【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモチリンアンタゴニスト
に関する。
【０００２】
【従来の技術】消化管ホルモンの一つであるモチリン
は、ブタ十二指腸より抽出された２２個の直鎖のペプチ
ドであり（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎ．
Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４
９、 ３９９−４０５ １９７１）、ヒトを含む哺乳類
動物の消化管運動を調節していることはよく知られてい
る。外因性に与えたモチリンは、ヒトおよびイヌに空腹
期伝播性収縮（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｍｉｇ
ｒａｔｉｎｇ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ，ＩＭＣ）と
同様な収縮を引き起こし、胃排出を促進することが報告
されている（Ｉｔｏｈｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ．
Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １１、９３−１
１０ １９７６； Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０２、 ９７−
１０１ １９９２）。そのため、モチリンアゴニストで
あるエリスロマイシン誘導体が消化管運動機能促進剤と
して開発が進められている（Ｉｎａｔｏｍｉ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ．Ｔｈｅ
ｒ． ２５１、 ７０７−７１２ １９８９； Ｓａｔ
ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．２５４、 ９４０−９４４ １９
９０）。
【０００３】またモチリンレセプターは、十二指腸に主
に存在することが知られていたが、最近、下部消化管の
大腸にも存在することが認められ（Ｗｉｌｌｉａｍ ｅ
ｔａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６
２、 Ｇ５０−Ｇ５５ １９９２）、上部消化管運動ば
かりでなく、下部消化管運動調節にもモチリンが関与す
る可能性が示されている。さらに、下痢症状を示す過敏
性腸症候群患者やストレス下の過敏性腸症候群患者が高
モチリン血症を示すことが報告されており（Ｐｒｅｓｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ ２６、 １０５９−１
０６４ １９８５； Ｆｕｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５１、
３７３−３８５ １９８７）、本病態に血中モチリンの
上昇が関与する可能性が示唆されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、選択的
なモチリンレセプターアンタゴニストはまだ発見されて
おらず、そのことが、モチリンの消化管運動に対する作
用の研究や、本分野における医薬品の開発研究において
大きな妨げになっている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以上のよ
うな観点からモチリンアンタゴニストについて鋭意研究
を重ねた結果、本発明の化合物がモチリンアンタゴニス
トの作用を有することを見いだし、本発明を完成した。
本発明化合物であるモチリンレセプターアンタゴニスト
は、モチリンおよびモチリンアゴニストの開発研究にお
いて、薬理学的なツールとして使えるばかりでなく、過
敏性腸症候群など消化管運動機能に関連した疾患に対す
る医薬品として開発できる可能性もある。
【０００６】本発明化合物は新規なペプチドであり、通
常のペプチド合成法、例えば固相合成法や液相合成法な
どで合成できる。また、アミノ酸上の置換基はペプチド
合成の前後の何れにおいても導入することができる。チ
ロシン残基への置換基の導入は、通常の有機化学的方法
例えばプロトン酸やルイス酸などの酸触媒の存在下での
フリーデルクラフツ反応などにより行うことができる。
【０００７】
【実施例】以下に実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。
【０００８】
【参考例１】化合物１の合成
【化２】
ＰＥＰＳＹＮ ＫＡ樹脂（ミリジェン社製、０．２ｍｍ
ｏｌ／ｇ）３．５ｇをＤＭＦ中にて膨潤させた後、Ｆｍ
ｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ １．７４ｇ 、ジイソプロピル
カルボジイミド３５３ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジ
ン８６ｍｇを加え、室温にて一晩放置し、反応させる。
反応終了後、ＤＭＦ，メタノール、酢酸で順次洗浄した
後、メタノール、ＤＭＦにて再度順次洗浄する。得られ
たＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＰＥＰＳＹＮ ＫＡ樹脂を原料
として、ペプチド合成装置（ＬＫＢ Ｂｉｏｌｙｎｘ４
１７５）を用いた固相合成法によってペプチド合成を行
う。常法にしたがって、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−
