JP2023526035A - 標的突然変異生成によって変異体植物を得るための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法であって、植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトすること、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、前記特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA、および選抜マーカーをコードする；トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を子孫植物から選抜することを含む方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、植物育種の分野に関する。植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法が提供され、そこで、植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトすること、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、前記特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA、および選抜マーカーをコードする；トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに子孫植物から遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を選抜することを含む。
突然変異生成（mutagenesis）技術は、植物育種に有用な更なる遺伝的多様性の創出を可能にする。栽培化およびその後の選抜育種過程による遺伝学的ボトルネック効果のために、ほとんどの作物において遺伝資源プールで利用可能な遺伝的多様性は限られているため、このような更なる遺伝的多様性の創出は特に重要である。そのため、誘発性突然変異生成法、例えば、化学的突然変異生成および放射線突然変異生成などは、植物育種に有用な新規の改良された植物の形質の探索において数十年間植物育種に使用されている。
標的突然変異生成法の発達は、急速に進歩した作物の形質の遺伝学的基盤の知識と相まって、植物育種に有用な新たな対立遺伝子の創出の更なる可能性を開いた。１つの特に有望な標的突然変異生成法は、人工（engineered）ヌクレアーゼを用いたゲノム編集であり、そこでは人工ヌクレアーゼを用いて標的細胞のゲノムDNAに部位特異的二本鎖切断が誘発される。ゲノム編集法に有用な人工ヌクレアーゼには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector-based nuclease：TALEN）、およびクラスター化した規則的な間隔の短い回文配列反復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats：CRISPR）関連ヌクレアーゼが含まれる。特に有用なゲノム編集法には、CRISPR/Cas9に基づく標的突然変異生成法およびCRISPR/Cpf1に基づく標的突然変異生成法が含まれる；例えば、Brooksら(2014) Plant Physiol 166, 1292-1297およびWO2016/205711 A1を参照せよ。
人工ヌクレアーゼによって誘発される二本鎖切断は、細胞の内在性DNA二本鎖切断修復機構、例えば、相同性指向修復機構（HDR）または非相同末端結合（NHEJ）などによって修復され得る。特に、宿主細胞のDNA修復過程の鋳型として用いられるDNA分子である修復鋳型存在下でのHDRは、標的細胞においてゲノムDNAの特定の突然変異の比較的効率の良い部位特異的導入を可能にする。特異的に設計された修復鋳型を標的細胞内に導入することによって、標的細胞のDNAの特異的な欠失、改変、挿入または置換が、良好な効率および信頼性で達成され得る。NHEJによる二本鎖切断のDNA修復は予想しにくく、二本鎖切断の部位に１つ以上のヌクレオチドの置換および/または欠失および/または挿入などの、異なる遺伝性突然変異を引き起こし得る。
標的植物細胞のゲノムDNAに１つ以上の二本鎖切断を誘発した後に生じ得る特定の突然変異は、しかし、比較的低頻度でしか生じないと予想され得る。これは、特に、非常に特異的な改変、例えば非常に特異的なヌクレオチドの欠失、置換（replacement）または挿入などが所望される場合である。低頻度で生じ得る他の改変は、より大きなDNA断片の欠失、DNA断片の逆位または転座である。このような低頻度の突然変異が所望の突然変異である場合、特異的に所望される突然変異を含む変異体植物を同定し選抜するために、複数の変異体植物が作製され、スクリーニングされる必要がある。特に、所望の突然変異が非常に低頻度でしか生じない場合、非常に多数の変異体植物がスクリーニングのために作製される必要があり、費用と時間がかかる。
従って、所望の遺伝性突然変異を有する植物のより時間効率が良く費用効率の良いスクリーニングを可能にする、植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法の必要性がある。
本発明は、植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法であって、（a）植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトすること、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、前記特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）、および選抜マーカーをコードする；（b）トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；（c）前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに（d）遺伝性突然変異を有する１つ以上のone or more植物を子孫植物から選抜することを含む前記方法を提供する。
発明の詳細な説明
一般的定義
本発明は特定の方法論または手順に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書に用いられる専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「a」、「an（and）」、および「the」は、文脈が明確にそうでないと指示しない限り複数形の言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「ベクター（a vector）」への言及は、1つ以上のベクターへの言及であり、当業者にとって既知のその同等物などが含まれる。「約」という用語は、本明細書において、およそ、大体、～前後、または～の辺りを意味するために用いられる。「約」という用語が数値範囲とともに用いられる場合、それは記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。通常、「約」という用語は、本明細書において、20パーセント、好ましくは10パーセント上方または下方（より高いまたはより低い）の変動まで、記述された値の上下に数値を修正するために用いられる。本明細書において用いられる場合、「または」という語は、特定の一覧の任意の１つの要素を意味し、またその一覧の要素の任意の組み合わせも含まれる。「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（include）」、「含んでいる（including）」、および「含まれる（includes）」という語は、本明細書および下記の特許請求の範囲において用いられる場合、1つ以上の記述された特徴、整数値、構成要素、またはステップの存在を規定することを目的としているが、それらは1つ以上の他の特徴、整数値、構成要素、ステップ、もしくはその群の存在または追加を除外しない。明確にするため、本明細書において用いられる特定の用語は、下記のように定義され使用される。
一般的定義
本発明は特定の方法論または手順に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書に用いられる専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「a」、「an（and）」、および「the」は、文脈が明確にそうでないと指示しない限り複数形の言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「ベクター（a vector）」への言及は、1つ以上のベクターへの言及であり、当業者にとって既知のその同等物などが含まれる。「約」という用語は、本明細書において、およそ、大体、～前後、または～の辺りを意味するために用いられる。「約」という用語が数値範囲とともに用いられる場合、それは記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。通常、「約」という用語は、本明細書において、20パーセント、好ましくは10パーセント上方または下方（より高いまたはより低い）の変動まで、記述された値の上下に数値を修正するために用いられる。本明細書において用いられる場合、「または」という語は、特定の一覧の任意の１つの要素を意味し、またその一覧の要素の任意の組み合わせも含まれる。「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（include）」、「含んでいる（including）」、および「含まれる（includes）」という語は、本明細書および下記の特許請求の範囲において用いられる場合、1つ以上の記述された特徴、整数値、構成要素、またはステップの存在を規定することを目的としているが、それらは1つ以上の他の特徴、整数値、構成要素、ステップ、もしくはその群の存在または追加を除外しない。明確にするため、本明細書において用いられる特定の用語は、下記のように定義され使用される。
「ゲノム」という用語は、生物の遺伝物質に関する。それはDNAで構成されている。ゲノムには、遺伝子とDNAの非コード配列との両方が含まれる。
「遺伝子」という用語は、細胞内でメッセンジャーRNA分子（mRNA）に転写される領域（転写領域）、および機能し得る形で連結されたもの（本明細書ではまた調節配列、例えばプロモーターとして記載される）を含む（ゲノム）DNA配列を意味する。遺伝子は、従って、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む5’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（cDNAまたはゲノムDNA）および例えば転写終結部位を含む3’非翻訳配列などの、いくつかの機能し得る形で連結された配列を含み得る。遺伝子の異なる対立遺伝子は、従って、遺伝子の異なる代替形態であり、それは、ゲノムDNA配列の（例えばプロモーター配列、エクソン配列、イントロン配列などの中の）、１つ以上のヌクレオチド、mRNAおよび/またはコードされるたんぱく質のアミノ酸配列における違いの形であり得る。遺伝子は、本明細書において、起源となる種に由来するDNA配列を含む遺伝子座として定義される、内在性遺伝子であり得る。
植物に対する誘発性遺伝子改変は、シスジェニック改変であってもよく、本発明の文脈においてそれは、同一種または生殖適合性のある種に由来する、コード配列ならびにそれらの生来の調節エレメント（例えばプロモーターおよびターミネーター）を含む（無傷の）全遺伝子の組み込みによる植物ゲノムの改変を指す。植物に対する誘発性遺伝子改変はまた、イントラジェニック改変であってもよく、本発明の文脈においてそれは、同一種または生殖適合性のある種に由来する、コード配列ならびにそれらの調節エレメント（例えばプロモーターおよびターミネーター）を含む組換え遺伝子の組み込みによる植物ゲノムの改変を指す。イントラジェネシスは、異なる組み合わせの遺伝要素、例えば異なる遺伝子由来のプロモーターが使用され得るという点でシスジェネシスとは異なる。生殖適合性のない生物または異なる属の生物に由来する任意のDNA配列がゲノムに組み込まれた植物は、「トランスジェニック植物」と呼ばれる。「交配可能な種」には、その生物の分類学上の科の範囲内の種が含まれる。「交配不可能な種」は、その種の分類学上の科の範囲外の種である。
遺伝子配列の「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域と定義される。プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近傍、同一鎖上およびそのDNAの上流に位置する。プロモーターは、約100～1000塩基対の長さであり得る。１つの態様では、プロモーターは、遺伝子によってコードされるタンパク質の開始コドン（すなわちATG）の上流の約1000塩基対以上、例えば約1500または2000塩基対の領域と定義される。
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに機能し得る形で連結されるDNA領域がRNAへと転写される過程を指し、そのRNAは生物学的に活性を有する、すなわち生物学的に活性を有するタンパク質またはペプチド（もしくは活性を有するペプチド断片）へと翻訳されることが可能である、あるいは（例えば転写後の遺伝子サイレンシングまたはRNAiにおいて）それ自体活性を有する。コード配列は、センス方向であり、所望の、生物学的に活性を有するタンパク質またはペプチド、または活性を有するペプチド断片をコードし得る。
「量的形質遺伝子座」または「QTL」は、連続的に分布した（量的な）表現型の表現度に影響を及ぼす１つ以上の対立遺伝子をコードする染色体遺伝子座である。
