔵用溶液を、注射する１５分以内に無菌の生理食塩水でさらに希釈した（容量で１：４）。ＰＥＧ−パクリタキセルは生理食塩水に溶解し（６ｍｇパクリタキセル相当量／ｍｌ）、無菌フィルターで濾過した（ミリポア４．５μｍ）。生理食塩水、パクリタキセル媒体、無水アルコール：クレモフォア（１：１）を生理食塩水で１：４に希釈した溶液、およびＰＥＧの生理食塩水溶液（６００ｍｇ／ｋｇ体重）を対照実験に使用した。腫瘍の増殖は、３つの直交する腫瘍の直径を計測することにより、経日的に測定した。腫瘍の大きさが直径１２ｍｍに達した時点で、腫瘍の増殖の遅延を算定した。
腫瘍の増殖曲線を図９に示す。４０ｍｇ／ｋｇの投与量では、ＰＥＧ−パクリタキセルおよびパクリタキセルは共に、腫瘍の増殖を効果的に遅延した。統計学的に有意な差はないが、パクリタキセルはＰＥＧ−パクリタキセルより効果が高かった。パクリタキセルで処理した腫瘍は直径が１２ｍｍに達するのに９．４日を要したが、ＰＥＧ−パクリタキセルで処理した腫瘍は８．５日であった。それぞれに相当する対照、すなわち、パクリタキセル媒体の６．７日、およびＰＥＧの生理食塩水溶液の６．５日と比較すると、これらの値は統計学的に有意な差があった（ｐ＞０．０５）（図４）。
本発明の内容および方法を好ましい具体例に関して記載したが、ここに記載した内容、方法、および、方法の過程もしくは一連の過程を、本発明の概念、意図、および範囲を逸脱することなく変化させてもよいことは、当該分野の技術者には明白であろう。特に、化学的かつ物理的に関連する試薬をここに記載する試薬の代替として使用してもよく、同様の、あるいは類似の結果が得られるであろうことは、明白であろう。当該分野に精通する者に明らかな、そのような類似する代替物および修飾は全て、添付する請求の範囲に定義する本発明の意図、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。

