JP3630453B2

JP3630453B2 - A therapeutic agent for immature myeloma cells comprising an IL-6 receptor antibody as an active ingredient

Info

Publication number: JP3630453B2
Application number: JP25965494A
Authority: JP
Inventors: 道生河野
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: JPH0899902A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はインターロイキン６レセプター抗体を有効成分とする化学療法剤抵抗性である未熟型骨髄腫細胞治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨髄腫は形質細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場として複数の部位で発生する腫瘍である。骨髄腫細胞の主要な増殖因子として、インターロイキン６（ＩＬ−６）が有力な候補として考えられている（Ｋａｗａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３，１９８８：Ｋｌｃｉｎら、Ｂｌｏｏｄ，７３，５１７，１９８９）。
【０００３】
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２あるいはインターフェロンβ２等と呼称されたサイトカインである。
ＩＬ−６はＢリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３，１９８６）、その後種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかとなった（Ａｋｉｒａら、Ａｄｖ，ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５４，１，１９９３）。
【０００４】
ＩＬ−６は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０ＫＤのリガンド結合性タンパク質、ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）である。ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）として存在する。もう一つは非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ＫＤのｇｐ１３０である。ＩＬ−６とＩＬ−６ＲはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を形成し、次いでもう一つの膜タンパク質ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ−６の生物学的活性が細胞に伝達される（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：９６７，１９８７）。
【０００５】
Ｋａｗａｎｏらは、ＶＬＡ（ｖｅｒｙｌａｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ）−５あるいはＭＰＣ（ｍａｔｕｒｅｐｌａｓｍａｃｅｌｌ）−１（Ｈｕａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ８２，３７２１，１９９３、特開平６−８６６８８）等の骨髄腫細胞上の表面抗原により、骨髄腫細胞がＶＬＡ−５陰性（⁻）ＭＰＣ−１⁻の未熟型骨髄腫細胞、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１陽性（^＋）の中間型骨髄腫細胞およびＶＬＡ−５^＋ＭＰＣ−１^＋成熟型骨髄腫細胞に分けられることを報告した（Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）。
【０００６】
また、このうち未熟型骨髄腫細胞が、化学療法剤に治療抵抗性を示す細胞集団の主体であることが知られている（Ｋａｗａｎｏら、第５６回日本血液学会総会要旨集、２６１頁、６４１，１９９４）。
これまで、ＩＬ−６Ｒ抗体を加えることにより、一般的に骨髄腫細胞の増殖が抑制されること（Ｇｏｔｏら、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ７，６５５，１９９３）およびＩＬ−６が未熟型骨髄腫細胞の増殖を刺激すること（Ｋａｗａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）が知られていた。
【０００７】
しかしながら、これら知見は骨髄腫細胞の増殖を指標としており、骨髄腫の治療において重要であると考えられている化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞の根絶を示唆するものではなかった。また、これまでＩＬ−６Ｒ抗体が未熟型骨髄腫細胞の根本的な治療剤に有用であるかについてはなんらデータもなく、未熟型骨髄腫細胞の生存自体に直接関与しているか否かは依然として不明であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞に対し、これまでその根本的な治療に有効である薬剤は見出されておらず、未熟型骨髄腫細胞を根絶する効果を有する薬剤の登場が待たれていた。従って本発明は未熟型骨髄腫細胞に対する治療剤を提供しようするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６Ｒ抗体が化学療法剤抵抗性の主体をなす未熟型骨髄腫細胞の生存を阻害することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、未熟型骨髄腫細胞を根本的に治療する新しい未熟型骨髄腫細胞治療剤を提供するものである。より詳しくは、本発明はＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞の生存阻害作用を有する未熟型骨髄腫細胞治療剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はＩＬ−６Ｒ抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞の生存阻害剤を提供する。
【００１０】
【具体的な説明】
本発明で使用されるＩＬ−６レセプター抗体は、未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来および種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わないが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。この抗体はＩＬ−６Ｒと結合することにより、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害して、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗体である。
【００１１】
モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。
【００１２】
このようなＩＬ−６レセプター抗体としては、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２９００−２９０６，１９８９），ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体あるいはＡＵＫ１４６−１５抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９）などが挙げられる。
モノクローナ抗体は、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、ＩＬ−６Ｒを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
【００１３】
より具体的には、モノクローナル抗体を作成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗原としては、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いることによって得られる。ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒタンパク質を感作抗原として用いればよい。
【００１４】
ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものの他に細胞膜より離脱している可能性のもの（ｓＩＬ−６Ｒ）が抗原として使用できる。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異なっている。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。
【００１５】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量併用して、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００１６】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３：１５４８，１９７８），ｐ３−Ｕ１（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１：１−７，１９７８），ＮＳ−１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６），ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ，８：４０５−４１５，１９７６）：ＳＰ２／０（Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８），ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３５：１−２１，１９８０），Ｓ１９４（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９７８），Ｒ２１０（Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）等が好適に使用される。