同一染色体上の遺伝子座の間（例えば遺伝子および/または分子マーカーおよび/または表現型マーカーの間）の「物理的距離」は、塩基もしくは塩基対（bp）、キロ塩基もしくはキロ塩基対（kb）またはメガ塩基もしくはメガ塩基対（Mb）で表される実際の物理的距離である。
同一染色体上の遺伝子座の間（例えば分子マーカーおよび/または表現型マーカーの間）の「遺伝的距離」は、交差の頻度、または組換え頻度（RF）によって測定され、センチモルガン（cM）で示される。１センチモルガンは1％の組換え頻度に相当する。組換えが見られない場合、RFはゼロであり、遺伝子座は物理的に極めて近接しているか、またはそれらは同一である。２つの遺伝子座が離れるほど、RFはより高くなる。
「減数分裂性組換え」という用語は、真核生物において減数分裂の間に起こる相同染色体の対合を伴う遺伝子組換えを指す。相同染色体の対合は、続いて前記染色体間での情報転移が起こり得る。この情報転移は、物理的交換を伴わずに（供与側の染色体は変化せずに、遺伝物質の一部が一方の染色体から他方に複写される）、またはDNA鎖の切断および再結合によって起こってもよく、新たな組換えDNA分子を形成する。
「RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ」という用語は、標的核酸（例えば標的DNA）内のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指し、切断部位は、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼと結合して複合体を形成するガイドRNAによって特異的に決定される。このようなRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは一般的に細菌における、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats：CRISPR）適応免疫系に関連し、異なるRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは異なる細菌種に由来する。RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは当技術分野において周知であり、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、およびCas13を含むがそれに限定されない（例えばSchindele 2018 doi:10.1002/1873-3468.13073を参照されたい）。
「ガイドRNA」（gRNA）という用語は、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼと結合することができ、標的核酸配列と特異的に結合する非コード低分子RNAを指し、それによってRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを前記標的核酸へと誘導する。gRNAは、「スペーサー核酸」を含み、それは、標的核酸と特異的に結合するために標的核酸に相補的な十分な数の塩基を含む核酸であり、それによってRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを対象の標的核酸の領域に誘導することができる。
「CRISPR RNA」（crRNA）という用語は、gRNAの構成要素を指し、crRNAは宿主DNAの正確な部分を見出すスペーサー核酸を含むgRNAの要素である。CRISPR-Cas9システムでは、crRNAは、活性型gRNAを形成するtracrRNAと結合する領域を含む。CRISPR-Cas9システムに含まれる活性型gRNAは、複合体を形成する個別のcrRNAおよび個別のtracrRNAを含んでもよく、または例えばリンカーによって共有結合したcrRNAおよびtracrRNAを含む活性型sgRNAを含んでもよい。「トランス活性化型crRNA」（tracrRNA）という用語は、CRISPR-Cas9システムに含まれるgRNAの構成要素を指し、通常ヘアピンループを含み、活性型gRNAを形成するcrRNAと結合する。
「選抜マーカー」という用語は、細胞内に導入された際、人為的な選抜に適した形質を与えることによって、細胞内に外来DNAを導入するよう意図されたトランスフェクションの成功を示す遺伝子を指す。特に適切な選抜マーカーには、ntp II（カナマイシン耐性のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼII）、hpt（ハイグロマイシンB耐性のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）およびaad A（ストレプトマイシン耐性のためのアミノグリコシド-3アデニルトランスフェラーゼ）などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、細胞内に核酸を意図的に導入する過程に関する。
「野生型対立遺伝子」（WT）は、本明細書では完全に機能するタンパク質（野生型タンパク質）をコードする遺伝子の型を指す。
例えば、「野生型MS10対立遺伝子」または「MS10対立遺伝子」または「MS10遺伝子の野生型対立遺伝子」という用語は、MS10遺伝子の完全に機能する対立遺伝子を指し、それは野生型MS10対立遺伝子と比較した際、正常なタンパク質機能（すなわち、発現タンパク質の正常な酵素活性を伴う正常なタンパク質発現）を可能にする。MS10遺伝子は塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子をコードする。例えば、Solanum lycopersicum種の野生型MS10対立遺伝子の１例は、配列番号２に示される野生型MS10 cDNA（mRNA）配列をコードする野生型ゲノムDNAである。この野生型MS10 cDNAによってコードされるタンパク質配列は、209アミノ酸残基を有し、NCBI参照配列XM_026029418.1に対応する配列番号１に示される。野生型Solanum lycopersicum MS10対立遺伝子は更に、本明細書に記載されるような野生型MS10 cDNAおよびアミノ酸配列をコードする野生型ゲノムDNAの機能的変異型を含む。本明細書に具体的に記載される野生型MS10対立遺伝子の特定の変異型が「機能的変異型」に相当するかどうかは、正常な生存能力を有する花粉の生産についての表現型試験およびタンパク質機能に影響を及ぼすアミノ酸変化のin silico予測を含むがそれに限定されない、通常の方法を用いることによって決定され得る。例えば、ウェブ上のコンピュータープログラムSIFT（Sorting Intolerant from Tolerant）は、アミノ酸置換がタンパク質の機能に影響を及ぼすかどうかを予測するプログラムである（ワールドワイドウェブsift.bii.a-star.edu.sg/を参照されたい）。機能的に重要なアミノ酸はタンパク質ファミリー内で保存されるものであるため、よく保存されている位置での変化は許容されないまたは有害であると予測される傾向がある（NgおよびHenikoff (2003) Nucleic Acids Res 31(13): 3812--3814も参照されたい）。例えば、タンパク質ファミリーのアライメントのある位置がアミノ酸イソロイシンしか含まない場合、他の任意のアミノ酸への置換はしないものとして選択され（selected against）、イソロイシンはタンパク質機能に必要であると推定される。従って、他の任意のアミノ酸への変化は、タンパク質機能に有害であると予測されるであろう。アライメントのある位置が疎水性アミノ酸イソロイシン、バリン、およびロイシンを含む場合、SIFTは、実質的にこの位置が疎水性を有するアミノ酸しか含み得ないと推定する。この位置では、他の疎水性アミノ酸への変化は通常許容されると予測されるが、他の残基（例えば荷電または極性など）はタンパク質機能に影響を及ぼすと予測されるであろう。タンパク質機能の予測に有用な代替ツールはProveanである（ワールドワイドウェブprovean.jcvi.org/index.phpを参照されたい）。また、Solanum lycopersicum MS10遺伝子の、特にSolanum lycopersicum種の近縁野生種でのオーソログは、その変異型が正常なタンパク質機能を許す場合には、野生型MS10対立遺伝子の機能的変異型であり得る。
更なる例として、「野生型AA対立遺伝子」または「AA対立遺伝子」または「AA遺伝子の野生型対立遺伝子」は、AA遺伝子の完全に機能する対立遺伝子を指し、それは野生型AA対立遺伝子と比較した際、正常なタンパク質機能（すなわち、発現タンパク質の正常な酵素活性を伴う正常なタンパク質発現）を可能にする。AA遺伝子はグルタチオンS-トランスフェラーゼ酵素をコードする。例えば、Solanum lycopersicum種の野生型AA対立遺伝子の１例は、配列番号４に示される野生型AA cDNA（mRNA）配列をコードする野生型ゲノムDNAである。この野生型AA cDNAによってコードされるタンパク質配列は、230アミノ酸残基を有し、NCBI参照配列XM_004232621.4に対応する配列番号３に示される。野生型Solanum lycopersicum AA対立遺伝子は更に、本明細書に記載されるような野生型AA cDNAおよびアミノ酸配列をコードする野生型ゲノムDNAの機能的変異型を含む。本明細書に具体的に記載される野生型AA対立遺伝子の特定の変異型が「機能的変異型」に相当するかどうかは、酵素活性の試験、胚軸の色についての表現型試験および、本明細書の上記に更に記載したようなタンパク質機能に影響を及ぼすアミノ酸変化のin silico予測を含むがそれに限定されない、通常の方法を用いることによって決定され得る。また、Solanum lycopersicum AA遺伝子の、特にSolanum lycopersicum種の近縁野生種でのオーソログは、その変異型が正常なタンパク質機能を許す場合には、野生型AA対立遺伝子の機能的変異型であり得る。
「変異対立遺伝子」は、本明細書では、野生型対立遺伝子と比較した際に１つ以上の突然変異を含む対立遺伝子を指し、本発明の形質をもたらす。１つ以上の突然変異は、コード配列（mRNA、cDNA、もしくはゲノム配列）内、あるいは関連した非コード配列および/またはコード配列の発現レベルを調節する調節配列内であり得る。このような突然変異（例えば１つ以上のヌクレオチドの挿入、逆位、欠失および/または置換）は、例えば、末端切断されたタンパク質または１つ以上のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質が原因で、in vitroおよび/またはin vivoでの機能性の低下（機能低下）あるいはin vitroおよび/またはin vivoでの無機能性（機能喪失）を有するコードタンパク質を生じ得る。このような変化は、異なる三次元構造を有するタンパク質、異なる細胞内区画に標的化されたタンパク質、１つ以上改変された触媒ドメインを有するタンパク質、核酸またはタンパク質への改変された結合活性を有するタンパク質などを生じ得る。好ましくは、本発明の変異対立遺伝子は、野生型タンパク質と比較した際に機能低下または機能喪失を有する末端切断型タンパク質をコードする。更に、突然変異（例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、逆位、欠失および/もしくは置換）は、発現が低下したコードタンパク質を生じるか、またはタンパク質発現がなくなり得る。
例えば、「変異ms10対立遺伝子」または「ms10対立遺伝子」または「MS10遺伝子の変異対立遺伝子」または「野生型MS10遺伝子の変異対立遺伝子」という用語は、特に、コード配列に１つ以上の突然変異を含むMS10遺伝子の対立遺伝子を指し、１つ以上の突然変異はコードされた遺伝子産物の機能低下または機能喪失を引き起こし、変異対立遺伝子がホモ接合型である際、植物に雄性不稔形質を持たせる。「雄性不稔」または「雄性不稔形質」という用語は、植物の機能的な葯、花粉、または雄性配偶子の産生不全を引き起こす植物の形質を指す。変異ms10対立遺伝子という用語はまた、機能が低下した、または機能のない変異ms10タンパク質をコードするms10対立遺伝子だけでなく、ノックアウトms10対立遺伝子およびノックダウンms10対立遺伝子を含む。本明細書において用いられる場合、「ノックアウト対立遺伝子」という用語は、それぞれの（野生型）遺伝子の発現がもはや検出できない対立遺伝子を指す。「ノックダウン」対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と比較して低下したそれぞれの（野生型）遺伝子の発現を有する。
更なる例として、「変異aa対立遺伝子」または「aa対立遺伝子」または「AA遺伝子の変異対立遺伝子」または「野生型AA遺伝子の変異対立遺伝子」という用語は、特に、コード配列に１つ以上の突然変異を含むAA遺伝子の対立遺伝子を指し、１つ以上の突然変異はコードされた遺伝子産物の機能低下または機能喪失を引き起こし、変異対立遺伝子がホモ接合型である際、植物にアントシアニン欠損形質を持たせる。「アントシアニン欠損」または「アントシアニン欠損形質」という用語は、前記植物の胚軸においてアントシアニン着色の欠損を引き起こす植物の形質を指す。変異aa対立遺伝子という用語はまた、機能が低下した、または機能のない変異aaタンパク質をコードするaa対立遺伝子だけでなく、ノックアウトaa対立遺伝子およびノックダウンaa対立遺伝子を含む。
「誘発性変異対立遺伝子」という用語は、本明細書において用いられる場合、突然変異生成など、人間の介入によって作製される本発明の形質をもたらす野生型遺伝子の任意の対立遺伝子を指す。好ましくは、誘発性変異対立遺伝子は、自然個体群または育種個体群中の植物では見出すことができない。
「自然変異対立遺伝子」という用語は、本明細書において用いられる場合、変異対立遺伝子が直接の人間の介入なしに進化した、本発明の形質をもたらす野生型遺伝子の任意の対立遺伝子を指す。好ましくは、自然変異対立遺伝子は、自然個体群または育種個体群中の植物において見出すことができる。
