JP2022026843A - Cell culture system, method for producing cell, and gas concentration control method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養技術に関し、特に細胞を高密度で培養するための細胞培養システムに関する。 The present invention relates to a cell culture technique, and more particularly to a cell culture system for culturing cells at high density.
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、袋状の細胞培養容器を用いて閉鎖系で細胞を自動的に大量培養することが提案されている。
In recent years, in the fields of pharmaceutical production, gene therapy, regenerative medicine, immunotherapy, etc., it has been required to efficiently culture a large amount of cells and tissues in an artificial environment.
Under such circumstances, it has been proposed to automatically mass-culture cells in a closed system using a bag-shaped cell culture vessel.
細胞培養容器を用いて閉鎖系で細胞を大量培養すると、次第に培養細胞の密度が50万個/cm2以上の高密度になってくる。すると、ポリエチレンやエチレン酢酸ビニルなどのガス透過性フィルムを用いて製造された100μm以上の厚みのある一般的な細胞培養容器ではガス透過性能が不十分となり、細胞の周辺の酸素濃度が低下して、増殖効率が低減してしまうという問題があった。
一方、例えば50μm以下の厚みのガス透過性フィルムを用いて製造された細胞培養容器は、高密度での培養には適するものの、容器の強度が不十分となって破袋の恐れが生じ、取り扱いが困難になるという問題があった。
When a large number of cells are cultured in a closed system using a cell culture vessel, the density of the cultured cells gradually increases to 500,000 cells / cm 2 or more. Then, the gas permeation performance becomes insufficient in a general cell culture vessel having a thickness of 100 μm or more manufactured by using a gas permeable film such as polyethylene or ethylene vinyl acetate, and the oxygen concentration around the cells decreases. There was a problem that the growth efficiency was reduced.
On the other hand, for example, a cell culture vessel manufactured by using a gas permeable film having a thickness of 50 μm or less is suitable for culturing at a high density, but the strength of the vessel becomes insufficient and there is a risk of bag breakage, so that it is handled. There was a problem that it became difficult.
ここで、ガス透過性能に優れた素材として、シリコーン材を挙げることができる。シリコーン材は強度が低いものの、厚みを300μm以上にしても優れたガス透過性能を得ることができるため、取り扱い時の強度を確保することはできる。
しかしながら、シリコーン材には、ポートなどを溶着することが困難であるという問題があった。また、シリコーン材は、放射線滅菌などによって有害な物質が溶出されるため、その後の培養性能に悪影響を及ぼす危険性があった。さらに、シリコーン材は、接着性細胞の培養に必要な表面処理が困難であるため、浮遊性細胞用の培養容器の製造は可能であるが、接着性細胞用の培養容器の製造が困難であるという問題もあった。
Here, as a material having excellent gas permeation performance, a silicone material can be mentioned. Although the silicone material has low strength, excellent gas permeation performance can be obtained even if the thickness is 300 μm or more, so that the strength at the time of handling can be ensured.
However, the silicone material has a problem that it is difficult to weld a port or the like. In addition, since harmful substances are eluted from the silicone material due to radiation sterilization or the like, there is a risk of adversely affecting the subsequent culture performance. Further, since the surface treatment required for culturing adhesive cells is difficult for the silicone material, it is possible to produce a culture vessel for floating cells, but it is difficult to produce a culture vessel for adhesive cells. There was also the problem.
そこで、本発明者らは鋭意研究して、ガス透過性フィルムを用いて製造された閉鎖系の細胞培養容器の周囲の酸素濃度を容器内の酸素濃度よりも高くなるように制御することによって、ガス透過性フィルムを介して容器内の培養液中の酸素濃度(溶存酸素濃度)を高密度での培養に適するように制御可能にすることに成功した。
また、細胞培養容器の周囲のその他のガス濃度を制御することにより、ガス透過性フィルムを介して容器内の培養液中のその他のガス濃度も制御することもでき、これによって培養する細胞に応じて培養液中のガス濃度をきめ細かく調整することが可能となった。
Therefore, the present inventors have studied diligently and controlled the oxygen concentration around the closed cell culture vessel manufactured by using the gas permeable film so as to be higher than the oxygen concentration in the vessel. We succeeded in making it possible to control the oxygen concentration (dissolved oxygen concentration) in the culture solution in the container via the gas permeable film so as to be suitable for high-density culture.
In addition, by controlling the concentration of other gases around the cell culture vessel, it is also possible to control the concentration of other gases in the culture solution in the vessel via the gas permeable film, depending on the cells to be cultured. It has become possible to finely adjust the gas concentration in the culture solution.
ところで、特許文献1には、培養槽内の培養液の酸素濃度等を計測して、培養槽に直接的にガスを注入して撹拌することによって、培養液の酸素濃度などを所望の値に制御することが開示されている。
また、特許文献2には、細胞培養容器に培養液を循環するための循環ラインを備え、循環ラインに培養液のガスと調整用ガスとのガス交換をするためのガス交換手段を設けて、このガス交換手段によって細胞培養容器内のガス濃度を制御することが開示されている。
By the way, in
Further,
しかしながら、培養槽に直接的にガスを注入する場合は汚染リスクがあり、細胞培養容器に培養液を循環する場合は静置状態で培養できず常に攪拌や循環が必要であるため装置が大掛かりになるという問題があった。
また、これらの方法では、培養液の攪拌や循環による細胞へのせん断ストレスが掛かるため、細胞へのダメージが懸念されるという問題もあった。
さらに、浮遊系の細胞の場合は、撹拌や循環によって細胞が培養液の流れとともに動いてしまい、細胞に悪影響を及ぼす危険性があった。
However, there is a risk of contamination when gas is directly injected into the culture tank, and when the culture solution is circulated in the cell culture vessel, it cannot be cultivated in a stationary state and always requires stirring and circulation, so the equipment is large-scale. There was a problem of becoming.
In addition, these methods have a problem that damage to the cells may be a concern because shear stress is applied to the cells due to stirring and circulation of the culture solution.
Furthermore, in the case of floating cells, there is a risk that the cells will move with the flow of the culture medium due to stirring or circulation, which will adversely affect the cells.
これに対して、本発明によれば、このような問題を生じることなく、細胞培養容器内の酸素濃度を高密度での培養に適するように制御することが可能である。
また、細胞培養容器のガス透過性フィルムを介して培養液中のその他のガス濃度を制御することで、細胞にダメージを与えることなく、培養する細胞に応じてガス濃度をきめ細かく調整することも可能である。
On the other hand, according to the present invention, it is possible to control the oxygen concentration in the cell culture vessel so as to be suitable for high-density culture without causing such a problem.
In addition, by controlling the concentration of other gases in the culture medium via the gas permeable film of the cell culture vessel, it is possible to finely adjust the gas concentration according to the cells to be cultured without damaging the cells. Is.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、閉鎖系の細胞培養容器のガス透過性フィルムを介して容器内のガス濃度を制御することで、細胞を高密度で培養することができ、培養する細胞に応じてガス濃度をきめ細かく調整することの可能な細胞培養システム、細胞の製造方法、及びガス濃度制御方法の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and cells can be cultured at high density by controlling the gas concentration in the vessel via the gas permeable film of the closed cell culture vessel. It is an object of the present invention to provide a cell culture system capable of finely adjusting the gas concentration according to the cells to be cultured, a method for producing cells, and a method for controlling the gas concentration.
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養システムは、ガス透過性を有する閉鎖系の培養容器に充填された培養液中のガス濃度を制御する細胞培養システムであって、前記培養容器を閉鎖的に収納して、前記培養容器の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置と、前記培養容器内の酸素濃度を取得する酸素濃度取得部と、前記容器収容装置に酸素を供給可能に配設された酸素供給装置と、前記酸素濃度取得部に接続され、取得された前記酸素濃度にもとづき前記酸素供給装置から前記容器収容装置への酸素供給を制御するガス濃度制御部とを備えた構成としてある。 In order to achieve the above object, the cell culture system of the present invention is a cell culture system that controls the gas concentration in the culture solution filled in a closed culture container having gas permeability, and closes the culture container. A container accommodating device that changes the gas concentration around the culture container, an oxygen concentration acquisition unit that acquires the oxygen concentration in the culture container, and an oxygen concentration accommodating device that can supply oxygen to the container accommodating device. As a configuration including a gas concentration control unit connected to the oxygen concentration acquisition unit and controlling oxygen supply from the oxygen supply device to the container accommodating device based on the acquired oxygen concentration. be.
また、本発明の細胞培養システムを、前記容器収容装置に窒素を供給可能に配設された窒素供給装置を備え、前記ガス濃度制御部が、取得された前記酸素濃度にもとづき前記窒素供給装置から前記容器収容装置への窒素供給を制御する構成とすることが好ましい。 Further, the cell culture system of the present invention is provided with a nitrogen supply device arranged so as to be able to supply nitrogen to the container accommodating device, and the gas concentration control unit is provided with the nitrogen supply device based on the acquired oxygen concentration. It is preferable to have a configuration that controls the supply of nitrogen to the container accommodating device.
