JP2824155B2 - 試料中の又は試料からアポトーシス細胞を検出し及び／又は場合により定量し及び／又は分離するための方法 - Google Patents
試料中の又は試料からアポトーシス細胞を検出し及び／又は場合により定量し及び／又は分離するための方法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は医学及び薬理学の分野に存する。特に本発明
は、臨床的診断を支持し、薬剤及び治療の有効性を評価
し、監視するために生理学及び病理学においてアポトー
シス（apoptosis）を測定する方法に関する。
は、臨床的診断を支持し、薬剤及び治療の有効性を評価
し、監視するために生理学及び病理学においてアポトー
シス（apoptosis）を測定する方法に関する。
発明の背景 生物の細胞の合計数は、一方で新しい細胞の生成（増
殖）に導く過程、及び他方で存在する細胞の破壊（細胞
死）に導く過程の結果である。アポトーシスは存在する
細胞の破壊を担う主要な過程である（１）。
殖）に導く過程、及び他方で存在する細胞の破壊（細胞
死）に導く過程の結果である。アポトーシスは存在する
細胞の破壊を担う主要な過程である（１）。
アポトーシスは、究極的に細胞死に導く一連の別個の
事象を特徴とする過程である、計画された細胞死又は細
胞自殺としても既知である。アポトーシスに入る細胞
は、隣接細胞との連結部があればそれを破壊する。細胞
質が濃厚になり、核が凝集し、壊れて断片となる。アポ
トーシスの開始時に、染色質は圧縮され、核膜に対して
分離する。細胞質は濃厚になり、核及び細胞膜は渦巻き
始める。後期アポトーシスにおいて、核の断片化が起こ
り、細胞表面は隆起を現す。アポトーシス体が形成さ
れ、それは近隣細胞により捕食される。アポトーシスの
間に原形質膜の性質が変化する。例えば炭水化物組成に
おける変更及び膜の疎水性及び電荷の変化が起こる。小
胞体は小胞に変化し、それは原形質膜と融合し、細胞内
液及びイオンの消失が起こる。最後の段階において、細
胞は複数の小さいアポトーシス体に分解する。
事象を特徴とする過程である、計画された細胞死又は細
胞自殺としても既知である。アポトーシスに入る細胞
は、隣接細胞との連結部があればそれを破壊する。細胞
質が濃厚になり、核が凝集し、壊れて断片となる。アポ
トーシスの開始時に、染色質は圧縮され、核膜に対して
分離する。細胞質は濃厚になり、核及び細胞膜は渦巻き
始める。後期アポトーシスにおいて、核の断片化が起こ
り、細胞表面は隆起を現す。アポトーシス体が形成さ
れ、それは近隣細胞により捕食される。アポトーシスの
間に原形質膜の性質が変化する。例えば炭水化物組成に
おける変更及び膜の疎水性及び電荷の変化が起こる。小
胞体は小胞に変化し、それは原形質膜と融合し、細胞内
液及びイオンの消失が起こる。最後の段階において、細
胞は複数の小さいアポトーシス体に分解する。
アポトーシスを介した細胞死は非同調的やり方で１つ
の集団内の単一細胞を襲い、炎症応答なして幾分目立た
ずに起こる（２）。
の集団内の単一細胞を襲い、炎症応答なして幾分目立た
ずに起こる（２）。
正常な組織のホメオスタシスは、細胞が１つ加わる毎
に１つが死ななければならないことを必要とする。アポ
トーシスは生理学の必須の過程であり、その対となる片
方の増殖とのホメオスタシス的均衡において十分に調節
されたやり方で進行する（3,4）。増殖及びアポトーシ
スの過程が均衡を失うと、これは発病の結果を生ずる。
今、異常なアポトーシスに関連付けることができる病理
学的状態の数が増加しつつあることが明らかになってき
ている。細胞が死ぬことを拒絶する時、すなわちアポト
ーシス経路に欠陥が起こる時に癌が起こるということが
仮定されるので、現在、抗癌治療を目的とする多数の研
究がある。従って抗癌処理は、自然に起こる自然経路を
誘導し、バイオテノロジー的な癌の治癒を与えることを
含む。さらにアポトーシスは、虚血、発作、心疾患及び
自己免疫などの多数の疾患におそらく関連していると考
えられる。実際にそれが含まれない過程を見いだすのが
挑戦的である程、それは基本的な生理学的現象であると
思われる（13）。例えば嚢胞性線維症に冒された患者の
肺において死亡するマクロファージは、アポトーシスを
経ている。DNAの肺−閉塞粘度はアポトーシス的死の特
徴である（12）。アポトーシスは、全身性紅斑性狼瘡
（SLE）などの自己免疫疾患における徴候としても用い
られてきた（13）。Ｂ−細胞白血病リンパ腫などのＢ−
細胞悪性疾患は、増殖速度の増加の故でなく、欠陥的ア
ポトーシスのための腫瘍細胞の成長を示す。移動する腫
瘍細胞のアポトーシスが抑制されると、腫瘍細胞の転移
が成功する。腫瘍細胞の増殖の速度及びアポトーシスの
速度の間の比率が腫瘍細胞の成長の速度を、従ってその
生命を脅かす性質を決定する。
に１つが死ななければならないことを必要とする。アポ
トーシスは生理学の必須の過程であり、その対となる片
方の増殖とのホメオスタシス的均衡において十分に調節
されたやり方で進行する（3,4）。増殖及びアポトーシ
スの過程が均衡を失うと、これは発病の結果を生ずる。
今、異常なアポトーシスに関連付けることができる病理
学的状態の数が増加しつつあることが明らかになってき
ている。細胞が死ぬことを拒絶する時、すなわちアポト
ーシス経路に欠陥が起こる時に癌が起こるということが
仮定されるので、現在、抗癌治療を目的とする多数の研
究がある。従って抗癌処理は、自然に起こる自然経路を
誘導し、バイオテノロジー的な癌の治癒を与えることを
含む。さらにアポトーシスは、虚血、発作、心疾患及び
自己免疫などの多数の疾患におそらく関連していると考
えられる。実際にそれが含まれない過程を見いだすのが
挑戦的である程、それは基本的な生理学的現象であると
思われる（13）。例えば嚢胞性線維症に冒された患者の
肺において死亡するマクロファージは、アポトーシスを
経ている。DNAの肺−閉塞粘度はアポトーシス的死の特
徴である（12）。アポトーシスは、全身性紅斑性狼瘡
（SLE）などの自己免疫疾患における徴候としても用い
られてきた（13）。Ｂ−細胞白血病リンパ腫などのＢ−
細胞悪性疾患は、増殖速度の増加の故でなく、欠陥的ア
ポトーシスのための腫瘍細胞の成長を示す。移動する腫
瘍細胞のアポトーシスが抑制されると、腫瘍細胞の転移
が成功する。腫瘍細胞の増殖の速度及びアポトーシスの
速度の間の比率が腫瘍細胞の成長の速度を、従ってその
生命を脅かす性質を決定する。
これらの考えから、薬剤による生体内におけるアポト
ーシスの調節が将来の抗癌治療のための有望な戦術であ
ることが明らかである。組織及び特に腫瘍における増
殖：アポトーシスの比率を診断し、治療を開発して導く
ために、迅速で感度の高い方法でアポトーシスを測定す
る手段を持たなければならない。今日まで文献に記載さ
れている方法は手がかかり、時間がかかるか、又は不十
分な特異性を有するので、この目的に役立たない。
ーシスの調節が将来の抗癌治療のための有望な戦術であ
ることが明らかである。組織及び特に腫瘍における増
殖：アポトーシスの比率を診断し、治療を開発して導く
ために、迅速で感度の高い方法でアポトーシスを測定す
る手段を持たなければならない。今日まで文献に記載さ
れている方法は手がかかり、時間がかかるか、又は不十
分な特異性を有するので、この目的に役立たない。
Duvall et al.（７）は、Percoll密度勾配を用いた
平衡遠心分離法により、アポトーシス又は非−アポトー
シス集団を分離できる方法を記載している。これらの勾
配は合計細胞の最高60％を含む有意な細胞損失を伴い、
そしてそれらはアポトーシス集団からすべてのトリパン
ブルー（Trypan Blue;Sigma Chemicals社 商品名）陽
性細胞を除去はしないので、これは日常的に用いられな
い方法である（トリパンブルー排除はどれだけの細胞が
生存性であるかを決定するために用いられる）。
平衡遠心分離法により、アポトーシス又は非−アポトー
シス集団を分離できる方法を記載している。これらの勾
配は合計細胞の最高60％を含む有意な細胞損失を伴い、
そしてそれらはアポトーシス集団からすべてのトリパン
ブルー（Trypan Blue;Sigma Chemicals社 商品名）陽
性細胞を除去はしないので、これは日常的に用いられな
い方法である（トリパンブルー排除はどれだけの細胞が
生存性であるかを決定するために用いられる）。
Fadok et al.（14）は、リンパ球集団におけるアポ
トーシス細胞のパーセンテージが、Diff−Quick（Baxte
r Healthcare Corp.Mc.Gaw Park,IL）で染色された
細胞遠心分離細胞（cyto centrifuged cells）の形態
学的検査により決定されたと記載している。アポトーシ
スの重要な特徴は核凝縮及び細胞質濃縮である。細胞の
生存性はトリパンブルー排除により決定された。Fadok
et al.（14）は、マクロファージが食作用によりア
ポトーシスリンパ球を除去する方法を見いだすことを目
的として行われた試験を記載している。それらは、アポ
トーシスリンパ球の食作用が、ホスファチジルセリンに
構造的に関連する化合物のＬ−イソ型により阻害される
こと、及び正常細胞と比較してアポトーシスリンパ球の
膜がより多くの量のメロシアニン540色素（Merocyanine
540 dye;Sigma Chemicals社 商品名）と結合して
おり、それらの膜脂質の充填がよりゆるく、膜のリン脂
質非対称の喪失と一致することを示していることを例示
した。その観察は、アポトーシスリンパ球が膜リン脂質
非対称を喪失し、原形質膜の外側のリーフレット上でホ
スファチジルセリンを露出していることを示唆してい
