JP3681873B2

JP3681873B2 - Method for measuring substances

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Publication number: JP3681873B2
Application number: JP27169797A
Authority: JP
Inventors: 聡須川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2017-10-03
Also published as: JPH11108926A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象物質を粒子状の固相担体へ捕捉させる捕捉反応を行う反応工程と、前記固相担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、固相担体に捕捉された前記物質を測定する測定工程とを含む物質の測定方法において、洗浄工程を経た後の固相担体の残存量のばらつきに依存する測定値のばらつきを補正し、測定再現性を改善する方法に関する。特に、医療診断における臨床検査方法等に用いられる測定精度の向上した測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査分野における免疫測定法には、放射性同位体（ＲＩ）、酵素、発光物質、蛍光物質などを各々標識物質として結合させた抗体または抗原を用いるラジオイムノアッセイ（以下、「ＲＩＡ」と略記する）、エンザイムイムノアッセイ（以下、「ＥＩＡ」と略記する）、ケミルミネッセンスイムノアッセイ（以下、「ＣＬＩＡ」と略記する）、フローレッセンスイムノアッセイ（以下、「ＦＩＡ」と略記する）に分類される。また、ラテックス等の不溶性担体粒子に担持された抗体または抗原と、それに対応する抗原または抗体とを反応させ、その反応に伴う反応混合物の透過光の変化から抗原抗体反応の速度を測定するラテックスイムノアッセイ（以下、「ＬＰＩＡ」と略記する）が知られている。
【０００３】
これらの測定方法は、未反応の試料や標識物質の洗浄を行わずに直接測定するホモジニアスアッセイと、洗浄によって未反応の試料や過剰の標識物質を除去した後に測定を行うヘテロジニアスアッセイの２種類に大別される。これらのうち、後者のヘテロジニアスアッセイでは、目的物と不要物の洗浄分離（Ｂ／Ｆ分離）を行うために固相担体が用いられるが、固相担体がラテックス微粒子のように可動である場合は、Ｂ／Ｆ分離工程後の固相担体の残存量（回収量）にばらつきがみられ、測定値の再現性不良の原因の一つとなっていた。例えば、不溶性担体として一次抗体または抗原を磁性粒子に結合したものを用い、磁石を利用して磁性粒子を捕集して洗浄操作等を行う方法があるが、Ｂ／Ｆ分離を行うための洗浄操作中に、磁力により捕集された磁性粒子の一部が流出し、洗浄工程後の磁性粒子の回収量（残存量）にばらつきがみられ、測定値の再現性不良の原因の一つとなっていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述したようなヘテロジニアスアッセイ等の、固相担体を用い洗浄操作を行う物質の測定方法において、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄操作後の固相担体の回収量のばらつきに起因する測定結果のばらつきを補正してその測定再現性を改善し、測定精度をさらに向上させた測定方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、測定対象物質を粒子状の固相担体へ捕捉させる捕捉反応を行う反応工程と、前記固相担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、固相担体に捕捉された前記物質を測定する測定工程とを含む物質の測定方法において、
前記洗浄工程後の固相担体の残存量を指標として前記測定工程における測定値を補正することを特徴とする測定方法である。
【０００６】
また、本発明の好ましい方法は、
（ａ）測定対象物質を、前記物質に特異的に結合しうる物質を担持させた不溶性磁性粒子からなる固相担体と反応容器の液体媒体中で反応させて、前記測定対象物質を前記不溶性磁性粒子へ捕捉させる反応工程、
（ｂ）工程（ａ）における反応後の不溶性磁性粒子を、磁場の作用により反応容器壁に付着させ、洗浄操作により該液体媒体を除去する洗浄工程、
（ｃ）前記測定対象物質と同じ特異性を有する物質を担持させた不溶性蛍光色素標識粒子と、工程（ｂ）における反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを、液体媒体中で反応させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用により反応容器壁に付着させ、洗浄操作により該液体媒体及び未反応の不溶性蛍光色素標識粒子を除去する洗浄工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）における反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定することにより測定対象物質を測定する測定工程、
を含む物質の測定方法において、前記工程（ｂ）及び／又は（ｄ）における洗浄操作後の不溶性磁性粒子の残存量を指標として前記工程（ｅ）における測定値を補正することを特徴とする測定方法である。
【０００７】
本発明の方法は、微粒子状の固相担体に抗体又は抗原を担持し、ヒト又は動物の体液中の成分を抗原抗体反応を利用して前記担体に結合させ、この結合物質を標識体（標識抗体、標識抗原など）によって検出または定量する免疫測定法に代表されるような物質の測定方法において、洗浄工程を経た後の固相担体の粒子数の残存量のばらつきに起因する測定値のばらつきを、該固相担体の粒子数又は濃度を吸光度測定等の方法によってモニターして標識物の測定値を補正することにより、その測定再現性を改善した測定方法である。
【０００８】
本発明の方法は測定精度が格段に向上したものであり、特に医療診断の分野における臨床検査法等に好適に用いられる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、測定対象物質を粒子状の固相担体へ捕捉させる捕捉反応を行う反応工程と、前記固相担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、固相担体に捕捉された前記物質を測定する測定工程とを含むものであれば特に限定されないが、具体的には、検体中に存在する抗体、抗原、核酸などの生物学的活性物質を検出、定量する方法として用いられる免疫測定法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。
【００１０】
（１）測定対象物質
本発明の測定対象物質としては、タンパク質、ペプチド、結合タンパク質、ハプテン、その他の抗原（抗体結合性物質）、それらに対する抗体、核酸などの生物学的活性物質を挙げることができる。
【００１１】
抗原しては、これに結合する抗体が得られるものであれば特に制限されない。また、抗体としては、上記のような抗原に結合するものであれば制限されず、抗体分子全体であっても、フラグメントであってもよい。核酸としては、天然又は合成のＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１２】
（２）固相担体
本発明に用いる固相担体は、測定対象物質を捕捉するためのものであり、該担体上には、かかる捕捉反応を行うために、通常、前記測定対象物質と特異的に結合しうる物質を固定化（担持）する。
【００１３】
固相担体の材質は、水又は測定に用いられる溶媒に不溶性であり、測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化できるものであれば特に制限されないが、天然ゴムやポリスチレン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エステル、及びポリメタクリル酸エステル等のプラスチック、カオリン、炭素、カーボン、活性炭、ガラス、シリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ等の無機物、ゼラチン、リポソーム、並びに血球等の天然有機高分子が挙げられる。
【００１４】
固相担体の形状は、洗浄時に可動の形態を有する粒子状であれば特に限定されず、その粒径も数ｎｍ〜数ｍｍの範囲で可能であるが、好ましくは平均粒径が０．１〜１０μｍの微粒子である。なお、本発明の方法は、液体による洗浄操作により流動し消失する可能性のある形状の固相担体を用いる場合に、その洗浄操作による消失後の残存量のばらつきを測定し、それに基づいて測定値のばらつきを補正することを特徴とするものであるから、本発明にいう「粒子状」とはかかる洗浄操作により消失する可能性のある微細形状のものすべてを包含するものである。
【００１５】
本発明において好ましくは、固相担体として不溶性磁性粒子を用いることができる（特開平７−１５１７５５号参照）。
不溶性磁性粒子は、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性重合体、もしくはそれぞれのモノマーの２〜４種程度の共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームからなる磁性粒子、又は上記磁性体をラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化した磁性粒子などが用いられる。
【００１６】
固相担体に固定化する前記測定対象物質と特異的に結合しうる物質としては、上述した生物学的活性物質と同様のタンパク質、ペプチド、結合タンパク質、その他の抗原、抗体、核酸などが挙げられる。例えば、前記測定対象物質が抗原である場合にはそれに結合する抗体、抗体である場合にはこれに結合する抗原が挙げられる。また、前記測定対象物質が抗体である場合、これに特異的に結合しううる物質は、この抗体に結合する抗体であってもよい。測定対象物質が核酸である場合、これと特異的に結合しうる物質は、その核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有する核酸である。
【００１７】
前記測定対象物質が抗原であり、該抗原を測定する免疫測定法を行う場合は、固相担体に固定化する抗体として、好ましくはＩｇＧが用いられるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの低分子化したものを用いてもよい。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメントを用いてもよい。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも適用できる。モノクローナル抗体を用いるときは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原のように繰り返し構造を持つタンパク質や、ＣＡ１９−９抗原のように分子内にエピトープを複数持つ抗原に対してはモノクローナル抗体は１種類以上で使用できる。また、認識エピトープの異なるものを２種類以上組み合わせても使用できる。
【００１８】
これらの物質を固相担体へ固定化する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に担持させる方法などが用いられる。
物理的吸着法としては、担体粒子に抗体又は抗原を直接固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定化する方法などが挙げられる。
【００１９】