ＰＦＰエステル、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＤＨＢ
Ｔエステルを順次反応、脱保護させた後、Ｆｍｏｃ−Ｐ
ｈｅ−ＰＦＰエステルのカップリング反応終了後、ＤＭ
Ｆ，メタノールにて順次洗浄し、乾燥して、保護ペプチ
ド樹脂３．９ｇを得る。得られた保護ペプチド樹脂３．
９ｇに、ＴＦＡ４．７ｍｌ、アニソール２．５ｍｌ、
１，２−エタンジチオール０．５ｍｌを加え、室温にて
２時間反応させる。濾過の後、濾液を減圧下にて濃縮
し、氷冷した無水エーテル中にあけ固体化する。得られ
た固体を遠心分離により収集し、無水エーテルにより洗
浄した後、乾燥させる。ＤＭＦ２００ｍｌ及びピリジン
２００ｍｌを加え、Ｂｏｐ試薬１．５５ｇを加えて、２
４時間反応させる。反応終了後減圧にて濃縮し、水を加
えて固体とし、一晩攪拌後、固体を濾集し乾燥させる。
２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液を加え２０分間室温で攪
拌した後、ＤＭＦを加え減圧にて濃縮する。得られた濃
縮液をセップパックＣ１８（ウォーターズ社製）で処理
した後、減圧下で濃縮し、高速液体クロマトグラフィー
［カラム；ＹＭＣ ＯＤＳ、移動相；アセトニトリル
（０．１％ＴＦＡ）／蒸留水（０．１％ＴＦＡ） １０
％→３０％グラジェント３０ｍｉｎ］にて、分離精製す
る。得られたピーク画分を凍結乾燥すると、化合物１
５６．９ｍｇを得る。
【０００９】アミノ酸分析
測定値（理論値） βＡｌａ；１．２３（１） Ｔｙ
ｒ；１．０９（１）
Ｐｈｅ；１．００（１） Ｌｙｓ；０．６３（１）
Ｆａｂ−Ｍａｓｓ ｍ／ｚ ５１０（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１０】
【実施例１】化合物２の合成
【化３】
参考例１で得られた化合物１ １７０ｍｇに、ＴＦＡ１
０ｍｌ，トリメチルシリルトリフラート０．１ｍｌを加
え、氷−食塩にて冷却しながらイソブテンガスを導入す
る。氷冷した無水エーテル中にあけ固体化し、得られた
固体を遠心分離により収集し、無水エーテルにより洗浄
する。ＤＭＦを加え溶解し、セップパックＣ１８（ウォ
ーターズ社製）で処理した後、高速液体クロマトグラフ
ィー［カラム；ＹＭＣ ＯＤＳ、移動相；アセトニトリ
ル（０．１％ＴＦＡ）／蒸留水（０．１％ＴＦＡ） ２
０％→６０％グラジェント４０ｍｉｎ］にて、分離精製
する。得られたピーク画分を凍結乾燥すると、化合物２
８５．５ｍｇを得る。
【００１１】ＮＭＲ（９０％Ｈ２Ｏ−１０％Ｄ２Ｏ）
δ；１．０１〜１．１１（ｍ，２Ｈ） １．２９（ｓ，
９Ｈ） １．３８〜１．４７（ｍ，２Ｈ） １．４９〜
１．６３（ｍ，２Ｈ） ２．０７〜２．３１（ｍ，２
Ｈ） ２．６２〜２．８８（ｍ，２Ｈ） ２．８０〜
２．９０（ｍ，２Ｈ）
３．９７〜４．０７（ｂｒｓ，１Ｈ） ４．２７〜４．
３３（ｍ，１Ｈ） ４．４０〜４．４７（ｍ，１Ｈ）
６．６４（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ） ６．８０（ｄ，Ｊ
＝８Ｈｚ，１Ｈ） ６．９５（ｓ，１Ｈ） ７．１４〜
７．２０（ｍ，２Ｈ） ７．２１〜７．２７（ｍ，２
Ｈ） ７．３５〜７．４０（ｍ，１Ｈ） ７．６０〜
７．６５（ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，８Ｈｚ、１Ｈ） ８．０
３（ｂｒｓ，３Ｈ）８．３９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）
８．５７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）
Ｆａｂ−Ｍａｓｓ ｍ／ｚ ５６６（Ｍ＋Ｈ）＋
【００１２】
【試験例１】モチリン受容体結合実験
モチリン受容体結合実験は次の方法で行った［Ｖａｎｔ
ｒａｐｐｅｎ ｅｔａｌ．，Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ，１５，１４３（１９８６）］。屠殺したウサギ
より十二指腸を摘出し、粘膜を剥離後、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ溶液中でｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅして蛋白液とした。
蛋白液を１２５Ｉモチリン２５ｐＭと共にインキュベー
トした後に、蛋白に結合した放射活性を測定した。イン
キュベート液中に、何も添加しなかった際の放射活性と
大過剰のモチリン（１０−７Ｍ）を添加した際の放射活
性の差を特異的結合とした。薬物の活性は特異的結合を
５０％に減らす濃度（ＩＣ５０，Ｍ）で表した。その結
果、本発明化合物は用量依存的に特異的結合を減少さ
せ、ＩＣ５０は、１．０±０．３ｘ１０−８Ｍ（Ｎ＝
４）と計算された。
【００１３】
【試験例２】ウサギ摘出十二指腸縦層筋標本の収縮に対
する作用
モチリンによるウサギ摘出十二指腸縦層筋標本の収縮に
対する本発明化合物の作用を調べた。屠殺したウサギよ
り摘出した十二指腸標本（５ｘ１５ｍｍ）を、２８℃に
加温したｋｒｅｂｓ溶液を満たした恒温槽（ｏｒｇａｎ
ｂａｔｈ １０ｍｌ）中に縦走筋方向に懸垂した。混
合ガス（９５％ ０２，５％Ｃ０２）をＫｒｅｂｓ溶液
に連続的に通気し、十二指腸標本の収縮は、ｉｓｏｔｏ
ｎｉｃｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＭＥ−３４０７，ＭＥ
Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を介
して等張性（負荷 １ｇ）に記録した。収縮の程度はア
セチルコリン１０−４Ｍの濃度による収縮を１００％と
して、それに対する割合で示した。結果を図１に示す。
【図１】恒温槽内に滴下されたモチリンは、十二指腸標
本を濃度依存的に収縮させた。本発明化合物の恒温槽内
への前処置は、モチリンの濃度依存性収縮曲線を右に平
行移動させた。この結果のＳｃｈｉｌｄプロットを図２
に示した。
【図２】これより直線の傾きは１．０７、ｐＡ２値は
７．１７と計算された。また、本発明化合物はアセチル
コリンおよびＫＣｌの濃度依存性収縮曲線には影響を与
えなかった。この結果より、本発明化合物は、モチリン
の競合的な拮抗剤と考えられた。Description [0001] The present invention relates to motilin antagonists. [0002] Motilin, one of the gut hormones, is a 22 linear peptide extracted from pig duodenum (Brown et al., Can.
J. Physiol. Pharmacol. 4
9, 399-405 1971), and is well known to regulate gastrointestinal motility in mammals, including humans. Motilin given exogenously gives fasting-induced contractions (Interdigestive Mig) to humans and dogs.
It has been reported that it causes contraction similar to that of ratting contractions (IMC) and promotes gastric emptying (Itoh et al., Scand.
J. Gastroenterol. 11, 93-1
10 1976; Peters et al. ,
Gastroenterology 102, 97-
101 1992). Therefore, erythromycin derivatives, which are motilin agonists, are being developed as gastrointestinal motility promoters (Inatomi et a).
l. , J. et al. Pharmacol. Exp. The
r. 251, 707-712 1989; Sat
oh et al. , J. et al. Pharmacol.
Exp. Ther. 254, 940-944 19
90). The motilin receptor has been known to mainly exist in the duodenum, but has recently been found to also exist in the large intestine of the lower gastrointestinal tract (Williamme).
tal. , Am. J. Physiol. 26
2, G50-G55 1992), indicating that motilin may be involved not only in upper gastrointestinal motility but also in lower gastrointestinal motility regulation. Furthermore, it has been reported that irritable bowel syndrome patients showing diarrhea symptoms and irritable bowel syndrome patients under stress show hypermotilinemia (Prest
on et al. , Gut 26, 1059-1
064 1985; Fukudo et al. ,
Tohoku J .; Exp. Med. 151,
373-385 1987), and it has been suggested that elevated blood motilin may be involved in this disease state. [0004] However, a selective motilin receptor antagonist has not yet been discovered, which has led to studies on the effects of motilin on gastrointestinal motility and research and development of pharmaceuticals in this field. Is a major hindrance. The present inventors have conducted intensive studies on motilin antagonists from the above viewpoints, and as a result, have found that the compound of the present invention has the action of a motilin antagonist. Completed the invention.
