JP2020529832A - Targeted heterodimer Fc fusion protein containing IL-15 / IL-15Rα and antigen binding domain - Google Patents

Targeted heterodimer Fc fusion protein containing IL-15 / IL-15Rα and antigen binding domain Download PDF

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Abstract

本発明は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質および抗原結合ドメインＦｃ融合タンパク質を含む新規の標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に関する。いくつかの例では、抗原結合ドメインはＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する。【選択図】図１ＡThe present invention relates to novel targeted heterodimer Fc fusion proteins, including IL-15 / IL-15Rα Fc fusion proteins and antigen binding domain Fc fusion proteins. In some examples, the antigen binding domain binds to CD8, NKG2A, or NKG2D. [Selection diagram] FIG. 1A

Description

関連出願の相互参照
この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２７，８９８号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれ、特に図、凡例、および特許請求の範囲を参照する。 Cross-reference to related applications This application claims the priority of US Provisional Patent Application No. 62 / 527,898 filed on June 30, 2017 under Article 119 (e) of the US Patent Act. And, in its entirety, is expressly incorporated herein by reference, with particular reference to figures, legends, and claims.

ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の増殖および分化を補助する機能を持つ。両サイトカインは、２つの共通の受容体、共通γ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）、およびＩＬ−２受容体Ｂ鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）、ならびに各サイトカインに固有のα鎖である、ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）またはＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα、ＣＤ２１５）からなるトリマー複合体への結合によってその細胞シグナル伝達機能を発揮する。両サイトカインは腫瘍学において潜在的に価値のある治療薬と考えられており、ＩＬ−２は転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の患者に使用することが承認されている。現在、いくつかの臨床試験が進行中であるが、組み換えＩＬ−１５の承認された用途はない。 IL-2 and IL-15 have the function of assisting the proliferation and differentiation of B cells, T cells, and NK cells. Both cytokines are two common receptors, a common γ chain (γc, CD132), and an IL-2 receptor B chain (IL-2Rβ, CD122), and an α chain unique to each cytokine, IL-2. It exerts its cellular signaling function by binding to a trimmer complex consisting of receptor α (IL-2Rα, CD25) or IL-15 receptor α (IL-15Rα, CD215). Both cytokines are considered potential therapeutic agents in oncology and IL-2 has been approved for use in patients with metastatic renal cell carcinoma and malignant melanoma. Currently, several clinical trials are underway, but there are no approved uses for recombinant IL-15.

ＩＬ−２は、高親和性受容体複合体（すなわち、ＩＬ−２Ｒα／β／γ複合体）を提示するＴ細胞を優先的に増殖させる。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋）はＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を恒常的に発現するので、ＩＬ−２によるＴ細胞の増殖は、免疫応答を抑制するＴｒｅｇに有利にスキュー（ｓｋｅｗ）され、したがって腫瘍治療には好ましくない。この不均衡が高用量ＩＬ−２の概念をもたらした。しかし、この手法は、血管漏出症候群などＩＬ−２媒介毒性によるさらなる問題を生じさせる。 IL-2 preferentially proliferates T cells that present a high affinity receptor complex (ie, IL-2Rα / β / γ complex). Since regulatory T cells (Treg, CD4 + CD25 high Foxp3 +) constitutively express IL-2Rα (CD25), T cell proliferation by IL-2 is skewed in favor of Treg, which suppresses the immune response. Therefore, it is not preferable for tumor treatment. This imbalance led to the concept of high dose IL-2. However, this approach raises additional problems due to IL-2 mediated toxicity, such as vascular leakage syndrome.

対照的に、ＩＬ−１５は主に単球および樹状細胞上のＩＬ−１５Ｒαを含む膜結合ヘテロダイマー複合体として提示され、その効果はＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の中間親和性受容体複合体へのトランス提示によって実現され（すなわち、ＩＬ−２Ｒβ／γ複合体）、例えば、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に見られる。しかし、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体はＴｒｅｇに有利にスキューされることはないが、この複合体は依然としてＴｒｅｇの増殖に寄与し、上述のとおり腫瘍治療には好ましくない。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化を有利にスキューする治療方針に対して、腫瘍治療における満たされないニーズが残る。さらにまた、ＴＩＬにおける高いＣＤ８／ＣＤ４ Ｔ細胞比は、一般的に腫瘍治療の良好な予後マーカーと考えられている。ＣＤ４エフェクターＴ細胞の刺激および増殖は、ＣＤ８エフェクターと比較してサイトカイン放出量の増加に寄与するとも考えられており、この効果を小さくすると、ＩＬ−１５治療は副作用の少ないより安全なものになる可能性がある。本発明は、ＩＬ−１５をＣＤ８＋Ｔ細胞に優先的に誘導する、新規なＩＬ−１５標的化タンパク質（例えば、二機能性）を提供することにより、この必要性に対処する。 In contrast, IL-15 is presented primarily as a membrane-bound heterodimer complex containing IL-15Rα on monocytes and dendritic cells, the effect of which is the intermediate affinity receptor for the IL-15 / IL-15Rα complex. It is realized by trans presentation to the body complex (ie, IL-2Rβ / γ complex) and is found, for example, in NK cells and CD8 + T cells. However, although the IL-15 / IL-15Rα complex is not skewed favorably by Tregs, this complex still contributes to the growth of Tregs and is not preferred for tumor treatment as described above. Therefore, there remains an unmet need in tumor treatment for therapeutic strategies that favorably skew the proliferation and activation of CD8 + T cells. Furthermore, high CD8 / CD4 T cell ratios in TIL are generally considered to be good prognostic markers for tumor treatment. Stimulation and proliferation of CD4 effector T cells is also thought to contribute to increased cytokine release compared to CD8 effectors, and reducing this effect makes IL-15 treatment safer with fewer side effects. there is a possibility. The present invention addresses this need by providing novel IL-15 targeting proteins (eg, bifunctional) that preferentially induce IL-15 into CD8 + T cells.

本発明は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体、ならびにヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄなどの１つ以上の抗原に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「二機能性」および「標的化」という用語は、互換的に使用することができる。 The present invention is a bifunctional heterodimer Fc fusion comprising an IL-15 / IL-15Rα complex and one or more antigen-binding domains that bind to one or more antigens such as human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. Provides protein. As used herein, the terms "bifunctional" and "targeting" can be used interchangeably.

一態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、または
ＩＬ−１５タンパク質が、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）および軽定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。 In one aspect, what is provided herein is
a) An IL-15 / IL-15Rα fusion protein containing an IL-15Rα protein, an IL-15 protein, and a first Fc domain.
The IL-15Rα protein covalently binds to the N-terminus of the IL-15 protein using a first domain linker, and the IL-15 protein uses a second domain linker to covalently bind to the N-terminus of the first Fc domain. The IL-15 protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using the first domain linker and the IL-15Rα protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using the second domain linker. With the IL-15 / IL-15Rα fusion protein, which is covalently attached to the N-terminus of the first Fc domain,
b) Heavy chains containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomers (VH is the variable heavy chain and CH2-CH3 is the second Fc domain), as well as variable light chains (VL) and light constant domains (VL). Contains an antigen-binding domain monomer containing a light chain containing CL), and
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered L368D / K370S: S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360. : A group consisting of a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q, and an antigen-binding domain monomer consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. It is a bifunctional heterodimer protein that binds to an antigen selected from.

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、またはＸＥＮＰ２７１４６であってもよい。 In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In some embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P /. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. In various embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein has SEQ ID NO: 3 (complete). It has the amino acid sequence of long human IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various cases, IL-15 protein and IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. In some cases, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. The bifunctional heterodimer proteins are XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP2491, XENP264218, XENP2491, XENP26223, XENP26952, XENP26223,

いくつかの実施形態では、上述のヘテロダイマータンパク質は、ドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含むことができ、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４８であってもよい。 In some embodiments, the heterodimeric protein described above can further comprise an antigen binding domain covalently bound to the N-terminus of the IL-15 protein or IL-15Rα protein using a domain linker, and the antigen binding described above. The domain includes a second variable heavy chain domain and a second variable light chain domain, and does not include an Fc domain. The bifunctional heterodimer protein may be XENP24548.

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第１の核酸、上記の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸、および任意選択的に、ドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合している抗原結合ドメインをコードする第３の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、および任意選択的に、第３の核酸を含む第３の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。 In some embodiments, provided herein are a first nucleic acid encoding the IL-15 / IL-15Rα fusion protein described above, a second nucleic acid encoding the antigen binding domain monomer described above, And optionally, a nucleic acid composition comprising a third nucleic acid encoding an antigen binding domain that is covalently attached to the N-terminal of the IL-15 protein or IL-15Rα protein using a domain linker. In some embodiments, provided herein are a first expression vector containing a first nucleic acid, a second expression vector containing a second nucleic acid, and optionally a third. It is an expression vector composition containing a third expression vector containing nucleic acid. In some embodiments, the host cell comprises an expression vector composition. Also provided herein is a method of making any one of the bifunctional heterodimer proteins. The method comprises culturing the above-mentioned host cells under conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed, and recovering the above-mentioned heterodimeric protein.

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、融合タンパク質と、
ｂ）第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、
ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群より選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。 In yet another aspect, what is provided herein is
a) A fusion protein comprising a first protein domain and a first Fc domain, wherein the first protein domain is covalently linked to the N-terminus of the first Fc domain using a domain linker. , Fusion protein,
b) A second protein domain that is non-covalently bound to the first protein domain,
c) A heavy chain containing a VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is a variable heavy chain and CH2-CH3 is a second Fc domain), and a light chain containing a variable light chain and a light constant domain. Contains and contains antigen-binding domain monomers.
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered L368D / K370S: S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q.
The first protein domain contains the IL-15Rα protein and the second protein domain contains the IL-15 protein, or the first protein domain contains the IL-15 protein and the second protein domain contains the IL-15Rα. A bifunctional heterodimer protein that comprises a protein and the antigen binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D.

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はシステイン残基を含み、ＩＬ−１５タンパク質はシステイン残基を含み、それによりジスルフィド結合を形成する。 In some embodiments, the IL-15Rα protein comprises a cysteine residue and the IL-15 protein comprises a cysteine residue thereby forming a disulfide bond.

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２５１３７であってもよい。 In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In some embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P /. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. In various embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein has SEQ ID NO: 3 (complete). It has the amino acid sequence of long human IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various cases, IL-15 protein and IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. In some cases, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. The bifunctional heterodimer protein may be XENP25137.

いくつかの実施形態では、上述のヘテロダイマータンパク質は、１つ以上のドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含むことができ、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。 In some embodiments, the heterodimeric protein described above can further comprise an antigen binding domain covalently bound to the N-terminus of the IL-15 protein or IL-15Rα protein using one or more domain linkers. , The antigen-binding domain includes a second variable heavy chain domain and a second variable light chain domain, and does not contain an Fc domain.

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記の融合タンパク質をコードする第１の核酸、上記の第２のタンパク質ドメインをコードする第２の核酸、上記の抗原結合ドメインをコードする第３の核酸、ならびに任意選択的に、１つ以上のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質および／またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをコードする第４の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、第３の核酸を含む第３の発現ベクター、および任意選択的に、４番目の核酸を含む第４の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。 In some embodiments, provided herein are a first nucleic acid encoding the fusion protein, a second nucleic acid encoding the second protein domain, and an antigen-binding domain. A third nucleic acid encoding, and optionally a fourth that encodes an antigen-binding domain co-linked to the N-terminal of the IL-15 and / or IL-15Rα proteins using one or more domain linkers. It is a nucleic acid composition containing nucleic acid. In some embodiments, what is provided herein is a first expression vector containing a first nucleic acid, a second expression vector containing a second nucleic acid, and a third containing a third nucleic acid. An expression vector composition comprising an expression vector and optionally a fourth expression vector containing a fourth nucleic acid. In some embodiments, the host cell comprises an expression vector composition. Also provided herein is a method of making any one of the bifunctional heterodimer proteins. The method comprises culturing the above-mentioned host cells under conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed, and recovering the above-mentioned heterodimeric protein.

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第１の重鎖（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む、第１の抗原結合ドメインモノマーと、
ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第２の重鎖（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインであり）、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む、第２の抗原結合ドメインモノマーと、
ｃ）第２の抗原結合ドメインモノマーの第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、
第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であるか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質であり、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、
第１のＦｃドメインのおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。 In yet another aspect, what is provided herein is
a) A first heavy chain containing a first VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the first variable heavy chain, CH2-CH3 is the first Fc domain), and a first. A first antigen-binding domain monomer comprising a variable light chain and a first light chain comprising a first light constant domain,
b) A second heavy chain containing a second VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the second variable heavy chain and CH2-CH3 is the second Fc domain), the second It comprises a second light chain containing a variable light chain and a second light constant domain, and a first protein domain covalently attached to the C-terminus of the second Fc domain using a first domain linker. With the second antigen-binding domain monomer,
c) Includes a second protein domain that is bound or non-covalently bound to the first protein domain of the second antigen binding domain monomer.
The first protein domain is IL-15Rα protein and the second protein domain is IL-15Rα protein, or the first protein domain is IL-15 protein and the second protein domain is IL-15Rα. Is a protein
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered L368D / K370S: S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q.
A bifunctional heterodimer protein in which a first antigen-binding domain monomer and a second antigen-binding domain monomer bind to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D.

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４６であってもよい。 In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In some embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P /. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. In various embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein has SEQ ID NO: 3 (complete). It has the amino acid sequence of long human IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various cases, IL-15 protein and IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. In some cases, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. The bifunctional heterodimer protein may be XENP24546.

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記の第１の抗原結合ドメインモノマーをコードする第１の核酸、上記の第２の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸、および上記の第２のタンパク質ドメインをコードする第３の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、および第３の核酸を含む第３の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。 In some embodiments, what is provided herein is a first nucleic acid encoding the first antigen-binding domain monomer described above, a second nucleic acid encoding the second antigen-binding domain monomer described above. , And a nucleic acid composition comprising a third nucleic acid encoding the second protein domain described above. In some embodiments, what is provided herein is a first expression vector containing a first nucleic acid, a second expression vector containing a second nucleic acid, and a third containing a third nucleic acid. It is an expression vector composition containing the expression vector of. In some embodiments, the host cell comprises an expression vector composition. Also provided herein is a method of making any one of the bifunctional heterodimer proteins. The method comprises culturing the above-mentioned host cells under conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed, and recovering the above-mentioned heterodimeric protein.

一態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、
第１の抗原結合ドメインは、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、抗原結合ドメインは、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
第２の抗原結合ドメインは、第３のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第４のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、
第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。 In one aspect, what is provided herein is
a) An IL-15 fusion protein comprising an IL-15 protein, a first antigen binding domain, and a first Fc domain.
The first antigen-binding domain is covalently attached to the N-terminus of the IL-15 protein using the first domain linker, and the IL-15 protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15 protein using the second domain linker of the first Fc domain. Covalently attached to the N-terminus, the antigen-binding domain is composed of an IL-15 fusion protein containing a first variable heavy chain domain and a first variable light chain domain and not containing an Fc domain.
b) An IL-15Rα fusion protein comprising an IL-15Rα protein, a second antigen binding domain, and a second Fc domain.
The second antigen-binding domain is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a third domain linker, and the IL-15Rα protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a fourth domain linker of the second Fc domain. Covalently attached to the N-terminus, the second antigen binding domain comprises an IL-15Rα fusion protein, which comprises a second variable heavy chain domain and a second variable light chain domain and does not contain an Fc domain.
The first and second Fc domains are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T. / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q have a set of amino acid substitutions selected from the group.
The first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain are bifunctional heterodimer proteins that bind to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D.

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４７であってもよい。 In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In some embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P /. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. In various embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein has SEQ ID NO: 3 (complete). It has the amino acid sequence of long human IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various cases, IL-15 protein and IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. In some cases, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. The bifunctional heterodimer protein may be XENP24547.

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、上述のＩＬ−１５融合タンパク質をコードする第１の核酸、および上記のＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクターおよび第２の核酸を含む第２の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。 In some embodiments, the nucleic acids provided herein include a first nucleic acid encoding the IL-15 fusion protein described above and a second nucleic acid encoding the IL-15Rα fusion protein described above. It is a composition. In some embodiments, what is provided herein is an expression vector composition comprising a first expression vector comprising a first nucleic acid and a second expression vector comprising a second nucleic acid. In some embodiments, the host cell comprises an expression vector composition. Also provided herein is a method of making any one of the bifunctional heterodimer proteins. The method comprises culturing the above-mentioned host cells under conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed, and recovering the above-mentioned heterodimeric protein.

別の態様では、本発明は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質を提供する。 In another aspect, the present invention is, XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP24919, XENP25137, XENP26223, XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585 , XENP27145, and XENP27146 provide a bifunctional heterodimer protein selected from the group.

一態様では、本発明は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５，およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸組成物を提供する。 In one aspect, the present invention is, XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP24919, XENP25137, XENP26223, XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585, Provided is a nucleic acid composition comprising one or more nucleic acids encoding a bifunctional heterodimer protein selected from the group consisting of XENP27145 and XENP27146.

さらに別の態様では、本発明は、１つ以上の発現ベクターがＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードするように、それぞれが核酸を含む１つ以上の発現ベクターを含む発現ベクター組成物を提供する。 In yet another aspect, the present invention has one or more expression vectors XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP2547, XENP24548, XENP2 , XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585, XENP27145, and XENP27146 to encode a bifunctional heterodimer protein selected from the group, each comprising one or more expression vectors containing nucleic acids. provide.

本明細書に記載の核酸組成物のいずれか１つを含む宿主細胞または本明細書に記載の発現ベクター組成物のいずれか１つを含む宿主細胞も提供される。 Host cells containing any one of the nucleic acid compositions described herein or host cells containing any one of the expression vector compositions described herein are also provided.

一態様では、本発明は、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のいずれかを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および（ｂ）上記タンパク質を回収することを含む。 In one aspect, the invention provides a method of producing any of the bifunctional heterodimer proteins described herein. The method comprises (a) culturing the host cells described herein under suitable conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed, and (b) recovering the protein.

一態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを患者に投与することを含む、それを必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。 In one aspect, the invention treats a patient's cancer in need thereof, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of any one of the bifunctional heterodimer proteins described herein. Provide a way to do it.

さらなるＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、例えば、２０１８年６月１２日に出願された米国特許第６２／６８４，１４３号、２０１８年４月１８日に出願された米国特許第６２／６５９，５６３号、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許第６２／４０８，６５５号、２０１６年１１月１日に出願された米国特許第６２／４１６，０８７号、２０１７年１月６日に出願された米国特許第６２／４４３，４６５号、２０１７年３月２８日に出願された米国特許第６２／４７７，９２６号、２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願第１５／７８５，４０１号、および２０１７年１０月１６日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５６８２９号に詳細に記載され、特にその図、凡例、および特許請求の範囲を参照して、その全体が参照により明示的に組み込まれる。 Additional IL-15 / IL-15Rα heterodimer Fc fusion proteins are described, for example, in US Pat. Nos. 62 / 648, 143, filed June 12, 2018, and US Pat. No. 6, 6, 2018, filed April 18, 2018. 62 / 659,563, US Patent No. 62 / 408,655 filed on October 14, 2016, US Patent No. 62 / 416,087 filed on November 1, 2016, 2017 1 US Patent No. 62 / 443,465 filed on March 6, 2017, US Patent No. 62 / 477,926 filed on March 28, 2017, US Patent Application filed on October 16, 2017. It is described in detail in PCT International Patent Application No. 15 / 785,401 and PCT International Patent Application No. PCT / US2017 / 056829 filed on October 16, 2017, with particular reference to its figures, legends and scope of patent claims. And the whole is explicitly incorporated by reference.

本発明の他の態様が本明細書で提供される。 Other aspects of the invention are provided herein.

（スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロダイマー化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。Shown are useful pairs of sets of Fc heterodimerized variants (including skew variants and PI variants). Some variants do not have a corresponding "monomer 2" variant, and these are pI variants that can be used alone with any of the monomers. 等配電子バリアント抗体の定常領域およびそれぞれ置換のリストを示す。ｐＩ＿（−）は低ｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩバリアントを示す。これらは、任意選択的に独立して、本発明の他のヘテロダイマー化バリアント（および本明細書に概説される他のバリアント型）と組み合わせることができる。A list of constant regions of equidistant electron variant antibodies and their respective substitutions is shown. pI_ (−) indicates a low pI variant and pI_ (+) indicates a high pI variant. These can optionally be independently combined with other heterodimerized variants of the invention (and other variant types outlined herein). ＦｃγＲ結合を除去した有用な切除バリアントを示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」バリアントと呼ばれる）。一般に、切除バリアントは両方のモノマーに見られるが、場合によっては、それらは一方のモノマーのみにあってもよい。Shows a useful excision variant from which the FcγR binding has been removed (often referred to as a "knockout" or "KO" variant). In general, excision variants are found in both monomers, but in some cases they may be in only one monomer. 本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」構成要素の有用な実施形態を示す。Demonstrates useful embodiments of the "non-cytokine" components of the IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention. 本発明のＣＤ８標的化、ＮＫＧ２Ａ標的化、およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」／「非Ｆｖ」構成要素の特に有用な実施形態を示す。Shown are particularly useful embodiments of the "non-cytokine" / "non-Fv" components of the CD8-targeted, NKG2A-targeted, and NKG2D-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention. ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのいくつかの例示的な可変長リンカーの数を示す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結するのに使用される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合するのに使用される。The number of some exemplary variable length linkers for use in the IL-15 / Rα-Fc fusion protein is shown. In some embodiments, these linkers are used to link the C-terminus of IL-15 and / or IL-15Rα (sushi) to the N-terminus of the Fc region. In some embodiments, these linkers are used to fuse IL-15 to IL-15Rα (sushi). 構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロダイマー抗体のｐＩを増加または減少するのに使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と称される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。As a component, we show several charged scFv linkers that are used to increase or decrease the pI of heterodimer antibodies that utilize one or more scFv. (+ H) Positive linkers are used specifically herein. A single prior art scFv linker with a single charge is available from Whitew et al. , Protein Engineering 6 (8): 989-995 (1993), referred to as "White". It should be noted that this linker was used to reduce aggregation at scFv and increase proteolytic stability. サイトカイン配列（例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット骨格の配列を示す。これらの骨格はまた、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の特定の実施形態において使用され得ることに留意することが重要である。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＤ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１ＥのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有し、さらに両方の鎖にＮ２９７Ａバリアントを有する。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格６および７の代替フォーマットは、両方の鎖において切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、鎖にＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番によるもので、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを有し、これは当技術分野で既知のとおり、Ｆａｂアーム交換を切除する。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアントを有する。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、およびＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、そして両方の同一の鎖にＣ２２０Ｓ、両方の同一の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを含む。骨格１３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。 当業者には理解され以下に概説されるように、これらの配列は、図１６Ａ〜１６Ｇおよび３０Ａ〜３０Ｄに概略的に示すＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｓｃＩＬ−１５／Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対とともに使用することができる。さらに、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントを、任意の組み合わせで、これら図８Ａ〜８Ｄの骨格に組み込むことができる。 これらの骨格のそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比べて）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび切除バリアントに加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。The sequences of some useful IL-15 / Rα-Fc format skeletons based on human IgG1 without the cytokine sequences (eg, IL-15 and / or IL-15Rα (sushi)) are shown. It is important to note that these scaffolds can also be used in certain embodiments of the CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion protein. Skeleton 1 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains C220S on both strands, a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S on both strands, and a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on both strands. It has a skew variant of L368D / K370S and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 2 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype), with C220S on both strands, a skew variant of S364K: L368D / K370S on both strands, a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D, and L368D / on both strands. It has a skew variant of K370S and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 3 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype), with C220S on both strands, a skew variant of S364K: L368E / K370S on both strands, a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D, and L368E / on both strands. It has a skew variant of K370S and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 4 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains C220S on both strands, a skew variant of D401K: K360E / Q362E / T411E on both strands, and a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on both strands. It has a skew variant of K360E / Q362E / T411E and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 5 is based on human IgG1 (356D / 358L allotype) and contains C220S on both strands, a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S on both strands, and a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on both strands. It has a skew variant of L368D / K370S and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 6 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains C220S on both strands, a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S on both strands, and a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on both strands. It has a skew variant of L368D / K370S, a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, and an N297A variant on both strands. Skeleton 7 is identical to 6 except that the mutation is N297S. Alternative formats of skeletons 6 and 7 can exclude excision variants E233P / L234V / L235A / G236del / S267K in both strands. Skeleton 8 is based on human IgG4 and contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on the strands, a skew variant of L368D / K370S and S228P (EU numbering) on both strands. It has a variant (which is S241P in Kabat), which excises the Fab arm replacement as is known in the art. Skeleton 9 is based on human IgG2 and contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D, and a skew variant of L368D / K370S. Skeleton 10 is based on human IgG2 and contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D in the strands, and an L368D / K370S skew variant, and an S267K variant in both strands. Skeleton 11 is identical to Skeleton 1 except that it contains an Xtend mutation of M428L / N434S. Skeleton 12 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains excised variants of C220S on both identical strands and E233P / L234V / L235A / G236del / S267K on both identical strands. Skeleton 13 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype), with C220S on both strands, a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S on both strands, a pI variant of P217R / P229R / N276K, and S364K / on both strands. It has a skew variant of E357Q and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. As will be appreciated by those skilled in the art and outlined below, these sequences are IL-15 / Rα hetero-Fc, ncIL-15 / Rα, and scIL-15, which are schematically shown in FIGS. 16A-16G and 30A-30D. It can be used with any IL-15 and IL-15Rα (sushi) pairs outlined herein, including but not limited to / Rα. In addition, any IL-15 and / or IL-15Rα (sushi) variant can be incorporated into these backbones of FIGS. 8A-8D in any combination. Each of these skeletons contains sequences that are 90, 95, 98, and 99% identical (as defined herein) to the listed sequences and / or (the present). As will be appreciated by those skilled in the art, 1, 2, 3, 4 (compared to the "parent" in the figure, which already contains some amino acid modifications compared to the parent human IgG1 (or IgG2 or IgG4 depending on the skeleton)) Includes 5, 6, 7, 8, 9, or 10 additional amino acid substitutions. That is, the enumerated backbones may include additional amino acid modifications (generally amino acid substitutions) in addition to the skew variants, pI variants and excision variants contained within the backbone of this figure. サイトカイン配列（例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））またはＶＨを含まず、さらに図１０に示す軽鎖骨格を除く、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体フォーマット骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのバリアント、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを有し、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのバリアント、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。 特定の実施形態では、これらの配列は、３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプのものであり得る。他の実施形態では、これらの配列は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｓ置換のいずれかを含み得る。いくつかの他の実施形態において、これらの配列はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含み得る。さらに他の実施形態では、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ４に基づくことができ、当技術分野で既知のように両方の鎖にＦａｂアーム交換を切除するＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番、ＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。なおさらなる実施形態において、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ２に基づき得る。さらに、これらの配列は、代わりに、図１Ａ〜１Ｅ、２、および３に示す他のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを利用し得る。 当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図７０に概略的に示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｄｓＩＬ−１５Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対とともに使用することができる。さらに当業者には理解されそして以下に概説されるように、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントがこれらの骨格に組み込まれ得る。さらに、当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかを含む、本明細書に概説された任意のＶＨおよびＶＬ対とともに使用することができる。 これらの骨格のそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比べて）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび切除バリアントに加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。また、本明細書に示される骨格は、本発明のＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に使用するのに適していることに留意すべきである。Several useful CD8-targeted IL-15s based on human IgG1 that do not contain cytokine sequences (eg IL-15 and / or IL-15Rα (sushi)) or VH and also exclude the light chain skeleton shown in FIG. The sequence of the / Rα-Fc fusion format skeleton is shown. Skeleton 1 contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, C220S, and a pI variant of Q295E / N384D / Q418E / N421D on the strands based on human IgG1 (356E / 358M allotype), and both strands contain L368D / K370S. It has a skew variant and a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 2 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, a pI variant of N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D on the strand, and a skew variant of L368D / K370S on the strand. , C220S, both strands have a variant of S364K / E357Q, a resection variant of E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. Skeleton 3 is based on human IgG1 (356E / 358M allotype) and contains a skew variant of S364K / E357Q: L368D / K370S, a pI variant of N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D on the strand, and a skew variant of L368D / K370S on the strand. , Q196K / I199T / P217R / P228R / N276K with pI variants, both strands with S364K / E357Q variants and E233P / L234V / L235A / G236del / S267K excision variants. In certain embodiments, these sequences can be of the 356D / 358L allotype. In other embodiments, these sequences may comprise either N297A or N297S substitutions. In some other embodiments, these sequences may comprise an Xtend mutation of M428L / N434S. In yet other embodiments, these sequences can instead be based on human IgG4, S228P (EU numbering, S241P in Kabat) that excises Fab arm exchanges on both strands as is known in the art. ) Includes variants. In still further embodiments, these sequences can instead be based on human IgG2. In addition, these sequences may instead utilize the other skew variants, pI variants, and excision variants shown in FIGS. 1A-1E, 2, and 3. As will be appreciated by those skilled in the art and outlined below, these sequences include, but are not limited to, scIL-15 / Rα, ncIL-15 / Rα, and dsIL-15Rα, which are schematically shown in FIG. , Can be used with any IL-15 and IL-15Rα (sushi) pairs outlined herein. Further, any IL-15 and / or IL-15Rα (sushi) variant can be incorporated into these backbones, as understood by those of skill in the art and outlined below. In addition, as understood by those of skill in the art and outlined below, these sequences can be used with any VH and VL pair outlined herein, including either scFv or Fab. .. Each of these skeletons contains sequences that are 90, 95, 98, and 99% identical (as defined herein) to the listed sequences and / or (the present). As will be appreciated by those skilled in the art, 1, 2, 3, 4 (compared to the "parent" in the figure, which already contains some amino acid modifications compared to the parent human IgG1 (or IgG2 or IgG4 depending on the skeleton)) Includes 5, 6, 7, 8, 9, or 10 additional amino acid substitutions. That is, the enumerated backbones may include additional amino acid modifications (generally amino acid substitutions) in addition to the skew variants, pI variants and excision variants contained within the backbone of this figure. It should also be noted that the skeletons shown herein are suitable for use in the NKG2A and NKG2D targeted IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention. 本発明のＣＤ８標的化、ＮＫＧ２Ａ標的化、およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に使用される軽鎖の「非Ｆｖ」骨格（すなわち、定常軽鎖）を示す。The "non-Fv" skeleton (ie, constant light chain) of the light chain used in the CD8 targeting, NKG2A targeting, and NKG2D targeting IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention is shown. 本明細書に記載のいくつかの実施例で使用される対照である、モタビズマブ（Ｎｕｍａｘ（登録商標））の可変領域に基づく抗ＲＳＶ ｍＡｂであるＸＥＮＰ１５０７４の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The sequence of XENP15074, an anti-RSV mAb based on the variable region of motabizumab (Numax®), which is the control used in some of the examples described herein, is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））の可変領域に基づいた抗ＰＤ−１ｍＡｂであるＸＥＮＰ１６４３２の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The sequence of XENP16432, which is an anti-PD-1 mAb based on the variable region of nivolumab (Opdivo®), is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. 本明細書に記載の多くの実施例で対照として使用される「ＲＳＶ標的化」ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体である、ＸＥＮＰ２６００７の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of XENP26007, which is the "RSV-targeted" IL-15 / Rα-Fc fusion used as a control in many of the examples described herein, is shown. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. ＩＬ−１５の受容体であるＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）、ＩＬ−１５Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通γ鎖（ＣＤ１３２）を含む複合体におけるＩＬ−１５の構造を示す。The structure of IL-15 in a complex containing IL-15Rα (CD215), IL-15Rβ (CD122), and a common γ chain (CD132), which are receptors for IL-15, is shown. 図は、ＩＬ−１５およびその受容体の配列を示す。The figure shows the sequences of IL-15 and its receptors. 本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのフォーマットを示す。ＩＬ−１５ＲαヘテロダイマーＦｃ融合体または「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」（図１６Ａ）は、ヘテロダイマーＦｃの一方側に組み換えで融合されたＩＬ−１５、およびヘテロダイマーＦｃの他方側に組み換えで融合されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含む。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、Ｆｃ領域のＣ末端とＮ末端との間に可変長Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有し得る。一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｂ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合され、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｃ）はヘテロダイマーＦｃに融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。二価非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｄ）はホモダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。二価一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｅ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ−１５を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、次いでこれをホモダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合させる。Ｆｃ非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」（図１６Ｆ）はヘテロダイマーＦｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。Ｆｃ−一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」（図１６Ｇ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ−１５を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＣ末端に融合され、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。Several formats of the IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention are shown. The IL-15Rα heterodimer Fc fusion or "IL-15 / Rα-hetero Fc" (FIG. 16A) is recombinantly fused to one side of the heterodimer Fc and recombinant to the other side of the heterodimer Fc. Includes IL-15Rα (sushi) fused in. IL-15 and IL-15Rα (sushi) may have a variable length Gly-Ser linker between the C-terminus and the N-terminus of the Fc region. The single chain IL-15 / Rα-Fc fusion or "scIL-15 / Rα-Fc" (FIG. 16B) comprises IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 by a variable length linker (“single”. The chain "IL-15 / IL-15Rα (sushi) complex or called" scIL-15 / Rα "), which is then fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region and the other side of the molecule is" Fc only "or It is an "empty Fc". Non-covalent IL-15 / Rα-Fc or "ncIL-15 / Rα-Fc" (FIG. 16C) contains IL-15Rα (sushi) fused to heterodimer Fc, whereas IL-15 is non-covalent. Transfected separately to form the IL-15 / Rα complex, the other side of the molecule is "Fc only" or "empty Fc". Although the divalent non-covalent IL-15 / Rα-Fc fusion or "divalent nc IL-15 / Rα-Fc" (FIG. 16D) contains IL-15Rα (sushi) fused to the N-terminus of the homodimer Fc region. , IL-15 are separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. The divalent single-strand IL-15 / Rα-Fc fusion or "divalent scIL-15 / Rα-Fc" (FIG. 16E) comprises IL-15 fused to IL-15Rα (sushi) by a variable length linker. (Called the "single-strand" IL-15 / IL-15Rα (sushi) complex or "scIL-15 / Rα"), which is then fused to the N-terminus of the homodimer Fc region. The Fc non-covalent IL-15 / Rα fusion or "Fc-nc IL-15 / Rα" (FIG. 16F) contains IL-15Rα (sushi) fused to the C-terminus of the heterodimer Fc region, but IL-15. Are separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex, with the other side of the molecule being "Fc only" or "empty Fc". The Fc-single chain IL-15 / Rα fusion or "Fc-sc IL-15 / Rα" (FIG. 16G) comprises IL-15 fused to IL-15Rα (sushi) by a variable length linker (“single). The chain "IL-15 / IL-15Rα (sushi) complex or called" scIL-15 / Rα "), which is then fused to the C-terminus of the heterodimer Fc region and the other side of the molecule is" Fc only "or It is an "empty Fc". 「ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP20818 and XENP21475, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "IL-15 / Rα hetero-Fc" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４７８およびＸＥＮＰ２１９９３の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP21478 and XENP21993, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "scIL-15 / Rα-Fc" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６およびＸＥＮＰ２４３４８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP21479, XENP22366 and XENP24348, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "ncIL-15 / Rα-Fc" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１９７８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of XENP21978, which is an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "divalent nc IL-15 / Rα-Fc" format, is shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "divalent scIL-15 / Rα-Fc" format is shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３７およびＸＥＮＰ２２６３８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP22637 and XENP22638, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "Fc-nc IL-15 / Rα" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "Fc-sc IL-15 / Rα" format is shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく異なるリンカー長を有するフォーマットＡの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図２４Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図２４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図２４Ｃ）ＣＤ８＋細胞の増殖の誘導を示す。(Fig. 24A) NK (CD56 + / CD16 +) cells, (Fig. 24B) CD4 + T cells, and Format A exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins with different linker lengths based on Ki67 expression measured by FACS. (Fig. 24C) shows the induction of CD8 + cell proliferation. ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づくｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７８）およびｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７９）の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図２５Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図２５Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図２５Ｃ）ＣＤ８＋細胞の増殖の誘導を示す。Illustrative IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the scIL-15 / Rα-Fc format (XENP21478) and ncIL-15 / Rα-Fc format (XENP21479) based on Ki67 expression measured by FACS (FIG. 25A). Induction of proliferation of NK (CD56 + / CD16 +) cells, (FIG. 25B) CD4 + T cells, and (FIG. 25C) CD8 + cells is shown. 操作されたジスルフィド結合対の位置を示すＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーの構造モデルを示す。A structural model of the IL-15 / Rα heterodimer showing the position of the engineered disulfide bond pair is shown. システイン残基を操作するための足場として機能するＣ末端のさらなる残基によって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列を示す。The sequence of exemplary IL-15Rα (sushi) variants engineered by additional C-terminal residues acting as a scaffold for manipulating cysteine residues is shown. システインによって操作されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントと共有ジスルフィド結合を形成するために、システインによって操作された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を示す。The sequence of exemplary IL-15 variants engineered with cysteine to form a covalent disulfide bond with the IL-15Rα (sushi) variant engineered with cysteine is shown. システインによって操作されたＩＬ−１５バリアントと共有ジスルフィド結合を形成するために、システインによって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列を示す。The sequence of an exemplary IL-15Rα (sushi) variant engineered with cysteine to form a covalent disulfide bond with the IL-15 variant engineered with cysteine is shown. 操作されたジスルフィド結合を有する本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のさらなるフォーマットを示す。ジスルフィド結合したＩＬ−１５ヘテロダイマーＦｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」）（図３０Ａ）は「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。ジスルフィド結合したＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図３０Ｂ）は「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。二価ジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図３０Ｃ）は、「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５はさらに共有結合している。Ｆｃ−ジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」（図３０Ｄ）は「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５がさらに共有結合している。Further formats of the IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention with engineered disulfide bonds are shown. The disulfide-bonded IL-15 heterodimer Fc fusion or "dsIL-15 / Rα-hetero Fc" (FIG. 30A) is identical to "IL-15 / Rα-hetero Fc", but IL-15Rα (sushi). And IL-15 are further covalently bound as a result of engineered cysteine. The disulfide-bonded IL-15 / RαFc fusion or "dsIL-15 / Rα-Fc" (FIG. 30B) is identical to "ncIL-15 / Rα-Fc", but IL-15Rα (sushi) and IL-15. Is further covalently bound as a result of the manipulated cysteine. The divalent disulfide-bonded IL-15 / Rα-Fc or "divalent dsIL-15 / Rα-Fc" (FIG. 30C) is identical to "divalent ncIL-15 / Rα-Fc" but has been engineered. As a result of cysteine, IL-15Rα (sushi) and IL-15 are further covalently linked. The Fc-disulfide-bonded IL-15 / Rα fusion or "Fc-ds IL-15 / Rα" (FIG. 30D) is identical to "Fc-nc IL-15 / Rα" but IL as a result of engineered cysteine. -15Rα (sushi) and IL-15 are further covalently linked. 「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP22013, XENP22014, XENP22015, and XENP22017, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "dsIL-15 / Rα-hetero Fc" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of the exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "dsIL-15 / Rα-Fc" format, XENP22357, XENP22358, XENP22359, XENP22684, and XENP22361 are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、ＸＥＮＰ２２６３６、およびＸＥＮＰ２２６８７の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP22634, XENP22635, XENP22636, and XENP22687, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "divalent ds IL-15 / Rα-Fc" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP22639 and XENP22640, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "Fc-ds IL-15 / Rα" format, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. ＣＥＦによって決定される操作されたジスルフィド結合がある場合とない場合の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の純度および均質性を示す。Shows the purity and homogeneity of an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein with and without engineered disulfide bonds determined by CEF. ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく、操作されたジスルフィド結合を含む場合と含まない場合の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図３６Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図３６Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、および（図３６Ｃ）ＣＤ４＋細胞の増殖の誘導を示す。(Fig. 36A) NK (CD56 + / CD16 +) cells, with and without engineered disulfide bonds based on Ki67 expression measured by FACS, with exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins. 36B) CD8 + T cells, and (Fig. 36C) show induction of proliferation of CD4 + cells. ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、および共通のγ鎖と複合体を形成したＩＬ−１５の構造を示す。効力を低減するために設計された置換の位置が示されている。The structures of IL-15Rα, IL-2Rβ, and IL-15 complexed with a common γ chain are shown. Positions of substitutions designed to reduce efficacy are shown. 効力低下のために操作された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を示す。列挙された配列と（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８および９９％同一であり、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のさらなるアミノ酸置換を含む配列がこれらのバリアントＩＬ−１５配列のそれぞれに含まれる。非限定的な例において、列挙された配列は、実施例３Ｂに記載されるように共有ジスルフィド結合の形成に寄与するものなどのさらなるアミノ酸修飾を含み得る。The sequence of exemplary IL-15 variants engineered for reduced potency is shown. 90, 95, 98 and 99% identical (as defined herein) and / or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 with the listed sequences. A sequence containing an additional amino acid substitution is included in each of these variant IL-15 sequences. In a non-limiting example, the listed sequences may include additional amino acid modifications, such as those that contribute to the formation of covalent disulfide bonds as described in Example 3B. 効力低下のために操作された「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２８２１、ＸＥＮＰ２２８２２、ＸＥＮＰ２３３４３、ＸＥＮＰ２３５５４、ＸＥＮＰ２３５５７、ＸＥＮＰ２３５６１、ＸＥＮＰ２４０１８、ＸＥＮＰ２４０１９、ＸＥＮＰ２４０４５、ＸＥＮＰ２４０５１、ＸＥＮＰ２４０５２、およびＸＥＮＰ２４３０６の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。An exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "IL-15 / Rα-hetero Fc" format engineered for reduced efficacy, XENP22821, XENP22822, XENP23343, XENP23554, XENP23557, XENP23561, XENP24018, XENP24019. , XENP24045, XENP24051, XENP24052, and XENP24306. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 効力低下のために操作された「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４０１３、ＸＥＮＰ２４０１４、ＸＥＮＰ２４０１５、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２４２９４、ＸＥＮＰ２４４７５、ＸＥＮＰ２４４７６、ＸＥＮＰ２４４７８、ＸＥＮＰ２４４７９、およびＸＥＮＰ２４４８１の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。An exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "scIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced efficacy, XENP24013, XENP24014, XENP24015, XENP24050, XENP24294, XENP24475, XENP24476, XENP24478, The sequences of XENP24479 and XENP24481 are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 効力低下のために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４９、ＸＥＮＰ２４８９０、およびＸＥＮＰ２５１３８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP24349, XENP24890, and XENP25138, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "ncIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced potency, are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 効力低下のために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーである、ＸＥＮＰ２２８０１およびＸＥＮＰ２２８０２の配列を示す。これらの配列は、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端におけるポリヒスチジン（Ｈｉｓ×６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。The sequences of XENP22801 and XENP22802, which are exemplary ncIL-15 / Rα heterodimers engineered for reduced efficacy, are shown. It is important to note that these sequences were generated using the polyhistidine (His × 6 or HHHHHH) C-terminal tag at the C-terminus of IL-15Rα (sushi). 効力低下のために操作された「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４２の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of XENP24342, which is an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "divalent ncIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced potency, is shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. 効力低下のために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの、例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２３４７２およびＸＥＮＰ２３４７３の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequences of XENP23472 and XENP23473, which are exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins, in the "dsIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced efficacy are shown. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially shown in FIG. 83. The slash (/), which can be replaced by other linkers), indicates the boundary (s) between the IL-15, IL-15Rα, linker, and Fc regions. ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、Ａ）ＮＫ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞の増殖の誘導を示す。Induction of proliferation of A) NK cells, B) CD8 + (CD45RA-) T cells, and C) CD4 + (CD45RA-) T cells by variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein based on Ki67 expression measured by FACS. Is shown. バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導するＥＣ５０、およびＸＥＮＰ２０８１８に対するＥＣ５０の倍率低下を示す。The variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein induces proliferation of NK and CD8 + T cells, and shows a reduction in EC50 to XENP20818. 指定のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質とともに４日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図４７Ａ〜４７Ｃは、増殖しているＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）（図４７Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）（図４７Ｂ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合を示す（図４７Ｃ）。図４７Ｄは、対照（ＸＥＮＰ２０８１８）に対する様々なＩＬ１５／ＩＬ１５ＲαＦｃヘテロダイマーのＥＣ５０の倍率変化を示す。Shows cell proliferation in human PBMCs incubated with the designated variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein for 4 days. 47A-47C show the proportions of proliferating NK cells (CD3-CD16 +) (FIG. 47A), CD8 + T cells (CD3 + CD8 + CD45RA-) (FIG. 47B), and CD4 + T cells (CD3 + CD4 + CD45RA-) (FIG. 47C). FIG. 47D shows the EC50 magnification changes of various IL15 / IL15RαFc heterodimers relative to the control (XENP20818). ヒトＰＢＭＣとＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション前（図５５Ａ）および後（図５５Ｂ）のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す。Expression of CD69 and CD25 is shown before (FIG. 55A) and after (FIG. 55B) incubation of human PBMCs with XENP22821. 指定のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質とともに３日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図５４Ａ〜Ｃは、増殖中のＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図４９Ａ）、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図４９Ｂ）、γδＴ細胞（図４９Ｃ）、およびＮＫ細胞（図４９Ｄ）の割合を示す。Shows cell proliferation in human PBMCs incubated with the designated variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein for 3 days. 54A-C show the proportions of proliferating CD8 + (CD45RA-) T cells (FIG. 49A), CD4 + (CD45RA-) T cells (FIG. 49B), γδ T cells (FIG. 49C), and NK cells (FIG. 49D). Shown. 追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５０Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５０Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図５０Ｃ）ＮＫ細胞でのＫｉ６７発現の割合を示す。The percentage of Ki67 expression in (FIG. 50A) CD8 + T cells, (FIG. 50B) CD4 + T cells, and (FIG. 50C) NK cells after treatment with additional IL-15 / Rα variants is shown. ＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５１Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５１Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５１Ｃ）γδＴ細胞、（図５１Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）細胞、および（図５１Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。(Fig. 51A) CD8 + (CD45RA-) T cells, (Fig. 51B) CD4 + (CD45RA-) T cells, (Fig. 51C) γδ T cells, (Fig. 51D) NK (CD16 + CD8α-) after treatment with the IL-15 / Rα variant. ) Cells and (Fig. 51E) NK (CD56 + CD8α-) cells show the percentage of Ki67 expression. ＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５２Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５２Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５２Ｃ）γδＴ細胞、（図５２Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）細胞、および（図５２Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。(Fig. 52A) CD8 + (CD45RA-) T cells, (Fig. 52B) CD4 + (CD45RA-) T cells, (Fig. 52C) γδ T cells, (Fig. 52D) NK (CD16 + CD8α-) after treatment with the IL-15 / Rα variant. ) Cells, and (Fig. 52E) NK (CD56 + CD8α-) cells show the percentage of Ki67 expression. 追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５３Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５３Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図５３Ｃ）γδＴ細胞、および（図５３Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。Percentage of Ki67 expression on (FIG. 53A) CD8 + T cells, (FIG. 53B) CD4 + T cells, (FIG. 53C) γδ T cells, and (FIG. 53D) NK (CD16 +) cells after treatment with additional IL-15 / Rα variants. Is shown. 追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５４Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図５４Ｃ）γδＴ細胞、および（図５４Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。Percentage of Ki67 expression on (Fig. 54A) CD8 + T cells, (Fig. 54B) CD4 + T cells, (Fig. 54C) γδ T cells, and (Fig. 54D) NK (CD16 +) cells after treatment with additional IL-15 / Rα variants. Is shown. Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与での様々なＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合タンパク質または対照のＩＶ−ＴＶ投与時のＰＫを示す。The PK of various IL-15 / RαFc fusion proteins or control IV-TV administration in a single dose of 0.1 mg / kg in C57BL / 6 mice is shown. 効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による処理後の半減期とＮＫ細胞の効力の相関を示す。The correlation between the half-life after treatment with the IL-15 / Rα-Fc fusion protein engineered for reduced potency and the potency of NK cells is shown. 本発明のＸ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのフォーマットを示す。Ｘは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄであってもよいが、これらに限定されない。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマット（図５７Ａ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、ｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの他方側に融合している。「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｂ）は、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｃ）は、「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｄ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｅ）は、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、一方、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｆ）は、「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｇ）は、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、これは次いでさらにヘテロダイマーＦｃ領域の一方のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｈ）は、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域の一方のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｉ）は、「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｊ）は、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）のＮ末端に組み換えで融合したＶＨと、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ヘテロダイマーＦｃの他方側にさらに融合する）のＮ末端に組み換えで融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｋ）は、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合される）に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨと、ヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。Several formats of the X-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion proteins of the invention are shown. X may be, but is not limited to, CD8, NKG2A, and NKG2D. The "scIL-15 / Rα x scFv" format (FIG. 57A) includes IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 by a variable length linker (referred to as "scIL-15 / Rα"), which is then heterozygous. It fuses to the N-terminus of the dimer Fc region and scFv fuses to the other side of the heterodimer Fc. The "scFv x nc IL-15 / Rα" format (FIG. 57B) contains scFv fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, IL-15Rα (sushi) fused to the other side of the heterodimer Fc, but IL- 15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. The "scFv x ds IL-15 / Rα" format (FIG. 57C) is identical to the "scFv x ncIL-15 / Rα" format, but IL-15Rα (sushi) and IL-15 are the result of engineered cysteine. Covalently bonded. The "scIL-15 / Rα x Fab" format (FIG. 57D) includes IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 by a variable length linker (referred to as "scIL-15 / Rα"), which is then heterozygous. Fusing to the N-terminus of the dimer Fc region, the variable heavy chain (VH) fuses to the other side of the heterodimer Fc, while the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. The "ncIL-15 / Rα × Fab" format (FIG. 57E) comprises a VH fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, with IL-15Rα (sushi) fused to the other side of the heterodimer Fc, but corresponding. The light chains are separately transfected to form a Fab containing VH, while IL-15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. The "dsIL-15 / Rα x Fab" format (FIG. 57F) is identical to the "ncIL-15 / Rα x Fab" format, but IL-15Rα (sushi) and IL-15 are the result of engineered cysteine. Covalently bonded. The "mAb-scIL-15 / Rα" format (FIG. 57G) contained VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, IL-15 fused to IL-15Rα (sushi) and It then further fuses to one C-terminus of the heterodimer Fc region, but the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. The "mAb-nc IL-15 / Rα" format (FIG. 57H) contains VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, where IL-15Rα (sushi) is one of the heterodimer Fc regions. Fused to the C-terminus, but the corresponding light chain is separately transfected to form a VH-containing Fab, and IL-15 is separately to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. Transfected. The "mAb-dsIL-15 / Rα" format (FIG. 57I) is identical to the "mAb-ncIL-15 / Rα" format, but IL-15Rα (sushi) and IL-15 are the result of engineered cysteine. Covalently bonded. The "central-IL-15 / Rα" format (FIG. 57J) is a recombinant fusion of VH to the N-terminus of IL-15 (further fused to one side of the heterodimer Fc) and IL-15Rα (sushi) (hetero). The N-terminus of (further fused to the other side of the dimer Fc) contains a recombinantly fused VH, but the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. The "central-sc IL-15 / Rα" format (Fig. 57K) is composed of VH fused to the N-terminus of IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 (further fused to one side of the heterodimer Fc). Containing with VH fused to the other side of the heterodimer Fc, the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. モナリズマブ（２０１４年１２月２日発行の米国特許第８，９０１，２８３号に開示）に基づく例示的な抗ＮＫＧ２Ａ ｍＡｂの配列をキメラｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）およびヒト化ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）として示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The sequences of exemplary anti-NKG2A mAbs based on monarizumab (disclosed in US Pat. No. 8,901,283, issued December 2, 2014) are shown as chimeric mAbs (XENP24542) and humanized mAbs (XENP24542). The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ＭＳ（２０１１年２月１日発行の米国特許第７，８７９，９８５号に開示）に基づく例示的な抗ＮＫＧ２Ｄ ｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。An exemplary anti-NKG2D mAb sequence based on MS (disclosed in US Pat. No. 7,879,985, issued February 1, 2011) is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットの例示的なＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、およびＸＥＮＰ２７１４６を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。Shown are the sequences of exemplary NKG2A targeted IL-15 / Rα-Fc fusions in the scIL-15 / Rα × Fab format, XENP24531, XENP24532, and XENP27146. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットの例示的なＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。Shown are the sequences of exemplary NKG2D targeted IL-15 / Rα-Fc fusions in the scIL-15 / Rα × Fab format, XENP24533, XENP24534, and XENP27145. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. ＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（および対照ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）での処理後の（図６２Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図６２Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、および（図６２Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。(FIG. 62A) CD4 + T cells, (FIG. 62B) CD8 + T cells, and (FIG. 62C) after treatment with NKG2A targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion (and control scIL-15 / Rα-Fc). The rate of Ki67 expression on NK cells is shown. 指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣ中の、細胞増殖と厳密に関連するタンパク質のＫｉ−６７を発現する、（図６３Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図６３Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、および（図６３Ｃ）ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を示す。CD8 + CD45RA-T cells (Fig. 63A), CD4 + CD45RA-T cells (Fig. 63B), and (Fig. 63B) expressing Ki-67, a protein closely related to cell proliferation, in human PBMCs treated with the specified test material. 63C) The ratio of CD16 + NK cells is shown. 指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣ中の、（図６４Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−Ｔ細胞、（図６４Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−Ｔ細胞、（図６４Ｃ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、および（図６４Ｄ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＳＴＡＴ５リン酸化を示す。(Fig. 64A) CD8 + CD45RA-CD25-T cells, (Fig. 64B) CD4 + CD45RA-CD25-T cells, (Fig. 64C) Treg (CD25 + FoxP3 +), and (Fig. 64D) CD56 + NK in human PBMCs treated with the specified test material. Shows STAT5 phosphorylation on cells. キメラｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７６）、ヒト化ｍＡｂ（１５２５１）、ヒト化Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、およびヒト化ワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３１７）としてフォーマットされたヒト化ｍＡｂ（２０１０年２月２日発行の米国特許第７，６５７，３８０号に前述したとおり）に基づく例示的なＣＤ８結合分子の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。Humanized mAbs formatted as chimeric mAbs (XENP15076), humanized mAbs (15251), humanized Fabs (XENP23647), and humanized one-arm mAbs (XENP24317) (US Pat. No. 7,657 issued February 2, 2010). , As described above in No. 380), showing the sequence of exemplary CD8 binding molecules. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ｓｃＩＬ−１５／ＲαｘＦａｂフォーマットの例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。An exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion in the scIL-15 / RαxFab format is shown. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table X, as described herein and applies to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. ＣＤ９標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ならびに対照の抗ＣＤ８ ｍＡｂおよびｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）での処理後の（図６７Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図６７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図６７Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。CD8 + T cells (FIG. 67A), CD4 + T cells (FIG. 67B), and (FIG. 67B) after treatment with a CD9-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion (and control anti-CD8 mAbs and scIL-15 / Rα-Fc). 67C) Shows the rate of Ki67 expression on NK cells. ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体での処理後の（図６８Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図６８Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図６８Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。The percentage of Ki67 expression on (FIG. 68A) CD8 + T cells, (FIG. 68B) CD4 + T cells, and (FIG. 68C) NK cells after treatment with a CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion is shown. ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図６９Ａ）ドナー２１および（図６９Ｂ）ドナー２３からのラパマイシン濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。The percentage of Ki67 expression on rapamycin-enriched CD4 + T cells from donors 21 (FIG. 69A) and donors 23 (FIG. 69B) after treatment with the CD8-targeted IL-15 (N65D) / Rα-Fc fusion and controls is shown. ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図７０Ａ）ドナー２１および（図７０Ａ）ドナー２３からの濃縮されたＴｒｅｇのＣＤ４＋細胞数を示す。The CD8-targeted IL-15 (N65D) / Rα-Fc fusion and the CD4 + cell count of enriched Tregs from donors 21 (FIG. 70A) and donors 23 (FIG. 70A) after treatment with controls are shown. ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図７１Ａ）ドナー２１および（図７１Ｂ）ドナー２３からのラパマイシン濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ ＭＦＩを示す。CD8-targeted IL-15 (N65D) / Rα-Fc fusion and CD25 MFI on rapamycin-enriched CD4 + T cells from donors 21 (FIG. 71A) and donors 23 (FIG. 71B) after treatment with controls are shown. Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体でＰＢＭＣを処理した後の（図７２Ａ）ＣＤ８レスポンダーＴ細胞、（図７２Ｂ）ＣＤ４レスポンダーＴ細胞、および（図７２Ｃ）ＮＫ細胞の増殖割合を示す。CD8 responder T cells (FIG. 72A), CD4 responder T cells (FIG. 72B), and NK cells (FIG. 72C) after PBMC treatment with a CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion in the presence of Treg. Shows the growth rate. 様々な量のＴｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体でＰＢＭＣを処理した後のＴｒｅｇ数を示す。The number of Tregs after treatment of PBMCs with CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions in the presence of varying amounts of Tregs is shown. Ｔｒｅｇ（１：２ Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ比）の存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体および対照でＰＢＭＣを処理した後の（図７４Ａ）ＣＤ８メモリーＴ細胞、および（図７４Ｂ）ＣＤ４レスポンダーＴ細胞、および（図７４Ｃ）Ｔｒｅｇ細胞数の増殖割合を示す。CD8 memory T cells (FIG. 74A) and CD4 (FIG. 74B) after processing PBMCs with CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions and controls in the presence of Treg (1: 2 Treg: PBMC ratio). The proliferation rate of the number of responder T cells and (Fig. 74C) Treg cells is shown. ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＰＢＭＣの非存在下での対照による処置後のＴｒｅｇ数を示す。The Treg number after treatment with a control in the absence of CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion and PBMC is shown. ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後４日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血中の、（図７６Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７６Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７６Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７６Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。CD4 + T cell phenomenon in whole blood of huPBMC-transplanted mice 4 days after treatment with CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion and IL-15 / Rα-Fc fusion variants, (Fig. 76A). (Fig. 76B) CD8 + T cell phenomenon, (Fig. 76C) Correlation between CD8 + T cell phenomenon and CD4 + T cell phenomenon, and (Fig. 76D) CD8 + T cell / CD4 + T cell ratio. ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後７日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血中の、（図７７Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７７Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７７Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７７Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。CD4 + T cell phenomenon in whole blood of huPBMC-transplanted mice 7 days after treatment with CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion and IL-15 / Rα-Fc fusion variants, (Fig. 77A). (Fig. 77B) shows the correlation between the CD8 + T cell phenomenon, (Fig. 77C) the CD8 + T cell phenomenon and the CD4 + T cell phenomenon, and (Fig. 77D) the CD8 + T cell / CD4 + T cell ratio. ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後８日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの脾臓中の、（図７８Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７８Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７８Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７８Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。CD4 + T cell phenomenon in the spleen of huPBMC-transplanted mice 8 days after treatment with the CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion and IL-15 / Rα-Fc fusion variants, (FIG. 78A). FIG. 78B) shows the correlation between the CD8 + T cell phenomenon, (FIG. 78C) the CD8 + T cell phenomenon and the CD4 + T cell phenomenon, and (FIG. 78D) the CD8 + T cell / CD4 + T cell ratio. 代替フォーマットでのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の例示的配列を示す（図５７に示すように）。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。An exemplary sequence of the CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion in alternative format is shown (as shown in FIG. 57). CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. 代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理後のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。The percentage of Ki67 expression on CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells treated with an alternative format of CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion is shown. ファージ由来の抗ＣＤ８抗体配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The anti-CD8 antibody sequence derived from the phage is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体として再フォーマットされた例示的なファージヒットの結合を示す。Shows exemplary phage hit binding reformatted as a one-arm Fab-Fc antibody against CD4 + and CD8 + T cells. 標的細胞上のｐＭＨＣＩへのＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８およびＴＣＲの結合の図。Diagram of binding of CD8 and TCR on CD8 + T cells to pMHCI on target cells. （抗ＣＤ８抗体とプレインキュベーションしない）対照と比較して、抗ＣＤ８抗体とともにプレインキュベーション後のＨＬＡ２：０１制限ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチド特異的Ｔ細胞に対するＨＬＡ２：０１制限ＭＨＣテトラマー特異的ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドによる結合割合を示す。HLA2: 01-restricted MHC tetramer-specific pp65 (NLVPMVATV) peptide for HLA2: 01-restricted pp65 (NLVPMVATV) peptide-specific T cells after preincubation with anti-CD8 antibody compared to controls (not pre-incubated with anti-CD8 antibody) Indicates the binding ratio by. ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドまたはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドをロードしたＴ２細胞とのインキュベーション後、（様々な抗ＣＤ８抗体とプレインキュベートした）ＨＬＡ２：０１制限ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドに特異的なＴ細胞によるＩＦＮγ放出を示す。After incubation with T2 cells loaded with HLA-A2 * 0201 restricted CMV pp65 (NLVPMVATV) peptide or NY-ESO-1 peptide, to HLA2: 01 restricted pp65 (NLVPMVATV) peptide (pre-incubated with various anti-CD8 antibodies). It shows IFNγ release by specific T cells. ＩＦＮγ放出とＴ細胞によるテトラマー結合との相関関係を示す。The correlation between IFNγ release and tetramer binding by T cells is shown. ファージ由来１Ｃ１１Ｂ３に基づく抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体である、ＸＥＮＰ２４７３６の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。The sequence of XENP24736, which is an exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing a phage-derived 1C11B3 based anti-CD8 Fab arm, is shown. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. 指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣでＫｉ６７を発現する（図８８Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図８８Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。The proportions of CD8 + CD45RA-T cells (FIG. 88A) and CD4 + CD45RA-T cells (FIG. 88B) expressing Ki67 in human PBMCs treated with the specified test material are shown. 示すようにマウスまたはヒト化のＯＫＴ８可変領域を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The OKT8 variable region of mouse or humanization is shown as shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ヒト化抗ＯＫＴ８ ｍＡｂであるＸＥＮＰ１５０７５の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The sequence of XENP15075, which is a humanized anti-OKT8 mAb, is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location can vary slightly depending on the numbering used as shown in Table 1, as is the case with any sequence described herein and including the CDRs herein, and is therefore underlined. Not only the CDRs labeled with, but also the CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are also included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. 図８９に示すヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づくＦａｂアームを含む例示的なワンアーム抗ＣＤ８ ｍＡｂを示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。An exemplary one-arm anti-CD8 mAb including a Fab arm based on the humanized OKT8 variable region shown in FIG. 89 is shown. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. 図８９に示すように、マウスまたはヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。As shown in FIG. 89, an exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing a mouse or humanized OKT8 variable region based anti-CD8 Fab arm is shown. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. ヒト化ＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中でＫｉ６７を発現する、（図９３Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図９３Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。Ki67 is expressed in human PBMCs treated with a CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing humanized OKT8 (Fig. 93A) CD8 + CD45RA - T cells and (Fig. 93B) CD4 + CD45RA - T cells. Indicates the ratio of. ７日目のヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中の（図９４Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞数、（図９４Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞数、および（図９４Ｃ）ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。(Fig. 94A) CD8 + CD45RA - T cell count, (Fig. 94B) CD4 + CD45RA - T cell number, and (Fig. 94C) CD8 + / CD4 + T cell ratio in the blood of human PBMC-transplanted NSG mice on day 7. Is shown. 図８９に示すＯＫＴ８＿Ｈ２（ヒト化可変重鎖Ｖ２）に基づくバリアント可変重領域と、図８９に示すＯＫＴ８＿Ｈ１（ヒト化可変軽鎖Ｖ１）に基づくバリアント可変軽領域を示す。本明細書に示す可変重領域のそれぞれは、この図に示される可変軽領域および図８９に示される可変軽領域のいずれかと組み合わせることができる。本明細書に示される可変軽領域のそれぞれは、この図に示される可変重領域および図８９に示される可変重領域のいずれかと組み合わせることができる。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。The variant variable heavy region based on OKT8_H2 (humanized variable heavy chain V2) shown in FIG. 89 and the variant variable light region based on OKT8_H1 (humanized variable light chain V1) shown in FIG. 89 are shown. Each of the variable weight regions shown herein can be combined with either the variable light region shown in this figure or the variable light region shown in FIG. 89. Each of the variable light regions shown herein can be combined with either the variable weight region shown in this figure or the variable weight region shown in FIG. 89. The CDRs are underlined. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. In addition, for all sequences in the figure, these VH and VL sequences can be used in either scFv or Fab format. ヒトおよびカニクイザルＣＤ８に対して例示的なカニクイザルＣＤ８の親和性操作したＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１の解離定数（ＫＤ）、解離速度（ｋｄ）、および会合速度（ｋａ）を示す。ここに描かれている分子は、空のＦｃおよびＦａｂを有するワンアームｍＡｂであり、図８９および９５に示すＦａｂアームは可変領域を含む。例えば、ＸＥＮＰ２６００９のＦａｂアームには、ＯＫＴ８＿Ｈ２．１５２可変重鎖とＯＫＴ８＿Ｌ１．１０３可変軽鎖がある。Affinity engineered OKT8_H2L1 dissociation constant of the exemplary cynomolgus CD8 against human and cynomolgus CD8 (K D), dissociation rate (k d), and shows the association rate (k a). The molecule depicted herein is a one-arm mAb with empty Fc and Fab, and the Fab arm shown in FIGS. 89 and 95 comprises a variable region. For example, the Fab arm of XENP26009 has an OKT8_H2.152 variable heavy chain and an OKT8_L1.103 variable light chain. 図９５に示すように、カニクイザル親和性操作（ＨｕＣｙ）ＯＫＴ８可変領域に基づいた、抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。As shown in FIG. 95, an exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing an anti-CD8 Fab arm is shown based on the cynomolgus monkey affinity manipulation (HuCy) OKT8 variable region. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location may vary slightly depending on the numbering used, as shown in Table 2, as described herein and as applicable to any sequence containing CDRs herein. Thus, not only underlined CDRs, but also CDRs contained within the VH and VL domains using other numbering systems are included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中のＫｉ６７を発現する、（図９８Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図９８Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。Crab-eating mackerel affinity manipulation Ki67 in human PBMCs treated with a CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing a humanized OKT8 binding domain (Fig. 98A) and CD8 + CD45RA - T cells and (Fig. 98B). The ratio of CD4 + CD45RA - T cells is shown. カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中の、（図９９Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図９９Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を示す。In human PBMC treated with CD8 targeting IL-15 / Rα-Fc fusion comprising a cynomolgus affinity operation humanized OKT8 binding domain, (FIG. 99A) CD8 + CD45RA - T cells and (FIG. 99B) CD4 + CD45RA - Shows STAT5 phosphorylation of T cells. カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を投与後７日目のヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血中の、（図１００Ａ）ＣＤ４５＋細胞数、（図１００Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数、（図１００Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数、および（図１００Ｄ）ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。Crab quiz affinity manipulation CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing a humanized OKT8 binding domain in the blood of human PBMC-transplanted NSG mice 7 days after administration (Fig. 100A) CD45 + cell count, (FIG. 100A). FIG. 100B) shows the number of CD4 + T cells, (FIG. 100C) the number of CD8 + T cells, and (FIG. 100D) the ratio of CD8 + / CD4 + T cells. カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したカニクイザルＰＢＭＣ中のＫｉ６７を発現する、（図１０１Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図１０１Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。Cytomal Affinity Manipulation Expressing Ki67 in cynomolgus monkey PBMCs treated with a CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing a humanized OKT8 binding domain (Fig. 101A) CD8 + CD45RA - T cells and (Fig. 101B). The ratio of CD4 + CD45RA - T cells is shown. Ｘｔｅｎｄ Ｆｃを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の例を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。An example of a CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing Xtend Fc is shown. CDRs are shown in bold. The exact identification of the CDR location can vary slightly depending on the numbering used as shown in Table 2, as is the case with any sequence described herein and including the CDRs herein, and is therefore underlined. Not only the CDRs labeled with, but also the CDRs contained within the VE and VL domains using other numbering systems are also included herein. IL-15 and IL-15Rα (sushi) are underlined and the linker is double underlined (but, as will be appreciated by those skilled in the art, the linker is partially underlined in FIGS. 6 and 7). (Can be replaced by other linkers shown in), slashes (/) indicate boundaries (s) between IL-15, IL-15Rα, linkers, various regions, and stationary / Fc regions. 様々な濃度の組み換えＩＬ−１５、ＷＴ ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２０８１８）、および例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２６５８５）による、（図１０３Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図１０３Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、（図１０３Ｃ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図１０３Ｄ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、（図１０３Ｅ）Ｔｒｅｇ、および（図１０３Ｆ）ＣＤ５６−ＮＫ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を経時的に示す。CD4 + CD45RA-T cells with varying concentrations of recombinant IL-15, WT IL-15 / Rα-Fc (XENP20818), and exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion (XENP26585) (FIG. 103A). STAT5 phosphorylation of CD4 + CD45RA + T cells, (FIG. 103C) CD8 + CD45RA-T cells, (FIG. 103D) CD8 + CD45RA + T cells, (FIG. 103E) Treg, and (FIG. 103F) CD56-NK cells over time. ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザル末梢血中の（図１０４Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数および（図１０４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数の経時的な倍率変化を示す。The change in the number of CD8 + T cells (Fig. 104A) and the number of CD4 + T cells in the peripheral blood of cynomolgus monkey after administration of XENP24050 or XENP26223 with time is shown. ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザル末梢血中のＫｉ６７を発現する（図１０５Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞および（図１０５Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。The percentage of CD8 + T cells (FIG. 105A) and CD4 + T cells expressing Ki67 in cynomolgus monkey peripheral blood after administration of XENP24050 or XENP26223 is shown. ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザルのリンパ節でＫｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。The percentage of CD8 + CD45RA-T cells expressing Ki67 in the lymph nodes of cynomolgus monkeys after administration of XENP24050 or XENP26223 is shown. Ｘｔｅｎｄ Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４２９４）を含むワンアーム効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＸｔｅｎｄ Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６５８５）を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の投与後の、（図１０７Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数、（図１０７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数、およびＣ）ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。CD8 + T after administration of one-arm reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion containing Xtend Fc (XENP24294) and CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing Xtend Fc (XENP26585) (FIG. 107A) The number of cells, (FIG. 107B) the number of CD4 + T cells, and C) the ratio of CD8 + / CD4 + T cells are shown. （図１０８Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１０８Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 108A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 108B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of Ki67-positive CD8 + T cells in purified T cells) is shown. （図１０９Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１０９Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 109A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 109B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of IFNγ-positive CD8 + T cells in purified T cells) is shown. （図１１０Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１０Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７およびＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 110A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 110B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of Ki67 and IFNγ-positive CD8 + T cells in purified T cells) is shown. （図１１１Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１１Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 111A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 111B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of Ki67-positive CD4 + T cells in purified T cells) is shown. （図１１２Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１２Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＩＦＮγ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 112A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 112B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of IFNγ-positive CD4 + T cells in purified T cells) is shown. （図１１３Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１３Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７およびＩＦＮγ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。(Fig. 113A) Group 1 (parent MCF-7 tumor cells and purified T cells incubated with designated test material) and (Fig. 113B) Group 2 (MCF-7 tumor cells expressing pp65 and designated test material) were incubated. The ratio of Ki67 and IFNγ-positive CD4 + T cells in purified T cells) is shown. 精製Ｔ細胞および指定の試験物質とともにインキュベーション後の残りの標的細胞を示す。［図１１４Ａ：親ＭＣＦ−７腫瘍細胞、図１１４Ｂ：ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞］The remaining target cells after incubation with purified T cells and the specified test substance are shown. [Fig. 114A: Parent MCF-7 tumor cells, Fig. 114B: MCF-7 tumor cells expressing pp65] ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指定の試験物質で処理後の、ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスの（図１１５Ａ）平均腫瘍体積および（図１１５Ｂ）腫瘍体積の変化を示す。Changes in mean tumor volume (FIG. 115A) and tumor volume (FIG. 115B) of NSG mice transplanted with pp65-expressing MCF-7 cells after transplantation with pp65-reactive huPBMC and treatment with the specified test substance are shown. ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指定の試験物質で処理後の、ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスの全血中の（図１１６Ａ）ＣＤ４５＋細胞、（図１１６Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図１１６Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図１１６Ｄ）ＮＫ細胞数、ならびに（図１１６Ｅ）ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。CD45 + cells (Fig. 116A), CD4 + T cells in whole blood of NSG mice transplanted with pp65-expressing MCF-7 cells transplanted with pp65-reactive huPBMC and treated with the specified test substance. , (Fig. 116C) CD8 + T cells, (Fig. 116D) NK cell number, and (Fig. 116E) CD8 + / CD4 + T cell ratio.

