JP3656952B2 - Method for detecting risk of developing secondary AA-amyloidosis in patients with rheumatoid arthritis and novel oligonucleotide containing single nucleotide polymorphism at SAA1 locus - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性関節リウマチ患者における続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率の検出方法及びＳＡＡ１遺伝子座における一塩基多型を含む新規オリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの器官疾患を引き起こす原因になりうる続発性ＡＡ−アミロイドーシスは、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）の最も深刻な合併症の一つであり、腎障害や消化管機能不全をきたすことにより、その予後に重大な影響を及ぼす（Ｏｋｕｄａ Ｙ．ら，１９９７，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．，５６，５３５−５４１）。臨床的には、この合併症はリウマチの長年に渡って続く重篤な炎症の一つである。なお、アミロイドーシスとは、アミロイドが全身の諸臓器に沈着するために起こる疾患を指し、沈着しているタンパク質の成分の違いから、ＡＡ−アミロイドーシスやＡＬ−アミロイードシスなどに分類されることがある。ＡＡ−アミロイドーシスにおいて沈着が認められるＡＡ−アミロイドは、関節リウマチや結核の経過中に認められる。
【０００３】
全ての慢性リウマチが続発性ＡＡ−アミロイドーシスを合併するわけではなく、また、慢性リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシスの罹患率は、異なった人種間グループでかなり多様である［Ｏｋｕｄａ Ｙら，１９９４，Ｒｙｕｍａｃｈｉ，３４，９３９−９４６；ＭｙＩｌｙｋａｎｇａｓ−Ｌｕｏｓｕｊａｒｖｉ Ｒら，１９９９，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ），３８，４９９−５０３；Ｂｅｎｓｏｎ ＭＤ．，１９９７，Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｋｏｏｐｍａｎ ＷＪ．（ｅｄ．），１６６１−１６８６；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ−Ｓｏｓｎｏｗｓｋａら，１９８７，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，２１，６９９−７０３］。異なった人種のグループ間で、続発性ＡＡ−アミロイドーシスの罹患率の違いが、遺伝的背景によるものか、または環境的要因によるものかどうか未だ分かっていないが、何らかの疾患感受性を規定する要因が存在するものと考えられている。
【０００４】
１１番染色体の短腕部ｐ１５．１（Ｓｅｌｌａｒ ＧＣら，１９９３，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，７７４−７７６）にあるヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）遺伝子クラスターは、１５０ｋｂ領域内に４種の遺伝子（ＳＡＡ１〜ＳＡＡ４）を含んでいる（Ｓｅｌｌａｒ ＧＣら，１９９４，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５，４９２−４９５）。ＳＡＡ１遺伝子及びＳＡＡ２遺伝子は、急性期ＳＡＡと呼ばれるＳＡＡ１タンパク質及びＳＡＡ２タンパク質をそれぞれコードし、ＳＡＡ４遺伝子は、恒常的に発現しているＳＡＡ（ＳＡＡ４タンパク質）をコードしている。ＳＡＡ３遺伝子は偽遺伝子である。急性期ＳＡＡタンパク質は、炎症の初期に肝臓において産生され、その濃度は約１０００倍に達するというもので、そのタンパク量のピークは維持される。ＳＡＡ１遺伝子のエキソン３における２つの一塩基多型（２９９５Ｃ／Ｔと３０１０Ｃ／Ｔ）のコンビネーションによって、ＳＡＡ１α、ＳＡＡ１β、及びＳＡＡ１γという３つの異なったハプロタイプが認められる（Ｓｉｐｅ ＪＤら，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，２９３１−２９３６；Ｂｅａｃｈ ＣＭら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２８２，６１５−６２０；Ｂａｂａ Ｓら，１９９３，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０３，３６１−３６６）。
【０００５】
馬場（Ｂａｂａ）らは、アミロイドーシスの亢進とＳＡＡ１における遺伝子型との相関を示した。つまり、日本人の慢性リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス症例において、正常日本人と比較し、ＳＡＡ１γハプロタイプが高頻度に認められることを報告した（Ｂａｂａ Ｓら，１９９５，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，４，１０８３−７）。本発明者もまた、ＳＡＡ１γのアレルがＲＡ患者に対し、アミロイドーシスの危険因子であったことを確かめ、ＳＡＡ１γホモ接合体のＲＡ患者におけるアミロイドーシスの亢進に対する見かけの相対的危険率は４．４８と評価し、また、ＳＡＡ１αアレルはアミロイドーシスの亢進に阻害効果を持っているようであった（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｍら，１９９９，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，１０５，３６０−３６６）。しかし、逆にブース（Ｂｏｏｔｈ）らは、ＳＡＡ１αアレルが白人種においてアミロイドーシスを亢進する危険因子であることを示した（Ｂｏｏｔｈ ＤＲら，１９９８，Ａｍｙｌｏｉｄ，５，２６２−２６５）。
【０００６】
これまで述べた知見以外にも、アミロイドーシスとＳＡＡ遺伝子に関連して、以下の知見が知られている。例えば、アミロイドーシスである患者において測定された血清Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ：炎症性疾患において、血中濃度が鋭敏に上昇し、病態の改善後、速やかに低下するタンパク質）の平均値が、ＳＡＡ１遺伝子座における遺伝子型と関係している（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｍら，１９９９，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，１０５，３６０−３６６）。
また、ＳＡＡ生合成の増加は主に転写レベルで調節されている（ＬｏｗｅｌｌＣＡら，１９８６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６１，８４５３−５４６１）。近年の研究において、ヒトＳＡＡ２遺伝子の転写は、多くのプロモーターとエンハンサーエレメントの協調によって発現が誘導される方向に制御されていることが明らかになっている（Ｂｅｔｔｓ ＪＣら，１９９３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６８，２５６２４−２３６３１；ＵｈＩａｒ ＣＭら，１９９７，Ｊ Ｉｍｍｕｍｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０３，１２３−３０；ＬｏｎｇｌｅｙＤＢら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，４５３７−４５４５；ＵｈＩａｒ ＣＭら，１９９９，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４９，３９９−４０４）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、ＳＡＡ１ハプロタイプよりも更に強く、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患と関連している一塩基多型を鋭意探索したところ、ＳＡＡ１遺伝子の５’末端隣接領域に、これまで全く知られていなかった３種類の一塩基多型（−６１Ｃ／Ｇ，−１３Ｔ／Ｃ，−２Ｇ／Ａ）を新たに発見した。しかも、この内の１つ（−１３Ｔ／Ｃ）が、ＳＡＡ１γハプロタイプと強い連鎖不平衡を示し、ＳＡＡ１γハプロタイプよりも、続発性ＡＡ−アミロイドーシスと関連していることを新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＳＡＡ１ハプロタイプよりも、より一般的な一塩基多型により、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を検出することのできる方法、及び前記方法においてプローブとして使用することのできる新規オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ１）遺伝子の−１３番目の塩基がチミン（Ｔ）であるかシトシン（Ｃ）であるかを決定することにより、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を検出する方法によって解決することができる。
また、本発明は、ヒト血清アミロイドＡ遺伝子の−１３番目の塩基の組合せが、チミン−チミンのホモ接合体であるか、チミン−シトシンのヘテロ接合体であるか、あるいは、シトシン−シトシンのホモ接合体であるかを決定することにより、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を検出する方法に関する。
また、本発明は、配列表の配列番号９又は１０の配列で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにも関する。
更に、本発明は、配列表の配列番号９又は１０の配列で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるヒト血清アミロイドＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定するためのプローブにも関する。
【００１０】
本明細書においては、或る遺伝子（例えば、ＳＡＡ遺伝子）におけるＸ番目の塩基を、その位置を示す数字Ｘと、塩基を表わす記号１又はそれ以上との組合せで示すことがある。例えば、「−１３Ｔ」とは、−１３番目の位置にあるＴを示し、「−１３Ｃ」とは、−１３番目の位置にあるＣを示し、「−１３Ｔ／Ｃ」とは、−１３番目の位置にあるＴ又はＣを示す。
【００１１】
本明細書において、「多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合、それらの対立遺伝子を指す。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は、選択された集団の１％より大きな頻度（好ましくは、１０％以上の頻度）で存在する。
【００１２】
「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より頻繁に近傍の特定対立遺伝子と出現する関係のことをいう。
例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａ及びｂ（これらは等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃ及びｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０．２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまり、ａｃという特定の遺伝子型がより頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。
【００１３】
連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択、あるいは、集団に導入された時期が進化的に見て最近であることにより生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては、連鎖不平衡の様式は異なり、或る集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係であり得る。連鎖不平衡における多型は、該多型が疾患を引き起こさないにも関わらず、疾患に対する感受性を検出することにおいて有効であり得る。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａが疾患の原因遺伝子要素ではないが、Ｙ遺伝子座の対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。
【００１４】
本明細書における「オリゴヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオシドのみからなるオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオシド及び／又は修飾リボヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド）からなるオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、あるいは、デオキシリボヌクレオシドとリボヌクレオシド（及び／又は修飾リボヌクレオシド）との両方からなるキメラオリゴリボ／デオキシリボヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡ）が含まれる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の検出方法においては、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）遺伝子の−１３番目の塩基における多型を決定し、その塩基の種類に基づいて、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を検出する。ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基がＴである場合には、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が高いと判断することができる。また、前記塩基がＣである場合には、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が低いと判断することができる。