【００１７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００１８】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００１９】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ通常、培養液に３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００２０】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が行われる。
【００２１】
このようにして作成されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２２】
さらに、前記の方法により得られるモノクローナル抗体は、塩析法、ゲル漉過法、アフィニテイークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高純度に精製することができる。
このようにして、作成されるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法（ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感度かつ高精度で認識することを確認することができる。
【００２３】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスのモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。
【００２４】
さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得ることができる。
【００２５】
なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：１−６，１９９３）。このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。
【００２６】
さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を阻害するかぎり抗体の断片、たとえばＦａｂあるいはＦｖ，Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的に使用することができる。（例えば、Ｂｉｒｄら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９：１３２−１３７，１９９１；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８を参照）。
【００２７】
本発明のＩＬ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤は、未熟型骨髄腫細胞のＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６により生存が維持された未熟型骨髄腫細胞の生存が阻害される限り、それらの未熟型骨髄腫細胞の根絶に有効である。
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与することができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとることができる。
【００２８】
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤のヒトに対する投与量は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、およそ１−１０００ｍｇ／患者の範囲で４回以下の分割容量を選択することができる。しかしながら、本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００２９】
本発明の未熟型骨髄腫細胞治療剤は常法にしたがって製剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製されたＩＬ−６Ｒ抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、参考例、実験例および実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１．ヒトＩＬ−６レセプター抗体ＰＭ−１の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
【００３１】
すなわち、ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５ＭＮａＣｌを含む１ｍＭｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
【００３２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０^９個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブイドーマを作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×１０^７個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
【００３３】
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍｌ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍｌのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により^３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。０．０５ｍｌのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。
【００３４】
洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍｌの^３５Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、ＩｇＧｌκ型のサブタイプを有する。
【００３５】
ハイブイドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボルトン−ハンター試薬（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＭＡ）により^１２５Ｉ標識した（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，１９８７）。
【００３６】
４×１０^５個のＵ２６６細胞を、１００倍量の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清及び１４０００ＣＰＭの^１２５Ｉ標識ＩＬ−６とともに培養した。７０μｌのサンプルを４００μｌのマイクロフユージポリエチレンチューブに入れた３００μｌのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。
その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害することが明らかとなった。
【００３７】
参考例２．ヒト型抗体ｈＰＭ−１の作成
ヒト型化抗体ｈＰＭ−１を国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９に記載の方法により得た。
参考例１で作成されたハイブリドーマＰＭ−１から常法で全ＲＮＡを調製し、これより一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウスＰＭ−１のＶ領域のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ法に使用するプライマーは、Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１に記載されたものを用いた。
【００３８】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を精製し、マウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、及びマウスガンマ型Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９に連結し、大腸菌ＤＨ５αのコンビテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得、プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、常法にしたがい決定し、さらに各Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。
【００３９】
キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡをＨＣＭＶ発現ベクターに挿入した。
ヒト型化ヒトＰＭ−１抗体を作成するために、ＣＤＲ移植法によりマウスＰＭ−１のＶ領域ＣＤＲをヒト抗体へ移植した。ヒト型化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換した。
【００４０】
このようにして作成したヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子を哺乳類細胞中で発現させるために、ヒトエロンゲーションファクターＩα（ＨＥＦ−１α）プロモーターを含有するベクターに各々導入し、ヒト型化ＰＭ−１抗体Ｌ鎖およびＨ鎖を発現するベクターを作成した。これら二つの発現ベクターをＣＨＯ細胞に同時に挿入することにより、ヒト型化ＰＭ−１（ｈＰＭ−１）を産生する細胞株を樹立した。得られたヒト型化抗体のヒトＩＬ−６Ｒへの結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６Ｒへの結合を阻害した。
【００４１】
実験例
（１）骨髄腫細胞の分類
骨髄腫患者から得た骨髄腫細胞を、フローサイトメトリー法を用い、表面抗原に基づく骨髄腫細胞の同定および分類を行った。
骨髄液を、リンパ球分離液Ｓｅｐａｒａｔｅ−Ｌ（ＭｕｔｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＣｏ．）により遠心分離し、単核細胞を分離した。
【００４２】