発明を実行するための形態Forms for carrying out the invention

Ｉ．概要
本発明の二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者には理解されるように、組み換えで産生されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロダイマーは、Ｔ細胞を強力に活性化することができる。しかし、その半減期が短いため、好ましい投薬が妨げられる。本発明の標的化ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化をもたらすことができ、癌細胞に対する免疫応答がより大きくなり、したがってより効果的な治療をもたらし得る。そのような標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、多種多様な腫瘍タイプの治療に有用性を見出すことが期待できる。 I. Overview The bifunctional heterodimer Fc fusion proteins of the invention are useful in treating various types of cancer. As will be appreciated by those skilled in the art, recombinantly produced IL-15 / IL-15Rα heterodimers are capable of potently activating T cells. However, its short half-life hinders preferred dosing. The targeted IL-15 / IL-15Rα × antigen-binding domain heterodimer Fc fusion proteins of the invention can result in T cell activation, resulting in a greater immune response to cancer cells and thus more effective treatment. Can bring. Such targeted heterodimer Fc fusion proteins can be expected to find usefulness in the treatment of a wide variety of tumor types.

後述するように、Ｔ細胞活性化を測定できる様々な方法がある。ＮＫ細胞およびＴ細胞に対する二重特異性チェックポイント抗体の機能的作用は、増殖、サイトカイン放出、および細胞表面メーカーのパラメーターの変化を測定することにより、インビトロ（以下により詳細に説明するように場合によっては、インビボ）で評価できる。ＮＫ細胞の場合、細胞増殖の増加、細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現の増加により測定される標的細胞を殺滅能力、または標的細胞殺滅を直接測定することによる）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体の発現（例えば、ＣＤ２５）は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅の増強を示す。Ｔ細胞の場合、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカー発現の増加（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１など）、細胞傷害性（標的細胞を死滅させる能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅増強などを示す。したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる。（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβＴ細胞抑制および／またはγδＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）少なくとも１つの制御性Ｔ細胞の細胞数および／または活性を減少させること、ならびに（ｘｉｉ）腫瘍免疫浸潤物を増加させること。 As described below, there are various methods that can measure T cell activation. The functional effects of bispecific checkpoint antibodies on NK and T cells are in vitro (possibly as described in more detail below) by measuring proliferation, cytokine release, and changes in cell surface maker parameters. Can be evaluated in vivo). For NK cells, increased cell proliferation, cytotoxicity (by measuring the ability to kill target cells as measured by increased expression of CD107a, granzyme, and perforin, or by directly measuring target cell killing), cytokine production (by directly measuring target cell killing), cytokine production ( For example, IFN-γ and TNF), and expression of cell surface receptors (eg, CD25) indicate immunoregulation, eg, enhanced killing of cancer cells. For T cells, increased proliferation, increased expression of activated cell surface markers (eg, CD25, CD69, CD137, PD1, etc.), cytotoxicity (ability to kill target cells), and cytokine production (eg, IL). -2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-17A) show immunomodulation, such as enhanced killing of cancer cells. Therefore, evaluation of treatment can be performed using an assay that evaluates one or more of the following: (I) Increase immune response, (ii) Increase activation of αβT cells and / or γδT cells, (iii) Increase cytotoxic T cell activity, (iv) NK and / or NKT Increasing cell activity, (v) reducing αβT cell suppression and / or γδT cell suppression, (vi) increasing inflammation-inducing cytokine secretion, (vii) increasing IL-2 secretion, (vi) vivi) Increasing interferon-γ production, (ix) increasing Th1 response, (x) decreasing Th2 response, (xi) decreasing cell number and / or activity of at least one regulatory T cell And (xii) increase tumor immune infiltrates.

いくつかの実施形態では、本発明は、二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の使用を提供し、それを必要とする対象において以下のうちの１つ以上を実施する。（ａ）炎症促進性サイトカインを上方制御すること（ｂ）Ｔ細胞の増殖、拡大、または腫瘍浸潤を増加させること（ｃ）Ｔ細胞によるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、および他のサイトカイン産生を増加させること、（ｄ）ＩＬ−２分泌増加させること、（ｅ）抗体応答を刺激すること、（ｆ）癌細胞の成長を阻害すること、（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞免疫を促進すること、（ｈ）ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を促進すること、（ｉ）Ｔ細胞抑制を緩和させること、（ｊ）ＮＫ細胞活性を促進すること、（ｋ）癌細胞のアポトーシスまたは溶解を促進すること、ならびに／または（ｌ）癌細胞に対する細胞傷害性または細胞増殖抑制作用。 In some embodiments, the invention provides the use of a bifunctional IL-15 / IL-15Rα × antigen-binding domain heterodimer Fc fusion protein, one or more of the following in a subject requiring it: To carry out. (A) Upregulation of pro-inflammatory cytokines (b) Increased T cell proliferation, expansion, or tumor invasion (c) Increased T cell production of interferon-γ, TNF-α, and other cytokines (D) Increase IL-2 secretion, (e) Stimulate antibody response, (f) Inhibit cancer cell growth, (g) Promote antigen-specific T cell immunity, (H) Promote CD4 + and / or CD8 + T cell activation, (i) Relax T cell suppression, (j) Promote NK cell activity, (k) Promote cancer cell apoptosis or lysis And / or (l) cytotoxic or inhibitory effects on cancer cells.

二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、集合して「ダイマー」を構築する２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各モノマーのアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の生成に関し、ヘテロダイマー形成を促進するために、かつ／またはホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに応じて、抗原をいくつかの方法で共結合することができる。 The bifunctional heterodimer Fc fusion protein construct is based on the self-assembling nature of the two Fc domains of the antibody heavy chain, eg, the two "monomers" that aggregate to form a "dimer". Heterodimer Fc fusion proteins are made by altering the amino acid sequence of each monomer, as described in more detail below. Therefore, the invention generally relates to the production of heterodimer Fc fusion proteins in different constant regions at each chain to promote heterodimer formation and / or to facilitate purification of heterodimers over homodimers. Depending on the amino acid variant, the antigen can be co-linked in several ways.

二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の形成における主要な障害は、ホモダイマー融合タンパク質から離れてヘテロダイマー融合タンパク質を精製することの難しさ、かつ／またはホモダイマーの形成よりもヘテロダイマーの形成に偏らせることの難しさである。この問題を解決するために、本発明のヘテロダイマーを生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロダイマー化を確実にすることができる。したがって、ヘテロダイマー抗体の生成を引き起こすアミノ酸バリアントは、「ヘテロダイマー化バリアント」と呼ばれる。後述するように、ヘテロダイマー化バリアントは、立体バリアント（例えば、下記の「ノブアンドホール」または「スキュー」バリアントおよび下記の「電荷対」バリアント）ならびに「ｐＩバリアント」含むことができ、それによってヘテロダイマーから離れてホモダイマー精製を可能にする。 A major obstacle in the formation of bifunctional heterodimer Fc fusion proteins is the difficulty of purifying the heterodimer fusion protein away from the homodimer fusion protein and / or biasing towards heterodimer formation rather than homodimer formation. Is the difficulty of. To solve this problem, there are several mechanisms that can be used to generate the heterodimers of the present invention. Moreover, as will be appreciated by those skilled in the art, these mechanisms can be combined to ensure high heterodimerization. Therefore, the amino acid variant that causes the production of heterodimer antibodies is referred to as the "heterodimerized variant." As described below, heterodimerized variants can include steric variants (eg, "knob and hole" or "skew" variants below and "charge pair" variants below) as well as "pI variants", thereby heterozygous. Allows homodimer purification away from the dimer.

１つのメカニズムは、当技術分野において一般的に「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）、または本明細書ではしばしば「スキューバリアント」を指し、これはヘテロダイマー形成を有利にし、ホモダイマー形成を不利にする立体効果および／または静電効果をもたらすアミノ酸操作を指すものであり、任意選択的に使用することができる。Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号、米国特許公開第２０１２／０１４９８７６号に記載のとおりであり、それらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」アミノ酸置換を含むいくつかの「モノマーＡ−モノマーＢ」対を同定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロダイマー化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。本発明において有用なのは、Ｔ３６６Ｗと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ならびに架橋ジスルフィドを有するこのバリアント、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃであり、特に以下に概説するｐＩバリアントを含む他のヘテロダイマー化バリアントとの組み合わせである。 One mechanism generally refers to "knob and hole" ("KIH") in the art, or often "skew variant" herein, which favors heterodimer formation and disadvantages homodimer formation. It refers to an amino acid manipulation that produces a steric effect and / or an electrostatic effect, and can be used arbitrarily. Ridgway et al. , Protein Engineering 9 (7): 617 (1996), Atwell et al. , J. Mol. Biol. As described in 1997 270: 26, U.S. Pat. No. 8,216,805, U.S. Patent Publication No. 2012/0149876, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. These figures identify several "monomer A-monomer B" pairs that contain "knob and hole" amino acid substitutions. In addition, Merchant et al. , Nature Biotechnology. As described in 16: 677 (1998), these "knobs and hole" mutations can be combined with disulfide bonds to skew formation for heterodimerization. Useful in the present invention are T366S / L368A / Y407V paired with T366W and this variant with crosslinked disulfide, T366S / L368A / Y407V / Y349C paired with T366W / S354C, particularly the pI variants outlined below. Combination with other heterodimerized variants, including.

ヘテロダイマー抗体の生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」または「電荷対」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロダイマー化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントと見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロダイマー化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「モノマーの対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。 Additional mechanisms used in the production of heterodimer antibodies are described herein by Gunasekaran et al. , J. Biol. Chem. Often referred to as "electrostatic steering" or "charge pair", as described in 285 (25): 19637 (2010). This is often referred to herein as a "charge pair". In this embodiment, electrostatics are used to skew the formation towards heterodimerization. As will be appreciated by those skilled in the art, these can also affect pI, ie purification, and can therefore also be considered as pI variants in some cases. However, since they were produced to force heterodimerization and were not used as a purification tool, they are classified as "stereovariant". These include D221E / P228E / L368E paired with D221R / P228R / K409R (eg, these are "corresponding sets of monomers") and C220E / P228E paired with C220R / E224R / P228R / K409R. / 368E is included, but not limited to these.

本発明において、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントを使用して、モノマーの一方または両方のｐＩを変更し、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電分離を可能にする。 In the present invention, in some embodiments, pI variants are used to modify the pI of one or both of the monomers to allow isoelectric separation of AA, AB, and BB dimer proteins. To do.

本発明において、ヘテロダイマータンパク質の精製を容易に引き起こすことができるいくつかの基本的メカニズムが存在し、その１つは、各モノマーが異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電精製が可能になるように、ｐＩバリアントの使用に依存する。あるいは、「トリプルＦ」フォーマットなどの一部の足場フォーマットでは、サイズに基づいて分離することもできる。以下にさらに概説するように、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロダイマー化バリアントおよびｐＩバリアントまたは電荷対バリアントの組み合わせは、本発明において特に使用される。 In the present invention, there are several basic mechanisms that can easily trigger the purification of heterodimer proteins, one of which is that each monomer has a different pI, thereby causing AA, AB, and It depends on the use of the pI variant so that isoelectric purification of the BB dimer protein is possible. Alternatively, some scaffolding formats, such as the "triple F" format, can be separated based on size. It is also possible to "skew" the formation of heterodimers rather than homodimers, as further outlined below. Therefore, combinations of steric heterodimerized variants and pI variants or charge pair variants are particularly used in the present invention.

ヘテロダイマータンパク質の精製を可能にする分離メカニズムとしてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸バリアントを一方または両方のモノマーポリペプチドに導入することができる。すなわち、一方のモノマー（本明細書では簡潔さために「モノマーＡ」と呼ぶ）のｐＩは、モノマーＢから離れて操作されることができ、あるいはＡとＢの両モノマーは、モノマーＡのｐＩを増加させ、モノマーＢのｐＩを減少させるように変えることができる。以下で完全に概説されるように、いずれかまたは両方のモノマーのｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば、中性アミノ酸を正荷電または負荷電のアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷へ荷電残基を変更することによって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、あるいは荷電残基を中性残基へ変更することによって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図に示す。さらに、本明細書のヘテロダイマー抗体の生成に使用するのに好適なｐＩバリアントはアイソタイプのもの、例えば、有意な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩバリアントを移入することである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４０２８８２７５号の図２９を参照されたい。 In the present invention, which utilizes pI as a separation mechanism that allows purification of heterodimer proteins, amino acid variants can be introduced into one or both monomeric polypeptides. That is, the pI of one monomer (referred to herein as "monomer A" for brevity) can be manipulated away from monomer B, or both monomers A and B are the pI of monomer A. Can be modified to increase and decrease the pI of monomer B. As fully outlined below, pI changes in either or both monomers are replaced by removing or adding charged residues (eg, replacing neutral amino acids with positively charged or charged amino acid residues). By changing the charged residue from positive or negative to opposite charge (eg from aspartic acid to lysine), or by changing the charged residue to neutral residue (eg from charge). Disappearance, from lysine to serine), can be carried out. Some of these variants are shown in the figure. In addition, suitable pI variants for use in the production of heterodimeric antibodies herein are of isotypes, eg, pI variants from different IgG isotypes such that the pI changes without introducing significant immunogenicity. Is to be imported. See FIG. 29 of US Patent Publication No. 20140288275, which is incorporated herein by reference in its entirety.

したがって、本発明のこの実施形態では、ヘテロダイマーをホモダイマーから分離することができるように、少なくとも１つのモノマーに十分なｐＩの変化を生じさせることをもたらす。当業者には理解され、かつ以下にさらに論じるように、これは「野生型」重鎖定常領域、およびそのｐＩを増加または減少させる（ｗｔＡ：Ｂ＋またはｗｔＡ：Ｂ−）ように操作されたバリアント領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋：Ｂ−またはＡ−：Ｂ＋）、実施できる。 Thus, this embodiment of the invention results in causing a sufficient pI change in at least one monomer so that the heterodimer can be separated from the homodimer. As understood by those skilled in the art and further discussed below, this is a "wild-type" heavy chain constant region, and variants engineered to increase or decrease its pI (wtA: B + or wtA: B-). This can be done by using regions or by increasing one region and decreasing the other (A +: B- or A-: B +).

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、ダイマータンパク質のモノマーの両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）をモノマーの一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする抗体の定常領域におけるアミノ酸バリアントである。本明細書中に示されるように、２つのホモダイマーからのヘテロダイマーの分離は、２つのモノマーのｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本発明において使用される。 Thus, in general, the components of some embodiments of the invention are amino acid substitutions ("pI variants" or "pI substitutions") of at least one isoelectric point (pI), if not both of the dimer protein monomers. ”) Is an amino acid variant in the constant region of an antibody intended to be altered by incorporating it into one or both of the monomers. As shown herein, separation of the heterodimer from the two homodimers can be achieved when the pIs of the two monomers differ slightly from 0.1 pH units, 0.2, 0.3, 0. 4, and anything different by 0.5 or more is used in the present invention.

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマーまたは両モノマー（複数可）に含まれるべきｐＩバリアントの数は、対象のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どのモノマーを操作するか、またはどの「方向」か（例えば、より陽性または陰性）を決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列を計算し、そこから決定される。当技術分野において既知のように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各モノマーの総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。 As will be appreciated by those skilled in the art, the number of pI variants to be included in each monomer or both monomers (s) for good separation depends in part on the scFv of interest and the starting pI of the Fab. Will. That is, the Fv sequences of the two target antigens are calculated and determined from which monomer is manipulated or which "direction" (eg, more positive or negative) is determined. As is known in the art, different Fvs will have different starting pIs utilized in the present invention. Generally, as outlined herein, pI is engineered to result in a total pI difference of at least about 0.1 log of each monomer, 0.2-0.5 as outlined herein. Is preferable.

さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては（フォーマットに応じて）、ヘテロダイマーはサイズ（例えば、分子量）に基づいてホモダイマーから分離することができる。図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、一部のフォーマットでは、サイズの異なるヘテロダイマーをもたらす。 Moreover, as understood by those skilled in the art and outlined herein, in some cases (depending on the format), heterodimers can be separated from homodimers based on size (eg, molecular weight). As shown in FIGS. 57A-57K, some formats result in heterodimers of different sizes.

さらに、図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、いくつかの抗原が二価に結合している可能性があることが認識される（例えば、単一の抗原に対する２つの抗原結合部位）。理解されているように、ＦａｂおよびｓｃＦｖの任意の組み合わせを利用して、所望の結果および組み合わせを達成することができる。 Furthermore, as shown in FIGS. 57A-57K, it is recognized that some antigens may be divalently bound (eg, two antigen binding sites for a single antigen). As is understood, any combination of Fab and scFv can be utilized to achieve the desired results and combinations.

ｐＩバリアントを使用してホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を達成する場合、重鎖（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、抗体を含む多重特異性タンパク質を設計および精製するよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび精製ヘテロダイマー化バリアントを含む）は可変領域に含まれないため、各個々の抗体を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低いｐＩ定常ドメインの解明、例えば、任意の特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。 When purifying heterodimers over homodimers using pI variants, rather than designing and purifying multispecific proteins, including antibodies, by using constant regions (s) of heavy chains (s). A modular approach is provided. Therefore, in some embodiments, heterodimerized variants (including skew variants and purified heterodimerized variants) are not included in the variable region and each individual antibody must be engineered. Moreover, in some embodiments, the immunogenicity potential resulting from the pI variant is by introducing the pI variant from a different IgG isotype so that the pI changes without introducing significant immunogenicity. Significantly reduced. Therefore, a further problem to be solved is the elucidation of low pI constant domains with high human sequence content, eg, minimization or avoidance of non-human residues at any particular location.

このｐＩ操作で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加である。すなわち、米国特許第８，６３７，６４１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。 A possible side benefit of this pI manipulation is also an increase in serum half-life and increased FcRn binding. That is, the pI of antibody constant domains, including those found in antibody and Fc fusions, as described in US Pat. No. 8,637,641 (which is incorporated herein by reference in its entirety). Can result in longer serum retention in vivo. These pI variants for prolonging serum half-life also promote pI changes for purification.

さらに、ヘテロダイマー化バリアントのｐＩバリアントは、ホモダイマーが存在するときを排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、二重特異性抗体の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与えることに注意すべきである。同様に、ヘテロダイマータンパク質の製造の再現性を確実に試験する能力は重要である。 In addition, the pI variant of the heterodimerized variant has a marked ability to eliminate, minimize, and distinguish the presence of homodimers, thus further benefiting the bispecific antibody analysis and quality control process. You should be careful. Similarly, the ability to reliably test the reproducibility of the production of heterodimer proteins is important.

当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。本発明は、抗原に関与し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体を含む新規免疫グロブリン組成物に関する。 The heterodimeric fusion proteins of the invention can have a wide variety of configuration, as understood by those skilled in the art and, as will be described in more detail below, generally as shown in FIGS. 57A-57K. Some figures show a "single-ended" configuration, with one "arm" of the molecule having one type of specificity and the other "arm" having different specificities. The other figure shows a "dual-ended" configuration, with at least one type of specificity at the "top" of the molecule and one or more different specificities at the "bottom" of the molecule. The present invention relates to novel immunoglobulin compositions that are involved in an antigen and contain an IL-15 / IL-15Rα complex.

さらに、本明細書で概説するように、追加の機能を追加するために、追加のアミノ酸バリアントを本発明の二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に導入してもよい。例えば、Ｆｃ領域内のアミノ酸変化を（一方のモノマーまたは両方のモノマーいずれか）追加して、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増加（例えば、Ｆｃγ受容体への結合の変化）を促進し、ＦｃＲｎへの結合を増加および／または結果として生じる分子の血清半減期を増加させることができる。本明細書でさらに説明するように、また当業者には理解されるように、本明細書で概説する変形のいずれかおよびすべては、他の変形と任意選択的に独立して組み合わせることができる。 In addition, as outlined herein, additional amino acid variants may be introduced into the bifunctional heterodimer Fc fusion proteins of the invention to add additional functionality. For example, amino acid changes within the Fc region (either one or both monomers) are added to promote increased ADCC or CDC (eg, changes in binding to the Fcγ receptor) and binding to FcRn. It is possible to increase and / or increase the serum half-life of the resulting molecule. As further described herein and as will be appreciated by those skilled in the art, any and all of the variants outlined herein can be optionally and independently combined with other variants. ..

同様に、機能性バリアントの別のカテゴリーは「Ｆｃγ切除バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）バリアント」である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。すなわち、例えば、ＡＤＣＣ活性を排除または有意に低下させるために、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが一般に望ましい。好適な切除バリアントを図２９に示す。 Similarly, another category of functional variants is the "Fcγ resection variant" or the "Fc knockout (FcKO or KO) variant". In these embodiments, for some therapeutic applications, the normal binding of the Fc domain to one or more or all Fcγ receptors (eg, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, etc.) is reduced or eliminated. , It is desirable to avoid additional mechanisms of action. That is, it is generally desirable to remove FcγRIIIa binding, for example, to eliminate or significantly reduce ADCC activity. A suitable excision variant is shown in FIG.