化学的に担持させる方法としては、担体表面に存在するアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することにより抗体、抗原等の分子と結合させることができる官能基を利用して、直接担体上に固定化する方法、担体と抗体、抗原等の分子との間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に抗体、抗原等を結合させた後、そのタンパク質を担体に化学結合させる方法などが挙げられる。
【００２０】
（３）反応工程
本発明においては、このようにして得られる固相担体を測定対象物質と反応させ、該担体上に固定化された測定対象物質と特異的に結合する物質を介して、該測定対象物質を固相担体へ捕捉させる。反応は、好ましくは反応容器の液体媒体中で混合することにより行う。免疫測定法の場合はｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９程度で反応を行う。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が例示されるが、これらに限られない。
【００２１】
（４）洗浄工程
前記捕捉反応の後、測定対象物質を捕捉した固相担体を含む反応系を洗浄して、未反応の体液成分や未反応の標識体等の物質を除去するＢ／Ｆ分離を行う。
【００２２】
未反応の物質を固相担体から洗浄・分離除去する方法としては、遠心分離、フィルターによる濾過、磁場による磁性分離などがある。
例えば、固相担体を遠心分離等により集めて未反応物を含む液体媒体（上清）を吸引除去する、あるいは必要に応じてさらに固相担体を適当な洗浄液に懸濁させ、撹拌した後遠心分離等により分離して洗浄液のみをまた吸引除去し、この操作を数回繰り返す、等の方法をとることができる。また、磁性分離としては、固相担体として不溶性磁性粒子を用い、不溶性磁性粒子を含む反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後反応液（上清）を除去し、さらに必要に応じて適当な洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行われる。
【００２３】
（５）測定工程
前記洗浄工程の後、固相担体に捕捉された測定対象物質を測定する。測定は、通常のイムノアッセイと同様に行えばよい。例えば、標識物質が化学発光物質または蛍光色素であれば、標識物質が発する発光または蛍光を、標識物質が酵素であれば、この酵素活性を測定することにより、測定対象物質を測定することができる。また、標識物質がラジオアイソトープ（放射性同位体）である場合には、標識物質の放射活性を測定すればよい。
【００２４】
（６）不溶性磁性粒子を用いた測定方法
本発明では、固相担体として前述した不溶性磁性粒子を用いる場合、標識物質として測定対象物質と同じ特異性を有する物質を固定化させた不溶性蛍光色素標識粒子を用い、競合法に基づいて測定する方法をとることもできる。その方法は以下の工程を含むものである。
（ａ）測定対象物質を、前記物質に特異的に結合しうる物質を担持させた不溶性磁性粒子からなる固相担体と反応容器の液体媒体中で反応させて、前記測定対象物質を前記不溶性磁性粒子へ捕捉させる反応工程。
（ｂ）工程（ａ）における反応後の不溶性磁性粒子を、磁場の作用により反応容器壁に付着させ、洗浄操作により該液体媒体を除去する洗浄工程。
（ｃ）前記測定対象物質と同じ特異性を有する物質を担持させた不溶性蛍光色素標識粒子と、工程（ｂ）における反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを、液体媒体中で反応させる工程。
（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用により反応容器壁に付着させ、洗浄操作により該液体媒体及び未反応の不溶性蛍光色素標識粒子を除去する洗浄工程。
（ｅ）工程（ｄ）における反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子と反応した不溶性蛍光色素標識粒子の蛍光強度を測定することにより測定対象物質を測定する測定工程。
【００２５】
不溶性蛍光色素標識粒子に用いる標識色素としては、蛍光色素であればいずれも使用できる。例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）などの希土類キレートや、フィコシアニン、フィコエリスリンなどのフィコビリプロテイン、フルオレッセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−メチルウンベリフェリン、７−アミノ−４−メチルクマリンなどが用いられる。
【００２６】
色素標識を行う不溶性担体粒子の材質としては、前記不溶性磁性粒子で述べたものと同様に、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル等の疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸系樹脂等の親水性重合体、またはそれぞれのモノマーの共重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームのほか、赤血球のような生体成分、金コロイドのような金属コロイド粒子等が用いられる。
【００２７】
かかる不溶性担体粒子に蛍光色素を担持させる方法としては、特開平１５１７５５公報に記載されているように、例えば粒子表面の官能基を利用して蛍光色素を化学的に結合させる方法、粒子を重合して合成する際に色素を加えて粒子内部に封じ込める方法、粒子内部又は表面に物理的に吸着、封入させる方法、あらかじめタンパク質、ペプチドなどと物理的又は化学的に色素を結合させておいてからそのタンパク質、ペプチドを粒子に固定化する方法などがある。
【００２８】
こうして得られる蛍光粒子には、測定しようとする生物学的活性物質と同じ特異性を有する抗原又は抗体、核酸等が前述のとおり物理的又は化学的に固定化される。
【００２９】
なお、本発明における「特異性を有する」とは、測定しようとする物質が抗原である場合、前述した抗原と生物学的あるいは生理学的に同一なものとして生体に非自己として認識され、抗体の産生を導く物質全般を指す。測定しようとする物質が抗体である場合は、かかる抗体の免疫グロブリンクラスと反応するもの、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡ又は補体成分の一種であるＣｌｑ等のように、ある種の抗体分子の特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質をいう。
【００３０】
不溶性磁性粒子を用いる上記方法においては、固相担体（不溶性磁性粒子）に試料中の測定対象物質を捕捉させた後に、該測定対象物質と同じ特異性を有する物質が担持された不溶性蛍光色素標識粒子を加えて同様に前記不溶性磁性粒子に捕捉・結合させる。その際、不溶性磁性粒子に既に捕捉されている測定対象物質は、不溶性磁性粒子上に固定化された物質と不溶性蛍光色素標識粒子とが結合するのを阻害する。よって、固相担体に捕捉される不溶性蛍光色素標識粒子の量は試料中の測定対象物質の量に依存することから、蛍光色素を定量することにより間接的に測定対象物質を定量することができる。
【００３１】
捕捉反応後、固相担体を洗浄してＢ／Ｆ分離を行ったのち、得られた固相担体に捕捉された不溶性蛍光色素標識粒子の量を蛍光色素の固有の励起光を照射して放出される蛍光強度を計測することにより測定する。例えば、Ｅｕキレートを標識色素とした場合、励起光は３００〜３８０ｎｍ、又は２４０〜２７０ｍｍの紫外光であり、蛍光は６００〜６３０ｎｍ（６１５ｎｍに極大値を有する）である。
【００３２】
（７）補正
本発明においては、洗浄工程後の固相担体の残存量を指標として前記測定工程で得られた測定値を補正する。
【００３３】
固相担体の残存量は、洗浄前後の固相担体の粒子数又は濃度を測定することによって算出することができる。固相担体の粒子数又は濃度を測定する方法としては、固相担体がラテックス粒子の場合は、透過光測定、散乱光測定等の光学的方法を採用するのが好ましい。その場合、好ましくは３００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長光が用いられる。
【００３４】
固相担体の残存量を指標として測定値を補正する方法としては、例えば、測定結果のカウント値を固相担体の残存量で除する方法が挙げられる。また、測定結果のカウント値を固相担体の残存量で除し、更に一定値を乗じてもよい。これによって、固相担体の洗浄による残存量のばらつきに左右されない測定結果を得ることが可能となる。
【００３５】
測定対象物質を定量する場合は、あらかじめ濃度既知品又は基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試料の濃度に対して図示して検量線を求め、それを用いて濃度未知試料の定量値から濃度を求めることができる。
【００３６】
尚、上記で補正のために乗ずる一定値は任意の数でよく、例えば、残存量の平均値や平均値付近の切りのいい数値等が挙げられる。但し、測定対象物質（濃度未知試料）の蛍光カウント補正時および検量線作成のための蛍光カウント補正時とに、同じ数値を用いる必要がある。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００３８】
【実施例１】
＜ＴＲ−ＦＩＡ法による遊離サイロキシン（ＦＴ４）の測定＞
（１）試薬の調製
▲１▼磁性ラテックス試薬の調製
マウス抗Ｔ４モノクローナル抗体を、公知の方法に従って、カルボジイミドによって磁性ラテックス粒子（材質：ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、平均粒径：０．７μｍ）上のカルボキシル基に共有結合させて調製した。
▲２▼ユーロピウムラテックスの調製
精製Ｔ４を公知の方法に従って、カルボジイミドによってユーロピウムラテックス（材質：ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、平均粒径：０．４μｍ）上のカルボキシル基に共有結合させて調製した。
▲３▼反応バッファーの調製
トリス（Tris）緩衝液：０．２Ｍ（ｐＨ７．０）、ゼラチン（Ge1atin）：０．２％、ＮａＮ₃：０．１％を含む溶液を調製した。
【００３９】
（２）測定方法
抗Ｔ４抗体感作磁性ラテックス粒子１００μＬ、前記反応バッファー１００μＬ、及び下記ＦＴ４標準品２０μＬをキュべット中で３７℃にて５分間反応させた後、キュべットを磁石上に１分間静置して磁性ラテックス粒子を集め、上清を吸引して洗浄を行った。
【００４０】
次に、キュべットにトラップされた磁性ラテックス粒子とＴ４感作ユーロピウムラテックス粒子１００μＬおよび反応バッファー１００μＬを３７℃にて１０分間反応させ、同様に磁石上で１分間静置させてから上清の吸引洗浄を行った。
【００４１】
次いで、磁性ラテックス粒子を水中に分散させ、吸光度計で吸光度（５４０ｎｍ）を測定し、同時に蛍光強度計で蛍光強度を測定した。測定はＬＰＩＡ・Ａ−７００とよばれる全自動ＴＲ−ＦＩＡ測定装置（三菱化学社製）において、下記濃度のＦＴ４標準品を用い、それぞれ１０反復測定を行った。
【００４２】
（ＦＴ４標準品）
Ca1.A：0.00ng/dL
Cal.B：0.27ng/dL
Ca1.C：0.67ng/dL
Ca1.D：1.60ng/dL
Ca1.E：2.83ng/dL
Ca1.F：4.70ng/dL
Ca1.G：6.47ng/dL
Ca1.H：8.57ng/dL
【００４３】
（３）測定結果
蛍光強度計による蛍光カウント値を表１に、濃度換算値を表２に、最終ＯＤ値を表３にそれぞれ示す。濃度計算は蛍光カウント値を検量線としてスプライン関数を用いて計算を行った。
【００４４】
【表１】