これらの骨髄細胞を２００μｇ／ｍｌＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ_３を含むＰＢＳに５×１０^５個／２０μｌとなるように懸濁し、はじめに各々２０μｌの抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ｍＡＢ）（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）、抗ＣＤ５６ｍＡＢ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、抗ＶＬＡ−５ｍＡＢ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）あるいは抗ＭＰＣ−１ｍＡＢ（特開平６−８６６８８参照）を加え、４℃にて３０分間反応させた後、２０ｍＭＳｏｄｉｕｍＰｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．２５ＭＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で二回洗浄した。
【００４３】
次いで、１００倍希釈した４０μｌのＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）にて染色（４℃、３０分間）し、前記ＰＢＳにて二回洗浄の後、１５μｌのマウス血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を加え、４℃、２０分間インキュベートし、さらに２０μｌの前記ＰＢＳ中で５μｌのＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）結合抗ＣＤ３８ｍＡＢ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）を添加して染色し（４℃、３０分間）、前記ＰＢＳにて二回洗浄した。
【００４４】
これら二重染色された骨髄細胞をフローサイートメーター（ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥ，Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にて蛍光を測定することにより解析した。骨髄腫細胞の特徴であるＣＤ３８強陽性の画分に出現する細胞の表面抗原を解析した結果、骨髄腫細胞は、ＶＬＡ−５^＋ＭＰＣ−１^＋の成熟型、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１^＋の中間型およびＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熟型に分けられた（Ｋａｗａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ，８２，５６４，１９９３）。
【００４５】
（２）骨髄腫細胞のアポトーシス誘導
骨髄腫細胞の生存率および死細胞のアポトーシスの判定を、ＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ．Ｃｏ．製）およびＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ社）を用いた二種染色フローサイトメトリー法（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４９，３７７６，１９８９）にて解析し、図１にアポトーシス誘導した細胞の分布を機械的に示した。
【００４６】
ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５（Ｏｈｔｓｕｋｉら、Ａｃｔｏ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｊｐｎ．，５１，１０５２，１９８８）を（１×１０^６）個／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培養液培養液中で調製し、アポトーシスを誘導するｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）を１×１０^−７Ｍとなるよう添加した。３７℃にて培養２４時間後にＫＭＳ−５細胞をＦＤＡ／ＰＩにて二重染色し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。その結果、図２に示すように、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ処理により生細胞画分（ＦＤＡ^＋ＰＩ⁻）に加え、アポトーシスが誘導された細胞の画分（ＦＤＡ⁻ＰＩ⁻）が出現した。
【００４７】
ＦＤＡ^＋ＰＩ⁻画分およびＦＤＡ⁻ＰＩ⁻画分の細胞をフローサイトメトリーにて分取し、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７１，３４３，１９８８の方法にしたがい、ＤＮＡを抽出した。このように調製したＤＮＡを１．２％アガロースゲル電気泳動にて分析した。その結果、図３に示すようにＦＤＡ^＋ＰＩ⁻画分の細胞由来のＤＮＡは分解していなかったが、ＦＤＡ⁻ＰＩ⁻画分の細胞は、アポトーシスの特徴であるＤＮＡの明らかな分解およびｌａｄｄｅｒ状のバンドがみられた。
【００４８】
実施例
実験例に記載のＦＤＡ／ＰＩ二重染色フローサイトメトリー法により患者骨髄腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける生存率の変化を検討した。
上記実施例と同様の方法にて、ＰＥ結合抗ＶＬＡ−５抗体およびＰＥ結合抗ＭＰＣ−１抗体により、骨髄腫細胞を染色し、以下の細胞群を分取した。
分取したＶＬＡ−５^＋ＭＰＣ−１^＋の成熟型、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１^＋の中間型およびＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熟型の骨髄腫細胞を１×１０^６個／ｍｌとなるよう１０％ＦＣＳおよび１×１０^−５Ｍの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培養液中に浮遊させ、３５×１０ｍｍのｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ
ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ社）に分注した。
【００４９】
これらの細胞を、２０Ｕ／ｍｌの組換型ヒトＩＬ−６（ｒＩＬ−６；Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３，１９８６）、５０μｇ／ｍｌのヒト型化抗ｈＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）存在あるいは非存在下にて３７℃で３日間培養した後、ＦＤＡ／ＰＩを用いてフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳＥＬＩＴＥ，Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により蛍光を測定し、生細胞の比率を求めた。なお、コントロールは、ｒＩＬ−６およびｈＰＭ−１非存在下で培養した。その結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】

【００５１】
さらに、これらの結果から、成熟型、中間形および未熟型の骨髄腫細胞の生存率にｒＩＬ−６が及ぼす影響を図４に示す。ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の表面抗原を有する未熟型骨髄腫細胞のｒＩＬ−６反応性とそれに対するｈＰＭ−１抗体の作用を図５に示した。ＶＬＡ−５^＋ＭＰＣ−１^＋の成熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１−９）は培養液のみでも比較的高い生存率を保った。これら成熟骨髄腫細胞は、ｒＩＬ−６にほとんど反応せず、ｈＰＭ−１抗体による生存阻害効果もみられなかった。一方、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１３−１８）は培養液のみでは生存が維持できず、アポトーシスに陥り易いことが示された。
【００５２】
これらの細胞はＩＬ−６に対する反応性が高く、ｒＩＬ−６により生存率が上昇した。この時、ｒＩＬ−６による未熟型骨髄腫細胞の生存維持効果は、ｈＰＭ−１抗体により明らかに阻害された（図５）。コントロール、ｒＩＬ−６，ｈＰＭ−１およびｒＩＬ−６とｈＰＭ−１各存在下における未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１７）のＦＤＡ／ＰＩ二重染色像を図６に示す。
【００５３】
コントロールに比べ、ｒＩＬ−６添加群では、アポトーシスを誘導した像（左下、Ｄ）の強度が低く、生細胞（右下、Ｅ）の割合が大きかった。これに対し、ｒＩＬ−６およびｈＰＭ−１存在下では、アポトーシスを誘導した細胞の画分（左下、Ｄ）の強度が高かった。ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１^＋を示す中間型骨髄腫細胞も、未熟型と同程度ではなかったが、ｒＩＬ−６に反応して生存率が上昇することおよびこの作用がｈＰＭ−１により阻害されることが示された。
【００５４】
【発明の効果】
治療抵抗性を示すことが多い骨髄腫細胞集団の主体をなす、表面抗原ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熟型骨髄腫細胞の生存維持にはＩＬ−６が深く係わっている。ＩＬ−６レセプター抗体による未熟型骨髄腫細胞の生存阻害作用が、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻未熟型骨髄腫細胞で強く認められたことから、本発明のＩＬ−６レセプター抗体は未熟型骨髄腫細胞治療剤としての有用性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、二重染色フローサイトメトリー法による、アポトーシスを誘導した骨髄腫細胞の分布を模式的に示す。Ｅは生細胞（ＦＤＡ^＋ＰＩ⁻）、Ｄはアポトーシス誘導細胞（ＦＤＡ⁻ＰＩ⁻）、Ｃはアポトーシスの特徴を有さない死細胞の像である。
【図２】図２は、デキサメタゾン処理によりアポトーシスが誘導された骨髄腫細胞株ＫＭＳ−５のフローサイトメトリー像である。
【図３】図３は、ＦＤＡ^＋ＰＩ⁻（Ｅ）およびＦＤＡ⁻ＰＩ⁻（Ｄ）画分の細胞のＤＮＡアガロースゲル電気泳動図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＦＤＡ^＋ＰＩ⁻（Ｅ）画分、レーン３はＦＤＡ⁻ＰＩ⁻（Ｄ）画分である。レーン３でＤＮＡの分解およびアポトーシスの特徴であるｌａｄｄｅｒ状のバンドがみられる。