ＩＩ．命名法
本発明の二重特異性抗体を、いくつかの異なるフォーマットに列挙する。各ポリペプチドには固有の「ＸＥＮＰ」番号が付与されるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列はより短い配列を含み得る。いくつかの分子には３つのポリペプチドがあるため、ＸＥＮＰ番号が構成要素とともに名称として使用される。したがって、ボトルオープナー形式の分子ＸＥＮＰ２４１１６は概して、３つの配列「ＸＥＮＰ２４１１６＿ヒトＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉドメイン）＿（ＧＧＧＧＳ）５＿ヒトＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ、一本鎖）−Ｆｃ」、「ＸＥＮＰ２４１１６＿５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖」、および「ＸＥＮＰ２４１１６＿５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ軽鎖」または同等物を含むが、当業者はこれらを配列アラインメントにより容易に特定することができるだろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表ならびに識別子にあり、図で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を生成する。例えば、Ｆａｂモノマーのリストには、完全長配列、可変重配列、可変重配列の３つのＣＤＲがあり、軽鎖には、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の３つのＣＤＲがあり、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインには、完全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽鎖ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、および３つの重鎖ＣＤＲがあり、ｓｃＦｖドメインを含む本明細書のすべての分子は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他の分子も使用できることに留意されたい。さらに、特定の可変ドメインの命名法では、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプの形式が使用され、番号は特定の可変鎖配列の一意の識別子である。したがって、ＸＥＮＰ２６２２９のＦａｂ側の可変ドメインは「ＯＫＴ８＿Ｈ２．１６６＿Ｌ１．１０３」であり、これは可変重ドメインＨ２．１６６が軽ドメインＬ１．１０３と組み合わされたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、「ＯＫＴ８＿Ｈ２．１６６＿Ｌ１．１０３」という名称は、可変重ドメインＨ２．１６６が軽ドメインＬ１．１０３と結合し、Ｎ末端からＣ末端に向かってｖｈ−リンカー−ｖｌ方向にあることを示す。重可変ドメインと軽可変ドメインの同一の配列を持つが逆順のこの分子は、「ＯＫＴ８＿Ｌ１．１０３＿Ｈ２．１６６」と名付けらる。同様に、配列表および図から明らかなように、異なる構築物は重鎖および軽鎖を「混合および適合」し得る。 II. Nomenclature The bispecific antibodies of the invention are listed in several different formats. Each polypeptide is given a unique "XENP" number, but as is understood in the art, longer sequences may contain shorter sequences. Since some molecules have three polypeptides, the XENP number is used as the name along with the components. Therefore, the bottle opener-type molecule XENP24116 generally has three sequences: "XENP24116_human IL15Rα (sushi domain) _ (GGGGS) 5_human IL15 (N65D, single-stranded) -Fc", "XENP24116_51.1 [CD8] _H1L1Fab-Fc". Includes "heavy chains", and "XENP24116_51.1 [CD8] _H1L1Fab-Fc light chains" or equivalents, but those skilled in the art will be readily identifiable by sequence alignment. These XENP numbers are in sequence listings as well as identifiers and are used in the figures. In addition, one molecule containing the three components produces multiple sequence identifiers. For example, the list of Fab monomers has three CDRs of full length sequence, variable weight sequence, and variable weight sequence, and the light chain has three CDRs of full length sequence, variable light sequence, and variable light sequence. , ScFv-Fc domains include full length sequence, scFv sequence, variable light sequence, three light chain CDRs, scFv linker, variable heavy sequence, and three heavy chain CDRs, all of which are included herein. Note that this molecule uses a single charged scFv linker (+ H), but other molecules can also be used. In addition, certain variable domain nomenclatures use the "Hx.xx_Ly.yy" type format, where the number is a unique identifier for a particular variable chain sequence. Therefore, the variable domain on the Fab side of XENP26229 is "OKT8_H2.166_L1.103", which indicates that the variable heavy domain H2.166 was combined with the light domain L1.103. When these sequences are used as scFv, the name "OKT8_H2.166_L1.103" means that the variable weight domain H2.166 binds to the light domain L1.103 and vh-linker from N-terminus to C-terminus. Indicates that it is in the vr direction. This molecule, which has the same sequence of heavy variable domain and light variable domain but in reverse order, is named "OKT8_L1.103_H2.166". Similarly, as is clear from the sequence listings and figures, different constructs can "mix and match" heavy and light chains.

ＩＩＩ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。 III. Definitions To help you understand this application more completely, some definitions are given below. Such a definition is intended to include grammatical equivalents.

本明細書において「アブレーション」とは、結合および／または活性の低下または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、その特定のバリアントを含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の開始結合を有することを意味し、７０〜８０〜９０〜９５〜９８％未満の結合喪失が好ましく、一般に、結合はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な結合のレベル未満である。ＦｃγＲ結合の除去において特に有用なものは、図２９に示すものである。しかしながら、他の記載がない限り、本発明のＦｃモノマーはＦｃＲｎへの結合を保持する。 As used herein, "ablation" means binding and / or reduction or removal of activity. Thus, for example, "removing the FcγR binding" means that the Fc region amino acid variant has less than 50% of the initiation binding compared to the Fc region that does not contain that particular variant, from 70-80. Loss of binding of less than 90-95-98% is preferred, and binding is generally below the level of binding detectable in the Biacore assay. Particularly useful in removing FcγR bindings are those shown in FIG. However, unless otherwise stated, the Fc monomers of the invention retain their binding to FcRn.

本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に除去する。 As used herein, "ADCC" or "antibody-dependent cellular cytotoxicity" refers to non-specific cytotoxic cells expressing FcγR recognizing ligated antibodies on target cells, followed by target cells. Means a cell-mediated reaction that causes the lysis of. ADCC correlates with binding to FcγRIIIa, and increased binding to FcγRIIIa results in increased ADCC activity. As discussed herein, many embodiments of the invention completely eliminate ADCC activity.

本明細書で用いられる「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。 As used herein, "ADCP" or antibody-dependent cell-mediated phagocytosis refers to nonspecific cytotoxic cells expressing FcγR recognizing linked antibodies on target cells, followed by phagocytosis of the target cells. It means the cell-mediated reaction that causes.

本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。 As used herein, "modification" means a substitution, insertion, and / or deletion of an amino acid in a polypeptide sequence, or modification to a portion chemically linked to a protein. For example, the modification may be a modified carbohydrate or PEG structure bound to a protein. As used herein, "amino acid modification" means a substitution, insertion, and / or deletion of an amino acid in a polypeptide sequence. For clarity, amino acid modifications are always for amino acids encoded by DNA, such as 20 amino acids with codons in DNA and RNA, unless otherwise stated.

本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙまたは２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されているバリアントポリペプチド、この場合はＦｃバリアントを指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるために（アルギニンをコードする）ＣＧＧを（アルギニンをなおコードする）ＣＧＡに交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４／０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆ Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、参照により全体が組み込まれる。 As used herein, "amino acid substitution" or "substitution" means substituting an amino acid at a specific position in the parent polypeptide sequence with a different amino acid. In particular, in some embodiments, the substitution is for an amino acid that is not naturally present at a particular position (either not naturally present in the organism or not present in any organism). For example, the substituted E272Y or 272Y refers to a variant polypeptide in which glutamic acid at position 272 is replaced with tyrosine, in this case the Fc variant. To clarify, change the nucleic acid coding sequence but not the starting amino acid (eg, replace the CGG (encoding arginine) with a CGA (still encoding arginine) to increase host organism expression levels. ) Is not an "amino acid substitution". That is, if a protein has the same amino acid at the particular position where it begins, it is not an amino acid substitution, despite the generation of a new gene encoding the same protein. Substitutions can include naturally occurring amino acids and, in some cases, synthetic amino acids. Examples include US Pat. No. 6,586,207, WO98 / 48032, WO03 / 073238, US2004 / 0214988A1, WO05 / 35727A2, WO05 / 74524A2, J. Mol. W. Chin et al. , (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9827, J. Mol. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11: 1135-1137, J. Mol. W. Chin, et al. , (2002), PICAS United States of America 99: 11020-11024, and L. et al. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10 is included and the whole is incorporated by reference.

本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置にアミノ酸残基またはアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅは、２３３位の後、かつ２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。 As used herein, "amino acid insertion" or "insertion" means adding an amino acid residue or amino acid sequence at a particular position in the parent polypeptide sequence. For example, -233E indicates the insertion of glutamic acid after position 233 and before position 234. In addition, -233ADE or A233ADE indicates the insertion of AlaAsspGlu after position 233 and before position 234.

本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸残基またはアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−、またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）、またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。 As used herein, "amino acid deletion" or "deletion" means removing an amino acid residue or amino acid sequence at a particular position in the parent polypeptide sequence. For example, E233-, or E233 #, E233 (), or E233del indicates a deletion of glutamate at position 233. In addition, EDA233- or EDA233 # indicate a deletion of the sequence GluAspAla starting at position 233.

本明細書で使用される「バリアントタンパク質」「タンパク質バリアント」または「バリアント」とは、少なくとも１つの修飾によって親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、それをコードするアミノ配列、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。 As used herein, "variant protein," "protein variant," or "variant" means a protein that differs from that of the parent protein by at least one modification. A protein variant can refer to the protein itself, a composition comprising the protein, an amino sequence encoding it, or a DNA sequence encoding it. Preferably, the protein variant has at least one amino acid modification compared to the parent protein, eg, about 1 to about 70 amino acid modifications compared to the parent, preferably about 1 to about 5 amino acid modifications. Modifications can be additions, deletions, or substitutions.

以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来の重定常ドメインまたはＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」として機能することができ、例えば、米国特許公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質バリアントの配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。 As described below, in some embodiments, the parent polypeptide, eg, the Fc parent polypeptide, is a human wild-type sequence such as a heavy constant domain or Fc region from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. Human sequences with variants can also function as "parent polypeptides" and can include, for example, the IgG1 / 2 hybrids of US Patent Publication No. 2006/0134105. The sequences of the protein variants herein are preferably at least about 80% identity, most preferably at least about 90% identity, and more preferably at least about 95-98-99% identity with the parent protein sequence. Has.

したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」または「バリアント抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧ配列に由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較してアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。 Thus, as used herein, an "antibody variant" or "variant antibody" means an antibody that is different from the parent antibody based on at least one amino acid modification and is the "IgG variant" used herein. Alternatively, "variant IgG" means an antibody that differs from the parent IgG (again, often derived from the human IgG sequence) based on at least one amino acid modification, and is used herein as "immunoglobulin." "Variant" or "variant immunoglobulin" means an immunoglobulin sequence that differs from that of the parental immunoglobulin sequence based on at least one amino acid modification. As used herein, "Fc variant" or "variant Fc" means a protein that contains an amino acid modification as compared to the Fc domain of human IgG1, IgG2, or IgG4.

本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、付番はＥＵインデックスによるものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述のバリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわちそれは、例えばＮ４３４Ｓ／Ｍ４２８ＬはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃバリアントである、などということである。抗体に関連する本発明において論じられるすべての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスによるものである。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５（これにより参照によりその全体が組み込まれる）も参照されたい。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。 The Fc variants of the invention are defined according to the amino acid modifications that make them up. Thus, for example, N434S or 434S is an Fc variant having a substituted serine at position 434 with respect to the parent Fc polypeptide, numbered by EU index. Similarly, M428L / N434S defines an Fc variant with substitutions M428L and N434S for the parent Fc polypeptide. The identity of the WT amino acids need not be specified, in which case the aforementioned variant is referred to as 428L / 434S. The order in which the substitutions are provided is arbitrary, that is, for example, N434S / M428L is the same Fc variant as M428L / N434S. Unless otherwise stated, for all positions discussed in the present invention relating to antibodies, amino acid position numbering is by EU index. The EU index, or EU index as in Kabat or the EU numbering scheme, refers to the numbering of EU antibodies. Kabat et al. Collected numerous primary sequences of variable regions of heavy and light chains. Based on the degree of sequence conservation, Kabat et al. Classified individual primary sequences into CDRs and frameworks and created a list of them (SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th publication, NIH publication, No. 91-3242, EA Kabat et al.). Edelman et al. , 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, which is incorporated by reference in its entirety. Modifications can be additions, deletions, or substitutions.

本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。生物学的に機能する分子が２つ以上のタンパク質を含む場合、各タンパク質は「モノマー」または「サブユニット」または「ドメイン」と呼ばれてもよく、生物学的に機能する分子は「複合体」と呼ばれてもよい。 As used herein, "protein" means at least two covalently linked amino acids, including proteins, polypeptides, oligopeptides, and peptides. In addition, polypeptides include one or more side chain or terminal synthetic derivatizations, glycosylations, PEGylations, circular sequences, cyclizations, linkers to other molecules, fusions to proteins or protein domains, and peptide tags. Alternatively, the addition of a label may be included. When a biologically functional molecule comprises two or more proteins, each protein may be referred to as a "monomer" or "subunit" or "domain" and the biologically functional molecule is a "complex" May be called.

「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。 As used herein, "residue" means a position in a protein and its associated amino acid features. For example, asparagine 297 (also referred to as Asn297 or N297) is the residue at position 297 in the human antibody IgG1.

本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、概して２つの異なるポリペプチド鎖の（例えば、一方の鎖のＶＨ−ＣＨ１、他方の鎖のＶＬ−ＣＬ）、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域単独、または本発明の二重特異性抗体との関係においてこの領域を指し得る。Ｆａｂの関連で、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。 As used herein, "Fab" or "Fab region" generally refers to two different polypeptide chains (eg, VH-CH1 on one chain, VL-CL on the other), VH, CH1, ... Means a polypeptide containing VL, and CL immunoglobulin domains. Fab can refer to this region alone or in relation to the bispecific antibody of the invention. In the context of Fab, Fab includes the Fv region in addition to the CH1 and CL domains.

本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上述のとおり、概して上記に概説されている定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）とｓｃＦｖの両方としてフォーマットすることができ、ｖｌおよびｖｈドメインを（一般に、本明細書で考察されるリンカーで）組み合わせてｓｃＦｖを形成する。 As used herein, "Fv" or "Fv fragment" or "Fv region" means a polypeptide comprising the VL and VH domains of ABD. The Fv region can be formatted as both Fab (two different polypeptides, as described above, generally also including the constant region outlined above) and scFv, and the vr and vh domains (generally, herein). Combine (with the linkers considered) to form scFv.

本明細書における「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は概して、本明細書で論じられるｓｃＦｖリンカーを使用してｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの向きにもあり得る。配列表および図に示す配列では、ｖｈおよびｖｌドメインの順序が名前に示される。例えば、ＨＸ＿Ｌ．Ｙは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ｖｈ−リンカー−ｖｌ、およびＬ．Ｙ＿Ｈ．Ｘがｖｌ−リンカー−ｖｈであることを意味する。 As used herein, "single chain Fv" or "scFv" generally means a variable weight domain covalently linked to a variable light domain that forms a scFv or scFv domain using the scFv linkers discussed herein. .. The scFv domain can be in either direction from the N-terminus to the C-terminus (vh-linker-vr or vl-linker-vh). In the sequences shown in the sequence listings and figures, the order of the vh and vr domains is indicated by name. For example, HX_L. Y is from the N-terminus to the C-terminus, vh-linker-vr, and L. Y_H. It means that X is vl-linker-vh.

本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。 As used herein, "IgG subclass modification" or "isotype modification" means an amino acid modification that converts one amino acid of one IgG isotype into the corresponding amino acid of a different, matched IgG isotype. For example, since IgG1 contains tyrosine and IgG2 contains phenylalanine at EU position 296, the F296Y substitution in IgG2 is considered to be an IgG subclass modification.

本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であると見なされる。 As used herein, "non-naturally occurring modification" means an amino acid modification that is not isotypic. For example, since none of the IgGs contain serine at position 434, substitution 434S in IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 (or a hybrid thereof) is considered a non-naturally occurring modification.

本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。 As used herein, "amino acid" and "amino acid identity" mean one of the 20 naturally occurring amino acids encoded by DNA and RNA.

本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。 As used herein, "effector function" means a biochemical event resulting from the interaction of an antibody Fc region with an Fc receptor or ligand. Effector functions include, but are not limited to, ADCC, ADCP, and CDC.

本明細書で使用される「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」または「Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同なＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１９０：１２３−１３６（参照により全体が組み込まれる））。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。 As used herein, an "IgG Fc ligand" or "Fc ligand" is a molecule, preferably a polypeptide, of any organism that binds to the Fc region of an IgG antibody to form an Fc / Fc ligand complex. means. Fc ligands include, but are not limited to, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, C1q, C3, mannan-binding lectins, mannose receptors, staphylococcal protein A, streptococcal protein G, and viral FcγR. Fc ligands also include the Fc receptor homologue (FcRH), a family of Fc receptors homologous to FcγR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190: 123-136 (incorporated in its entirety by reference). )). The Fc ligand may include an undiscovered molecule that binds to Fc. Specific IgG Fc ligands are FcRn and Fc gamma receptors.

本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１とＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１とＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８とＦ１５８を含む）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１とＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５）、同様に、任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。 As used herein, "Fc gamma receptor," "FcγR," or "Fc gamma R" means any member of the protein family that binds to the IgG antibody Fc region and is encoded by the FcγR gene. To do. In humans, this family includes FcγRI (CD64) containing isoforms FcγRIa, FcγRIb, and FcγRIc, isoforms FcγRIIa (including allotypes H131 and R131), FcγRIIb (including FcγRIIb-1 and FcγRIIb-2), and FcγRIIc. FcγRII (CD32) containing FcγRIII (CD32), and FcγRIII (CD16) containing isoforms FcγRIIIa (including allotypes V158 and F158) and FcγRIIIb (including allotypes FcγRIIb-NA1 and FcγRIIb-NA2) (Jefferis et al. , 2002, Immunol Lett 82: 57-65), as well, including, but not limited to, any undiscovered human FcγR or FcγR isoform or allotype. FcγRs can be of any organism, including but not limited to humans, mice, rats, rabbits, and monkeys. Mouse FcγRs include FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), and FcγRIII-2 (CD16-2), as well as any undiscovered mouse FcγR or FcγR isoforms or allotypes. Not limited to.

本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野で既知のとおり、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリン（β２−ミクログロブリン）であり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ２−ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃバリアントを使用して、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、場合によっては、血清半減期を増加させることができる。「ＦｃＲｎバリアント」とは、ＦｃＲｎへの結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎバリアントを以下に示す。概して、別段の記載がない限り、本発明のＦｃモノマーは、ＦｃＲｎへの結合を保持する（下記のように、ＦｃＲｎへの結合を増大させるためのアミノ酸バリアントを含み得る）。 As used herein, "FcRn" or "neonatal Fc receptor" means a protein that binds to the Fc region of an IgG antibody and is at least partially encoded by the FcRn gene. FcRn can be of any organism, including but not limited to humans, mice, rats, rabbits, and monkeys. As is known in the art, functional FcRn proteins include two polypeptides, often referred to as heavy and light chains. The light chain is β-2-microglobulin (β2-microglobulin) and the heavy chain is encoded by the FcRn gene. Unless otherwise stated herein, FcRn or FcRn protein refers to a complex of FcRn heavy chains and β2-microglobulin. Various Fc variants can be used to increase binding to FcRn and, in some cases, increase serum half-life. The "FcRn variant" is one that increases binding to FcRn, and suitable FcRn variants are shown below. In general, unless otherwise stated, Fc monomers of the invention retain their binding to FcRn (which may include amino acid variants to increase binding to FcRn, as described below).

本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親抗原結合ドメイン」は、バリアントを生成するように修飾される未修飾抗原結合ドメインポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」は、バリアントを生成するように修飾される未修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、バリアント抗体を生成するように修飾される未修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説するように、既知の市販の組み換えで産生した抗体が含まれることに注意すべきである。 As used herein, "parent polypeptide" means a starting polypeptide that is subsequently modified to produce a variant. The parent polypeptide may be a naturally occurring polypeptide, or a variant or engineered version of a naturally occurring polypeptide. The parent polypeptide may refer to the polypeptide itself, a composition comprising the parent polypeptide, or an amino acid sequence encoding the same. Thus, as used herein, "parental antigen-binding domain" means an unmodified antigen-binding domain polypeptide that is modified to produce a variant, and "parental immunoglobulin" as used herein is. , Means an unmodified immunoglobulin polypeptide modified to produce a variant, and as used herein, "parent antibody" means an unmodified antibody modified to produce a variant antibody. It should be noted that "parent antibody" includes known commercially available recombinantly produced antibodies, as outlined below.

本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを意味し、場合によってはヒンジを含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ付番では、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはアミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義には、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）または２１６〜４４７（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方、またはそのフラグメントが含まれる。この文脈における「Ｆｃフラグメント」は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方のより少ないアミノ酸を含んでもよいが、一般的にサイズに基づく標準的な方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して検出できるように、別のＦｃドメインまたはＦｃフラグメントとダイマーを形成する能力を依然として保持する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは本発明において特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来のＦｃドメインであり得る。本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味し、場合によっては、最初に定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）またはその一部のすべてまたは一部を除外し、場合によっては、ヒンジのすべてまたは一部をさらに除外する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ２とＣＨ３）、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、および任意選択的にこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端のすべてまたは一部を指し得る。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびに任意選択的に、ＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）との間のヒンジ領域のすべてまたは一部を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｅ２１６、Ｃ２２６、またはＡ２３１を含むものと定義され、ここでの付番はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲまたはＦｃＲｎへの結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。 As used herein, "Fc" or "Fc region" or "Fc domain" means a polypeptide comprising the CH2-CH3 domain of an IgG molecule, optionally including a hinge. In the EU numbering of human IgG1, the CH2-CH3 domain contains amino acids 231-447 and the hinges are 216-230. Therefore, the definition of "Fc domain" includes both amino acids 231-447 (CH2-CH3) or 216-447 (hinge-CH2-CH3), or fragments thereof. An "Fc fragment" in this context may contain less amino acids at either the N-terminus and the C-terminus, but is generally a standard size-based method (eg, non-denaturing chromatography, size exclusion chromatography). It still retains the ability to form a dimer with another Fc domain or Fc fragment so that it can be detected using a graph or the like. Human IgG Fc domains are particularly useful in the present invention and can be Fc domains derived from human IgG1, IgG2 or IgG4. As used herein, "Fc" or "Fc region" or "Fc domain" means a polypeptide comprising a constant region of an antibody and, in some cases, first a constant region immunoglobulin domain (eg, CH1). Or exclude all or part of it, and in some cases further exclude all or part of the hinge. Thus, Fc is the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD, and IgG (eg, CH2 and CH3), the last three constant region immunoglobulin domains of IgE and IgM, and optionally these. Can refer to all or part of the N-end of the mobile hinge for the domain of. In the case of IgA and IgM, the Fc may contain a J chain. In the case of IgG, the Fc domain comprises immunoglobulin domains CH2 and CH3 (Cγ2 and Cγ3), and optionally all or part of the hinge region between CH1 (Cγ1) and CH2 (Cγ2). Although the boundaries of the Fc region can vary, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined to contain residues E216, C226, or A231 at its carboxy terminus, where the numbering is EU as in Kabat. It is due to the index. In some embodiments, amino acid modifications are made to the Fc region, for example, to alter binding to one or more FcγRs or FcRn, as described in more detail below.

当業者には理解されるように、重定常領域ドメインの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。ＥＵおよびＫａｂａｔによる重定常領域の付番の有用な比較は以下のとおり、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５、およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。
As will be appreciated by those skilled in the art, the exact numbering and placement of heavy constant region domains can vary in different numbering systems. A useful comparison of heavy stationary region numbering by EU and Kabat is as follows: Edelman et al. , 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, and Kabat et al. , 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (which is incorporated by reference in its entirety).

「バリアントＦｃ領域」は、親のＦｃドメインと比較したアミノ酸修飾を含む。したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸修飾（切除バリアントの場合はアミノ酸欠失が含まれるが、一般的にアミノ酸置換）を含むものである。一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧＦｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を有する（以下に議論する同一性アルゴリズム（一実施形態では当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズム）をデフォルトパラメーターを用いて使用する）。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインに対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸修飾を有し得る。さらに、本明細書で議論されるように、本明細書のバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定される別のＦｃドメインとともにダイマーを形成する能力を依然として保持する。 The "variant Fc region" comprises an amino acid modification compared to the parent Fc domain. Thus, a "variant human IgG1Fc domain" comprises an amino acid modification (including an amino acid deletion in the case of a resection variant, but generally an amino acid substitution) as compared to the human IgG1Fc domain. In general, variant Fc domains have at least about 80, 85, 90, 95, 97, 98 or 99% identity to the corresponding parent human IgG Fc domain (the identity algorithm discussed below (in one embodiment). The BLAST algorithm known in the art) is used with default parameters). Alternatively, the variant Fc domain is 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,11,12,13,14 with respect to the parent Fc domain. , 15, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acid modifications. In addition, as discussed herein, the variant Fc domain herein dimers along with another Fc domain measured using known techniques described herein, such as non-denatured gel electrophoresis. Still retains the ability to form.

本明細書において「重定常領域」とは、アミノ酸１１８〜４４７などのヒトＩｇＧ１のＥＵ付番において、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分（またはそのフラグメント）を意味し、可変重ドメインを除く。本明細書における「重鎖定常領域フラグメント」とは、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からのアミノ酸がより少ない重鎖定常領域を意味するが、別の重鎖定常領域とダイマーを形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。 As used herein, the term "heavy constant region" means the CH1-hinge-CH2-CH3 portion (or fragment thereof) of an antibody in the EU numbering of human IgG1 such as amino acids 118-447, excluding the variable weight domain. .. As used herein, the term "heavy chain constant region fragment" means a heavy chain constant region with less amino acids from either or both of the N-terminus and C-terminus, but forms a dimer with another heavy chain constant region. It means a heavy chain constant region that still retains its capacity.

本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、少なくとも２つのタンパク質の共有結合を意味する。本明細書に記載されるように、融合タンパク質は人工配列、例えば、ドメインリンカーを含み得る。本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」とは概して、（任意選択的に、本明細書に記載のドメインリンカーを介して）１つ以上の異なるタンパク質、例えば本明細書に記載のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒに連結したＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。いくつかの例では、２つのＦｃ融合タンパク質がホモダイマーＦｃ融合タンパク質またはヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を形成することができ、後者が好ましい。場合によっては、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の一方のモノマーは、Ｆｃドメインのみ（例えば、空のＦｃドメイン）を含み、他方のモノマーは、バリアントＦｃドメインおよび受容体、リガンド、または他の結合パートナーなどのタンパク質ドメインを含むＦｃ融合体である。 As used herein, "fusion protein" means a covalent bond of at least two proteins. As described herein, fusion proteins can include artificial sequences, such as domain linkers. As used herein, "Fc fusion protein" or "immunoadhesin" is generally referred to as one or more different proteins (optionally via the domain linkers described herein), such as those described herein. Means a protein containing an Fc region linked to IL-15 and / or IL-15R. In some examples, the two Fc fusion proteins can form a homodimer Fc fusion protein or a heterodimer Fc fusion protein, the latter being preferred. In some cases, one monomer of a heterodimer Fc fusion protein contains only the Fc domain (eg, an empty Fc domain) and the other monomer is a variant Fc domain and a receptor, ligand, or other binding partner. It is an Fc fusion containing a protein domain.

本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に付番されるか、または確立されたフォーマット、例えば、抗体付番のためのＥＵインデックスによって付番されてもよい。 As used herein, "position" means a location in a protein sequence. Positions may be numbered in sequence or by an established format, eg, the EU index for antibody numbering.

本明細書中の本発明のヘテロダイマータンパク質のモノマーの文脈で「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロダイマーを形成する能力を保持、生成、および／または促進するようにヘテロダイマー化バリアントを各モノマーに組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩバリアントがモノマーＡへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体バリアントはｐＩバリアントを妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷バリアントが同一の「鎖」または「モノマー」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー」バリアントついて、当業者は、対の１つのセットを組み入れる鎖またはモノマーがどちらに入るかを決定する際に、同様にスキューのｐＩを使用してｐＩ分離を最大化するようにｐＩを考慮する。 In the context of the monomers of the heterodimer proteins of the invention herein, "strandedness" retains the ability to "match" to form heterodimers, as well as "matching" double-stranded DNA. Means incorporating a heterodimerized variant into each monomer to promote, production, and / or. For example, if some pI variants are engineered to monomer A (eg, higher pI), then similarly available "charge pairs" steric variants do not interfere with the pI variants, eg pI. The elevated charge variants are placed on the same "chain" or "monomer" and retain both functions. Similarly, for "skew" variants that are paired sets, as outlined in more detail below, one of ordinary skill in the art will likewise in determining whether a chain or monomer that incorporates one set of pairs falls into. Consider pI to maximize pI separation using skew pI.

本明細書で使用される「標的抗原」とは、所与の抗原結合ドメインまたは抗体の可変領域が特異的に結合する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多数の適切な標的抗原が以下に記載されている。 As used herein, "target antigen" means a molecule to which a given antigen-binding domain or variable region of an antibody specifically binds. The target antigen may be a protein, carbohydrate, lipid, or other compound. A number of suitable target antigens are listed below.

「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。 "Target cell", as used herein, means a cell that expresses a target antigen.

本明細書の本発明による二重特異性抗体を製造する文脈における「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外因性核酸を含み、好適な条件下で二重特異性抗体を発現できる細胞を意味する。好適な宿主細胞について以下で説明する。 As used herein, a "host cell" in the context of producing a bispecific antibody according to the invention comprises an exogenous nucleic acid encoding a component of the bispecific antibody and is bispecific under suitable conditions. It means a cell capable of expressing an antibody. Suitable host cells will be described below.

本明細書で使用される「可変領域」とは、κ、λ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。 As used herein, a "variable region" is one that is substantially encoded by any of the Vκ, Vλ, and / or VH genes that make up the κ, λ, and heavy chain immunoglobulin loci, respectively. It means a region of immunoglobulin containing the above Ig domain.

本明細書における「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。 As used herein, "wild-type or WT" means a naturally found amino acid or nucleotide sequence that contains an allelic mutation. The WT protein has an unintentionally unmodified amino acid or nucleotide sequence.

タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整合し、必要ならギャップを導入した後の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整合を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整合を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１６／０２４４５２５号の段落番号［０２７９］〜［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ−２プログラムである。 The "amino acid sequence identity percent (%)" for a protein sequence is the amino acid residue in a particular (parent) sequence after sequence matching to achieve the maximum sequence identity percent and, if necessary, a gap. It is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that is identical to the group and does not consider any conservative substitution as part of the sequence identity. Alignments for determining the percentage of amino acid sequence identity are within the scope of the art using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megaligin (DNASTAR) software. Can be achieved in various ways. One of ordinary skill in the art can determine appropriate parameters for measuring matching, including any algorithm required to achieve maximum matching over the entire length of the sequence being compared. One particular program is the ALIGN-2 program outlined in paragraph numbers [0279] to [0280] of US Patent Publication No. 2016/0244525, which is incorporated herein by reference.

本発明は、ヒト抗体ドメインと配列同一性を有するいくつかの抗原結合ドメインを提供する。２つの類似した配列（抗体可変ドメインなど）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，（１９９０）”Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，ｔｈｅ”ＢＬＡＳＴ”ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ参照のこと）などのアルゴリズムによって測定できる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメーター（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、デフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して配列同一性を測定する。 The present invention provides several antigen binding domains that have sequence identity with the human antibody domain. Sequence identity between two similar sequences (such as antibody variable domains) is described in Smith, T. et al. F. & Waterman, M.D. S. (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Apple. Math. 2: 482 [local homology algorithm], Needleman, S. et al. B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Sequencing For Similities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. et al. Mol. Biol. 48: 443 [homology algorithm algorithm], Pearson, W. et al. R. & Lipman, D.I. J. (1988) “Improved Tools For Biological Sequencing Comparison,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 [search for similar method], or Altschul, S. et al. F. et al, (1990) "Basic Local Element Search Tool," J. Mol. Mol. Biol. It can be measured by an algorithm such as 215: 403-10, the "BLAST" algorithm (see https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). If you use any of the above algorithms, the default parameters (window length, gap penalty, etc.) are used. In one embodiment, the default parameters are used and the BLAST algorithm is used to measure sequence identity.

本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、「本発明の配列」の長さまたは親配列の長さのうちの短い方で割った、２つの配列の整合における正確な一致の数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。 The degree of identity between the amino acid sequence of the invention (“sequence of the invention”) and the parent amino acid sequence is divided by the length of the “sequence of the invention” or the length of the parent sequence, whichever is shorter. Calculated as the exact number of matches in matching two sequences. Results are expressed as a percentage of identity.

いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％まで同一である。 In some embodiments, the two or more amino acid sequences are at least 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% identical. In some embodiments, the two or more amino acid sequences are at least 95%, 97%, 98%, 99%, and even 100% identical.

本発明のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は概して、単離されているか、または組み換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離されたヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質」とは、宿主細胞タンパク質などの細胞培養由来の他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。「組み換え体」は、外来性宿主細胞において組み換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味し、それらも単離され得る。 The heterodimer Fc fusion proteins of the invention are generally isolated or recombinant. When used to describe the various polypeptides disclosed herein, "isolated" is identified and isolated and / or recovered from the cell or cell culture in which it was expressed. Means a polypeptide. Usually, the isolated polypeptide is prepared by at least one purification step. "Isolated heterodimer Fc fusion protein" refers to a protein that is substantially free of other proteins from cell culture, such as host cell proteins. "Recombinant" means that antibodies are produced in foreign host cells using recombinant nucleic acid technology, and they can also be isolated.

本明細書における「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、抗原決定基にその結合特異性を付与する抗原結合分子の一部を意味する。 As used herein, the term "antigen-binding domain" or "ABD" means a part of an antigen-binding molecule that imparts its binding specificity to an antigenic determinant.