Field of Invention
The present invention relates generally to the field of pharmaceutical compositions for use in the treatment of cancer, autoimmune diseases and restenosis. The invention also relates to the field of formulation of anticancer drugs such as paclitaxel (Taxol) and docetaxel (taxotere), in particular by coupling paclitaxel to a water-soluble moiety. It is related with making water-soluble.
Background of the Invention
Paclitaxel, an anti-microtubule agent extracted from the needles and bark of Pacific yew (Taxus brevifolia), has significant antitumor effects on human cancer Shown in Phase I experiments and early Phase II and III studies (Horwitz et al., 1993). This was mainly reported in advanced ovarian and breast cancers. Significant activity has been described in small-cell lung cancer and non-small cell lung cancer, head and neck cancer, and metastatic melanoma. However, the main difficulty in developing paclitaxel for clinical trials was that it is insoluble in water.
Docetaxel is semi-synthesized from 10-deacetylbaccatin III, a non-cytotoxic precursor extracted from the needles of Taxus baccata and esterified with chemically synthesized side chains (Cortes and Pazdur, 1995). Various cancer cell lines have been shown to be reactive to docetaxel, including breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, and colorectal cancer and melanoma. In clinical trials, complete or partial responses were achieved in breast, ovarian, head and neck, and malignant melanoma with docetaxel.
Paclitaxel is generally formulated as a concentrate containing 6 mg of paclitaxel per ml of Cremophor EL (polyoxyethylated castor oil) and dehydrated alcohol (50% v / v) and must be further diluted prior to administration (Goldspiel, 1994). The amount of cremophor EL needed to deliver the required amount of paclitaxel is significantly higher than for any other drug formulated in the cremophor. Several toxicities have been attributed to the cremophor, including vasodilation, dyspnea and hypotension. This vehicle has also been shown to cause severe hypersensitivity in laboratory animals and humans (Weiss et al., 1990). In fact, the maximum amount of paclitaxel that can be administered to mice by intravenous bolus injection is determined by the acute lethal toxicity of Cremophor vehicle (Eiseman et al., 1994). Furthermore, Cremophor EL, which is a surfactant, is known to exude phthalate plasticizers such as di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) from polyvinyl chloride bags and intravenous administration tubes. DEHP is known to cause hepatotoxicity in animals and to be carcinogenic in rodents. This paclitaxel formulation has also been shown to produce granules over time and therefore needs to be filtered during administration (Goldspiel, 1994). Therefore, special equipment is required for the preparation and administration of paclitaxel solutions to ensure safe drug delivery to the patient, which inevitably increases costs.
Previous attempts to obtain water-soluble paclitaxel include preparing a prodrug of paclitaxel by introducing a solubilizing moiety such as succinate and amino acid at the 2'-hydroxyl group or 7-hydroxyl position. (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992). However, it has been found that these prodrugs are not chemically stable enough for development. For example, Deutsch et al. (1989) reported a 2'-succinate derivative of paclitaxel, but the aqueous solubility of the sodium salt is only about 0.1% and the triethanolamine and N-methylglucamine salts are about 1%. % Could only be dissolved. Furthermore, amino acid esters have been reported to be unstable. Similar results were reported by Mathew et al. (1992). Greenwalt et al. Report the synthesis of taxol 2 'and 7-polyethylene glycol esters with high water solubility. (Greenwalt et al., 1994), but no data on the in vivo antitumor activity of these compounds has been reported (Greenwalt et al., 1995).
Other attempts to solve these problems involved microencapsulating paclitaxel in both liposomes and nanospheres (Bartoni and Boitard, 1990). Liposome formulations were reported to be as effective as free paclitaxel, but only liposome formulations containing less than 2% paclitaxel were physically stable (Sharma and Staubinger, 1994). Unfortunately, nanosphere formulations have been found to be toxic. Accordingly, there remains a need for water soluble paclitaxel formulations that can deliver effective amounts of paclitaxel and docetaxel without the disadvantages associated with drug insolubility.
Another obstacle to the widespread use of paclitaxel is that the source of paclitaxel production is limited, resulting in expensive paclitaxel therapy. For example, a course can cost thousands of dollars. In addition, there is a disadvantage that not all tumors respond to paclitaxel therapy, which appears to be because paclitaxel does not enter the tumor. Therefore, it has a high serum half-life water solubility for the treatment of tumors, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, and to prevent restenosis of vessels undergoing trauma such as angioplasty and stenting There is an urgent need for effective formulations of paclitaxel and related drugs.
Summary of the Invention
The present invention relates to a composition comprising a chemotherapeutic and antiangiogenic drug, such as paclitaxel or docetaxel, conjugated to a water-soluble polymer, such as polyglutamic acid or polyaspartic acid, or to a water-soluble metal chelator. The provision aims to overcome these and other drawbacks of the prior art. These compositions are shown herein to be unexpectedly effective as anti-tumor agents for the exemplified tumor models, and taxanes or taxoids are known to be effective. It is expected to be at least as effective as paclitaxel or docetaxel for any disease or condition present. The compositions of the present invention provide water-soluble taxoids to overcome the disadvantages associated with the water insolubility of these drugs themselves and have the advantage of controlled release, so that tumors after a single intravenous administration in animal models Is shown herein to be eradicated.
The methods described herein can also be used to make water-soluble polymer conjugates of other therapeutic agents, contrast agents and drugs. This includes etopside, teniposide, fludarabine, doxorubicin, daunomycin, emodin, 5-fluorouracil, FUDR, estradiol, camptothecin, retinoic acid, verapamil, elone And cyclosporine. In particular, a drug with a free hydroxyl group could be attached to the polymer by a chemical reaction similar to that described herein for paclitaxel. Such linkages can be readily made by those skilled in the chemical arts and are within the scope of the present invention. These agents include, but are not limited to etopside, teniposide, camptothecin and epothilones. As used herein, binding to a water-soluble polymer refers to the covalent binding of a drug to a polymer or chelating agent.
It is also understood that the water-soluble conjugates of the present invention can be administered in combination with other drugs, including other anti-tumor drugs or anti-cancer drugs. Such combinations are known in the art. The water-soluble paclitaxel or docetaxel of the present invention can be combined with other drugs used in combination with platinum drugs, antibiotics such as doxorubicin or daunorubicin, or taxol in certain types of treatment.
The coupling of chemotherapeutic drugs to polymers is an attractive way to reduce systemic toxicity and improve therapeutic index. Polymers with molecular weights greater than 30 kDa do not diffuse easily through normal capillaries and glomerular endothelium, thus freeing normal tissue from unrelated drug-mediated toxicities (Maeda and Matsumura, 1989; Reynolds 1995). On the other hand, it is well established that malignant tumors are often accompanied by capillary endothelial dysfunction and are more permeable than normal tissue vessels (Maeda and Matsumura, 1989; Fidler et al., 1987). Thus, polymer-drug conjugates that remain in the blood vessels under normal conditions can selectively leak from the blood vessels into the tumor, resulting in the accumulation of effective therapeutic agents in the tumor. Furthermore, the polymer-drug conjugate acts as a drug reservoir for sustained release, allowing tumor cells to be exposed to the drug for long periods of time. Finally, water-soluble polymers can be used to solubilize components that are otherwise insoluble, as well as to stabilize drugs. A variety of synthetic and natural polymers are currently being tested for their ability to enhance tumor-specific drug delivery (Kopecek, 1990; Maeda and Matsumura, 1989). However, there are currently only clinical evaluations of several types including SMANCS in Japan and HPMA-Dox in the UK (Maeda, 1991; Kopecek and Kopeckova, 1993).
As used herein, taxoid is taken to mean compounds including paclitaxel and docetaxel, and other chemicals with a taxene skeleton (Cortes and Pazdur, 1995), and are derived from natural sources such as yew trees or cell cultures. It may be a molecule that can be released or chemically synthesized. Preferred is general formula C₄₇H₅₁NO₁₄[2aR- [2aα, 4β, 4αβ, 6β, 9α (αR *, βS *), 11α, 12α, 12aα, 12bα]]-β- (benzoylamino) -α-hydroxybenzene Propanoic acid 6,12b-bis (acetyloxy) -12- (benzoyloxy) -2a, 3,4,4a, 5,6,9,10,11,12,12a, 12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy -4a, 8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7,11-methano-1H-cyclodeca [3,4] benz [1,2-b] oxyeth-9-yl ester. Paclitaxel and docetaxel are each more effective than other drugs for certain types of tumors, and in the practice of the present invention, tumors that are more sensitive to certain taxoids are treated with this water soluble taxoid conjugate. Interpreted.