【００１６】
また、ヒト血清アミロイドＡ遺伝子の−１３番目の塩基の組合せが、チミン−チミンのホモ接合体であるか、あるいは、チミン−シトシンのヘテロ接合体である場合には、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が高いと判断することができる。また、前記塩基の組合せが、シトシン−シトシンのホモ接合体である場合には、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が低いと判断することができる。
【００１７】
本発明の検出方法においてＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定する方法としては、例えば、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ ＲＫら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１６３−１６６；以下、ＰＣＲと称する）により、−１３番目の塩基を含むＳＡＡ遺伝子の部分断片を増幅した後、その部分断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列を直接決定するダイレクトシークエンス法、（２）前記ＰＣＲ産物に対して、本発明のプローブを用いて実施するハイブリダイゼーション法、あるいは、（３）前記ＰＣＲ産物に対して、制限酵素ＡｃｉＩを用いて実施する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法を挙げることができる。
【００１８】
−１３番目の塩基を含むＳＡＡ遺伝子の部分断片をＰＣＲ法により増幅する際に使用するプライマーは、−１３番目の塩基を含むＳＡＡ遺伝子の部分断片を増幅可能なプライマーである限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ＳＡＡ遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。このようなプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列からなるバックプライマーとの組合せを挙げることができ、これらのプライマーを用いてＰＣＲ法を実施すると、ＳＡＡ遺伝子における−２７７番目の塩基〜２６番目の塩基からなる部分断片（３０３ｂｐ）を得ることができる。
【００１９】
ＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンス法（１）においては、例えば、ＰＣＲに用いたプライマーと同じプライマーを使用して実施することができる。
【００２０】
ＰＣＲ産物に対して実施するハイブリダイゼーション法（２）においては、これに限定されるものではないが、プローブとして、例えば、本発明のプローブを用いることができる。
【００２１】
本発明の第１のプローブは、配列表の配列番号９の配列で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド［好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）］からなる。配列表の配列番号９の配列で表される塩基配列は、ＳＡＡ１遺伝子座における−１３Ｔ一塩基多型を含み、しかも、その多型位置がプローブの中心に配置されている。本発明の第１のプローブは、−１３Ｔ特異的プローブである。
本発明の第１のプローブとしては、例えば、本発明による配列表の配列番号９の配列で表される塩基配列からなる１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）、あるいは、配列表の配列番号９の配列で表される塩基配列の５’側末端及び／又は３’側末端に塩基数１又はそれ以上からなる塩基配列が付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を挙げることができる。本発明の第１のプローブとしては、１５ｍｅｒ〜１９ｍｅｒであることが好ましい。
【００２２】
本発明の第２のプローブは、配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド［好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）］からなる。配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列は、ＳＡＡ１遺伝子座における−１３Ｃ一塩基多型を含み、しかも、その多型位置がプローブの中心に配置されている。本発明の第２のプローブは、−１３Ｃ特異的プローブである。
本発明の第２のプローブとしては、例えば、本発明による配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列からなる１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）、あるいは、配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列の５’側末端及び／又は３’側末端に塩基数１又はそれ以上からなる塩基配列が付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を挙げることができる。本発明の第２のプローブとしては、１５ｍｅｒ〜１９ｍｅｒであることが好ましい。
【００２３】
本発明による第１プローブ及び第２プローブを用いると、以下に示す手順に限定されるものではないが、前記ＰＣＲ産物との特異的なハイブリダイゼーションの有無を調べることにより、ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定する（すなわち、−１３Ｔ多型を検出する）ことができる。
例えば、被験者由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列からなるバックプライマーとの組合せを用いて調製したＰＣＲ産物を、ポリアミドメンブレンにスポットした後、アルカリ処理にて固定する。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰにより標識した本発明による第１のプローブ（−１３Ｔ特異的プローブ）を、ハイブリダイゼーション用溶液（例えば、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ；クローンテック社）中において３７℃で２時間ハイブリダイズ反応させ、その後、２×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び０．０５％ＳＤＳを含有する洗浄溶液中において３７℃で３０分間の洗浄を２回行ない、更に、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液中で４２℃の洗浄（１０分間）と、更に５８℃での洗浄（１０分間）とを続けて行なう。コントロール用として、本発明による第２のプローブ（対立遺伝子−１３Ｃ特異的プローブ）を用いること以外は、前記操作を繰り返し、本発明による第１のプローブ（−１３Ｔ特異的プローブ）を用いた場合のハイブリダイゼーション強度と、本発明による第２のプローブ（−１３Ｃ特異的プローブ）を用いた場合のハイブリダイゼーション強度との間の顕著な差を検出することにより、−１３Ｔ多型の存在を検出することができる。
【００２４】
ＰＣＲ産物に対して制限酵素ＡｃｉＩを用いて実施するＲＦＬＰ法（３）においては、例えば、ＰＣＲ用プライマーとして、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列からなるバックプライマーとの組合せを用いた場合には、以下の判定基準により、ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定することができる。すなわち、ＰＣＲ法により得られたＰＣＲ産物（３０３ｂｐ）を制限酵素ＡｃｉＩを用いて切断した場合に、２７６ｂｐの断片が生成されれば、−１３Ｔであると判断することができ、一方、２５４ｂｐの断片が生成されれば、−１３Ｃであると判断することができる。
【００２５】
本発明の検出方法においては、これまで具体的に説明した３種類の方法以外にも、公知の一般的な多型検出法に基づいて、ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定することができる。
このような公知方法としては、多型特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションを基本とする方法、鋳型特的なプライマーからポリメラーゼによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（例えば、ダイデオキシヌクレオチドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、あるいは、取り込まれたダイデオキシヌクレオチドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、あるいは、鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対又は非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などを挙げることができる。
【００２６】
前記の多型特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションを基本とする方法としては、例えば、チップ、ガラススライド、又はナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する方法、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメラーゼが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、或る種の２本鎖特的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことによって２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、あるいは、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法などを挙げることができる。
【００２７】
遺伝子型の決定方法（すなわち、ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定する方法）におけるこれらの基本的な検出法は、公知の方法［例えば、Ｂｒｕｃｅ，Ｂら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ／Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ．４），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ．，１９９９など］に従えば、実施可能であるが、多型遺伝子型決定方法に関しては、現在様々な方法が開発されており、ここで述べたものに限定されるわけではない。
【００２８】
更には、一本鎖高次構造多型解析（Ｏｒｉｔａ Ｍら，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６，２７６６−２７７０；以下、ＳＳＣＰと称する）、変性高圧液体クロマトグラフィー（Ｈｕｂｅｒ ＣＧら，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，１０６１−１０６６；以下、ｄＨＰＬＣと称する）、変性勾配ゲル電気泳動法（Ｃａｒｉｅｌｌｏ ＮＦ及びＳｋｏｐｅｋ ＴＲ，１９９３，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３−１１２；以下、ＤＧＧＥと称する）、あるいは、混合ＤＮＡにより形成されるヘテロ２本鎖の化学的又は酵素的切断法（Ｄｅａｎ Ｍ，１９９５，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，９，１０３−１０４）によっても、ＳＡＡ遺伝子の−１３番目の塩基を決定することができる。
【００２９】
ＳＳＣＰでは、ＤＮＡを加熱又はホルムアルデヒド等により変性させ、１本鎖にした後、電気泳動を行なう。１本鎖は再び折り畳まれ、部分的に塩基配列特異的な２次構造を形成し、この構造の相違が電気泳動速度の変化を引き起こし、変異の有無を検出可能とする。
ｄＨＰＬＣでは、一度変性した後、再び会合させたＤＮＡを変性開始温度付近でカラムを通して分離すると、多型がある場合には、その部分が異なるヘテロ２本鎖が形成され、ホモ２本鎖と移動度が異なることから、変異の検出が可能となる。
ＤＧＧＥでは、溶液における異なる配列依存性溶融特性及びＤＮＡの電気泳動移動度に基づいて変異を同定することができる。
また、混合ＤＮＡにより形成されるヘテロ２本鎖の化学的又は酵素的切断法では、切断の有無に基づいて多型の同定が可能になる。
【００３０】