本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する任意の分子を指す。抗原結合分子は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化学化合物であってもよい。抗原結合分子の例としては、免疫グロブリンおよびその誘導体またはフラグメント、例えばＦａｂおよびｓｃＦｖがある。抗原結合分子の追加の例は、受容体とリガンドである。 As used herein, the term "antigen-binding molecule", in its broadest sense, refers to any molecule that specifically binds to an antigenic determinant. The antigen-binding molecule may be a protein, carbohydrate, lipid, or other chemical compound. Examples of antigen-binding molecules are immunoglobulins and their derivatives or fragments, such as Fab and scFv. Additional examples of antigen-binding molecules are receptors and ligands.

特異的結合の強度または親和性は、相互作用の解離定数（ＫＤ）として表すことができ、ＫＤが小さいほど親和性が大きくなり、ＫＤが大きいほど親和性が低くなる。結合特性は、生体層干渉法および表面プラズモン共鳴に基づく方法などの当技術分野で周知の方法によって決定することができる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原または受容体／リガンド複合体の会合速度と解離速度を測定することを伴い、速度は、複合パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。したがって、会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）の両方を決定でき、ｋｄ／ｋａの比は解離定数ＫＤに等しくなる（Ｎａｔｕｒｅ３６１：１８６−１８７（１９９３）およびＤａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５９：４３９−４７３を参照のこと）。 The strength or affinity of the specific bond can be expressed as the dissociation constant (KD) of the interaction. The smaller the KD, the higher the affinity, and the larger the KD, the lower the affinity. Binding properties can be determined by methods well known in the art, such as biolayer interferometry and methods based on surface plasmon resonance. One such method involves measuring the rate of association and dissociation of the antigen binding site / antigen or receptor / ligand complex, where the rate is the concentration of the complex partner, the affinity of the interaction, and both directions. Depends on geometric parameters that equally affect the speed of. Therefore, both the association rate (ka) and the dissociation rate (kd) can be determined, and the kd / ka ratio is equal to the dissociation constant KD (Nature 361: 186-187 (1993) and Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem 59: 439-473).

特定の分子またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示すことができる。典型的には、抗原に特異的に結合する抗原結合分子は、抗原またはエピトープに対する対照分子について、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上のＫＤを有することになる。 Specific binding to a particular molecule or epitope is, for example, at least about 10-4 M, at least about 10-5 M, at least about 10-6 M, at least about 10-7 M, at least about 10 to the antigen or epitope. It can be indicated by an antibody having -8 M, at least about 10-9 M, alternatives at least about 10-10 M, at least about 10-11 M, at least about 10-12 M, or higher KD. Typically, the antigen-binding molecule that specifically binds to the antigen is 20-fold, 50-fold, 100-fold, 500-fold, 1000-fold, 5,000-fold, 10,000-fold, with respect to the control molecule for the antigen or epitope. Or will have a higher KD.

また、特定の分子またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫａまたは会合速度が、対照と比べたそのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗原結合分子によって示され得る。 Also, specific binding to a particular molecule or epitope, for example, Ka or association rate to the antigen or epitope is at least 20-fold, 50-fold, 100-fold, 500-fold, 1000-fold relative to that epitope compared to the control. , 5,000 times, 10,000 times, or more, can be indicated by antigen-binding molecules.

「エピトープ」とは、本明細書では、特異的抗原結合ドメイン、例えばパラトープとして既知の抗体分子の可変領域と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一分子は、２つ以上のエピトープを有してもよい。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。エピトープは、立体配座または直線状のいずれであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗原結合分子は、ある抗原結合分子の別の抗原結合分子の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された本明細書の抗原結合分子および抗原結合ドメインを含むだけでなく、列挙された抗原結合分子または抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。 "Epitope" as used herein means a determinant that interacts with a specific antigen binding domain, eg, a variable region of an antibody molecule known as a paratope. Epitopes are groups of molecules such as amino acids or sugar side chains and usually have specific structural and specific charge properties. A single molecule may have more than one epitope. Epitopes are amino acid residues that are directly involved in binding (also referred to as the immunodominant component of the epitope) and other amino acid residues that are not directly involved in binding, such as amino acids that are effectively blocked by a specific antigen-binding peptide. Residues, in other words, may include amino acid residues within the footprint of a specific antigen-binding peptide. The epitope may be either conformational or linear. Conformational epitopes are created by spatial juxtaposition of amino acids from different segments of a linear polypeptide chain. Linear epitopes are created by adjacent amino acid residues within the polypeptide chain. Conformational epitopes and non-conformational epitopes can be distinguished in that they lose their binding to the former in the presence of a denaturing solvent, but not the latter. Epitopes typically contain at least 3, more generally at least 5, or 8-10 amino acids within a unique spatial conformation. Antigen-binding molecules that recognize the same epitope can be validated in a simple immune assay that exhibits the ability of one antigen-binding molecule to block the binding of another antigen-binding molecule to a target antigen, eg, "binning." As outlined below, the invention includes not only the listed antigen-binding molecules and antigen-binding domains herein, but also the binding to the listed antigen-binding molecules or epitopes bound by the antigen-binding domain. Including competing ones.

「融合」または「共有結合」とは、本明細書で概説される構成要素（例えば、ＩＬ−１５タンパク質およびＦｃドメイン）が、直接またはドメインリンカーを介してペプチド結合により連結されることを意味する。 By "fusion" or "covalent bond" is meant that the components outlined herein (eg, IL-15 protein and Fc domain) are linked by peptide bond, either directly or via a domain linker. ..

本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施形態では、一本鎖ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」、すなわちＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインが融合して、単一ペプチド鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５のＣ末端はＩＬ−１５ＲαｓｕｓｈｉドメインのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、モノマーは直接連結されている。他の実施形態では、モノマーは、本明細書に概説されるドメインリンカーを介して連結される。 As used herein, the term "single strand" refers to a molecule that contains amino acid monomers linearly linked by peptide bonds. In certain embodiments, the single-strand IL-15 / IL-15Rα complex or "scIL-15 / Rα", i.e. the IL-15 and IL-15Rαshsi domains, fuse to form a single peptide chain. In some embodiments, the C-terminus of IL-15 is attached to the N-terminus of the IL-15Rαshsi domain. In some embodiments, the monomers are directly linked. In other embodiments, the monomers are linked via a domain linker outlined herein.

特定の抗原またはエピトープへの「特異的結合」もしくはそれら「に特異的に結合する」またはそれら「に対して特異的である」とは、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定することができる。 "Specific binding" to a particular antigen or epitope or "specifically binding to" or "specific to" them means a binding that is measurable different from a non-specific interaction. .. Specific binding can be measured, for example, by determining the binding of a molecule compared to that of a control molecule, which is a molecule of similar structure that generally does not have binding activity. For example, specific binding can be determined by competition with a control molecule that is similar to the target.

特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。 Specific binding to a particular antigen or epitope is, for example, at least about 10-4 M, at least about 10-5 M, at least about 10-6 M, at least about 10-7 M, at least about 10 to the antigen or epitope. Can be indicated by an antibody having -8 M, at least about 10-9 M, alternatives at least about 10-10 M, at least about 10-11 M, at least about 10-12 M, or more, with KD. Refers to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. Typically, an antibody that specifically binds to an antigen is 20-fold, 50-fold, 100-fold, 500-fold, 1000-fold, 5,000-fold, 10,000-fold, compared to the antigen or epitope. You will have a KD that is twice as large or greater than that.

また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般的に、ＢｉａｃｏｒｅＳＰＲまたはＢＬＩアッセイを用いて測定される。 In addition, specific binding to a specific antigen or epitope, for example, KA or Ka to the antigen or epitope is at least 20 times, 50 times, 100 times, 500 times, 1000 times, as compared with the control. , 5,000-fold, 10,000-fold, or more, can be indicated by antibodies, KA or Ka refers to the association rate of a particular antibody-antigen interaction. Binding affinity is generally measured using the Biacore SPR or BLI assay.

本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。 Before further describing the invention, it should be understood that the invention is not limited to the particular embodiments described and thus can, of course, vary. As the scope of the invention is limited only by the appended claims, the terms used herein are for the purposes of describing only certain embodiments and are not intended to be limiting. It should also be understood that there is no such thing.

ＩＶ．標的化ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
本明細書において提供されるのは、抗原に結合することができ、共通γ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）および／またはＩｌ−２受容体β鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）と複合体形成することができるヘテロダイマー融合タンパク質である。ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質および抗原結合ドメインを含み得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒαに共有結合したＩＬ−１５タンパク質、およびＦｃドメインを含み得る。任意選択で、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。抗原結合ドメインは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄなど、だがこれらに限定されない標的抗原に特異的に結合する。 IV. Targeted IL-15 / IL-15Rα × Antigen Binding Domain Heterodimer Fc Fusion Protein Provided herein are capable of binding to an antigen and have a common γ chain (γc, CD132) and / or Il-2. It is a heterodimer fusion protein that can form a complex with the receptor β chain (IL-2Rβ, CD122). Heterodimer fusion proteins may include IL-15 / IL-15Rα-Fc fusion proteins and antigen binding domains. The IL-15 / IL-15Rα-Fc fusion protein may include an IL-15 protein covalently attached to IL-15Rα, and an Fc domain. Optionally, the IL-15 and IL-15Rα proteins are non-covalently linked. Antigen binding domains specifically bind to target antigens such as, but not limited to, CD8, NKG2A, and NKG2D.

Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインから誘導することができ、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが本発明において特に使用される。以下に、本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合モノマーおよび抗原結合ドメインに有用なＦｃドメインを記載する。 The Fc domain can be derived from an IgG Fc domain, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc domain, the IgG1 Fc domain being particularly used in the present invention. The IL-15 / IL-15Rα Fc fusion monomer of the bifunctional heterodimer protein of the present invention and the Fc domain useful for the antigen binding domain are described below.

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し、Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は概して、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上述（１９９１）を参照）。 The carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector function, and Kabat et al. Collected numerous primary sequences of variable regions of heavy and light chains. Based on the degree of sequence conservation, Kabat et al. Classified individual primary sequences into CDRs and frameworks and created a list of them (SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th publication, NIH publication, No. 91-3242, EA Kabat et al.). Throughout the specification, the Kabat numbering system is generally used to refer to residues within the variable domain (approximately residues 1-107 of the light chain variable region and residues 1-113 of the heavy chain variable region). The EU numbering system is for the Fc region (see, eg, Kabat et al., Supra (1991)).

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖においていくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧとの関連における「ＣＨ」ドメインは以下のとおりである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる１１８〜２１５位を指す。「ヒンジ」とは、Ｋａｂａｔにあるような、ＥＵインデックスによる２１６〜２３０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる２３１〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う３４１〜４４７位を指す。表１に示すように、重鎖ドメインの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。本明細書に示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、以下に考察されるヒンジ領域と同様に１つまたは複数のＣＨ領域にあり得る。 The IgG subclass of immunoglobulins has several immunoglobulin domains in the heavy chain. As used herein, "immunoglobulin (Ig) domain" means a region of immunoglobulin having distinctly different tertiary structure. Heavy chain domains, including stationary weight (CH) domains and hinge domains, are of interest in the present invention. In the context of IgG antibodies, each IgG isotype has three CH regions. Therefore, the "CH" domain in the context of IgG is: "CH1" refers to positions 118-215 according to the EU index, as in Kabat. "Hinge" refers to positions 216-230 according to the EU index, as in Kabat. "CH2" refers to positions 231 to 340 according to the EU index as in Kabat, and "CH3" refers to positions 341 to 447 according to the EU index as in Kabat. As shown in Table 1, the exact numbering and placement of heavy chain domains can vary for different numbering systems. As shown herein and described below, the pI variant can be in one or more CH regions as well as the hinge regions discussed below.

重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、位置２１６（ＩｇＧ１中のＥ２１６）から２３０（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように本明細書で定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域に関連して、ヒンジが含まれ、一般に位置２１６〜２３０を指す。本明細書に記載のとおり、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。 Another type of heavy chain Ig domain is the hinge region. As used herein, the term "hinge" or "hinge region" or "antibody hinge region" or "immunoglobulin hinge region" means a mobile polypeptide containing amino acids between the first and second constant domains of an antibody. To do. Structurally, the IgG CH1 domain ends at EU position 215 and the IgG CH2 domain begins at residue EU position 231. Thus, for IgG, antibody hinges are defined herein to include positions 216 (E216 in IgG1) to 230 (P230 in IgG1), and numbering is by EU index as in Kabat. is there. In some embodiments, for example, in relation to the Fc region, a hinge is included, generally pointing to positions 216-230. As described herein, pI variants can be made in the hinge region as well.

したがって、本発明は、異なる抗体ドメイン、例えば異なるＦｃドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において既知のとおり、本発明のヘテロダイマータンパク質は異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むが、これらに限定されない。 Therefore, the present invention provides different antibody domains, eg different Fc domains. As described herein and known in the art, the heterodimeric proteins of the invention contain different domains, which can also overlap. These domains include, but are not limited to, Fc domains, CH1 domains, CH2 domains, CH3 domains, hinge domains, and heavy constant domains (CH1-hinge-Fc domain or CH1-hinge-CH2-CH3).

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および場合によりヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインはまた、ＣＨ１ドメインの一部も含む。本明細書のいくつかの実施形態では、タンパク質フラグメント、例えばＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合している場合、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。他の実施形態では、タンパク質フラグメント、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合している場合、それは、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα構築物のＮ末端であり、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインに結合している。 Thus, the "Fc domain" includes the -CH2-CH3 domain and optionally the hinge domain. In some embodiments, the Fc domain also includes a portion of the CH1 domain. In some embodiments herein, when a protein fragment, such as IL-15 or IL-15Rα, is bound to the Fc domain, it is IL- that is bound to all or part of the hinge of the Fc domain. 15 or the C-terminus of the IL-15Rα construct, for example, it is attached to the sequence EPKS, which is generally the beginning of the hinge. In other embodiments, if a protein fragment, eg, IL-15 or IL-15Rα, is attached to the Fc domain, it is the N-terminus of the IL-15 or IL-15Rα construct and is in the CH3 domain of the Fc domain. It is combined.

本明細書に概説したＦｃドメインタンパク質の構築物および配列のいくつかにおいて、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメントのＣ末端はドメインリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は定常ＦｃドメインのＮ末端に結合している（Ｎ−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメント−リンカー−Ｆｃドメイン−Ｃ）が、これはスイッチできる（Ｎ−Ｆｃドメイン−リンカー−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメント−Ｃ）。本明細書に概説される他の構築物および配列において、第１のタンパク質断片のＣ末端は、場合によりドメインリンカーを介して、第２のタンパク質断片のＮ末端に結合し、第２のタンパク質断片のＣ末端は、場合によりドメインリンカーを介して定常ＦｃドメインのＮ末端に結合する。本明細書に概説されるさらに他の構築物および配列において、第１のタンパク質断片または第２のタンパク質断片に結合していない定常Ｆｃドメインが提供される。ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、本明細書に記載の２つ以上の例示的なモノマーＦｃドメインタンパク質を含み得る。 In some of the Fc domain protein constructs and sequences outlined herein, the C-terminus of the IL-15 or IL-15Rα protein fragment binds to the N-terminus of the domain linker, which C-terminus is the N-terminus of the constant Fc domain. (N-IL-15 or IL-15Rα protein fragment-linker-Fc domain-C), but this can be switched (N-Fc domain-linker-IL-15 or IL-15Rα protein fragment-C) ). In other constructs and sequences outlined herein, the C-terminus of the first protein fragment binds to the N-terminus of the second protein fragment, optionally via a domain linker, of the second protein fragment. The C-terminus is optionally attached to the N-terminus of the constant Fc domain via a domain linker. In yet other constructs and sequences outlined herein, constant Fc domains that are not bound to a first protein fragment or a second protein fragment are provided. Heterodimer Fc fusion proteins may include two or more exemplary monomeric Fc domain proteins described herein.

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」であり、そのいくつかを図６に示す。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に１〜２〜３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、リンカーは荷電ドメインリンカーである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロダイマーＦｃドメイン融合ポリペプチドを形成する、２つの異なる重鎖バリアントＦｃ配列の使用に依存するヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供する。 In some embodiments, the linker is a "domain linker" used to link any two domains outlined herein together, some of which are shown in FIG. Any suitable linker can be used, but in many embodiments, for example, n is an integer of at least 1 (generally 1-2 to 3 to 4 to 5), (GS) n, (GSGGS). Glycine-serine polymers containing n, (GGGGS) n, and (GGGS) n, as well as two domains capable of recombinant binding with sufficient length and flexibility to allow each domain to retain its biological function. Utilize any peptide sequence. In some cases, the linker is a charged domain linker, paying attention to the "strandness" outlined below. Thus, in some embodiments, the invention provides a heterodimeric Fc fusion protein that relies on the use of two different heavy chain variant Fc sequences to self-assemble to form a heterodimeric Fc domain fusion polypeptide.

一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、それがｐＩ操作などのヘテロダイマーを生成するように操作することができる少なくとも２つの定常ドメインを含む。使用され得る他のＦｃドメインは、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジドメインのうちの１つ以上を含む断片を含む。特に、図５７Ａ〜５７Ｋに示すフォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であり、つまり、タンパク質が、ヘテロダイマーＦｃドメインに自己組織化した２つの関連Ｆｃ配列および少なくとも１つのタンパク質フラグメント（例えば、１、２またはそれ以上のタンパク質フラグメント）を有することを意味する。場合によっては、第１のタンパク質フラグメントは第１のＦｃ配列に連結し、第２のタンパク質フラグメントは第２のＦｃ配列に連結する。場合によっては、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、第１のＦｃ配列に連結している第２のタンパク質フラグメントに連結した第１のタンパク質フラグメント、および第１のまたは第２のタンパク質フラグメントのいずれにも連結していない第２のＦｃ配列を含む。 In one embodiment, the heterodimer Fc fusion protein comprises at least two constant domains that can be engineered to produce a heterodimer, such as a pI manipulation. Other Fc domains that may be used include fragments containing one or more of the pI-engineered CH1, CH2, CH3, and hinge domains of the invention. In particular, the format shown in FIGS. 57A-57K is a heterodimer Fc fusion protein, i.e., two related Fc sequences in which the protein is self-assembled into the heterodimer Fc domain and at least one protein fragment (eg, 1, 2). Or more protein fragments). In some cases, the first protein fragment is linked to the first Fc sequence and the second protein fragment is linked to the second Fc sequence. In some cases, the heterodimer Fc fusion protein is linked to either a first protein fragment linked to a second protein fragment linked to a first Fc sequence, and either a first or second protein fragment. Contains a second Fc sequence that is not.

本発明は、１つ以上の結合パートナー、リガンド、または受容体への結合を可能にするヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供するための新規構築物に関する。ヘテロダイマーＦｃ構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「ダイマー」に組み立てられる２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロダイマーＦｃ融合体は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各モノマーのアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、結合パートナー（複数可）またはリガンド（複数可）または受容体（複数可）をいくつかの方法で共結合することができるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の生成に関し、ヘテロダイマー形成を促進するために、かつ／またはホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに依存している。 The present invention relates to novel constructs for providing heterodimer Fc fusion proteins that allow binding to one or more binding partners, ligands, or receptors. The heterodimer Fc construct is based on the self-assembling nature of the two Fc domains of the antibody's heavy chain, eg, two "monomers" assembled into a "dimer". Heterodimer Fc fusions are made by altering the amino acid sequence of each monomer, as described in more detail below. Therefore, the present invention generally relates to the production of heterodimer Fc fusion proteins capable of co-binding a binding partner (s) or ligand (s) or receptor (s) in several ways. Relies on amino acid variants in different constant regions for each chain to facilitate and / or facilitate purification of heterodimers over homodimers.

本発明のヘテロダイマーを生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロダイマー化を確実にすることができる。したがって、ヘテロダイマーの産生をもたらすアミノ酸バリアントは、「ヘテロダイマー化バリアント」と呼ばれる。後述するように、ヘテロダイマー化バリアントは、ヘテロダイマーから離れてホモダイマーの精製を可能にする立体バリアント（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」バリアントおよび「電荷対」バリアント）ならびに「ｐＩバリアント」を含み得る。ＷＯ２０１４／１４５８０６（その全体が参照により、具体的には以下で「ヘテロダイマー化バリアント」の議論について本明細書に組み込まれ）に一般的に記載されているとおり、ヘテロダイマー化の有用なメカニズムには「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書でしばしば「スキュー」バリアントとして記載（ＷＯ２０１４／１４５８０６中の議論を参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載される「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるｐＩバリアント、およびＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説される一般的なさらなるＦｃバリアントが含まれる。 There are several mechanisms that can be used to generate the heterodimers of the invention. Moreover, as will be appreciated by those skilled in the art, these mechanisms can be combined to ensure high heterodimerization. Therefore, the amino acid variant that results in the production of heterodimers is referred to as the "heterodimerized variant." As described below, heterodimerized variants are steric variants that allow purification of homodimers away from heterodimers (eg, "knob-and-hole" or "skew" and "charge pair" variants described below) and "pI". Can include "variants". As generally described in WO2014 / 145806, which is incorporated herein by reference in its entirety for the discussion of "heterodimerization variants"), it is a useful mechanism for heterodimerization. Is "knob and hole" ("KIH", often described herein as a "skew" variant (see discussion in WO2014 / 145806), "electrostatic steering" or "charge pair" as described in WO2014 / 145806. , WO2014 / 145806, and WO2014 / 145806 and general additional Fc variants outlined below.

本発明において、ヘテロダイマータンパク質の精製を容易に引き起こすことができるいくつかの基本的メカニズムが存在し、その１つは、各モノマー、続いて各ダイマー種が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電精製が可能になるように、ｐＩバリアントの使用に依存する。代替的に、いくつかのフォーマットはまた、サイズに基づいて分離することも可能にする。以下にさらに概説するように、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロダイマー化バリアントおよびｐＩバリアントまたは電荷対バリアントの組み合わせは、本発明において特に使用される。 In the present invention, there are several basic mechanisms that can easily trigger the purification of heterodimer proteins, one of which is that each monomer, followed by each dimer species, has a different pI, thereby AA. , AB, and BB dimer proteins are dependent on the use of pI variants to allow isoelectric purification. Alternatively, some formats also allow separation based on size. It is also possible to "skew" the formation of heterodimers rather than homodimers, as further outlined below. Therefore, combinations of steric heterodimerized variants and pI variants or charge pair variants are particularly used in the present invention.

一般に、本発明において特に使用される実施形態は、２つのモノマー間および各ダイマー種間のｐＩ差を増加させる、ｐＩバリアントと組み合わせた、ホモダイマー形成に対するヘテロダイマー形成を促進するスキューバリアントを含むバリアントのセットに依存する。 In general, embodiments specifically used in the present invention are variants that include a skew variant that promotes heterodimer formation relative to homodimer formation in combination with a pI variant that increases the pI difference between the two monomers and between each dimer species. Depends on the set.

さらに、以下により完全に概説されるように、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質のフォーマットに応じて、ｐＩバリアントはモノマーの定常ドメインおよび／またはＦｃドメイン内に含まれるか、またはドメインリンカーが使用されるかのいずれかであり得る。すなわち、本発明は、一方または両方のモノマー上にあるｐＩバリアント、および／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。 In addition, depending on the format of the heterodimer Fc fusion protein, the pI variant is contained within the constant domain and / or Fc domain of the monomer, or a domain linker is used, as fully outlined below. It can be either. That is, the invention also provides pI variants and / or charged domain linkers that are on one or both monomers. In addition, additional amino acid manipulations for alternative functionality can also confer pI changes such as Fc, FcRn, and KO variants.

ヘテロダイマータンパク質の精製を可能にする分離メカニズムとしてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸バリアントを一方または両方のモノマーポリペプチドに導入することができる。すなわち、一方のモノマー（本明細書では簡潔さために「モノマーＡ」と呼ぶ）のｐＩは、モノマーＢから離れて操作されることができ、あるいはＡとＢの両モノマーは、モノマーＡのｐＩを増加させ、モノマーＢのｐＩを減少させるように変えることができる。論じられるように、いずれかまたは両方のモノマーのｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグルタミンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図に示す。 In the present invention, which utilizes pI as a separation mechanism that allows purification of heterodimer proteins, amino acid variants can be introduced into one or both monomeric polypeptides. That is, the pI of one monomer (referred to herein as "monomer A" for brevity) can be manipulated away from monomer B, or both monomers A and B are the pI of monomer A. Can be modified to increase and decrease the pI of monomer B. As discussed, pI changes in either or both monomers are by removing or adding charged residues (eg, replacing neutral amino acids with positively or negatively charged amino acid residues, eg glutamine to glutamic acid). Performed by changing the charged residue from positive or negative to the opposite charge (eg from aspartic acid to lysine) or by changing the charged residue to a neutral residue (eg loss of charge, from lysine to serine) can do. Some of these variants are shown in the figure.

したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロダイマーをホモダイマーから分離することができるように、少なくとも１つのモノマーに十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解され、かつ以下にさらに論じるように、これは「野生型」重鎖定常領域、およびそのｐＩを増加または減少させる（ｗｔＡ：Ｂ＋またはｗｔＡ：Ｂ−）ように操作されたバリアント領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋：Ｂ−またはＡ−：Ｂ＋）、実施できる。 Therefore, this embodiment of the present invention provides that at least one monomer undergoes a sufficient change in pI so that the heterodimer can be separated from the homodimer. As understood by those skilled in the art and further discussed below, this is a "wild-type" heavy chain constant region, and variants engineered to increase or decrease its pI (wtA: B + or wtA: B-). This can be done by using regions or by increasing one region and decreasing the other (A +: B- or A-: B +).

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、ダイマータンパク質のモノマーの両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）をモノマーの一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする定常領域におけるアミノ酸バリアントである。本明細書中の２つのホモダイマーからのヘテロダイマーの分離は、２つのモノマーのｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本発明において使用される。 Thus, in general, the components of some embodiments of the invention are amino acid substitutions ("pI variants" or "pI substitutions") of at least one isoelectric point (pI), if not both of the monomers of the dimer protein. ”) Is an amino acid variant in the constant region intended to be altered by incorporating it into one or both of the monomers. Separation of heterodimers from the two homodimers herein can be achieved when the pIs of the two monomers differ slightly from 0.1 pH units, 0.2, 0.3, 0.4, and 0. Anything that differs by 5 or more is used in the present invention.

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマーまたは両方のモノマー（複数可）に含まれるべきｐＩバリアントの数は、構成要素の出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どのモノマーを操作するか、またはどの「方向」（例えば、より陽性またはより陰性）かを決定するために、Ｆｃドメインの配列、場合によっては、Ｆｃドメインに連結するタンパク質ドメイン（複数可）が計算され、そこから決定がなされる。当技術分野において既知のとおり、異なるＦｃドメインおよび／またはタンパク質ドメインは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各モノマーの総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。 As will be appreciated by those skilled in the art, the number of pI variants that should be contained in each monomer or both monomers (s) for good separation will depend in part on the starting pI of the component. Let's do it. That is, the sequence of the Fc domain, and in some cases the protein domain (s) linked to the Fc domain, to determine which monomer to manipulate or which "direction" (eg, more positive or more negative). Is calculated and decisions are made from it. As is known in the art, different Fc domains and / or protein domains will have different starting pIs utilized in the present invention. Generally, as outlined herein, pI is engineered to result in a total pI difference of at least about 0.1 log of each monomer, 0.2-0.5 as outlined herein. Is preferable.

さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロダイマーはサイズに基づいてホモダイマーから分離することができる。図に示すように、例えば、フォーマットのいくつかは、サイズに基づいてヘテロダイマーおよびホモダイマーの分離を可能にする。 Moreover, in some embodiments, heterodimers can be separated from homodimers based on size, as understood by those skilled in the art and outlined herein. As shown, for example, some formats allow the separation of heterodimers and homodimers based on size.

ｐＩバリアントを使用してヘテロダイマー化を達成する場合、Ｆｃドメイン（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を設計および精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態において、ヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび精製ヘテロダイマー化バリアントを含む）を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低ｐＩの定常ドメインの解明、例えば、任意の特定の位置における非ヒト残基の最小化または回避である。 A more modular approach to designing and purifying heterodimeric Fc fusion proteins by using the constant region (s) of the Fc domain (s) when heterodimerization is achieved using the pI variant. Is provided. Therefore, in some embodiments, heterodimerized variants, including skew variants and purified heterodimerized variants, must be manipulated. Moreover, in some embodiments, the immunogenicity potential resulting from the pI variant is by introducing the pI variant from a different IgG isotype so that the pI changes without introducing significant immunogenicity. Significantly reduced. Therefore, a further problem to be solved is the elucidation of low pI constant domains with high human sequence content, eg, minimization or avoidance of non-human residues at any particular location.

このｐＩ操作で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加である。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。 A possible side benefit of this pI manipulation is also an increase in serum half-life and increased FcRn binding. That is, lowering the pI of antibody constant domains, including those found in antibody and Fc fusions, as described in USSN13 / 194,904, which is incorporated herein by reference in its entirety. It can result in longer serum retention in vivo. These pI variants for prolonging serum half-life also promote pI changes for purification.

さらに、ヘテロダイマー化バリアントのｐＩバリアントは、ホモダイマーが存在するとき、排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、Ｆｃ融合タンパク質の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与える。同様に、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の製造の再現性を確実に試験する能力は重要である。 In addition, the pI variant of the heterodimerized variant provides additional benefits to the Fc fusion protein analysis and quality control process, as the ability to eliminate, minimize, and distinguish in the presence of homodimers is significant. Similarly, the ability to reliably test the reproducibility of the production of heterodimer Fc fusion proteins is important.

Ａ．ヘテロダイマー化バリアント
本発明は、ヘテロダイマー形成および／またはホモダイマーからの精製を可能にするためにヘテロダイマーバリアントを利用する、様々なフォーマットのヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む、ヘテロダイマータンパク質を提供する。ヘテロダイマー融合構築物は、２つのＦｃドメイン、例えば、「ダイマー」に組み立てられる２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。 A. Heterodimerized Variants The present invention provides heterodimeric proteins, including heterodimeric Fc fusion proteins of various formats, that utilize heterodimer variants to allow heterodimer formation and / or purification from homodimers. The heterodimer fusion construct is based on the self-organizing nature of two Fc domains, eg, two "monomers" assembled into a "dimer".

ヘテロダイマー化スキューバリアントのセットのいくつかの好適な対がある。これらのバリアントは、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１のモノマーに組み込まれ、他のセットの対が第２のモノマーに組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方のモノマー上の残基と他方のモノマー上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」バリアントとして必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げる２つのモノマー間の境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロダイマーの割合を予想の５０％（２５％ホモダイマーＡ／Ａ：５０％ヘテロダイマーＡ／Ｂ：２５％ホモダイマーＢ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。 There are several suitable pairs of sets of heterodimerized skew variants. These variants are "pairs" of "sets". That is, one set of pairs is incorporated into the first monomer and the other set of pairs is incorporated into the second monomer. It should be noted that these sets do not necessarily behave as "knob-in-hole" variants that have a one-to-one correspondence between residues on one monomer and residues on the other. That is, the pair of these sets is expected to form the interface between two monomers that promote heterodimer formation and prevent homodimer formation, and predict the proportion of heterodimers that spontaneously form under biological conditions. 90% or more instead of% (25% homodimer A / A: 50% heterodimer A / B: 25% homodimer B / B).

Ｂ．立体バリアント
いくつかの実施形態において、ヘテロダイマーの形成は、立体バリアントの付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモダイマーを形成するよりもヘテロダイマー構造を形成する可能性が高い。好適な立体バリアントは、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図２９に含まれており、そのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、同様に図１Ａ〜１Ｅにも含まれる。 B. Three-dimensional variants In some embodiments, the formation of heterodimers can be facilitated by the addition of three-dimensional variants. That is, by changing the amino acids in each heavy chain, it is more likely that different heavy chains will associate to form a heterodimer structure rather than forming a homodimer having the same Fc amino acid sequence. Suitable three-dimensional variants are included in FIG. 29 of USSN15 / 141,350, all of which are incorporated herein by reference in their entirety, as well as in FIGS. 1A-1E.