また、本発明の細胞培養システムを、前記培養容器内の二酸化炭素濃度を取得する二酸化炭素濃度取得部と、前記容器収容装置に二酸化炭素を供給可能に配設された二酸化炭素供給装置を備え、前記ガス濃度制御部が、前記二酸化炭素濃度取得部に接続され、取得された前記二酸化炭素濃度にもとづき前記二酸化炭素供給装置から前記容器収容装置への二酸化炭素供給を制御する構成とすることが好ましい。 Further, the cell culture system of the present invention is provided with a carbon dioxide concentration acquisition unit for acquiring the carbon dioxide concentration in the culture container and a carbon dioxide supply device arranged so as to be able to supply carbon dioxide to the container storage device. It is preferable that the gas concentration control unit is connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit and controls the supply of carbon dioxide from the carbon dioxide supply device to the container storage device based on the acquired carbon dioxide concentration. ..
また、本発明の細胞培養システムを、前記培養容器を備え、前記培養容器に当該培養容器内の二酸化炭素濃度を測定する二酸化炭素濃度センサが配設され、前記二酸化炭素濃度センサが前記二酸化炭素濃度取得部に接続され、前記二酸化炭素濃度取得部が、前記二酸化炭素濃度センサからの入力情報にもとづき前記培養容器内の二酸化炭素濃度を取得する構成とすることが好ましい。 Further, the cell culture system of the present invention is provided with the culture vessel, and the carbon dioxide concentration sensor for measuring the carbon dioxide concentration in the culture vessel is provided in the culture vessel, and the carbon dioxide concentration sensor is the carbon dioxide concentration. It is preferable that the carbon dioxide concentration acquisition unit is connected to the acquisition unit and acquires the carbon dioxide concentration in the culture vessel based on the input information from the carbon dioxide concentration sensor.
また、本発明の細胞培養システムを、前記培養容器を備え、前記培養容器に当該培養容器内の酸素濃度を測定する酸素濃度センサが配設され、前記酸素濃度センサが前記酸素濃度取得部に接続され、前記酸素濃度取得部が、前記酸素濃度センサからの入力情報にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を取得する構成とすることが好ましい。 Further, the cell culture system of the present invention is provided with the culture vessel, an oxygen concentration sensor for measuring the oxygen concentration in the culture vessel is provided in the culture vessel, and the oxygen concentration sensor is connected to the oxygen concentration acquisition unit. Therefore, it is preferable that the oxygen concentration acquisition unit acquires the oxygen concentration in the culture vessel based on the input information from the oxygen concentration sensor.
また、本発明の細胞培養システムを、前記培養容器を備え、前記酸素濃度取得部に前記培養容器内の細胞を撮影して得られた画像を前記酸素濃度取得部に入力するカメラが接続され、前記酸素濃度取得部が、前記画像における細胞の占有面積にもとづき細胞数を算出して、得られた細胞数にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を算出する
構成とすることが好ましい。
Further, the cell culture system of the present invention is provided with the culture vessel, and a camera for inputting an image obtained by photographing the cells in the culture vessel to the oxygen concentration acquisition unit is connected to the oxygen concentration acquisition unit. It is preferable that the oxygen concentration acquisition unit calculates the number of cells based on the occupied area of the cells in the image, and calculates the oxygen concentration in the culture vessel based on the obtained number of cells.
また、本発明の細胞培養システムを、前記培養容器を備え、前記酸素濃度取得部が、前記培養容器による細胞の培養時間にもとづき前記培養容器内の細胞数を算出して、得られた細胞数にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を算出する構成とすることが好ましい。 Further, the cell culture system of the present invention is provided with the culture vessel, and the oxygen concentration acquisition unit calculates the number of cells in the culture vessel based on the cell culture time in the culture vessel, and the number of cells obtained is obtained. It is preferable that the structure is such that the oxygen concentration in the culture vessel is calculated based on the above.
また、本発明の細胞培養システムを、前記ガス濃度制御部が、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の酸素濃度と、前記培養容器内の酸素濃度との差が、5%以上に維持されるように、前記酸素供給装置から前記容器収容装置への酸素供給を制御する構成とすることが好ましい。 Further, in the cell culture system of the present invention, the gas concentration control unit maintains the difference between the oxygen concentration around the culture container in the container storage device and the oxygen concentration in the culture container at 5% or more. As such, it is preferable to have a configuration that controls the oxygen supply from the oxygen supply device to the container storage device.
また、本発明の細胞の製造方法は、上記の細胞培養システムを用いて細胞を培養する方法としてある。 Further, the method for producing cells of the present invention is a method for culturing cells using the above-mentioned cell culture system.
また、本発明のガス濃度制御方法は、ガス透過性を有する閉鎖系の培養容器に充填された培養液中のガス濃度を制御する細胞培養におけるガス濃度制御方法であって、前記培養容器を当該培養容器の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置に閉鎖的に収納し、酸素濃度取得部が、前記培養容器内の酸素濃度を取得し、前記酸素濃度取得部に接続されたガス濃度制御部が、取得された前記酸素濃度にもとづいて、前記容器収容装置に酸素を供給する酸素供給装置から前記容器収容装置への酸素供給を、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の酸素濃度が前記培養容器内の酸素濃度より高い狙い値になるように制御する方法としてある。 Further, the gas concentration control method of the present invention is a gas concentration control method in cell culture that controls the gas concentration in the culture solution filled in a closed culture vessel having gas permeability, and the culture vessel is used as the gas concentration control method. It is closedly housed in a container accommodating device that changes the gas concentration around the culture container, and the oxygen concentration acquisition unit acquires the oxygen concentration in the culture container and is connected to the oxygen concentration acquisition unit. However, based on the acquired oxygen concentration, the oxygen supply from the oxygen supply device that supplies oxygen to the container storage device to the container storage device is obtained, and the oxygen concentration around the culture container in the container storage device is the said. This is a method of controlling the target value to be higher than the oxygen concentration in the culture vessel.
また、本発明のガス濃度制御方法を、前記ガス濃度制御部が、取得された前記酸素濃度にもとづいて、前記容器収容装置に窒素を供給する窒素供給装置から前記容器収容装置への窒素供給を、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の酸素濃度が前記培養容器内の酸素濃度より高い狙い値になるように制御する方法とすることが好ましい。 Further, in the gas concentration control method of the present invention, the gas concentration control unit supplies nitrogen from the nitrogen supply device that supplies nitrogen to the container storage device to the container storage device based on the acquired oxygen concentration. It is preferable to use a method of controlling the oxygen concentration around the culture vessel in the container storage device so that the target value is higher than the oxygen concentration in the culture vessel.
また、本発明のガス濃度制御方法を、二酸化炭素濃度取得部が、前記培養容器内の二酸化炭素濃度を取得し、前記二酸化炭素濃度取得部に接続された前記ガス濃度制御部が、取得された前記二酸化炭素濃度にもとづいて、前記容器収容装置に二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給装置から前記容器収容装置への二酸化炭素供給を、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の二酸化炭素濃度が前記培養容器内の二酸化炭素濃度より低い狙い値になるように制御することが好ましい。 Further, in the gas concentration control method of the present invention, the carbon dioxide concentration acquisition unit acquired the carbon dioxide concentration in the culture vessel, and the gas concentration control unit connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit was acquired. Based on the carbon dioxide concentration, the carbon dioxide supply device that supplies carbon dioxide to the container storage device supplies carbon dioxide to the container storage device, and the carbon dioxide concentration around the culture container in the container storage device is the said. It is preferable to control the target value to be lower than the carbon dioxide concentration in the culture vessel.
本発明によれば、閉鎖系の細胞培養容器のガス透過性フィルムを介して容器内のガス濃度を制御することで、細胞を高密度で培養することができ、培養する細胞に応じてガス濃度をきめ細かく調整することの可能な細胞培養システム、細胞の製造方法、及びガス濃度制御方法の提供が可能となる。 According to the present invention, cells can be cultured at high density by controlling the gas concentration in the container through the gas permeable film of the closed cell culture container, and the gas concentration depends on the cells to be cultured. It becomes possible to provide a cell culture system, a method for producing cells, and a method for controlling gas concentration, which can be finely adjusted.
以下、本発明の細胞培養システム、細胞の製造方法、及びガス濃度制御方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the cell culture system, the cell production method, and the gas concentration control method of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments and examples.