本発明の検出方法は、ＳＡＡ１遺伝子の−１３番目の塩基における多型（−１３Ｔ）が、公知のＳＡＡ１γハプロタイプよりも、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患と強く相関しているとの発見に基づくものである。この発見は、これに限定されるものではないが、例えば、以下に示す方法により導き出すことができる。
一般に関連解析では、患者集団とコントロール集団（健常者集団）とで、特定のマーカー対立遺伝子の頻度を比較することにより、疾患とマーカーとの関連を検出することができる。すなわち、或る特定の一塩基多型の頻度について、罹患者と健常者とを比較し、特定の多型と罹患者及び健常者との関係を統計的に推測し、一塩基多型と疾患との関連の有無を評価することができる。
比較すべき項目は、遺伝子型の頻度、アレル頻度、問題にしている一塩基多型を持っている場合の罹患頻度（ポジティビティー）、そして、問題にしている一塩基多型を持っていない場合に罹患していない頻度（リバースポジティビティー）である。それぞれの多型に関して、各項目を罹患者と対照群とで、カイ二乗検定法又はフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の直接確率検定法を用いて評価することにより、同多型の疾患への関与の程度の推測が可能となる。
【００３１】
関連性の程度は、公算比（オッズ比）を用いても表現可能である。例えば、ある事象が確率ｐで起こるとき、比ｐ／（１−Ｐ）をオッズという。このオッズの比であるオッズ比の有意性の検定（統計解析）には、カイ二乗検定、フィッシャーの直接確率検定法、又はブレスロー−ディー（Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ）検定法などが用いられる。ハプロタイプ頻度は、公知のソフトウエア［例えば、Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ（ＥＨ）ソフトウエア（ｆｔｐ：／／ｌｉｎｋａｇｅ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｈ）］などを用いて、推測することができるが、これに限られるわけではない。
【００３２】
本発明者において見出された知見［すなわち、ＳＡＡ１遺伝子の−１３番目の塩基における多型（−１３Ｔ）が、公知のＳＡＡ１γハプロタイプよりも、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患と強く相関しているとの知見］によれば、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシスの治療薬又は予防薬のスクリーニング系の可能性を示唆する。
【００３３】
例えば、−１３Ｔ多型が遺伝子のプロモーター領域に位置する場合、前記一塩基多型によって引き起こされるプロモーター活性の強弱により、前記遺伝子産物の量の変化が起こり、この変化が疾患危険率を変化させる可能性を示唆する。すなわち、特定の多型によりプロモーター活性が強められ、遺伝子発現が増強されることが疾患罹患リスクを高めるのであるならば、前記一塩基多型を含むプロモーターを用い、そのプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子などの適切なレポーター遺伝子を挿入した系を構築し、前記レポーター発現遺伝子を適切な細胞（この場合は、ＳＡＡ１遺伝子発現が報告されている肝臓由来の細胞）に導入し、ＩＬ−１やＴＮＦαなどの炎症性刺激に応答して誘導のかかるレポーター活性を指標にして、細胞系に添加することによって、レポーター活性の誘導を阻害する物質を選択すればよい。
あるいは、ＳＡＡ１遺伝子産物に対する抗体を用いることにより、発現したＳＡＡ１遺伝子産物の量を定量可能になるので、このＥＬＩＳＡ系を用いて、発現細胞に化合物を加えるスクリーニング系にてタンパク質発現の誘導を阻害する物質を選択すればよい。
【００３４】
また、本発明者において見出された前記知見によれば、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシスの治療薬又は予防薬候補物質に関する臨床試験の対象集団を効果的に選別することが可能と思われる。すなわち、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシスの治療薬又は予防薬候補物質の臨床試験を行なう場合に、同多型を有する集団とコントロール集団とで行うことが考えられる。このように、遺伝的に均一な集団を選択し、その集団を臨床試験へ使用すると、遺伝的要因の不均一性に起因する結果の変動を減少又は排除することができるので、被験者数の軽減による必要コストを低減することができることは勿論のこと、潜在的な薬物の有効性を、より正確に評価することが可能となる。
【００３５】
更に、本発明者において見出された前記知見によれば、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患素因保持者を効果的に選別することができ、従って、罹患者への治療薬又は予防薬を適切に選択することが可能と思われる。
例えば、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患素因保持者又は罹患者に対して、前記一塩基多型を決定することにより、素因保持者に対しては、例えば、食事又は運動などの生活様式を変化させることができる。また、予防薬が存在する場合には、予防薬の投与を開始することの動機付けを行なうこともできる。更に、治療薬が存在する場合には、多型の存在を確認し、患者の状態のモニタリングを行なうことにより、発症後の迅速な薬物投与を行なうことができる。
【００３６】
【データ解析例】
以下、ＳＡＡ１遺伝子の−１３Ｔ／Ｃが、ＳＡＡ１γハプロタイプよりも、続発性ＡＡ−アミロイドーシスと関連している事実を、本発明者が確定したデータ解析を具体的に説明する。
（１）ＳＡＡ１遺伝子周辺多型の検出
ＳＡＡ１遺伝子配列及びＳＡＡ２遺伝子配列は、それぞれ、データベース［ＳＡＡ１遺伝子：Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ． Ｘ５６６５２（Ｂｅｔｔｓ，Ｊ．Ｃ．ら，１９９１，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４，４７１−４８２）；ＳＡＡ２遺伝子配列：Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ． Ｌ０５９２１（Ｓｔｅｅｌ，Ｄ．Ｍ．ら，１９９３，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，４４７−４５４）］から得た配列を用いた。
【００３７】
多型を検索するために、ＰＣＲにより増幅させた領域は、ＳＡＡ１遺伝子の５’末端上流の２箇所、ＳＡＡ１遺伝子のエキソン３の一部からエキソン４の一部を含む領域、そして、ＳＡＡ２遺伝子のエキソン４の一部の計４箇所であった。ＳＡＡ１遺伝子の５’末端上流２箇所の具体的な位置は、エキソン１のキャップサイトから番号を付けると、それぞれ、−７１２番目の塩基〜−１８５番目の塩基からなる５２８ｂｐの領域（以下、ＰＣＲ産物１と称する）と、−２７７番目の塩基〜２６番目の塩基からなる３０３ｂｐの領域（以下、ＰＣＲ産物２と称する）であった。同様に、ＳＡＡ２遺伝子のエキソン３の一部は、２９１９番目の塩基〜３４３６番目の塩基からなる５１８ｂｐの領域（以下、ＰＣＲ産物３と称する）であった。また、ＳＡＡ２遺伝子のエキソン４は、エキソン１のキャップサイトから番号を付けると、３１３０番目の塩基〜３２４４番目の塩基からなる１１５ｂｐの領域（以下、ＰＣＲ産物４と称する）であった。
【００３８】
ＰＣＲ産物１を増幅するために用いたプライマーＤＮＡは、
フォワードプライマー：ＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧ（配列番号１：−７１２番目の塩基〜−６９３番目の塩基に対応）及び
リバースプライマー：ＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号２：−２０４番目の塩基〜−１８５番目の塩基に対応）
の組合せであった。
以下、同様に、ＰＣＲ産物２を増幅するために用いたプライマーＤＮＡは、
フォワードプライマー：ＣＴＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣ（配列番号３：−２７７番目の塩基〜−２５８番目の塩基に対応）及び
リバースプライマー：ＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＧ（配列番号４：７番目の塩基〜２６番目の塩基に対応）
の組合せであり、
ＰＣＲ産物３を増幅するために用いたプライマーＤＮＡは、
フォワードプライマー：ＧＣＣＡＡＴＴＡＣＡＴＣＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号５：２９１９番目の塩基〜２９３７番目の塩基に対応）及び
リバースプライマー：ＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＧＡＴ（配列番号６：３４１７番目の塩基〜３４３６番目の塩基に対応）
の組合せであり、
ＰＣＲ産物４を増幅するために用いたプライマーＤＮＡは、
フォワードプライマー：ＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号７：３１３０番目の塩基〜３１５４番目の塩基に対応）及び
リバースプライマー：ＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＧＡＴ（配列番号８：３２２５番目の塩基〜３２４４番目の塩基に対応）
の組合せであった。
【００３９】
ＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡ２００〜３００ｎｇを鋳型とし、０．５Ｕ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ｄＮＴＰｓ（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、プライマー（０．５μＭ）、及び１Ｘ ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ ＨＣＩ（ｐＨ ８．３），１．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ2，５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣＩ］を用い、総容量５０μＬの系で行なった。
【００４０】
ＰＣＲ産物１の条件は、次の通りである。すなわち、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、６１℃で１分間、及び７２℃で１分間からなるサイクルを３５サイクル実施し、更に７２℃で５分間反応させた。
ＰＣＲ産物２の条件は、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、６４℃で１分間、及び７２℃で３０秒間からなるサイクルを３５サイクル実施し、更に７２℃で５分間反応させた。
ＰＣＲ産物３及び４の条件は、９４℃で４分間反応させた後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、及び７２℃で３０秒間からなるサイクルを３５サイクル実施し、更に７２℃で５分間反応させた。
ＰＣＲ増幅に用いる鋳型は、ＤＮＡサンプル提供者の末梢白血球より、常法に従い、ゲノムＤＮＡを抽出したものを用いた。
【００４１】
ＰＣＲ産物の多型のスクリーニングでは、１２人のリウマチ患者のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、前出の論文（Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｍら，１９９９，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，１０５，３６０−３６６）に従ってＰＣＲ−ＳＳＣＰを行なった。これら１２人の内訳は、ＳＡＡ１α、ＳＡＡ１β、及びＳＡＡ１γのホモ接合３種につき、それぞれ４人ずつである。
多型部位の特定は、ＳＳＣＰを行なった後、多型の存在が示されたＰＣＲ産物について、シーケンサー（ＡＢＩ３７３Ａ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）及びシークエンスキット（Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｋｉｔ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列を決定することにより行なった。
【００４２】
この結果、ＳＡＡ１遺伝子をコードしている領域の５’末端上流に、−６１番目の塩基におけるＣ／Ｇの多型（以下、−６１Ｃ／Ｇと称する）、−１３番目の塩基におけるＴ／Ｃの多型（以下、−１３Ｔ／Ｃと称する）、そして、−２番目の塩基におけるＧ／Ａの多型（以下、−２Ｇ／Ａと称する）の３個の新規一塩基多型部位を見出した。これらは全てＰＣＲ産物２上に含まれていた。なお、公知の一塩基多型部位として、ＰＣＲ産物３上における２９９５番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型（以下、２９９５Ｃ／Ｔと称する）及び３０３０番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型（以下、３０３０Ｃ／Ｔと称する）、並びにＰＣＲ産物４上の３１５６番目の塩基におけるＡ／Ｇの多型（以下、３１５６Ａ／Ｇと称する）も確認した。
【００４３】
（２）遺伝子多型の頻度解析に用いたゲノムＤＮＡサンプルの準備
遺伝子型の頻度解析では、４４人の続発性ＡＡ−アミロイドーシス患者（アミロイド群）、５５人の初期リウマチ患者（リウマチ群）、及び５８人の健常者群（コントロール群）から、遺伝子解析用としてＤＮＡサンプルの提供を受けた。
【００４４】