「オーソロガス遺伝子」または「オーソログ」という用語は、種分化事象を通じて進化した異なる種の遺伝子と定義される。通常、オーソログは異なる種で同一の生物学的機能を有すると推測される。従って、Solanum lycopersicum種の近縁野生種の野生型Solanum lycopersicum MS10遺伝子のオーソログによってコードされるタンパク質は、野生型Solanum lycopersicum MS10タンパク質と同じ生物学的機能を有することが、特に好ましい。更に、Solanum lycopersicum種の近縁野生種の野生型Solanum lycopersicum AA遺伝子のオーソログによってコードされるタンパク質は、野生型Solanum lycopersicum AAタンパク質と同じ生物学的機能を有することが、特に好ましい。オーソログを同定する方法は、２つの目的：進化の過程の力および機構を研究するために遺伝子系図を記述すること、ならびに同じ生物学的機能を有する遺伝子群を作ることを達成するため、当技術分野において非常によく知られている（Fang G,ら(2010) Getting Started in Gene Orthology and Functional Analysis. PLoS Comput Biol 6(3): e1000703. doi:10.1371/journal.pcbi.1000703）。例えば、特定の遺伝子またはタンパク質のオーソログは、対象のタンパク質の遺伝子配列の、他の種の遺伝子配列との配列アライメントまたは配列同一性を用いて同定され得る。遺伝子アライメントまたは遺伝子配列同一性の決定は、当技術分野において既知の方法に従って、例えば既存の核酸またはタンパク質データベース（例えばGENBANK、SWISSPROT、TrEMBL）において核酸またはタンパク質配列を同定すること、および、標準的な配列解析ソフトウェア、例えば配列類似性検索ツール（BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTAなど）を用いることによって、実施され得る。
「遺伝子移入（introgression）断片」あるいは「遺伝子移入部分」あるいは「遺伝子移入領域」は、交配もしくは従来の育種技術、例えば戻し交配などによって、同一種または近縁種の別の植物内に導入された染色体断片（あるいは染色体部分あるいは領域）を指し、言い換えれば、遺伝子移入された断片は、「遺伝子移入する」という動詞で呼ばれる育種方法（例えば戻し交配など）の結果である。「遺伝子移入断片」という用語は決して染色体全体を含まず、染色体の一部のみを含むことが理解される。遺伝子移入断片は、例えば染色体の４分の３または半分程大きくてもよいが、好ましくはより小さく、例えば約15Mb以下、例えば約10Mb以下、約9Mb以下、約8Mb以下、約7Mb以下、約6Mb以下、約5Mb以下、約4Mb以下、約3Mb以下、約2.5Mbもしくは約2Mb以下、約1Mb（1,000,000塩基対と等しい）以下、または約0.5Mb（500,000塩基対と等しい）以下、例えば約200,000bp（200キロ塩基対と等しい）以下、約100,000bp（100kb）以下、約50,000bp（50kb）以下、約25,000bp（25kb）以下などである。
「同系植物」という用語は、対象の変異対立遺伝子以外は遺伝的に同一の２つの植物を指す。例えば変異体植物の表現型に対する対象の変異対立遺伝子の影響は、従って、突然変異を含む植物系統（変種）と突然変異を含まないその同質遺伝子系統との間で比較できる。
「核酸配列」または「核酸分子」またはポリヌクレオチドという用語は、相互に交換可能に使用され、一本鎖もしくは二本鎖型のDNAまたはRNA、特に、本発明に従ったタンパク質またはタンパク質断片をコードするDNAを指す。「単離された核酸配列」とは、もはやそれが単離された自然環境にはない核酸配列、例えば細菌宿主細胞内または植物核ゲノムもしくはプラスチドゲノム内の核酸配列を指す。
「タンパク質」、「ペプチド配列」、「アミノ酸配列」または「ポリペプチド」という用語は、相互に交換可能に使用され、特定の作用機序、大きさ、三次元構造または起源に関わらず、アミノ酸の鎖で構成されている分子を指す。タンパク質の「断片」または「部分」は、従ってまだ「タンパク質」と呼ばれ得る。「単離されたタンパク質」は、もはやその自然環境にはない、例えばin vitroまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞内のタンパク質を指すために用いられる。
「活性を有するタンパク質」または「機能的なタンパク質」は、in vitroで（例えばin vitro活性アッセイによって）、および/またはin vivoで（例えばタンパク質によって与えられる表現型によって）、測定可能であるようなタンパク質活性を有するタンパク質である。「野生型」タンパク質は、野生型植物に存在するような、完全に機能的なタンパク質である。「変異タンパク質」は、本明細書では、タンパク質をコードする核酸配列に１つ以上の突然変異を含むタンパク質であり、それによって突然変異は、活性の変化を有する（変異核酸分子がコードする）タンパク質、好ましくは活性の低下を有するタンパク質、最も好ましくは活性を持たないタンパク質をもたらす。
本明細書に記載される場合タンパク質の「機能的派生物」は、活性もしくは変異タンパク質に特異的な抗体との免疫学的交差反応性の少なくとも一部を保持するタンパク質の断片、変異型、類似体、または化学的誘導体である。
変異タンパク質の断片とは、その分子の任意の一部を指す。
変異型ペプチドは、直接化学合成によって、例えば、当技術分野において周知の方法を用いて作製され得る。
変異タンパク質の類似体とは、タンパク質全体またはその断片のいずれかと実質的に類似した非天然タンパク質を指す。
核酸分子における「突然変異」は、例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入による、野生型配列と比較して１つ以上のヌクレオチドの変化である。
タンパク質を構成しているアミノ酸分子における「突然変異」は、例えば１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入による、野生型配列と比較して１つ以上のアミノ酸の変化である。このようなタンパク質は、その結果「変異タンパク質」とも呼ばれる。
「点突然変異」は、単一ヌクレオチドの置換、または単一ヌクレオチドの挿入もしくは欠失である。
「ナンセンス突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列中の（点）突然変異であり、それによって核酸分子中のコドンは終止コドンに変化する。これは、mRNA中に存在する未成熟終止コドンをもたらし、末端切断型タンパク質の翻訳を引き起こす。末端切断型タンパク質は、機能低下または機能喪失があり得る。
「ミスセンスまたは非同義突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列中の（点）突然変異であり、それによってコドンは異なるアミノ酸をコードするように変化する。結果として生じるタンパク質は、機能低下または機能喪失があり得る。
「スプライス部位突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列中の突然変異であり、それによってmRNA前駆体のRNAスプライシングが変化し、野生型と比べて異なるヌクレオチド配列を有するmRNAおよび異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を生じる。結果として生じるタンパク質は、機能低下または機能喪失があり得る。
「フレームシフト突然変異」は、それによってmRNAの読み枠が変化する、タンパク質をコードする核酸配列中の突然変異であり、異なるアミノ酸配列をもたらす。結果として生じるタンパク質は、機能低下または機能喪失があり得る。
本発明の文脈において「欠失」は、所定の核酸配列中のどこかで、対応する野生型配列の核酸配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドが欠けている、または所定のアミノ酸配列中のどこかで、対応する（野生型）配列のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸が欠けていることを意味するものとする。
本発明の文脈において「逆位」は、所定の核酸配列中で、少なくとも３つ以上のヌクレオチドの断片のヌクレオチド配列が、野生型ヌクレオチド配列と比較した際に反転している突然変異を意味するものとする。
本発明の文脈において「重複」は、所定の核酸配列中の少なくとも３つ以上のヌクレオチドの断片のヌクレオチド配列が、野生型ヌクレオチド配列と比較した際に重複している突然変異を意味するものとする。重複した断片は、1つ以上の遺伝子全体を含み得る。重複した断片は、更に１つ以上の調節領域を含み得る。更に、断片はゲノムの同一の染色体内に重複してもよく、またはゲノム内の異なる染色体上に重複してもよい。
本発明の文脈において「転座」は、所定の核酸配列中で、少なくとも３つ以上のヌクレオチドの断片のヌクレオチド配列が、野生型ヌクレオチド配列と比較した際に、ゲノム内の１つの遺伝子座から欠失し、ゲノム内の異なる遺伝子座に挿入される突然変異を意味するものとする。少なくとも３つ以上のヌクレオチドの転座される断片は、1つ以上の遺伝子全体を含み得る。少なくとも３つ以上のヌクレオチドの転座される断片は、更に1つ以上の調節領域を含み得る。更に、断片はゲノムの同一の染色体内に転座してもよく、またはゲノム内の異なる染色体上に転座してもよい。
「末端切断」は、ヌクレオチド配列の3’末端もしくは5’末端のいずれかで少なくとも１つのヌクレオチドが、対応する野生型配列の核酸配列と比較して欠けている、またはタンパク質のN末端もしくはC末端のいずれかで少なくとも１つのアミノ酸が、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して欠けており、それによって、3’末端またはC末端の末端切断では、それぞれ、5’末端の少なくとも最初のヌクレオチドまたはN末端の最初のアミノ酸が依然として存在し、5’末端またはN末端の末端切断では、それぞれ、3’末端の少なくとも最後のヌクレオチドまたはC末端の最後のアミノ酸が依然として存在することを意味すると理解されるものとする。5’末端は、対応する野生型核酸配列の翻訳における開始コドンとして使用されるATGコドンによって決定される。
「置換」は、それぞれのタンパク質のコード配列中のヌクレオチドの交換が原因で、核酸配列中の少なくとも１つのヌクレオチドまたはタンパク質配列中の少なくとも１つのアミノ酸が、それぞれ、対応する野生型核酸配列または対応する野生型アミノ酸配列と比較して異なることを意味するものとする。
「挿入」は、核酸配列またはタンパク質のアミノ酸配列が、それぞれ、対応する野生型核酸配列または対応する野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも１つの更なるヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことを意味するものとする。
本発明の文脈において「未成熟終止コドン」は、対応する野生型コード配列の終止コドンと比較して、終止コドンが、5’末端の開始コドンにより近いコード配列（cds）中に存在することを意味する。
例えば遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー中のような「調節配列中の突然変異」は、例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失もしくは挿入による、野生型配列と比較して１つ以上のヌクレオチドの変化であり、例えば、作られる遺伝子のmRNA転写産物の減少または欠如を引き起こす。「遺伝子配列のプロモーター」は、従って、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域と定義される。プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近く、同一鎖上およびそのDNAの上流に位置する。プロモーターは、約100～1000塩基対の長さであり得る。１つの態様では、プロモーターは、遺伝子によってコードされるタンパク質の開始コドン（すなわちATG）の約2000塩基対以上上流の領域と定義され、好ましくは、プロモーターは、開始コドンの約1500塩基対上流の領域であり、より好ましくは、プロモーターは、開始コドンの約1000塩基対上流の領域である。
本明細書において用いられる場合、「機能し得る形で連結された」という用語は、機能的な関係でのポリヌクレオチド要素の結合を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合「機能し得る形で連結され」ている。例えば、プロモーター、より正確には（rather）転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能し得る形で連結されている。機能し得る形で連結されたとは、連結されている核酸配列が通常連続していることを意味する。