【図４】図４は、骨髄腫細胞の生存率にＩＬ−６が及ぼす影響を示す。ＩＬ−６存在下において、感熱型骨髄腫細胞（ＶＬＡ−５^＋ＭＰＣ−１^＋）はほぼその存在に影響を受けない（約１．１倍）。一方、中間型（ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１^＋）および未熟型骨髄腫細胞（ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻）は各々約２．４倍、３．５倍の生存細胞数の増加がみられる。
【図５】図５は、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熱型骨髄腫細胞のＩＬ−６に対する反応性と、それに対するｈＰＭ−１抗体の作用を示す。○は表１中の患者由来骨髄腫細胞１３、□は同１４、△は同１５、●は同１６、×は同１７、▼は同１８を示す。これらの未熟型骨髄腫細胞の生存はＩＬ−６により支持され、その生存支持効果をｈＰＭ−１抗体が明らかに阻害する。
【図６】図６は、ＶＬＡ−５⁻ＭＰＣ−１⁻の未熟型骨髄腫細胞（表１中、患者由来骨髄腫細胞１７）のコントロール、ｒＩＬ−６，ｈＰＭ−１およびｒＩＬ−６とｈＰＭ−１の各存在下におけるＦＤＡ／ＰＩ二重染色像を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a therapeutic agent for immature myeloma cells which is resistant to a chemotherapeutic agent comprising an interleukin-6 receptor antibody as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Myeloma is a tumor in which plasma cells have become malignant, and is a tumor that develops at multiple sites using the bone marrow as a place for growth. As a major growth factor for myeloma cells, interleukin 6 (IL-6) is considered as a promising candidate (Kawano et al., Nature, 332, 83, 1988: Klcin et al., Blood, 73, 517, 1989). .
[0003]
IL-6 is a cytokine called B cell stimulating factor 2 or interferon β2.
IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphoid cells (Hirano et al., Nature, 324, 73, 1986), and is subsequently a multifunctional cytokine that affects the function of various cells. (Akira et al., Adv, in Immunology, 54, 1, 1993).
[0004]
IL-6 transmits its biological activity through two proteins on the cell. One is IL-6 receptor (IL-6R), a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 KD to which IL-6 binds. IL-6R exists as soluble IL-6R (sIL-6R) mainly composed of its extracellular region in addition to the membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane. The other is gp130 with a molecular weight of about 130 KD that is involved in non-ligand binding signaling. IL-6 and IL-6R form an IL-6 / IL-6R complex and then bind to another membrane protein gp130, thereby transmitting the biological activity of IL-6 to the cell (Taga Et al., J. Exp. Med. 196: 967, 1987).
[0005]
Kawano et al. Have surface antigens on myeloma cells such as VLA (very late activation antigen) -5 or MPC (mature plasma cell) -1 (Huang et al., Blood 82, 3721, 1993, Japanese Patent Laid-Open No. 6-86688). Myeloma cells are VLA-5 negative (⁻MPC-1⁻Immature myeloma cells, VLA-5⁻MPC-1 positive (⁺) Intermediate myeloma cells and VLA-5⁺MPC-1⁺It has been reported that it can be divided into mature myeloma cells (Blood, 82, 564, 1993).
[0006]
Of these, immature myeloma cells are known to be the main cell population that is resistant to chemotherapeutic agents (Kawano et al., 56th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology, 261, 641). , 1994).
So far, the addition of IL-6R antibody generally inhibits the growth of myeloma cells (Goto et al., Biotherapy 7,655, 1993) and IL-6 stimulates the growth of immature myeloma cells (Kawano et al., Blood, 82, 564, 1993) was known.
[0007]
However, these findings are based on the proliferation of myeloma cells and do not suggest the eradication of immature myeloma cells, which are the main component of chemotherapeutic resistance, which is considered to be important in the treatment of myeloma. It was. Furthermore, there is no data as to whether IL-6R antibody is useful as a radical therapeutic agent for immature myeloma cells, and whether or not IL-6R antibody is directly involved in the survival itself of immature myeloma cells remains. It was unknown.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
For the immature myeloma cells, which are mainly resistant to chemotherapeutic agents, no drug has been found that is effective for the fundamental treatment of the immature myeloma cells. The appearance was awaited. Accordingly, the present invention provides a therapeutic agent for immature myeloma cells.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive research aimed at achieving the above object, the present inventors have found that IL-6R antibody inhibits the survival of immature myeloma cells, which are mainly chemotherapeutic drug resistant, and completed the present invention. It was.
That is, the present invention provides a new therapeutic agent for immature myeloma cells that fundamentally treats immature myeloma cells. More specifically, the present invention provides a therapeutic agent for immature myeloma cells having an inhibitory effect on the survival of immature myeloma cells comprising an IL-6R antibody as an active ingredient. More specifically, the present invention provides an immature myeloma cell survival inhibitor containing an IL-6R antibody as an active ingredient.