続発性ＡＡ−アミロイドーシス患者については、生体組織検査標本をコンゴレッド（ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ）染色し、偏光顕微鏡下に緑色複屈折性を確認し、アミロイドＡタンパク質に対する抗血清で染色し、ＡＡ−アミロイドの蓄積を確認することにより診断を確定した。
５５人の初期リウマチ患者は、ＤＮＡサンプルの提供を受けた時点で、５年未満のリウマチ罹患歴を持つ患者からなる。ＲＡ罹患期間が５年未満の患者を選択することにより、全てのリウマチ患者の中でなるべく偏っていない集団を得ることができる。
アミロイド群及びリウマチ群の全ての患者は、アメリカリウマチ協会により１９８７年に改訂されたリウマチとしての分類基準を全て満たす。
【００４５】
また、白色人種における多型をスクリーニングするために、白色人種５０人分のＤＮＡパネルを購入した（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）。このパネルは、次のサンプルよりなりたっている。すなわち、ＧＭ００１３０、ＧＭ００１３１、ＧＭ００５３６、ＧＭ００５４６、ＧＭ００５５８、ＧＭ００６０７、ＧＭ００６２１、ＧＭ００８９３、ＧＭ００９２２、ＧＭ００９４６、ＧＭ０１０５６、ＧＭ０１３１０、ＧＭ０１８０５、ＧＭ０１８０６、ＧＭ０１８１４、ＧＭ０１９５３、ＧＭ０１９５４、ＧＭ０１９９０、ＧＭ０２１３１、ＧＭ０２１８４、ＧＭ０２２５４、ＧＭ０３６５７、ＧＭ０５１６１、ＧＭ０５９２０、ＧＭ０６３１５、ＧＭ０６８６１、ＧＭ０８２２８、ＣＭ０８４２８、ＧＭ０８５８７、ＧＭ０９０９１、ＧＭ０９１９６、ＧＭ０９３０６、ＧＭ０９８９９、ＧＭ０９９４７、ＧＭ０９９４８、ＧＭ１０９５９、ＧＭ１１８５４、ＧＭ１２５９３、ＧＭ１３０６９、ＧＭ１３０７０、ＧＭ１３７６８、ＧＭ１４４４８、ＧＭ１４４９２、ＧＭ１４５４７、ＧＭ１４５４８、ＧＭ１４６７３、ＧＭ１４６９３、ＧＭ１４７５３、ＧＭ１４７８２、及びＧＭ１４８０７である。
【００４６】
（３）遺伝子多型の頻度解析
ＳＡＡ１遺伝子の５’末端上流に見出された新規一塩基多型−６１Ｃ／Ｇ、−１３Ｔ／Ｃ、及び−２Ｇ／Ａの遺伝子型決定は、それぞれ、制限酵素ＭｎｌＩ、ＡｃｉＩ、及びＣａｃ８Ｉを用いたＲＦＬＰ解析により決定した。また、既に報告のある２９９５Ｃ／Ｔ、３０１０Ｃ／Ｔ、及び３１５６Ａ／Ｇについては、それぞれ、制限酵素ＢａｎＩ、ＢｃｌＩ、及びＮｃｏＩを用いたＲＦＬＰ解析により決定した。
【００４７】
これらのＲＦＬＰ解析により、４４人の続発性ＡＡ−アミロイドーシス患者（アミロイド群）、５５人の初期リウマチ患者（リウマチ群）、及び５８人の健常者群（コントロール群）の遺伝子型を決定し、その結果を表１にまとめた。
【００４８】
一般的な関連解析を用いて、これらの６個の一塩基多型が続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患の危険性に関与するかどうを検討した。つまり、表１に示すデータに基づいて、アミロイド群とリウマチ群について、各一塩基多型のアリル数、特定塩基のポジティビティー、特定塩基のリバースポジティビティー、及び遺伝子型についてのカイ二乗値を求めた。また、アレル数とポジティビティーについてはそれぞれの危険率（オッズ比）を求めた。結果を表２に示す。
【００５０】
表２に示すように、それぞれの項目では、−１３Ｔ／Ｃ及び２９９５Ｃ／Ｔの一塩基多型についてのみ、有意なカイ二乗値が得られた。２９９５Ｃ／Ｔ及び３０１０Ｃ／Ｔによるハプロタイプはこれまでの研究から正の相関が示されていたが、それは、３０１０Ｃ／Ｔではなく、２９９５Ｃ／Ｔの続発性ＡＡ−アミロイドーシスとの相関を反映していると考えられる。
オッズ比を比較した場合、−１３Ｔを有する個体の割合を比較した−１３Ｔ陽性危険率（ポジティビティー）がもっとも高かった（オッズ比＝３３．３，９５％ＣＩ＝４．３−２５９．４）。実際、本発明者のサンプルでは、−１３Ｔを有さない個体で、続発性ＡＡ−アミロイドーシスを罹患しているケースは１個体のみであった。
【００５１】
アミロイド群とリウマチ群におけるＳＡＡ１遺伝子座−１３Ｔ陽性及びＳＡＡ１γ陽性のオッズ比の比較について、表３に示す。
これまでの報告では、エキソン３のα、β、及びγの３種のハプロタイプと続発性ＡＡ−アミロイドーシスの危険とを相関づけていたが、γのアレルを有する個体の割合を比較した表３から得られるオッズ比は、−１３Ｔを有する個体の割合を比較した表３から得られるオッズ比よりも低かった（オッズ比３．８対３３．３，ブレスロー−ディーテスト，Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
表１に示すデータに基づいて、アミロイド群と非リウマチ群について、各一塩基多型のアレル数、特定塩基のポジティビティー、特定塩基のリバースポジティビティー、遺伝子型についてのカイ二乗値を求めた結果と、アレル数とポジティビティーに関してそれぞれの危険率（オッズ比）を求めた結果とを、表４に示す。
【００５５】
表４に示すように、非リウマチ群とアミロイド群を比較したところ、−１３Ｔ／Ｃ及び２９９５Ｃ／Ｔのみが有意なカイ二乗値を有した。このように２９９５Ｃ／Ｔのリバースポジティビティーを除いた−１３Ｔ／Ｃ及び２９９５Ｃ／Ｔに対する検討では、有意なカイ二乗値を有した。２９９５Ｃ／Ｔに対するアレル数については−１３Ｔ／Ｃよりも高いカイ二乗値を示したが、一般的に−１３Ｔ／Ｃに対するカイ二乗値は２９９５Ｃ／Ｔに対するカイ二乗値よりも高かった。
【００５６】
表４に示すオッズ比を比べたところ、−１３Ｔ陽性危険率（ポジティビティー）の値が最も高いオッズ比を示した（１７．８，９５％ＣＩ＝２．３−１４０．１）。リウマチ群とアミロイド群との間、あるいは、非リウマチ群とアミロイド群との間の２つの比較において、−１３Ｔ及び２９９５Ｃの両方の一塩基多型が続発性ＡＡ−アミロイドーシスに有意の相関を示した。しかし、−１３Ｔ／Ｃの一塩基多型に対するカイ二乗値の方が、全体的に見て２９９５Ｃ／Ｔよりも高かった。更に、−１３Ｔを有する個体をリウマチ群とアミロイド群との間、あるいは、非リウマチ群とアミロイド群との間で比較したオッズ比（３３．３及び１７．８）は、２９９５Ｃを有する個体で比較したオッズ比（４．３及び５．０）よりも高かった。
これらの結果より、−１３Ｔ／Ｃの一塩基多型は、２９９５Ｃ／Ｔ（すなわち、ＳＡＡ１遺伝子ハプロタイプ）よりも、慢性リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を評価する良い指標となり得ることが判明した。
【００５８】
（４）連鎖不平衡解析
日本人の非リウマチ群において、ハプロタイプ頻度推計プログラム［Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ（ＥＨ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ］を用いて解析した結果を、表５及び表６に示す。なお、このＥＨプログラムは、異なるマーカー間、あるいは、疾患の部位とマーカーと間の連鎖不均衡のテスト及び推定を行なう連鎖解析プログラムである。表５は、日本人（ｎ＝５８）と白人（ｎ＝５０）とのＳＡＡ１遺伝子座の５個の一塩基多型部位の連鎖不均衡のカイ二乗値を比較した結果を示す。また、表６は、３個の一塩基多型のハプロタイプの頻度について日本人と白人とを比較した結果を示す。
【００５９】
表５に示すように、ＳＡＡ１遺伝子にある５個の一塩基多型部位の多くは互いに連鎖不平衡の状態にあった。実際に、２９９５Ｃ／Ｔの一塩基多型は、−１３Ｔ／Ｃと強く連鎖不平衡になっていた。このことは、−１３Ｔ／Ｃと２９９５Ｃ／Ｔとの連鎖不平衡のために、これまでＳＡＡ１ハプロタイプが、一見疾患との関連を示しているかのように認められたことを示し、エキソン３のハプロタイプと続発性ＡＡ−アミロイドーシスとの正の相関は単に連鎖不平衡を反映しており、病気との直接の関係を示すものではないことがわかる。
この結論は、これまでいわれていたＳＡＡ１α及びＳＡＡ１βのハプロタイプにおける日本人集団と白色人種集団での矛盾、つまり、日本人集団ではβハプロタイプがαハプロタイプよりも続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が高くなっているが、白色人種集団では逆であるという矛盾を説明可能である。それは、表６に示すように、−１３Ｔを持つＳＡＡ１αとＳＡＡ１βの頻度を比較した場合、日本人と白色人種集団間で顕著な変化が存在するからである。すなわち、日本人では、−１３Ｔ一塩基多型（ＳＮＰ）はαハプロタイプよりもよりβハプロタイプにリンクしている（０．０６１対０．０００）のに対して、白色人種では、−１３Ｔ一塩基多型はβハプロタイプよりもよりαハプロタイプにリンクしている（０．０２対０．０００）。このような逆の連鎖不平衡の関連が存在するために、日本人集団と白色人種集団とでは、一見ハプロタイプと続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率の関連が逆に見える。つまり、続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率が直接−１３Ｔと関連しており、−１３Ｔ／Ｃとエキソン３のハプロタイプとの間の連鎖不平衡により、エキソン３のハプロタイプが続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率と関連しているという説明により解決できるように思える。２つの集団で、連鎖不平衡関係が逆になっているので、エキソン３の異なるハプロタイプが一見疾患と関連していたのである。
【００６０】
【発明の効果】
本発明方法によれば、従来知られていたＳＡＡ１ハプロタイプよりも、より正確に、慢性関節リウマチ続発性ＡＡ−アミロイドーシス罹患危険率を検出することができる。
【００６３】
【配列表】
<110> Kamatani, Naoyuki
<120> A method for detecting a risk for developing secondary AA-amyloidosis in rheumatoid arthritis patients and a novel oligonucleotide with single nucleotide polymorphisms at the SAA1 locus
<130> YAM002967P
<160> 10
<210> 1
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 1
ｇｔｇｃａｇｔｇｇｃ ｇｔｇａｔｔａｔａｇ ２０
<210> 2
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 2
ｃａａｃｃｔｇａｇｇ ｇａａｃａａｇａｔｇ ２０
<210> 3
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 3
ｃｔｃａａｃｔｃｃｇ ｃａｇｃｃｔｃａｇｃ ２０
<210> 4
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 4
ｇｔｇｃｔｇｔａｇｃ ｔｇａｇｃｔｇｃｇｇ ２０
<210> 5
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 5
ｇｃｃａａｔｔａｃａ ｔｃｇｇｃｔｃａｇ １９
<210> 6
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 6
ｔｇｇｃｃａａａｇａ ａｔｃｔｃｔｇｇａｔ ２０
<210> 7
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 7
ａｇａｇａａｔａｔｃ ｃａｇａｇａｃｔｃａ ｃａｇｇｃ ２５
<210> 8
＜２１１＞ ２０
<212> DNA
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 8
ｔｇｇｃｃａａａｇａ ａｔｃｔｃｔｇｇａｔ ２０
<210> 9
＜２１１＞ １５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 9
ｇｃｃａｃｃｇｔｔｃ ｃｃｔｇｇ １５
<210> 10
＜２１１＞ １５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
<400> 10
ｇｃｃａｃｃｇｃｔｃ ｃｃｔｇｇ １５[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a risk of developing secondary AA-amyloidosis in a patient with rheumatoid arthritis and a novel oligonucleotide containing a single nucleotide polymorphism at the SAA1 locus.
[0002]
[Prior art]
Secondary AA-amyloidosis, which can cause many organ diseases, is one of the most serious complications of rheumatoid arthritis (RA), and its prognosis is caused by kidney damage and gastrointestinal dysfunction. Serious effect (Okuda Y. et al., 1997, Arthritis Rheum Dis., 56, 535-541). Clinically, this complication is one of the severe inflammations that have lasted for many years in rheumatism. Amyloidosis refers to a disease that occurs because amyloid is deposited in various organs throughout the body, and is sometimes classified into AA-amyloidosis, AL-amyloidosis, and the like based on the difference in the components of the deposited protein. AA-amyloid in which deposition is observed in AA-amyloidosis is observed during the course of rheumatoid arthritis and tuberculosis.