In embodiments where paclitaxel is bound to a water soluble metal chelator, the composition will further comprise a chelated metal ion. The chelated metal ions of the present invention are aluminum, boron, calcium, chromium, cobalt, copper, dysprosium, erbium, europium, gadolinium, gallium, germanium, holmium, indium, iridium, iron, magnesium, manganese, nickel, platinum, rhenium. , Rubidium, ruthenium, samarium, sodium, technetium, thallium, tin, yttrium, or zinc. In certain preferred embodiments, the chelated metal ion will be a radionuclide of any of the metals listed above, i.e., a radioisotope. Preferred radionuclides include⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,¹¹¹In,^99mTc,⁹⁹Y,^114mIn, and^193mIncluding, but not limited to, Pt.
Preferred water-soluble chelating agents used in the practice of the present invention include, but are not limited to: diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1,4,7,10 -Tetraazacyclododecane-N, N ', N ", N'"-tetraacetate (DOTA), tetraazacyclotetradecane-N, N ', N ", N'"-tetraacetic acid (TETA), hydroxyethylidene Phosphonate (HEDP), dimercaptosuccinic acid (DMSA), diethylenetriaminetetramethylenephosphonic acid (DTTP), and 1- (p-aminobenzyl) -DTPA, 1,6-diaminohexane-N, N ′, N ″, N '"-Tetraacetic acid, DPDP, and ethylenebis (oxyethylenenitrilo) -tetraacetic acid. DTPA is most preferred. A preferred embodiment of the present invention is:¹¹¹It can also be a composition comprising In-DTPA-paclitaxel.
In a particular embodiment of the invention, paclitaxel or docetaxel is attached to a water soluble polymer, preferably the polymer is attached to the 2 'or 7-hydroxyl or both of paclitaxel or docetaxel. Thus, as noted above, when a functional group is used to link the drug to the C2'-hydroxyl of paclitaxel, a degradable linkage (in this case an ester) to ensure that the active drug is released from the polymeric carrier. Is used. Preferred polymers include, but are not limited to: polyethylene glycol, poly (l-glutamic acid), poly (d-glutamic acid), poly (dl-glutamic acid), poly (l-aspartic acid), poly (D-aspartic acid), poly (dl-aspartic acid), polyethylene glycol, copolymers of polyamino acids and polyethylene glycols listed above, polycaprolactone, polyglycolic acid and polyacetic acid, and polyacrylic acid, poly (2-hydroxy Ethyl-1-glutamine), carboxymethyldextran, hyaluronic acid, human serum albumin, and alginic acid. Polyethylene glycol, polyaspartic acids and polyglutamic acids are particularly preferred. The polyglutamic acids or polyaspartic acids of the present invention preferably have a molecular weight of about 5,000 to about 100,000, more preferably about 20,000 to about 80,000, more preferably about 30,000 to about 60,000. preferable.
It is understood that the composition of the present invention may be dispersed in the following pharmaceutically acceptable carrier solution. Such solutions are sterilized or sterile and do not cause water, buffers, isotonic agents, or other allergic or other adverse reactions when administered to a subject animal or human. Components known to those skilled in the art can be included. Thus, the present invention can also be described as a pharmaceutical composition comprising a chemotherapeutic or anticancer drug such as paclitaxel or docetaxel conjugated to a high molecular weight water soluble polymer or chelating agent. The pharmaceutical composition can contain polyethylene glycol, polyglutamic acids, polyaspartic acids, or chelating agents, preferably DTPA. It is understood that radionuclides can be used as antineoplastic agents or drugs, and the pharmaceutical compositions of the present invention may contain a therapeutically effective amount of a chelated radioisotope.
In certain embodiments, the present invention can be described as a method of measuring uptake of a chemotherapeutic drug such as paclitaxel or docetaxel by tumor tissue. The method can include preparing a drug-metal chelator conjugate comprising a chelated metal ion, contacting the tumor tissue with the composition, and measuring the presence of the chelated metal ion in the tumor tissue. The presence of chelated metal ions in the tumor tissue indicates that the tumor tissue has taken up. The chelated metal ion may be a radionuclide and the detection may be by scintigraphy. The tumor tissue may be in the subject animal or human body, in which case the composition is administered to the subject.
The present invention can also be described as a method of treating cancer in a subject in certain embodiments. This method prepares a composition comprising a chemotherapeutic agent, such as paclitaxel or docetaxel, bound to a water-soluble polymer or chelating agent and dispersed in a pharmaceutically acceptable solution, and this solution is effective in treating tumors. Administration to a subject in an amount. Preferred compositions comprise paclitaxel or docetaxel conjugated to polyglutamic acids or polyaspartic acids, more preferably poly (l-glutamic acid) or poly (l-aspartic acid). The compositions of the invention are construed to be effective against any type of cancer where unbound taxoids have been shown to be effective. This includes, but is not limited to breast cancer, ovarian cancer, malignant melanoma, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, head and neck cancer or leukemia.
Tumor treatment methods may include some estimation of the uptake of paclitaxel or docetaxel into the tumor prior to administering a therapeutically effective amount of the drug or prodrug. This method includes any of the imaging methods described above wherein a paclitaxel-chelator-chelated metal is administered to a subject and detected in a tumor. This step provides a cost effective way to determine that if the drug does not enter the tumor, it will not be expected to respond to DTPA-paclitaxel therapy. If it is possible to estimate the response to paclitaxel using an imaging method and identify a patient who does not seem to respond, it would be possible to save significant expense and significant time for the patient. If a reasonable amount of chemotherapeutic drug does not accumulate in the tumor, the tumor response to that drug is expected to be relatively small.
In certain embodiments, the present invention can be described as a method for obtaining a body image of a subject. A body image is obtained by administering an effective amount of a radioactive metal ion chelated to a paclitaxel-chelator conjugate to a subject, and measuring the scintigraphic signal of the radioactive metal to obtain an image.
In certain broad aspects, the invention relates to a method of alleviating at least one symptom of a systemic autoimmune disease, wherein a subject with systemic autoimmune disease is treated with poly-1-glutamic acid or poly-1-aspartic acid. It can also be described as a method comprising administering an effective amount of a composition comprising paclitaxel or docetaxel bound to Of particular importance with respect to the present disclosure is the treatment of rheumatoid arthritis, which is known in some cases to respond to taxol when administered in a standard cremophor formulation (US Pat. No. 5,583,153). Similar to tumor treatment, the effectiveness of the water-soluble taxoids of the present invention is not reduced by binding to the water-soluble moiety, and the water-soluble prodrug acts as a controlled release formulation that releases the active drug over a period of time It is considered possible. Thus, the compositions of the present invention are expected to be as effective as taxol for example for rheumatoid arthritis, but will provide the advantage of controlled release. It is also construed that the taxoid composition of the present invention can be used in combination with other drugs, such as an angiogenesis inhibitor (AGM-1470) (Oliver et al., 1994) or methotrexate.
The finding that paclitaxel also prevents restenosis after balloon angioplasty indicates that the water-soluble paclitaxel and docetaxel of the present invention have more versatile uses than direct parenteral administration (International Patent Publication No. WO 9625176). issue). For example, water-soluble paclitaxel is useful as a coating on implantable medical devices such as tubes, shunts, catheters, artificial implants, pins, electrical implants (eg pacemakers), especially arterial or venous stents (including balloon inflatable stents). I will. In these embodiments, water-soluble paclitaxel may be bound to the implantable medical device, or water-soluble paclitaxel may be passively attached to the surface of the implantable device. For example, a stent can be coated with a polymer-drug conjugate by immersing the stent in a polymer-drug solution or spraying such a solution onto the stent. Suitable materials for implantable devices must be biocompatible and non-toxic, from metals such as nickel-titanium alloys, steel, or biocompatible polymers, hydrogels, polyurethanes, polyethylene, ethylene-vinyl acetate copolymers, etc. You can choose. In a preferred embodiment, a water soluble paclitaxel, particularly a PG-paclitaxel conjugate, is coated on a stent for insertion into an artery or vein after balloon angioplasty. Accordingly, the present invention, in a specific broad aspect, is a method of preventing arterial restenosis or arterial occlusion after undergoing vascular trauma, wherein the subject is in need of poly-1-glutamic acid or poly-1- It can be described as a method comprising administering a composition comprising paclitaxel or docetaxel conjugated to aspartic acid. In performing the method, the subject is, for example, a patient who has undergone coronary artery bypass grafting, vascular surgery, organ transplantation, or coronary artery or arthroplasty, and the composition is administered directly intravenously or coated on a stent. This stent can then be implanted at the site of vascular trauma.
Accordingly, one aspect of the present invention is an implantable medical device wherein the device is coated with a composition comprising paclitaxel or docetaxel conjugated to polyglutamic acid or polyaspartic acid in an amount effective to inhibit smooth muscle cell proliferation. It is. A preferred device is a stent coated with the composition of the present invention described above, and in a particularly preferred embodiment, the stent is suitable for use after balloon angioplasty and the coating is effective to prevent restenosis. .