[0010]
[Specific explanation]
The IL-6 receptor antibody used in the present invention may be of any origin and type as long as it blocks IL-6 signaling of immature myeloma cells and inhibits IL-6 biological activity ( Monoclonal and polyclonal) are preferred, but mammal-derived monoclonal antibodies are particularly preferred. This antibody is an antibody that inhibits the binding of IL-6 to IL-6R by binding to IL-6R, blocks IL-6 signaling, and inhibits the biological activity of IL-6. .
[0011]
The animal species of the monoclonal antibody producing cell is not particularly limited as long as it is a mammal, and may be derived from a human antibody or a mammal other than human. As a monoclonal antibody derived from mammals other than humans, a monoclonal antibody derived from a rabbit or rodent is preferable because of its ease of preparation. The rodent is not particularly limited, and preferred examples include mouse, rat, hamster and the like.
[0012]
Examples of such IL-6 receptor antibodies include PM-1 antibody (Hirata et al., J. Immunol. 143: 2900-2906, 1989), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody, or AUK146-15 antibody (international patent application). Publication number WO92-19759).
Monoclonal antibodies can be prepared basically using known techniques as follows. That is, using IL-6R as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and by a normal screening method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
[0013]
More specifically, a monoclonal antibody can be prepared as follows. For example, the sensitizing antigen can be obtained by using the gene sequence of human IL-6R disclosed in European Patent Application Publication No. EP325474. The human IL-6R gene sequence is inserted into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, and then the target IL-6R protein is purified from the host cell or culture supernatant. Purified IL-6R protein may be used as a sensitizing antigen.
[0014]
In addition to those expressed on the cell membrane, IL-6R that can be detached from the cell membrane (sIL-6R) can be used as an antigen. sIL-6R is composed mainly of the extracellular region of IL-6R bound to the cell membrane, and the membrane-bound IL-6R is different from the membrane-bound IL-6R in that the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region are deficient. Is different.
The mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Hamsters, rabbits, etc. are used.
[0015]
In order to immunize an animal with a sensitizing antigen, a known method is performed. For example, as a general method, a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously. Specifically, the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline to an appropriate amount and suspended, and if desired, a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant is used in combination with an appropriate amount. Preferably, animals are dosed several times every 4-21 days. In addition, an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
[0016]
After immunizing in this manner and confirming that the desired antibody level rises in the serum, immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion. Preferred immune cells include spleen cells. It is done.
Mammalian myeloma cells as the other parental cells to be fused with the immune cells are already known various cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123: 1548, 1978), p3. -U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8: 405-415). , 1976): SP2 / 0 (Nature, 276: 269-270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148: 313-323). 1978), R210 (Nature, 277). 131-133,1979) or the like is preferably used.
[0017]
The cell fusion between the immune cells and myeloma cells can be performed basically according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981).
More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter. For example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion accelerator, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
[0018]
The usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably 1-10 times that of immune cells relative to myeloma cells, for example. As the culture solution used for the cell fusion, for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used. Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
[0019]
For cell fusion, a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution and pre-warmed to about 37 ° C., for example, PEG having an average molecular weight of about 1000 to 6000, usually a culture solution Is added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to form the desired fused cell (hybridoma). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma can be removed by adding an appropriate culture solution successively and centrifuging to remove the supernatant.
[0020]
The hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. Subsequently, a normal limiting dilution method is performed, and a hybridoma producing the target antibody is screened and single-cloned.
[0021]
The thus produced hybridoma producing a monoclonal antibody can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
In order to obtain a monoclonal antibody from the hybridoma, the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is transplanted to a mammal compatible therewith and proliferated, and the ascites The method obtained as follows is adopted. The former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
[0022]
Furthermore, the monoclonal antibody obtained by the above-described method can be purified with high purity using ordinary purification means such as salting-out method, gel filtration method, affinity chromatography method and the like.
In this way, the prepared monoclonal antibody is highly sensitive to antigens by usual immunological means such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA), and fluorescent antibody method (Immunofluorescence Analysis). In addition, it can be confirmed that the recognition is performed with high accuracy.
[0023]
The monoclonal antibody used in the present invention is not limited to the monoclonal antibody produced by the hybridoma, but may be artificially modified for the purpose of reducing the heteroantigenicity to humans. For example, a chimeric antibody composed of a variable region of a non-human mammal, for example, a mouse monoclonal antibody and a constant region of a human antibody, can be used. In particular, it can be produced using genetic recombination techniques.
[0024]
In addition, reshaped human antibodies can be used in the present invention. This is obtained by replacing the complementarity determining region of a human antibody with a complementarity determining region of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, and a general gene recombination technique is also known. Using the known method, a reshaped human antibody useful in the present invention can be obtained.
[0025]
If necessary, amino acids in the framework region (FR) of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato et al., Cancer). Res. 53: 1-6, 1993). A humanized PM-1 (hPM-1) antibody is preferably exemplified as such a reconstituted human antibody (see International Patent Application Publication No. WO92-19759).
[0026]
Furthermore, as long as it binds to an antigen and inhibits the activity of IL-6, it encodes a fragment of an antibody, for example, a single chain Fv (scFv) in which Fv of Fab or Fv, H chain and L chain are linked by an appropriate linker. Can be constructed and expressed in a suitable host cell and used for the aforementioned purposes. (See, eg, Bird et al., TIBTECH, 9: 132-137, 1991; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988).