[0003]
Not all chronic rheumatism is complicated by secondary AA-amyloidosis, and the prevalence of chronic rheumatic secondary AA-amyloidosis is quite diverse in different racial groups [Okuda Y et al., 1994, Ryumachi]. 34, 939-946; MyIlykangas-Luosjarvi R et al., 1999, Rheumatology (Oxford), 38, 499-503; Benson MD. , 1997, Amyloidosis. In Kopman WJ. (Ed.), 1661-1686; Filipowicz-Sosnowska et al., 1987, Arthritis Rheum. , 21, 699-703]. Although it is not yet known whether the difference in prevalence of secondary AA-amyloidosis between different ethnic groups is due to genetic background or environmental factors, there are factors that define some disease susceptibility It is considered to exist.
[0004]
The human serum amyloid A (SAA) gene cluster in the short arm p15.1 (Sellar GC et al., 1993, Genomics, 16, 774-776) of chromosome 11 has four genes (SAA1 to SAA4) in the 150 kb region. (Seral GC et al., 1994, Genomics, 15, 492-495). The SAA1 gene and SAA2 gene encode SAA1 protein and SAA2 protein called acute phase SAA, respectively, and the SAA4 gene encodes constitutively expressed SAA (SAA4 protein). The SAA3 gene is a pseudogene. Acute phase SAA protein is produced in the liver in the early stages of inflammation, and its concentration reaches about 1000 times, and the peak of its protein amount is maintained. The combination of two single nucleotide polymorphisms in the exon 3 of the SAA1 gene (2995C / T and 3010C / T) results in three different haplotypes, SAA1α, SAA1β, and SAA1γ (Sipe JD et al., 1985, Biochemistry, 24 , 2931-2936; Beach CM et al., Biochem J., 282, 615-620; Baba S et al., 1993, Arch Biochem Biophys., 303, 361-366).
[0005]
Baba et al. Showed a correlation between increased amyloidosis and genotype in SAA1. In other words, it was reported that SAA1γ haplotype was observed more frequently in Japanese cases of chronic rheumatoid secondary AA-amyloidosis than in normal Japanese (Baba S et al., 1995, Hum Mol Genet., 4, 1083). 7). The present inventor has also confirmed that the SAA1γ allele was a risk factor for amyloidosis in RA patients, and the apparent relative risk factor for increased amyloidosis in RA patients with SAA1γ homozygotes was evaluated as 4.48. Moreover, the SAA1α allele seemed to have an inhibitory effect on the enhancement of amyloidosis (Moriguchi M et al., 1999, Hum Genet., 105, 360-366). However, Booth et al. Have shown that the SAA1α allele is a risk factor for enhancing amyloidosis in Caucasian species (Boot DR et al., 1998, Amyloid, 5, 262-265).
[0006]
In addition to the findings described so far, the following findings are known in relation to amyloidosis and the SAA gene. For example, the average value of serum C-reactive protein (CRP: a protein whose blood concentration increases sharply in inflammatory diseases and decreases rapidly after improvement of the disease state) measured in patients with amyloidosis is SAA1 It is related to the genotype at the locus (Moriguchi M et al., 1999, Hum Genet., 105, 360-366).
In addition, the increase in SAA biosynthesis is mainly regulated at the transcriptional level (Lowell CA et al., 1986, J Biol Chem., 261, 8453-5461). Recent studies have revealed that transcription of the human SAA2 gene is regulated in the direction in which expression is induced by the coordination of many promoters and enhancer elements (Betts JC et al., 1993, J Biol Chem. UhIar CM et al., 1997, J Immun Methods, 203, 123-30; LongleyDB et al., 1999, J. Immunol., 163, 4537-4545; UhIar CM et al., 1999, Scand J Immunol., 49, 399-404).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventor has intensively searched for a single nucleotide polymorphism that is stronger than the SAA1 haplotype and is associated with rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis disease. Three types of single nucleotide polymorphisms (−61C / G, −13T / C, −2G / A) that were not found were newly discovered. Moreover, one of these (−13T / C) showed a strong linkage disequilibrium with the SAA1γ haplotype and was newly found to be associated with secondary AA-amyloidosis rather than the SAA1γ haplotype. The present invention is based on such knowledge.
[0008]
Therefore, the object of the present invention is to detect a risk of developing rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis by a more common single nucleotide polymorphism than the SAA1 haplotype, and to be used as a probe in the method. It is to provide a novel oligonucleotide that can be used.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The object is to determine whether the -13th base of human serum amyloid A (SAA1) gene is thymine (T) or cytosine (C) according to the present invention. It can be solved by a method for detecting the risk of amyloidosis.
In the present invention, the combination of the -13th base of the human serum amyloid A gene is a thymine-thymine homozygote, a thymine-cytosine heterozygote, or a cytosine-cytosine homozygote. The present invention relates to a method for detecting a risk of developing AA-amyloidosis secondary to rheumatoid arthritis by determining whether it is a zygote.
The present invention also relates to an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 in the sequence listing.
Furthermore, the present invention also relates to a probe for determining the -13th base of the human serum amyloid A gene comprising an oligonucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 in the sequence listing.
[0010]
In the present specification, the X-th base in a certain gene (for example, SAA gene) may be indicated by a combination of a number X indicating its position and a symbol 1 or more indicating the base. For example, “−13T” indicates T at the −13th position, “−13C” indicates C at the −13th position, and “−13T / C” indicates −13th. T or C at the position of is shown.
[0011]
As used herein, “polymorphism” refers to alleles when there are two or more genetically determined alleles. A “single nucleotide polymorphism” is a polymorphism caused by a single nucleic acid change. Polymorphisms exist with a frequency greater than 1% (preferably a frequency of 10% or more) of the selected population.