In certain preferred embodiments, the present invention provides a composition comprising polyglutamic acids bound to 2 'or 7-hydroxyl or both of paclitaxel, or a composition comprising polyaspartic acids bound to 2' or 7-hydroxyl or both of paclitaxel. It can be described as a product. As used herein, the term “polyglutamic acid” or “polyglutamic acids” includes poly (l-glutamic acid), poly (d-glutamic acid) and poly (dl-glutamic acid), and includes “polyaspartic acid” or The term “polyaspartic acids” includes poly (l-aspartic acid), poly (d-aspartic acid) and poly (dl-aspartic acid).
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described.
[Brief description of the drawings]
FIG. Chemical structure of paclitaxel, PEG-paclitaxel and DTPA-paclitaxel.
FIG. 1B. Chemical structure of PG-paclitaxel and reaction formula for its production.
FIG. Effect of paclitaxel, PEG-paclitaxel and DTPA-paclitaxel on proliferation of B16 melanoma cells.
FIG. Antitumor effect of DTPA-paclitaxel on MCa-4 breast tumor.
FIG. Median time in days to reach 12 mm tumor diameter after treatment with paclitaxel, DTPA-paclitaxel and PEG-paclitaxel.
FIG.¹¹¹In-DTPA-paclitaxel and¹¹¹Gamma-scintigraph of MCa-4 tumor-bearing mice after intravenous injection of In-DTPA. Arrow indicates tumor.
FIG. Hydrolysis of PG-paclitaxel measured at 37 ° C. in PBS (pH 7.4). -□-represents the percent of paclitaxel remaining bound to soluble PG, -Δ- represents the percent of released paclitaxel, and-○-represents the percent of metabolite-1 produced.
FIG. 7A. Antitumor effect of PG-paclitaxel on rats bearing murine breast tumor (13762F). -□-represents a response to a single intravenous administration of PG (0.3 g / kg), -Δ- represents a response to paclitaxel (40 mg / kg),-○-represents PG-paclitaxel (equivalent to 60 mg paclitaxel / kg) Represents the reaction to.
FIG. 7B. Antitumor effect of PG-paclitaxel and paclitaxel on mice bearing OCa-1 tumor. -□-represents a response to a single intravenous administration of PG (0.8 g / kg), -Δ- represents a response to paclitaxel (80 mg / kg),-●-represents PG-paclitaxel (equivalent to 80 mg paclitaxel / kg) -O- represents a reaction to PG-paclitaxel (equivalent to 160 mg / kg paclitaxel).
FIG. 7C. Antitumor effect of PG-paclitaxel on mice bearing MCa-4 breast cancer. -□-represents a response to a single intravenous administration of saline, -Δ- represents a response to a single intravenous administration of PG (0.6 mg / kg), and-♦-represents a response to PG-paclitaxel (40 mg / kg). -◇-represents a reaction to PG-paclitaxel (equivalent to 60 mg paclitaxel / kg), and -o- represents a reaction to PG-paclitaxel (120 mg / kg).
FIG. 7D. Anti-tumor effect of PG-paclitaxel on soft tissue sarcoma (FSa-II) in mice. -□-represents a response to a single intravenous administration of saline,-◇-represents a response to a single intravenous administration of PG (0.8 mg / kg), and-○-represents a response to paclitaxel (80 mg / kg). , -Δ- represents a reaction to PG-paclitaxel (equivalent to 160 mg / kg paclitaxel).
Figure 7E. Antitumor effect of PG-paclitaxel on syngeneic liver carcinoma (HCa-1) in mice. -□-represents a response to a single intravenous administration of saline, --Δ-- represents a response to a single intravenous administration of PG (0.8 mg / kg),-○-represents PG-paclitaxel (80 mg / kg) Represents the response to PG-paclitaxel (equivalent to 160 mg / kg paclitaxel / kg).
FIG. Release profile of paclitaxel from PEG-paclitaxel in phosphate buffer (pH 7.4). Paclitaxel, -X-; PEG-paclitaxel, -O-.
FIG. Anti-tumor effect of PEG-paclitaxel on MCa-4 breast tumor. -□-represents the response to a single intravenous injection of PEG salt solution (60 mg / ml),-■-represents the response to cremophor / alcohol vehicle,-○-represents a single dose of paclitaxel at 40 mg / kg (body weight) -●-represents PEG-paclitaxel equivalent to 40 mg / kg (body weight) of paclitaxel.
The present invention is based on the discovery of novel water soluble formulations of paclitaxel and docetaxel, and the surprising effects of these formulations in vivo on tumor cells. Poly (l-glutamic acid) -bound-paclitaxel (PG-paclitaxel) administered to mice bearing ovarian cancer (OCa-I) significantly delayed tumor growth compared to the same amount of paclitaxel without PG It was. Paclitaxel alone or the combination of free paclitaxel and PG initially showed tumor growth delay, but after 10 days the tumors regrown to a level comparable to the untreated control group. Furthermore, at the maximum tolerated dose (MTD) of the PG-paclitaxel conjugate (paclitaxel equivalent to 160 mg / kg), the tumor growth was completely suppressed, the tumor contracted, and the mouse observed for 2 months after the treatment had no tumor. (MTD: defined as the maximum dose with less than 15% weight loss occurring within 2 weeks after a single intravenous injection). In a parallel study, the antitumor activity of PG-paclitaxel was examined in rats with rat mammary carcinoma (13762F). Again, complete tumor eradication was seen with paclitaxel equivalent to 40-60 mg / kg of PG-paclitaxel. These surprising results demonstrate that the polymer-drug conjugate, PG-paclitaxel, succeeded in eradicating well established solid tumors after a single intravenous injection in both mice and rats. Furthermore, PG-paclitaxel with a half-life of 40 days at pH 7.4 is one of the most stable water-soluble paclitaxel derivatives known (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992; Zhao and Kingston, 1991).
It is also shown herein that DTPA-paclitaxel is as effective as paclitaxel in an in vitro anti-tumor efficacy assay using the B16 melanoma cell line. DTPA-paclitaxel showed no significant difference in anti-tumor effect compared to paclitaxel for MCa-4 breast tumors with a single injection of 40 mg / kg (body weight). further,¹¹¹Indium-labeled DTPA-paclitaxel has been shown to accumulate in MCa-4 tumors as evidenced by gunmachigraphy. This demonstrates that the chelator-conjugated anti-tumor agents of the present invention are useful and effective for tumor imaging.
Water-soluble paclitaxel has been proposed to improve the efficacy of paclitaxel-based anticancer therapies and the novel compounds and methods of the present invention provide a composition derived from water-soluble and controlled release paclitaxel by It provides a significant advance over conventional methods and compositions. Such compositions eliminate the need for solvents that cause the side effects seen with conventional paclitaxel compositions. In addition, radiolabeled paclitaxel has been shown to retain anti-tumor activity, which may also be useful for tumor imaging. Furthermore, according to the present invention, whether or not paclitaxel is taken up by a specific tumor can be measured by scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT) or positron emission computed tomography (PET). This measurement can then be used to determine the efficiency of anti-tumor therapy. This information may be useful for physicians to obtain guidance on selecting patients for paclitaxel therapy.
Paclitaxel can be rendered water-soluble in two ways: binding paclitaxel to a water-soluble polymer that acts as a drug carrier, and derivatizing with a water-soluble chelating agent. The latter method is useful for radionuclide (eg, for nuclear imaging studies and / or radiation therapy)¹¹¹In,⁹⁰Y,¹⁶⁶Ho,⁶⁸Ga,^99mIt also provides an opportunity to label with Tc). The structures of paclitaxel, polyethylene glycol-paclitaxel (PEG-paclitaxel), polyglutamic acid-paclitaxel (PG-paclitaxel) and diethylenetriaminepentaacetic acid-paclitaxel (DTPA-paclitaxel) are shown in FIG.
In certain embodiments of the invention, DTPA-paclitaxel or other paclitaxel-chelator conjugates, such as EDTA-paclitaxel, DTTP-paclitaxel or DOTA-paclitaxel, are dissolved in water-soluble salts (sodium, potassium, tetrabutylammonium salts). , Calcium salt, iron (III) salt, etc.). These salts would be useful as therapeutic agents for tumor treatment. Secondly, DTPA-paclitaxel or other paclitaxel-chelators are useful as diagnostic agents,¹¹¹In or^99mLabeling with a radionuclide such as Tc can be used in combination with nuclear imaging to detect specific tumors. In addition to paclitaxel (taxol) and docetaxel (taxotere), other taxane derivatives can be adapted to the compositions and methods of the present invention, and all such compositions and methods are to be construed as being included in the claims. The
Toxicity studies, pharmacokinetics, and tissue distribution of DTPA-paclitaxel were observed in DTPA-paclitaxel LD observed by single intravenous injection in mice.₅₀(50% lethal dose) was about 110 mg / kg (body weight). There is a dose-volume limitation due to the limited solubility of paclitaxel, and intravenous administration is accompanied by vehicle toxicity, making direct comparison with paclitaxel difficult. However, chemotherapy personnel will determine the effective dose and maximum tolerated capacity for use in subjects in clinical trials in light of the present disclosure.
In a particular embodiment of the invention, a stent coated with a polymer-paclitaxel conjugate can be used to prevent restenosis, ie, arterial occlusion after balloon angioplasty. Recent results in clinical trials using balloon expandable stents for coronary angioplasty have shown significant advantages in patency and reduced restenosis compared to standard balloon angioplasty (Serruys et al ., 1994). According to the response-to-injury hypothesis, neointima formation occurs with cell proliferation. Currently, it is generally accepted that the clinical course leading to vascular lesions in both spontaneous and progressive atherosclerosis is smooth muscle cell (SMC) proliferation (Phillips-Hughes and Kandarpa 1996). Since SMC phenotypic proliferation after arterial injury is similar to that of neoplastic cells, anticancer drugs may be useful in preventing SMC accumulation due to neointima formation. Therefore, a polymer-bonded anti-proliferative drug-coated stent capable of releasing these drugs at sufficient concentrations over a long period of time prevents the hyperplastic intima and media from proliferating into the lumen, This will reduce restenosis.