[0027]
The therapeutic agent for immature myeloma comprising the IL-6 receptor antibody of the present invention as an active ingredient blocks immature myeloma cell IL-6 signaling and immature bone marrow whose survival is maintained by IL-6 As long as the survival of the tumor cells is inhibited, they are effective in eradicating those immature myeloma cells.
The therapeutic agent for immature myeloma cells of the present invention can be administered systemically or locally, preferably parenterally, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like. Furthermore, it can take the form of a pharmaceutical composition or kit with at least one pharmaceutical carrier or diluent.
[0028]
The dose of the therapeutic agent for immature myeloma cells of the present invention to humans varies depending on the patient's disease state, age or administration method, but it is necessary to select an appropriate amount as appropriate. For example, a divided volume of 4 or less can be selected in the range of approximately 1-1000 mg / patient. However, the premature myeloma cell therapeutic agent of the present invention is not limited to these doses.
[0029]
The therapeutic agent for immature myeloma cells of the present invention can be formulated according to a conventional method. For example, in an injectable preparation, a purified IL-6R antibody is dissolved in a solvent such as physiological saline or a buffer solution, and an adsorption inhibitor such as Tween 80, gelatin, human serum albumin (HSA) or the like is added thereto. It may be added or lyophilized for reconstitution prior to use. As an excipient for lyophilization, sugar alcohols and sugars such as mannitol and glucose can be used.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference examples, experimental examples, and examples, but the present invention is not limited thereto.
Reference example 1.Preparation of human IL-6 receptor antibody PM-1
Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) obtained by activating the anti-IL-6R antibody MT18 prepared by the method of Hirata et al. (J. Immunol., 143: 2900-2906, 1989) with CNBr and the accompanying formulation And purified IL-6R (Yamazaki et al., Science 241: 825-828, 1988).
[0031]
That is, human myeloma cell line U266 was prepared from 1% digitonin (manufactured by Wako Chemicals), 1 mM p-paraaminophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (manufactured by Wako Chemicals) containing 10 mM triethanolamine (pH 7.8) and 0.15 M NaCl (manufactured by Wako Chemicals). Buffer) and mixed with MT18 antibody conjugated to Sepharose 4B beads. Thereafter, the beads were washed 6 times with digitonin buffer solution to obtain partially purified IL-6R used for immunization.
[0032]
3 x 10 BALB / c mice⁹The partially purified IL-6R obtained from a single U266 cell was immunized 4 times every 10 days, and then a hybridoma was prepared by a conventional method. The hybridoma culture supernatant from the growth positive well was examined for the binding activity to IL-6R by the following method. 5 × 10⁷U266 cells were labeled with 35S-methionine (2.5 mCi) and solubilized with the digitonin buffer.
[0033]
Solubilized U266 cells were mixed with 0.018 ml volume of Sepharose 4B beads conjugated MT18 antibody, then washed 6 times with digitonin buffer, and 0.25 ml of digitonin buffer (pH 3.4).³⁵S-methionine labeled IL-6R was drained and neutralized with 0.025 ml of 1 M Tris (pH 7.4). 0.05 ml of the hybridoma culture supernatant was mixed with 0.01 ml of Protein G Sepharose (manufactured by Pharmacia).
[0034]
After washing, Sepharose was prepared in 0.005 ml prepared above.³⁵Incubated with S-labeled IL-6R solution. Immunoprecipitates were analyzed by SDS-PAGE to examine hybridoma culture supernatants that react with IL-6R. As a result, a reaction positive hybridoma clone PM-1 was established. IL-6R antibody PM-1 produced from hybridoma PM-1 has a subtype of IgGlκ type.
[0035]
The inhibitory activity of IL-6 binding to the human IL-6R of the antibody produced by hybridoma PM-1 was examined using the human myeloma cell line U266. Recombinant human IL-6 was prepared from E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) and Bolton-Hunter reagent (New England Nuclear, Boston. MA).¹²⁵I-labeled (Taga et al., J. Exp. Med. 166: 967, 1987).
[0036]
4x10⁵Of U266 cells were cultured in 70% (v / v) hybridoma PM-1 culture supernatant and 14000 CPM for 1 hour at room temperature in the presence of 100-fold excess of unlabeled IL-6.¹²⁵Incubated with I-labeled IL-6. 70 μl of the sample was overlaid on 300 μl FCS in a 400 μl microfuge polyethylene tube, and after centrifugation, the radioactivity on the cells was measured.
As a result, it was revealed that the antibody produced by hybridoma PM-1 inhibits the binding of IL-6 to IL-6R.
[0037]
Reference Example 2 Production of human antibody hPM-1
Humanized antibody hPM-1 was obtained by the method described in International Patent Application Publication No. WO92-19759.
Total RNA was prepared from the hybridoma PM-1 prepared in Reference Example 1 by a conventional method, and single-stranded cDNA was synthesized therefrom. The DNA of the V region of mouse PM-1 was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method. Primers used in the PCR method are S.A. T.A. The one described in Jones et al., Bio / Technology, 9, 88, 1991 was used.
[0038]
A DNA fragment amplified by the PCR method was purified to obtain a DNA fragment containing a gene encoding a mouse kappa type L chain V region and a DNA fragment containing a gene encoding a mouse gamma type H chain variable region. These DNA fragments were ligated to plasmid pUC19 and introduced into E. coli DH5α competent cells to obtain E. coli transformants. The plasmid was obtained from this transformant, the base sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined according to a conventional method, and the complementarity determining region (CDR) of each V region was determined.