[0012]
“Linkage disequilibrium” refers to a relationship in which the frequency of any allele combination in a population appears more frequently with nearby specific alleles than expected by chance.
For example, if locus X has alleles a and b (which are present with equal frequency) and neighboring locus Y has alleles c and d (which are present with equal frequency), then another The haplotype ac, which is a combination of genetic polymorphisms, is expected to exist at a frequency of 0.25 in the population. An allele ac is said to be in linkage disequilibrium if the haplotype ac is greater than these expected values, that is, if a particular genotype ac appears more frequently.
[0013]
Linkage disequilibrium is caused by the natural selection of a specific combination of alleles or the evolutionary recent introduction of a population, and the linked alleles do not reach equilibrium. Can arise from. Therefore, the linkage disequilibrium is different in another group, such as ethnicity and race, and even if ac is linkage disequilibrium in another group, ad is linked disequilibrium in another group. It can be. Polymorphisms in linkage disequilibrium can be effective in detecting susceptibility to disease, even though the polymorphism does not cause disease. For example, allele a at a certain locus X may not be a causative gene element of the disease, but may be susceptible to disease due to linkage disequilibrium with allele c at the Y locus.
[0014]
In the present specification, “oligonucleotide” includes oligodeoxyribonucleotide (DNA) consisting only of deoxyribonucleoside, ribonucleoside and / or modified ribonucleoside (for example, 2′-O-methylribonucleoside). Or chimeric oligoribo / deoxyribonucleotides (RNA / DNA) consisting of both deoxyribonucleosides and ribonucleosides (and / or modified ribonucleosides).
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the detection method of the present invention, the polymorphism in the -13th base of the human serum amyloid A (SAA) gene is determined, and the risk of developing AA-amyloidosis secondary to rheumatoid arthritis is detected based on the type of the base. To do. When the -13th base of the SAA gene is T, it can be determined that the risk of developing AA-amyloidosis secondary to rheumatoid arthritis is high. Moreover, when the said base is C, it can be judged that the risk of developing rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis is low.
[0016]
Further, when the combination of the -13th base of the human serum amyloid A gene is a thymine-thymine homozygote or a thymine-cytosine heterozygote, rheumatoid arthritis secondary AA- It can be determined that the risk of amyloidosis is high. When the base combination is a cytosine-cytosine homozygote, it can be determined that the risk of developing rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis is low.
[0017]
As a method for determining the -13th base of the SAA gene in the detection method of the present invention, for example, (1) polymerase chain reaction (Saiki RK et al., 1986, Nature, 324, 163-166; hereinafter referred to as PCR) By a direct sequencing method in which a partial fragment of the SAA gene containing the -13th base is amplified, and then the base sequence of the partial fragment (PCR product) is directly determined. (2) For the PCR product, Examples thereof include a hybridization method carried out using a probe, and (3) a restriction fragment length polymorphism (RFLP) method carried out on the PCR product using a restriction enzyme AciI.
[0018]
The primer used for amplifying the partial fragment of the SAA gene containing the -13th base by PCR is particularly limited as long as it is a primer capable of amplifying the partial fragment of the SAA gene containing the -13th base. However, those skilled in the art can easily determine based on the base sequence of the SAA gene. As such a primer, for example, a combination of a forward primer composed of the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a back primer composed of the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing When a PCR method is performed using these primers, a partial fragment (303 bp) consisting of the −277th base to the 26th base in the SAA gene can be obtained.
[0019]
In the direct sequencing method (1) of the PCR product obtained by the PCR method, for example, the same primer as the primer used for PCR can be used.
[0020]
In the hybridization method (2) performed on the PCR product, the probe of the present invention can be used as the probe, for example, although not limited thereto.
[0021]
The first probe of the present invention comprises an oligonucleotide [preferably oligodeoxyribonucleotide (DNA)] containing a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. The base sequence represented by the sequence number 9 in the sequence listing includes a -13T single nucleotide polymorphism at the SAA1 locus, and the polymorphic position is located at the center of the probe. The first probe of the present invention is a -13T specific probe.
As the first probe of the present invention, for example, a 15-mer oligonucleotide (preferably DNA) consisting of the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 9 of the present invention, or the sequence of SEQ ID NO: 9 of the sequence listing Examples thereof include an oligonucleotide (preferably DNA) having a base sequence in which a base sequence having 1 or more bases is added to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the base sequence represented by the sequence. The first probe of the present invention is preferably 15 mer to 19 mer.
[0022]
The second probe of the present invention comprises an oligonucleotide [preferably oligodeoxyribonucleotide (DNA)] containing a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. The base sequence represented by the sequence number 10 in the sequence listing contains a -13C single nucleotide polymorphism at the SAA1 locus, and the polymorphic position is located at the center of the probe. The second probe of the present invention is a -13C specific probe.
As the second probe of the present invention, for example, a 15-mer oligonucleotide (preferably DNA) consisting of a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 10 of the present invention, or a sequence of SEQ ID NO: 10 of the sequence listing Examples thereof include an oligonucleotide (preferably DNA) having a base sequence in which a base sequence having 1 or more bases is added to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the base sequence represented by the sequence. The second probe of the present invention is preferably 15 mer to 19 mer.
[0023]
When the first probe and the second probe according to the present invention are used, the procedure is not limited to the following procedure. By examining the presence or absence of specific hybridization with the PCR product, the -13th position of the SAA gene can be obtained. Can be determined (ie, the -13T polymorphism can be detected).
For example, using a genomic DNA derived from a subject as a template, a forward primer consisting of a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and a back primer consisting of a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 4 of the sequence listing; PCR products prepared using the combination are spotted on a polyamide membrane and then fixed by alkali treatment. The first probe according to the present invention (-13T-specific probe) labeled with [γ-32P] dATP using T4 polynucleotide kinase is incubated at 37 ° C. in a hybridization solution (eg, ExpressHyb; Clontech). The mixture was allowed to hybridize for 2 hours, and then washed twice at 37 ° C. for 30 minutes in a washing solution containing 2 × SSC (Saline-sodium citrate buffer) and 0.05% SDS. A wash at 42 ° C. (10 minutes) and a further wash at 58 ° C. (10 minutes) are subsequently performed in a wash solution containing SSC and 0.1% SDS. The above procedure was repeated except that the second probe (allele-13C specific probe) according to the present invention was used for control, and the first probe (-13T specific probe) according to the present invention was used. Detecting the presence of the -13T polymorphism by detecting a significant difference between the hybridization intensity and the hybridization intensity when using the second probe (-13C specific probe) according to the present invention. Can do.
[0024]
In the RFLP method (3) performed using the restriction enzyme AciI on the PCR product, for example, as a primer for PCR, a forward primer comprising a base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and a sequence listing When the combination with the back primer consisting of the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 4 is used, the -13th base of the SAA gene can be determined according to the following criteria. That is, when the PCR product (303 bp) obtained by the PCR method is cleaved with the restriction enzyme AciI, if a 276 bp fragment is generated, it can be determined that the fragment is -13T, while the 254 bp fragment. Can be determined to be -13C.
[0025]
In the detection method of the present invention, the -13th base of the SAA gene can be determined based on a known general polymorphism detection method in addition to the three methods specifically described so far. .
Such known methods include a method based on hybridization using a polymorphism-specific probe, a base extension reaction performed by a polymerase from a template-specific primer, and a base incorporated into the polymorphic site at that time. Specific methods (for example, using dideoxynucleotides, fluorescently labeling each, and detecting each fluorescence, or detecting incorporated dideoxynucleotides by mass spectrometry), or template-specific Examples thereof include a method in which the presence or absence of a complementary base pair or a non-complementary base pair at the mutation site is recognized by an enzyme following the primer.
[0026]
As a method based on hybridization using the above polymorphism-specific probe, for example, a specific probe is attached on a chip, a glass slide, or a nylon membrane, and a difference in hybridization intensity between these probes is detected. A method for determining the type of polymorphism, a method for identifying the efficiency of hybridization of a specific probe, a method for identifying a genotype by detecting the amount of a probe that the polymerase degrades during template double-strand amplification, Detecting the temperature difference of double-stranded melting by following the temperature change of the fluorescence emitted by a special double-stranded fluorescent dye of a species, thereby identifying the polymorphism, and both ends of the oligo probe specific to the polymorphic site A complementary sequence is attached to the probe and the probe forms a secondary structure in the self molecule depending on the temperature, or the target And the like method by utilizing the difference in or hybridize to preparative region genotyping.
[0027]
These basic detection methods in the genotype determination method (that is, the method for determining the -13th base of the SAA gene) are known methods [eg, Bruce, B, et al., Genome Analysis / A laboratory Manual (vol. 4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY. , 1999, etc.], but various methods are currently being developed for polymorphic genotyping methods, and are not limited to those described here.
[0028]
Furthermore, single chain conformation polymorphism analysis (Orita M et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86, 2766-2770; hereinafter referred to as SSCP), denaturing high pressure liquid chromatography (Huber CG et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 1061-1066; hereinafter referred to as dHPLC), denaturing gradient gel electrophoresis (Cariello NF and Skopek TR, 1993, Mutat. Res., 288, 103-112; hereinafter referred to as DGGE) Alternatively, the -13th base of the SAA gene is also determined by chemical or enzymatic cleavage of a heteroduplex formed by mixed DNA (Dean M, 1995, Nature Genet., 9, 103-104). be able to.