Since paclitaxel has been shown to suppress collagen-induced arthritis in a mouse model (Oliver et al., 1994), the formulations of the present invention treat autoimmune and / or inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis It is also useful. When paclitaxel binds to tubulin, the equilibrium shifts towards a stable microtubule polymer, which is a potent inhibitor of eukaryotic cell proliferation by blocking cells in late G2 mitosis. Several mechanisms may be involved in the suppression of arthritis by paclitaxel. For example, the phase specific cytotoxicity of paclitaxel will affect rapidly proliferating inflammatory cells. In addition, paclitaxel is a cell mitosis, migration, chemotaxis, intracellular transport and neutrophil H₂O₂Inhibits production. Furthermore, paclitaxel will have anti-angiogenic activity by blocking endothelial cell migration coordination (Oliver et al., 1994). Thus, the polymer-bound prodrugs of the present invention are believed to be as useful as free paclitaxel in the treatment of rheumatoid arthritis. The polymer binding formulations disclosed herein also provide the advantages of delayed or sustained release of the drug and increased solubility. Injecting or implanting the formulations of the present invention directly into the joint area is an aspect of arthritis treatment.
Paclitaxel or docetaxel formulations suitable for injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the preparation of sterile solutions or dispersions. In all cases, for injection purposes, the formulation must be sterile and liquid. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier may be a solvent or dispersion medium and includes, for example, water, ethanol, polyol (for example, glyceryl, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride.
Sterile injection solutions are prepared by containing the required amount of the active ingredient in a suitable solvent containing the various other ingredients listed above and then aseptically filtering. In general, liquid dispersions are prepared by incorporating a variety of sterilized active ingredients into a sterile vehicle containing a basic dispersion medium and other necessary ingredients selected from those listed above. In the case of a sterile powder for preparing a sterile injectable solution, the preferred method of preparation is a vacuum drying method and a freeze drying method from the solution which has been filtered aseptically in advance, whereby a powder containing the active ingredient and other target ingredients can be obtained. can get.
As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. However, if a conventional medium or drug is incompatible with the active ingredient, consider using it in the therapeutic composition. Supplementary active ingredients may be included in the composition.
The phrase “pharmaceutically acceptable” also refers to molecular forms and compositions that do not produce allergic reactions or similar adverse reactions when administered to animals or humans.
For example, for parenteral administration in an aqueous solution, the solution should be appropriately buffered if necessary, and the liquid diluent is first made isotonic with a sufficient amount of saline or glucose. These aqueous solutions are particularly suitable for intravenous and intraperitoneal administration. Sterile aqueous media that can be used in this regard will be apparent to those skilled in the art in view of the present disclosure.
The following examples are presented to demonstrate preferred embodiments of the invention. It is obvious that the techniques disclosed in the following examples are techniques that the present inventors have found to function well in the practice of the present invention, and therefore can be considered to constitute a preferred embodiment of the present invention. However, in light of the present disclosure, it is to be understood that many changes can be made in the specific embodiments presented and that similar or similar results can be obtained without departing from the spirit and scope of the present invention. It will be obvious to the contractor.
Example 1
DTPA-paclitaxel
Synthesis of DTPA-paclitaxel:
Diethylenetriaminepentaacetic anhydride (DTPA A) (210 mg, 0.585 mmol) was added to a solution of paclitaxel (100 mg, 0.117 mmol) in dry DMF (2.2 ml) at 0 ° C. The reaction mixture was stirred at 4 ° C. overnight. The suspension was filtered (0.2 μm Millipore filter) to remove unreacted anhydrous DTPA. The filtrate was poured into distilled water and stirred at 4 ° C. for 20 minutes to collect the precipitate. C₁₈The crude product was purified by developing TLC for separation using a silica gel plate with acetonitrile / water (1: 1). Paclitaxel R_fThe value was 0.34. R at the top of paclitaxel_fA band with a value of 0.65 to 0.75 was scraped off and eluted with an acetonitrile / water (1: 1) mixture, and the solvent was removed to give 15 mg of DTPA-paclitaxel as the product (yield 10.4%). ): Mp;> 226 ° C. decomposition. The UV spectrum (aqueous solution of sodium salt) showed maximum absorption at 228 nm, which is also characteristic for paclitaxel. Mass spectrum; (FAB) m / e 1229 (M + H)⁺, 1251 (M + Na), 1267 (M + K).¹H NM R spectrum (DMSO-d₆) DTPA NCH₂CH₂N resonances to δ2.71-2.96 ppm as a complex series of signals, and CH₂COOH resonance was observed as multiple lines at δ 3.42 ppm. The resonance signal of C7-H at 4.10 ppm in paclitaxel shifted to 5.51 ppm, suggesting that the 7-position is esterified. The remaining spectrum was consistent with the structure of paclitaxel.
The sodium salt of DTPA-paclitaxel is obtained by adding an ethanol solution of DTPA-paclitaxel to an equal amount of 0.05M NaHCO 3._ThreeAnd freeze-dried to produce a water-soluble solid powder (solubility> 20 mg paclitaxel equivalent / ml).
Stability of DTPA-paclitaxel to hydrolysis:
Examination of the stability of DTPA-paclitaxel to hydrolysis was performed under accelerated conditions. That is, 1 mg of DTPA-paclitaxel was added to 1 ml of 0.5 M NaHCO 3._ThreeIt was dissolved in an aqueous solution (pH 9.3) and analyzed by HPLC. The HPLC apparatus was a Waters 150 × 3.9 (inner diameter) mm Nova-Pac column (packed with C18 4 μm silica gel), Perkin-Elmer isocratic LC pump, PE Nelson 900 series interface, Spectra- It consists of a Physics UV-Vis detector and a data station. The eluent (acetonitrile / methanol / 0.02M ammonium acetate = 4: 1: 5) was allowed to flow at 1.0 ml / min, and detection was performed with a UV detector (228 nm). The retention times for DTPA-paclitaxel and paclitaxel were 1.38 and 8.83 minutes, respectively. Peak areas were quantified and compared to a standard curve to determine the concentrations of DTPA-paclitaxel and paclitaxel. DTPA-paclitaxel 0.5M NaHCO_ThreeThe half-life in aqueous solution is estimated to be about 16 days at room temperature.
Effect of DTPA-paclitaxel on proliferation of murine B16 melanoma cells in vitro:
Cells are 2.5x10^FourDulbecco's modified minimal essential medium (DEM) and F12 medium (50:50) seeded in 24-well plates at a concentration of cells / ml and containing 10% calf serum Among them, 5.5% CO₂The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in an atmosphere containing 97% and humidified. Thereafter, the culture broth is 5 × 10^-9M to 75x10^-9The culture medium was replaced with a fresh medium containing paclitaxel or DTPA-paclitaxel in the M concentration range. After 40 hours, the cells were released by trypsin treatment and counted with a Coulter counter. The final concentrations of DMSO (used to dissolve paclitaxel) and 0.05 M sodium bicarbonate solution (used to dissolve DTPA-paclitaxel) in the cell culture were below 0.01%. This amount of solvent did not have any effect on cell growth, as measured in control experiments.
The effect of DTPA-paclitaxel on the growth of B16 melanoma cells is shown in FIG. After culturing at various concentrations for 40 hours, the cytotoxicity of DTPA-paclitaxel and paclitaxel was compared. IC of paclitaxel and DTPA-paclitaxel₅₀The values are 15 nM and 7.5 nM, respectively.
Anti-tumor effect on breast cancer (MCa-4) tumor model:
Breast cancer (MCa-4) was inoculated into the right thigh muscle of female C3Hf / Kam mice (5 × 10 5^FiveCells / mouse). When the tumor reached 8 mm (about 2 weeks), a single dose of 10, 20, and 40 mg paclitaxel equivalent to paclitaxel or DTPA-paclitaxel per kg body weight was administered. In the control experiment, physiological saline and a solution (1: 4) obtained by diluting anhydrous alcohol / Chremophor (50/50) with physiological saline were used. Tumor growth was measured daily by measuring the diameter of three orthogonal tumors. The tumor growth delay was calculated when the tumor size reached 12 mm in diameter. Mice were killed when the tumor reached approximately 15 mm.
The growth curve of the tumor is shown in FIG. Compared to the control experiment, both paclitaxel and DTPA-paclitaxel showed antitumor effects at a dose of 40 mg / kg. The data was further analyzed to determine the average number of days it took for the tumor to reach a diameter of 12 mm. Statistical analysis revealed that DTPA-paclitaxel significantly delayed tumor growth compared to saline-treated controls at a dose of 40 mg / kg (p <0. 0). 01). The average time required for the tumor to reach 12 mm in diameter was 12.1 days for DTPA-paclitaxel compared to 9.4 days for paclitaxel (FIG. 4).
Of DTPA-paclitaxel¹¹¹In label:
0.6 μM sodium acetate buffer (pH 5.3) 40 μl, 0.06 M sodium citrate buffer (pH 5.5) 40 μl, DTPA-paclitaxel in ethanol (2% W / V) 20 μl, and sodium acetate buffer Dissolved in (pH 5.5)¹¹¹