【００４５】
【表２】

【００４６】
【表３】

【００４７】
表２に示したようにCal.B、Ca1.C等の低濃度域では濃度のＣＶ％が１０％を超えてしまうことがわかる。このデータを用いて本発明のデータ補正法によってどのようにデータが改善されるかを次に示す。
【００４８】
（４）データ補正
表１のデータをＯＤ値で除することによって補正し、さらに得られる値を補正後の蛍光カウント値とするために０．７を乗じた。すなわち、
【００４９】
【数１】
蛍光カウント÷ＯＤ値×０．７
【００５０】
の計算式によって蛍光カウントの補正値を得た。その結果を表４に示す。
次に、この蛍光カウント補正値を検量線として上述と同様の方法で濃度計算を行った。その結果を表５に示す。
【００５１】
【表４】

【００５２】
【表５】

【００５３】
（５）考察
補正前のデータ（表１・表２）と補正後のデータ（表４・表５）を比較してわかるように、本発明のデータ補正処理によって測定値のＣＶ％、即ち測定再現性が向上し、特にCal.B、Cal.CでのＣＶ％が１０％以内に入っていることがわかる。
【００５４】
【実施例２】
＜ＴＲーＦＩＡ法による総トリヨードサイロニン（ＴＴ３）の測定＞
（１）試薬の調製
▲１▼磁性ラテックス試薬の調製
ヒツジ抗Ｔ３モノクローナル抗体を公知の方法に従って、カルボジイミドによって磁性ラテックス粒子（材質：ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、平均粒径：０．７μｍ）上のカルボキシル基に共有結合させて調製した。
▲２▼ユーロピウムラテックスの調製
精製Ｔ３を公知の方法に従って、カルボジイミドによってユーロピウムラテックス（材質：ポリスチレン−ジビルベンゼン共重合体、平均粒径：０．４μｍ）上のカルボキシル基に共有結合させて調製した。
▲３▼反応バッファー（１）の調製
バルビタール（Barbita1）Ｎａ：１２０ｍＭ（ｐＨ８．６）、ゼラチン：０．２％、ＮａＮ₃：０．１％、ＡＮＳ（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸）：１ｍＭを含む溶液を調製した。
▲４▼反応バッファー（２）の調製
トリス（Tris）緩衝液：０．２Ｍ（ｐＨ７．０）、ゼラチン：０．２％、ＮａＮ₃：０．１％を含む溶液を調製した。
【００５５】
（２）測定
下記ＴＴ３標準品２０μＬ、反応バッファー（１）１００μＬ、及び抗Ｔ３抗体感作磁性ラテックス粒子１００μＬをキュべット中で３７℃・５分間反応させた後、キュベットを磁石上に１分間静置して磁性ラテックス粒子を集め、上清を吸引して洗浄を行った。
【００５６】
次に、キュベットにトラップされた磁性ラテックス粒子とＴ３感作ユーロピウムラテックス粒子１００μＬ及び反応バッファー１００μＬを３７℃にて１０分間反応させ、同様に磁石上で１分間静置させてから上清の吸引洗浄を行った。
【００５７】
最後に磁性ラテックス粒子を水中に分散させ、吸光度計で吸光度を測定し、同時に蛍光強度計で蛍光強度を測定した。測定は実施例１と同様にＬＰＩＡ・Ａ−７００において、下記濃度のＴＴ３標準品を用い、それぞれ１０反復測定を行った。
【００５８】
（ＴＴ３標準品）
Cal.A'：0.00ng/mL
Cal.B'：0.50ng/mL
Cal.C'：1.00ng/mL
Cal.D'：1.98ng/mL
Cal.E'：3.95ng/mL
Ca1.F'：7.90ng/mL
【００５９】
（３）測定結果
蛍光カウント値を表６に、濃度換算値を表７に、最終ＯＤ値を表８にそれぞれ示す。濃度計算は蛍光カウント値を検量線とし、スプライン関数を用いて計算を行った。
【００６０】
【表６】