１つのメカニズムは、当技術分野で一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロダイマー形成を有利にし、ホモダイマー形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸操作を指し、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載のとおりであり、それらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「モノマーＡ−モノマーＢ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロダイマー化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。 One mechanism, commonly referred to in the art as "knob and hole", refers to an amino acid manipulation that produces a steric effect that favors heterodimer formation and disadvantages homodimer formation, USSN61 / 596,846, Ridgway. et al. , Protein Engineering 9 (7): 617 (1996), Atwell et al. , J. Mol. Biol. As described in US Pat. No. 8,216,805, 1997270: 26, all of them are incorporated herein by reference in their entirety. These figures identify several "monomer A-monomer B" pairs that depend on "knob and hole". In addition, Merchant et al. , Nature Biotechnology. As described in 16: 677 (1998), these "knobs and hole" mutations can be combined with disulfide bonds to skew formation for heterodimerization.

ヘテロダイマーの生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロダイマー化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントと見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロダイマー化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「モノマーの対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。 Additional mechanisms used in the generation of heterodimers are incorporated herein by reference in their entirety, Gunasekaran et al. , J. Biol. Chem. As described in 285 (25): 19637 (2010), it is often referred to as "electrostatic steering". This is often referred to herein as a "charge pair". In this embodiment, electrostatics are used to skew the formation towards heterodimerization. As will be appreciated by those skilled in the art, these can also affect pI, ie purification, and can therefore also be considered as pI variants in some cases. However, since they were produced to force heterodimerization and were not used as a purification tool, they are classified as "stereovariant". These include D221E / P228E / L368E paired with D221R / P228R / K409R (eg, these are "corresponding sets of monomers") and C220E / P228E paired with C220R / E224R / P228R / K409R. / 368E is included, but not limited to these.

さらなるモノマーＡおよびモノマーＢのバリアントは、本明細書に概説されるｐＩバリアントまたはＵＳ２０１２／０１４９８７６（参照によりそのすべてが本明細書に明示的に組み込まれる）の図３７に示される他の立体バリアントなどの他のバリアントと、任意選択的に独立して任意の量で組み合わせることができる。 Additional Monomer A and Monomer B variants include the pI variant outlined herein or the other steric variant shown in FIG. 37 of US2012 / 0149876, all of which are expressly incorporated herein by reference. It can be arbitrarily combined with other variants in any amount independently.

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体バリアントは、任意のｐＩバリアント（またはＦｃバリアント、ＦｃＲｎバリアント等の他のバリアント）を一方または両方のモノマーに任意選択的に独立して組み込むことができ、本発明のタンパク質に独立して任意選択的に含むかまたは除外することができる。 In some embodiments, the steric variants outlined herein optionally and independently incorporate any pI variant (or other variant, such as an Fc variant, FcRn variant, etc.) into one or both monomers. It can be independently and optionally included or excluded from the proteins of the invention.

好適なスキューバリアントの一覧を図１Ａ〜１Ｅに示す。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択的に架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むが、これらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方のモノマーが二重バリアントセットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重バリアントセットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は出発ｐＩに依存する。 A list of suitable skew variants is shown in FIGS. 1A-1E. Particularly useful in many embodiments are S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / S A pair of sets including, but not limited to, S364K / E357Q and T366S / L368A / Y407V: T366W (optionally including crosslinked disulfides T366S / L368A / Y407V / Y349C: T366W / S354C). In terms of nomenclature, pair "S364K / E357Q: L368D / K370S" means that one monomer has a dual variant set S364K / E357Q and the other has a dual variant set L368D / K370S, as described above. In addition, the "strandness" of these pairs depends on the starting pI.

Ｃ．ヘテロダイマーのｐＩ（等電点）バリアント
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書に記載されるように、これらのバリアントのすべての組み合わせを使用することができる。一方のモノマーは野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さないバリアントであってもよく、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。あるいは、各モノマーは、１つはより塩基性に、１つはより酸性へと変化し得る。 C. Heterodimer pI (isoelectric point) variants As will be appreciated by those skilled in the art, there are two general categories of pI variants: those that increase protein pI (basic changes) and protein pI. There is something to reduce (acid change). All combinations of these variants can be used as described herein. One monomer may be wild-type or a variant that does not exhibit a significantly different pI from wild-type, and the other may be either more basic or more acidic. Alternatively, each monomer can change one to be more basic and one to be more acidic.

ｐＩバリアントの好ましい組み合わせはＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３０に示されており、そのすべてはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。 Preferred combinations of pI variants are shown in FIG. 30 of USSN15 / 141,350, all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Although these changes are shown in comparison to IgG1, as outlined herein and shown in the figure, all isotypes can be modified in this way, as do isotype hybrids. If the heavy chain constant domain is derived from IgG2-4, R133E and R133Q can also be used.

一実施形態では、Ｆｃモノマーの１つがＣＨ１ドメインを含む場合、ｐＩバリアントの好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較するときＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つのモノマーを有する。いくつかの例では、第２のモノマーは、（ＧＫＰＧＳ）４を含む、正荷電ドメインリンカーを含む。場合によっては、第１のモノマーは２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の場合）において、好ましい負のｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較するときＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。 In one embodiment, when one of the Fc monomers comprises a CH1 domain, the preferred combination of pI variants is the 208D / 295E / 384D / 418E / 421D variant (N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D when compared to human IgG1). Has one monomer containing. In some examples, the second monomer comprises a positively charged domain linker, including (GKPGS) 4 . In some cases, the first monomer comprises a CH1 domain containing position 208. Therefore, in constructs that do not contain the CH1 domain (eg, in the case of heterodimer Fc fusion proteins that do not utilize the CH1 domain in one of the domains), the preferred negative pI variant Fc set is the 295E / 384D / 418E / 421D variant (human). Includes Q295E / N384D / Q418E / N421D) when compared to IgG1.

いくつかの実施形態では、変異は、位置２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、および２３０を含む、Ｆｃドマン（ｄｏｍａｎ）のヒンジドメインで生じる。したがって、ｐＩ変異、特に置換は、本発明で使用されている１、２、３、４または５個の変異によって位置２１６〜２３０のうちの１つ以上で行うことができる。同様に、すべての可能な組み合わせが、単独で、または他のドメイン中の他のｐＩバリアントとともに企図されている。 In some embodiments, the mutations of Fc doman, including positions 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, and 230. Occurs in the hinge domain. Thus, pI mutations, especially substitutions, can be made at one or more of positions 216-230 with the 1, 2, 3, 4 or 5 mutations used in the present invention. Similarly, all possible combinations are contemplated alone or with other pI variants in other domains.

ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはトレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、および２３６位の欠失または非天然アラニンが含まれるがこれらに限定されない。場合によっては、ヒンジドメインにおいてはｐＩ置換のみが行われ、他の例では、これらの置換（複数可）は他のドメイン内の他のｐＩバリアントに任意の組み合わせで加えられる。 Specific substitutions used to lower the pI of the hinge domain include a deletion at position 221 or unnatural valine or threonine at position 222, a deletion at position 223, and unnatural glutamic acid at position 224 Deletions include, but are not limited to, deletions at position 235, and deletions at position 236 or unnatural alanine. In some cases, only pI substitutions are made in the hinge domain, and in other examples these substitutions (s) are added to other pI variants in other domains in any combination.

いくつかの実施形態では、位置２３３、２３４、２３５、２３６、２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４、および３３９を含むＣＨ２領域内に変異を生じさせることができる。２３３〜２３６における変化は、ＩｇＧ２骨格における（３２７Ａとともに）エフェクター機能を増加させるためになされ得ることに留意されたい。同様に、これら１４個の位置のすべての可能な組み合わせを作ることができ、例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＣＨ２のｐＩ置換を有していてもよい。 In some embodiments, mutations can occur within the CH2 region, including positions 233, 234, 235, 236, 274, 296, 300, 309, 320, 322, 326, 327, 334, and 339. Note that the changes in 233-236 can be made to increase effector function (along with 327A) in the IgG2 backbone. Similarly, all possible combinations of these 14 positions can be made, for example, a pI antibody of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 CH2 pIs. It may have a substitution.

ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、およびＣＨ２内および他のドメインとのすべての可能な組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。 Specific substitutions used to lower the pI of the CH2 domain include unnatural glutamine or glutamic acid at position 274, unnatural phenylalanine at position 296, unnatural phenylalanine at position 300, unnatural valine at position 309, 320. Unnatural glutamic acid at position 322, unnatural glutamic acid at position 326, unnatural glutamic acid at position 326, unnatural glycine at position 327, natural glutamic acid at position 334, unnatural threonine at position 339, and all within CH2 and with other domains. Possible combinations of, but not limited to.

この実施形態では、変異は位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４および４４７から独立して任意選択的に選択され得る。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸が含まれるがこれらに限定されない。ｐＩバリアントの例示的な実施形態は図２に提示されている。 In this embodiment, mutations can be arbitrarily selected independently of positions 355, 359, 362, 384, 389, 392, 397, 418, 419, 444 and 447. Specific substitutions used to lower the pI of the CH3 domain include unnatural glutamine or glutamic acid at position 355, unnatural serine at position 384, unnatural aspartic acid or glutamic acid at position 392, and unnatural methionine at position 397. , 419-position unnatural glutamic acid, 359-position unnatural glutamic acid, 362-position unnatural glutamic acid, 389-position unnatural glutamic acid, 418-position unnatural glutamic acid, 444-position unnatural glutamic acid, and 447-position deletion or Includes, but is not limited to, unnatural aspartic acid. An exemplary embodiment of the pI variant is presented in FIG.

Ｄ．アイソタイプバリアント
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られるモノマーのｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、バリアントＦｃ融合タンパク質のｐＩに顕著な影響を与えるためには、一般にいくつかのアミノ酸置換が必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。 D. Isotype Variants In addition, many embodiments of the invention rely on the "transfer" of pI amino acids at specific positions from one IgG isotype to another IgG isotype, thus introducing unwanted immunogenicity into the variant. Reduce or eliminate the possibility of Some of these are shown in Figure 21 of US Patent Application Publication No. 2014/0370013, which is incorporated herein by reference. That is, IgG1 is a common isotype of therapeutic antibody for a variety of reasons, including high effector function. However, the heavy constant region of IgG1 has a higher pI than that of IgG2 (8.10 vs. 7.31). By introducing an IgG2 residue into the IgG1 backbone at a particular position, the pI of the resulting monomer is reduced (or increased), exhibiting an even longer serum half-life. For example, IgG1 has glycine (pI 5.97) at position 137, IgG2 has glutamic acid (pI 3.22), and transfer of glutamic acid affects the pI of the resulting protein. As described below, some amino acid substitutions are generally required to significantly affect the pI of the variant Fc fusion protein. However, it should be noted that even changes in the IgG2 molecule allow an increase in serum half-life, as discussed below.

他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるか、または以下でさらに詳細に説明する安定性等のための構造の調整を可能にする。 In other embodiments, non-isotyped amino acid changes are made to reduce the overall charge state of the resulting protein (eg, by changing from high pI amino acids to low pI amino acids), or: Allows structural adjustment for stability, etc., described in more detail in.

さらに、重定常ドメインと軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロダイマーの各モノマーにおける顕著な変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。 In addition, by pI manipulation of both the heavy and light constant domains, significant changes can be seen in each monomer of the heterodimer. As discussed herein, the difference in pI between the two monomers by at least 0.5 results in ion exchange chromatography or isoelectric focusing, or separation by other methods sensitive to isoelectric points. It is possible.

Ｅ．ｐＩの計算
各モノマーのｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩおよび全モノマーのｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どのモノマーを操作するかは概して、各モノマーの固有のｐＩによって決定される。 E. Calculation of pI The pI of each monomer depends on the pI of the variant heavy chain constant domain and the pI of all monomers and may include the variant heavy chain constant domain and fusion partners. Therefore, in some embodiments, changes in pI are calculated based on the variant heavy chain constant domain using the chart of FIG. 19 of US Patent Application Publication No. 2014/0370013. As discussed herein, which monomer is manipulated is generally determined by the unique pI of each monomer.

Ｆ．インビボ結合により良好なＦｃＲｎも付与するｐＩバリアント
ｐＩバリアントがモノマーのｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。 F. PI variants that also confer good FcRn by in vivo binding If the pI variants reduce the pI of the monomer, they can have the additional advantage of improving serum retention in vivo.

まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、全体が参照により組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異体は、実際に血清濃度の低下および野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。 Although still under investigation, the Fc region is believed to have a longer half-life in vivo due to Fc sequestration upon binding to FcRn at pH 6 in endosomes (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today.18 (). 12): 592-598, the whole is incorporated by reference). The endosome compartment then recycles Fc to the cell surface. When the compartment opens into the extracellular space, a higher pH of about 7.4 induces the release of Fc into the blood. In mice, Dollar'Acqua et al. Showed that Fc variants with increased FcRn binding at pH 6 and pH 7.4 actually had reduced serum levels and the same half-life as wild-type Fc (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180, which is incorporated by reference in its entirety). The increased affinity of Fc for FcRn at pH 7.4 is believed to prevent the release of Fc into the blood. Thus, Fc mutations that increase the half-life of Fc in vivo ideally increase FcRn binding at lower pH while still allowing release of Fc at higher pH. The amino acid histidine changes its charge state in the pH range of 6.0-7.4. Therefore, it is not surprising to find His residues at important positions in the Fc / FcRn complex.

Ｇ．追加機能のための追加のＦｃバリアント
ｐＩアミノ酸バリアントに加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を改変すること、ＦｃＲｎ受容体への結合の改変等を含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾が存在する。 G. Additional Fc Variants for Additional Functions In addition to pI amino acid variants, a variety of, including, but not limited to, modifying binding to one or more FcγR receptors, modifying binding to FcRn receptors, and the like. There are several useful Fc amino acid modifications that can be performed for a reason.

したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩバリアントおよび立体バリアントを含む、本明細書に概説したヘテロダイマー化バリアントを含むアミノ酸修飾を含むことができる。バリアントの各セットは独立して任意選択的に特定のヘテロダイマータンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。 Thus, the proteins of the invention can include amino acid modifications including the heterodimerized variants outlined herein, including pI variants and steric variants. Each set of variants can be independently and optionally included in or excluded from a particular heterodimer protein.

Ｈ．ＦｃγＲバリアント
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を変更するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で使用されるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、それらのすべてはその全体が、具体的にはそこで開示されるバリアントが参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。 H. FcγR Variants Therefore, there are several useful Fc substitutions that can be performed to alter binding to one or more of the FcγR receptors. Substitutions that result in increased binding as well as reduced binding may be useful. For example, increased binding to FcγRIIIa generally results in ADCC (Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity, ie, non-specific cytotoxic cells expressing FcγR recognizing the binding antibody on the target cell, followed by It is known to bring about an increase in cell-mediated reactions) that cause lysis of target cells. Similarly, under some circumstances, reduced binding to FcγRIIb (inhibitory receptor) may also be beneficial. Amino acid substitutions used in the present invention include those listed in USSN11 / 124,620 (particularly FIG. 41), USSN11 / 174,287, USSN11 / 396,495, USSN11 / 538,406, among which All in their entirety, specifically the variants disclosed therein, are expressly incorporated herein by reference. The specific variants used include 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D / 332E, 267D, 267E, 328F, 267E / 328F, 236A / 332E, 239D / 332E / 330Y, 239D, 332E / 330L, 243A. 243L, 264A, 264V, and 299T are included, but not limited to.

さらに、ＦｃγＲＩＩｃに対する親和性を増加させるアミノ酸置換もまた、本明細書に概説されるＦｃドメインバリアントに含まれ得る。例えば、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０およびＵＳＳＮ１４／５７８，３０５に記載される置換は有用である。 In addition, amino acid substitutions that increase affinity for FcγRIIc may also be included in the Fc domain variants outlined herein. For example, the substitutions described in USSN11 / 124,620 and USSN14 / 578,305 are useful.

さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示される、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎへの結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。 In addition, 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L / 434S, 259I / 308F, 436I / 428L, 436I or There are additional Fc substitutions used to increase binding to FcRn and increase serum half-life, including but not limited to V / 434S, 436V / 428L, and 259I / 308F / 428L.

Ｉ．切除バリアント
同様に、機能性バリアントの別のカテゴリーは「ＦｃγＲ切除バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、さらなる作用機序を回避するために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去することが望ましい。つまり、例えば、多くの実施形態において、特に二機能性免疫調節性タンパク質の使用において、Ｆｃドメインのうちの１つが、１つ以上のＦｃγ受容体切除バリアントを含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ結合を切除してＡＤＣＣ活性を除去または顕著に減少させることが望ましい。これらの切除バリアントは、それらのすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３１に示されており、ＥＵインデックスに従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切除バリアントを用いる好ましい態様で、それぞれが独立して任意選択的に含まれるか除外することができる。本明細書で言及される切除バリアントは、ＦｃγＲ結合を切除するが、ＦｃＲｎ結合を切除しないことに留意されたい。 I. As with excision variants, another category of functional variants is the "FcγR excision variant" or "Fc knockout (FcKO or KO)" variant. In these embodiments, for some therapeutic uses, the Fc domain to one or more or all Fcγ receptors (eg, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, etc.) to avoid further mechanisms of action. It is desirable to reduce or eliminate the normal binding of. Thus, for example, in many embodiments, especially in the use of bifunctional immunomodulatory proteins, the FCγRIIIa binding is resected so that one of the Fc domains comprises one or more Fcγ receptor resection variants. It is desirable to eliminate or significantly reduce ADCC activity. These excision variants are shown in FIG. 31 of USSN15 / 141,350, all of which are incorporated herein by reference in their entirety, and according to the EU index, G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del. / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G / 232 In a preferred embodiment using the excision variants to be performed, each can be independently and optionally included or excluded. Note that the excision variants referred to herein excise the FcγR binding but not the FcRn binding.

Ｊ．ヘテロダイマーとＦｃバリアントの組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび／またはｐＩバリアントを含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「モノマー分割」を保持する限り、任意の方法で任意選択的に独立して組み合わせることができる。さらに、これらのバリアントはすべて、ヘテロダイマー化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。 J. Combination of Heterodimer and Fc Variants As will be appreciated by those skilled in the art, all of the listed heterodimerized variants (including skew variants and / or pI variants) are their "strandedness" or "monomers". As long as the "division" is retained, they can be arbitrarily and selectively combined independently in any way. Moreover, all of these variants can be combined with any of the heterodimerized formats.

ｐＩバリアントの場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つのモノマー間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。 In the case of pI variants, the embodiments specifically used are shown in the drawings, but other combinations can be produced according to the basic rule of varying the pI difference between the two monomers to facilitate purification.

さらに、ヘテロダイマー化バリアント、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で概説されるように、独立して任意選択的にＦｃ切除バリアント、Ｆｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントと組み合わせることができる。 In addition, any of the heterodimerized variants, skews, and pIs can be independently and optionally combined with Fc excision variants, Fc variants, and FcRn variants, as outlined herein.

さらに、モノマーＦｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳまたはＣ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むアミノ酸置換のセットを含み得る。 In addition, the monomeric Fc domain may include a set of amino acid substitutions including C220S / S267K / L368D / K370S or C220S / S267K / S364K / E357Q.

さらに、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、スキューバリアント（例えば、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０号の図１Ａ〜１Ｃ（それらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されるアミノ酸置換のセット）を含むことができ、特に有用なスキューバリアントは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択され（任意選択的に、架橋ジスフィルドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）、任意選択的に切除バリアント、任意選択的に荷電ドメインリンカー、および任意選択的にｐＩバリアントを含むことができる。 In addition, heterodimeric Fc fusion proteins are skew variants (eg, a set of amino acid substitutions shown in FIGS. 1A-1C of USSN15 / 141,350, all of which are incorporated herein by reference in their entirety). Particularly useful skew variants include S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K. : Selected from the group consisting of S364K / E357Q, T366S / L368A / Y407V: T366W, and T366S / L368A / Y407V: T366W (optionally including crosslinked disulfide T366S / L368A / Y407V / Y349C: T366W / S354). It can optionally include excision variants, optionally charged domain linkers, and optionally pI variants.

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵ付番による２３６Ｒ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｆ２４３Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｖ２５９Ｉ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ６７Ｋ、Ｓ２９８Ａ、Ｖ３０８Ｆ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｒ、３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓ、２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｆ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３Ｓ、Ｙ４３６Ｉ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３６Ｖ／Ｍ４２８Ｌ、Ｖ４３６Ｉ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。 In some embodiments, the Fc domains are EU numbered 236R, S239D, S239E, F243L, M252Y, V259I, S267D, S267E, S67K, S298A, V308F, L328F, L328R, 330L, I332D, I332E, M428L, N , N434S, 236R / L328R, S239D / I332E, 236R / L328F, V259I / V308F, S267E / L328F, M428L / N43S, Y436I / M428L, N436V / M428L, V436I / N434S, Y433V / 423S, / S54T / T256E, V259I / V308F / M428L, E233P / L234V / L235A / G236_ / S239K, E233P / L234V / L235A / G236_ / S239K / A327G, E233P / L234V / L234V / 235A / 235A Includes one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of / G236_ and E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K.

一実施形態では、本発明で使用されるスキューおよびｐＩバリアントの特定の組み合わせは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択的に、架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）であり、一方のモノマーがＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み他方が正荷電ドメインリンカーである。当技術分野において理解されるように、「ノブインホール」バリアントはｐＩを変化させず、したがってどちらのモノマーにも使用することができる。 In one embodiment, the particular combination of skew and pI variants used in the present invention is T366S / L368A / Y407V: T366W (optionally including crosslinked disulfides T366S / L368A / Y407V / Y349C: T366W / S354C). One monomer contains Q295E / N384D / Q418E / N481D and the other is a positively charged domain linker. As will be appreciated in the art, the "knob-in-hole" variant does not alter pI and can therefore be used with either monomer.

Ｖ．ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合モノマー
本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）−Ｆｃ融合モノマーを含む。場合によっては、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質ドメインは異なる向きにある。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合モノマーの例示的な実施形態は、図４Ａ〜４Ｅ、５Ａ〜５Ｄ、および８Ａ〜８Ｄを含むがこれらに限定されない図で提供される。 V. IL-15 / IL-15Rα-Fc Fusion Monomer The bifunctional heterodimer fusion protein of the invention comprises an IL-15 / IL-15 receptor α (IL-15Rα) -Fc fusion monomer. In some cases, the IL-15 and IL-15 receptor α (IL-15Rα) protein domains are oriented differently. Illustrative embodiments of the IL-15 / IL-15Rα-Fc fusion monomers are provided in diagrams including, but not limited to, FIGS. 4A-4E, 5A-5D, and 8A-8D.

いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−１５タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０００５７６．１または配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。場合によっては、ヒトＩＬ−１５のコード配列を、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０００５８５に示す。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロダイマータンパク質の例示的なＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸４９〜１６２を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列およびアミノ酸置換Ｎ７２Ｄを有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列ならびにＣ４２Ｓ、Ｌ４５Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｅ５３Ｃ、Ｅ８７Ｃ、およびＥ８９Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。場合により、ＩＬ−１５タンパク質はまたＮ７２Ｄ置換を有する。Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ−１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを有する。 In some embodiments, the human IL-15 protein has the amino acid sequence set forth in NCBI reference SEQ ID NO: NP_000576.1 or SEQ ID NO: 1. In some cases, the coding sequence for human IL-15 is shown in NCBI reference SEQ ID NO: NM_000585. An exemplary IL-15 protein of the Fc fusion heterodimer protein outlined herein can have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or amino acids 49-162 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-15 protein is at least 90%, eg, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% relative to SEQ ID NO: 2. , 99%, or more sequence identity. In some embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and the amino acid substitution N72D. In other embodiments, the IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of C42S, L45C, Q48C, V49C, L52C, E53C, E87C, and E89C. .. Optionally, the IL-15 protein also has an N72D substitution. The IL-15 protein of the Fc fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 amino acid substitutions. In some embodiments, the human IL-15 protein of the Fc fusion protein has an amino acid substitution N4D. In some embodiments, the human IL-15 protein of the Fc fusion protein has an amino acid substitution N65D. In some embodiments, the human IL-15 protein of the Fc fusion protein has an amino acid substitution of N4D / N65D. In some embodiments, the human IL-15 protein of the Fc fusion protein has an amino acid substitution D30N / E64Q / N65D.

いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。場合によっては、ヒトＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換を有さない。 In some embodiments, the human IL-15 protein of the Fc fusion protein is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some cases, human IL-15 protein does not have amino acid substitutions.

アミノ酸置換（複数可）は、ＩＬ−１５：ＩＬ−２βおよびＩＬ−１５：共通γ鎖の境界面での等配電子置換であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｑ１０８Ｅ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｑ１０８Ｅを有する。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅ置換を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄを有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを有する。 The amino acid substitution (s) can be an isometric electron substitution at the interface of the IL-15: IL-2β and IL-15: common γ chains. In some embodiments, the human IL-15 protein undergoes one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D, Q108E, and any combination thereof. Have. In some embodiments, the IL-15 protein has the amino acid substitution Q108E. In some cases, the IL-15 protein has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more amino acid substitutions. The IL-15 protein can have N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D, or Q108E substitutions. In some embodiments, the amino acid substitutions are N1D / D61N, N1D / E64Q, N4D / D61N, N4D / E64Q, D8N / D61N, D8N / E64Q, D61N / E64Q, E64Q / Q108E, N1D / N4D / D8N, D61N. / E64Q / N65D, N1D / D61N / E64Q, N1D / D61N / E64Q / Q108E, or N4D / D61N / E64Q / Q108E may be included. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution N4D. In certain embodiments, the IL-15 protein has the amino acid substitution N65D. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution N4D / N65D. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution D30N / E64Q / N65D.

いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿００２１８０．１または配列番号３に示したアミノ酸配列を有する。場合によっては、ヒトＩＬ−１５Ｒαのコード配列を、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿００２１８９．３に示す。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロダイマータンパク質の例示的なＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３のｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号３のアミノ酸３１〜９５）、換言すると、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＤ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、およびＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択されるアミノ酸挿入を有し、アミノ酸位置は完全長ヒトＩＬ−１５Ｒαタンパク質または配列番号３に対してである。例えば、Ｄ（例えばＡｓｐ）、Ｐ（例えばＰｒｏ）、Ａ（例えばＡｌａ）、ＤＰ（例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ）、ＤＣ（例えばＡｓｐ−Ｃｙｓ）、ＤＰＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ＤＰＣ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）、またはＤＣＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ）のようなアミノ酸は、配列番号４のＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＣ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＫ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０Ｃ、およびＬ４２Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、ここでアミノ酸位置は配列番号４に対してである。ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有することができる。 In some embodiments, the human IL-15 receptor α (IL-15Rα) protein has the amino acid sequence set forth in NCBI reference SEQ ID NO: NP_0021800.1 or SEQ ID NO: 3. In some cases, the coding sequence for human IL-15Rα is shown in NCBI reference SEQ ID NO: NM_002189.3. An exemplary IL-15Rα protein of the Fc fusion heterodimer protein outlined herein is the sushi domain of SEQ ID NO: 3 (eg, amino acids 31-95 of SEQ ID NO: 3), in other words, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Can include or consist of. In some embodiments, the IL-15Rα protein is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, D96, P97, A98, D96 / P97, D96 / C97, D96 / P97 / A98, D96 / P97 / C98, and D96 / C97. It has an amino acid insertion selected from the group consisting of / A98 and the amino acid position is for the full length human IL-15Rα protein or SEQ ID NO: 3. For example, D (eg Asp), P (eg Pro), A (eg Ala), DP (eg Asp-Pro), DC (eg Asp-Cys), DPA (eg Asp-Pro-Ala), DPC (eg Asp-Pro-Ala) , Asp-Pro-Cys), or DCA (eg, Asp-Cys-Ala) can be added to the C-terminus of the IL-15Rα protein of SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the IL-15Rα protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of K34C, A37C, G38C, S40C, and L42C, wherein the amino acids The position is relative to SEQ ID NO: 4. The IL-15Rα protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more amino acid mutations (eg, substitutions, insertions and / or deletions).

配列番号１は、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳである。 SEQ ID NO: 1 is MRISKPHLLSIQCYLLLLLSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIDEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCCKVTAMMKCFLLLELQVISLESGDASIHDTVENGELIILANNSLINGSSNGTEST.

配列番号２は、ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳである。 SEQ ID NO: 2 is NWVNVISDLKKIDELIQSMHIDATLYTESDVHPPSCKVTAMKCFLLLELQVISLESGDASIHDTVENLLIILANNSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSVFVHIVQMFINTS.

配列番号３は、ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＮＮＴＡＡＴＴＡＡＩＶＰＧＳＱＬＭＰＳＫＳＰＳＴＧＴＴＥＩＳＳＨＥＳＳＨＧＴＰＳＱＴＴＡＫＮＷＥＬＴＡＳＡＳＨＱＰＰＧＶＹＰＱＧＨＳＤＴＴＶＡＩＳＴＳＴＶＬＬＣＧＬＳＡＶＳＬＬＡＣＹＬＫＳＲＱＴＰＰＬＡＳＶＥＭＥＡＭＥＡＬＰＶＴＷＧＴＳＳＲＤＥＤＬＥＮＣＳＨＨＬである。 SEQ ID NO: 3 is a MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL.

配列番号４は、ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲである。 SEQ ID NO: 4 is ITCPPPMSVEHADIWVKSSYSLERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTPSLKCIR.

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。さらに他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＣ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。 In some embodiments, the IL-15 protein is attached to the N-terminus of the Fc domain and the IL-15Rα protein is attached to the N-terminus of the IL-15 protein. In other embodiments, the IL-15Rα protein is bound to the N-terminus of the Fc domain and the IL-15Rα protein is non-covalently bound to the IL-15 protein. In yet another embodiment, the IL-15Rα protein is bound to the C-terminus of the Fc domain and the IL-15Rα protein is non-covalently bound to the IL-15 protein.

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介してともに結合している。任意選択的に、タンパク質はリンカーを介して結合していない。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。任意選択的に、リンカーは、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質をＦｃドメインに結合するためには使用されない。 In some embodiments, the IL-15 protein and the IL-15Rα protein are bound together via a linker. Optionally, the protein is not bound via a linker. In other embodiments, the IL-15 and IL-15Rα proteins are non-covalently linked. In some embodiments, the IL-15 protein is linked to the Fc domain via a linker. In other embodiments, the IL-15Rα protein is linked to the Fc domain via a linker. Optionally, the linker is not used to bind the IL-15 or IL-15Rα protein to the Fc domain.

いくつかの例では、免疫チェックポイントＡＢＤはドメインリンカーなどのリンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。 In some examples, the immune checkpoint ABD is covalently attached to the N-terminus of the Fc domain via a linker such as a domain linker.

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に１〜２〜３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、荷電ドメインリンカーは、本明細書において考察し図６および７に示すように使用することができる。 In some embodiments, the linker is a "domain linker" used to concatenate any two domains outlined herein. Any suitable linker can be used, but in many embodiments, for example, n is an integer of at least 1 (generally 1-2 to 3 to 4 to 5), (GS) n, (GSGGS). Glycine-serine polymers containing n, (GGGGS) n, and (GGGS) n, as well as two domains capable of recombinant binding with sufficient length and flexibility to allow each domain to retain its biological function. Utilize any peptide sequence. In some cases, paying attention to the "strandenedness" outlined below, the charged domain linker can be used as discussed herein and shown in FIGS. 6 and 7.