る。次いでマクロファージが、露出されたホスファチジ
ルセリンの認識の後にアポトーシスリンパ球を捕食す
る。文献の著者等は、アポトーシス細胞の特異的検出又
は単離にかかわらなかった。彼らは膜アポートシス細胞
のゆるい充填の決定のために非特異的色素を用いた。彼
らは平衡遠心分離法又は形態学的分析を用いることによ
りアポトーシス及び非−アポトーシス細胞の間の相違を
識別し、ゆるく充填された膜に大部分が結合する非特異
的メロシアニン540色素で細胞を着色することによりこ
れを追跡した。アポトーシス及び非−アポトーシス細胞
を特異的に識別する新規な方法に関する示唆は与えられ
ていない。
トーシス細胞のパーセンテージが、Diff−Quick（Baxte
r Healthcare Corp.Mc.Gaw Park,IL）で染色された
細胞遠心分離細胞（cyto centrifuged cells）の形態
学的検査により決定されたと記載している。アポトーシ
スの重要な特徴は核凝縮及び細胞質濃縮である。細胞の
生存性はトリパンブルー排除により決定された。Fadok
et al.（14）は、マクロファージが食作用によりア
ポトーシスリンパ球を除去する方法を見いだすことを目
的として行われた試験を記載している。それらは、アポ
トーシスリンパ球の食作用が、ホスファチジルセリンに
構造的に関連する化合物のＬ−イソ型により阻害される
こと、及び正常細胞と比較してアポトーシスリンパ球の
膜がより多くの量のメロシアニン540色素（Merocyanine
540 dye;Sigma Chemicals社 商品名）と結合して
おり、それらの膜脂質の充填がよりゆるく、膜のリン脂
質非対称の喪失と一致することを示していることを例示
した。その観察は、アポトーシスリンパ球が膜リン脂質
非対称を喪失し、原形質膜の外側のリーフレット上でホ
スファチジルセリンを露出していることを示唆してい
る。次いでマクロファージが、露出されたホスファチジ
ルセリンの認識の後にアポトーシスリンパ球を捕食す
る。文献の著者等は、アポトーシス細胞の特異的検出又
は単離にかかわらなかった。彼らは膜アポートシス細胞
のゆるい充填の決定のために非特異的色素を用いた。彼
らは平衡遠心分離法又は形態学的分析を用いることによ
りアポトーシス及び非−アポトーシス細胞の間の相違を
識別し、ゆるく充填された膜に大部分が結合する非特異
的メロシアニン540色素で細胞を着色することによりこ
れを追跡した。アポトーシス及び非−アポトーシス細胞
を特異的に識別する新規な方法に関する示唆は与えられ
ていない。
アポトーシス細胞の存在の決定のための現在までにお
けるすばらしい標準は、細胞DNAの分析である。この方
法の場合、細胞を破壊し、DNAを抽出し、分析する。証
拠となる約180塩基対のDNAラダーがアポトーシス細胞の
ゲル上に現れる。DNAアッセイにおけるそのようなラダ
ーの存在は、例えば全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫疾
患の診断のための信号となってきた。DNA断片の分析はS
ellens and Cohen（16）（６）により修正されたBurt
on（15）のジフェニルアミン反応を用いて行うことがで
きる。DNAラダーにより証明される通り、２本鎖DNA切断
がアポートシス細胞に最後の一撃を与える機能であると
いう長年の観点が、最近、異議を唱えられた。研究者等
は、細胞がヌクレオキソーム内切断なしでアポトーシス
を経ることができ、その意味するものは、アポトーシス
が現在の多くの診断手段が示唆するより広範囲であり得
ることであることを示唆している（17）。
けるすばらしい標準は、細胞DNAの分析である。この方
法の場合、細胞を破壊し、DNAを抽出し、分析する。証
拠となる約180塩基対のDNAラダーがアポトーシス細胞の
ゲル上に現れる。DNAアッセイにおけるそのようなラダ
ーの存在は、例えば全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫疾
患の診断のための信号となってきた。DNA断片の分析はS
ellens and Cohen（16）（６）により修正されたBurt
on（15）のジフェニルアミン反応を用いて行うことがで
きる。DNAラダーにより証明される通り、２本鎖DNA切断
がアポートシス細胞に最後の一撃を与える機能であると
いう長年の観点が、最近、異議を唱えられた。研究者等
は、細胞がヌクレオキソーム内切断なしでアポトーシス
を経ることができ、その意味するものは、アポトーシス
が現在の多くの診断手段が示唆するより広範囲であり得
ることであることを示唆している（17）。
アポトーシスの分野における他の大問題の１つは、あ
なたはアポトーシス細胞を検出せずにライシスされた細
胞を検出するので、最初に細胞を殺してしまった場合に
アポトーシスを阻害したと考える過ちを犯し易いことで
ある。アポトーシスを阻害することができる化合物又は
処置を探す場合、その方法が実際にアポトーシスを阻害
するべきであり、細胞がアポトーシス状態に達する前に
他の手段で細胞を単に殺したのではないことが必須であ
る。
なたはアポトーシス細胞を検出せずにライシスされた細
胞を検出するので、最初に細胞を殺してしまった場合に
アポトーシスを阻害したと考える過ちを犯し易いことで
ある。アポトーシスを阻害することができる化合物又は
処置を探す場合、その方法が実際にアポトーシスを阻害
するべきであり、細胞がアポトーシス状態に達する前に
他の手段で細胞を単に殺したのではないことが必須であ
る。
発明の記述 アポトーシス細胞の特徴の１つは、改変された原形質
膜の性質である（７、８）。驚くべきことに、アポトー
シスのプログラムに入った無損傷の細胞はそれらの膜の
性質を変化させ、ホスファチジルセリンに対する高い親
和性を有するより多量の試薬に結合できるようにするこ
とが見いだされた。これに関連し、高い親和性は10-6M
より小さいホスファチジルセリンに関する解離定数Kd、
好ましくは10-10より小さいKdを有することを意味す
る。アネキシンの範疇に属するポリペプチド又はタンパ
ク質を用いて驚く程良い結果を得ることができる。因子
Vaの軽鎖は、ホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬の他の適した例である。
膜の性質である（７、８）。驚くべきことに、アポトー
シスのプログラムに入った無損傷の細胞はそれらの膜の
性質を変化させ、ホスファチジルセリンに対する高い親
和性を有するより多量の試薬に結合できるようにするこ
とが見いだされた。これに関連し、高い親和性は10-6M
より小さいホスファチジルセリンに関する解離定数Kd、
好ましくは10-10より小さいKdを有することを意味す
る。アネキシンの範疇に属するポリペプチド又はタンパ
ク質を用いて驚く程良い結果を得ることができる。因子
Vaの軽鎖は、ホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬の他の適した例である。
アネキシンは十分に記載された両親媒性タンパク質の
群を構成し、それはカチオンの存在下で細胞膜に可逆的
に結合することができる（９）。アネキシンの一次構造
は４倍又は８倍の反復ドメインを含み、それは共通配列
を含む。非保存的及びそのままのアネキシン特異的Ｎ−
末端尾部が第１のドメインに先行する。ドメインは短い
可変リンカーペプチドを介して相互連結されている。ア
ネキシンタンパク質は胎盤組織のような組織から精製す
ることができ（10）、又は組み換え法により得ることが
できる（11）。
群を構成し、それはカチオンの存在下で細胞膜に可逆的
に結合することができる（９）。アネキシンの一次構造
は４倍又は８倍の反復ドメインを含み、それは共通配列
を含む。非保存的及びそのままのアネキシン特異的Ｎ−
末端尾部が第１のドメインに先行する。ドメインは短い
可変リンカーペプチドを介して相互連結されている。ア
ネキシンタンパク質は胎盤組織のような組織から精製す
ることができ（10）、又は組み換え法により得ることが
できる（11）。
PCT/EP90/02257において、プロトロンビン活性化状態
に入った血小板上のホスファチジルセリンへの結合のた
めのアネキシンが記載されている。他の目的のためのア
ネキシンの利用に関しては何も記載又は示唆されておら
ず、本発明の方法における利用に関する示唆は与えられ
ていない。
に入った血小板上のホスファチジルセリンへの結合のた
めのアネキシンが記載されている。他の目的のためのア
ネキシンの利用に関しては何も記載又は示唆されておら
ず、本発明の方法における利用に関する示唆は与えられ
ていない。
アポトーシス細胞が有するアネキシンに対する結合部
位が増加しているという観察は、細胞を破壊せずに個々
に基づいて（individual basis）非−アポトーシス及
びアポトーシス細胞を迅速に識別するアッセイの開発に
導いた。その方法は以下の原理に基づく。懸濁細胞又は
組織断片はホスファチジルセリンに特異的な試薬と混合
することができ、細胞表面結合試薬の量は試薬に共役さ
せた標識により直接あるいは試薬に特異的な抗体を介し
て間接的に測定することができる。細胞−結合試薬のパ
ラメーターは、細胞がアポトーシス性であるか又はそう
でないかを明らかにする。決定は定性的又は定量的性質
のものであることができる。
位が増加しているという観察は、細胞を破壊せずに個々
に基づいて（individual basis）非−アポトーシス及
びアポトーシス細胞を迅速に識別するアッセイの開発に
導いた。その方法は以下の原理に基づく。懸濁細胞又は
組織断片はホスファチジルセリンに特異的な試薬と混合