[第一実施形態]
本実施形態の細胞培養システムは、ガス透過性を有する閉鎖系の培養容器に充填された培養液中のガス濃度を制御する細胞培養システムであって、培養容器を閉鎖的に収納して、培養容器の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置と、培養容器内の酸素濃度を取得する酸素濃度取得部と、容器収容装置に酸素を供給可能に配設された酸素供給装置と、酸素濃度取得部に接続され、取得された酸素濃度にもとづき酸素供給装置から容器収容装置への酸素供給を制御するガス濃度制御部とを備えたことを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養システムは、容器収容装置に窒素を供給可能に配設された窒素供給装置を備え、ガス濃度制御部が、取得された酸素濃度にもとづき窒素供給装置から容器収容装置への窒素供給を制御することが好ましい。
[First Embodiment]
The cell culture system of the present embodiment is a cell culture system that controls the gas concentration in the culture solution filled in a closed culture container having gas permeability, and the culture container is closedly stored and cultured. A container accommodating device that changes the gas concentration around the container, an oxygen concentration acquisition unit that acquires the oxygen concentration in the culture vessel, an oxygen supply device that is arranged so that oxygen can be supplied to the container accommodating device, and an oxygen concentration acquisition. It is characterized by being provided with a gas concentration control unit which is connected to the unit and controls the oxygen supply from the oxygen supply device to the container accommodating device based on the acquired oxygen concentration.
Further, the cell culture system of the present embodiment includes a nitrogen supply device arranged so as to be able to supply nitrogen to the container storage device, and the gas concentration control unit can supply the container storage device from the nitrogen supply device based on the acquired oxygen concentration. It is preferable to control the nitrogen supply to.
具体的には、図1に示すように、本実施形態の細胞培養システム1は、容器収容装置10、酸素濃度取得部30、ガス濃度制御部40、及び酸素ボンベOを備えている。また、本実施形態の細胞培養システム1は、窒素ボンベNを備えることが好ましい。本実施形態の細胞培養システム1は、容器収容装置10に培養容器20を収容して使用される。
Specifically, as shown in FIG. 1, the
容器収容装置10としては、例えばCO2インキュベータや培養二重容器(特許第4665588号)などを用いることができる。図1において、容器収容装置10内には、パンチングメタルなどからなる載置台11が設置されており、この載置台11に培養容器20が配置されて閉鎖的に収納される。なお、載置台11を省略してもよい。
As the container
容器収容装置10には、酸素ボンベO(酸素供給装置)と窒素ボンベN(窒素供給装置)からそれぞれ酸素ガス、窒素ガスが供給されることにより、その内部のガス濃度が制御されて、培養容器20の周囲のガス濃度を調整することが可能になっている。
容器収容装置10には、酸素ガスを供給する酸素ボンベOと窒素ガスを供給する窒素ボンベNがそれぞれバルブを介して接続されており、ガス濃度制御部40の制御によって各バルブの開閉動作が制御され、各ガスボンベからの容器収容装置10へのガスの供給が制御されて、容器収容装置10内の酸素濃度を調整することが可能になっている。
Oxygen gas and nitrogen gas are supplied to the container
An oxygen cylinder O for supplying oxygen gas and a nitrogen cylinder N for supplying nitrogen gas are connected to the container
培養容器20は、ガス透過性を有する閉鎖系の細胞培養容器であり、例えば矩形状の2枚のガス透過性フィルムの周縁部をヒートシールにより熱溶着させることによって形成されたものなどを用いることができる。2枚のガス透過性フィルムの間に形成された空間は、細胞を培養するための培養空間として用いられ、ガス透過性フィルムにおける培養空間を形成する領域は、培養容器20において培養部21を構成する。
The
ガス透過性フィルムとしては、例えばLLDPE(Linear Low Density Polyethylene,直鎖状低密度ポリエチレン)などのポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。また、培養容器20の内部を視認可能にするために、ガス透過性フィルムは、透明材であることが好ましい。
As the gas permeable film, for example, polyethylene such as LLDPE (Linear Low Density Polyethylene) or a polyolefin resin such as polypropylene can be preferably used. Further, in order to make the inside of the
図1において、培養容器20の長手方向両端に対向してポート22が2つ備えられているが、ポートの個数はこれに限定されず、1個でも3個以上であってもよい。ポートの材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、FEPなどの熱可塑性樹脂等を用いることができる。
In FIG. 1, two
培養容器20を用いて培養する細胞は、特に限定されず、培養液中に浮遊させて培養が行われるリンパ球や樹状細胞などの浮遊性細胞であっても、容器内の培養部21に接着させて培養が行われる人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、間葉系幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞、及び活性化工程のリンパ球等の接着性細胞であってもよい。
The cells to be cultured using the
酸素濃度取得部30は、培養容器20内の酸素濃度を取得する装置であり、PLC(programmable logic controller,プログラマブルロジックコントローラ)やマイコン、コンピュータなどを用いて構成することができる。
酸素濃度取得部30として、酸素濃度センサを用いて酸素濃度を取得するもの、細胞数にもとづき酸素濃度を算出するもの、及び培養時間にもとづき酸素濃度を推定するものの3種類を挙げることができる。
The oxygen
As the oxygen
酸素濃度取得部30として、酸素濃度センサを用いて酸素濃度を取得するものを用いる場合、図1に示すように、容器収容装置10に収容された培養容器20に酸素濃度センサ31を取り付ける。そして、酸素濃度センサ31と酸素濃度取得部30を接続し、酸素濃度センサ31により培養容器20内の培養液中の溶存酸素濃度を計測して、計測された情報を酸素濃度取得部30に入力する。
When an oxygen
この酸素濃度センサ31としては、例えば非接触式酸素センサと溶存酸素計を挙げることができる。非接触式酸素センサは、蛍光染料がコートされており、蛍光染料から発せられる蛍光エネルギーを測定する光学的手法によって酸素濃度を計測する。また、溶存酸素計は、電解液に満たされた2極間に酸素透過性の膜が用いられ、膜を透過した酸素量と2極間に流れる電流にもとづき酸素濃度を計測する。
Examples of the
酸素濃度取得部30として、細胞数にもとづき酸素濃度を算出するものを用いる場合、酸素濃度取得部30にCCDカメラが接続され、このCCDカメラで培養容器20内の培養細胞を位相差顕微鏡を介して撮影して得られた画像が酸素濃度取得部30に入力され、酸素濃度取得部30が画像における細胞の占有面積にもとづき細胞数を計算することができる。
また、細胞種によって細胞1個あたりの酸素消費量は概ね決まっているため、酸素濃度取得部30は、得られた細胞数にもとづき容器内の酸素消費量を計算して、容器内の酸素濃度を算出することができる。
When the oxygen
Further, since the oxygen consumption per cell is generally determined by the cell type, the oxygen
酸素濃度取得部30として、培養時間にもとづき酸素濃度を推定するものを用いる場合、酸素濃度取得部30は、培養時間(培養日数)にもとづいて、細胞数を算出することができる。
すなわち、増殖性が安定しているiPS細胞などの細胞を培養する場合、培養時間に対する培養細胞数は概ね一定になるため、培養時間から細胞数を推定できる。そして、酸素濃度取得部30は、得られた細胞数にもとづき容器内の酸素消費量を計算して、容器内の酸素濃度を算出することができる。
When an oxygen
That is, when culturing cells such as iPS cells having stable proliferation, the number of cultured cells is substantially constant with respect to the culturing time, so that the number of cells can be estimated from the culturing time. Then, the oxygen
ガス濃度制御部40は、酸素濃度取得部30に接続され、酸素濃度取得部30によって取得された酸素濃度の情報を酸素濃度取得部30から入力して、この情報にもとづきガスボンベから容器収容装置10へのガス供給を制御する装置であり、PLCやマイコン、コンピュータなどを用いて構成することができる。
The gas
容器収容装置10内の酸素濃度を高くする場合は、酸素ボンベOから容器収容装置10へ酸素を供給して、容器収容装置10における培養容器20の周囲の酸素濃度が所定の狙い値(培養容器20内の酸素濃度より高い狙い値)になるように制御が行われる。
When increasing the oxygen concentration in the
また、最初に容器収容装置10内の酸素濃度を低くする場合は、窒素ボンベNから容器収容装置10へ窒素を供給して、容器収容装置10における培養容器20の周囲の酸素濃度が所定の狙い値(培養容器20内の酸素濃度より低い狙い値)になるように制御が行われる。
そして、容器収容装置10内の酸素濃度を例えば低酸素濃度で維持する場合には、窒素ボンベNから容器収容装置10への窒素ガスの供給を減らすことにより、容器収容装置10内の酸素濃度が所定の狙い値(当該低酸素濃度よりも高い狙い値)になるように制御が行われる。
When the oxygen concentration in the
Then, when the oxygen concentration in the
ガス濃度制御部40によるガスボンベから容器収容装置10へのガス供給は、ガスボンベのバルブの単位時間あたりの開閉回数と開閉時間等にもとづいて制御することができる。
具体的には、一般的なCO2インキュベータの場合、ガスが導入できるように若干リークするように作られており、弱い加圧力により元々充満していたガスをチャンバから追い出しながら導入する。例えば、容器収容装置10内のガス濃度を維持する場合には、数秒ごとにガス濃度をモニターして、ガス濃度が狙い値と差が生じた場合にガスボンベのバルブを一瞬だけ開放して、容器収容装置10へガスを供給することができる。また、容器収容装置10内のガス濃度が狙い濃度と1%以上の差がある場合には開放時間を5秒、1%~0.2%の差がある場合には開放時間を1秒、それ以下の場合には開放時間を0.5秒とすることなどによって、容器収容装置10へガスを供給することができる。
The gas supply from the gas cylinder to the container