ＶＩ．抗原結合ドメインモノマー
ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化に焦点を当てた治療方針は、癌の治療の臨床に大いに有望であり得る。癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力がないものと考えることができる。多くの場合、これらの形質転換した（例えば、癌性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内でのＴ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機構が存在し、これを、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免疫療法」と称されることもある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、およびＯｐｄｉｖｏ（登録商標）などいくつかのＴ細胞チェックポイント阻害抗体が近年承認されている。共刺激性と共抑制性の両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合することができると一般に理解されている。 VI. A therapeutic strategy that focuses on the proliferation and activation of antigen-binding domain monomer CD8 + T cells can be of great promise in the clinical setting of cancer treatment. Cancer can be thought of as the patient's inability to recognize and eliminate cancerous cells. Often, these transformed (eg, cancerous) cells react to immune surveillance. There are natural regulatory mechanisms that limit T cell activation in the body to prevent unlimited T cell activity, which can be utilized by cancerous cells to avoid or suppress the immune response. The purpose of immunotherapy is to restore the ability of immune effector cells, especially T cells, to recognize and eliminate cancer. The field of immunooncology, sometimes referred to as "immunotherapy," is evolving rapidly, with several T cell checks such as Yervoy®, Keytruda®, and Opdivo®. Point-inhibiting antibodies have been approved in recent years. It is generally understood that a variety of immunomodulatory signals, both co-stimulatory and co-inhibitory, can be used to integrate optimal antigen-specific immune responses.

本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞および／またはＩＬ−２Ｒβおよび共通γ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）を発現する細胞に結合する二機能性ヘテロダイマータンパク質の生成に関する。二機能性ヘテロダイマータンパク質は、免疫抗原または免疫細胞に結合できる任意の有用な抗体フォーマットの抗原結合性モノマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合モノマーは、Ｆｃドメインに連結したＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。 The present invention relates to the production of a bifunctional heterodimer protein that binds to immune cells such as CD8 + T cells or NK cells and / or cells expressing IL-2Rβ and a common γ chain (γc; CD132). Bifunctional heterodimeric proteins can include antigen-binding monomers in any useful antibody format capable of binding to immune antigens or immune cells. In some embodiments, the antigen binding monomer comprises a Fab or scFv linked to the Fc domain.

そのような抗原結合モノマーの例示的な実施形態は、図６６Ａ（ＸＥＮＰ２４１１４の鎖２および３）、図６６Ａ（ＸＥＮＰ２４１１５の鎖２および３）、図６６Ｂ（ＸＥＮＰ２４１１６の鎖２および３）、図６０Ａ（ＸＥＮＰ２４５３２の鎖２および３）、図６１Ａ（ＸＥＮＰ２４５３３の鎖２および３）、図６１Ａ（ＸＥＮＰ２４５３４の鎖２および３）、図７９Ａ（ＸＥＮＰ２４５４３の鎖２および３）、図７９Ａ（ＸＥＮＰ２４５４６の鎖２および３）、図７９Ｂ（ＸＥＮＰ２４５４７の鎖２および３）、および図７９Ｂ（ＸＥＮＰ２４５４８の鎖２および３）に提供されている。 Exemplary embodiments of such antigen-binding monomers are FIG. 66A (chains 2 and 3 of XENP24114), FIG. 66A (chains 2 and 3 of XENP24115), FIG. 66B (chains 2 and 3 of XENP24116), FIG. 60A ( XENP24532 chains 2 and 3), FIG. 61A (XENP24533 chains 2 and 3), FIG. 61A (XENP24534 chains 2 and 3), FIG. 79A (XENP24543 chains 2 and 3), FIG. 79A (XENP24546 chains 2 and 3). ), FIG. 79B (chains 2 and 3 of XENP24547), and FIG. 79B (chains 2 and 3 of XENP24548).

Ａ．標的抗原
本発明の標的化ヘテロダイマータンパク質は、Ｆｃドメインに融合した標的抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および異なるＦｃドメインに融合したＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαタンパク質ドメインを有する。好適な標的抗原には、ヒト（しばしばカニクイザル）ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｂが含まれる。いくつかの実施形態では、２つの異なる標的抗原（「標的対」）に結合する２つの異なるＡＢＤは、二価の二機能性フォーマットまたは三価の二機能性フォーマットのいずれかで存在する。したがって、好適な二機能性ＡＢＤは、ＣＤ８とＮＫＧ２Ａ、ＣＤ８とＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｄを結合する。さらに他の実施形態では、二機能性ヘテロダイマータンパク質は、二価の二機能性フォーマットまたは三価の二機能性フォーマットのいずれかで同じ標的抗原（「標的対」）に結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を有し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαタンパク質ドメインはタンパク質のＦｃドメインのうちの１つに融合した。 A. Targeted Antigen The targeted heterodimer protein of the invention has at least one antigen binding domain (ABD) that binds to the target antigen fused to the Fc domain, and an IL-15 / IL-15Rα protein domain fused to a different Fc domain. .. Suitable target antigens include human (often cynomolgus monkey) CD8, NKG2A, and NKG2B. In some embodiments, the two different ABDs that bind to two different target antigens (“target pairs”) are present in either a divalent bifunctional format or a trivalent bifunctional format. Therefore, a suitable bifunctional ABD binds CD8 and NKG2A, CD8 and NKG2D, or NKG2A and NKG2D. In yet another embodiment, the bifunctional heterodimer protein is two different antigens that bind to the same target antigen (“target pair”) in either a divalent bifunctional format or a trivalent bifunctional format. Having a binding domain (ABD), the IL-15 / IL-15Rα protein domain was fused to one of the Fc domains of the protein.

ＡＢＤは、ＦａｂフォーマットまたはｓｃＦｖフォーマットなどの様々なフォーマットであり得る。本発明で使用するための例示的なＡＢＤはＵＳ６２／３５３，５１１に開示されており、その内容はすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。 ABD can be in various formats such as Fab format or scFv format. An exemplary ABD for use in the present invention is disclosed in US62 / 353,511, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＣＤ８に結合する。ＣＤ８に結合する好適なＡＢＤは、二価抗体（ＸＥＮＰ１５０７６およびＸＥＮＰ１５２５１）、Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３１７）として図６５Ａ〜６５Ｆに、二価抗体（ＸＥＮＰ２４０２５）、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３２１）として図８１に、図８９（マウスおよびヒト化可変重ドメインおよび可変軽ドメインとして）に、二価抗体（ＸＥＮＰ１５０７５）として図９０に、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４９２０）として図９１に、図９５（バリアントヒト化可変重ドメインおよび可変軽ドメインとして）に示す。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、これらの図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８に結合するＡＢＤを含むモノマーは、非ブロッキング抗ＣＤ８アームとして作用することができる。 In some embodiments, one of the ABDs binds to CD8. Suitable ABDs that bind to CD8 are divalent antibodies (XENP15076 and XENP15251), Fab (XENP23647), one-arm Fab-Fc antibody (XENP24317) as shown in FIGS. 65A-65F, bivalent antibody (XENP24025), one-arm Fab-Fc antibody. FIG. 81 as (XENP24321), FIG. 89 (as mouse and humanized variable heavy domain and variable light domain), FIG. 90 as bivalent antibody (XENP15075), and FIG. 91 as one-arm Fab-Fc antibody (XENP24920). FIG. 95 (as variant humanized variable heavy domain and variable light domain) is shown. As will be appreciated by those skilled in the art, a suitable ABD can include a set of 6 CDRs as shown in these figures, as underlined. In some embodiments, the monomer containing ABD that binds to CD8 can act as a non-blocking anti-CD8 arm.

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＮＫＧ２Ａに結合する。ＮＫＧ２Ａに結合する好適なＡＢＤは、二価抗体（ＸＥＮＰ２４５４１およびＸＥＮＰ２４５４２）およびＦａｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）として図５８に示される。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、これらの図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。 In some embodiments, one of the ABDs binds to NKG2A. Suitable ABDs that bind to NKG2A are shown in FIG. 58 as divalent antibodies (XENP24541 and XENP24542) and Fabs (XENP24542). As will be appreciated by those skilled in the art, a suitable ABD can include a set of 6 CDRs as shown in these figures, as underlined.

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＮＫＧ２Ｄに結合する。ＮＫＧ２Ｄに結合する好適なＡＢＤを図５９（ＸＥＮＰ２４３６５）に示す。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、この図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。 In some embodiments, one of the ABDs binds to NKG2D. A suitable ABD that binds to NKG2D is shown in FIG. 59 (XENP24365). As will be appreciated by those skilled in the art, a suitable ABD can include a set of 6 CDRs as shown in this figure, as underlined.

さらに、本発明の抗体は、本明細書に概説した抗原結合ドメインと同一のエピトープに結合するか、または本明細書に概説した抗原結合ドメインとの結合について競合するかのいずれかのものを含む。いくつかの実施形態では、二機能性チェックポイント抗体は、本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つ、および本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つとの結合で競合する第２のＡＢＤを含み得る。いくつかの実施形態では、両方のＡＢＤが、本明細書で概説した対応するＡＢＤとの結合について競合する。結合の競合は一般に、本明細書に概説されるようにＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて決定される。 Further, the antibodies of the invention include either those that bind to the same epitope as the antigen binding domain outlined herein or that compete for binding to the antigen binding domain outlined herein. .. In some embodiments, the bifunctional checkpoint antibody is a second ABD that competes for binding to one of the ABDs outlined herein and one of the ABDs outlined herein. May include. In some embodiments, both ABDs compete for binding to the corresponding ABDs outlined herein. Binding competition is generally determined using the Biacore assay as outlined herein.

当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、一般的にＵＳ６２／３５３，５１１の図１に示すように、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。図５７Ａ〜５７Ｋを参照されたい。したがって、本発明は、免疫抗原とＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα結合パートナーを共結合する新規な免疫グロブリン組成物に関する。 The heterodimeric fusion proteins of the invention have a wide variety of configuration, as will be appreciated by those skilled in the art and will be described in more detail below, as generally shown in FIG. 1 of US62 / 353,511. Can be done. Some figures show a "single-ended" configuration, with one "arm" of the molecule having one type of specificity and the other "arm" having different specificities. The other figure shows a "dual-ended" configuration, with at least one type of specificity at the "top" of the molecule and one or more different specificities at the "bottom" of the molecule. See FIGS. 57A-57K. Therefore, the present invention relates to novel immunoglobulin compositions that co-bind an immune antigen with an IL-15 / IL-15Rα binding partner.

当業者には理解されるように、本発明のヘテロダイマーフォーマットは、異なる価数を有し得るとともに、二機能性であり得る。すなわち、本発明のヘテロダイマー抗体は二価および二機能性であることができ、一方の標的抗原は１つの結合ドメインにより結合され、他方の標的抗原は第２の結合ドメインにより結合される。ヘテロダイマー抗体はまた、三価および二機能性であり得、第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。 As will be appreciated by those skilled in the art, the heterodimer formats of the present invention may have different valences and may be bifunctional. That is, the heterodimeric antibody of the present invention can be bivalent and bifunctional, with one target antigen bound by one binding domain and the other target antigen bound by a second binding domain. Heterodimer antibodies can also be trivalent and bifunctional, with the first antigen bound by two binding domains and the second antigen bound by a second binding domain.

Ｂ．抗体
以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。本発明で使用される抗体は、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができ、本明細書に記載され図に示される従来の抗体、および抗体誘導体、断片および模倣物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、抗原結合ドメインおよびＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、本明細書に記載のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質とともに二機能性ヘテロダイマータンパク質を形成する。そのような二機能性ヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態には、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、およびＸＥＮＰ２４５４８が含まれるが、これらに限定されない。そのような二機能性ヘテロダイマータンパク質の例示的なフォーマットには、図５７Ａ〜５７Ｋに示すものが含まれるが、これらに限定されない。 B. Antibodies The term "antibodies" is commonly used, as discussed below. The antibodies used in the present invention can take several formats as described herein, the conventional antibodies described herein and shown in the drawings, and antibody derivatives, fragments and mimics. Including things. In some embodiments, the invention provides an antibody fusion protein comprising an antigen binding domain and an Fc domain. In some embodiments, the antibody fusion protein forms a bifunctional heterodimer protein with the IL-15 / IL-15Rα Fc fusion proteins described herein. Exemplary embodiments of such bifunctional heterodimer proteins include, but are not limited to, XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, and XENP24548. Exemplary formats of such bifunctional heterodimer proteins include, but are not limited to, those shown in FIGS. 57A-57K.

従来の抗体構造単位は、典型的にはテトラマーを含む。各テトラマーは、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。本発明は概して、ＩｇＧクラスに基づく抗体または抗体断片（抗体モノマー）に関し、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。 Traditional antibody structural units typically include tetramers. Each tetramer typically consists of two identical polypeptide chain pairs, each pair having one "light" chain (typically a molecular weight of about 25 kDa) and one "heavy". It has a chain (typically a molecular weight of about 50-70 kDa). Human light chains are classified as κ light chains and λ light chains. The present invention generally relates to antibodies or antibody fragments (antibody monomers) based on the IgG class, which have several subclasses including, but not limited to, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. In general, IgG1, IgG2, and IgG4 are used more frequently than IgG3. It should be noted that IgG1 has different allotypes with polymorphisms at 356 (D or E) and 358 (L or M). The sequences illustrated herein use 356D / 358M allotypes, but other allotypes are included herein. That is, any sequence comprising the IgG1 Fc domain included herein can have 356E / 358L instead of the 356D / 358M allotype.

さらに、本明細書中の配列の多くは、位置２２０の少なくとも１つのシステインをセリンで置換したものであり、これは一般に、本明細書に記載の配列の大部分について「ｓｃＦｖモノマー」側にあるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂモノマー」側、またはその両方にすることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置換されたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。 In addition, many of the sequences herein have at least one cysteine at position 220 replaced with serine, which is generally on the "scFv monomer" side for most of the sequences described herein. However, it can also be on the "Fab monomer" side, or both, to reduce disulfide formation. Specifically included in the sequences herein are those in which one or both of these cysteines have been substituted (C220S).

したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ工学を包含し、これは参照により本明細書に組み込まれる。 Thus, as used herein, "isotype" means any subclass of immunoglobulins defined by the chemical and antigenic characteristics of their constant regions. It should be understood that therapeutic antibodies may also include hybrids of isotypes and / or subclasses. For example, as set forth in U.S. Patent Application Publication No. 2009/0163699, the present invention includes pI engineering of IgG1 / G2 hybrids, which is incorporated herein by reference.

超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそ、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ （１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。 Hypervariable regions generally include amino acid residues 24-34 (LCDR1, "L" stands for light chain), 50-56 (LCDR2), and 89-97 (LCDR3), as well as heavy in the light chain variable region. In the chain variable region, amino acid residues (Kabat et al., SEQENCES OF) from approximately 31-35B (HCDR1, "H" stands for heavy chain), 50-65 (HCDR2), and 95-102 (HCDR3). PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) and / or residues forming a hypervariable loop (eg, 26-32 residues in a hypervariable loop Includes LCDR1), 50-52 (LCDR2), and 91-96 (LCDR3), as well as 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2), and 96-101 (HCDR3) in the heavy chain variable region (Chothia). and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Specific CDRs of the invention are described below.

当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ付番の有用な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
As will be appreciated by those skilled in the art, the exact numbering and placement of CDRs may differ in different numbering systems. However, it should be understood that the disclosure of variable heavy chains and / or variable light chains includes disclosure of relevant (unique) CDRs. Therefore, the disclosure of each variable heavy region is the disclosure of vhCDRs (eg, vhCDR1, vhCDR2, and vhCDR3), and the disclosure of each variable light region is the disclosure of vlCDRs (eg, vlCDR1, vlCDR2, and vlCDR3). A useful comparison of CDR numbering is as follows: Lafranc et al. , Dev. Comp. Immunol. 27 (1): 55-77 (2003).

本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上述（１９９１））。 Throughout the specification, the Kabat numbering system is generally used to refer to residues within the variable domain (approximately residues 1-107 of the light chain variable region and residues 1-113 of the heavy chain variable region). The EU numbering system is for the Fc region (eg, Kabat et al., Supra (1991)).

重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書では、２１６位（ＩｇＧ１中のＥ２１６）〜２３０位（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように定義され、付番はＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスによる。場合によっては、「ヒンジフラグメント」が使われ、それは、ヒンジドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方でより少ないアミノ酸を含む。本明細書に記載のとおり、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。 Another type of heavy chain Ig domain is the hinge region. As used herein, the term "hinge" or "hinge region" or "antibody hinge region" or "hinge domain" means a mobile polypeptide comprising amino acids between the first and second constant domains of an antibody. Structurally, the IgG CH1 domain ends at EU position 215 and the IgG CH2 domain begins at residue EU position 231. Thus, for IgG, antibody hinges are defined herein to include positions 216 (E216 in IgG1) to 230 (P230 in IgG1), numbered by EU index as in Kabat. .. In some cases, a "hinge fragment" is used, which contains less amino acids at either or both of the N-terminus and C-terminus of the hinge domain. As described herein, pI variants can be made in the hinge region as well.

軽鎖は、一般に、可変軽ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重ドメインとともにＦｖ領域を形成する）、および定常軽領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。 The light chain generally comprises two domains: a variable light domain (containing a light chain CDR and forming an Fv region with a variable heavy domain) and a constant light domain (often referred to as CL or Cκ).

上に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。 Another target region for the additional substitutions outlined above is the Fc region.

本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲおよび３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重および可変軽ドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。 The present invention provides a number of different CDR sets. In this case, the "complete CDR set" includes three variable light chain CDRs and three variable heavy chain CDRs such as vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 and vhCDR3. These can be part of a larger variable light or variable heavy domain, respectively. Moreover, as fully outlined herein, variable weight and variable light domains are separate polypeptide chains when heavy and light chains are used (eg, when Fabs are used). It can be on top, or in the case of scFv sequences, on a single polypeptide chain.

ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。 CDRs contribute to the formation of antigen binding, or more specifically, the formation of epitope binding sites for antibodies. "Epitope" refers to a determinant that interacts with a specific antigen binding site within the variable region of an antibody molecule known as a paratope. Epitopes are groups of molecules such as amino acids or sugar side chains and usually have specific structural and specific charge properties. A single antigen may have more than one epitope.

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。 Epitopes are amino acid residues that are directly involved in binding (also referred to as the immunodominant component of the epitope) and other amino acid residues that are not directly involved in binding, such as amino acids that are effectively blocked by a specific antigen-binding peptide. Residues, in other words, may include amino acid residues within the footprint of a specific antigen-binding peptide.

エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。 The epitope may be either conformational or linear. Conformational epitopes are created by spatial juxtaposition of amino acids from different segments of a linear polypeptide chain. Linear epitopes are created by adjacent amino acid residues within the polypeptide chain. Conformational epitopes and non-conformational epitopes can be distinguished in that they lose their binding to the former in the presence of a denaturing solvent, but not the latter.

エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。 Epitopes typically contain at least 3, more generally at least 5, or 8-10 amino acids within a unique spatial conformation. Antibodies that recognize the same epitope can be validated in a simple immune assay that exhibits the ability of one antibody to block the binding of another antibody to a target antigen, eg, "binning." As outlined below, the invention includes not only the listed antigen-binding domains and the antibodies herein, but also those that compete for binding to epitopes bound by the listed antigen-binding domains.

したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において既知のとおり、本発明のヘテロダイマー抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。 Therefore, the present invention provides different antibody domains. As described herein and known in the art, the heterodimeric antibodies of the invention contain different domains within the heavy and light chains, which can also overlap. These domains are Fc domain, CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain, hinge domain, heavy constant domain (CH1-hinge-Fc domain or CH1-hinge-CH2-CH3), variable heavy domain, variable light domain, light constant. Includes, but is not limited to, domains, Fab domains, and scFv domains.

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、任意選択的にヒンジドメイン（−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、これは、ＣＨ１−任意選択のＣＨ２−ＣＨ３を含むヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説した構築物および配列のほとんどにおいて、可変重鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は可変軽鎖のＮ末端に結合している（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、これはスイッチできる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。 Thus, the "Fc domain" includes the -CH2-CH3 domain, optionally the hinge domain (-H-CH2-CH3). In embodiments herein, when scFv is attached to the Fc domain, it is the C-terminus of the scFv construct that is attached to all or part of the hinge of the Fc domain, eg, it is generally the beginning of the hinge. Is bound to the sequence EPKS. The heavy chain comprises a variable heavy domain and a constant domain, which includes a hinge-Fc domain containing CH1-optional CH2-CH3. Light chains include variable light chains and light constant domains. The scFv comprises a variable heavy chain, a scFv linker, and a variable light domain. In most of the constructs and sequences outlined herein, the C-terminus of the variable heavy chain is attached to the N-terminus of the scFv linker, which C-terminus is attached to the N-terminus of the variable light chain (N-vh-linker). -Vl-C), but this can be switched (N-vr-linker-vh-C).

本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然に生じないが、ｓｃＦｖリンカーによってともに連結した可変重ドメインと可変軽ドメインとを一般に含む。本明細書に概説するように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、Ｎ末端からＣ末端方向にｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌであるが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のｖｈおよびｖｌ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて片端または両端の任意のリンカーを用いて、ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈへと逆転させることができる（一般的に図５７Ａ−５７Ｋを参照されたい。）。 Some embodiments of the invention include at least one scFv domain, which does not occur naturally, but generally comprises a variable heavy domain and a variable light domain that are linked together by an scFv linker. As outlined herein, the scFv domain is generally vh-scFv linker-vr from the N-terminus to the C-terminus, but this uses the scFv domain (or the vh and vl sequences from Fab). For any of the domains constructed in), it can be reversed to vl-scFv linker-vh using any linker at one end or both ends, depending on the format (generally see Figure 57A-57K). I want to.).

本明細書に示されるように、好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用）にはいくつかあり、列挙されたドメインに共有結合（組み換え技術により生成される従来型ペプチド結合を含む）するために使用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が使用されている。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。例示的なドメインリンカーを図６に示す。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得る。 As shown herein, there are several suitable linkers (used as either domain linkers or scFv linkers) that covalently bind to the listed domains, including conventional peptide bonds generated by recombinant techniques. ) Can be used to. In some embodiments, the linker peptide may predominantly contain the following amino acid residues Gly, Ser, Ala, or Thr. The linker peptides should be long enough to bind the two molecules in such a way that they are in the correct conformation to each other so that they retain the desired activity. In one embodiment, the linker is about 1-50 amino acids long, preferably about 1-30 amino acids long. In one embodiment, a linker having a length of 1 to 20 amino acids may be used, and in some embodiments, about 5 to about 10 amino acids are used. Useful linkers include, for example, (GS) n, (GSGGS) n (SEQ ID NO: XX), (GGGGS) n (SEQ ID NO: XX), and (GGGS) n (SEQ ID NO: XX), (n is at least 1 (n). And generally include glycine-serine polymers, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other mobile linkers, including (which is an integer of 3-4). An exemplary domain linker is shown in FIG. Alternatively, various non-proteinogenic polymers including, but not limited to, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylene, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol can be useful as linkers.

他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではなく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基は含まない場合がある。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。 Other linker sequences include any sequence of the CL / CH1 domain of any length, but not all residues of the CL / CH1 domain, eg, the first 5-12 amino acids of the CL / CH1 domain. May contain no residues. The linker can be derived from an immunoglobulin light chain, such as Cκ or Cλ. The linker can be derived from any isotype of immunoglobulin heavy chain, including, for example, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, and Cμ. The linker sequence may also be derived from other proteins such as Ig-like proteins (eg, TCR, FcR, KIR), hinge region-derived sequences, and other naturally occurring sequences from other proteins.

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあり、別の任意のドメインリンカーはｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合している（ただし、多くの実施形態では、このドメインリンカーとしてヒンジが使用される）。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むドメインリンカーとしてグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーを使用することができる。 In some embodiments, the linker is a "domain linker" used to concatenate any two domains outlined herein. For example, there is a domain linker that binds the C-terminus of the CH1 domain of Fab to the N-terminus of scFv, and another arbitrary domain linker binds the C-terminus of scFv to the CH2 domain (although in many embodiments, A hinge is used as this domain linker). Any suitable linker can be used, but in many embodiments, for example, n is an integer of at least 1 (generally 3-4-5), (GS) n, (GSGGS) n, (GGGGSS). ) N, and a glycine-serine polymer as a domain linker containing (GGGS) n, as well as allowing recombination of two domains with sufficient length and flexibility to allow each domain to retain its biological function. Use any peptide sequence to be used. In some cases, a charged domain linker can be used, as used in some embodiments of the scFv linker, paying attention to the "strandenedness" outlined below.

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で考察されるｖｈおよびｖｌドメインを共有結合するために使用されるｓｃＦｖリンカーである。したがって、本発明はさらに、第１のモノマーと第２のモノマーとの間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なるモノマーに対してｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、Ｆｃドメインをさらに変化させずに、荷電リンカーを含むモノマーはｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」またはモノマー上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、トリプルＦフォーマットヘテロダイマー抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。 In some embodiments, the linker is an scFv linker used to covalently bind the vh and vr domains discussed herein. Therefore, the present invention further provides a charged scFv linker to facilitate the separation of pI between the first and second monomers. That is, by incorporating either a positive or negative charged scFv linker (or both for scaffolds that use scFv for different monomers), the monomer containing the charged linker is pI without further altering the Fc domain. Allows you to change. These charged linkers can be substituted in any scFv containing standard linkers. Also, as will be appreciated by those skilled in the art, charged scFv linkers are used on the correct "chain" or monomer according to the desired change in pI. For example, to make a triple F format heterodimer antibody, as discussed herein, the original pI of the Fv region for each of the desired antigen binding domains is calculated, and to make scFv 1 One is selected and either a positive or negative linker is selected, depending on the pI.

荷電ドメインリンカーを使用して発明のモノマーのｐＩ分離を増加させることもでき、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することもできる。特に、図５７Ａ〜５７Ｋに示すフォーマットは抗原結合タンパク質を含み、通常「ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質」と呼ばれ、タンパク質が、ヘテロダイマーＦｃドメインに自己組織化した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてであるかｓｃＦｖとしてであるかを問わず、少なくとも１つ以上のＦｖ領域を有することを意味する。 A charged domain linker can also be used to increase the pI separation of the monomers of the invention, or can be used in any embodiment herein in which the linker is utilized. In particular, the formats shown in FIGS. 57A-57K include antigen-binding proteins, commonly referred to as "heterodimer Fc fusion proteins," where the proteins are self-assembled into the heterodimeric Fc domain as at least two related Fc sequences and Fabs. It means that it has at least one or more Fv regions, regardless of whether it is as scFv or scFv.

Ｃ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体に由来し得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列でスワップされた、非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト由来のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部またはすべてがコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークにグラフティングして、その特異性がグラフティングされたＣＤＲによって決定される抗体を作製する。そのような抗体の生成は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載され、参照により全体が組み込まれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆変異」が、最初の移植された構築物において失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、参照により全体が組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、通常は全部を含み、したがって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて生成され得る。Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４、参照により全体が本明細書に組み込まれる。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法は、当技術分野で周知である（参照により全体が組み込まれる、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。ヒト化方法には、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：１００２９−３３、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５、Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１−８に記載される方法が含まれ、参照により全体が組み込まれる。ヒト化、または非ヒト抗体の可変領域の免疫原性を低下させる他の方法には、例えば、参照により全体が組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が含まれ得る。特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（すなわち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって、そのようなものとして特定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０個以下のアミノ酸差しか示さない（本明細書中の任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５個以下、またはさらには４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸差しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。一実施形態では、親抗体は、当技術分野で既知のとおり、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含むがこれらに限定されない選択に基づく方法が抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために使用でき、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみを移植することを含んでもよく、これには、参照によりすべての内容が組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれるがこれらに限定されない。 C. Chimeric and humanized antibodies In some embodiments, the antibodies herein can be derived from mixtures from different species, such as chimeric and / or humanized antibodies. In general, both "chimeric antibody" and "humanized antibody" refer to an antibody that combines regions from two or more species. For example, a "chimeric antibody" traditionally comprises a variable region (s) derived from a mouse (or rat in some cases) and a constant region (s) derived from a human. "Humanized antibody" generally refers to a non-human antibody in which the variable domain framework region is swapped with the sequences found in the human antibody. In general, in humanized antibodies, the entire antibody, excluding the CDR, is identical to such antibody except within the CDR, which is encoded by a human-derived polynucleotide. CDRs encoded in part or in whole by nucleic acids originating from non-human organisms are graphed into the beta sheet framework of the human antibody variable region, and the specificity of the graphed antibody is determined by the CDR. To make. The production of such antibodies is described, for example, in WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al. , 1988, Science 239: 1534-1536, which is incorporated by reference in its entirety. A "reverse mutation" of the selected acceptor framework residues to the corresponding donor residues is often required to restore the lost affinity in the first transplanted construct (US 5530101, US 5585089). , US5693761, US5693762, US6180370, US5859205, US5821337, US605427, US6407213, incorporated by reference in its entirety). The humanized antibody will also optimally contain at least a portion, usually all, of an immunoglobulin constant region, typically a human immunoglobulin constant region, and thus typically a human Fc region. .. Humanized antibodies can also be produced using mice with a genetically engineered immune system. Roque et al. , 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654, which is incorporated herein by reference in its entirety. Various techniques and methods for humanizing and reforming non-human antibodies are well known in the art (incorporated in their entirety by reference, Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology, Elsevier). , 533-545, Elsevier Science (USA), and references cited therein). For humanization methods, see Jones et al. , 1986, Nature 321: 522-525, Richmann et al. , 1988, Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al. , 1988, Science, 239: 1534-1536, Queen et al. , 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86: 12002-33, He et al. , 1998, J. et al. Immunol. 160: 1029-1035, Carter et al. , 1992, Proc Natl Acad Sci USA89: 4285-9, Presta et al. , 1997, Cancer Res. 57 (20): 4593-9, Gorman et al. , 991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 4181-4185, O'Connor et al. , 1998, Protein Eng 11: 321-8, which is incorporated by reference in its entirety. Humanization, or other methods of reducing the immunogenicity of the variable region of a non-human antibody, are described, for example, by reference to Roguska et al. , 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. Surface reconstruction methods such as those described in USA 91: 969-973 may be included. In certain embodiments, the antibodies of the invention comprise a heavy chain variable region derived from a particular germline heavy chain immunoglobulin gene and / or a light chain variable region derived from a particular germline light chain immunoglobulin gene. For example, such antibodies may include or consist of human antibodies that contain heavy or light chain variable regions that are or are "derived from" a particular germline sequence. Human antibodies that are or are "derived from" the human germline immunoglobulin sequence compare the amino acid sequence of the human antibody with the amino acid sequence of the human germline immunoglobulin and in the sequence of the human antibody. It can be identified as such by selecting the human germline immunoglobulin that has the closest sequence (ie, the highest% identity). Human antibodies that are or are "derived from" a particular human germline immunoglobulin sequence are, for example, due to the deliberate introduction of naturally occurring somatic or site-specific mutations. May contain differences in amino acids compared to germline sequences. However, humanized antibodies are typically at least 90% identical in amino acid sequence to the amino acid sequence encoded by the human germline immunoglobulin gene, and germline immunoglobulin amino acid sequences of other species (eg, eg). Contains amino acid residues that identify the antibody as derived from the human sequence when compared to the mouse germline sequence). In certain cases, humanized antibodies are at least 95, 96, 97, 98 or 99%, or at least 96%, 97%, 98 in the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene. %, Or up to 99% can be the same. Typically, a humanized antibody derived from a particular human germline sequence indicates only an amino acid sequence encoded by a human germline immunoglobulin gene and no more than 10 to 20 amino acids (in the specification). Prior to the introduction of any skew variant, pI variant, and excision variant of, i.e., prior to the introduction of the variants of the invention, the number of variants is generally small). In certain cases, the humanized antibody may indicate no more than 5 or even 4, 3, 2, or 1 amino acid sequence to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene. (Similarly, prior to the introduction of any skew variant, pI variant, and excision variant herein, ie, prior to the introduction of the variants of the invention, the number of variants is generally small). In one embodiment, the parent antibody is affinity matured, as is known in the art. Structure-based methods can be used for humanization and affinity maturation, for example, as described in USSN11 / 004,590. Wu et al. , 1999, J.M. Mol. Biol. 294: 151-162; Baca et al. , 1997, J. Mol. Biol. Chem. 272 (16): 10678-10684; Rosok et al. , 1996, J. Mol. Biol. Chem. 271 (37): 22611-22618; Radar et al. , 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al. , 2003, Protein Engineering 16 (10): 753-759, selection-based methods including, but not limited to, can be used for humanization and / or affinity maturation of antibody variable regions. All are incorporated herein by reference. Other humanization methods may include transplanting only a portion of the CDR, which incorporates all content by reference, USSN09 / 810,510, Tan et al. , 2002, J. Immunol. 169: 1119-1125, De Pascalis et al. , 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084 includes, but is not limited to, the methods described.