[0039]
In order to prepare a vector expressing the chimeric PM-1 antibody, cDNAs encoding the mouse PM-1 κ L chain and H chain V regions were inserted into the HCMV expression vector.
In order to prepare a humanized human PM-1 antibody, the V region CDR of mouse PM-1 was transplanted to a human antibody by the CDR transplantation method. The amino acids in the framework region (FR) of the variable region of the antibody were substituted so that the CDR of the humanized antibody formed an appropriate antigen binding site.
[0040]
In order to express the L-chain and H-chain genes of the humanized PM-1 antibody thus prepared in mammalian cells, each was introduced into a vector containing a human elongation factor Iα (HEF-1α) promoter. Then, a vector expressing humanized PM-1 antibody L chain and H chain was prepared. A cell line producing humanized PM-1 (hPM-1) was established by simultaneously inserting these two expression vectors into CHO cells. The binding ability of the obtained humanized antibody to human IL-6R was confirmed by ELISA. Furthermore, hPM-1 inhibited the binding of human IL-6 to human IL-6R, as did mouse and chimeric antibodies.
[0041]
Experimental example
(1) Classification of myeloma cells
Myeloma cells obtained from myeloma patients were identified and classified based on surface antigens using flow cytometry.
The bone marrow fluid was centrifuged with a lymphocyte separation solution Separate-L (Muto Pure Chemicals Co.) to separate mononuclear cells.
[0042]
These bone marrow cells were treated with 200 μg / ml BSA and 0.01% NaN₃5 × 10 in PBS containing⁵First, 20 μl each of anti-CD19 monoclonal antibody (mAB) (Immunotech), anti-CD56 mAB (Coulter), anti-VLA-5 mAB (Immunotech) or anti-MPC-1 mAB (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6) -86688) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C for 30 minutes, and then washed twice with PBS (pH 7.2) containing 20 mM sodium phosphate and 0.25 M NaCl.
[0043]
Subsequently, it was stained with 40 μl of PE (phycoerythrin) -conjugated goat anti-mouse IgG (manufactured by Immunotech) diluted 100-fold (4 ° C., 30 minutes), washed twice with PBS, and then 15 μl of mouse serum (Chemicon) Incubate at 4 ° C. for 20 minutes, add 5 μl of FITC (fluorescein isothiocyanate) -conjugated anti-CD38 mAB (manufactured by Immunotech) in 20 μl of the PBS, and stain (4 ° C., 30 minutes). Washed twice with PBS.
[0044]
These double-stained bone marrow cells were analyzed by measuring fluorescence with a flow cytometer (EPICS ELITE, Coulter). As a result of analyzing the surface antigen of the cells appearing in the strongly positive CD38 fraction, which is a characteristic of myeloma cells, myeloma cells were found to be VLA-5.⁺MPC-1⁺Mature form of VLA-5⁻MPC-1⁺Intermediate type and VLA-5⁻MPC-1⁻(Kawano et al., Blood, 82, 564, 1993).
[0045]
(2) Induction of apoptosis in myeloma cells
The determination of myeloma cell viability and dead cell apoptosis was determined by two-staining flow cytometry (Cancer Res.) Using FDA (fluorescein diacetate, Aldrich Chem. Co.) and PI (propidium iodide, Sigma). , 49, 3776, 1989), and the distribution of cells in which apoptosis was induced is shown mechanically in FIG.
[0046]
Human myeloma cell line KMS-5 (Ohtsuki et al., Acto. Haematol. Jpn., 51, 1052, 1988) (1 × 10⁶) 1x10 dexamethasone (manufactured by Sigma) that induces apoptosis is prepared in RPMI culture medium with 10% FCS added so that the number of cells / ml^-7It added so that it might become M. After 24 hours of culture at 37 ° C., KMS-5 cells were double-stained with FDA / PI, and fluorescence was measured with a flow cytometer. As a result, as shown in FIG.⁺PI⁻) And the fraction of cells in which apoptosis was induced (FDA⁻PI⁻) Appeared.
[0047]
FDA⁺PI⁻Fraction and FDA⁻PI⁻The cells of the fraction were collected by flow cytometry, and Br. J. et al. Haematol. , 71, 343, 1988, DNA was extracted. The DNA thus prepared was analyzed by 1.2% agarose gel electrophoresis. As a result, as shown in FIG.⁺PI⁻The fractional cell-derived DNA was not degraded, but the FDA⁻PI⁻The cells of the fraction showed obvious DNA degradation and ladder-like bands characteristic of apoptosis.
[0048]
Example
Changes in the in vitro survival rate of patient myeloma cells were examined by the FDA / PI double staining flow cytometry method described in the experimental examples.
In the same manner as in the above Examples, myeloma cells were stained with PE-conjugated anti-VLA-5 antibody and PE-conjugated anti-MPC-1 antibody, and the following cell groups were collected.
Sorted VLA-5⁺MPC-1⁺Mature form of VLA-5⁻MPC-1⁺Intermediate type and VLA-5⁻MPC-1⁻1 × 10 of immature myeloma cells⁶10% FCS and 1x10 to be pieces / ml^-5Suspend in RPMI medium containing M 2-mercaptoethanol, 35 × 10 mm tissue culture
Dispensing into dish (Falcon).