Specifically, in the case of a general CO 2 incubator, it is made so as to leak slightly so that gas can be introduced, and the gas originally filled by a weak pressing force is introduced while being expelled from the chamber. For example, when maintaining the gas concentration in the container
また、本実施形態において、ガス濃度制御部40が、容器収容装置10における培養容器20の周囲の酸素濃度と、培養容器20内の酸素濃度との差が、5%以上に維持されるように、酸素ボンベOから容器収容装置11への酸素供給を制御することが好ましい。
Further, in the present embodiment, the gas
ここで、培養容器20内の細胞密度が100万個/cm2程度の場合、通常、培養容器20内の酸素濃度が、容器収容装置10内の酸素濃度よりも10%以上低くなることが実験的に分かっている。
したがって、細胞密度が100万個/cm2以上の高密度で培養する場合、容器収容装置10内の酸素濃度が例えば25%~40%の狙い値になるように制御して、培養容器20内の酸素濃度を21%に近づけることが好ましい。
Here, when the cell density in the
Therefore, when culturing at a high density of 1 million cells / cm 2 or more, the oxygen concentration in the container
また、培養容器20内を5%程度の低酸素濃度にして培養する場合、細胞密度が10万個/cm2程度の低密度でも培養容器20内の酸素濃度が、容器収容装置10内の酸素濃度よりも2%程度低くなることが実験的に分かっている。
したがって、このような場合には、容器収容装置10内の酸素濃度が例えば7%の狙い値になるように制御して、培養容器20内の酸素濃度を5%に近づけることが好ましい。
Further, when culturing in the
Therefore, in such a case, it is preferable to control the oxygen concentration in the container
このように、本実施形態によれば、培養する細胞や細胞密度に応じて、容器収容装置10内の酸素濃度として所定の狙い値を設定し、容器収容装置10内の酸素濃度を狙い値になるように制御することで、培養容器20内の酸素濃度をきめ細かく調整することが可能になっている。なお、具体的な狙い値は、これらに限定されず、適宜設定することができる。これは、以下の実施形態においても同様である。
As described above, according to the present embodiment, a predetermined target value is set as the oxygen concentration in the
本実施形態の細胞の製造方法は、上述した本実施形態の細胞培養システム1を用いて、細胞を製造することを特徴とする。
The method for producing cells of the present embodiment is characterized in that cells are produced using the
本実施形態のガス濃度制御方法は、ガス透過性を有する閉鎖系の培養容器に充填された培養液中のガス濃度を制御する細胞培養におけるガス濃度制御方法であって、培養容器20を当該培養容器20の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置10に閉鎖的に収納し、酸素濃度取得部30が、培養容器20内の酸素濃度を取得し、酸素濃度取得部30に接続されたガス濃度制御部40が、取得された酸素濃度にもとづいて、容器収容装置10に酸素を供給する酸素供給装置Oから容器収容装置10への酸素供給を、容器収容装置10における培養容器20の周囲の酸素濃度が培養容器20内の酸素濃度より高い狙い値になるように制御することを特徴とする。
The gas concentration control method of the present embodiment is a gas concentration control method in cell culture that controls the gas concentration in the culture solution filled in a closed culture container having gas permeability, and the
また、本実施形態のガス濃度制御方法は、ガス濃度制御部40が、取得された酸素濃度にもとづいて、容器収容装置10に窒素を供給する窒素供給装置Nから容器収容装置10への窒素供給を、容器収容装置10における培養容器20の周囲の酸素濃度が培養容器20内の酸素濃度より高い狙い値になるように制御することが好ましい。
Further, in the gas concentration control method of the present embodiment, the gas
このような本実施形態によれば、培養する細胞や細胞密度に応じて、容器収容装置への酸素ガスと窒素ガスの供給を制御することで、容器収容装置内のガス濃度を通常状態に維持したり、高酸素濃度にしたり、低酸素濃度に制御することができる。このため、培養容器のガス透過性フィルムを介して容器内の酸素濃度をきめ細かく適切に制御することが可能となっている。 According to this embodiment, the gas concentration in the container storage device is maintained in a normal state by controlling the supply of oxygen gas and nitrogen gas to the container storage device according to the cells to be cultured and the cell density. It can be controlled to a high oxygen concentration or a low oxygen concentration. Therefore, it is possible to finely and appropriately control the oxygen concentration in the container through the gas permeable film of the culture container.
[第二実施形態]
本実施形態の細胞培養システムは、培養容器内の二酸化炭素濃度を取得する二酸化炭素濃度取得部と、容器収容装置に二酸化炭素を供給可能に配設された二酸化炭素供給装置を備え、ガス濃度制御部が、二酸化炭素濃度取得部に接続され、取得された二酸化炭素濃度にもとづき二酸化炭素供給装置から容器収容装置への二酸化炭素供給を制御する点で第一実施形態と相違する。その他の点については、以下に説明する点を除いて、第一実施形態と同様である。
[Second Embodiment]
The cell culture system of the present embodiment includes a carbon dioxide concentration acquisition unit for acquiring the carbon dioxide concentration in the culture container and a carbon dioxide supply device arranged so as to be able to supply carbon dioxide to the container storage device, and gas concentration control is provided. The unit is connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit, and is different from the first embodiment in that the carbon dioxide supply from the carbon dioxide supply device to the container storage device is controlled based on the acquired carbon dioxide concentration. Other points are the same as those of the first embodiment except for the points described below.
具体的には、図2に示すように、本実施形態の細胞培養システム1aは、容器収容装置10a、酸素濃度取得部30a、ガス濃度制御部40a、二酸化炭素濃度取得部50a、酸素ボンベO、窒素ボンベN、及び二酸化炭素ボンベCを備えている。本実施形態の細胞培養システム1aは、容器収容装置10aに培養容器20aを収容して使用される。
Specifically, as shown in FIG. 2, the
容器収容装置10aには、酸素ボンベO(酸素供給装置)と窒素ボンベN(窒素供給装置)と二酸化炭素ボンベC(二酸化炭素供給装置)からそれぞれ酸素ガス、窒素ガス、二酸化炭素ガスが供給されることにより、その内部のガス濃度が制御されて、培養容器20aの周囲のガス濃度を調整することが可能になっている。
Oxygen gas, nitrogen gas, and carbon dioxide gas are supplied to the container
容器収容装置10aには、酸素ガスを供給する酸素ボンベOと窒素ガスを供給する窒素ボンベNと二酸化炭素ガスを供給する二酸化炭素ボンベCがそれぞれバルブを介して接続されており、ガス濃度制御部40aの制御によって各バルブの開閉動作が制御され、各ガスボンベからの容器収容装置10aへのガスの供給が制御されて、容器収容装置10a内の酸素濃度と二酸化炭素濃度を調整することが可能になっている。
An oxygen cylinder O for supplying oxygen gas, a nitrogen cylinder N for supplying nitrogen gas, and a carbon dioxide cylinder C for supplying carbon dioxide gas are connected to the container
二酸化炭素濃度取得部50aは、培養容器20a内の二酸化炭素濃度を取得する装置であり、PLCやマイコン、コンピュータなどを用いて構成することができる。
二酸化炭素濃度取得部50aとして、二酸化炭素濃度センサを用いて二酸化炭素濃度を取得するものを用いることができる。この場合、図2に示すように、容器収容装置10aに収容された培養容器20aに二酸化炭素濃度センサ51aを取り付ける。そして、二酸化炭素濃度センサ51aと二酸化炭素濃度取得部50aを接続し、二酸化炭素濃度センサ51aにより培養容器20a内の培養液中の溶存二酸化炭素濃度を計測して、計測された情報を二酸化炭素濃度取得部50aに入力する。
なお、第一実施形態で上述した酸素濃度取得部30と同様にして、二酸化炭素濃度取得部50aにより細胞数や培養時間にもとづき二酸化炭素濃度を取得するようにしてもよい。
The carbon dioxide
As the carbon dioxide
In addition, in the same manner as the oxygen
ガス濃度制御部40aは、酸素濃度取得部30aと二酸化炭素濃度取得部50aに接続され、酸素濃度取得部30aによって取得された酸素濃度の情報を酸素濃度取得部30から入力すると共に、二酸化炭素濃度取得部50aによって取得された二酸化炭素濃度の情報を二酸化炭素濃度取得部50aから入力して、これらの情報にもとづきガスボンベから容器収容装置10へのガス供給を制御する。
The gas
すなわち、容器収容装置10a内の酸素濃度を高くする場合は、酸素ボンベOから容器収容装置10aへ酸素を供給するように制御が行われ、容器収容装置10a内の酸素濃度を低くする場合は、窒素ボンベNから容器収容装置10aへ窒素を供給するように制御が行われる。
また、大気中の二酸化炭素濃度は約0.04%であるところ、細胞培養に適する培養液中の溶存二酸化炭素濃度は約5%であるため、二酸化炭素ボンベCから容器収容装置10aへ二酸化炭素を供給するように制御が行われる。
That is, when the oxygen concentration in the container
Further, since the concentration of carbon dioxide in the atmosphere is about 0.04% and the concentration of dissolved carbon dioxide in the culture solution suitable for cell culture is about 5%, carbon dioxide is transferred from the carbon dioxide cylinder C to the
ここで、前述のとおり、細胞密度が100万個/cm2以上の高密度で培養する場合、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば25%~40%の狙い値になるように制御して、培養容器20a内の酸素濃度を21%に近づけることが好ましい。