【００６１】
【表７】

【００６２】
【表８】

【００６３】
表７に示したようにCa1.B'、Ca1.F'では濃度のＣＶ％が１０％を超えてしまうことがわかる。このデータを用いて本発明のデータ補正法によってどのようにデータが改善されるかを次に示す。
【００６４】
（４）データ補正
表６のデータをＯＤ値で除することによって補正し、さらに得られる値を補正後の蛍光カウント値とするために０．７を乗じた。すなわち、
【００６５】
【数２】
蛍光カウント÷ＯＤ値×０．７
【００６６】
の計算式によって蛍光カウントの補正値を得た。その結果を表９に示す。
次に、この蛍光カウント補正値を検量線として上述と同様の方法で濃度計算を行った。その結果を表１０に示す。
【００６７】
【表９】

【００６８】
【表１０】

【００６９】
（５）考察
補正前のデータ（表６、表７）と補正後のデータ（表９、表１０）を比較してわかるように、本発明のデータ補正処理によって測定値のＣＶ％、即ち測定再現性が向上し、特にCal.B'、Cal.F'でのＣＶ％が１０％以内に入っていることがわかる。
【００７０】
【実施例３】
＜ＴＲ−ＦＩＡ法による甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定＞
（１）試薬の調製
▲１▼磁性ラテックス試薬の調製
マウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体を公知の方法に従って、カルボジイミドによって磁性ラテックス粒子（材質：ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、平均粒径：１μｍ）上のカルボキシル基に共有結合して調製した。
▲２▼ユーロピウムラテックスの調製
マウス抗ＴＳＨモノクローナル抗体を公知の方法に従って、カルボジイミドによってユーロピウムラテックス（材質：ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、平均粒径：０．１μｍ）上のカルボキシル基に共有結合して調製した。
▲３▼反応バッファーの調製
トリス（Tris）緩衝液：０．２Ｍ（ｐＨ７．０）、ゼラチン：０．２％、ＮａＮ₃：０．１％を含む溶液を調製した。
【００７１】
（２）測定方法
下記ＴＳＨ標準品７０μＬと反応バッファー１００μＬ及び抗ＴＳＨ抗体感作磁性ラテックス粒子１００μＬをキュペット中で３７℃にて５分間反応させた後、キュべットを磁石上に１分間静置して磁性ラテックス粒子を集め、上清を吸引して洗浄を行った。
【００７２】
次に、キュベットにトラップされた磁性ラテックス粒子と抗ＴＳＨ抗体感作ユーロピウムラテックス粒子１００μＬおよび反応バッファー１００μＬを３７℃にて１０分間反応させ、同様に磁石上で１分間静置させてから上清の吸引洗浄を行った。
【００７３】
次いで、磁性ラテックス粒子を水中に分散させ、吸光度計で吸光度を測定し、同時に蛍光強度計で蛍光強度を測定した。測定は実施例１と同様にＬＰＩＡ・Ａ−７００において、下記濃度のＴＳＨ標準品を用い、それぞれ１０反復測定を行った。
【００７４】
（ＴＳＨ標準品）
Cal.1： 0.00μIU/mL
Cal.2： 0.05μIU/mL
Cal.3： 0.1 μIUノmL
Cal.4： 0.2 μIU/mL
Cal.5： 1.0 μIU/mL
Cal.6：10 μIUノmL
Cal.7：50 μIU/mL
Ca1.8：80 μIUノmL
【００７５】
また、濃度計算はＴＳＨ標準品を下記のように回帰して計算を行った。
Cal.1〜Ca1.4：直線
Ca1.4〜Ca1.6：放物線（対数）
Cal.6〜Cal.8：放物線（対数）
【００７６】
（３）測定結果
蛍光カウント値を表１１に、濃度換算値を表１２に、最終ＯＤ値を表１３にそれぞれ示す。
【００７７】
【表１１】

【００７８】
【表１２】

【００７９】
【表１３】

【００８０】
（４）データ補正
表１１のデータをＯＤ値で除することによって補正し、さらに得られる値を補正後の蛍光カウント値とするために０．３を乗じた。すなわち、
【００８１】
【数３】
蛍光カウント÷ＯＤ値×０．３
【００８２】
の計算式によって蛍光カウントの補正値を得た。その結果を表１４に示す。
次に、この蛍光カウント補正値を検量線として上述と同様の方法で濃度計算を行った。その結果を表１５に示す。
【００８３】
【表１４】