「配列同一性」および「配列類似性」は、グローバルもしくはローカルアライメントアルゴリズムを用いた２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアライメントによって決定され得る。配列は、それらが例えばプログラムGAPまたはBESTFITまたはEmbossプログラム「Needle」（デフォルトパラメーター使用、下記参照）により最適にアライメントされ、少なくとも特定の最小限の配列同一性パーセント（下記において更に定義される）を共有した場合、「実質的に同一である」と見なしてもよい。これらのプログラムは、ニードルマン・ブンシュグローバルアライメントアルゴリズムを用いて、それらの全長にわたって２つの配列をアライメントし、マッチ数を最大化しギャップ数を最小化する。通常、ギャップクリエーションペナルティー=10およびギャップエクステンションペナルティー=0.5（ヌクレオチドとタンパク質アライメントの両方で）のデフォルトパラメーターが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアマトリックスはDNAFULLであり、タンパク質については、デフォルトスコアマトリックスはBlosum62である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919）。配列アライメントおよび配列同一性パーセントのスコアは、例えばEMBOSS（http://www.ebi.ac.uk under /Tools/psa/emboss_needle/でのebi.ac.ukによりインターネット上で利用可能）などのコンピュータープログラムを用いて決定され得る。代替方法として、配列類似性または同一性は、FASTA、BLASTなどのデータベース検索によって決定され得るが、ヒットは、配列同一性を比較するためにペアワイズで検索およびアライメントされるべきである。配列同一性パーセントが少なくとも95％、96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％、または99.3％以上、好ましくは99.7％である場合（デフォルトパラメーター、すなわち、ギャップクリエーションペナルティー=10、ギャップエクステンションペナルティー=0.5を用い、核酸についてはDNAFULL、タンパク質についてはBlosum62のスコアマトリックスを用いてEmboss“needle”によって決定された場合）、２つのタンパク質または２つのタンパク質ドメイン、あるいは２つの核酸配列は、「実質的配列同一性」を有する。このような配列もまた、本明細書において「変異型」と見なされ、例えば、本明細書に開示される特定の核酸およびアミノ酸配列が同定され得るよりもむしろ本発明の雄性不稔形質および/または本発明のアントシアニン欠損形質の原因となる対立遺伝子の他の変異型ならびにタンパク質などであり、それは雄性不稔および/または胚軸でのアントシアニンの欠損に対して本発明の植物と同様の作用を有する。
本明細書において用いられる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、通常、プローブ配列および標的配列の性質に応じて、当業者にとって容易に理解されるであろう適切なストリンジェンシー条件（厳しいハイブリダイゼーション条件）での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当技術分野において周知であり、インキュベーション時間、温度および/または溶液のイオン強度を変化させることによる所望のストリンジェンシーに応じた条件の調整は容易に行われる（例えば、Sambrook, J.ら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照されたい）。条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的G-C含量、および許容されるミスマッチ量によって決定される。より低い程度の相補性を有する鎖間の部分的なハイブリダイゼーションが望まれる場合、低ストリンジェンシー条件が好ましい。完全またはほぼ完全な相補性が望まれる場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件では、ハイブリダイゼーション溶液は、6×S.S.C.、0.01 M EDTA、１×デンハルト溶液、および0.5％ SOSを含有する。ハイブリダイゼーションは、クローニングされたDNAの断片では約68℃で約3～4時間、全真核細胞DNAでは約12～約16時間行われる。より低いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの温度を、二本鎖の融解温度（TM）よりも低い約42℃に低下させる。TMは、G-C含量および二本鎖の長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
本明細書において用いられる場合、DNAまたはRNA分子に「ハイブリダイズする」という語句は、ハイブリダイズする分子、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または任意のヌクレオチド配列が（センスもしくはアンチセンス方向で）、およそ同じサイズであり、且つ適切な条件下でハイブリダイゼーションを生じるようにそれと十分な配列類似性を有する別の核酸分子中の配列を認識し、ハイブリダイズすることを意味する。例えば、ある遺伝子の3'コード領域または非コード領域由来の100ヌクレオチド長の分子は、２つの配列の間に約70％以上の配列類似性がある限り、その遺伝子または任意の他の植物遺伝子の3'コード領域または非コード領域内のヌクレオチド配列のおよそ100ヌクレオチドの部分を認識し、ハイブリダイズするであろう。対応する部分のサイズは、ハイブリダイゼーション中のいくらかのミスマッチを許容するであろうことが理解されるべきであり、対応する部分は、それにハイブリダイズする分子より小さいまたはより大きくてもよく、例えば20～30％大きいまたは小さい、好ましくは約12～15％大きいまたは小さいことを超えない。
本明細書において用いられる場合、「少なくとも95％配列同一性を含む配列」または「少なくとも95％アミノ酸配列同一性を含む配列」または「少なくとも95％ヌクレオチド配列同一性を含む配列」という語句は、示された参照配列と比較した際少なくとも95％、例えば少なくとも96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％、または99.3％以上、好ましくは99.7％配列同一性を有する配列を意味する。配列同一性は、本明細書に記載された方法に従って決定され得る。
遺伝子またはDNA配列の「断片」とは、その分子の任意の一部、例えば、より短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。１つの態様では、断片は、本発明よって定義されたような突然変異を含む。
遺伝子またはDNAの「変異型」とは、１つ以上の置換されたヌクレオチドを有するヌクレオチド置換変異型のような、遺伝子全体またはその断片のいずれかと実質的に類似した分子を指すが、それは、特定の遺伝子とハイブリダイズする能力、または天然のDNAとハイブリダイズするmRNA転写産物をコードする能力を維持する。好ましくは、変異型は、本発明によって定義されるような変異対立遺伝子を含む。
本明細書において用いられる場合、「植物」という用語は、植物全体あるいはその任意の部分または派生物、例えば植物器官（例えば採取された、もしくは採取されていない花、葉など）、植物細胞、植物プロトプラスト、植物全体が再生され得る植物細胞もしくは組織培養物、再生可能もしくは再生不可能な植物細胞、植物カルス、植物細胞集塊、および植物内の完全な植物細胞、または植物の一部、例えば、胚、花粉、胚珠、子房（例えば採取された組織もしくは器官）花、葉、種子、塊茎、クローン増殖した植物、根、茎、子葉、胚軸、根端などを含む。また、実生、未成熟および成熟などの、任意の発生段階が含まれる。
「植物系統」または「育種系統」とは、植物およびその子孫を指す。本明細書において用いられる場合、「近交系」という用語は、繰り返し自殖され、あらゆる特性についてほぼホモ接合性である植物系統を指す。従って、「近交系」または「親系統」とは、数世代（例えば少なくとも5、6、7世代以上）の同系交配を経た植物を指し、高い均一性を有する植物系統を生じる。
「植物変種」は、既知の最も低い等級の同一の植物分類群内の植物のグループであり、それは（植物育種家の権利を認めるための条件が満たされているか否かに関わらず）特定の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する特性の発現に基づいて定義することができ、少なくとも１つのそれらの特性の発現によって他の任意の植物のグループと区別することができ、それが変化することなく増殖できることから、実体（entity）と見なすことができる。従って、「植物変種」という用語は、たとえそれらが同じ種類であったとしても、それらが１つの遺伝子座もしくは遺伝子の存在（またはこの単一の遺伝子座もしくは遺伝子に起因する一連の表現型特性）によってすべて特徴付けられるが、その他の点で他の遺伝子座または遺伝子については互いに大きく異なり得る場合、植物のグループを表すために使用することはできない。「F1、F2など」は、２つの親植物または親系統間の交配後の連続的な血縁関係にある世代を指す。２つの植物または系統の交配によって生じた種から成長した植物は、F1世代と呼ばれる。F1植物の自殖はF2世代を生じるなど。「F1雑種」植物（もしくはF1種子、または雑種）は、２つの近交親系統の交配から得られる世代である。「自殖」とは、従って、植物の自家受粉、すなわち同一植物由来の配偶子の融合を指す。
「戻し交配」とは、ある（単一の）形質、例えば雄性不稔形質および/またはアントシアニン欠損形質を、１つの遺伝的背景（また一般的に「ドナー」とも呼ばれるが、必ずしもこれは下位の遺伝的背景ではない）から別の遺伝的背景（また一般的に「反復親」とも呼ばれるが、必ずしもこれは上位の遺伝的背景ではない）の中に移動させることができる育種方法を指す。交配の子孫（例えば、本発明の変異対立遺伝子を含む特定の植物種の第１植物を、同一植物種もしくは前記第１植物と交配され得る異なる植物種の第２植物と交配することによって得られ、ここで前記第２植物種は本発明の変異対立遺伝子を含まないF1植物；またはF1の自殖によって得られるF2植物もしくはF3植物など）は、前記第２植物種の親植物と「戻し交配」される。反復戻し交配の後、ドナー遺伝的背景の形質、例えば本明細書に記載されるような雄性不稔形質および/またはアントシアニン欠損形質を与える変異対立遺伝子は、反復性遺伝的背景に取り込まれているであろう。「遺伝子変換された（gene converted）」または「変換植物（conversion plant）」または「単一遺伝子座変換（single locus conversion）」という用語は、この文脈において、戻し交配によって発生した植物を指し、供与親（donor parent）から導入された１つ以上の遺伝子に加えて、反復親（recurrent parent）の基本的にすべての所望の形態学的および/または生理学的特性が取り戻されている。F1植物の第２親植物系統との戻し交配によって生じた種子から生育された植物は、「BC1世代」と呼ばれる。BC1個体群由来の植物は、自殖されてBC1F2世代を生じる、または栽培親植物系統と再度戻し交配されてBC2世代を提供し得る。「M1個体群」は、特定の植物系統の複数の突然変異誘発された種子/植物である。「M2、M3、M4など」は、最初の突然変異生成された種子/植物（M1）の自殖後に得られる連続した世代を指す。「T0植物」という用語は、本明細書において用いられる場合、１つ以上のトランスフェクト細胞から再生された植物を指す。「T1、T2、T3など」は、最初のトランスフェクト種子/植物（T0）の自殖後に得られる連続した世代を指す。
「栽培植物」または「栽培品種」という用語は、ヒトによって栽培され、優良な農学的特性を有している、所定の種の植物、例えばその種の変種、育種系統または栽培品種などを指す。いわゆるエアルーム変種または栽培品種、すなわちヒトの歴史の初期に一般に栽培され、しばしば特定の地理的領域に適応した自然受粉変種または栽培品種は、栽培植物として本明細書に包含される本発明の１つの態様である。「栽培植物」という用語は、野生植物を包含しない。「野生植物」は例えば野生系統（wild accession）を含む。
「食物」という用語は、体に栄養補給を提供するために消費される任意の物質である。それは、通常植物または動物起源であり、必須の栄養素、例えば炭水化物、脂質、タンパク質、ビタミン、またはミネラルなどを含む。その物質は、生物によって消化され、エネルギーを生産し、生命を維持し、または成長を促進するために生物の細胞によって同化される。食物という用語は、ヒトと動物の体の両方に栄養補給を提供するために消費される物質を含む。
「栄養繁殖」または「クローン増殖」とは、例えば挿し木からの植物の増殖またはin vitro増殖などによる栄養組織からの植物の増殖を指す。in vitro増殖は、in vitroでの細胞または組織の培養およびin vitro培養物からの植物全体の再生を含む。元の植物のクローン（すなわち遺伝学的に同一の栄養繁殖）は、このようにin vitroでの培養によって生成され得る。「細胞培養」または「組織培養」とは、植物の細胞または組織のin vitroでの培養を指す。「再生」とは、細胞培養または組織培養または栄養繁殖からの植物の発生を指す。「非繁殖細胞」とは、植物全体に再生することができない細胞を指す。
「平均」とは、本明細書において算術平均を指す。
異なる植物系統間での比較は、１つ以上の対照植物系統（好ましくは野生型植物）の植物と同じ条件下で、系統（または変種）の多数の植物（例えば、系統あたり少なくとも５株の植物、好ましくは少なくとも10株の植物）を生育すること、および同じ環境条件下で生育した際の植物系統間での差、好ましくは統計的に有意な差の決定を含むことが理解される。好ましくは、植物は同一の系統または変種である。
植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法
本発明は、（a）植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトし、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）、および選抜マーカーをコードする；（b）トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；（c）前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに（d）遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を子孫植物から選抜することを含む、植物において前記特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法を提供する。