また、培養容器20a内を5%程度の低酸素濃度にして培養する場合、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば7%の狙い値になるように制御して、培養容器20a内の酸素濃度を5%に近づけることが好ましい。
Here, as described above, when culturing at a high density of 1 million cells / cm 2 or more, the oxygen concentration in the container
Further, when culturing in the
さらに、細胞密度が100万個/cm2以上の高密度で培養する場合、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば3%の狙い値になるように制御して、培養容器20a内の二酸化炭素濃度を5%に近づけることが好ましく、細胞密度が10万個/cm2以上の低密度で培養する場合、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば4.5%の狙い値になるように制御して、培養容器20a内の二酸化炭素濃度を5%に近づけることが好ましい。
Further, when culturing at a high density of 1 million cells / cm 2 or more, the carbon dioxide concentration in the container
容器収容装置10aのガス濃度制御の例として、(1)ガス濃度を通常状態で維持する場合、(2)低酸素濃度で維持する場合、(3)高酸素濃度で維持する場合の3とおりの方法を挙げることができる。
As an example of gas concentration control of the container
(1)ガス濃度を通常状態で維持する場合、培養容器20a内のガス濃度を例えば酸素21%、二酸化炭素5%に制御することが好ましい。
この場合、ガス濃度制御部40aは、酸素と窒素の供給は行わず、二酸化炭素濃度取得部50aからの二酸化炭素濃度の情報にもとづき二酸化炭素を二酸化炭素ボンベCから容器収容部10aに供給して、培養容器20a内の二酸化炭素濃度が5%になるように制御することができる。
具体的には、例えば容器収容装置10aの容量が50Lの場合、二酸化炭素ガス約2Lを容器収容部10aに供給する。
(1) When maintaining the gas concentration in a normal state, it is preferable to control the gas concentration in the
In this case, the gas
Specifically, for example, when the capacity of the container
(2)低酸素濃度に維持する場合、培養容器20a内のガス濃度を例えば酸素5%、二酸化炭素5%に制御することが好ましい。なお、低酸素濃度でのiPS細胞の培養によって、心筋細胞が効率的に誘導されたとの報告がある(特許第6429280号)。
この場合、ガス濃度制御部40aは、酸素の供給は行わず、酸素濃度取得部30aからの酸素濃度の情報にもとづき窒素を窒素ボンベNから容器収容部10aに供給して、培養容器20a内の酸素濃度が5%になるように制御することができる。
(2) When maintaining a low oxygen concentration, it is preferable to control the gas concentration in the
In this case, the gas
また、二酸化炭素濃度取得部50aからの二酸化炭素濃度の情報にもとづき二酸化炭素を二酸化炭素ボンベCから容器収容部10aに供給して、培養容器20a内の二酸化炭素濃度が5%になるように制御することができる。
具体的には、例えば容器収容装置10aの容量が50Lの場合、窒素ガス約40Lと二酸化炭素ガス約3Lを容器収容部10aに供給する。
Further, carbon dioxide is supplied from the carbon dioxide cylinder C to the
Specifically, for example, when the capacity of the container
(3)高酸素濃度に維持する場合、培養容器20a内のガス濃度を例えば酸素40%、二酸化炭素5%に制御することが好ましい。
この場合、ガス濃度制御部40aは、窒素の供給は行わず、酸素濃度取得部30aからの酸素濃度の情報にもとづき酸素を酸素ボンベOから容器収容部10aに供給して、培養容器20a内の酸素濃度が40%になるように制御することができる。
(3) When maintaining a high oxygen concentration, it is preferable to control the gas concentration in the
In this case, the gas
また、二酸化炭素濃度取得部50aからの二酸化炭素濃度の情報にもとづき二酸化炭素を二酸化炭素ボンベCから容器収容部10aに供給して、培養容器20a内の二酸化炭素濃度が5%になるように制御することができる。
具体的には、例えば容器収容装置10aの容量が50Lの場合、酸素ガス約15Lと二酸化炭素ガス約3Lを容器収容部10aに供給する。
Further, carbon dioxide is supplied from the carbon dioxide cylinder C to the
Specifically, for example, when the capacity of the container
また、ガス濃度を通常状態で維持する場合、培養容器20a内の細胞密度が10万個/cm2程度の低密度の場合の制御例として、例えば以下の手順を実行することができる。
(ア)酸素濃度取得部30aにより、酸素濃度が例えば19%になった(低くなった)との情報が取得される。
(イ)ガス濃度制御部40aが、この情報を酸素濃度取得部30aから入力して、酸素ボンベOから容器収容装置10aへ酸素ガスを供給して、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば23%の狙い値(21%+2%)になるように制御する。
Further, when the gas concentration is maintained in a normal state, the following procedure can be executed, for example, as a control example when the cell density in the
(A) The oxygen
(A) The gas
(ウ)二酸化炭素濃度取得部50aにより、二酸化炭素濃度が例えば5.5%になった(高くなった)との情報が取得される。
(エ)ガス濃度制御部40aが、この情報を二酸化炭素濃度取得部50aから入力して、二酸化炭素ボンベCから容器収容装置10aへの二酸化炭素ガスの供給を、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば4.5%の狙い値(5%-0.5%)になるように制御する。
(C) The carbon dioxide
(D) The gas
また、ガス濃度を通常状態で維持する場合、培養容器20a内の細胞密度が200万個/cm2程度の高密度の場合の制御例として、例えば以下の手順を実行することができる。
(カ)酸素濃度取得部30aにより、酸素濃度が例えば2%になった(低くなった)との情報が取得される。
(キ)ガス濃度制御部40aが、この情報を酸素濃度取得部30aから入力して、酸素ボンベOから容器収容装置10aへ酸素ガスを供給して、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば40%の狙い値(21%+19%)になるように制御する。
Further, when the gas concentration is maintained in a normal state, the following procedure can be executed, for example, as a control example when the cell density in the
(F) The oxygen
(G) The gas
(ク)二酸化炭素濃度取得部50aにより、二酸化炭素濃度が例えば7%になった(高くなった)との情報が取得される。
(ケ)ガス濃度制御部40aが、この情報を二酸化炭素濃度取得部50aから入力して、二酸化炭素ボンベCから容器収容装置10aへの二酸化炭素ガスの供給を、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば3%の狙い値(5%-2%)になるように制御する。
(H) The carbon dioxide
(K) The gas
また、低酸素濃度で維持する場合、酸素濃度取得部30aにより酸素濃度が低くなったとの情報が取得されると、ガス濃度制御部40aが酸素濃度取得部30aから当該酸素濃度の情報を入力して、窒素ボンベNから容器収容装置10aへの窒素ガスの供給量を減らすことにより、容器収容装置10a内の酸素濃度が大きくなるように制御することが可能である。
Further, in the case of maintaining a low oxygen concentration, when the information that the oxygen concentration has become low is acquired by the oxygen
具体的には、培養容器20a内の細胞密度が10万個/cm2程度の低密度の場合の制御例として、例えば以下の手順を実行することができる。
(サ)酸素濃度取得部30aにより、酸素濃度が例えば4%になった(低くなった)との情報が取得される。
(シ)ガス濃度制御部40aが、この情報を酸素濃度取得部30aから入力して、窒素ボンベNから容器収容装置10aへの窒素ガスの供給を減らして、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば6%の狙い値(5%+1%)になるように制御する。
Specifically, as a control example when the cell density in the
(S) The oxygen
(S) The gas
(ス)二酸化炭素濃度取得部50aにより、二酸化炭素濃度が例えば5.5%になった(高くなった)との情報が取得される。
(セ)ガス濃度制御部40aが、この情報を二酸化炭素濃度取得部50aから入力して、二酸化炭素ボンベCから容器収容装置10aへの二酸化炭素ガスの供給を、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば4.5%の狙い値(5%-0.5%)になるように制御する。
(S) The carbon dioxide
(C) The gas
また、培養容器20a内の細胞密度が200万個/cm2程度の高密度の場合の制御例として、例えば以下の手順を実行することができる。
(タ)酸素濃度取得部30aにより、酸素濃度が例えば0%になった(低くなった)との情報が取得される。
(チ)ガス濃度制御部40aが、この情報を酸素濃度取得部30aから入力して、窒素ボンベNから容器収容装置10aへの窒素ガスの供給を減らして、容器収容装置10a内の酸素濃度が例えば8%の狙い値(5%+3%)になるように制御する。
Further, as a control example when the cell density in the
(T) The oxygen
(H) The gas
(ツ)二酸化炭素濃度取得部50aにより、二酸化炭素濃度が例えば7%になった(高くなった)との情報が取得される。
(テ)ガス濃度制御部40aが、この情報を二酸化炭素濃度取得部50aから入力して、二酸化炭素ボンベCから容器収容装置10aへの二酸化炭素ガスの供給を、容器収容装置10a内の二酸化炭素濃度が例えば3%の狙い値(5%-2%)になるように制御する。
(T) The carbon dioxide
(T) The gas
本実施形態の細胞の製造方法は、上述した本実施形態の細胞培養システム1aを用いて、細胞を製造することを特徴とする。
The method for producing cells of the present embodiment is characterized in that cells are produced using the
本実施形態のガス濃度制御方法は、第一実施形態の方法に加えて、以下の方法とすることを特徴とする。
すなわち、本実施形態のガス濃度制御方法は、二酸化炭素濃度取得部50aが、培養容器20a内の二酸化炭素濃度を取得し、二酸化炭素濃度取得部50aに接続されたガス濃度制御部40aが、取得された二酸化炭素濃度にもとづいて、容器収容装置10aに二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給装置Cから容器収容装置10aへの二酸化炭素供給を、容器収容装置10aにおける培養容器20aの周囲の二酸化炭素濃度が狙い値になるように制御することを特徴とする。
The gas concentration control method of the present embodiment is characterized by the following method in addition to the method of the first embodiment.