【００８４】
【表１５】

【００８５】
（５）考察
本発明のデータ補正処理によってほぼ全領域にわたってＣＶ％の向上が見られた。
【００８６】
【発明の効果】
本発明によれば、固相担体を用い洗浄工程を有する物質の測定方法において、Ｂ／Ｆ分離後の固相担体の残存量のばらつきに起因する測定結果のばらつきを補正することにより、測定再現性を改善することができる。よって、臨床検査法等の測定精度をさらに向上させることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reaction step for performing a capture reaction for capturing a substance to be measured on a particulate solid phase carrier, a washing step for washing a reaction system containing the solid phase carrier to perform B / F separation, and a solid phase carrier. In a method for measuring a substance including a measurement step for measuring the substance trapped in the substrate, the measurement reproducibility is improved by correcting the variation in the measured value depending on the variation in the remaining amount of the solid phase carrier after the washing step. On how to do. In particular, the present invention relates to a measurement method with improved measurement accuracy used for clinical examination methods in medical diagnosis.
[0002]
[Prior art]
As an immunoassay in the field of clinical examination, a radioimmunoassay (hereinafter abbreviated as “RIA”) using an antibody or an antigen in which a radioisotope (RI), an enzyme, a luminescent substance, a fluorescent substance, etc. are bound as a labeling substance. , Enzyme immunoassay (hereinafter abbreviated as “EIA”), chemiluminescence immunoassay (hereinafter abbreviated as “CLIA”), and florescence immunoassay (hereinafter abbreviated as “FIA”). Latex immunoassay that reacts antibody or antigen supported on insoluble carrier particles such as latex with the corresponding antigen or antibody, and measures the rate of antigen-antibody reaction from the change in transmitted light of the reaction mixture accompanying the reaction. (Hereinafter abbreviated as “LPIA”).
[0003]
These measurement methods include two types: a homogeneous assay that directly measures without washing unreacted samples and labeling substances, and a heterogeneous assay that performs measurements after removing unreacted samples and excess labeling substances by washing. It is divided roughly into. Among these, in the latter heterogeneous assay, a solid support is used to perform washing separation (B / F separation) of a target product and an unnecessary product, but the solid support is movable like latex fine particles. However, the residual amount (recovered amount) of the solid phase carrier after the B / F separation step was varied, which was one of the causes of poor reproducibility of measured values. For example, there is a method in which a primary antibody or antigen bound to magnetic particles is used as an insoluble carrier, and magnetic particles are collected using a magnet and washed, etc., but washing for performing B / F separation is possible. During operation, some of the magnetic particles collected by the magnetic force flow out, and the recovered amount (residual amount) of the magnetic particles after the cleaning process varies, which is one of the causes of poor reproducibility of measured values. It was.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is due to variations in the recovery amount of a solid phase carrier after a washing operation for B / F separation in a method for measuring a substance that is washed using a solid phase carrier, such as the heterogeneous assay as described above. It is an object of the present invention to provide a measurement method that corrects variations in measurement results to improve measurement reproducibility and further improve measurement accuracy.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The method of the present invention comprises a reaction step for carrying out a capture reaction for capturing a substance to be measured on a particulate solid phase carrier, a washing step for carrying out B / F separation by washing the reaction system containing the solid phase carrier, A method for measuring a substance comprising a measuring step of measuring the substance trapped on a phase carrier,
The measurement method is characterized in that the measurement value in the measurement step is corrected using the residual amount of the solid phase carrier after the washing step as an index.
[0006]
Also, the preferred method of the present invention is:
(A) A substance to be measured is reacted with a solid phase carrier made of insoluble magnetic particles carrying a substance capable of binding specifically to the substance in a liquid medium in a reaction vessel, and the substance to be measured is made to be insoluble magnetic. A reaction process for trapping particles,
(B) a cleaning step in which the insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed by a cleaning operation;
(C) A step of reacting insoluble fluorescent dye-labeled particles carrying a substance having the same specificity as the substance to be measured with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in the step (b) in a liquid medium. ,
(D) a washing step in which the insoluble magnetic particles in step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium and unreacted insoluble fluorescent dye-labeled particles are removed by a washing operation;
(E) a measurement step of measuring the substance to be measured by measuring the fluorescence intensity of the insoluble fluorescent dye-labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in the step (d),
In the method for measuring a substance containing, the measurement value in the step (e) is corrected using the residual amount of insoluble magnetic particles after the washing operation in the step (b) and / or (d) as an index. Is the method.
[0007]
In the method of the present invention, an antibody or antigen is supported on a particulate solid carrier, components in human or animal body fluids are bound to the carrier using an antigen-antibody reaction, and the binding substance is labeled (labeled). In measurement methods for substances such as antibodies and labeled antigens that are detected or quantified by immunoassay, the variation in measured values due to the variation in the remaining amount of solid phase carrier particles after the washing step Is a measurement method in which the measurement reproducibility is improved by monitoring the number or concentration of particles of the solid phase carrier by a method such as absorbance measurement and correcting the measurement value of the label.
[0008]
The method of the present invention has a markedly improved measurement accuracy, and is particularly suitable for clinical test methods and the like in the field of medical diagnosis.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method of the present invention comprises a reaction step for carrying out a capture reaction for capturing a substance to be measured on a particulate solid phase carrier, a washing step for carrying out B / F separation by washing the reaction system containing the solid phase carrier, It is not particularly limited as long as it includes a measurement step for measuring the substance captured by the phase carrier, and specifically, it detects biologically active substances such as antibodies, antigens, and nucleic acids present in the specimen. Examples of the quantification method include an immunoassay method and a hybridization method.
[0010]
(1) Substance to be measured
Examples of the measurement target substance of the present invention include biologically active substances such as proteins, peptides, binding proteins, haptens, other antigens (antibody binding substances), antibodies against them, and nucleic acids.
[0011]
The antigen is not particularly limited as long as an antibody that binds to the antigen can be obtained. The antibody is not limited as long as it binds to the antigen as described above, and may be the whole antibody molecule or a fragment. Nucleic acids include natural or synthetic DNA, RNA, or oligonucleotides.
[0012]
(2) Solid support
The solid phase carrier used in the present invention is for capturing a substance to be measured, and a substance capable of specifically binding to the substance to be measured is usually present on the carrier in order to perform such a capture reaction. Immobilize (carry).
[0013]
The material of the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is insoluble in water or a solvent used for measurement and can immobilize a substance that specifically binds to the substance to be measured, but natural rubber, polystyrene, polystyrene-divinyl. Plastics such as benzene copolymer, styrene-butadiene copolymer, polyacrylic acid ester, and polymethacrylic acid ester, kaolin, carbon, carbon, activated carbon, glass, silica, alumina, silica-alumina and other inorganic materials, gelatin, liposomes And natural organic polymers such as blood cells.
[0014]
The shape of the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is a particle having a movable form at the time of washing, and the particle size can be in the range of several nm to several mm, but preferably the average particle size is 0.1. 10 μm fine particles. In the method of the present invention, when a solid support having a shape that may flow and disappear due to a washing operation with a liquid is used, the variation in the remaining amount after disappearance due to the washing operation is measured, and the measurement is performed based on the variation. Since it is characterized by correcting variations in values, the “particulate” as used in the present invention includes all fine shapes that may be lost by such a washing operation.
[0015]
In the present invention, preferably, insoluble magnetic particles can be used as a solid support (see JP-A-7-151755).
The insoluble magnetic particles are not particularly limited as long as they can be easily magnetized by magnetic induction, for example, iron trioxide (Fe _Three O _Four ), Iron sesquioxide (γ-Fe ₂ O _Three ), Various fine particles of ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, etc., magnetic fine particles made of alloys such as cobalt, nickel, manganese, etc., or polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylate containing these magnetic materials inside Hydrophobic polymers such as nitrile, polymethyl methacrylate, polycapramide, polyethylene terephthalate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-oxyethyl acrylate), poly (2-oxyethyl methacrylate), Crosslinked hydrophilic polymers such as poly (2,3-dioxypropyl acrylate), poly (2,3-dioxypropyl methacrylate), polyethylene glycol methacrylate, Latex, such as species of approximately copolymer, gelatin, magnetic particles made of a liposome, or latex the magnetic, gelatin, surface-immobilized magnetic particles such as liposomes are employed.
[0016]
Examples of the substance that can specifically bind to the measurement target substance immobilized on the solid phase carrier include the same proteins, peptides, binding proteins, other antigens, antibodies, nucleic acids, and the like as the biologically active substances described above. . For example, when the substance to be measured is an antigen, an antibody that binds to the antigen, and when it is an antibody, an antigen that binds to the antibody can be used. When the substance to be measured is an antibody, the substance that can specifically bind to the substance may be an antibody that binds to the antibody. When the substance to be measured is a nucleic acid, the substance that can specifically bind to this is a nucleic acid having a base sequence substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid.
[0017]
When the substance to be measured is an antigen and an immunoassay for measuring the antigen is performed, IgG is preferably used as an antibody to be immobilized on a solid phase carrier, but digestive enzymes such as pepsin and papain or dithiothrease are used. Using a reducing agent such as Tol, Mercaptoethanol, F (ab ′) ₂ , Fab ′, Fab or the like having a reduced molecular weight may be used. Further, not only IgG but also IgM or a fragment obtained by reducing the molecular weight by the same treatment as IgG may be used. Either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be applied. When using monoclonal antibodies, use one or more monoclonal antibodies for proteins with repetitive structures such as hepatitis B surface antigen and antigens with multiple epitopes in the molecule such as CA19-9 antigen. it can. Further, two or more types having different recognition epitopes can be used in combination.
[0018]
As a method for immobilizing these substances on a solid phase carrier, a chemical adsorption method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, and an ion bond method is used.
Examples of the physical adsorption method include a method of directly immobilizing an antibody or antigen on a carrier particle, a method of chemically adsorbing to another protein such as albumin, and then adsorbing and immobilizing.
[0019]