することができ、細胞表面結合試薬の量は試薬に共役さ
せた標識により直接あるいは試薬に特異的な抗体を介し
て間接的に測定することができる。細胞−結合試薬のパ
ラメーターは、細胞がアポトーシス性であるか又はそう
でないかを明らかにする。決定は定性的又は定量的性質
のものであることができる。
アポトーシス細胞を非−アポトーシス細胞から、分離
法に適した試薬に共役させたマーカーの選択を介して分
離することもできる。特異的集団の選択及び異なる集団
からのその単離に適した複数のマーカーが当該技術分野
において既知である。
法に適した試薬に共役させたマーカーの選択を介して分
離することもできる。特異的集団の選択及び異なる集団
からのその単離に適した複数のマーカーが当該技術分野
において既知である。
一般に、本発明は、試料中のアポトーシス細胞を検出
し及び／又は場合により定量するための方法を目的とし
ており、その方法は ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を
有する検出可能な試薬と接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する
検出可能な試薬と反応した無損傷の細胞を定性的に及び
／又は場合により定量的に検出する ことを含む。この方法は試料中のアポトーシス細胞を分
離するための一部としても用いることができる。アポト
ーシス細胞の分離を目的とする方法は、 ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を
有する検出可能な試薬と接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する
検出可能な試薬と反応した無損傷の細胞を定性的に及び
／又は場合により定量的に検出し、該検出が非−アポト
ーシス細胞からアポトーシス細胞を分離するための段階
ｃ）の前又は後に起こることにより行われ、その分離
は、アポトーシス細胞が段階ａ）においてホスファチジ
ルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬を
備えており、該検出可能な試薬はそれ自体既知の方法に
よって選択可能であるという事実の故に行うことができ
る。ライシス（lysis）を受けた細胞と反対の無損傷で
ある細胞の検出は、それ自体既知の方法で行うことがで
きる。例えばプロピジウムヨーダイドは、ライシスを受
けた細胞を認識するが、無損傷の細胞を認識しないマー
カーであることが既知である。プロピジウムヨーダイド
を用いた処理の後、無損傷の細胞をそれ自体既知の方法
で、例えばフローサイトメトリー（flow cytometry）
によりライシスを受けた細胞から分離することもでき
る。一般に無損傷の細胞に結合しないがライシスを受け
た細胞に結合するマーカーを、ライシスされない細胞か
らライシスされた細胞を識別するために、それ自体既知
の方法で用いることができる。ライシスされた細胞に関
するマーカーはホスファチジルセリンに対する高い親和
性を有する試薬に関するマーカーと識別可能でもあるの
が好ましく、無損傷である細胞からライシスされた細胞
の集団を実際に分離するためにも用いることができるの
が好ましい。
し及び／又は場合により定量するための方法を目的とし
ており、その方法は ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を
有する検出可能な試薬と接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する
検出可能な試薬と反応した無損傷の細胞を定性的に及び
／又は場合により定量的に検出する ことを含む。この方法は試料中のアポトーシス細胞を分
離するための一部としても用いることができる。アポト
ーシス細胞の分離を目的とする方法は、 ａ）試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を
有する検出可能な試薬と接触させ、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する
検出可能な試薬と反応した無損傷の細胞を定性的に及び
／又は場合により定量的に検出し、該検出が非−アポト
ーシス細胞からアポトーシス細胞を分離するための段階
ｃ）の前又は後に起こることにより行われ、その分離
は、アポトーシス細胞が段階ａ）においてホスファチジ
ルセリンに対する高い親和性を有する検出可能な試薬を
備えており、該検出可能な試薬はそれ自体既知の方法に
よって選択可能であるという事実の故に行うことができ
る。ライシス（lysis）を受けた細胞と反対の無損傷で
ある細胞の検出は、それ自体既知の方法で行うことがで
きる。例えばプロピジウムヨーダイドは、ライシスを受
けた細胞を認識するが、無損傷の細胞を認識しないマー
カーであることが既知である。プロピジウムヨーダイド
を用いた処理の後、無損傷の細胞をそれ自体既知の方法
で、例えばフローサイトメトリー（flow cytometry）
によりライシスを受けた細胞から分離することもでき
る。一般に無損傷の細胞に結合しないがライシスを受け
た細胞に結合するマーカーを、ライシスされない細胞か
らライシスされた細胞を識別するために、それ自体既知
の方法で用いることができる。ライシスされた細胞に関
するマーカーはホスファチジルセリンに対する高い親和
性を有する試薬に関するマーカーと識別可能でもあるの
が好ましく、無損傷である細胞からライシスされた細胞
の集団を実際に分離するためにも用いることができるの
が好ましい。
ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する試
薬はアネキシンとして分類されるポリペプチド又はタン
パク質であることができる。一般的アネキシンの及び特
にアネキシンＶの特異的リン脂質−結合性は、共役体が
まだリン脂質−結合性を保有しているような方法で広範
囲の化合物とアネキシンを共役させる能力と組み合わさ
れて、本発明の方法の別の実施態様として、自然に起こ
るか又はいずれかの種類の環境的因子により誘導される
細胞アポトーシスを定性的及び／又は定量的に決定する
ために用いることができる。ホスファチジルセリンに対
する高い親和性をなお示すアネキシンの誘導体も本発明
の方法で用いることができる。アネキシン又はそれらの
誘導体を本発明の方法においてホスファチジルセリンに
対する高い親和性を有する試薬として用いる場合、試薬
がホスファチジルセリンとの結合能力を示すために、カ
チオンの存在下で、好ましくは２価のカチオンの存在下
で試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を有
する試薬と接触させるのも好ましい。２価のカチオンは
例えばCd2+、Zn2+、Mn2+、Co2+及び好ましくはCa2+から
成る群より選ぶことができる。ある量のCa2+の存在下
で、例えばアネキシンＶはリン脂質膜に外部的（extrin
sic）やり方で吸着する。Ca2+イオンはアネキシンＶの
部位に結合し、特異的アミノ酸の６個のカルボニル酸素
に連結することによりタンパク質とリン脂質膜の間に架
橋すると思われる。しかしながらかくしてキレート化さ
れたCa2+イオンは配位及び電荷において不飽和である。
そこで７番目の配位部位はホスファチジルセリンのリン
部分を受容することができる。架橋は生理学的イオン強
度及びpH条件下及びCa2+閾量以上において非常に安定で
あると思われるが、Ca2+濃度が閾量以下に減少すると急
速に及び完全に離れる。興味深いことに、これらのCa2+
の閾量は膜のホスファチジルセリン含有量と逆比例して
いると思われる。特にアネキシンＶはホスファチジルセ
リン含有膜に対する高い親和性を示す。しかしながらKd
などの客観的（objective）パラメーターを用いて親和
性を表すのは困難であると思われ、10-10Mより小さいと
いう見積もりとして与えられる。実際これは、ビタミン
Ｋ依存性凝固因子ならびに補因子VII（ａ）及びＶ
（ａ）などの他のリン脂質−結合タンパク質が、膜への
結合に関してアネキシンＶと重大に競合しないという事
実により反映される。
薬はアネキシンとして分類されるポリペプチド又はタン
パク質であることができる。一般的アネキシンの及び特
にアネキシンＶの特異的リン脂質−結合性は、共役体が
まだリン脂質−結合性を保有しているような方法で広範
囲の化合物とアネキシンを共役させる能力と組み合わさ
れて、本発明の方法の別の実施態様として、自然に起こ
るか又はいずれかの種類の環境的因子により誘導される
細胞アポトーシスを定性的及び／又は定量的に決定する
ために用いることができる。ホスファチジルセリンに対
する高い親和性をなお示すアネキシンの誘導体も本発明
の方法で用いることができる。アネキシン又はそれらの
誘導体を本発明の方法においてホスファチジルセリンに
対する高い親和性を有する試薬として用いる場合、試薬
がホスファチジルセリンとの結合能力を示すために、カ
チオンの存在下で、好ましくは２価のカチオンの存在下
で試料をホスファチジルセリンに対する高い親和性を有
する試薬と接触させるのも好ましい。２価のカチオンは
例えばCd2+、Zn2+、Mn2+、Co2+及び好ましくはCa2+から
成る群より選ぶことができる。ある量のCa2+の存在下
で、例えばアネキシンＶはリン脂質膜に外部的（extrin
sic）やり方で吸着する。Ca2+イオンはアネキシンＶの
部位に結合し、特異的アミノ酸の６個のカルボニル酸素
に連結することによりタンパク質とリン脂質膜の間に架
橋すると思われる。しかしながらかくしてキレート化さ