That is, in the gas concentration control method of the present embodiment, the carbon dioxide
このような本実施形態によれば、培養する細胞や細胞密度に応じて、容器収容装置への酸素ガスと窒素ガスと二酸化炭素ガスの供給を制御することで、容器収容装置内のガス濃度を制御することができる。このため、培養容器のガス透過性フィルムを介して容器内の酸素濃度と二酸化炭素濃度をきめ細かく適切に制御することが可能となっている。 According to the present embodiment as described above, the gas concentration in the container storage device is increased by controlling the supply of oxygen gas, nitrogen gas and carbon dioxide gas to the container storage device according to the cells to be cultured and the cell density. Can be controlled. Therefore, it is possible to finely and appropriately control the oxygen concentration and the carbon dioxide concentration in the container through the gas permeable film of the culture container.
[第三実施形態]
本実施形態の細胞培養システムは、容器収容装置内に、培養容器を閉鎖的に収納するための内部収容装置を備え、内部収容装置内のガス濃度を制御して細胞培養を行う構成としている点で第二実施形態と相違する。その他の点については、以下に説明する点を除いて、第二実施形態と同様である。
[Third Embodiment]
The cell culture system of the present embodiment is provided with an internal storage device for closedly storing the culture container in the container storage device, and is configured to control the gas concentration in the internal storage device to perform cell culture. It differs from the second embodiment. Other points are the same as those of the second embodiment except for the points described below.
具体的には、図3に示すように、本実施形態の細胞培養システム1bは、容器収容装置10b、酸素濃度取得部30b、ガス濃度制御部40b、二酸化炭素濃度取得部50b、酸素ボンベO、窒素ボンベN、及び二酸化炭素ボンベCを備えている。
また、容器収容装置10b内には内部収容装置12bが備えられ、培養容器20bは、この内部収容装置12b内に閉鎖的に収容されて、細胞培養に用いられる。
Specifically, as shown in FIG. 3, the
Further, an
内部収容装置12bとしては、例えば小型のガス制御用チャンバなどを用いることができる。
内部収容装置12bには、酸素ボンベO(酸素供給装置)と窒素ボンベN(窒素供給装置)と二酸化炭素ボンベC(二酸化炭素供給装置)からそれぞれ酸素ガス、窒素ガス、二酸化炭素ガスが供給されることにより、その内部のガス濃度が制御されて、培養容器20bの周囲のガス濃度を調整することが可能になっている。
As the internal
Oxygen gas, nitrogen gas, and carbon dioxide gas are supplied to the internal
内部収容装置12bには、酸素ガスを供給する酸素ボンベOと窒素ガスを供給する窒素ボンベNと二酸化炭素ガスを供給する二酸化炭素ボンベCがそれぞれバルブを介して接続されており、ガス濃度制御部40bの制御によって各バルブの開閉動作が制御され、各ガスボンベからの内部収容装置12bへのガスの供給が制御されて、内部収容装置12b内の酸素濃度と二酸化炭素濃度を調整することが可能になっている。
An oxygen cylinder O for supplying oxygen gas, a nitrogen cylinder N for supplying nitrogen gas, and a carbon dioxide cylinder C for supplying carbon dioxide gas are connected to the internal
このような本実施形態の細胞培養システム及びガス濃度制御方法によれば、容器収容装置10bよりも容量の小さい内部収容装置12bを用いてその内部のガス濃度の制御を行うようにすることで、第二実施形態の細胞培養システムよりもガス消費量を低減することが可能である。
According to the cell culture system and the gas concentration control method of the present embodiment as described above, the gas concentration inside the container is controlled by using the
[第四実施形態]
本実施形態の細胞培養システムは、容器収容装置内に、培養容器を閉鎖的に収納するための内部収容装置を複数個備え、それぞれの内部収容装置内のガス濃度を制御して細胞培養を行う構成としている点で第二実施形態と相違する。その他の点については、以下に説明する点を除いて、第二実施形態と同様である。
[Fourth Embodiment]
The cell culture system of the present embodiment is provided with a plurality of internal storage devices for closedly storing the culture container in the container storage device, and cell culture is performed by controlling the gas concentration in each internal storage device. It differs from the second embodiment in that it has a configuration. Other points are the same as those of the second embodiment except for the points described below.
具体的には、図4に示すように、本実施形態の細胞培養システム1cは、容器収容装置10c、酸素濃度取得部30c、ガス濃度制御部40c、二酸化炭素濃度取得部50c、酸素ボンベO、窒素ボンベN、及び二酸化炭素ボンベCを備えている。
また、容器収容装置10c内には内部収容装置12c-1,12c-2,12c-3が備えられている。そして、各内部収容装置内にそれぞれ培養容器20c-1,20c-2,20c-3が閉鎖的に収容されて、細胞培養に用いられる。なお、容器収容装置10c内における内部収容装置の個数は限定されず、2個でも4個以上であってもよい。
Specifically, as shown in FIG. 4, the
Further, the container
内部収容装置12c-1~12c-3としては、それぞれ例えば小型のガス制御用チャンバなどを用いることができる。
内部収容装置12c-1~12c-3には、酸素ボンベO(酸素供給装置)と窒素ボンベN(窒素供給装置)と二酸化炭素ボンベC(二酸化炭素供給装置)からそれぞれ酸素ガス、窒素ガス、二酸化炭素ガスが供給されることにより、その内部のガス濃度が制御されて、各培養容器20c-1~20c-3の周囲のガス濃度を個別に調整することが可能になっている。
As the internal
The internal
内部収容装置12c-1~12c-3には、酸素ガスを供給する酸素ボンベOと窒素ガスを供給する窒素ボンベNと二酸化炭素ガスを供給する二酸化炭素ボンベCがそれぞれバルブを介して接続されており、ガス濃度制御部40cの制御によって各バルブの開閉動作が制御され、各ガスボンベからの内部収容装置12c-1~12c-3へのガスの供給が制御されて、内部収容装置12c-1~12c-3内の酸素濃度と二酸化炭素濃度をそれぞれ調整することが可能になっている。
Oxygen cylinder O for supplying oxygen gas, nitrogen cylinder N for supplying nitrogen gas, and carbon dioxide cylinder C for supplying carbon dioxide gas are connected to the internal
このような本実施形態の細胞培養システム及びガス濃度制御方法によれば、容器収容装置10c内に内部収容装置12cを複数個備えて、それぞれの内部収容装置12cに培養容器20cを収容して細胞培養を行うことで、個々の培養容器20cに対して個別にガス制御を行うことが可能である。
According to the cell culture system and the gas concentration control method of the present embodiment as described above, a plurality of
以下、本発明の実施形態に係る細胞培養システム、細胞の製造方法、及びガス濃度制御方法の効果を確認するために行った試験について説明する。 Hereinafter, the tests conducted to confirm the effects of the cell culture system, the cell production method, and the gas concentration control method according to the embodiment of the present invention will be described.