本発明は、（a）植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトし、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）、および選抜マーカーをコードする；（b）トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；（c）前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに（d）遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を子孫植物から選抜することを含む、植物において前記特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法を提供する。
T0植物を野生型植物と交配することによって、特定の遺伝性突然変異が低頻度でしか起こらない場合に、非常に多数のT0植物を作製しスクリーニングする必要があることを防ぐことができる。理論に拘束されるものではないが、少なくともT0植物の一部において、DNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体は活性を有するであろうと考えられる。T0植物を野生型植物（活性構築物を含まない植物）と交配することによって、活性を有するDNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体を有するT0植物は、F1世代（活性構築物を有するT0植物と野生型植物との間の交配の子）において所望の突然変異を誘発するであろう。その結果として、対象の特定の遺伝性突然変異を同定するために必要とされる非常に多数のF1植物を作製することが可能である。このような多数のF1植物は、非常に多数のT0植物より容易に得ることができる。例えば、所望の遺伝性突然変異が、２つの形質間の遺伝学的距離をゼロに減少させるような標的植物のゲノムDNA中の逆位である場合、克服されなければならない最も重大な問題は、実際の逆位が非常に低頻度でしか起こらないことである。所望の逆位を有する植物を同定することができる十分なトランスジェニック事象を発生させることは、非常に困難ですらあり得る。代わりに、本発明者らは意外にも、活性構築物を有するトランスフェクト植物が選抜され、これらの植物を完全なgRNA標的部位を有する同系の野生型植物由来の花粉と交配し得ることを発見した。この同系の野生型花粉は、受精後のための（for the after fertilization）新たな鋳型をもたらす。その結果、これらの交配由来の種子から生じたはるかに多数の実生は、子葉のサンプリング、DNAの単離およびPCRに基づくスクリーニングによって容易にスクリーニングされ得る。従って、本発明の方法を用いることによって、新たにトランスフェクトまたは形質転換される個体のin vitroでの作製の必要性なしに、多くの新たな植物個体が容易に作製でき、所望の希少な突然変異を有する植物を同定することができる。実際に、活性CRISPR-Cas構築物を有する植物は、交配するための任意の花粉ドナーにおいて「突然変異誘発物」として使用され得る。所望の突然変異を有するドナーの遺伝子型を作製するために、わずかな戻し交配しか必要とされないであろう。
外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配するステップは、従って、活性を有するDNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体に、無傷なgRNA標的部位を有するゲノムDNAを提供し、それによって活性を有するDNAエンドヌクレアーゼ/gRNAによる所望の突然変異を誘発する。本発明に含まれるような、前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配する工程段階は、従って、作製される植物のゲノム内に形質を導入する、またはゲノム中で形質を改変する技術ステップに相当する。前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配する工程段階における形質の導入または改変は、有性交配のために選ばれた植物の遺伝子の混合の結果ではない。
本発明の方法の１つのステップでは、適宜（accordingly）、植物細胞が外来DNAによってトランスフェクトされる。植物細胞内に外来DNAを導入する手段および方法は、当技術分野において周知であり、細菌媒介性形質転換（例えばアグロバクテリウム媒介性形質転換）、ウイルス媒介性遺伝子導入、例えばパーティクルボンバードメントを用いたバイオリスティック法のような粒子によるトランスフェクション法、例えばエレクロトポレーション、超音波処理およびマイクロインジェクションなどの非化学的方法、ならびに例えばリポソームトランスフェクションのような化学的方法を含むがそれに限定されない（例えばKeith LindseyおよびWenbin Wei. In: Arabidopsis, A Practical Approach. Ed. Z.a. Wilson. Oxford Uni-versity Press, 2000. New York, USAを参照されたい）。外来DNAの植物細胞内への導入は、植物細胞培養物、植物組織培養物において、または植物全体に含まれる植物細胞においてであっても実施され得る。後者の場合、トランスフェクト細胞から植物を再生する前に、トランスフェクト細胞はトランスフェクトされていない植物細胞から単離または分離される。形質転換植物の子孫において新たな突然変異事象が引き起こされ、同定される必要があり、それが活性を有する遺伝性のDNA構築物を必要とする場合、例えばアグロバクテリウムによる安定な形質転換が好ましい。
本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、前記特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）、および選抜マーカーをコードする。本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAは、更なるエレメント例えば、限定はされないが修復鋳型などをコードしてもよい。修復鋳型は、宿主細胞のDNA修復過程、特に相同性指向修復機構（HDR）における鋳型として機能する核酸分子の配列である。しかし、本発明の文脈において植物細胞内に導入される外来DNAは、修復鋳型を含まないことが好ましい。
本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAは、適宜、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼをコードする。本発明の方法に使用され得る様々な異なるRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼが、これまでの間に同定されている。１つの態様では、本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAによってコードされるRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、およびCas13からなる群より選択される。１つの態様では、本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAによってコードされるRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼは、好ましくはCas12a（以前はCpf1とも名付けられていた）である。Cas12aは付着末端を残してDNAを切断し、より効率的なその後のDNA修復を引き起こし得る。
本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAは更に、所望の特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）をコードする。本発明の文脈において使用されるgRNAは、複合体を形成する複数のRNAで構成されてもよく、または単一のgRNA（sgRNA）で構成され、そこではgRNAの異なる構成要素が、例えば１つ以上のリンカーによって共有結合されていてもよい。gRNAの設計は大きく異なる可能性があり、一部は本発明の方法に使用される特定のRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼの選択によって決定される。例えば、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼとしてのCas9の選択は、gRNAがトランス活性化型crRNA（tracrRNA）および少なくとも１つのCRISPR RNA (crRNA)を含むことを必要とする。別法として、Cas9と組み合わせて用いられるgRNAはまた、１つのRNAに結合されたtracrRNAおよび少なくとも１つのcrRNAを含む単一のgRNA（sgRNA）でもあり得る。１つの態様では、従って、本発明の過程におけるRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼはCas9であり、そこでgRNAは、tracrRNAおよび少なくともcrRNAを含む、またはgRNAは、１つのRNAに結合されたtracrRNAおよび少なくとも１つのcrRNAを含むsgRNAである。更なる例として、RNA誘導型DNAとしてのCas12aの選択は、gRNAがtracrRNAを含むことを必要としない。代わりに、Cas12aは、gRNAがTリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含むことを必要とする。
本発明に従った方法は、植物において任意の遺伝性突然変異を誘発するために使用され得る。このような遺伝性突然変異は、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、未成熟終止コドン突然変異、欠失、末端切断、置換、挿入、逆位、重複、および転座からなる群より選択される１つ以上の突然変異であり得る。突然変異は、コード領域、非コード領域、調節配列、例えばプロモーター配列またはエンハンサー配列などからなる群より選択される１つ以上の中であり得る。本発明に従った方法は、比較的低頻度でしか生じないと予想される遺伝性突然変異の導入および選抜に特に有用である。このような低頻度の突然変異は、例えば非相同末端結合（NHEJ）によって得られる突然変異であり得る。更なる態様では、従って、本発明は、本明細書に記載されるような、植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法を提供し、そこで特定の遺伝性突然変異は、逆位、重複または転座である。トランスジェニック植物ではない植物を得ることが本発明の方法を使用する目的である場合、このような突然変異は特に有用である。
本発明の方法において植物細胞内に導入される外来DNAは、更に、外来DNAの導入が成功し、コードされたRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼおよびgRNAの発現が可能になる植物細胞の選抜を可能にする選抜マーカーをコードする。
本発明の方法の更なるステップでは、植物は、トランスフェクトされた細胞から再生され、複数のT0植物を提供する。植物細胞から植物を再生する手段および方法は、当技術分野において周知である。例えば、細胞または組織培養物は、シュート誘導（shooting）培地および/または発根（rooting）培地で処理され、植物全体を再生することができる。
本発明の１つの態様では、そこからT0植物が再生されるトランスフェクト細胞は、選抜マーカーの活性に基づいて選抜され、選抜マーカーは、好ましくはカナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、テトラサイクリン耐性およびアンピシリン耐性からなる群より選択される。
本発明の方法の更なるステップでは、得られたT0植物は、前記外来DNAを含まない同系植物と交配され、複数の子孫植物を提供する。意外にも、外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配することによって、はるかに多数の変異体植物が得られることが見出された。その結果として、これらの交配からの種子に由来するはるかに多数の実生は、容易にスクリーニングされ得る。
本発明の方法の更なるステップでは、遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物が子孫植物から選抜される。多数の植物中で特定の突然変異をスクリーニングする手段および方法は当技術分野において周知であり、所望の突然変異の存在を検出するために、既知の方法を用いたDNA、RNA（もしくはcDNA）またはタンパク質レベルでのスクリーニングを含み得る。例えば、本発明の過程で得られた子孫植物の実生は、栽培された後、子葉などの植物部分からサンプル採取され得る。その後、子葉サンプルからDNAが単離された後、PCRに基づく所望の突然変異のスクリーニングが実施され得る。
PCRの数を減らすため、PCRに基づくスクリーニング前に、DNAサンプルはプールされ得る。例えば、1000個のDNAサンプルは、10個体の植物由来のDNAをそれぞれ含む100プールごとにプールされ得る。これらの100プールのPCRに基づくスクリーニングおよびこれらのプールの１つ以上での突然変異の同定後、次のPCRにおいて、同定されたプールを構成している個々のDNAサンプルがスクリーニングされることによって、突然変異を含むDNAサンプルが同定され得る（一次元プーリング）。