れたCa2+イオンは配位及び電荷において不飽和である。
そこで７番目の配位部位はホスファチジルセリンのリン
部分を受容することができる。架橋は生理学的イオン強
度及びpH条件下及びCa2+閾量以上において非常に安定で
あると思われるが、Ca2+濃度が閾量以下に減少すると急
速に及び完全に離れる。興味深いことに、これらのCa2+
の閾量は膜のホスファチジルセリン含有量と逆比例して
いると思われる。特にアネキシンＶはホスファチジルセ
リン含有膜に対する高い親和性を示す。しかしながらKd
などの客観的（objective）パラメーターを用いて親和
性を表すのは困難であると思われ、10-10Mより小さいと
いう見積もりとして与えられる。実際これは、ビタミン
Ｋ依存性凝固因子ならびに補因子VII（ａ）及びＶ
（ａ）などの他のリン脂質−結合タンパク質が、膜への
結合に関してアネキシンＶと重大に競合しないという事
実により反映される。
本発明の方法は、２種又はそれ以上のカチオンの組み
合わせを用いて行うこともできる。特にCa2+とZn2+の組
み合わせは良い結果を与える。Tb3+などの３価のカチオ
ンを用いることもできる。
合わせを用いて行うこともできる。特にCa2+とZn2+の組
み合わせは良い結果を与える。Tb3+などの３価のカチオ
ンを用いることもできる。
用いられる試薬はホスファチジルセリンに対する高い
親和性を有していなければならない。非−アポトーシス
細胞の細胞膜の外側のリーフレット上で利用できる他の
膜成分に対してそのような高い親和性を有していないも
のも好ましい。特にそれはホスファチジルコリン又はス
フィンゴミエリンにあまり結合してはならず、非−アポ
トーシス細胞の他の外膜成分にあまり結合しないのが好
ましい。本発明の方法が単に定性的効果の決定のための
比較目的で用いられる場合、多量の試薬が結合した細胞
と少量の試薬が結合した細胞を区別しなければならない
だけなので、この後者の要求は厳密ではない。しかし当
然ホスファチジルセリンに対する試薬の親和性が高い方
がより良い。非−アポトーシス細胞及びアポトーシス細
胞の外膜に含まれる種々のリン脂質の識別は、アネキシ
ンを非−アポトーシス細胞からアポトーシス細胞を分離
するための理想的試薬としているものである。ホスファ
チジルセリン及びホスファチジルコリンの間でホスファ
チジルセリンを優先して特異的に決定することができる
いずれの試薬も本発明の方法で用いることができる。ホ
スファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬の
追加の性質は、それが検出及び／又は選択のために用い
られる標識に共役させられた時にまだホスファチジリセ
リンに結合できることである。
親和性を有していなければならない。非−アポトーシス
細胞の細胞膜の外側のリーフレット上で利用できる他の
膜成分に対してそのような高い親和性を有していないも
のも好ましい。特にそれはホスファチジルコリン又はス
フィンゴミエリンにあまり結合してはならず、非−アポ
トーシス細胞の他の外膜成分にあまり結合しないのが好
ましい。本発明の方法が単に定性的効果の決定のための
比較目的で用いられる場合、多量の試薬が結合した細胞
と少量の試薬が結合した細胞を区別しなければならない
だけなので、この後者の要求は厳密ではない。しかし当
然ホスファチジルセリンに対する試薬の親和性が高い方
がより良い。非−アポトーシス細胞及びアポトーシス細
胞の外膜に含まれる種々のリン脂質の識別は、アネキシ
ンを非−アポトーシス細胞からアポトーシス細胞を分離
するための理想的試薬としているものである。ホスファ
チジルセリン及びホスファチジルコリンの間でホスファ
チジルセリンを優先して特異的に決定することができる
いずれの試薬も本発明の方法で用いることができる。ホ
スファチジルセリンに対する高い親和性を有する試薬の
追加の性質は、それが検出及び／又は選択のために用い
られる標識に共役させられた時にまだホスファチジリセ
リンに結合できることである。
ここで本方法はアポトーシス細胞及びまたアポトーシ
ス細胞の生成へのある種の処置及び／又は化合物が与え
る結果を分析するための手段を提供する。今回、アポト
ーシス細胞に導く経路の活性化又は不活性化への処置及
び／又は化合物の効果を追跡することが可能になった。
それはまた細胞を破壊する必要なく、ある集団における
非−アポトーシス細胞からのアポトーシス細胞の簡単な
分離を可能にする。従って、続いて分離されるアポトー
シス及び非−アポトーシス細胞の集団を、次いでさらな
る試験及び／又は臨床的適用、例えば同原（autologou
s）又は異種（heterologous）幹細胞あるいは骨髄細胞
の移植に用いることもできる。個々の細胞に基づいて分
析及び単離することもできる。本発明の方法は懸濁細胞
又は組織切片の試料について用いることができる。
ス細胞の生成へのある種の処置及び／又は化合物が与え
る結果を分析するための手段を提供する。今回、アポト
ーシス細胞に導く経路の活性化又は不活性化への処置及
び／又は化合物の効果を追跡することが可能になった。
それはまた細胞を破壊する必要なく、ある集団における
非−アポトーシス細胞からのアポトーシス細胞の簡単な
分離を可能にする。従って、続いて分離されるアポトー
シス及び非−アポトーシス細胞の集団を、次いでさらな
る試験及び／又は臨床的適用、例えば同原（autologou
s）又は異種（heterologous）幹細胞あるいは骨髄細胞
の移植に用いることもできる。個々の細胞に基づいて分
析及び単離することもできる。本発明の方法は懸濁細胞
又は組織切片の試料について用いることができる。
細胞当たりに結合するホスファチジルセリンに対する
高い親和性を有する試薬の量は、直接又は間接的に測定
することができる。直接測定の場合、分析されるべき細
胞を、標識を有するホスファチジルセリンに対する高い
親和性の試薬と接触させる。そのような標識は、蛍光マ
ーカー、放射性マーカー、酵素、金属、色素、検出可能
な免疫グロブリン又はタンパク質部分のようないずれの
一般的に許容され得る検出可能なマーカーであることも
できる。適した例は125I、131I、111In、32P、35S及び
99mTcから成る群より選ばれる放射性マーカーである。
適した蛍光マーカーはフルオレセイン、フィコエリスリ
ン及びローダミンからなる群より選ぶことができる。適
した酵素マーカーはアルコールデヒドロゲナーゼ、パー
オキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼからなる群
より選ぶことができる。タンパク質部分はフェリチン、
ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンならびにこ
れらの誘導体からなる群より選ぶことができる。適した
色素はエバンスブルー（Evans Blue;Sigma Chemicals
社 商品名）及びクーマシーブリリアントブルー（Coom
assie Brilliant Blue;Sigma Chemicals社製 商品
名）からなる群より選ぶことができる。標識法は標識の
型に特異的であり、文献に記載されているか又は標識の
商業的供給者により提供される。上記の標識の例は単に
例示であり、商業的に入手可能ないずれの一般的に許容
され得る標識も用いることができる。
高い親和性を有する試薬の量は、直接又は間接的に測定
することができる。直接測定の場合、分析されるべき細
胞を、標識を有するホスファチジルセリンに対する高い
親和性の試薬と接触させる。そのような標識は、蛍光マ
ーカー、放射性マーカー、酵素、金属、色素、検出可能
な免疫グロブリン又はタンパク質部分のようないずれの
一般的に許容され得る検出可能なマーカーであることも
できる。適した例は125I、131I、111In、32P、35S及び
99mTcから成る群より選ばれる放射性マーカーである。
適した蛍光マーカーはフルオレセイン、フィコエリスリ
ン及びローダミンからなる群より選ぶことができる。適
した酵素マーカーはアルコールデヒドロゲナーゼ、パー
オキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼからなる群
より選ぶことができる。タンパク質部分はフェリチン、
ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンならびにこ
れらの誘導体からなる群より選ぶことができる。適した
色素はエバンスブルー（Evans Blue;Sigma Chemicals
社 商品名）及びクーマシーブリリアントブルー（Coom
assie Brilliant Blue;Sigma Chemicals社製 商品
名）からなる群より選ぶことができる。標識法は標識の
型に特異的であり、文献に記載されているか又は標識の
商業的供給者により提供される。上記の標識の例は単に
例示であり、商業的に入手可能ないずれの一般的に許容
され得る標識も用いることができる。
間接的測定の場合、調べられるべき試料をホスファチ
ジルセリンに対する高い親和性を有する非標識試薬と接
触させ、それ自体既知の方法で試薬特異的抗体により結
合試薬の量を決定することができる。
ジルセリンに対する高い親和性を有する非標識試薬と接
触させ、それ自体既知の方法で試薬特異的抗体により結
合試薬の量を決定することができる。
アポトーシスの測定は、試料を例えばカチオン及びア
ネキシンタンパク質と接触させた後に行うことができ
る。アポトーシスの測定は、標識の存在及び／又は量の
決定のための標準的方法を用いて行うことができる。分
析に用いることができる方法の例はフロー−及びイメー