[試験1]
まず、本実施形態の細胞培養システム及びガス濃度制御方法により高密度培養を行った場合に、培養容器内の酸素濃度を好適に制御できるかを確認するための試験を行った。
具体的には、培養容器として、厚み110μmの直鎖状低密度ポリエチレンからなり、外形のサイズが120mm×65mm、培養空間の底面積が48cm2である培養バッグ(東洋製罐グループホールディングス株式会社製)を準備した。この培養バッグに培養液としてAlyS505N-0(株式会社細胞科学研究所製)にFBS2%を添加したものを48ml充填し、試験細胞としてJurkat(ヒト白血病T細胞由来の細胞株)を200万個/cm2の高密度で播種した。
[Test 1]
First, a test was conducted to confirm whether the oxygen concentration in the culture vessel could be appropriately controlled when high-density culture was performed by the cell culture system and the gas concentration control method of the present embodiment.
Specifically, as a culture container, a culture bag made of linear low-density polyethylene having a thickness of 110 μm, an outer size of 120 mm × 65 mm, and a bottom area of the culture space of 48 cm 2 (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.). ) Was prepared. This culture bag is filled with 48 ml of AlyS505N-0 (manufactured by Cell Science Laboratory Co., Ltd.) containing 2% FBS as a culture solution, and 2 million Jurkat (cell line derived from human leukemia T cells) as test cells / The seeds were sown at a high density of cm 2 .
また、この培養バッグ内に非接触式酸素センサ(PreSens社,Oxy-4)を配設し、非接触式酸素センサを酸素濃度取得部に接続した。また、酸素濃度取得部とガス濃度制御部を接続して、ガス濃度制御部により酸素ボンベOからCO2インキュベータ(PHC株式会社,型式MCO-5M-PJ)への酸素供給を制御可能とした。 Further, a non-contact oxygen sensor (PreSens, Oxy-4) was arranged in this culture bag, and the non-contact oxygen sensor was connected to the oxygen concentration acquisition unit. Further, the oxygen concentration acquisition unit and the gas concentration control unit are connected, and the oxygen supply from the oxygen cylinder O to the CO 2 incubator (PHC Corporation, model MCO-5M-PJ) can be controlled by the gas concentration control unit.
そして、この培養バッグを、CO2インキュベータの載置台に配置して閉鎖的に収容し、インキュベータ内の酸素濃度を大気中の酸素濃度である21%のままの状態で、37℃で細胞培養を開始すると共に、非接触式酸素センサから酸素濃度取得部に入力された酸素濃度の計測を開始した。 Then, this culture bag is placed on a mounting table of a CO 2 incubator and housed in a closed manner, and cell culture is performed at 37 ° C. with the oxygen concentration in the incubator remaining at 21%, which is the oxygen concentration in the atmosphere. At the same time, the measurement of the oxygen concentration input to the oxygen concentration acquisition unit from the non-contact oxygen sensor was started.
酸素濃度が10%程度の状態が維持された測定開始後約190分の時点において、ガス濃度制御部によりインキュベータ内の酸素濃度を33%の狙い値に上昇させるように制御(酸素濃度の設定値を21%から33%に変更)して、酸素ボンベから容器収容装置へ酸素ガスの供給を行った。培養バッグ内の酸素濃度の変化を図3に示す。 Approximately 190 minutes after the start of measurement when the oxygen concentration was maintained at about 10%, the gas concentration control unit controlled the oxygen concentration in the incubator to increase to the target value of 33% (oxygen concentration set value). Was changed from 21% to 33%), and oxygen gas was supplied from the oxygen cylinder to the container accommodating device. The change in oxygen concentration in the culture bag is shown in FIG.
同図に示されるように、細胞を高密度で培養した結果、培養容器内の酸素濃度は10%程度に低下し、効率的な培養を行うことができない濃度となった。その後、上記のようにインキュベータ内に酸素ガスを供給することによって、細胞の酸素消費と培養容器へのガス透過の平衡が保たれた状態にすることができ、培養容器内の酸素濃度を21%に適切に維持することができた。 As shown in the figure, as a result of culturing the cells at a high density, the oxygen concentration in the culture vessel decreased to about 10%, which was a concentration at which efficient culture could not be performed. After that, by supplying oxygen gas into the incubator as described above, the equilibrium between the oxygen consumption of the cells and the gas permeation into the culture vessel can be maintained, and the oxygen concentration in the culture vessel is 21%. I was able to maintain it properly.
[試験2]
次に、本実施形態の細胞培養システム及びガス濃度制御方法により高密度培養を行った場合に、細胞の培養効率が向上するかを確認するための試験を行った。
具体的には、培養容器として、厚み110μmの直鎖状低密度ポリエチレンからなり、外形のサイズが120mm×65mm、培養空間の底面積が48cm2である培養バッグ(東洋製罐グループホールディングス株式会社製)を2つ準備した。
それぞれの培養バッグに培養液としてAlyS505N-0(株式会社細胞科学研究所製)にFBS2%を添加したものを48ml充填し、試験細胞としてJurkat(ヒト白血病T細胞由来の細胞株)を300万個/cm2の高密度で播種した。
[Test 2]
Next, a test was conducted to confirm whether the cell culture efficiency was improved when high-density culture was performed by the cell culture system and the gas concentration control method of the present embodiment.
Specifically, as a culture container, a culture bag made of linear low-density polyethylene having a thickness of 110 μm, an outer size of 120 mm × 65 mm, and a bottom area of the culture space of 48 cm 2 (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.). ) Was prepared.
Each culture bag was filled with 48 ml of AlyS505N-0 (manufactured by Cell Science Laboratory Co., Ltd.) containing 2% FBS as a culture solution, and 3 million Jurkat (cell line derived from human leukemia T cells) as test cells. The seeds were sown at a high density of / cm 2 .
そして、一方の培養バッグを、CO2インキュベータの載置台に配置して閉鎖的に収容し、試験1と同様に、ガス濃度制御部により酸素ボンベOからCO2インキュベータへの酸素供給を制御可能とし、37℃で細胞培養を行った。
このとき、ガス濃度制御部によりインキュベータ内の酸素濃度を35%の狙い値に上昇させるように制御(酸素濃度の設定値を21%から35%に変更)して、酸素ボンベOから容器収容装置へ酸素ガスの供給を行った。(実施例1)。
Then, one of the culture bags is placed on the mounting table of the CO 2 incubator and housed in a closed manner, and the oxygen supply from the oxygen cylinder O to the CO 2 incubator can be controlled by the gas concentration control unit as in
At this time, the gas concentration control unit controls the oxygen concentration in the incubator to increase to the target value of 35% (changes the oxygen concentration setting value from 21% to 35%), and the oxygen cylinder O is used as a container accommodating device. Oxygen gas was supplied to. (Example 1).
また、他方の培養バッグ内を、CO2インキュベータの載置台に配置して閉鎖的に収容し、インキュベータ内の酸素濃度を大気中の酸素濃度である21%のままの状態で、37℃で細胞培養を行った(比較例1)。
そして、これらの培養バッグを用いて、2回/日で培養液を全量交換し、3日間培養を行った。培養バッグ内の細胞密度の変化を図4に示す。
In addition, the cells in the other culture bag were placed on a mounting table of a CO 2 incubator and housed in a closed manner, and the cells in the incubator remained at 21%, which is the oxygen concentration in the atmosphere, at 37 ° C. Culturing was performed (Comparative Example 1).
Then, using these culture bags, the entire amount of the culture solution was exchanged twice a day, and the cells were cultured for 3 days. The change in cell density in the culture bag is shown in FIG.
同図に示されるように、培養3日後において、実施例1の培養容器内の酸素密度が820万個/cm2程度あるのに対し、比較例1の培養容器内の酸素密度が645万個/cm2程度であり、実施例1は比較例1に対して、細胞の増殖効率が30%近く向上したことが分かった。 As shown in the figure, after 3 days of culturing, the oxygen density in the culture vessel of Example 1 was about 8.2 million / cm2 , whereas the oxygen density in the culture vessel of Comparative Example 1 was 6.45 million. It was about / cm2 , and it was found that the cell proliferation efficiency of Example 1 was improved by nearly 30% as compared with Comparative Example 1.
本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、ガス濃度の具体的な制御内容は、例示したものに限定されず、培養の目的に応じて適宜変更することが可能である。 It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention. For example, the specific control content of the gas concentration is not limited to the illustrated one, and can be appropriately changed according to the purpose of the culture.
本発明は、細胞培養バッグを用いて細胞を高密度で大量培養する場合などに好適に利用することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used when cells are mass-cultured at high density using a cell culture bag.