別法として、例えば900個のDNAサンプルは、30列（x1～x30）および30行（y1～y30）による仮想の二次元グリットに整理されてもよく、その中で各サンプルはx1y1から始まりx30y30で終わるそれ自身の座標を持つ。すべての列由来のDNAをプールすると30個のx-プールとなり、すべての行由来のDNAをプールすると30個のy-プールとなる。それらの30個のx-プールおよび30個のy-プールにおいてPCRに基づくスクリーニングが実施され、２つのプール；x-プール中の１つとy-プール中の１つにおいて突然変異の同定に至るかもしれない。そのx-プールおよびy-プールの番号が、例えばx20y10のように、突然変異を含む特定のDNAサンプルの同定につながる。
別法として、例えば1000個のDNAサンプルは、10のx座標、10のy座標および10のz座標による仮想の三次元グリットに整理されてもよく、その中で各DNAサンプルはx1,y1,z1から始まりx10,y10,z10で終わるそれ特有の座標を持つ。各次元のDNAサンプルをプールすると10個のx-プール、10個のy-プールおよび10個のz-プールとなり、それぞれは100個体に由来するDNAを含み、各個体は各次元の１つのプールで表される。30プールのPCRに基づく分析は、例えばx-プール3、y-プール5およびz-プール4のように、各次元の１つのプールにおける突然変異の同定に至るかもしれない。これは、座標x3,y5,z4を有する１つの植物個体のDNAサンプルの同定につながるであろう（Tsaiら、2011; https://doi.org/10.1104/pp.110.169748）。
PCRに基づくスクリーニングは、期待されるまたは所望の突然変異に特異的なプライマーを用いて実施され得る。プライマーは、特定の逆位が起こった場合だけDNA断片を増幅するように設計され得る。例えば、標的DNA上の同じ方向に設計された２つのプライマーは産物を増幅しない。しかし、逆位が起こり、１つのプライマー結合部位の逆位をもたらす場合、一方のプライマーの、他方に対する新たな方向は、その特定の事象のマーカーとして使用され得る特異的なDNA断片の増幅を可能にし得る。
別法として、プライマーセットはまた、欠失が起こった場合だけにDNA断片を増幅するように設計され得る。例えば、フォワード方向のプライマーおよびリバースプライマーの位置は、離れ過ぎていて、選択された反応条件下では産物を増幅することができない可能性がある。特定のDNAポリメラーゼは、1分あたり1kbpを転写することが可能であり得る。10秒の伸長時間を有するPCRでは、約1kbp以上の産物は増幅できない。欠失のような突然変異は、プライマーの物理的距離の減少をもたらし、10秒の伸長時間を有するPCRでのアンプリコンの生成を可能にし、ひいては欠失のマーカーになり得るであろう。
別法として、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）のようなデジタルPCRシステムを使用することによって、プールされたDNAサンプル中の突然変異を同定してもよい。ドロップレットデジタルPCRは、DNAサンプルを何千ものドロップレットに分画する。その後、鋳型のPCR増幅がそれぞれ個別のドロップレット中で起こり、陽性ドロップレットの計数は正確で絶対的な標的の定量を与える。デジタルPCRは、SNP、対立遺伝子変異型、編集されたDNAなどのまれな配列の検出および定量を可能にする。
従って、更なる態様では、本発明は、子孫植物の一部からゲノムDNAを単離し、そのゲノムDNAが遺伝性突然変異を含むかどうかを決定することによって、遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を選抜する方法を提供する。
好ましくは、本発明の方法で得られた植物のゲノムDNAが所望の遺伝性突然変異を含むかどうかを決定するために、DNA配列決定法が使用される。DNA配列決定法の手段および方法は、当技術分野において周知であり、例えば鎖停止配列決定法（サンガー配列決定法）、合成による配列決定法（イルミナ配列決定法）、ナノポアDNA配列決定法、ポロニー配列決定法、イオン半導体配列決定法およびDNAナノボール配列決定法などの方法が含まれる。
別法として、特に、所望の突然変異を含む植物と所望の突然変異を含まない植物との間で単一ヌクレオチドの違い（単一ヌクレオチド多型、SNP）を検出するのに十分である場合、SNP遺伝子型決定アッセイが使用されることによって、所望の遺伝性突然変異を有する植物を選抜することができる。例えば、SNPはKASPアッセイ（ワールドワイドウェブkpbioscience.co.ukを参照されたい）または他のSNP遺伝子型決定アッセイを用いて容易に検出され得る。KASPアッセイの開発のために、例えばSNPの70塩基対上流および70塩基対下流が選択され、２つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーおよび１つの対立遺伝子特異的リバースプライマーが設計され得る（例えばAllenら、2011, Plant Biotechnology J. 9, 1086-1099、特にKASPアッセイ法についてはp097-1098を参照されたい）。同様に、例えばTaqMan SNP遺伝子型決定アッセイ、高解像度融解曲線（High-Resolution Melting）（HRM）アッセイおよびSNP遺伝子型決定アレイ（例えばFluidigm、Illuminaなど）のような、他の遺伝子型決定アッセイが使用され得る。
更なる態様では、本発明の方法は、T0植物の野生型植物との交配に先立って、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを発現するT0植物が選抜されることによって、活性構築物を有する1つ以上のT0植物を提供し、活性構築物を有する1つ以上のT0植物だけが野生型植物と交配されることによって、複数の子孫植物を提供するステップを含む。本明細書において用いられる場合「活性構築物」という用語によって、先に導入された外来DNAによってコードされるDNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体は活性を有する、すなわちDNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体はF1世代（活性構築物を有するT0植物と野生型植物との間の交配の子）に所望の突然変異を誘発することができるということを意味する。
活性構築物を有するT0植物の選抜、および活性構築物を有さない植物とそれらの交配によって、次世代の植物のスクリーニングはより効率的になる。活性構築物を有する１つまたは比較的少数のT0植物だけが、野生型植物（活性構築物を有さない）と交配された際、多数の異なるF1植物が生成され、低頻度事象についてスクリーニングすることができる。DNAエンドヌクレアーゼ/gRNA複合体が活性を持たないT0植物が野生型植物と交配される集団から除去される場合、特定の遺伝性突然変異を有する可能性がある非常に多数のF1植物を作製することは、はるかに効率的になる。
１つの態様では、本発明の方法は、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを発現する選抜されたT0植物は、前記RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼのRNAが検出されるT0植物であるステップを含む。活性CRISPR-Cas構築物を有するT0植物を同定する１つの間接的方法は、活性構築物によって引き起こされる突然変異の存在である。例えば、CRISP-Cas構築物は逆位にされるべきゲノムDNA断片の隣接部を標的とする２つ以上のガイドRNAをコードし得る。所望の逆位は稀にしか起こらない事象であり、T0世代には存在しないかもしれない。しかし、小さい欠失を引き起こす突然変異は、構築物の活性に応じてgRNA標的部位で起こり得る。ヘテロ接合状態でのこれらの突然変異の存在は、活性構築物を証明する。ホモ接合状態での突然変異は、CRISPR-Cas構築物が活性を有する更により良い証拠であり得る。
更なる態様では、本発明の方法は、子孫植物が自殖され、それに続いて子孫植物から遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物の選抜が行われるステップを含む。
最初にF1子孫植物を自殖させてF2子孫集団を得ること、および前記F2子孫集団から遺伝性突然変異を有する植物を選抜することによって、活性構築物の存在についてホモ接合性の植物が得られる。活性構築物を含むF1子孫植物は常に活性構築物についてヘテロ接合性である。別法として、T0植物が自殖されることによって、ホモ接合性のT1植物を得てもよく、それは外来DNAを含まない同系植物と交配されることによって、複数の子孫植物を提供し得る。従って、本発明の方法は、T0植物が自殖されることによってT1植物を得て、それは外来DNAを含まない同系植物と交配されることによって複数の子孫植物を提供するステップを含み得る。
更なる態様では、本発明の方法は、更に、複数のT0植物（本明細書において上述のような方法ステップ（a）で得られる）のサブセットが少なくとも１回の自殖を受け、そこで前記少なくとも１回の自殖ステップによって得られた次世代の植物（offspring plant）が、そこから遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物が選抜される子孫植物（progeny plant）（本明細書において上述のような方法ステップ（c）で得られる）とともにプールされる（すなわち混合される）ことを含む。従って、トランスフェクト細胞から再生されるT0植物の一部は、外来DNAを含まない同系植物と交配する代わりに、少なくとも１回の自殖ステップを受ける。前記少なくとも１回の自殖ステップから得られた植物は、前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物の交配によって得られる子孫植物とともにプールされ、それに続いて遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を選抜するステップが行われる。
更なる態様では、本発明の方法は、更に、遺伝性突然変異を有する１つ以上の選抜された植物が戻し交配されることによって、特定の遺伝性突然変異を含み、いかなる外来DNAも含まない子孫植物を得ることを含む。
下記の非限定的な実施例は、本発明に従った方法を用いて、どのようにして効率的に変異トマト植物を得ることができるかを記載し、そこでは前記トマト植物は、それらのゲノム中に、野生型雄性不稔10（MS10）遺伝子の変異対立遺伝子および野生型アントシアニン欠損（AA）遺伝子の変異対立遺伝子を含む少なくとも１つの染色体を含み、前記植物では、前記野生型MS10遺伝子の変異対立遺伝子と前記野生型AA遺伝子の変異対立遺伝子との間で減数分裂性組換えは抑制される。実施例において特に明記しない限り、すべての組換えDNA技術は、Sambrookら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびSambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第三版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY;ならびにAusubel ら(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの１巻および２巻に記載されるような標準的な手順に従って実施される。植物分子研究のための標準的な材料および方法は、Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy著, BIOS Scientific Publications Ltd (UK)およびBlackwell Scientific Publications, UKによる共同刊行に記載される。標準的な育種方法は、'Principles of Plant breeding', 第二版Robert W. Allard (ISBN 0-471-02309-4) に記載される。
[実施例１]
構築物の設計およびクローニング
MSに対するgRNAの設計のために、本発明者らはMSの第一エクソンを用いた。AAに対するgRNAの設計のために、本発明者らはこの遺伝子の第一および第二エクソンを用いた。各遺伝子に対して、本発明者らは、ソフトウェアCRISPOR（http://crispor.tefor.net）を用いて２つのgRNA（表１）を設計した。
構築物の設計およびクローニング
MSに対するgRNAの設計のために、本発明者らはMSの第一エクソンを用いた。AAに対するgRNAの設計のために、本発明者らはこの遺伝子の第一および第二エクソンを用いた。各遺伝子に対して、本発明者らは、ソフトウェアCRISPOR（http://crispor.tefor.net）を用いて２つのgRNA（表１）を設計した。
AAに対する１つのgRNAをMSに対する１つと組み合わせて、２つのCRISPR-Cas構築物を作製した。構築物1はgMS1およびgAA1を含み、構築物2はgMS2およびgAA2を含んだ（表１）。
Golden Gate MoClo Toolkit（https://www.addgene.org/kits/marillonnet-moclo/）を用いたクローニングによって、CRISPR-Cas構築物を作製した。設計したgRNAsはオリゴとして注文され、それぞれ個別にArabidopsis thaliana由来のU6-26プロモーター（pICSL90002 plasmid, https://www.addgene.org/68261/）の後ろに挿入された。プロモーターを有するgRNAsは、Petroselinum crispum Ubiquitin4-2プロモーターおよびNOSターミネーターのもとでArabidopsisコドン最適化SpCas9配列（pDe-CAS9, https://www.addgene.org/61433/）と結合された。本発明者らは、トランスフェクトに成功したプロトプラストの割合を概算するために、CaMV-35Sプロモーターによって駆動される蛍光GFP遺伝子およびターミネーター(p35S-fGFP-ter35S)をCRISPR-Cas構築物に加えた。
CRISPR-Cas構築物1または2を含むプラスミドの単離