[0049]
These cells were treated with 20 U / ml recombinant human IL-6 (rIL-6; Hirano et al., Nature, 324, 73, 1986), 50 μg / ml humanized anti-hIL-6 receptor antibody (hPM-1 After culturing at 37 ° C. for 3 days in the presence or absence, fluorescence was measured with a flow cytometer (EPICS ELITE, Coulter) using FDA / PI to determine the ratio of viable cells. The control was cultured in the absence of rIL-6 and hPM-1. The results are shown in Table 1.
[0050]
[Table 1]

[0051]
Furthermore, from these results, the effect of rIL-6 on the viability of mature, intermediate and immature myeloma cells is shown in FIG. VLA-5⁻MPC-1⁻FIG. 5 shows the rIL-6 reactivity of immature myeloma cells having various surface antigens and the effect of hPM-1 antibody on the reactivity. VLA-5⁺MPC-1⁺Mature myeloma cells (in Table 1, patient-derived myeloma cells 1-9) maintained a relatively high survival rate even with the culture medium alone. These mature myeloma cells hardly responded to rIL-6, and the survival inhibitory effect by hPM-1 antibody was not observed. On the other hand, VLA-5⁻MPC-1⁻The immature myeloma cells (patient-derived myeloma cells 13-18 in Table 1) were not able to maintain their survival only with the culture medium, and were shown to be prone to apoptosis.
[0052]
These cells were highly responsive to IL-6, and the survival rate was increased by rIL-6. At this time, the survival maintenance effect of immature myeloma cells by rIL-6 was clearly inhibited by the hPM-1 antibody (FIG. 5). FIG. 6 shows FDA / PI double-stained images of immature myeloma cells (in Table 1, patient-derived myeloma cells 17) in the presence of control, rIL-6, hPM-1, and rIL-6 and hPM-1. Show.
[0053]
Compared with the control, in the rIL-6 addition group, the intensity of the image inducing apoptosis (lower left, D) was low, and the ratio of live cells (lower right, E) was large. In contrast, in the presence of rIL-6 and hPM-1, the intensity of the fraction of cells in which apoptosis was induced (lower left, D) was high. VLA-5⁻MPC-1⁺The intermediate myeloma cells exhibiting the same were not as much as the immature type, but it was shown that the survival rate was increased in response to rIL-6 and that this action was inhibited by hPM-1.
[0054]
【The invention's effect】
Surface antigen VLA-5, which is the main component of the myeloma cell population that is often resistant to treatment⁻MPC-1⁻IL-6 is deeply involved in maintaining the survival of immature myeloma cells. The inhibitory effect of IL-6 receptor antibody on the survival of immature myeloma cells is VLA-5⁻MPC-1⁻Since it was strongly observed in immature myeloma cells, the IL-6 receptor antibody of the present invention was suggested to be useful as a therapeutic agent for immature myeloma cells.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 schematically shows the distribution of myeloma cells in which apoptosis is induced by double staining flow cytometry. E is a living cell (FDA⁺PI⁻), D is apoptosis-inducing cell (FDA)⁻PI⁻), C is an image of dead cells without apoptotic features.
FIG. 2 is a flow cytometry image of myeloma cell line KMS-5 in which apoptosis was induced by dexamethasone treatment.
FIG. 3 shows an FDA⁺PI⁻(E) and FDA⁻PI⁻(D) DNA agarose gel electrophoresis diagram of cells of fraction. Lane 1 is molecular weight marker, Lane 2 is FDA⁺PI⁻(E) Fraction, Lane 3 is FDA⁻PI⁻(D) It is a fraction. In lane 3, a ladder-like band characteristic of DNA degradation and apoptosis is seen.
FIG. 4 shows the effect of IL-6 on myeloma cell viability. In the presence of IL-6, thermosensitive myeloma cells (VLA-5⁺MPC-1⁺) Is almost unaffected by its presence (approximately 1.1 times). On the other hand, intermediate type (VLA-5⁻MPC-1⁺) And immature myeloma cells (VLA-5)⁻MPC-1⁻) Increase the number of viable cells by about 2.4 times and 3.5 times, respectively.
FIG. 5 shows VLA-5⁻MPC-1⁻Shows the reactivity of unheated myeloma cells to IL-6 and the effect of hPM-1 antibody on it. In Table 1, the patient-derived myeloma cells 13 in Table 1, □ indicates the same 14, Δ indicates the same 15, ● indicates the same 16, × indicates the same 17, and ▼ indicates the same 18. The survival of these immature myeloma cells is supported by IL-6, and hPM-1 antibody clearly inhibits the survival support effect.
FIG. 6 shows VLA-5⁻MPC-1⁻FDA / PI double-stained images in the presence of control, rIL-6, hPM-1 and rIL-6 and hPM-1 of immature myeloma cells (in Table 1, patient-derived myeloma cells 17) in FIG. .

Claims

As an active ingredient interleukin-6 receptor ^{antibody, VLA-5 - MPC-1} - Survival inhibitors of immature myeloma cells having a surface antigen.

2. The immature myeloma cell survival inhibitor according to claim 1, wherein the interleukin-6 receptor is a human interleukin-6 receptor.

2. The immature myeloma cell survival inhibitor according to claim 1, wherein the interleukin-6 receptor antibody is a monoclonal antibody.

2. The immature myeloma cell survival inhibitor according to claim 1, wherein the interleukin-6 receptor antibody is a humanized antibody.

2. The immature myeloma cell survival inhibitor according to claim 1, wherein the interleukin-6 receptor antibody is a PM-1 antibody.

2. The immature myeloma cell survival inhibitor according to claim 1, wherein the interleukin-6 receptor antibody is a humanized PM-1 antibody.