InCl

_Three20 μl of the solution (1.0 mCi) was added sequentially to a 2 ml V-vial. After incubation at room temperature for 30 minutes, the reaction mixture was passed through a C18 Sep-Pac cartridge using saline and then ethanol as the mobile phase and labeled.¹¹¹In-DTPA-paclitaxel was purified. Free¹¹¹In-DTPA (<3%) is removed by saline,¹¹¹In-DTPA-paclitaxel was recovered by ethanol washing. Ethanol was evaporated under nitrogen gas and the labeled product was redissolved in saline. Radiochemical yield; 84%.
¹¹¹Analysis of In-DTPA-paclitaxel:
Analyze the reaction mixture using HPLC,¹¹¹The purity of In-DTPA-paclitaxel was analyzed. The apparatus consists of an LDC binary pump, a Waters 100 × 8.0 mm (inner diameter) column (packed with ODS 5 μm silica gel). The column was eluted with a gradient of water and ethanol (gradient from 0% to 85% methanol over 15 minutes) at a flow rate of 1 ml / min. The gradient system was measured with a NaI crystal detector and a Spectra-Physics UV / Vis detector. According to HPLC analysis, retention time is 2.7 minutes after purification with Sepppack cartridge.¹¹¹It was revealed that most of In-DTPA was removed.¹¹¹In-DTPA is believed to be derived from DTPA, a trace amount of contaminant in DTPA-paclitaxel.¹¹¹The radiochromatogram of In-DTPA-paclitaxel correlated with its UV chromatogram, suggesting that the peak at 12.3 minutes is the target compound. Under similar chromatographic conditions, the retention time of paclitaxel was 17.1 minutes. The radiochemical purity of the final preparation was 90% as determined by HPLC analysis.
Whole body scintigraphy:
Breast cancer (MCa-4) was inoculated into the right thigh muscle of female C3Hf / Kam mice (5 × 10 5^Fivecell). When the tumor reached 12 mm in diameter, the mice were separated into two groups. In Group I, mice are anesthetized by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital, then¹¹¹In-DTPA-paclitaxel (100-200 mCi) was infused via the tail vein. A γ-camera equipped with a medium energy collimator was placed on top of the mice (3 per group). A series of 5-minute acquisitions were collected at 5, 30, 60, 120, 240 minutes, and 24 hours after injection. In group II, the mice served as controls¹¹¹The same method was performed except that In-DTPA was injected. In FIG.¹¹¹In-DTPA and¹¹¹Figure 3 shows a gamma-scintigraph of mice injected with In-DTPA-paclitaxel.¹¹¹In-DTPA is quickly removed from plasma, rapidly and highly excreted in urine with minimal retention in the kidney, and negligible in tumors, liver, intestines, and other organs or body parts There was a feature that only stopped. In contrast,¹¹¹In-DTPA-paclitaxel showed a pharmacological profile similar to paclitaxel (Eiseman et al., 1994). There was very little radioactivity in the brain. The liver and kidney have the largest tissue: plasma ratio. Hepatobiliary excretion of radiolabeled DTPA-paclitaxel or its metabolites was one of the main routes by which drugs are removed from the blood. Unlike paclitaxel, a significant amount¹¹¹In-DTPA-paclitaxel was also excreted through the kidney, but the kidney played only a minor role in the removal of paclitaxel. Tumor¹¹¹In-DTPA-paclitaxel was significantly incorporated. From these results,¹¹¹Detection of tumors with In-DTPA-paclitaxel, and¹¹¹Quantification of tumor uptake of In-DTPA-paclitaxel is possible, and to select patients for paclitaxel treatment¹¹¹It has been found that In-DTPA-paclitaxel may be used.
Example 2
Polyglutamic acid-paclitaxel
This example describes the binding of paclitaxel to a water soluble polymer, poly 1-glutamic acid (PG). The potential of water-soluble polymers used as drug carriers is sufficiently stable (Kopecek, 1990; Maeda and Matsumura, 1989). In addition to the ability to solubilize other insoluble drugs, the drug-polymer conjugate also serves as a slow-release depot to control drug release.
Synthesis of PG-paclitaxel:
PG was selected as a carrier for paclitaxel because it can be rapidly degraded by lysosomal enzymes, is stable in plasma, and contains sufficient functional groups to adhere to the drug. Antitumor agents, including adriamycin (Van Heeswijk et al., 1985; Hoes et al., 1985), cyclophosphamide (Hirano et al., 1979), and Ara-C (Kato et al., 1984) have been conjugated to PG.
PG sodium salt (MW 34K, Sigma, 0.35 g) was dissolved in water. The pH of the aqueous solution was adjusted to 2 using 0.2M HCl. The precipitate was collected, dialyzed against distilled water, and lyophilized to obtain 0.29 g of PG.
To a solution of PG (75 mg, repeat unit FW 170, 0.44 mmol) in dry DMF (1.5 mL), 20 mg paclitaxel (0.023 mmol, molar ratio PG / paclitaxel = 19), 15 mg dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (0 0.073 mmol), and a trace amount of dimethylaminopyridine (DMAP) was added. The reaction was carried out at room temperature for 4 hours. Thin layer chromatography (TLC, silica) showed that paclitaxel (Rf = 0.55) was completely converted to polymer conjugate (Rf = 0) (mobile phase CHCl)._Three/ MeOH = 10: 1). The reaction mixture was poured into chloroform. The produced precipitate was collected and dried under vacuum to obtain a 65-m polymer-drug conjugate. By varying the weight ratio of paclitaxel to PG in the starting material, it is possible to synthesize polymer conjugates of various concentrations of paclitaxel.
The sodium salt of the PG-paclitaxel conjugate gives the product 0.5M NaHCO 3._ThreeIt was obtained by dissolving in An aqueous solution of PG-paclitaxel was dialyzed against distilled water (MWCO 1,000), low molecular weight contaminants and excess NaHCO_ThreeSalt was removed. The dialyzed product was lyophilized to obtain 88.6 mg of white powder. When the paclitaxel content in this polymer conjugate was measured by UV (described later), it was 21% (W / W). Yield (conversion to polymer-bound paclitaxel, UV); 93%. By simply increasing the ratio of paclitaxel to PG used, PG-paclitaxel containing more paclitaxel (up to 35%) can be synthesized in this way.
¹H-NMR (GE model GN 500 spectrometer, 500 MHz, D₂O): δ = 7.75-7.36 ppm (aromatic constituents of paclitaxel); δ = 6.38 ppm (C_Ten-H), 5.97 ppm (C₁₃-H), 5.63 and 4.78 ppm (C₂'-H), 5.55-5.36 ppm (C_Three'-H and C₂-H, m), 5.10 ppm (C_Five-H), 4.39 ppm (C₇-H), 4.10 (C₂₀-H), 1.97 ppm (OCOCH_Three) And 1.18-1.20 ppm (C-CH_Three) Is assigned to the aliphatic component of paclitaxel. The other resonance signal of paclitaxel was ambiguous due to the resonance signal of PG. The resonance signals of PG at 4.27 ppm (H-α), 2.21 ppm (H-γ), and 2.04 ppm (H-β) are consistent with the spectrum of pure PG. The coupling of polymer-bound paclitaxel cannot be measured with sufficient accuracy due to insufficient separation. The solubility in water was> 20 mg paclitaxel / ml.
Characterization of PG-paclitaxel:
The ultraviolet spectrum (UV) was obtained with a Beckman DU-640 spectrophotometer (Fullerton, CA). Made with known concentrations of paclitaxel dissolved in methanol, assuming that the polymer conjugate dissolved in water and the free drug dissolved in methanol have the same molar extinction coefficient and that both follow Lambert-Beer law Based on the standard curve, the content of paclitaxel bound to PG was measured by UV. (Λ = 228 nm). As shown in the UV spectrum, PG-paclitaxel had an absorption characteristic of paclitaxel, which was λ shifted from 228 nm to 230 nm. Assuming that the polymer conjugate dissolved in water (230 nm) and the free drug dissolved in methanol (228 nm) have the same molar extinction and both obey Lambert-Beer law, The concentration of paclitaxel in PG-paclitaxel was quantified based on a standard curve made with an absorption at 228 nm using a concentration of paclitaxel.
Examination of gel permeation chromatography of PG-paclitaxel:
The relative molecular weight of PG-paclitaxel was determined by gel permeation chromatography (GPC). The GPC instrument consists of two LDC model III pumps frozen on an LDC gradient instrument, a PL gel GPC column, and a Waters 990 photodiode array detector. The eluent (DMF) was flowed at 1.0 ml / min, and the UV detector was set at 270 nm. Binding of paclitaxel to PG increases the molecular weight of PG-paclitaxel, which means that the retention time shifts from 6.4 minutes of PG to 5.0 minutes of PG-paclitaxel conjugate by analysis by GPC. Indicated. The molecular weight of PG-paclitaxel containing 15-25% paclitaxel (W / W) is estimated to be in the range of 45-55 kDa. The crude product contained low molecular weight contaminants (retention times 8.0 to 10.0 minutes, and 11.3 minutes), but they were converted by dialyzing PG-paclitaxel after converting it to its sodium salt. Could be removed effectively.
Hydrolysis of PG-paclitaxel conjugate:
PG-paclitaxel was dissolved in phosphate buffer (PBS, 0.01M) at pH 6.0, pH 7.4, and pH 9.6 to a concentration corresponding to 0.4 mM paclitaxel. The solution was incubated at 37 ° C. with gentle agitation. A fixed fraction (100 μl) was removed every selected time, mixed with an equal amount of methanol, and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC instrument consists of a reverse phase silica column (Novapack, Waters, CA), a methanol-water (2: 1, v / v) mobile phase (flow rate 1.0 ml / min), and a photodiode detector. Assuming that the molar extinction coefficient of each peak at 228 nm is equal to that of paclitaxel, the peak area is compared to a standard curve prepared separately with paclitaxel and PG-bound paclitaxel, free paclitaxel in each sample. , And other degradation product concentrations were quantified. The half-life of the conjugate as calculated by the least squares method was 132 days, 40 days, and 4 days at pH 6.0, pH 7.4, and pH 9.6, respectively. HPLC analysis revealed that incubating PG-paclitaxel in a PBS solution produced paclitaxel and other substances, including substances that are more hydrophobic than paclitaxel (metabolite-1). Indeed, after 100 hours of incubation, the amount of metabolite-1 (most likely 7-epipaclitaxel) recovered with PBS pH 7.4 was greater than the amount of paclitaxel (FIG. 6).
In vitro study:
Certain fractions obtained from a pH 7.4 PBS solution were analyzed in a tubulin polymerization assay. The tubulin assembly reaction was performed at a tubulin (cow brain, Cytoskeleton, Boulder, CO) concentration of 1 mg / ml (10 μM) in PEM buffer (pH 6.9), with test samples (equivalent to 1.0 μM paclitaxel) Performed at 32 ° C. in the presence of 1.0 mM GTP. After tubulin polymerization, the absorbance of the solution was measured at 340 nm outside the specified time. After 15 minutes, calcium chloride (125 mM) is added and CaCl₂-Measurement of microtubule depolymerization by induction. PG-paclitaxel freshly dissolved in PBS was inactive in producing microtubules, but the fraction of PG-paclitaxel incubated for 3 days caused tubulin polymerization. Microtubules are CaCl₂-Stable to induced depolymerization.
The effect of PG-paclitaxel on cell proliferation was also tested in a tetrazolium salt (MTT) assay (Mosmann, 1983). 2x10 MCF-7 cells or 13762F cells^FourThe cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of cells / ml, treated with various concentrations of PG-paclitaxel, paclitaxel, or PG after 24 hours, and further incubated for 72 hours. MTT solution (20 μl, 5 mg / ml) was then added to each well and incubated for 4 hours. The supernatant was aspirated and MTT formazan produced metabolically by viable bacteria was measured at a wavelength of 590 nm using a microplate fluorescence reader. For more than 3 days, PG-paclitaxel inhibited tumor cell growth to the same extent as free paclitaxel. IC obtained with human breast tumor cell line MCF-7₅₀The values were 0.59 μM for paclitaxel and 0.82 μM for PG-paclitaxel (measured in units of paclitaxel equivalent). For the 13762F cell line, the sensitivity of PG-paclitaxel (IC₅₀= 1.86 μM) is that of paclitaxel (IC₅₀= 6.79 μM). PG alone IC in both cell lines₅₀Both were greater than 100 μM.
In vivo anti-tumor activity:
All animal experiments were performed at the animal facility of the M.D. Anderson Cancer Center according to institutional guidelines. In the Department of Experimental Radiation Oncology, C3H / Kam mice were crossed and reared in a pathogen free facility. 5x10^FiveMurine ovarian cancer cells (OCa-I), breast cancer (MCa-4), liver cancer (HCa-I), or fibrosarcoma (FSa-II), and female C3H / Kam mice (25-30 g) A solitary tumor was generated in the right thigh muscle. In a parallel experiment, female Fischer 344 rats (125-150 g) were immunized with 1.0 x 10 viable 13762F tumor cells dissolved in 0.1 ml PBS.^FiveWas injected. Mouse tumor is 500mm^Three(Diameter 10mm) or when the rat tumor is 2400mm^ThreeWhen reaching (diameter 17 mm), the treatment was started. PG-paclitaxel dissolved in physiological saline or paclitaxel dissolved in Cremophor EL vehicle (vehicle) was administered in a single dose with a dose varied in the range of 40 to 160 mg paclitaxel per kg body weight. In the control experiment, physiological saline, cremophor medium (50/50 cremophor / ethanol diluted 1: 4 with physiological saline), physiological saline solution of PG (MW 38K), and a paclitaxel / PG mixture were used. Tumor growth was measured over time by measuring the diameter of three orthogonal tumors (FIGS. 7A, 7B, 7C, 7D, and 7E). Tumor volume was calculated according to the formula (AxBxC) / 2. The absolute growth delay (AGD) in mice is 500 to 2000 mm in tumors treated with various drugs in mice.^ThreeFrom the number of days required to reach 500 to 2000 mm in control tumors treated with saline^ThreeDefined as the number of days required to reach Table 1 summarizes the acute toxicity of PG paclitaxel in rats compared to paclitaxel / cremophor. Table 2 summarizes the data regarding the effects of PG-paclitaxel on mouse MCa-4, FSa-II, and HCa-I tumors. Data are also shown in FIGS. 7A-7E.