２つのCRISPR-Cas構築物を含むプラスミドは、Escherichia coli（25mL LB）中で増幅され、QIAGEN plasmid midi kit（Cat No./ID: 12143）を用いて、取扱説明書に記載されるとおりに単離された。
２つのCRISPR-Cas構築物を含むプラスミドは、Escherichia coli（25mL LB）中で増幅され、QIAGEN plasmid midi kit（Cat No./ID: 12143）を用いて、取扱説明書に記載されるとおりに単離された。
プラスミドDNAは200μL EBバッファー中に溶出され、Nanodrop One（Thermofisher）を用いて定量された。トランスフェクションのために、10μgのプラスミドを2 mLチューブにピペットで加え、容量が20 μlに達するまで水を加えた。
植物材料
栽培品種Moneymakerのトマト種子を1％次亜塩素酸塩および0.01％Tween20で滅菌した。その後、種子を３回滅菌水で洗浄し、ポット中の発芽培地上に置いた。発芽培地は、1リットルあたり2.2グラムのMS ビタミン（Duchefa）添加MS培地（Duchefa）、および5グラムのスクロースで構成された。pHは5.8に調整された。ポットは16時間明期8時間暗期の状態で24℃に置かれた。
栽培品種Moneymakerのトマト種子を1％次亜塩素酸塩および0.01％Tween20で滅菌した。その後、種子を３回滅菌水で洗浄し、ポット中の発芽培地上に置いた。発芽培地は、1リットルあたり2.2グラムのMS ビタミン（Duchefa）添加MS培地（Duchefa）、および5グラムのスクロースで構成された。pHは5.8に調整された。ポットは16時間明期8時間暗期の状態で24℃に置かれた。
若い実生を、ポットあたり２苗ずつ、エアフィルター付きのポットに移植した。ポットには、4.4g/Lのビタミン添加MS培地（Duchefa）、1リットルあたり30グラムのスクロースが含まれ、pHは5.8に調整された。植物は、16時間明期8時間暗期のもと、24℃で4週間、数枚の十分に発達した葉が存在するまで栽培された。
トランスフェクション
各トランスフェクションのために、２ポットから健康な伸展した葉を採取し、酵素消化バッファー中で小片に切断し、一晩インキュベートした。プロトプラストをろ過、洗浄し、標準的な方法を用いて、トランスフェクションのためのプラスミドおよびPEGで処理した。その後、プロトプラストを洗浄し、回復培地中に入れ、24℃暗所で24時間インキュベートした。トランスフェクション効率は、GFP遺伝子の存在により緑色蛍光を示したプロトプラストの割合を概算することによって測定された。各トランスフェクション反応に対して、150μLの最終容量中に約200,000個のプロトプラストが存在した。これは1μLあたり約1,300個のプロトプラストの濃度と同程度である。
各トランスフェクションのために、２ポットから健康な伸展した葉を採取し、酵素消化バッファー中で小片に切断し、一晩インキュベートした。プロトプラストをろ過、洗浄し、標準的な方法を用いて、トランスフェクションのためのプラスミドおよびPEGで処理した。その後、プロトプラストを洗浄し、回復培地中に入れ、24℃暗所で24時間インキュベートした。トランスフェクション効率は、GFP遺伝子の存在により緑色蛍光を示したプロトプラストの割合を概算することによって測定された。各トランスフェクション反応に対して、150μLの最終容量中に約200,000個のプロトプラストが存在した。これは1μLあたり約1,300個のプロトプラストの濃度と同程度である。
誘発された逆位の存在の確認
誘発された変異の存在を確認するために、本発明者らは、図１ＢおよびＣに示されるような標的化PCRを用いた。gRNA遺伝子座に隣接している配列に対するリファレンスゲノム、およびプライマー設計ソフトウェアPrimer3（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）を用いて、MSおよびAAガイドの周辺にフォワードおよびリバースプライマーを設計した。プライマー対は(AA-F) 5’-TGGTTGCTGCTCATCTTCAC -3’（配列番号９）と(AA-R) 5’-GCAAAGCCACCTTCATTCAT-3’（配列番号１０）および(MS-F) 5’-TAGGGGATTTTCATGCTGGT-3’（配列番号１１）と(MS-R) 5’-GCCAAAAATGAGTCCTTCCA-3’（配列番号１２）である。
誘発された変異の存在を確認するために、本発明者らは、図１ＢおよびＣに示されるような標的化PCRを用いた。gRNA遺伝子座に隣接している配列に対するリファレンスゲノム、およびプライマー設計ソフトウェアPrimer3（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）を用いて、MSおよびAAガイドの周辺にフォワードおよびリバースプライマーを設計した。プライマー対は(AA-F) 5’-TGGTTGCTGCTCATCTTCAC -3’（配列番号９）と(AA-R) 5’-GCAAAGCCACCTTCATTCAT-3’（配列番号１０）および(MS-F) 5’-TAGGGGATTTTCATGCTGGT-3’（配列番号１１）と(MS-R) 5’-GCCAAAAATGAGTCCTTCCA-3’（配列番号１２）である。
トランスフェクトされたプロトプラストは、下記の方法で処理された：サンプルあたり、2 μLの単離プロトプラストを20mM KOH、1％カゼイン溶液に1:1で希釈し、5分間煮沸し、5分間氷上に置いた。
誘発された逆位の「左側」および「右側」は、Phireポリメラーゼ（Thermofisher）を用いて、PCRによって増幅された。左端については、フォワードMSプライマー(MS-F)およびフォワードAAプライマー(AA-F)が用いられ、一方右側については、本発明者らは、リバースMS-RおよびリバースAA-Rプライマーを用いた（図１Ｃ）。反応混合物は、5 μlの5×バッファー、1μLの5mM DNTP、1.25μLの10 pmol/μL Fプライマー、10 pmol/μL Rプライマー、0.35 μlのPhireポリメラーゼ、4μLのプロトプラスト溶液（～2700プロトプラスト）、および12.5μLの水を含んだ。水対照もまた含まれた。稀にしか起こらない事象も検出するために、80 PCRサイクル（98℃で10秒、61.5℃で20秒、および72℃で40秒の伸長時間）が実施された。陰性対照として、トランスフェクトされていないプロトプラストが用いられた。PCR産物は、それらを可視化させるためにアガロースゲル上に移動された。
qPCR
逆位事象の頻度を概算するために、処理されたプロトプラストサンプルに対してqPCRを行った。これは、qPCR装置（Biorad）でiQ SYBR Green Supermix（Biorad）を用いて行われた。反応条件は以下の通りである：12.5μL iQ SYBR Green Supermix、1.25 μL 10 pmol/μL Fプライマー、10 pmol/μL Rプライマー、2 μL プロトプラスト溶液（～1300プロトプラスト)、25μLまで水。
逆位事象の頻度を概算するために、処理されたプロトプラストサンプルに対してqPCRを行った。これは、qPCR装置（Biorad）でiQ SYBR Green Supermix（Biorad）を用いて行われた。反応条件は以下の通りである：12.5μL iQ SYBR Green Supermix、1.25 μL 10 pmol/μL Fプライマー、10 pmol/μL Rプライマー、2 μL プロトプラスト溶液（～1300プロトプラスト)、25μLまで水。
参照として、トマト由来のアクチン遺伝子が含まれ、フォワードおよびリバースプライマー配列として、それぞれ5’-ACTGTCCCTATCTATGAAGGTTATGC-3’（配列番号１３）および5’-GAAACAGACAGGACACTCGCACT-3’（配列番号１４）を用いた。
植物の形質転換
CRISPR-Casを含むトランスジェニック植物（T0）は、Agrobacterium tumefaciens仲介性形質転換によって作製された。下記の形質転換方法は適切に使用され得る。2％ MSO（100mg L-1 ミオイノシトール、400μg L-1チアミン塩酸塩および20g L-1スクロースを含有する液体MS培地）中に600nmで0.5の希釈度（attenuance）に懸濁された8mLのAgrobacterium細胞中で、10日齢の実生の子葉をインキュベートする。30分後、子葉を滅菌ろ紙上で拭いて乾かし、1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、3％w/vスクロース、1mg L-1 NAA、1mg L-1 6‐ベンジルアミノプリンおよび0.7％w/v寒天、pH 5.7を含むMS培地上に置く。2日間の共存培養後、200mg L-1 カルベニシリンを含む液体MS培地中で子葉を洗い、1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、3％w/vスクロース、2mg L-1 ゼアチン、200mg L-1 カルベニシリン、0.7％w/v寒天、pH 5.7、および選択のために100mg L-1 カナマイシンを含むシュート誘導MS培地に移す。カルスを生じ始めた子葉を、半分のゼアチン濃度および1mg L-1 GA3を含む新しい培地に移す。子葉を2週間ごとに新しい培地に移す。最初のカルスが形成された際、シュート原基を切除して、200mg L-1 カルベニシリンおよび100mg L-1 カナマイシンを含む発芽培地である、シュート伸長MS培地に移す。2～4cmの伸長したシュートをカルスから切除し、発根（rooting） MS培地（1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、1.5％w/vスクロース、5mg L-1 IAA、200mg L-1 カルベニシリン、50mg L-1 カナマイシンおよび0.7％w/v寒天、pH 5.7）に移す。根付いた（T0）小植物体を更なる解析のために土に移す。培地成分および抗生物質はDuchefa Biochemieから入手される。
CRISPR-Casを含むトランスジェニック植物（T0）は、Agrobacterium tumefaciens仲介性形質転換によって作製された。下記の形質転換方法は適切に使用され得る。2％ MSO（100mg L-1 ミオイノシトール、400μg L-1チアミン塩酸塩および20g L-1スクロースを含有する液体MS培地）中に600nmで0.5の希釈度（attenuance）に懸濁された8mLのAgrobacterium細胞中で、10日齢の実生の子葉をインキュベートする。30分後、子葉を滅菌ろ紙上で拭いて乾かし、1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、3％w/vスクロース、1mg L-1 NAA、1mg L-1 6‐ベンジルアミノプリンおよび0.7％w/v寒天、pH 5.7を含むMS培地上に置く。2日間の共存培養後、200mg L-1 カルベニシリンを含む液体MS培地中で子葉を洗い、1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、3％w/vスクロース、2mg L-1 ゼアチン、200mg L-1 カルベニシリン、0.7％w/v寒天、pH 5.7、および選択のために100mg L-1 カナマイシンを含むシュート誘導MS培地に移す。カルスを生じ始めた子葉を、半分のゼアチン濃度および1mg L-1 GA3を含む新しい培地に移す。子葉を2週間ごとに新しい培地に移す。最初のカルスが形成された際、シュート原基を切除して、200mg L-1 カルベニシリンおよび100mg L-1 カナマイシンを含む発芽培地である、シュート伸長MS培地に移す。2～4cmの伸長したシュートをカルスから切除し、発根（rooting） MS培地（1×Nitsch and Nitschビタミン混合物、1.5％w/vスクロース、5mg L-1 IAA、200mg L-1 カルベニシリン、50mg L-1 カナマイシンおよび0.7％w/v寒天、pH 5.7）に移す。根付いた（T0）小植物体を更なる解析のために土に移す。培地成分および抗生物質はDuchefa Biochemieから入手される。
活性CRISPR-Cas構築物を含むT0トランスジェニック植物の選抜
CRISPR-Cas構築物の活性は、ゲノム中の組み込みの位置に依存する。活性構築物を有するT0植物を同定するために、T0植物のMSおよびAA遺伝子中の標的とされる領域を配列決定することによって、突然変異を含む植物を同定した。Phireポリメラーゼ（Thermofisher）を用いて、PCRによってこれらの領域を増幅した。MSまたはAA遺伝子中の標的とされる領域のいずれかに特異的なプライマーセットが使用された。反応混合物は、5μLの5×バッファー、1μLの5mM DNTP、1.25μLの10pmol/μL フォワードプライマー、10pmol/μL リバースプライマー、0.35μLのPhireポリメラーゼ、4μLのゲノムDNA溶液（4ng）、および12.5μLの水を含有した。標的領域を増幅するために、30 PCRサイクル（98℃で10秒、60℃で20秒、および72℃で5秒の伸長時間）が実施された。PCR産物はサービス提供会社によって配列決定され、突然変異の存在はDNA配列解析のためのコンピュータープログラムを用いて決定した。
CRISPR-Cas構築物の活性は、ゲノム中の組み込みの位置に依存する。活性構築物を有するT0植物を同定するために、T0植物のMSおよびAA遺伝子中の標的とされる領域を配列決定することによって、突然変異を含む植物を同定した。Phireポリメラーゼ（Thermofisher）を用いて、PCRによってこれらの領域を増幅した。MSまたはAA遺伝子中の標的とされる領域のいずれかに特異的なプライマーセットが使用された。反応混合物は、5μLの5×バッファー、1μLの5mM DNTP、1.25μLの10pmol/μL フォワードプライマー、10pmol/μL リバースプライマー、0.35μLのPhireポリメラーゼ、4μLのゲノムDNA溶液（4ng）、および12.5μLの水を含有した。標的領域を増幅するために、30 PCRサイクル（98℃で10秒、60℃で20秒、および72℃で5秒の伸長時間）が実施された。PCR産物はサービス提供会社によって配列決定され、突然変異の存在はDNA配列解析のためのコンピュータープログラムを用いて決定した。