[0029]
In SSCP, DNA is denatured by heating or formaldehyde to form a single strand, followed by electrophoresis. The single strand is refolded to partially form a base sequence-specific secondary structure, and this difference in structure causes a change in electrophoresis speed, making it possible to detect the presence or absence of mutation.
In dHPLC, once denatured and then re-associated DNA is separated through a column near the denaturation start temperature, if there is a polymorphism, a heteroduplex with a different part is formed, which moves with the homoduplex. Since the degree is different, the mutation can be detected.
In DGGE, mutations can be identified based on different sequence-dependent melting characteristics in solution and electrophoretic mobility of DNA.
In addition, in the chemical or enzymatic cleavage method of heteroduplex formed by mixed DNA, polymorphism can be identified based on the presence or absence of cleavage.
[0030]
The detection method of the present invention is based on the discovery that the polymorphism at the -13th base of the SAA1 gene (−13T) is more strongly correlated with rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis than the known SAA1γ haplotype. Is based. This discovery is not limited to this, but can be derived by, for example, the following method.
In general, in association analysis, the association between a disease and a marker can be detected by comparing the frequency of a specific marker allele between a patient population and a control population (a healthy population). That is, regarding the frequency of a certain single nucleotide polymorphism, the affected person and the healthy person are compared, the relationship between the specific polymorphism, the affected person and the healthy person is statistically estimated, and the single nucleotide polymorphism and the disease The presence or absence of an association with can be evaluated.
Items to be compared are genotype frequency, allele frequency, morbidity (possibility) when the single nucleotide polymorphism in question is present, and when the single nucleotide polymorphism in question is not present Frequency of not suffering from (reverse positive). For each polymorphism, the degree of involvement of the polymorphism in the disease is evaluated by evaluating each item in the affected group and the control group using the chi-square test or Fisher's exact test. Guessing is possible.
[0031]
The degree of relevance can also be expressed using a probable ratio (odds ratio). For example, when an event occurs with probability p, the ratio p / (1-P) is called odds. For the test (statistical analysis) of the significance of the odds ratio, which is the ratio of the odds, a chi-square test, Fisher's exact test, Breslow-Day test, or the like is used. The haplotype frequency can be estimated using known software [for example, Estimation Happotype-frequency (EH) software (ftp://linkage.rockefeller.edu/software/eh)]. It is not limited.
[0032]
The findings found by the present inventors [i.e., the polymorphism at the -13th base of the SAA1 gene (-13T) correlates more strongly with rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis than the known SAA1γ haplotype. According to the findings, it suggests the possibility of a screening system for therapeutic or prophylactic agents for rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis.
[0033]
For example, when the -13T polymorphism is located in the promoter region of a gene, the amount of the gene product changes due to the intensity of the promoter activity caused by the single nucleotide polymorphism, and this change may change the disease risk rate. Suggest sex. That is, if promoter activity is enhanced by a specific polymorphism and gene expression is enhanced to increase the risk of disease, a promoter containing the single nucleotide polymorphism is used, and a luciferase gene or the like downstream of the promoter is used. A system in which an appropriate reporter gene is inserted is constructed, and the reporter expression gene is introduced into an appropriate cell (in this case, a cell derived from a liver in which SAA1 gene expression is reported), and inflammation such as IL-1 and TNFα A substance that inhibits the induction of reporter activity may be selected by adding to the cell system using the reporter activity induced in response to sex stimulation as an index.
Alternatively, since the amount of the expressed SAA1 gene product can be quantified by using an antibody against the SAA1 gene product, this ELISA system is used to inhibit the induction of protein expression in a screening system in which a compound is added to an expression cell. What is necessary is just to select a substance.
[0034]
In addition, according to the above findings found by the present inventors, it is considered possible to effectively select a target population for clinical trials regarding a therapeutic or prophylactic drug candidate substance for rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis. . That is, when a clinical trial of a therapeutic or prophylactic drug candidate substance for secondary rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis is conducted, it is conceivable to conduct it in a population having the same polymorphism and a control population. In this way, selecting a genetically uniform population and using that population in clinical trials can reduce or eliminate variation in results due to genetic heterogeneity, thus reducing the number of subjects. As a matter of course, it is possible to more accurately evaluate the effectiveness of a potential drug, as well as to reduce the cost required for the drug.
[0035]
Furthermore, according to the above findings found by the present inventor, it is possible to effectively select those who are predisposed to suffering from rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis. It seems possible to select it appropriately.
For example, by determining the single nucleotide polymorphism for a predisposed person or affected person with rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis, the predisposed person can be given a lifestyle such as diet or exercise. Can be changed. In addition, when a prophylactic drug is present, it can be motivated to start administration of the prophylactic drug. Furthermore, when there is a therapeutic agent, rapid drug administration after onset can be performed by confirming the presence of the polymorphism and monitoring the patient's condition.
[0036]
[Example of data analysis]
Hereinafter, the data analysis that the present inventor has determined will be specifically described with respect to the fact that −13T / C of the SAA1 gene is associated with secondary AA-amyloidosis rather than the SAA1γ haplotype.
(1) Detection of polymorphism around SAA1 gene
The SAA1 gene sequence and SAA2 gene sequence are respectively stored in a database [SAA1 gene: Genbank ACCESSION No. X56652 (Betts, JC, et al., 1991, Scand. J. Immunol., 34, 471-482); SAA2 gene sequence: Genbank ACCESSION No. L05921 (Steel, DM, et al., 1993, Genomics, 16, 447-454)] was used.
[0037]
In order to search for polymorphisms, the region amplified by PCR was divided into two regions upstream of the 5 ′ end of the SAA1 gene, a region containing part of exon 3 to part of exon 4 of the SAA1 gene, and the region of SAA2 gene There were a total of four locations in part of exon 4. The specific positions of the two positions upstream of the 5 ′ end of the SAA1 gene are numbered from the cap site of exon 1, and each is a 528 bp region consisting of the −712th base to the −185th base (hereinafter referred to as the PCR product). 1)) and a 303 bp region (hereinafter referred to as PCR product 2) composed of the −277th base to the 26th base. Similarly, a part of exon 3 of the SAA2 gene was a 518 bp region (hereinafter referred to as PCR product 3) consisting of the 2919th base to the 3436th base. In addition, exon 4 of the SAA2 gene was a 115 bp region (hereinafter referred to as PCR product 4) consisting of the 3130th base to the 3244th base when numbered from the cap site of exon 1.
[0038]
The primer DNA used to amplify PCR product 1 is
Forward primer: GTGCAGTGGGCGGTATATAG (corresponding to SEQ ID NO: 1: 712st base to -693rd base) and
Reverse primer: CAACCTGGAGGGAACAAGATG (SEQ ID NO: 2: corresponding to the −204th base to the −185th base)
It was a combination.
Hereinafter, similarly, the primer DNA used to amplify PCR product 2 is:
Forward primer: CTCAACTCCGCAGGCCTCAGC (SEQ ID NO: 3: corresponding to the −277th base to the −258th base) and
Reverse primer: GTGCTGTAGCTGAGCTGGCGG (SEQ ID NO: 4: corresponding to the 7th to 26th bases)
A combination of
The primer DNA used to amplify PCR product 3 is
Forward primer: GCCAATTACATCGGCTCAG (SEQ ID NO: 5: corresponding to 2919th base to 2937th base) and
Reverse primer: TGGCCAAAGAATCTCTGGAT (SEQ ID NO: 6: corresponding to the 3417th to 3436th bases)
A combination of
The primer DNA used to amplify PCR product 4 is
Forward primer: AGAGAATATCCCAGAGACTCACAGC (SEQ ID NO: 7: corresponding to the 3130th base to the 3154th base) and
Reverse primer: TGGCCAAAGAATCTCTGGAT (SEQ ID NO: 8: corresponding to the 3225th base to the 3244th base)
It was a combination.
[0039]
PCR reaction was performed using genomic DNA 200-300 ng as a template, 0.5 U-Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim), dNTPs (0.2 mmol / L), primer (0.5 μM), and 1 × buffer [10 mmol / L-Tris HCl. (PH 8.3), 1.5 mmol / L-MgCl 2 , 50 mmol / L-KCI] in a system with a total volume of 50 μL.
[0040]
The conditions for PCR product 1 are as follows. That is, after reacting at 94 ° C. for 3 minutes, 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 61 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute were carried out, and further reacted at 72 ° C. for 5 minutes.
The PCR product 2 was reacted at 94 ° C. for 3 minutes, then subjected to 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 64 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 30 seconds, and then 72 ° C. for 5 minutes. Reacted.
PCR products 3 and 4 were prepared by reacting at 94 ° C. for 4 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 30 seconds. The reaction was allowed for 5 minutes.
The template used for PCR amplification was obtained by extracting genomic DNA from peripheral leukocytes of a DNA sample provider according to a conventional method.
[0041]
For PCR product polymorphism screening, PCR-SSCP was performed according to the previous paper (Moriguchi M et al., 1999, Hum Genet., 105, 360-366) using genomic DNA samples from 12 rheumatic patients. . The breakdown of these 12 people is 4 each for 3 types of homozygous SAA1α, SAA1β, and SAA1γ.