The motilin receptor antagonist of the present invention can be used not only as a pharmacological tool in the development research of motilin and motilin agonists, but also as a drug for diseases related to gastrointestinal motility such as irritable bowel syndrome. There is also. The compound of the present invention is a novel peptide and can be synthesized by an ordinary peptide synthesis method, for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. In addition, a substituent on an amino acid can be introduced before or after peptide synthesis. Introduction of a substituent to a tyrosine residue can be carried out by a conventional organic chemical method such as a Friedel-Crafts reaction in the presence of an acid catalyst such as a protonic acid or a Lewis acid. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Reference Example 1 Synthesis of Compound 1 PEPSYN KA resin (Milligen, 0.2 mm
ol / g) After swelling 3.5 g in DMF, Fm
1.74 g of oc-βAla-OH, 353 mg of diisopropylcarbodiimide, and 86 mg of 4-dimethylaminopyridine are added, and left at room temperature overnight to react.
After the completion of the reaction, the resultant is sequentially washed with DMF, methanol and acetic acid, and then sequentially again with methanol and DMF. Using the obtained Fmoc-βAla-PESYN KA resin as a raw material, a peptide synthesizer (LKB Biolynx4) was used.
The peptide is synthesized by the solid phase synthesis method using 175). According to a conventional method, Fmoc-Tyr (tBu)-
PFP ester, Fmoc-Lys (Boc) -DHB
After sequentially reacting and deprotecting the T ester, Fmoc-P
After completion of the coupling reaction of the he-PFP ester, DM
It wash | cleans in order by F and methanol, and it dries, and obtains 3.9 g of protected peptide resins. 2. Obtained protected peptide resin
In 9 g, 4.7 ml of TFA, 2.5 ml of anisole,
0.5 ml of 1,2-ethanedithiol is added and reacted at room temperature for 2 hours. After filtration, the filtrate is concentrated under reduced pressure, poured into ice-cooled anhydrous ether, and solidified. The resulting solid is collected by centrifugation, washed with anhydrous ether and dried. 200 ml of DMF and 200 ml of pyridine were added, 1.55 g of Bop reagent was added, and 2
Incubate for 4 hours. After completion of the reaction, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and solidified by adding water. After stirring overnight, the solid is collected by filtration and dried.
After adding a 20% piperidine-DMF solution and stirring for 20 minutes at room temperature, DMF is added and concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate is treated with Seppak C 18 (manufactured by Waters), concentrated under reduced pressure, and subjected to high-performance liquid chromatography [column: YMC ODS, mobile phase: acetonitrile (0.1% TFA) / distilled water] (0.1% TFA) 10
% → 30% gradient 30 min]. When the obtained peak fraction was lyophilized, Compound 1 was obtained.
56.9 mg are obtained. Amino acid analysis measured value (theoretical value) βAla; 1.23 (1) Ty
r; 1.09 (1) Phe; 1.00 (1) Lys; 0.63 (1) Fab-Mass m / z 510 (M + H) + Example 1 Synthesis of Compound 2 ] 170 mg of the compound 1 obtained in Reference Example 1 was added to TFA1
0 ml and 0.1 ml of trimethylsilyl triflate are added, and isobutene gas is introduced while cooling with ice-salt. The solid is poured into ice-cold anhydrous ether and the resulting solid is collected by centrifugation and washed with anhydrous ether. DMF was added and dissolved, treated with Seppak C 18 (manufactured by Waters), and then subjected to high performance liquid chromatography [column: YMC ODS, mobile phase: acetonitrile (0.1% TFA) / distilled water (0.1% TFA) ) 2
[0% → 60% gradient 40 min]. The resulting peak fraction was lyophilized to give Compound 2
85.5 mg are obtained. NMR (90% H 2 O-10% D 2 O) δ; 1.01-1.11 (m, 2H) 1.29 (s,
9H) 1.38-1.47 (m, 2H) 1.49-
1.63 (m, 2H) 2.07 to 2.31 (m, 2H)
H) 2.62 to 2.88 (m, 2H) 2.80 to
2.90 (m, 2H) 3.97-4.07 (brs, 1H) 4.27-4.