複数の子孫植物を提供するための、自家受粉および外来DNAを含まない植物とT0植物の交配
活性CRISPR-Cas構築物を有する選抜されたT0植物を栽培し、花を自家受粉させることによってT1種子を含む果実を生産した。果実を成長させてT1種子を採取した。
活性CRISPR-Cas構築物を有する選抜されたT0植物を栽培し、花を自家受粉させることによってT1種子を含む果実を生産した。果実を成長させてT1種子を採取した。
別法として、活性CRISPR-Cas構築物を有する選抜されたT0植物を栽培し、葯の裂開前に花の雄しべを除去することによって、自家受粉を妨げた。野生型植物から単離される花粉を採取して、選抜されたT0植物を受粉させるために使用し、果実を成長させてF1種子を採取した。活性CRISPR-Cas構築物を含むF1植物は、F2種子を生産するために栽培され得る。
T1、F1およびF2種子を発芽させ、第一葉からゲノムDNAを単離した。PCRsは所望の突然変異、逆位または他の構造多型を検出するために設計された。プーリング戦略（例えばTsaiら、2011; https://doi.org/10.1104/pp.110.169748）を用いることによって、多数の実生を、限られた回数のPCRだけで解析することができる。
[実施例２]
CRISPR-Cas9構築物は、実施例１に記載されるように作製された。１つのAAに対するgRNAを１つのMSに対するgRNAと組み合わせて、３つのCRISPR-Cas9構築物を作製した。構築物1はgMS1およびgAA1を、構築物3はgMS3およびgAA3を、構築物4はgMS4およびgAA4を含んだ。
CRISPR-Cas9構築物は、実施例１に記載されるように作製された。１つのAAに対するgRNAを１つのMSに対するgRNAと組み合わせて、３つのCRISPR-Cas9構築物を作製した。構築物1はgMS1およびgAA1を、構築物3はgMS3およびgAA3を、構築物4はgMS4およびgAA4を含んだ。
構築物をEscherichia coli中で増幅させ、トマトプロトプラストのトランスフェクションのためにプラスミドを単離し、精製した。in vitroで栽培された「Moneymaker」の植物葉からプロトプラストを単離した。トランスフェクションおよびインキュベーションの後、PCRによって逆位について細胞培養物をスクリーニングした。それを行うために、トランスフェクトされたプロトプラストの一部（～2.700細胞）をPCRチューブに移し、実施例１に記載されたようにKOH中で変性させた。
AA-FとMS-FまたはAA-RとMS-Rの組み合わせプライマー対を用いて別々のPCRで、細胞溶解液に対してPCRを行った。一対のプライマーのアニーリング鎖は同じであり、野生型DNAでの増幅を妨げ、誘発された逆位の場合でのみ増幅を可能にしている（図２）。加えて、一対のプライマーの間の距離は、野生型ゲノムでは約1.1Mbpであり、大きすぎてPCR産物を増幅できない。
しかし、gRNA標的の間の領域の逆位は、図２に図示されるように逆位の境界を含むPCR産物の増幅を可能にするであろう方向でプライマー部位を1か所にまとめた。
構築物1、3、および4によってトランスフェクトされたプロトプラスト由来のPCR産物をアガロースゲルで分離し、予想されるサイズを有する断片をゲルから切り出し、DNAをサンガー法で配列決定した。ほとんどのPCRのDNA断片において、予想されるサイズが生じたことは驚くべきことであり、それは反応あたり１つ以上のプロトプラストにおいて逆位が起こることを意味するであろう。１つの反応は約2700プロトプラストに由来するDNAを含み、トランスフェクション効率は約70％（構築物中にまた存在するGFP遺伝子の蛍光から推定される；データは示さない）であったことを考えると、それは逆位の頻度が＞1/(0.7*2700)細胞であることを意味するであろう。予想されるPCRアンプリコンサイズは、ゲノム上のプライマーおよびgRNA結合部位の位置に基づき、約1.3kbである。プライマーおよびgRNA結合部位の位置ならびにそれらの配列は、表２および３に図示される。
図３は、プライマーMS-RおよびAA-R、ならびにgRNA gMS1およびgAA1を含む構築物１によってトランスフェクトされたプロトプラスト培養物由来のゲノムDNAによって生じるPCR産物のDNA配列の一部を示す。配列は逆位の下流右端に由来する。図の下部のアライメントは、DNAがgMS1結合部位で切断され、上流部分がgAA1結合部位に連結されたことを示す。一見したところ、Cas酵素は両方のgRNA結合部位に二本鎖切断（DSB）を生じ、間に約 1.1Mbpの染色体断片の逆位を引き起こした。DSBは正確にgRNA結合部位の予測される位置に生じ、それはPAM部位の上流３塩基対と４塩基対との間である。反転した染色体断片の末端のライゲーションは、いかなる付加的な配列変更もなく行われた。
図４は、プライマーMS-FおよびAA-F、ならびに構築物3によってトランスフェクトされたプロトプラスト由来のゲノムDNAによって生じるPCR産物のDNA配列の一部を示す。配列は逆位の上流左端に由来する。図の下部のアライメントは、DNAがgMS3結合部位で切断され、上流部分がgAA3結合部位に連結されたことを示す。
Cas9酵素はここでもまた、両方のgRNA結合部位に二本鎖切断（DSB）を生じ、間に約1.1Mbpの染色体断片の逆位を引き起こした。DSBsは正確にgRNA結合部位の予測される位置に生じ、反転した染色体断片の末端のライゲーションは、いかなる付加的な配列変更もなく行われた。
図５は、プライマーMS-RおよびAA-R、ならびに構築物4によってトランスフェクトされたプロトプラスト由来のゲノムDNAによって生じるPCR産物のDNA配列の一部を示す。配列は逆位の下流右端である。図の下部のアライメントは、DNAがgMS4結合部位の位置で切断され、それがgAA4結合部位の位置に連結されたことを示す。Cas酵素はここでもまた、正確にgRNA結合部位の予測される位置に誘発される逆位の両側にDSBを生じ、末端のライゲーションは、ライゲーション部位に１つのアデノシンの欠失を伴って行われた。
図３から５の３つの配列は、gRNAsがCas9を予測される位置に標的化し、DNA開裂が期待される位置で起こることを示す。加えて、配列決定されたトランジションは、DSBが染色体上の2つの位置で生じ、いくつかの事例では、間の染色体断片が修復後反転していたことを実証する。連結された末端の配列（トランジション）は、DSBが予測される位置で生じたことを実証する。
実施例２は従って、約2700プロトプラスト由来のDNAを含むPCRのほとんどで、逆位由来の境界の増幅によって逆位が検出され得ることを示す。上記に説明されたように、これは、逆位が約2700×0.7（～トランスフェクション効率）＝約1900プロトプラストに１つで起こることを意味するであろう。所望の突然変異を有する植物を得るには、所望の突然変異を有するものを発見する機会を得るために多数（＞1900）の再生シュートを必要とするであろう。トマトを含む多くの種において、プロトプラストからのシュートの再生は、技術的に非常に困難であり、いくつかの種では今まで適用に成功したことがない。
この技術的な課題を解決するために、本発明は、このような突然変異を同定するための種子に基づくスクリーニング方法を提供する。通常、CRISPR-Cas構築物はDNAに二本鎖切断を引き起こし、事象の大部分においてそれは修復される。修復システムはしばしばガイドRNA（gRNA）結合部位に変更を加え、それは修復後にgRNAの結合部位が失われ、新たな二本鎖切断を生じ得ないことを意味する。しかし、活性CRISPR-Cas構築物を含む植物が野生型植物と交配される場合、生じる種子の少なくとも半分は、変更されていないgRNA結合部位を有する野生型DNAに加えて活性CRISPR-Cas構築物を含むであろう。これは、このような植物由来のそれぞれの種子が、稀にしか起こらない突然変異事象の誘発および同定の新たな機会を提供することを意味する。従って、ある事象、例えば逆位が1900事象に１回の割合で起こる場合、所望の突然変異を同定するために、この数の実生の多数のスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、プロトプラストに対して上に記載したような境界特異的プライマーを用いたPCRであり得る。個々のPCR数を減らすために、一次元、二次元または三次元のプーリング戦略が設計され得る。
本明細書に記載される方法は、その結果初めて、同時に３つの望ましい形質、すなわち：
1.MSをノックアウトし、ホモ接合性植物での雄性不稔をもたらし、雑種種子の生産を容易にすること；
2.AAをノックアウトし、アントシアニンの欠損、およびその結果胚軸の紫色の喪失をもたらすこと；
3.逆位、ならびにその結果２つの遺伝子間の配列の相同性の喪失が原因で起こる、変異対立遺伝子msおよびaaの間での減数分裂性組換えの抑制による、これら２つの形質の遺伝的連鎖
を含むトマト植物の提供を可能にする。
1.MSをノックアウトし、ホモ接合性植物での雄性不稔をもたらし、雑種種子の生産を容易にすること；
2.AAをノックアウトし、アントシアニンの欠損、およびその結果胚軸の紫色の喪失をもたらすこと；
3.逆位、ならびにその結果２つの遺伝子間の配列の相同性の喪失が原因で起こる、変異対立遺伝子msおよびaaの間での減数分裂性組換えの抑制による、これら２つの形質の遺伝的連鎖
を含むトマト植物の提供を可能にする。
Claims (11)
- 植物において特定の遺伝性突然変異を導入および選抜する方法であって、
（a）植物細胞を外来DNAによってトランスフェクトすること、そこで前記外来DNAは、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、前記特定の遺伝性突然変異を誘発するようにRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを誘導するための適切なガイドRNA（gRNA）、および選抜マーカーをコードする；
（b）トランスフェクト細胞から植物を再生させ、複数のT0植物を提供すること；
（c）前記外来DNAを含まない同系植物とT0植物を交配し、複数の子孫植物を提供すること；ならびに
（d）遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物を子孫植物から選抜すること
を含む方法。 - T0植物の野生型植物との交配に先立って、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを発現するT0植物が選抜されることによって、活性構築物を有する１つ以上のT0植物を提供し、かつ活性構築物を有する前記１つ以上のT0植物だけが野生型植物と交配されることによって、複数の子孫植物を提供する、請求項１に記載の方法。
- RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼを発現する選抜されたT0植物は、その中で前記RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼのRNAが検出されるT0植物である、請求項２に記載の方法。
- 子孫植物が自殖され、それに続いて子孫植物から遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物の選抜が行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のT0植物のサブセットが少なくとも１回の自殖ステップを受け、そこで前記少なくとも１回の自殖ステップによって得られた次世代の植物（offspring plant）が、そこから遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物が選抜される子孫植物（progeny plant）とともにプールされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 特定の遺伝性突然変異が逆位、重複または転座である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼが、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、およびCas13からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼがCas9であり：
gRNAが、トランス活性化型crRNA（tracrRNA）および少なくとも１つのCRISPR RNA （crRNA）を含む；または
gRNAが、１つのRNAに結合されたtracrRNAおよび少なくとも１つのcrRNAを含む単一ガイドRNA（sgRNA）である、請求項７に記載の方法。 - 遺伝性突然変異を有する１つ以上の選抜された植物が戻し交配されることによって、特定の遺伝性突然変異を含み、いかなる外来DNAも含まない子孫植物が得られる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- そこからT0植物が再生されるトランスフェクト細胞が、選抜マーカーの活性に基づいて選抜され、選抜マーカーが、好ましくはカナマイシン耐性；およびアンピシリン耐性からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝性突然変異を有する１つ以上の植物が、子孫植物の一部から、好ましくは子葉からゲノムDNAを単離すること、および前記ゲノムDNAが遺伝性突然変異を含むかどうかを決定することによって選抜される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
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