The chemical loading method involves chemically modifying the amino group, carboxyl group, mercapto group, hydroxyl group, aldehyde group, epoxy group, etc. present on the surface of the carrier to bind to molecules such as antibodies and antigens. A method of directly immobilizing on a carrier using a functional group capable of binding, a method of immobilizing by introducing a spacer molecule (carbodiimide compound, etc.) by a chemical bond between a carrier and a molecule such as an antibody or an antigen, albumin Examples include a method in which an antibody, an antigen, or the like is bound to another protein, and then the protein is chemically bound to a carrier.
[0020]
(3) Reaction process
In the present invention, the solid phase carrier thus obtained is reacted with a substance to be measured, and the substance to be measured is immobilized via a substance that specifically binds to the substance to be measured immobilized on the carrier. Capture to the phase carrier. The reaction is preferably carried out by mixing in the liquid medium of the reaction vessel. In the case of an immunoassay, the reaction is carried out at a pH of 5 to 10, preferably about 7 to 9. In order to maintain the target pH, a buffer solution is usually used, and examples thereof include, but are not limited to, phosphoric acid and tris (hydroxymethyl) aminomethane.
[0021]
(4) Cleaning process
After the capture reaction, the reaction system including the solid phase carrier that captured the substance to be measured is washed, and B / F separation is performed to remove substances such as unreacted body fluid components and unreacted labels.
[0022]
Methods for washing / separating and removing unreacted substances from the solid support include centrifugation, filtration with a filter, and magnetic separation with a magnetic field.
For example, the solid phase carrier is collected by centrifugation or the like, and the liquid medium (supernatant) containing unreacted substances is removed by suction, or if necessary, the solid phase carrier is further suspended in an appropriate washing solution, stirred, and then centrifuged. It is possible to take a method such as separation by separation or the like and removing only the cleaning liquid by suction and repeating this operation several times. For magnetic separation, insoluble magnetic particles are used as the solid phase carrier, a magnetic field is applied to the reaction vessel containing the insoluble magnetic particles, and the magnetic particles are collected by adhering to the reaction vessel wall. This is carried out by repeating the operation of removing the supernatant after removing the supernatant after adding a suitable washing solution as required and applying a magnetic field in the same manner.
[0023]
(5) Measurement process
After the washing step, the measurement target substance captured on the solid phase carrier is measured. The measurement may be performed in the same manner as a normal immunoassay. For example, if the labeling substance is a chemiluminescent substance or a fluorescent dye, the substance to be measured can be measured by measuring the luminescence or fluorescence emitted by the labeling substance, and if the labeling substance is an enzyme, the enzyme activity is measured. . Further, when the labeling substance is a radioisotope (radioisotope), the radioactivity of the labeling substance may be measured.
[0024]
(6) Measuring method using insoluble magnetic particles
In the present invention, when the insoluble magnetic particles described above are used as the solid phase carrier, insoluble fluorescent dye-labeled particles on which a substance having the same specificity as the measurement target substance is immobilized as the labeling substance are measured based on the competition method. You can also take a method. The method includes the following steps.
(A) A substance to be measured is reacted with a solid phase carrier made of insoluble magnetic particles carrying a substance capable of binding specifically to the substance in a liquid medium in a reaction vessel, and the substance to be measured is made to be insoluble magnetic. A reaction process for capturing particles.
(B) A cleaning step in which the insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed by a cleaning operation.
(C) A step of reacting insoluble fluorescent dye-labeled particles carrying a substance having the same specificity as the substance to be measured with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in the step (b) in a liquid medium. .
(D) A washing step in which the insoluble magnetic particles in step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium and unreacted insoluble fluorescent dye-labeled particles are removed by a washing operation.
(E) A measurement step of measuring the substance to be measured by measuring the fluorescence intensity of the insoluble fluorescent dye-labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in the step (d).
[0025]
Any labeling dye can be used as the labeling dye used for the insoluble fluorescent dye labeling particles. For example, rare earth chelates such as europium (Eu), terbium (Tb), samarium (Sm), phycobiliproteins such as phycocyanin and phycoerythrin, fluorescein, tetramethylrhodamine, Texas red, 4-methylumbelliferin 7-amino-4-methylcoumarin and the like are used.
[0026]
The material of the insoluble carrier particles for performing the dye labeling is the same as described for the insoluble magnetic particles, such as a hydrophobic polymer such as polystyrene, polyacrylonitrile, polymethacrylonitrile, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid type. In addition to latex polymers such as resins, copolymers of monomers, gelatin, liposomes, biological components such as erythrocytes, metal colloidal particles such as gold colloids, and the like are used.
[0027]
As a method for supporting the fluorescent dye on the insoluble carrier particles, as described in JP-A-151755, for example, a method of chemically binding the fluorescent dye using a functional group on the particle surface, or polymerizing the particles. The method of adding a dye and encapsulating it inside the particle, the method of physically adsorbing and encapsulating it inside or on the surface of the particle, the physical or chemical combination of the dye with protein, peptide, etc. There are methods for immobilizing proteins and peptides on particles.
[0028]
On the fluorescent particles thus obtained, an antigen, an antibody, a nucleic acid or the like having the same specificity as the biologically active substance to be measured is physically or chemically immobilized as described above.
[0029]
In the present invention, “having specificity” means that when the substance to be measured is an antigen, it is recognized as non-self in the living body as being biologically or physiologically identical to the antigen described above, and It refers to all substances that lead to production. If the substance to be measured is an antibody, one that reacts with the immunoglobulin class of such an antibody, ie, an antibody against IgG, IgA, IgM, IgD, IgE or their light chain portion, protein A or complement component A substance having the ability to selectively recognize and bind to the characteristics of a certain type of antibody molecule, such as Clq, which is a type.
[0030]
In the above method using insoluble magnetic particles, an insoluble fluorescent dye label in which a substance having the same specificity as the substance to be measured is carried after the solid substance (insoluble magnetic particles) captures the substance to be measured in the sample. Particles are added and similarly captured and bound to the insoluble magnetic particles. At that time, the substance to be measured already captured by the insoluble magnetic particles inhibits the substance immobilized on the insoluble magnetic particles from being bound to the insoluble fluorescent dye-labeled particles. Therefore, since the amount of insoluble fluorescent dye-labeled particles captured by the solid phase carrier depends on the amount of the measurement target substance in the sample, the measurement target substance can be indirectly quantified by quantifying the fluorescent dye. .
[0031]
After the capture reaction, the solid phase carrier is washed and B / F separation is performed, and then the amount of the insoluble fluorescent dye-labeled particles captured on the obtained solid phase carrier is released by irradiating the excitation light inherent to the fluorescent dye. Measured by measuring the fluorescence intensity. For example, when Eu chelate is used as a labeling dye, excitation light is 300 to 380 nm or 240 to 270 mm ultraviolet light, and fluorescence is 600 to 630 nm (having a maximum value at 615 nm).
[0032]
(7) Correction
In the present invention, the measurement value obtained in the measurement step is corrected using the remaining amount of the solid phase carrier after the washing step as an index.
[0033]
The remaining amount of the solid phase carrier can be calculated by measuring the number or concentration of the solid phase carrier particles before and after washing. As a method for measuring the number of particles or the concentration of the solid phase carrier, when the solid phase carrier is latex particles, it is preferable to employ an optical method such as transmitted light measurement or scattered light measurement. In that case, light with a wavelength of 300 nm to 1100 nm is preferably used.
[0034]
Examples of a method of correcting the measurement value using the residual amount of the solid phase carrier as an index include a method of dividing the count value of the measurement result by the residual amount of the solid phase carrier. Alternatively, the count value of the measurement result may be divided by the remaining amount of the solid phase carrier and further multiplied by a certain value. This makes it possible to obtain measurement results that are not affected by variations in the remaining amount due to washing of the solid phase carrier.
[0035]
When quantifying a substance to be measured, perform measurement using a known or reference product as a sample in advance, obtain a calibration curve by graphically representing the obtained quantitative value with respect to the concentration of the sample, and use it to determine an unknown concentration sample. The concentration can be determined from the quantitative value.
[0036]
The fixed value multiplied for correction in the above may be an arbitrary number, for example, an average value of the remaining amount, a numerical value near the average value, or the like. However, it is necessary to use the same numerical value when correcting the fluorescence count of the measurement target substance (sample with unknown concentration) and when correcting the fluorescence count for preparing the calibration curve.
[0037]
【Example】
Examples of the present invention will be described below.
[0038]
[Example 1]
<Measurement of free thyroxine (FT4) by TR-FIA method>
(1) Preparation of reagents
(1) Preparation of magnetic latex reagent
A mouse anti-T4 monoclonal antibody was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on magnetic latex particles (material: polystyrene-divinylbenzene copolymer, average particle size: 0.7 μm) by carbodiimide according to a known method.
(2) Preparation of europium latex
Purified T4 was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on europium latex (material: polystyrene-divinylbenzene copolymer, average particle size: 0.4 μm) with carbodiimide according to a known method.
(3) Preparation of reaction buffer
Tris buffer: 0.2M (pH 7.0), gelatin (Ge1atin): 0.2%, NaN _Three : A solution containing 0.1% was prepared.
[0039]
(2) Measuring method
After reacting 100 μL of anti-T4 antibody-sensitized magnetic latex particles, 100 μL of the above reaction buffer, and 20 μL of the following FT4 standard product in a cuvette at 37 ° C. for 5 minutes, the cuvette was allowed to stand on a magnet for 1 minute. The magnetic latex particles were collected and the supernatant was aspirated and washed.
[0040]
Next, the magnetic latex particles trapped in the cuvette, 100 μL of T4 sensitized europium latex particles and 100 μL of the reaction buffer are reacted at 37 ° C. for 10 minutes, and allowed to stand on the magnet in the same manner for 1 minute, and then the supernatant. Was aspirated and washed.
[0041]
Next, the magnetic latex particles were dispersed in water, and the absorbance (540 nm) was measured with an absorptiometer, and at the same time, the fluorescence intensity was measured with a fluorescence intensity meter. The measurement was carried out 10 times each using a fully automatic TR-FIA measuring device (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) called LPIA · A-700, using FT4 standard products having the following concentrations.
[0042]
(FT4 standard product)
Ca1.A: 0.00ng / dL
Cal.B: 0.27ng / dL
Ca1.C: 0.67ng / dL
Ca1.D: 1.60ng / dL
Ca1.E: 2.83ng / dL
Ca1.F: 4.70ng / dL
Ca1.G: 6.47ng / dL
Ca1.H: 8.57ng / dL
[0043]
(3) Measurement results
Table 1 shows the fluorescence count values measured by the fluorescence intensity meter, Table 2 shows the converted concentrations, and Table 3 shows the final OD values. Concentration calculation was performed using a spline function with a fluorescence count value as a calibration curve.
[0044]
[Table 1]