Example 3
Polyethylene glycol-paclitaxel
Synthesis of polyethylene glycol-paclitaxel (PEG-paclitaxel):
The synthesis was performed in two stages. First, 2'-succinyl-paclitaxel was prepared according to a reported method (Deutsch et al., 1989). Paclitaxel (200 mg, 0.23 mmol) and succinic anhydride (288 mg, 2.22 mmol) were reacted in anhydrous pyridine (6 ml) at room temperature for 3 hours. The pyridine was then distilled off and the residue was treated with water, stirred for 20 minutes and filtered. The precipitate was dissolved in acetone, water was gradually added, and fine crystals were collected to obtain 180 mg of 2'-succinyl-paclitaxel. PEG-paclitaxel was synthesized by a coupling reaction via N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ). 2'-succinyl-paclitaxel (160 mg, 0.18 mmol) and methoxypolyoxyethyleneamine (PEG-NH₂, MW5000, 900 mg, 0.18 mmol) in methylene chloride was added EEDQ (180 mg, 0.72 mmol). The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The crude product was chromatographed on silica gel eluting with ethyl acetate and then chloroform-methanol (10: 1). This gave 350 mg of product.¹1 H NMR (CDCl_Three); Δ 2.76 (m, succinic acid, COCH)₂CH₂CO₂), Δ 3.63 (PEG, OCH₂CH₂O), [delta] 4.42 (C7-H), and [delta] 5.51 (C2'-H). The maximum UV absorption was 288 nm, which is also characteristic for paclitaxel. Adhesion to PEG significantly improved the solubility of paclitaxel in water (> 20 mg paclitaxel equivalent / ml water).
Stability of PEG-paclitaxel to hydrolysis:
PEG-paclitaxel was dissolved in various pH phosphate buffers (0.01 M) at a concentration of 0.4 mM and the solution was incubated at 37 ° C. with gentle agitation. A fixed fraction (200 μl) was removed at each selected time and lyophilized. The produced dry crystals were redissolved in methylene chloride and subjected to gel permeation chromatography (GPC analysis). The GPC instrument consists of a Perkin-Elmer PL gel mixed bed column, a Perkin-Elmer isocratic LC pump, a PE Nelson 900 series interface, a Spectra-Physics UV / Vis detector, and a data station. The eluent (methyl chloride) was flowed at 1.0 ml / min, and the UV detector was adjusted to 228 nm. Retention times for PEG-paclitaxel and paclitaxel were 6.1 minutes and 8.2 minutes, respectively. The peak area was measured and the percentage of remaining PEG-paclitaxel and free paclitaxel was calculated. It was 54 minutes when the half life of PEG-paclitaxel was computed by the least squares method at pH 7.4. The half-life at pH 9.0 was 7.6 minutes. The release diagram of paclitaxel from PEG-paclitaxel at pH 7.4 is shown in FIG.
In vitro cytotoxicity of PEG-paclitaxel using mouse B16 melanoma cells:
Following the method described in the cytotoxicity studies with DTPA-paclitaxel, 2.5 × 10^Four5.5% in Dulbecco's modified minimal essential medium (DME) and F12 medium (50:50) seeded in 24-well plates at a concentration of cells / ml and containing 10% calf serum CO₂The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in an atmosphere containing 97% and humidified. Thereafter, the culture broth is 5 × 10^-9M to 75x10^-9The culture medium was replaced with a fresh culture solution containing paclitaxel in the M concentration range or a derivative thereof. After 40 hours, the cells were released by trypsin treatment and counted with a Coulter counter. The final concentrations of DMSO (used to dissolve paclitaxel) and 0.05 M sodium bicarbonate solution (used to dissolve PEG-paclitaxel) in the cell culture were below 0.01%. This amount of solvent did not have any effect on cell growth, as measured in control experiments. Also for PEG, 5x10^-9M to 75x10^-9The concentration range used to generate M paclitaxel equivalent concentrations did not affect cell growth.
Anti-tumor effect of PEG-paclitaxel against MCa-4 tumor in mice:
To evaluate the anti-tumor effect of PEG-paclitaxel on breast solid tumors, MCa-4 cells (5 × 10 5^Five) Was injected into the right thigh muscle of female C3Hf / Kam mice. As described in Example 1 using DTPA-paclitaxel, when the tumor reached 8 mm (approximately 2 weeks), 10, 20, and 40 mg of paclitaxel per kg body weight equivalent to paclitaxel or PEG-paclitaxel One dose was administered. First, paclitaxel was dissolved in a mixture of absolute ethanol and an equal amount of cremophor. This stock solution was further diluted with sterile saline (1: 4 by volume) within 15 minutes of injection. PEG-paclitaxel was dissolved in physiological saline (6 mg paclitaxel equivalent / ml) and filtered through a sterile filter (Millipore 4.5 μm). Saline, paclitaxel vehicle, absolute alcohol: Cremophor (1: 1) diluted 1: 4 with saline, and saline solution of PEG (600 mg / kg body weight) were used for control experiments. Tumor growth was measured daily by measuring the diameter of three orthogonal tumors. The tumor growth delay was calculated when the tumor size reached 12 mm in diameter.
The tumor growth curve is shown in FIG. At the 40 mg / kg dose, both PEG-paclitaxel and paclitaxel effectively delayed tumor growth. Although there was no statistically significant difference, paclitaxel was more effective than PEG-paclitaxel. Tumors treated with paclitaxel took 9.4 days to reach a diameter of 12 mm, whereas tumors treated with PEG-paclitaxel were 8.5 days. There was a statistically significant difference in these values when compared to the corresponding controls, ie, 6.7 days for paclitaxel vehicle and 6.5 days for saline solution of PEG (p> 0. 05) (FIG. 4).
Although the content and method of the present invention have been described with reference to preferred embodiments, the content, method, and process or sequence of methods described herein may be altered without departing from the concept, intent, and scope of the present invention. It will be apparent to those skilled in the art that this may be possible. In particular, it will be apparent that chemically and physically related reagents may be used as an alternative to the reagents described herein and that similar or similar results will be obtained. All such similar substitutes and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

Claims

A pharmaceutical composition comprising a conjugate comprising paclitaxel conjugated to polyglutamic acid .

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the polyglutamic acid is selected from the group consisting of poly (d-glutamic acid), poly (l-glutamic acid), and poly (dl-glutamic acid).

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the conjugate comprises 35% paclitaxel.

4. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the polymer has a molecular weight of 5,000 to 100,000.

4. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the polymer has a molecular weight of 20,000 to 80,000.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the polymer has a molecular weight of 30,000 to 60,000.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 6, wherein the water-soluble polymer is conjugated to the 2'- and / or 7-hydroxyl of paclitaxel.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the pharmaceutical composition is dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier solution.

8. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the pharmaceutical composition is suitable for injection.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the pharmaceutical composition is lyophilized.

11. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 10, wherein the pharmaceutical composition is for the treatment of cancer.

Wherein the cancer is breast cancer, ovarian cancer, malignant melanoma, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, head and neck cancer or leukemia, a pharmaceutical composition of claim 11.

A conjugate of paclitaxel and polyglutamic acid , wherein the paclitaxel is attached to the polyglutamic acid at one or more free hydroxyl groups of the paclitaxel .

14. The conjugate according to claim 13 , wherein the polymer is selected from the group consisting of poly (d-glutamic acid), poly (l-glutamic acid), and poly (dl-glutamic acid).

15. A conjugate according to claim 13 or 14 , wherein the paclitaxel is conjugated to the polymer to the 2'- and / or 7-hydroxyl of the paclitaxel.

16. A conjugate according to any one of claims 13 to 15 , wherein the polymer has a molecular weight of 5,000 to 100,000.

16. A conjugate according to any one of claims 13 to 15 , wherein the polymer has a molecular weight of 20,000 to 80,000.

16. A conjugate according to any one of claims 13 to 15 , wherein the polymer has a molecular weight of 30,000 to 60,000.

19. A method for producing a conjugate according to any one of claims 13-18 , wherein the polymer is reacted with paclitaxel to form an ester linkage.