Identification of the polymorphic site is carried out using a sequencer (ABI373A; Perkin-Elmer) and a sequence kit (Dye terminator cycle sequence kit; Perkin-Elmer Applied Biosystems) for PCR products that have been shown to have polymorphism after SSCP. The nucleotide sequence was determined using
[0042]
As a result, a C / G polymorphism at the −61st base (hereinafter referred to as −61C / G) and a T / C at the −13th base are located upstream of the 5 ′ end of the region encoding the SAA1 gene. And 3 novel single nucleotide polymorphism sites of G / A polymorphism (hereinafter referred to as -2G / A) at the -2nd base It was. These were all contained on PCR product 2. As the known single nucleotide polymorphism site, the C / T polymorphism at the 2995th base on the PCR product 3 (hereinafter referred to as 2995C / T) and the C / T polymorphism at the 3030th base (hereinafter referred to as “polymorphism”) , 3030C / T), as well as the A / G polymorphism at the 3156th base on PCR product 4 (hereinafter referred to as 3156A / G).
[0043]
(2) Preparation of genomic DNA sample used for frequency analysis of gene polymorphism
In the frequency analysis of genotype, DNA was used for gene analysis from 44 secondary AA-amyloidosis patients (amyloid group), 55 early rheumatic patients (rheumatic group), and 58 healthy people group (control group). Received samples.
[0044]
For patients with secondary AA-amyloidosis, biopsy specimens are stained with congo red, confirmed with green birefringence under a polarizing microscope, stained with antiserum against amyloid A protein, and accumulation of AA-amyloid The diagnosis was confirmed by confirming.
The 55 early rheumatic patients consist of patients with a history of rheumatic disease less than 5 years upon receipt of the DNA sample. By selecting patients with an RA duration of less than 5 years, it is possible to obtain a population that is as unbiased as possible among all rheumatic patients.
All patients in the amyloid and rheumatic groups meet all the classification criteria for rheumatism revised in 1987 by the American Rheumatism Association.
[0045]
In addition, in order to screen polymorphisms in white race, a DNA panel for 50 white races was purchased (Coriell Cell Repository). This panel consists of the following samples: That is, GM00130, GM00131, GM00536, GM00546, GM00558, GM00607, GM00621, GM00893, GM00922, GM00946, GM01056, GM01310, GM01805, GM01806, GM01814, GM01953, GM0195, GM0195, GM0195, GM01G GM06315, GM06861, GM08228, CM08428, GM08858, GM09901, GM09196, GM09306, GM09899, GM09947, GM09948, GM10959, GM11854, GM12593, GM13069, GM13070, GM13768 M14448, GM14492, GM14547, GM14548, GM14673, GM14693, GM14753, GM14782, and is GM14807.
[0046]
(3) Frequency analysis of gene polymorphism
For the genotyping of the novel single nucleotide polymorphisms -61C / G, -13T / C, and -2G / A found upstream of the 5 'end of the SAA1 gene, use restriction enzymes MnlI, AciI, and Cac8I, respectively. Determined by RFLP analysis. Further, already reported 2995C / T, 3010C / T, and 3156A / G were determined by RFLP analysis using restriction enzymes BanI, BclI, and NcoI, respectively.
[0047]
These RFLP analyzes determined the genotypes of 44 secondary AA-amyloidosis patients (amyloid group), 55 early rheumatic patients (rheumatic group), and 58 healthy people group (control group), The results are summarized in Table 1.
[0048]
Using general association analysis, we examined whether these six single nucleotide polymorphisms are involved in the risk of developing secondary AA-amyloidosis. That is, based on the data shown in Table 1, the number of alleles of each single nucleotide polymorphism, the specific base positiveity, the specific base reverse positiveity, and the chi-square value for the genotype are obtained for the amyloid group and the rheumatic group. It was. In addition, the risk ratio (odds ratio) was calculated for the number of alleles and positiveness. The results are shown in Table 2.
[0050]
As shown in Table 2, in each item, a significant chi-square value was obtained only for the single nucleotide polymorphisms of −13T / C and 2995C / T. Haplotypes with 2995C / T and 3010C / T have been shown to be positively correlated with previous studies, but reflect a correlation with secondary AA-amyloidosis of 2995C / T but not 3010C / T it is conceivable that.
When comparing the odds ratio, the -13T positive risk rate (positivity) comparing the proportion of individuals with -13T was the highest (odds ratio = 33.3, 95% CI = 4.3-259.4) . In fact, in our sample, there was only one individual who did not have -13T and suffered from secondary AA-amyloidosis.
[0051]
Table 3 shows a comparison of odds ratios of SAA1 locus-13T positive and SAA1γ positive in the amyloid group and the rheumatic group.
Previous reports correlated the three haplotypes of exon 3 α, β, and γ with the risk of secondary AA-amyloidosis, but from Table 3 comparing the proportion of individuals with γ alleles The resulting odds ratio was lower than the odds ratio obtained from Table 3 comparing the proportion of individuals with -13T (odds ratio 3.8 vs. 33.3, Breslow-D test, P <0.05).
[0053]
Based on the data shown in Table 1, for the amyloid group and non-rheumatic group, the results were obtained for the number of alleles of each single nucleotide polymorphism, the positiveity of the specific base, the reverse positiveity of the specific base, and the chi-square value of the genotype Table 4 shows the results of determining the respective risk factors (odds ratio) for the number of alleles and the positiveity.
[0055]
As shown in Table 4, when the non-rheumatic group and the amyloid group were compared, only -13T / C and 2995C / T had significant chi-square values. Thus, in the examination with respect to −13T / C and 2995C / T excluding the reverse polarity of 2995C / T, there was a significant chi-square value. The allele number for 2995C / T showed a higher chi-square value than -13T / C, but generally the chi-square value for -13T / C was higher than the chi-square value for 2995C / T.
[0056]
When the odds ratios shown in Table 4 were compared, the odds ratio with the highest value of -13T positive risk (positivity) was shown (17.8, 95% CI = 2.3-140.1). In two comparisons between the rheumatoid group and the amyloid group, or between the non-rheumatic group and the amyloid group, both -13T and 2995C single nucleotide polymorphisms showed significant correlation with secondary AA-amyloidosis. . However, the chi-square value for the -13T / C single nucleotide polymorphism was generally higher than 2995C / T. Furthermore, the odds ratios (33.3 and 17.8) comparing individuals with -13T between the rheumatism group and the amyloid group or between the non-rheumatic group and the amyloid group are compared for the individuals with 2995C. Higher odds ratios (4.3 and 5.0).
From these results, it was found that the -13T / C single nucleotide polymorphism can be a better index to evaluate the risk of developing chronic rheumatic secondary AA-amyloidosis than 2995C / T (ie, SAA1 gene haplotype). .
[0058]
(4) Linkage disequilibrium analysis
Tables 5 and 6 show the results of analysis using the haplotype frequency estimation program [Estimating Haplotype-frequency (EH) software program] in the Japanese non-rheumatic group. This EH program is a linkage analysis program that tests and estimates linkage disequilibrium between different markers or between a disease site and a marker. Table 5 shows the results of comparing the chi-square values of linkage disequilibrium of the five single nucleotide polymorphism sites in the SAA1 locus between Japanese (n = 58) and white (n = 50). Table 6 shows the results of comparison between Japanese and Caucasians regarding the frequency of three single nucleotide polymorphism haplotypes.
[0059]
As shown in Table 5, many of the five single nucleotide polymorphic sites in the SAA1 gene were in linkage disequilibrium with each other. In fact, the single nucleotide polymorphism of 2995C / T was in strong linkage disequilibrium with -13T / C. This indicates that, due to linkage disequilibrium between -13T / C and 2995C / T, the SAA1 haplotype was previously recognized as showing an association with the disease, and the haplotype of exon 3 It can be seen that the positive correlation between AA and secondary AA-amyloidosis simply reflects linkage disequilibrium and does not indicate a direct relationship with the disease.
The conclusion is that the previously-discussed haplotypes of SAA1α and SAA1β are inconsistent between the Japanese population and the white population, that is, the β haplotype has a higher risk of developing secondary AA-amyloidosis than the α haplotype in the Japanese population. However, it is possible to explain the contradiction that the opposite is true in white populations. This is because, as shown in Table 6, when the frequencies of SAA1α and SAA1β having −13T are compared, there is a significant change between the Japanese and white populations. That is, in the Japanese, the -13T single nucleotide polymorphism (SNP) is linked to the β haplotype more than the α haplotype (0.061 vs. 0.000), whereas in the white race, -13T one Nucleotide polymorphisms are linked to α haplotypes more than β haplotypes (0.02 vs. 0.000). Because of this reverse linkage disequilibrium relationship, it appears that the relationship between the haplotype and the risk of developing secondary AA-amyloidosis appears to be reversed between the Japanese population and the white population. That is, the risk of developing secondary AA-amyloidosis is directly related to -13T, and due to linkage disequilibrium between -13T / C and the haplotype of exon 3, the haplotype of exon 3 is at risk of developing secondary AA-amyloidosis. It seems that it can be solved by explaining that it is related to the rate. Since the linkage disequilibrium relationship was reversed in the two populations, different haplotypes of exon 3 seemed to be associated with the disease.
[0060]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, the risk of suffering from rheumatoid arthritis secondary AA-amyloidosis can be detected more accurately than the conventionally known SAA1 haplotype.
[0063]
[Sequence Listing]
<110> Kamatani, Naoyuki
<120> A method for detecting a risk for developing secondary AA-amyloidosis in rheumatoid arthritis patients and a novel oligonucleotide with single nucleotide polymorphisms at the SAA1 locus
<130> YAM002967P
<160> 10
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtgcagtggc gtgattatag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
caacctgagg gaacaagatgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctcaactccg cagcctcagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gtgctgtagc tgagctgcgg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gccatattaca tcggctcag 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
tggccaaaa atctctgat 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agagaatc cagagactca caggc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
tggccaaaa atctctgat 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 10
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