ジサイトメトリー（flow−and imagecytometry）、な
らびに画像分析（image analysis）である。抗体を用
いる間接的測定の場合、当該技術の現状において記載さ
れているいずれの抗体検出イムノアッセイも用いること
ができる。
ネキシンタンパク質と接触させた後に行うことができ
る。アポトーシスの測定は、標識の存在及び／又は量の
決定のための標準的方法を用いて行うことができる。分
析に用いることができる方法の例はフロー−及びイメー
ジサイトメトリー（flow−and imagecytometry）、な
らびに画像分析（image analysis）である。抗体を用
いる間接的測定の場合、当該技術の現状において記載さ
れているいずれの抗体検出イムノアッセイも用いること
ができる。
特に試料からのアポトーシス細胞の分離は、蛍光標識
に共役させたホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬を用い、続いて多量の蛍光を有する細胞を
蛍光の低い又は蛍光を持たない細胞から分離するように
設定されるFacs細胞選別機システムを用いて行うことが
できる。分離はホスファチジルセリンに対する高い親和
性を有する試薬又は用いられる試薬の共役形態に関して
親和性を示す固相の使用を介しても行うことができる。
例えば固定化ビオチンを用い、ホスファチジルセリンに
対する高い親和性を有する試薬に共役させたストレプト
アビジンに結合することができる。
に共役させたホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬を用い、続いて多量の蛍光を有する細胞を
蛍光の低い又は蛍光を持たない細胞から分離するように
設定されるFacs細胞選別機システムを用いて行うことが
できる。分離はホスファチジルセリンに対する高い親和
性を有する試薬又は用いられる試薬の共役形態に関して
親和性を示す固相の使用を介しても行うことができる。
例えば固定化ビオチンを用い、ホスファチジルセリンに
対する高い親和性を有する試薬に共役させたストレプト
アビジンに結合することができる。
本発明の方法は、個々の又は特定の試料におけるアポ
トーシスの量に対する化合物又は特定の処置の効果を決
定するために用いることができる。この効果の結果は、
調べるべき化合物の存在に供された又は調べるべき処置
に供された試料を用いて本発明を行い、この結果を、標
準試料あるいは調べるべき化合物の存在の前に及び／又
は調べるべき処置に試料を供する前に採取された試料を
用いて同じ条件下で本発明の方法を行って得られる結果
と比較することにより確定することができる。この比較
は定性的又は定量的な性質のものであることができる。
トーシスの量に対する化合物又は特定の処置の効果を決
定するために用いることができる。この効果の結果は、
調べるべき化合物の存在に供された又は調べるべき処置
に供された試料を用いて本発明を行い、この結果を、標
準試料あるいは調べるべき化合物の存在の前に及び／又
は調べるべき処置に試料を供する前に採取された試料を
用いて同じ条件下で本発明の方法を行って得られる結果
と比較することにより確定することができる。この比較
は定性的又は定量的な性質のものであることができる。
本発明の方法を行うのに適したキットも本発明の範囲
内に含まれる。そのようなキットは、試薬がホスファチ
ジルセリンに共役させられた場合にも検出可能な又は検
出可能とされ得る、ホスファチジルセリンに関して特異
的な試薬を含まなければならない。試薬はすでにキット
において標識が与えられていることができ又はキットを
用いて標識を与えることもできる。キットは無損傷の細
胞及びライシスを受けた細胞を識別することができる検
出可能な及び好ましくは選択可能な標識も含まなければ
ならない。そのような標識の適した例はプロピジウムヨ
ーダイドである。キットがホスファチジルセリンに関し
て特異的な試薬としてアネキシンを含む場合、場合によ
りホスファチジルセリンに関して特異的な試薬の細胞膜
への結合に必要なカチオンを含むことができる。キット
はさらに本発明の方法を行うのに適した媒体を含むこと
ができる。キットは比較アッセイで用いることができる
特定の細胞集団の標準試料も含むことができる。キット
は分析されるべき特定の細胞に達した媒体及び／又は標
識が存在することにより、これらの細胞の型又は組織の
型に関して特異的であることができる。癌の処置のため
の薬剤の効果の分析の場合、特定の癌がある種の組織又
は細胞の型に特異的である場合が非常に多く、そのよう
な場合にはそのような細胞に適した特定の媒体又はマー
カーを用いるのが興味深い。
内に含まれる。そのようなキットは、試薬がホスファチ
ジルセリンに共役させられた場合にも検出可能な又は検
出可能とされ得る、ホスファチジルセリンに関して特異
的な試薬を含まなければならない。試薬はすでにキット
において標識が与えられていることができ又はキットを
用いて標識を与えることもできる。キットは無損傷の細
胞及びライシスを受けた細胞を識別することができる検
出可能な及び好ましくは選択可能な標識も含まなければ
ならない。そのような標識の適した例はプロピジウムヨ
ーダイドである。キットがホスファチジルセリンに関し
て特異的な試薬としてアネキシンを含む場合、場合によ
りホスファチジルセリンに関して特異的な試薬の細胞膜
への結合に必要なカチオンを含むことができる。キット
はさらに本発明の方法を行うのに適した媒体を含むこと
ができる。キットは比較アッセイで用いることができる
特定の細胞集団の標準試料も含むことができる。キット
は分析されるべき特定の細胞に達した媒体及び／又は標
識が存在することにより、これらの細胞の型又は組織の
型に関して特異的であることができる。癌の処置のため
の薬剤の効果の分析の場合、特定の癌がある種の組織又
は細胞の型に特異的である場合が非常に多く、そのよう
な場合にはそのような細胞に適した特定の媒体又はマー
カーを用いるのが興味深い。
実施例１ 標準的方法により血液から好中球を単離する。好中球
をサイトカインの不在下又は存在下の培地中に終夜保
つ。サイトカインは好中球がアポトーシスに入るのを防
ぐことが知られている。
をサイトカインの不在下又は存在下の培地中に終夜保
つ。サイトカインは好中球がアポトーシスに入るのを防
ぐことが知られている。
好中球集団におけるアポトーシスを測定するために、
細胞を緩衝食塩水中の3mMのCa2+及びフルオレセインと
共役させた10μg/mlの最終的濃度のアネキシンＶ及び10
μg/mlのプロピジウムヨーダイドと混合する。混合細胞
をフローサイトメトリーにより分析する。サイトカイン
を添加しない試験の結果を示す図１及びサイトカインを
用いた試験の結果を示す図２は、プロピジウムヨーダイ
ド陰性細胞が２つの集団を含み、それはこの方法により
区別され得ることを示している。少量の結合アネキシン
Ｖを有する無損傷細胞の集団及び多量の結合アネキシン
Ｖを有する無損傷細胞の集団である。後者の集団は他の
分析法により明らかにされる通り、アポトーシス性であ
ると思われる。フローサイトメトリー分析から、サイト
カインの不在下で非−アポトーシス細胞対アポトーシス
細胞の比率は1.82:1であるが、サイトカインの存在下で
この比率は7.62:1であることになる。これは、サイトカ
インの存在のためにアポトーシス相に入る細胞の量が顕
著に少ないという事実を示している。サイトカイン以外
の異なる化合物の効果を類似の方法で比較することがで
き、かくしてそのような化合物のアポトーシスへの効果
も迅速に及び高感度で識別することができる。
細胞を緩衝食塩水中の3mMのCa2+及びフルオレセインと
共役させた10μg/mlの最終的濃度のアネキシンＶ及び10
μg/mlのプロピジウムヨーダイドと混合する。混合細胞
をフローサイトメトリーにより分析する。サイトカイン
を添加しない試験の結果を示す図１及びサイトカインを
用いた試験の結果を示す図２は、プロピジウムヨーダイ
ド陰性細胞が２つの集団を含み、それはこの方法により
区別され得ることを示している。少量の結合アネキシン
Ｖを有する無損傷細胞の集団及び多量の結合アネキシン
Ｖを有する無損傷細胞の集団である。後者の集団は他の
分析法により明らかにされる通り、アポトーシス性であ
ると思われる。フローサイトメトリー分析から、サイト
カインの不在下で非−アポトーシス細胞対アポトーシス
細胞の比率は1.82:1であるが、サイトカインの存在下で
この比率は7.62:1であることになる。これは、サイトカ
インの存在のためにアポトーシス相に入る細胞の量が顕
著に少ないという事実を示している。サイトカイン以外
の異なる化合物の効果を類似の方法で比較することがで
き、かくしてそのような化合物のアポトーシスへの効果
も迅速に及び高感度で識別することができる。
実施例２ ミクロタイタープレートのウェルに接着性細胞をそれ
自体既知の方法で植え付ける。用いられる接着性細胞の
型の選択は、行われる診断に依存するであろう。複数の
種々の適した細胞型が商業的に入手可能であり、用いら
れるべき型の選択は当該技術分野における熟練者に明ら
かであろう。続いて細胞をおそらくアポトーシスの誘導
又は阻害を生ずる方法で処理する。次いでアポトーシス
の量をCa+2イオンを含む緩衝液中で、例えばフルオレセ
イン又はビチオンのようなリポーター基と共役させたア
ネキシンＶの添加により評価する。インキュベーション
の後、非結合アネキシンＶを洗い流す。次いで結合アネ
キシンＶの量を直接又は間接的に測定する。直接測定
は、アネキシンＶ−フルオレセインの場合ミクロタイタ
ーリーダーにおいて行うことができる。間接的測定はス
トレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダー
ゼ及びアネキシンＶ−ビオチンと組み合わされた発色性
基質を用いて行うことができる。結合アネキシンの量は
ウェル当たりのアポトーシスの量と関連する。
自体既知の方法で植え付ける。用いられる接着性細胞の
型の選択は、行われる診断に依存するであろう。複数の
種々の適した細胞型が商業的に入手可能であり、用いら
れるべき型の選択は当該技術分野における熟練者に明ら
かであろう。続いて細胞をおそらくアポトーシスの誘導
又は阻害を生ずる方法で処理する。次いでアポトーシス
の量をCa+2イオンを含む緩衝液中で、例えばフルオレセ
イン又はビチオンのようなリポーター基と共役させたア
ネキシンＶの添加により評価する。インキュベーション
の後、非結合アネキシンＶを洗い流す。次いで結合アネ
キシンＶの量を直接又は間接的に測定する。直接測定
は、アネキシンＶ−フルオレセインの場合ミクロタイタ
ーリーダーにおいて行うことができる。間接的測定はス
トレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダー
ゼ及びアネキシンＶ−ビオチンと組み合わされた発色性
基質を用いて行うことができる。結合アネキシンの量は
ウェル当たりのアポトーシスの量と関連する。
実施例３ 以下の文において、種々の疾患の治療における重要な
臨床的疑問に役立つ手段としての例により本発明を説明
する。
臨床的疑問に役立つ手段としての例により本発明を説明
する。
3.I.白血病患者のための抗癌治療の有効性の評価 白血球細胞にとって致死でない条件下で患者から血液
を採取する。そのような条件は公共の文献により記載さ
れている。
を採取する。そのような条件は公共の文献により記載さ
れている。
血液を遠心分離して白血球細胞を含む軟質を形成す
る。これらを集め、密度勾配遠心分離法、例えば所望の
密度のFicoll又はPercoll（いずれもSigma Chemicals
社 商品名）により遠心分離にかける。選ばれる密度は
白血病の型に依存する。その方法は高度に濃縮された白
血病細胞を単離するために構築されている。単離される
白血病細胞を培地、例えばIscove's DMEM又はRPMI1640
（いずれもGibco社製 商品名）中に懸濁させる。培地
にヒト又はウシ起源の血清を、及びグルタミン酸、成長
因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの
添加剤を補足することができる。
る。これらを集め、密度勾配遠心分離法、例えば所望の
密度のFicoll又はPercoll（いずれもSigma Chemicals
社 商品名）により遠心分離にかける。選ばれる密度は
白血病の型に依存する。その方法は高度に濃縮された白
血病細胞を単離するために構築されている。単離される
白血病細胞を培地、例えばIscove's DMEM又はRPMI1640
（いずれもGibco社製 商品名）中に懸濁させる。培地
にヒト又はウシ起源の血清を、及びグルタミン酸、成長
因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの
添加剤を補足することができる。
懸濁細胞を培養皿に入れ、例えば37℃においてインキ
ュベートする。例えばフルダラビン、メトトレキセー
ト、サイクロスポリンのような可能な抗癌治療の主成分
を、濃度を変化させて培養中の細胞に加える。成分の存
在下で細胞をさらに培養する。あらかじめ決められた時
点に試料を採取し、本発明の方法の原理により細胞死に
関して測定する：細胞試料を0.5〜5mMのCa+2−イオンを
含むHepes−NaCl緩衝液（Sigma Chemicals社から購入
した薬品を用いて調製）で洗浄し、最後に約104〜106細
胞を含む445μｌの緩衝液において懸濁させる。フルオ
レセインと共役させた５μｌのアネキシンＶ及び50μｌ
のプロピジウムヨーダイドを試料に加え、例えばそれぞ
れ0.025〜10μg/ml及び0.5〜20μg/mlとする。試料をさ
らにインキュベートし、次いで確立された方法に従って
フローサイトメトリー２色分析により分析する。
ュベートする。例えばフルダラビン、メトトレキセー
ト、サイクロスポリンのような可能な抗癌治療の主成分
を、濃度を変化させて培養中の細胞に加える。成分の存
在下で細胞をさらに培養する。あらかじめ決められた時
点に試料を採取し、本発明の方法の原理により細胞死に
関して測定する：細胞試料を0.5〜5mMのCa+2−イオンを
含むHepes−NaCl緩衝液（Sigma Chemicals社から購入
した薬品を用いて調製）で洗浄し、最後に約104〜106細
胞を含む445μｌの緩衝液において懸濁させる。フルオ
レセインと共役させた５μｌのアネキシンＶ及び50μｌ
のプロピジウムヨーダイドを試料に加え、例えばそれぞ
れ0.025〜10μg/ml及び0.5〜20μg/mlとする。試料をさ
らにインキュベートし、次いで確立された方法に従って
フローサイトメトリー２色分析により分析する。
図３はそのような分析の典型的結果を示す。この分析
は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を与え
る。死細胞（アポトーシス＋壊死細胞）の画分は、この
特定の細胞型への、用いられる薬剤の有効性に関する指
標である。従ってこのアッセイは患者の白血病細胞の薬
剤抵抗性を明らかにし、かくして抗癌治療の選択におい
て医師を導く。
は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を与え
る。死細胞（アポトーシス＋壊死細胞）の画分は、この
特定の細胞型への、用いられる薬剤の有効性に関する指
標である。従ってこのアッセイは患者の白血病細胞の薬
剤抵抗性を明らかにし、かくして抗癌治療の選択におい
て医師を導く。
3.II.AIDSの進行の評価 白血球にとって致死でない条件下でHIV−陽性患者又
はAIDS患者から血液を採取する。そのような条件は公表
された文献に記載されている。軟層を得るための遠心分
離法及び続く例えば所望の密度のFicoll又はPercollの
ような密度勾配上における軟層の遠心分離法を含む標準
的方法により末梢血単核球（PBMC）を単離する。PBMCを
培地、例えばIscove'sDMEM又はRPMI1640中に懸濁させ
る。培地にヒト又はウシ起源の血清及びグルタミン酸、
成長因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤な
どの添加剤を補足することができる。懸濁細胞を培養皿
に入れ、例えば37℃においてインキュベートする。あら
かじめ決められた時点に試料を採取し、本発明の方法の
原理により細胞死に関して測定する。細胞をリン酸塩緩
衝食塩水で洗浄し、次いでフィコエリスリン標識CD4又
はCD8抗体と共にインキュベートする。次いで細胞を0.5
〜5mMのCa2+−イオンを含むHepes−NaClで洗浄する。細
胞を例えば104〜106細胞を含む445μｌの緩衝液におい
て懸濁させる。フルオレセインと共役させた５μｌのア
ネキシンＶ及び50μｌのプロピジウムヨーダイドを試料
に加え、それぞれ0.025〜10μg/ml及び0.5〜20μg/mlと
する。試料をさらにインキュベートし、次いで確立され
た方法に従ってフローサイトメトリー３色分析により分
析する。図３はそのような分析の典型的結果を示す。こ
の分析は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を
与える。３色分析のために、PMBCサブセットCD4＋及びC
D8＋における死細胞のパーセンテージを測定することが
できる。PMBCのこれらの小集団における死細胞のパーセ
ンテージはAIDSの進行に関する指標であり、治療の選択
において医師を導く。
はAIDS患者から血液を採取する。そのような条件は公表
された文献に記載されている。軟層を得るための遠心分
離法及び続く例えば所望の密度のFicoll又はPercollの
ような密度勾配上における軟層の遠心分離法を含む標準
的方法により末梢血単核球（PBMC）を単離する。PBMCを
培地、例えばIscove'sDMEM又はRPMI1640中に懸濁させ
る。培地にヒト又はウシ起源の血清及びグルタミン酸、
成長因子、サイトカイン又は他の細胞生理学の調節剤な
どの添加剤を補足することができる。懸濁細胞を培養皿
に入れ、例えば37℃においてインキュベートする。あら
かじめ決められた時点に試料を採取し、本発明の方法の
原理により細胞死に関して測定する。細胞をリン酸塩緩
衝食塩水で洗浄し、次いでフィコエリスリン標識CD4又
はCD8抗体と共にインキュベートする。次いで細胞を0.5
〜5mMのCa2+−イオンを含むHepes−NaClで洗浄する。細
胞を例えば104〜106細胞を含む445μｌの緩衝液におい
て懸濁させる。フルオレセインと共役させた５μｌのア
ネキシンＶ及び50μｌのプロピジウムヨーダイドを試料
に加え、それぞれ0.025〜10μg/ml及び0.5〜20μg/mlと
する。試料をさらにインキュベートし、次いで確立され
た方法に従ってフローサイトメトリー３色分析により分
析する。図３はそのような分析の典型的結果を示す。こ
の分析は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を
与える。３色分析のために、PMBCサブセットCD4＋及びC
D8＋における死細胞のパーセンテージを測定することが
できる。PMBCのこれらの小集団における死細胞のパーセ
ンテージはAIDSの進行に関する指標であり、治療の選択
において医師を導く。