1,1a,1b,1c 細胞培養システム
10,10a,10b,10c 容器収容装置
11,11a 載置台
12b,12c-1~12c-3 内部収容装置
20,20a,20b,20c-1~20c-3 培養容器
21,21a 培養部
22,22a ポート
30,30a,30b,30c 酸素濃度取得部
31,31a 酸素濃度センサ
40,40a,40b,40c ガス濃度制御部
50a,50b,50c 二酸化炭素濃度取得部
51a 二酸化炭素濃度センサ
O 酸素ボンベ(酸素供給装置)
N 窒素ボンベ(窒素供給装置)
C 二酸化炭素ボンベ(二酸化炭素供給装置)
1,1a, 1b, 1c
N Nitrogen cylinder (nitrogen supply device)
C carbon dioxide cylinder (carbon dioxide supply device)
Claims (12)
前記培養容器を閉鎖的に収納して、前記培養容器の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置と、
前記培養容器内の酸素濃度を取得する酸素濃度取得部と、
前記容器収容装置に酸素を供給可能に配設された酸素供給装置と、
前記酸素濃度取得部に接続され、取得された前記酸素濃度にもとづき前記酸素供給装置から前記容器収容装置への酸素供給を制御するガス濃度制御部と、を備えた
ことを特徴とする細胞培養システム。 A cell culture system that controls the gas concentration in a culture solution filled in a closed culture vessel with gas permeability.
A container accommodating device that closely stores the culture container and changes the gas concentration around the culture container.
An oxygen concentration acquisition unit that acquires the oxygen concentration in the culture vessel,
An oxygen supply device arranged so as to be able to supply oxygen to the container storage device,
A cell culture system including a gas concentration control unit connected to the oxygen concentration acquisition unit and controlling oxygen supply from the oxygen supply device to the container storage device based on the acquired oxygen concentration. ..
前記ガス濃度制御部が、取得された前記酸素濃度にもとづき前記窒素供給装置から前記容器収容装置への窒素供給を制御する
ことを特徴とする請求項1記載の細胞培養システム。 The container accommodating device is provided with a nitrogen supply device arranged so as to be able to supply nitrogen.
The cell culture system according to claim 1, wherein the gas concentration control unit controls the supply of nitrogen from the nitrogen supply device to the container storage device based on the acquired oxygen concentration.
前記容器収容装置に二酸化炭素を供給可能に配設された二酸化炭素供給装置を備え、
前記ガス濃度制御部が、前記二酸化炭素濃度取得部に接続され、取得された前記二酸化炭素濃度にもとづき前記二酸化炭素供給装置から前記容器収容装置への二酸化炭素供給を制御する
ことを特徴とする請求項1又は2記載の細胞培養システム。 A carbon dioxide concentration acquisition unit that acquires the carbon dioxide concentration in the culture vessel,
The container accommodating device is provided with a carbon dioxide supply device arranged so as to be able to supply carbon dioxide.
A claim characterized in that the gas concentration control unit is connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit and controls the supply of carbon dioxide from the carbon dioxide supply device to the container storage device based on the acquired carbon dioxide concentration. Item 2. The cell culture system according to Item 1 or 2.
前記培養容器に当該培養容器内の二酸化炭素濃度を測定する二酸化炭素濃度センサが配設され、前記二酸化炭素濃度センサが前記二酸化炭素濃度取得部に接続され、
前記二酸化炭素濃度取得部が、前記二酸化炭素濃度センサからの入力情報にもとづき前記培養容器内の二酸化炭素濃度を取得する
ことを特徴とする請求項3記載の細胞培養システム。 Provided with the culture vessel
A carbon dioxide concentration sensor for measuring the carbon dioxide concentration in the culture container is arranged in the culture container, and the carbon dioxide concentration sensor is connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit.
The cell culture system according to claim 3, wherein the carbon dioxide concentration acquisition unit acquires the carbon dioxide concentration in the culture vessel based on the input information from the carbon dioxide concentration sensor.
前記培養容器に当該培養容器内の酸素濃度を測定する酸素濃度センサが配設され、前記酸素濃度センサが前記酸素濃度取得部に接続され、
前記酸素濃度取得部が、前記酸素濃度センサからの入力情報にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を取得する
ことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の細胞培養システム。 Provided with the culture vessel
An oxygen concentration sensor for measuring the oxygen concentration in the culture container is provided in the culture container, and the oxygen concentration sensor is connected to the oxygen concentration acquisition unit.
The cell culture system according to any one of claims 1 to 4, wherein the oxygen concentration acquisition unit acquires the oxygen concentration in the culture vessel based on the input information from the oxygen concentration sensor.
前記酸素濃度取得部に前記培養容器内の細胞を撮影して得られた画像を前記酸素濃度取得部に入力するカメラが接続され、
前記酸素濃度取得部が、前記画像における細胞の占有面積にもとづき細胞数を算出して、得られた細胞数にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を算出する
ことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の細胞培養システム。 Provided with the culture vessel
A camera for inputting an image obtained by photographing cells in the culture vessel to the oxygen concentration acquisition unit is connected to the oxygen concentration acquisition unit.
Claims 1 to 4 are characterized in that the oxygen concentration acquisition unit calculates the number of cells based on the occupied area of cells in the image, and calculates the oxygen concentration in the culture vessel based on the obtained number of cells. The cell culture system according to any one of.
前記酸素濃度取得部が、前記培養容器による細胞の培養時間にもとづき前記培養容器内の細胞数を算出して、得られた細胞数にもとづき前記培養容器内の酸素濃度を算出する
ことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の細胞培養システム。 Provided with the culture vessel
The oxygen concentration acquisition unit calculates the number of cells in the culture vessel based on the cell culture time in the culture vessel, and calculates the oxygen concentration in the culture vessel based on the obtained number of cells. The cell culture system according to any one of claims 1 to 4.
ことを特徴とする請求項1~7のいずれかに記載の細胞培養システム。 From the oxygen supply device, the gas concentration control unit can maintain the difference between the oxygen concentration around the culture vessel in the container accommodating device and the oxygen concentration in the culture vessel at 5% or more. The cell culture system according to any one of claims 1 to 7, wherein the oxygen supply to the container accommodating device is controlled.
前記培養容器を当該培養容器の周囲のガス濃度を変化させる容器収容装置に閉鎖的に収納し、
酸素濃度取得部が、前記培養容器内の酸素濃度を取得し、
前記酸素濃度取得部に接続されたガス濃度制御部が、取得された前記酸素濃度にもとづいて、前記容器収容装置に酸素を供給する酸素供給装置から前記容器収容装置への酸素供給を、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の酸素濃度が前記培養容器内の酸素濃度より高い狙い値になるように制御する
ことを特徴とするガス濃度制御方法。 A gas concentration control method in cell culture that controls the gas concentration in a culture solution filled in a closed culture vessel having gas permeability.
The culture container is closedly stored in a container storage device that changes the gas concentration around the culture container.
The oxygen concentration acquisition unit acquires the oxygen concentration in the culture vessel and obtains the oxygen concentration.
The gas concentration control unit connected to the oxygen concentration acquisition unit supplies oxygen from the oxygen supply device that supplies oxygen to the container storage device to the container storage device based on the acquired oxygen concentration. A gas concentration control method characterized in that the oxygen concentration around the culture vessel in the accommodating device is controlled to be a target value higher than the oxygen concentration in the culture vessel.
ことを特徴とする請求項10記載のガス濃度制御方法。 Based on the acquired oxygen concentration, the gas concentration control unit supplies nitrogen from the nitrogen supply device that supplies nitrogen to the container storage device to the container storage device around the culture container in the container storage device. The gas concentration control method according to claim 10, further comprising controlling the oxygen concentration of the above to a target value higher than the oxygen concentration in the culture vessel.
前記二酸化炭素濃度取得部に接続された前記ガス濃度制御部が、取得された前記二酸化炭素濃度にもとづいて、前記容器収容装置に二酸化炭素を供給する二酸化炭素供給装置から前記容器収容装置への二酸化炭素供給を、前記容器収容装置における前記培養容器の周囲の二酸化炭素濃度が前記培養容器内の二酸化炭素濃度より低い狙い値になるように制御する
ことを特徴とする請求項10又は11記載のガス濃度制御方法。
The carbon dioxide concentration acquisition unit acquires the carbon dioxide concentration in the culture vessel and obtains the carbon dioxide concentration.
The gas concentration control unit connected to the carbon dioxide concentration acquisition unit supplies carbon dioxide to the container storage device based on the acquired carbon dioxide concentration, and the carbon dioxide from the carbon dioxide supply device to the container storage device. The gas according to claim 10 or 11, wherein the carbon supply is controlled so that the carbon dioxide concentration around the culture vessel in the container accommodating device is controlled to be a target value lower than the carbon dioxide concentration in the culture vessel. Concentration control method.
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