[0045]
[Table 2]

[0046]
[Table 3]

[0047]
As shown in Table 2, it can be seen that CV% of the concentration exceeds 10% in a low concentration region such as Cal.B and Ca1.C. The following shows how the data is improved by the data correction method of the present invention using this data.
[0048]
(4) Data correction
The data in Table 1 was corrected by dividing by the OD value, and 0.7 was multiplied to obtain the corrected fluorescence count value. That is,
[0049]
[Expression 1]
Fluorescence count / OD value × 0.7
[0050]
The correction value of the fluorescence count was obtained by the following formula. The results are shown in Table 4.
Next, concentration calculation was performed in the same manner as described above using this fluorescence count correction value as a calibration curve. The results are shown in Table 5.
[0051]
[Table 4]

[0052]
[Table 5]

[0053]
(5) Consideration
As can be seen by comparing the data before correction (Tables 1 and 2) and the data after correction (Tables 4 and 5), the data correction processing of the present invention improves the CV% of the measured value, that is, the measurement reproducibility. In particular, it can be seen that CV% in Cal.B and Cal.C is within 10%.
[0054]
[Example 2]
<Measurement of total triiodothyronine (TT3) by TR-FIA method>
(1) Preparation of reagents
(1) Preparation of magnetic latex reagent
A sheep anti-T3 monoclonal antibody was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on magnetic latex particles (material: polystyrene-divinylbenzene copolymer, average particle size: 0.7 μm) with carbodiimide according to a known method.
(2) Preparation of europium latex
Purified T3 was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on europium latex (material: polystyrene-divirbenzene copolymer, average particle size: 0.4 μm) with carbodiimide according to a known method.
(3) Preparation of reaction buffer (1)
Barbita1 Na: 120 mM (pH 8.6), gelatin: 0.2%, NaN _Three : A solution containing 0.1%, ANS (8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid): 1 mM was prepared.
(4) Preparation of reaction buffer (2)
Tris buffer: 0.2 M (pH 7.0), gelatin: 0.2%, NaN _Three : A solution containing 0.1% was prepared.
[0055]
(2) Measurement
The following TT3 standard 20 μL, reaction buffer (1) 100 μL, and anti-T3 antibody-sensitized magnetic latex particles 100 μL were reacted in a cuvette at 37 ° C. for 5 minutes, and then the cuvette was left on the magnet for 1 minute. The magnetic latex particles were collected and the supernatant was aspirated and washed.
[0056]
Next, the magnetic latex particles trapped in the cuvette, 100 μL of T3 sensitized europium latex particles and 100 μL of the reaction buffer are reacted at 37 ° C. for 10 minutes. Went.
[0057]
Finally, the magnetic latex particles were dispersed in water, the absorbance was measured with an absorptiometer, and simultaneously the fluorescence intensity was measured with a fluorescence intensity meter. In the same manner as in Example 1, the measurement was carried out using TT3 standard products having the following concentrations in LPIA • A-700, and 10 measurements were performed.
[0058]
(TT3 standard product)
Cal.A ': 0.00ng / mL
Cal.B ': 0.50ng / mL
Cal.C ': 1.00ng / mL
Cal.D ': 1.98ng / mL
Cal.E ': 3.95ng / mL
Ca1.F ': 7.90ng / mL
[0059]
(3) Measurement results
Table 6 shows the fluorescence count value, Table 7 shows the converted concentration value, and Table 8 shows the final OD value. The concentration was calculated using a spline function with the fluorescence count value as a calibration curve.
[0060]
[Table 6]