3.III.疾患、全身性紅斑性狼瘡の状態の評価 実施例3.II.に記載されている通りにSLE患者から血液
を採取し、処理し、PMBCを得る。単離PMBCを培地、例え
ばIscove'sDMEM又はRPMI1640中に懸濁させる。培地にヒ
ト又はウシ起源の血清及びグルタミン酸、成長因子、サ
イトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの添加剤を
補足することができる。懸濁細胞を培養皿に入れ、例え
ば37℃においてインキュベートする。あらかじめ決めら
れた時点に試料を採取し、本発明の方法の原理により細
胞死に関して測定する。
を採取し、処理し、PMBCを得る。単離PMBCを培地、例え
ばIscove'sDMEM又はRPMI1640中に懸濁させる。培地にヒ
ト又はウシ起源の血清及びグルタミン酸、成長因子、サ
イトカイン又は他の細胞生理学の調節剤などの添加剤を
補足することができる。懸濁細胞を培養皿に入れ、例え
ば37℃においてインキュベートする。あらかじめ決めら
れた時点に試料を採取し、本発明の方法の原理により細
胞死に関して測定する。
次いで細胞を0.5〜5mMのCa2+−イオンを含むHepes−N
aClで洗浄する。細胞を例えば104〜106細胞を含む445μ
ｌの緩衝液において懸濁させる。フルオレセインと共役
させた５μｌのアネキシンＶ及び50μｌのプロピジウム
ヨーダイドを試料に加え、それぞれ例えば0.025〜10μg
/ml及び0.5〜20μg/mlとする。試料をさらにインキュベ
ートし、次いで確立された方法に従ってフローサイトメ
トリー２色分析により分析する。
aClで洗浄する。細胞を例えば104〜106細胞を含む445μ
ｌの緩衝液において懸濁させる。フルオレセインと共役
させた５μｌのアネキシンＶ及び50μｌのプロピジウム
ヨーダイドを試料に加え、それぞれ例えば0.025〜10μg
/ml及び0.5〜20μg/mlとする。試料をさらにインキュベ
ートし、次いで確立された方法に従ってフローサイトメ
トリー２色分析により分析する。
図３はそのような分析の典型的結果を示す。この分析
は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を与え
る。死細胞（アポトーシス＋壊死細胞）の画分は疾患の
活性の状態に関する指標であり、従って治療法の選択に
おいて医師を導く。
は生存、アポトーシス及び壊死細胞の集団分布を与え
る。死細胞（アポトーシス＋壊死細胞）の画分は疾患の
活性の状態に関する指標であり、従って治療法の選択に
おいて医師を導く。
3.IV.胚の正常な又は異常な発生の評価 受胎後11〜13日（plug＝０日）の妊娠中のマウスをエ
ーテルで麻酔した後に頚部脱臼により犠牲にする。子宮
を取り出し、胚を集め、２つの群に分ける。ビオチンと
共役させたアネキシンＶの注入により細胞死を検出する
ために胚を一時的に培養する。先端の直径が15〜25μｍ
のガラス針を有するHamilton−Syringe（Sigma Chemic
als社 商品名）ピペット系を用いて胚を心臓の心室に
注入する。胚を37℃の緩衝液中に保って外科用顕微鏡下
で或る容量の約３μｍのアネキシンＶ−ビオチン溶液
（ａ volume of approx imately ３μｍ Annexin
Ｖ−biotin solution）を注入する。注入に成功する
と、臍静脈の一時的白化（blanching）が見られるであ
ろう。心臓活性を調べ、インキュベーションの30分間で
残存する胚をさらに処理する。インキュベーションの
後、胚を光学顕微鏡法（LM）のために４％Forman heap
s緩衝液（Sigma Chemicals社から購入した薬品を用い
て調製）中で又は電子顕微鏡法（EM）のために２％グル
タルアルデヒド−２％パラホルムアルデヒドカコジレー
ト緩衝液中で４℃において終夜固定する。
ーテルで麻酔した後に頚部脱臼により犠牲にする。子宮
を取り出し、胚を集め、２つの群に分ける。ビオチンと
共役させたアネキシンＶの注入により細胞死を検出する
ために胚を一時的に培養する。先端の直径が15〜25μｍ
のガラス針を有するHamilton−Syringe（Sigma Chemic
als社 商品名）ピペット系を用いて胚を心臓の心室に
注入する。胚を37℃の緩衝液中に保って外科用顕微鏡下
で或る容量の約３μｍのアネキシンＶ−ビオチン溶液
（ａ volume of approx imately ３μｍ Annexin
Ｖ−biotin solution）を注入する。注入に成功する
と、臍静脈の一時的白化（blanching）が見られるであ
ろう。心臓活性を調べ、インキュベーションの30分間で
残存する胚をさらに処理する。インキュベーションの
後、胚を光学顕微鏡法（LM）のために４％Forman heap
s緩衝液（Sigma Chemicals社から購入した薬品を用い
て調製）中で又は電子顕微鏡法（EM）のために２％グル
タルアルデヒド−２％パラホルムアルデヒドカコジレー
ト緩衝液中で４℃において終夜固定する。
LMの場合の組織学的分析 固定に続き、胚を脱水し、パラフィン中に埋め込み、
３μｍで系列的に切断する。メタノール/H2O2（9:1 v/
v）中で20分間インキュベートすることにより、内因性
パーオキシダーゼを遮断する。切片をリン酸塩緩衝食塩
水（PBS）中で洗浄する。ホースラディッシュパーオキ
シダーゼ共役アビジン（アビジン−HRP）（Vector ABC
Eliteキット、Brunschwig,Germany）を用いるアビジ
ン−ビオチン複合体法を用い、室温で細胞結合アネキシ
ンＶ−ビオチンを検出する。3,3′−ジアミノベンジジ
ンテトラヒドロクロリド（DAB）を用いて染色を発色さ
せ、ヘマトキシリンを用いて対比染色する。
３μｍで系列的に切断する。メタノール/H2O2（9:1 v/
v）中で20分間インキュベートすることにより、内因性
パーオキシダーゼを遮断する。切片をリン酸塩緩衝食塩
水（PBS）中で洗浄する。ホースラディッシュパーオキ
シダーゼ共役アビジン（アビジン−HRP）（Vector ABC
Eliteキット、Brunschwig,Germany）を用いるアビジ
ン−ビオチン複合体法を用い、室温で細胞結合アネキシ
ンＶ−ビオチンを検出する。3,3′−ジアミノベンジジ
ンテトラヒドロクロリド（DAB）を用いて染色を発色さ
せ、ヘマトキシリンを用いて対比染色する。
EMの場合の組織学的分析 アネキシンＶ−ビオチンと共にインキュベートした
後、前記のガラス針を用いて胚を心臓内注入により固定
する。次いで組織断片を取り出し、４℃において終夜固
定する。100μＭの切片をビブラトーム（vibratome;Ted
Pelia Inc.商品名）上で切断し、LMの場合と同様に
してアネキシンＶ−ビオチンの染色を発色させる。DAB
の後、切片をOsO4で後固定し、３％ウラニルアセテート
を用いて全体的に染色し、続いて脱水してプラスチック
（Durcopan;Sigma Chemicals社 商品名）に埋め込
む。組織をミクロトーム（Reichert Jung Ultracut
S;Leica社 商品名）上で超薄切片に切断し、最後に１
％クエン酸鉛で染色する。切片を電子顕微鏡法により調
べる。
後、前記のガラス針を用いて胚を心臓内注入により固定
する。次いで組織断片を取り出し、４℃において終夜固
定する。100μＭの切片をビブラトーム（vibratome;Ted
Pelia Inc.商品名）上で切断し、LMの場合と同様に
してアネキシンＶ−ビオチンの染色を発色させる。DAB
の後、切片をOsO4で後固定し、３％ウラニルアセテート
を用いて全体的に染色し、続いて脱水してプラスチック
（Durcopan;Sigma Chemicals社 商品名）に埋め込
む。組織をミクロトーム（Reichert Jung Ultracut
S;Leica社 商品名）上で超薄切片に切断し、最後に１
％クエン酸鉛で染色する。切片を電子顕微鏡法により調
べる。
アネキシンＶ−ビオチンは、死亡しつつある細胞又は死
細胞に結合するが、生存細胞には結合しない。従って処
理された胚の切片は、子宮から胚を取り出した時点にお
ける、発生中の胚の細胞死の形態を視覚化しているであ
ろう。細胞死は空間と時間の座標により胚において計画
されている。空間及び時間において異常な細胞死は生物
にとって重大性を有するであろう。例えば二分脊椎はあ
る時点におけるある場所の細胞死の欠如の結果である。
正常に計画された細胞死の目録は公表された文献に十分
に記載されている。この目録は、この実施例に記録の方
法により測定される発生中の胚における細胞死の正常性
（異常性）を判定するための参照としての役目を果す。
発生中の胚における細胞死の測定は遺伝的欠陥の研究及
び化合物の奇形形成性の評価において重要である。
細胞に結合するが、生存細胞には結合しない。従って処
理された胚の切片は、子宮から胚を取り出した時点にお
ける、発生中の胚の細胞死の形態を視覚化しているであ
ろう。細胞死は空間と時間の座標により胚において計画
されている。空間及び時間において異常な細胞死は生物
にとって重大性を有するであろう。例えば二分脊椎はあ
る時点におけるある場所の細胞死の欠如の結果である。
正常に計画された細胞死の目録は公表された文献に十分
に記載されている。この目録は、この実施例に記録の方
法により測定される発生中の胚における細胞死の正常性
（異常性）を判定するための参照としての役目を果す。
発生中の胚における細胞死の測定は遺伝的欠陥の研究及
び化合物の奇形形成性の評価において重要である。
図面の簡単な説明 図１は、好中球をサイトカインの不在下に培養した場
合のアポトーシスをフローサイトメトリーにより分析し