33 (m, 1H) 4.40 to 4.47 (m, 1H)
6.64 (d, J = 8 Hz, 1H) 6.80 (d, J
= 8 Hz, 1H) 6.95 (s, 1H) 7.14-
7.20 (m, 2H) 7.21 to 7.27 (m, 2H)
H) 7.35-7.40 (m, 1H) 7.60-
7.65 (dd, J = 8 Hz, 8 Hz, 1H) 8.0
3 (brs, 3H) 8.39 (d, J = 8 Hz, 1H)
8.57 (d, J = 8 Hz, 1 H) Fab-Mass m / z 566 (M + H) + [Test Example 1] Motilin receptor binding experiment The motilin receptor binding experiment was performed by the following method [Vant
rappen et al. , Regul. Pepti
des, 15, 143 (1986)]. The duodenum was removed from the sacrificed rabbit, the mucous membrane was detached, and 50 mM Tr was removed.
It was homogenized in an is solution to obtain a protein solution.
After incubating the protein solution with 25 pM of 125 I motilin, the radioactivity bound to the protein was measured. The difference between the radioactivity when nothing was added and the radioactivity when a large excess of motilin (10 −7 M) was added to the incubation solution was defined as specific binding. Drug activity was expressed as the concentration that reduced specific binding to 50% (IC 50 , M). As a result, the compound of the present invention reduced specific binding in a dose-dependent manner, and IC 50 was 1.0 ± 0.3 × 10 −8 M (N =
4) was calculated. Test Example 2 Effect on contraction of a rabbit isolated duodenal longitudinal muscle sample The effect of the compound of the present invention on contraction of a rabbit isolated duodenal longitudinal muscle sample by motilin was examined. A duodenal specimen (5 × 15 mm) extracted from a sacrificed rabbit was placed in a thermostat (organ) filled with a krebs solution heated to 28 ° C.
bath 10 ml) in the longitudinal muscle direction. A gas mixture (95% 0,5% C02) was continuously bubbled through the Krebs solution and the contraction of the duodenal specimen was
nictransducer (ME-3407, ME
It was recorded isotonic (load 1 g) via Commercial (Tokyo, Japan). The degree of contraction was expressed as a percentage with respect to the contraction due to the concentration of acetylcholine 10 −4 M as 100%. The results are shown in FIG. FIG. 1. Motilin dropped into a thermostat shrinks a duodenal specimen in a concentration-dependent manner. Pretreatment of the compound of the present invention in a thermostatic bath translated the concentration-dependent contraction curve of motilin to the right. The resulting Schild plot is shown in FIG.
It was shown to. FIG. 2 From this, the slope of the straight line was calculated to be 1.07, and the pA2 value was calculated to be 7.17. Further, the compound of the present invention did not affect the concentration-dependent contraction curves of acetylcholine and KCl. From these results, the compound of the present invention was considered to be a competitive antagonist of motilin.
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明化合物のウサギ摘出十二指腸縦層筋標
本の収縮に対する作用を示す。
【図２】 本発明化合物のＳｃｈｉｌｄプロットを示
す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the effect of the compound of the present invention on contraction of a rabbit isolated duodenal longitudinal muscle sample. FIG. 2 shows a Schild plot of the compound of the present invention.
─────────────────────────────────────────────────────
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(56)参考文献 Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，1989年,
257，Ｇ470−Ｇ474
Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，2002年，45,
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(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 5/023
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＣＡ（ＳＴＮ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References Am J Physiol, 1989, 257, G470-G474 J Med Chem, 2002, 45, 670-675 Biomed Med Chem Lett, 1999, 9 (24), 3441-3446 (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C07K 5/023 MEDLINE (STN) CA (STN)