[0061]
[Table 7]

[0062]
[Table 8]

[0063]
As shown in Table 7, it is understood that CV% of the concentration exceeds 10% in Ca1.B ′ and Ca1.F ′. The following shows how the data is improved by the data correction method of the present invention using this data.
[0064]
(4) Data correction
The data in Table 6 was corrected by dividing by the OD value, and 0.7 was multiplied to obtain the corrected value as the fluorescence count value after correction. That is,
[0065]
[Expression 2]
Fluorescence count / OD value × 0.7
[0066]
The correction value of the fluorescence count was obtained by the formula The results are shown in Table 9.
Next, concentration calculation was performed in the same manner as described above using this fluorescence count correction value as a calibration curve. The results are shown in Table 10.
[0067]
[Table 9]

[0068]
[Table 10]

[0069]
(5) Consideration
As can be seen by comparing the data before correction (Tables 6 and 7) with the data after correction (Tables 9 and 10), the data correction processing of the present invention improves the CV% of the measured value, that is, the measurement reproducibility. In particular, it can be seen that CV% at Cal.B ′ and Cal.F ′ is within 10%.
[0070]
[Example 3]
<Measurement of thyroid stimulating hormone (TSH) by TR-FIA method>
(1) Preparation of reagents
(1) Preparation of magnetic latex reagent
A mouse anti-TSH monoclonal antibody was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on a magnetic latex particle (material: polystyrene-divinylbenzene copolymer, average particle size: 1 μm) with carbodiimide according to a known method.
(2) Preparation of europium latex
A mouse anti-TSH monoclonal antibody was prepared by covalently bonding to a carboxyl group on europium latex (material: polystyrene-divinylbenzene copolymer, average particle size: 0.1 μm) with carbodiimide according to a known method.
(3) Preparation of reaction buffer
Tris buffer: 0.2 M (pH 7.0), gelatin: 0.2%, NaN _Three : A solution containing 0.1% was prepared.
[0071]
(2) Measuring method
The following TSH standard 70 μL, reaction buffer 100 μL and anti-TSH antibody-sensitized magnetic latex particles 100 μL were reacted in a cuppet at 37 ° C. for 5 minutes, and then the cuvette was allowed to stand on the magnet for 1 minute to form magnetic latex. The particles were collected and the supernatant was aspirated and washed.
[0072]
Next, the magnetic latex particles trapped in the cuvette, the anti-TSH antibody-sensitized europium latex particles (100 μL) and the reaction buffer (100 μL) are reacted at 37 ° C. for 10 minutes. Suction cleaning was performed.
[0073]
Next, the magnetic latex particles were dispersed in water, the absorbance was measured with an absorptiometer, and at the same time the fluorescence intensity was measured with a fluorescence intensity meter. In the same manner as in Example 1, the measurement was carried out 10 times in each of the LPIA · A-700 using TSH standard products having the following concentrations.
[0074]
(TSH standard product)
Cal.1: 0.00μIU / mL
Cal.2: 0.05μIU / mL
Cal.3: 0.1 μIU mL
Cal.4: 0.2 μIU / mL
Cal.5: 1.0 μIU / mL
Cal.6: 10 μIU mL
Cal.7: 50 μIU / mL
Ca1.8: 80 μIU no mL
[0075]
The concentration was calculated by regressing a TSH standard product as follows.
Cal.1 to Ca1.4: Straight line
Ca1.4 to Ca1.6: Parabola (logarithm)
Cal.6 to Cal.8: Parabola (logarithm)
[0076]
(3) Measurement results
The fluorescence count value is shown in Table 11, the converted concentration value is shown in Table 12, and the final OD value is shown in Table 13, respectively.
[0077]
[Table 11]

[0078]
[Table 12]

[0079]
[Table 13]

[0080]
(4) Data correction
Correction was made by dividing the data in Table 11 by the OD value, and the obtained value was multiplied by 0.3 to obtain the corrected fluorescence count value. That is,
[0081]
[Equation 3]
Fluorescence count / OD value × 0.3
[0082]
The correction value of the fluorescence count was obtained by the formula The results are shown in Table 14.
Next, concentration calculation was performed in the same manner as described above using this fluorescence count correction value as a calibration curve. The results are shown in Table 15.
[0083]
[Table 14]

[0084]
[Table 15]

[0085]
(5) Consideration
By the data correction processing of the present invention, CV% was improved over almost the entire region.
[0086]
【The invention's effect】
According to the present invention, in a method for measuring a substance having a washing step using a solid phase carrier, the measurement reproduction is corrected by correcting the variation in the measurement result caused by the variation in the remaining amount of the solid phase carrier after the B / F separation. Can improve sex. Therefore, it is possible to further improve the measurement accuracy of the clinical test method and the like.

Claims

A reaction step for performing a capture reaction for capturing a substance to be measured on a particulate solid phase carrier, a washing step for performing B / F separation by washing the reaction system containing the solid phase carrier, and a solid phase carrier. In a method for measuring a substance comprising a measuring step for measuring the substance,
A measurement method comprising correcting the measurement value in the measurement step using the remaining amount of the solid phase carrier after the washing step as an index.

The measurement method according to claim 1, wherein the substance to be measured is an antigen or an antibody.

The measurement method according to claim 1, wherein the solid phase carrier is a fine particle having an average particle diameter of 0.1 to 10 μm.

The measurement method according to claim 1, wherein the remaining amount is obtained by optically measuring the number of particles of the solid phase carrier.

(A) A substance to be measured is reacted with a solid phase carrier made of insoluble magnetic particles carrying a substance capable of binding specifically to the substance in a liquid medium in a reaction vessel, and the substance to be measured is made to be insoluble magnetic. A reaction process for trapping particles,
(B) a cleaning step in which the insoluble magnetic particles after the reaction in step (a) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium is removed by a cleaning operation;
(C) A step of reacting insoluble fluorescent dye-labeled particles carrying a substance having the same specificity as the substance to be measured with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in the step (b) in a liquid medium. ,
(D) A cleaning step in which the insoluble magnetic particles in step (c) are attached to the reaction vessel wall by the action of a magnetic field, and the liquid medium and unreacted insoluble fluorescent dye-labeled particles are removed by a cleaning operation, and (e) step A measurement step of measuring the substance to be measured by measuring the fluorescence intensity of the insoluble fluorescent dye-labeled particles reacted with the insoluble magnetic particles attached to the reaction vessel wall in (d),
In the method for measuring a substance containing, the measurement value in the step (e) is corrected using the residual amount of insoluble magnetic particles after the washing operation in the step (b) and / or (d) as an index, The measuring method in any one of Claims 1-4.