た結果を示すグラフである。
合のアポトーシスをフローサイトメトリーにより分析し
た結果を示すグラフである。
図２は、好中球をサイトカインの存在下に培養した場
合のアポトーシスをフローサイトメトリーにより分析し
た結果を示すグラフである。
合のアポトーシスをフローサイトメトリーにより分析し
た結果を示すグラフである。
図３は、白血病細胞を抗癌剤と共に培養した試料につ
いて本発明の方法の原理に従い細胞死について測定した
結果を示すフローサイトメトリー２色分析によるグラフ
である。
いて本発明の方法の原理に従い細胞死について測定した
結果を示すフローサイトメトリー２色分析によるグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/543 G01N 33/566 G01N 33/531
Claims (33)
- 【請求項１】ａ）試料を、ホスファチジルセリンに対す
る高い親和性を有する検出可能な試薬と接触させ、これ
に関連して、高い親和性とはKd＜10-6Mのホスファチジ
ルセリンに関する解離定数を有することを意味し、 ｂ）ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有する
検出可能な試薬と反応した細胞を定性的及び／又は定量
的に検出し、細胞は好ましくは無損傷の細胞であり、該
検出は ｃ）非−アポトーシス細胞からアポトーシス細胞を単離
する ための任意の単離段階の前又は後に行われる ことを特徴とする試料中のアポトーシス細胞を検出及び
／又は定量及び／又は単離するための方法。 - 【請求項２】試薬が選択可能な試薬であり、単離法がア
ポトーシス細胞に結合する該試薬を用いる請求の範囲第
１項に記載の方法。 - 【請求項３】ホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬がアネキシンとして分類されるポリペプチ
ド又はタンパク質である請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項４】ライシス（lysis）を受けた細胞を検出す
るためのマーカーの利用により、細胞をライシスを受け
た細胞と無損傷の細胞に区別することができる請求の範
囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】マーカーがプロピジウムヨーダイドである
請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】細胞がフローサイトメトリー（flowcytome
try）により検出される請求の範囲第４又は５項に記載
の方法。 - 【請求項７】ホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬がアネキシンＶ又はホスファチジルセリン
に対する高い親和性を示すそれらの誘導体である請求の
範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】ホスファチジルセリンに対する高い親和性
を有する試薬を、試薬がホスファチジルセリンに対する
親和性を示すためにカチオンの存在下で試料と接触させ
る請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】カチオンが２価のカチオンである請求の範
囲第８項に記載の方法。 - 【請求項１０】２価のカチオンがCd2+、Zn2+、Mn2+、Co
2+及びCa2+からなる群より選ばれる請求の範囲第９項に
記載の方法。 - 【請求項１１】カチオンがCa2+である請求の範囲第10項
に記載の方法。 - 【請求項１２】ホスファチジルセリンに対する高い親和
性を有する試薬を、試薬がホスファチジルセリンに対す
る高い親和性を示すためにCa2+及びZn2+の両方の存在下
で試料と接触させる請求の範囲第８〜11項に記載の方
法。 - 【請求項１３】カチオンがTb3+である請求の範囲第８項
に記載の方法。 - 【請求項１４】ホスファチジルセリンに対して特異的な
試薬に検出可能なマーカーを設ける請求の範囲第１〜13
項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】検出可能なマーカーが蛍光マーカー、放
射性マーカー、酵素、金属、色素、検出可能な免疫グロ
ブリン又はタンパク質部分から選ばれる請求の範囲第14
項に記載の方法。 - 【請求項１６】放射性マーカーが125I、131I、111In、
32P、35S及び99mTcからなる群より選ばれる請求の範囲
第14又は15項に記載の方法。 - 【請求項１７】蛍光マーカーがフルオレセイン、フィコ
エリスリン及びローダミンからなる群より選ばれる請求
の範囲第14又は15項に記載の方法。 - 【請求項１８】酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、パ
ーオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼからなる
群より選ばれる請求の範囲第14又は15項に記載の方法。 - 【請求項１９】検出可能なマーカーがフェリチン、ビオ
チン、アビジン及びストレプトアビジンならびにそれら
の誘導体からなる群より選ばれる請求の範囲第14項に記
載の方法。 - 【請求項２０】色素がエバンスブルー（Evans Blue）
及びクーマシーブリリアントブルー（Coomassie Brill
iant Blue）からなる群より選ばれる請求の範囲第14又
は15項に記載の方法。 - 【請求項２１】アポトーシス細胞がフローサイトメータ
ー又は抗体検出イムノアッセイの利用により単離される
請求の範囲第１〜20項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２２】ミクロタイタープレートに接着性細胞を
設け、アポトーシスがミクロタイタープレートにおいて
測定される請求の範囲第１〜20項のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項２３】アポトーシス細胞に結合する試薬に対し
て高い親和性を示す固相の利用により非−アポトーシス
細胞からアポトーシス細胞を分離する請求の範囲第１〜
20項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２４】アネキシン又はアネキシンの共役形態に
対して高い親和性を示す固相の利用により非−アポトー
シス細胞からアポトーシス細胞を分離する請求の範囲第
１〜20項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２５】或る化合物の存在に供された試料を用い
て請求の範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法を行
い、その結果を、標準試料を用いて同じ条件下で請求の
範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法を行って得られ
る結果と比較することを特徴とする、試料中のアポトー
シスの程度に対する化合物又は特定の処置の効果を決定
するための方法。 - 【請求項２６】調べるべき化合物の存在に供された試料
を用いて請求の範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法
を行い、その結果を、標準試料を用いて同じ条件下で請
求の範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法を行って得
られる結果と比較することを特徴とする、個体における
アポトーシスの程度に対する化合物又は特定の処置の効
果を決定するための方法。 - 【請求項２７】或る化合物の存在に供された試料を用い
て請求の範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法を行
い、その結果を、調べるべき化合物の存在の前に採取さ
れた試料を用いて同じ条件下で請求の範囲第１〜24項の
いずれかに記載の方法を行って得られる結果と比較する
ことを特徴とする、試料中のアポトーシスの程度に対す
る化合物又は特定の処置の効果を決定するための方法。 - 【請求項２８】調べるべき化合物の存在に供された試料
を用いて請求の範囲第１〜24項のいずれかに記載の方法
を行い、その結果を、調べるべき化合物の存在の前に採
取された試料を用いて同じ条件下で請求の範囲第１〜24
項のいずれかに記載の方法を行って得られる結果と比較
することを特徴する、個体におけるアポトーシスの程度
に対する化合物又は特定の処置の効果を決定するための
方法。 - 【請求項２９】検出可能な又は検出可能にされることが
できる、ホスファチジルセリンに対する高い親和性を有
する試薬を含み、そして無損傷の細胞からライシスを受
けた細胞を区別するための検出可能なマーカーをさらに
含むことを特徴とする、請求の範囲第１〜28項のいずれ
かに記載の方法を行うためのキット。 - 【請求項３０】カチオンをさらに含む請求の範囲第29項
に記載のキット。 - 【請求項３１】適した媒体をさらに含む請求の範囲第29
又は30項に記載のキット。 - 【請求項３２】検出可能なマーカーが、細胞が分離され
得るようにする選択可能なマーカーである請求の範囲第
29〜31項のいずれかに記載のキット。 - 【請求項３３】マーカーがプロピジウムヨーダイドであ
る請求の範囲第29〜32項のいずれかに記載のキット。
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