ＶＩＩ．本発明の有用な実施形態
図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、本発明の二重特異性ヘテロダイマー融合タンパク質のいくつかの有用なフォーマットが存在する。一般に、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、３つの機能性成分：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）成分、抗原結合ドメイン成分（例えば、抗ＣＤ８成分、抗ＮＫＧ２Ａ成分、抗ＮＫＧ２Ｄ成分）、およびＦｃ成分を有し、本明細書で概説されるようにそれぞれが異なる形態をとることができ、それぞれが任意の立体配置で他の構成要素と組み合わせることができる。 VII. Useful Embodiments of the Invention As shown in FIGS. 57A-57K, there are several useful formats of the bispecific heterodimer fusion proteins of the invention. In general, the heterodimeric fusion proteins of the invention have three functional components: IL-15 / IL-15Rα (sushi) component, antigen binding domain component (eg, anti-CD8 component, anti-NKG2A component, anti-NKG2D component), and They have Fc components, each of which can take different forms as outlined herein, and each can be combined with other components in any configuration.

第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による、ａ）Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、ｂ）Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｃ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｄ）Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｅ）Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、ｆ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびｇ）Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。 The first and second Fc domains are according to EU numbering: a) S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, b) S364K / E357Q: L368D / K370S, c) L368D / K370S: S364K, d) It can have a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of L368E / K370S: S364K, e) T411T / K360E / Q362E: D401K, f) L368D / K370S: S364K / E357L, and g) K370S: S364K / E357Q. ..

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。 In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering.

任意選択的に、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。 Optionally, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del.

任意選択的に、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、半減期延長のために４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを有する。 Optionally, the first and / or second Fc domain has a 428L / 434S variant for half-life extension.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ
一実施形態は図５７Ａに示されており、２つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にもドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表し、共有結合リンカーを用いたＩＬ−１５およびｓｕｓｈｉドメインの結合を指す。 scIL-15 / Rα × scFv
One embodiment is shown in FIG. 57A and comprises two monomers. The first monomer contains sushi domain-domain linker-IL-15-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, and the second monomer is vh-scFv linker-vr-hinge-CH2. Includes -CH3 or vl-scFv linker-vh-hinge-CH2-CH3, but domain linkers can be substituted for hinges in either direction. This is commonly referred to as "scIL-15 / Rα x scFv", where "sc" stands for "single chain" and refers to the binding of IL-15 and sushi domains using a covalent linker.

図５７Ａについて、「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマットは、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの他方側に融合している。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２５１３７であり得る。 For FIG. 57A, the "scIL-15 / Rα x scFv" format includes IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 by a variable length linker (referred to as "scIL-15 / Rα"), which is then heterozygous. It is fused to the N-terminus of the dimer Fc region and the scFv is fused to the other side of the heterodimer Fc. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP25137.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the scIL-15 / Rα × scFv format, one preferred embodiment utilizes skew variants vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the scIL-15 / Rα × scFv format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on the scFv-Fc monomer) and L368D / K370S (on the IL-15 complex monomer), the pI variant Q295E. / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally bilateral 428L / 434S variants are utilized.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（鎖１）、ＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）、ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖３）、およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖４）の配列を有する。 In the scIL-15 / Rα × scFv format, one preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 92C, human_IL15Rα (Sushi) _Fc (216) _IgG1_pI (-) _iso-distributed electron _A_C220S / PVA_ / S267K / L368D / K370SIL-15Rα (sushi) -Fc chain (chain 1), IL15_D30N / E64Q / N65D (chain 2), OKT8 [CD8] _H2_IgG1_PVA_ / S267K / S364K / E357Q heavy chain (chain 3), It has the sequence of [CD8] _L1 light chain (chain 4).

１つの好ましい実施形態は、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（一本鎖）の配列を有するｓｃＩＬ−１５／Ｒα複合体を利用する。 One preferred embodiment is the human_IL15Rα (Sushi) _Fc (216) _IgG1_pI (-) _iso-distributed electron_A_C220S / PVA_ / S267K / L368D / K370S IL-15Rα (sushi) -Fc chain, as shown in FIG. 92C. The scIL-15 / Rα complex having a single-strand) sequence is utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）バリアントＩＬ−１５ドメイン、ｉｖ）第２のドメインリンカー、ｖ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第３のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーとを含み、ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含み、ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) from N-terminus to C-terminus, i) IL-15sushi domain, ii) first domain linker, iii) variant IL-15 domain, iv) second. Domain linker, v) first monomer containing the first variant Fc domain containing CH2-CH3, and b) from N-terminus to C-terminus, i) scFv domain, ii) third domain linker, iii ) Containing a second monomer comprising a second variant Fc domain comprising CH2-CH3, the scFv domain comprises a first variable weight domain, a scFv linker, and a first variable light domain, and the scFv domain is It binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D.

ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｂに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にも、ドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。これは一般に「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。 scFv × ncIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57B and comprises three monomers. The first monomer contains a sushi domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, and the second monomer is a vh-scFv linker-vr-hinge-CH2-CH3 or vl-scFv linker. -Vh-Hinges-CH2-CH3s are included, but in either direction the domain linker can be substituted for the hinge. The third monomer is the IL-15 domain. This is commonly referred to as "ncIL-15 / Rα x scFv" or "scFv x ncIL-15 / Rα", where "nc" refers to "non-covalent", which refers to the self-organizing, non-covalent bond between IL-15 and the sushi domain. Represent.

図５７Ｂについて、「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。 For FIG. 57B, the "scFv x ncIL-15 / Rα" format contains scFv fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, IL-15Rα (sushi) fused to the other side of the heterodimer Fc, but IL- 15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex.

ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the ncIL-15 / Rα × scFv format, one preferred embodiment utilizes skew variants vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the ncIL-15 / Rα × scFv format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on the scFv-Fc monomer) and L368D / K370S (on the IL-15 complex monomer), the pI variant Q295E. / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally bilateral 428L / 434S variants are utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第２のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマー（上記ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含む）と、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー（上記ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a first variant Fc comprising a) N-terminus to C-terminus, i) IL-15sushi domain, ii) first domain linker, iii) CH2-CH3. A second monomer comprising a domain and a second variant Fc domain comprising b) from the N-terminus to the C-terminus, i) scFv domain, ii) second domain linker, iii) CH2-CH3. (The scFv domain includes a first variable heavy domain, a scFv linker, and a first variable light domain) and a third monomer containing the c) variant IL-15 domain (the scFv domain is human). Includes (binds to CD8, NKG2A, or NKG2D).

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｃに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインが操作されたシステイン残基を有し、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にも、ドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。第３のモノマーは、システインバリアントアミノ酸を有するようにも操作されたＩＬ−１５ドメインであり、それにより、ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ−１５ドメインとの間にジスルフィド架橋を形成することが可能になる。これは一般に「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｄｓ」は「ジスルフィド」を表す。 scFv × dsIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57C and comprises three monomers. The first monomer contains a sushi domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, the sushi domain has an engineered cysteine residue, and the second monomer is a vh-scFv linker. Includes -vl-hinge-CH2-CH3 or vl-scFv linker-vh-hinge-CH2-CH3, but in either direction the domain linker can be substituted for the hinge. The third monomer is an IL-15 domain that has also been engineered to have a cysteine variant amino acid, which allows the formation of disulfide crosslinks between the sushi domain and the IL-15 domain. This is commonly referred to as "scFv x dsIL-15 / Rα" or "dsIL-15 / Rα x scFv", where "ds" stands for "disulfide".

図５７Ｃについて、「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、操作されたシステインの結果として、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。 For FIG. 57C, the "scFv x dsIL-15 / Rα" format contains scFv fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, IL-15Rα (sushi) fused to the other side of the heterodimer Fc, but engineered. As a result of cysteine, IL-15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex.

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the scFv × dsIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variants vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the scFv × dsIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on the scFv-Fc monomer) and L368D / K370S (on the IL-15 complex monomer), the pI variant Q295E. / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally bilateral 428L / 434S variants are utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってｉ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第２のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマー（ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含む）と、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー（バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein comprises a) a variant IL-15sushi domain containing cysteine residues from the N-terminus to the C-terminus, ii) a first domain linker, iii) CH2-CH3. A first monomer containing a first variant Fc domain and a second variant Fc containing b) N-terminus to C-terminus, i) scFv domain, ii) second domain linker, iii) CH2-CH3. A second monomer containing a domain (the scFv domain comprises a first variable heavy domain, a scFv linker, and a first variable light domain) and c) a third containing a variant IL-15 domain containing a cysteine residue. (Variant IL-15shi domain and variant IL-15 domain form a disulfide bond and the scFv domain binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D).

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ
この実施形態は、図５７Ｄに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。本実施形態のバリアントの好ましい組み合わせは、図６０Ａ、６０Ｂ、６１Ａ、６１Ｂ、６６Ａ、６６Ｂ、８７、９２Ａ、９２Ｂ、９２Ｃ、９７Ａ、９７Ｂ、および１０２に見られる。 scIL-15 / Rα × Fab
This embodiment is shown in FIG. 57D and comprises three monomers. The first monomer contains sushi domain-domain linker-IL-15-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, and the second monomer is a heavy chain, VH-CH1-hinge-CH2. -Includes CH3. The third monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "scIL-15 / Rα x Fab", where "sc" stands for "single strand". Preferred combinations of variants of this embodiment are found in FIGS. 60A, 60B, 61A, 61B, 66A, 66B, 87, 92A, 92B, 92C, 97A, 97B, and 102.

図５７Ｄについて、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ（またはＦａｂ×ｓｃＩＬ−１５／Ｒα）フォーマットは、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２７１４５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６であり得る。 For FIG. 57D, the scIL-15 / Rα × Fab (or Fab × scIL-15 / Rα) format comprises IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 by a variable length linker (“scIL-15 / Rα”. (Called), which then fuses to the N-terminus of the heterodimer Fc region, so that the variable heavy chain (VH) fuses to the other side of the heterodimer Fc, but the corresponding light chain forms a Fab containing VH. Transfected separately. Exemplary embodiments of such heterodimer proteins include XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP24919, XENP25137, XENP26223, XENP26224, XENP262227, XENP262524, XENP262225, XENP2645 It can be XENP27145, and XENP27146.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１０２に示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図１０２に示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６５８５である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 102. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 102. In some cases, the heterodimer protein is XENP26585.

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２３である。 In some embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 97A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 97A. In some cases, the heterodimer protein is XENP26223.

他の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２４である。 In other embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 97A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 97A. In some cases, the heterodimer protein is XENP26224.

様々な実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２７である。 In various embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 97B. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 97B. In some cases, the heterodimer protein is XENP26227.

特定の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２９である。 In certain embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 97B. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 97B. In some cases, the heterodimer protein is XENP26229.

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１７である。 In some embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 92A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 92A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24917.

他の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１８である。 In another embodiment, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 92B. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 92B. In some cases, the heterodimer protein is XENP24918.

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１９である。 In some embodiments, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 92B. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 92B. In some cases, the heterodimer protein is XENP24919.

一実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図８７に示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図８７に示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４７３６である。 In one embodiment, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. In some cases, the heterodimer protein is XENP24736.

別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１４である。 In another embodiment, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 66A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 66A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24114.

さらに別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１５である。 In yet another embodiment, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 66A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 66A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24115.

別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１６である。 In another embodiment, the scIL-15 / Rα × anti-CD8 heterodimer protein utilizes an anti-CD8 ABD having the sequence shown in FIG. 66A. In some embodiments, the IL-15 complex of protein utilizes the sequence shown in FIG. 66A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24116.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３３である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-NKG2D ABD having the sequence shown in FIG. 61A. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 61A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24533.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３４である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-NKG2D ABD having the sequence shown in FIG. 61A. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 61A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24534.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ｂに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ｄ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ｂに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３５である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-NKG2D ABD having the sequence shown in FIG. 61B. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 61B. In some cases, the heterodimer protein is XENP24535.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６０Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３１である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-NKG2A ABD having the sequence shown in FIG. 60A. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 60A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24531.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６０Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３２である。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes an anti-NKG2A ABD having the sequence shown in FIG. 60A. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 60A. In some cases, the heterodimer protein is XENP24532.

別の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、図６０Ｂに示す配列を有する抗ＮＫＧ２Ａ ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ｂに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２７１４６である。 In another embodiment, the heterodimer protein utilizes an anti-NKG2A ABD having the sequence shown in FIG. 60B. In some embodiments, the IL-15 complex of scIL-15 / Rα × Fab utilizes the sequence shown in FIG. 60B. In some cases, the heterodimer protein is XENP27146.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（抗ＣＤ８モノマー、抗ＮＫＧ２Ａモノマー、または抗ＮＫＧ２Ｄモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the scIL-15 / Rα × Fab format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on anti-CD8 monomer, anti-NKG2A monomer, or anti-NKG2D monomer) and L368D / K370S (IL-15 complex monomer). Above), pI variants Q295E / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally 428L / 434S on both sides. Use a variant.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）バリアントＩＬ−１５ドメイン、ｉｖ）第２のドメインリンカー、ｖ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) from the N-terminus to the C-terminus, i) IL-15sushi domain, ii) first domain linker, iii) variant IL-15 domain, iv) second. Domain linker, v) a first monomer containing the first variant Fc domain containing CH2-CH3, and b) a second monomer containing a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3). Is a second variant Fc domain) and c) a light chain containing VL-CL (VH and VL form an antigen binding domain that binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D).

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図５７Ｅに示されており、４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。第４のモノマーは、軽鎖ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図９２Ｃに見られる。 Fab x ncIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57E and comprises four monomers. The first monomer contains a sushi domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, and the second monomer comprises a heavy chain, VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The third monomer is the IL-15 domain. The fourth monomer is light chain VL-CL. This is commonly referred to as "Fab x nc IL-15 / Rα", where "nc" stands for "non-covalent", which refers to the self-organizing non-covalent bond between IL-15 and the sushi domain. A preferred combination of variants for this embodiment can be seen in FIG. 92C.

図５７Ｅについて、Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα（またはｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ）フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２５１３７であり得る。 For FIG. 57E, the Fab × ncIL-15 / Rα (or ncIL-15 / Rα × Fab) format contains VH fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, where IL-15Rα (sushi) is the other of the heterodimer Fc. Although fused to the side, the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH, and IL-15 is translocated separately to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. Be affected. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP25137.

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the Fab × ncIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the Fab × ncIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on the scFv-Fc monomer) and L368D / K370S (on the IL-15 complex monomer), the pI variant Q295E. / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally bilateral 428L / 434S variants are utilized.

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（鎖１）、ＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）、ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖３）、およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖４）の配列を有する。 A preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 92C, human _IL15Rα (Sushi) _Fc (216) _IgG1_pI (-) _ equidistant electron _A_C220S / PVA_ / S267K / L368D / K370SIL-15Rα (sushi). Sequences of -Fc chain (chain 1), IL15_D30N / E64Q / N65D (chain 2), OKT8 [CD8] _H2_IgG1_PVA_ / S267K / S364K / E357Q heavy chain (chain 3), and OKT8 [CD8] _L1 light chain (chain 4) Has.

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、図９２Ｃに示すように、１つの好ましい実施形態は、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ鎖（鎖１）、およびＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）の配列を有するｎｃＩＬ−１５／Ｒα複合体を利用する。 In the Fab × nc IL-15 / Rα format, as shown in FIG. 92C, one preferred embodiment is human_IL15Rα (Sushi) _Fc (216) _IgG1_pI (-) _iso-distributed electrons _A_C220S / PVA_ / S267K / L368D / K370S. The ncIL-15 / Rα complex having the sequence of IL-15Rα-Fc chain (chain 1) and IL15_D30N / E64Q / N65D (chain 2) is utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロ二ダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーと、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマーと、ｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) with a first monomer comprising a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 is the first variant Fc domain). , B) From the N-terminus to the C-terminus, i) IL-15sushi domain, ii) first domain linker, ii) second monomer containing a second variant Fc domain containing CH2-CH3, and c) A third monomer containing the variant IL-15 domain and d) a fourth monomer containing a light chain containing VL-CL (VH and VL form an antigen-binding domain that binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D. ) And.

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図５７Ｆに示されており、４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むよう操作されており、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーは、天然の細胞条件下でジスルフィド架橋が形成されるようにシステイン残基を有するように操作されたＩＬ−１５ドメインである。第４のモノマーは、軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｄｓ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「ジスルフィド」を表す。 Fab x dsIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57F and comprises four monomers. The first monomer contains a sushi domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus, the sushi domain is engineered to contain a cysteine residue, and the second monomer is a heavy chain. Includes VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The third monomer is an IL-15 domain engineered to have a cysteine residue to form a disulfide bridge under natural cellular conditions. The fourth monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "Fab x ds IL-15 / Rα", where "ds" stands for "disulfide" which refers to the self-assembled non-covalent bond between IL-15 and the sushi domain.

図５７Ｆについて、Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα（またはｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ）フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、一方、操作されたシステインの結果として、ＩＬ−１５は、共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。 For FIG. 57F, the Fab × dsIL-15 / Rα (or dsIL-15 / Rα × Fab) format contains VH fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region, where IL-15Rα (sushi) is the other of the heterodimer Fc. Although fused to the side, the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH, while IL-15 is a covalent IL-15 / Rα complex as a result of engineered cysteine. Are transfected separately to form.

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the Fab × dsIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。 In the Fab × dsIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is the skew variants S364K / E357Q (on the scFv-Fc monomer) and L368D / K370S (on the IL-15 complex monomer), the pI variant Q295E. / N384D / Q418E / N421D (on the IL-15 complex side), excision variants on both monomers E233P / L234V / L235A / G236_ / S267K, and optionally bilateral 428L / 434S variants are utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーと、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマーと、ｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマーとを含み、バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ＶＨおよびＶＬはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) a first monomer comprising a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 is the first variant Fc domain). b) From the N-terminal to the C-terminal, i) a variant IL-15sushi domain containing a cysteine residue, ii) a first domain linker, iii) a second variant containing a second variant Fc domain containing CH2-CH3. It contains a monomer, c) a third monomer containing a variant IL-15 domain containing a cysteine residue, and d) a fourth monomer containing a light chain containing VL-CL, a variant IL-15shi domain and a variant IL. The -15 domain forms a disulfide bond, and VH and VL form an antigen-binding domain that binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D.

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｇに示され、３つのモノマーを含む（融合タンパク質はテトラマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ｓｃＩＬ−１５複合体を有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５を含む。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ａに見られる。 mAb-scIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57G and comprises three monomers (although the fusion protein is a tetramer). The first monomer comprises a heavy chain, VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The second monomer comprises a heavy chain having an scIL-15 complex, VH-CH1-hinge-CH2-CH3-domain linker-sushi domain-domain linker-IL-15. The third (and fourth) monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "mAb-scIL-15 / Rα", where "sc" stands for "single strand". A preferred combination of variants for this embodiment can be seen in FIG. 79A.

図５７Ｇについて、ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、次いでこれはさらにヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４６であり得る。 For FIG. 57G, the mAb-sc IL-15 / Rα format contains VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, IL-15 fused to IL-15Rα (sushi), and then this. Is further fused to the C-terminus of one of the heterodimer Fc regions, but the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP24546.

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the mAb-scIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図７９Ａに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−Ｆｃ−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５（一本鎖）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。 A preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 79A, 51.1 [CD8] _H1-Fc-IL15Rα (sushi) _ (GGGGS) 5-IL15 (single chain), 51.1 [ It has a sequence of [CD8] _H1L1Fab-Fc heavy chain (chain 2) and 51.1 [CD8] _H1L1 light chain (chain 3).

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ａに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−Ｆｃ−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５（一本鎖）のｓｃＩＬ−１５／Ｒα複合配列を利用する。 In the mAb-scIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is the scIL- of 51.1 [CD8] _H1-Fc-IL15Rα (sushi) _ (GGGGS) 5-IL15 (single strand) shown in FIG. 79A. Use a 15 / Rα complex sequence.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカー−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５バリアントを含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、およびｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) a first monomer comprising a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 above is the first variant Fc domain), b. ) VH-CH1-Hing-CH2-CH3 Domain Linker-IL-15sushi Domain-Domain Linker-IL-15 A second monomer containing a variant (CH2-CH3 is a second variant Fc domain), and c) VL It contains a third monomer containing a light chain containing -CL (VH and VL domains bind to human CD8, NKG2A, or NKG2D).

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｈに示され、４つのモノマーを含む（ヘテロダイマー融合タンパク質はペンタマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含む。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。第４の（および第５の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ａに見られる。 mAb-ncIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57H and comprises four monomers (although the heterodimer fusion protein is pentamer). The first monomer comprises a heavy chain, VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The second monomer comprises a heavy chain having an IL-15Rα (sushi) domain, the VH-CH1-hinge-CH2-CH3-domain linker-sushi domain. The third monomer is the IL-15 domain. The fourth (and fifth) monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "mAb-ncIL-15 / Rα", where "nc" stands for "non-covalent bond". A preferred combination of variants for this embodiment can be seen in FIG. 79A.

図５７Ｈについて、ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４３であり得る。 For FIG. 57H, the mAb-nc IL-15 / Rα format contains VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, where IL-15Rα (sushi) is one of the heterodimer Fc regions. Fused to the C-terminus, but the corresponding light chain is separately transfected to form a VH-containing Fab, and IL-15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. Transfected. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP24543.

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the mAb-ncIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図７９Ａに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ−重鎖−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ軽鎖（鎖３）、およびＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ）（鎖４）の配列を有する。 A preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 79A, 51.1 [CD8] _H1L1Fab-Fc-heavy chain-IL15Rα (sushi) (chain 1), 51.1 [CD8] _H1L1Fb-Fc. It has the sequences of heavy chain (chain 2), 51.1 [CD8] _H1L1Fab-Fc light chain (chain 3), and IL15 (N65D) (chain 4).

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα形式では、１つの好ましい実施形態は、図７９Ａに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１＿Ｆａｂ−Ｆｃ−重鎖−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（鎖１）およびＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ）（鎖４）のｎｃＩＬ−１５／Ｒα複合体配列を利用する。 In the mAb-ncIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is 51.1 [CD8] _H1L1_Fab-Fc-heavy chain-IL15Rα (sushi) (sushi) (chain 1) and IL15 (N65D) (chain 4) shown in FIG. 79A. ) NcIL-15 / Rα complex sequence is used.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカーＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインを含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー、およびｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) a first monomer comprising a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 is the first variant Fc domain), b). VH-CH1-Hing-CH2-CH3 Domain Linker A second monomer containing the IL-15sushi domain (CH2-CH3 is the second variant Fc domain), c) A third monomer containing the variant IL-15 domain, And d) contains a fourth monomer containing a light chain containing VL-CL (VH and VL domains bind to human CD8, NKG2A, or NKG2D).

ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｉに示され、４つのモノマーを含む（ヘテロダイマー融合タンパク質はペンタマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むように操作されている。第３のモノマーは、ＩＬ−１５複合体が生理学的条件下で形成されるようにシステイン残基を含むように操作されたＩＬ−１５ドメインである。第４の（および第５の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｄｓ」は「ジスルフィド」を表す。 mAb-dsIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57I and comprises four monomers (although the heterodimer fusion protein is pentamer). The first monomer comprises a heavy chain, VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The second monomer comprises a heavy chain having an IL-15Rα (sushi) domain, a VH-CH1-hinge-CH2-CH3-domain linker-sushi domain, and the sushi domain has been engineered to contain a cysteine residue. .. The third monomer is the IL-15 domain engineered to contain cysteine residues so that the IL-15 complex is formed under physiological conditions. The fourth (and fifth) monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "mAb-dsIL-15 / Rα", where "ds" stands for "disulfide".

図５７Ｉについて、ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は、操作されたシステインの結果として、共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクトされる。 For FIG. 57I, the mAb-ds IL-15 / Rα format contains VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, where IL-15Rα (sushi) is one of the heterodimer Fc regions. Fusing to the C-terminus, the corresponding light chain is separately transfected to form a VH-containing Fab, and IL-15 is a covalent IL-15 / Rα complex as a result of engineered cysteine. Are transfected separately to form.

ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the mAb-dsIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカーＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインを含む第２のモノマー（上記バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインはシステイン残基を含み、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー、およびｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) a first monomer comprising a heavy chain containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 is the first variant Fc domain), b). VH-CH1-Hing-CH2-CH3 Domain Linker A second monomer containing the IL-15sushi domain (the variant IL-15sushi domain contains a cysteine residue and CH2-CH3 is the second variant Fc domain), c. ) A third monomer containing a variant IL-15 domain containing a cysteine residue, and d) a fourth monomer containing a light chain containing VL-CL (variant IL-15shi domain and variant IL-15 domain have disulfide bonds. The VH and VL domains that form and bind to human CD8, NKG2A, or NKG2D) are included.

Ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｊに示され、テトラマーを形成する４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ｂに見られる。 Central-IL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57J and comprises four monomers forming a tetramer. The first monomer comprises VH-CH1- [optional domain linker] -IL-15- [optional domain linker] -CH2-CH3, and the second optional domain linker is often a hinge domain. .. The second monomer comprises VH-CH1- [optional domain linker] -sushi domain- [optional domain linker] -CH2-CH3, and the second optional domain linker is often a hinge domain. The third (and fourth) monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "central-IL-15 / Rα". A preferred combination of variants for this embodiment can be seen in FIG. 79B.

図５７Ｊについて、ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、次いでヘテロダイマーＦｃの一方にさらに融合したＩＬ−１５のＮ末端に組み換え融合したＶＨと、次いでヘテロダイマーＦｃの他方にさらに融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組み換え融合したＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４７であり得る。 For FIG. 57J, the central-IL-15 / Rα format was then recombinantly fused to the N-terminus of IL-15 further fused to one of the heterodimer Fc, and then further fused to the other of the heterodimer Fc, IL-15Rα. The N-terminus of (sushi) contains a recombinantly fused VH, while the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP24547.

ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the central-IL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図７９Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）−Ｆｃ（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。 A preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 79B, 51.1 [CD8] _H1-IL15 (N4D / N65D) -Fc (chain 1), 51.1 [CD8] _H1-IL15Rα ( It has the sequence of sushi) -Fc (chain 2), 51.1 [CD8] _H1L1 light chain (chain 3).

ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ｂに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）−Ｆｃ（鎖１）および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−ＦｃのＩＬ−１５／Ｒα複合配列を利用する。 In the central-IL-15 / Rα format, one preferred embodiment is 51.1 [CD8] _H1-IL15 (N4D / N65D) -Fc (chain 1) and 51.1 [CD8] _H1- shown in FIG. 79B. The IL-15 / Rα complex sequence of IL15Rα (sushi) -Fc is utilized.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカーバリアントＩＬ−１５ドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカーバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) a first monomer containing the VH-CH1-domain linker variant IL-15 domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus (CH2 above). -CH3 is the first variant Fc domain) and b) a second monomer containing the VH-CH1-domain linker variant IL-15sushi domain-domain linker-CH2-CH3 from the N-terminus to the C-terminus. CH2-CH3 is the first variant Fc domain) and c) a third monomer containing a light chain containing VL-CL (VH and VL are antigen-binding domains that bind to human CD8, NKG2A, or NKG2D. To form) and include.

Ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｋに示され、テトラマーを形成する４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ｂに見られる。 Central-scIL-15 / Rα
This embodiment is shown in FIG. 57K and comprises four monomers forming a tetramer. The first monomer comprises VH-CH1- [optional domain linker] -sushi domain-domain linker-IL-15- [optional domain linker] -CH2-CH3, and the second optional domain linker. Is often the hinge domain. The second monomer comprises VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The third (and fourth) monomer is the light chain, VL-CL. This is commonly referred to as "central-scIL-15 / Rα", where "sc" stands for "single strand". A preferred combination of variants for this embodiment can be seen in FIG. 79B.

図５７Ｋについて、ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、ＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合し、それは次いでヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合したＶＨと、ヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４８であり得る。 For FIG. 57K, the central-scIL-15 / Rα format fused to the N-terminus of IL-15Rα (sushi) fused to IL-15, which in turn was further fused to one side of the heterodimer Fc with VH and the heterodimer. It contains VH fused to the other side of the Fc, but the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH. An exemplary embodiment of such a heterodimer protein can be XENP24548.

ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。 In the central-scIL-15 / Rα format, one preferred embodiment utilizes skew variant vs. S364K / E357Q: L368D / K370S.

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ ＡＢＤを利用し、図７９Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５−Ｆｃ（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。 A preferred embodiment utilizes anti-CD8 ABD and, as shown in FIG. 79B, 51.1 [CD8] _H1-IL15Rα (sushi) _ (GGGGS) 5-IL15-Fc (chain 1), 51.1 [CD8]. ] _H1L1Fab-Fc heavy chain (chain 2), 51.1 [CD8] _H1L1 light chain (chain 3).

ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ｂに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５−Ｆｃ（鎖１）のｓｃＩＬ−１５複合配列を利用する。 In the central-scIL-15 / Rα format, one preferred embodiment is scIL-15 of 51.1 [CD8] _H1-IL15Rα (sushi) _ (GGGGS) 5-IL15-Fc (chain 1) shown in FIG. 79B. Use a composite array.

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−バリアントＩＬ−１５ドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３含む第１モノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。 In some embodiments, the heterodimeric protein is a) from the N-terminus to the C-terminus, VH-CH1-domain linker-IL-15sushi domain-domain linker-variant IL-15 domain-domain linker-CH2-CH3. A first monomer containing (CH2-CH3 is the first variant Fc domain) and a second monomer containing a heavy chain containing b) VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (CH2-CH3 is the second). (Variant Fc domain) and c) a third monomer containing a light chain containing VL-CL (VH and VL form an antigen-binding domain that binds to human CD8, NKG2A, or NKG2D).

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ８（ＣＤ８α鎖など）に特異的に結合する。ヒトＣＤ８α鎖ポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０１７３２に記載されている。当業者は、ＣＤ８がすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤは、図６６Ａおよび６６Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖の配列を有する。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤは、図８１に示すように、ＸＥＮＰ２４０２５の配列：１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１重鎖（鎖１）および１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖２）、またはＸＥＮＰ２４３２１の配列：１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖１）、１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖２）、および空のＦｃ（鎖３）を有する。他の場合には、図９０に示すように、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤはＸＥＮＰ１５０７５（ＯＫＴ８＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ）の配列を有する。特定の場合には、図９１に示すように、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤは、ＸＥＮＰ２４９２０の配列、すなわちＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖３）を有する。ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤは、図９７Ａに示すように、ＸＥＮＰ２６２２３の配列：ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２．１５７＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１．１０３軽鎖（鎖３）を有する。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ ＡＢＤは、図１０２に示すように、ＸＥＮＰ２６５８５の配列：ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２．１５７＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１．１０３軽鎖（鎖３）を有する。 In some embodiments, the antigen binding domain specifically binds to human CD8 (such as the CD8α chain). The human CD8α chain polypeptide sequence is described in, for example, Uniprot Accession No. It is described on P01732. Those skilled in the art will appreciate that CD8 includes all isoform variants. In some examples, the anti-CD8 ABDs of the heterodimeric proteins of the invention are sequences of 51.1 [CD8] _H1L1Fab-Fc heavy chains and 51.1 [CD8] _H1L1 light chains, as shown in FIGS. 66A and 66B. Has. In some examples, the anti-CD8 ABDs of the heterodimeric proteins of the invention have the sequence of XENP24025: 1C11B3 [CD8] _H1L1 heavy chain (chain 1) and 1C11B3 [CD8] _H1L1 light chain (chain), as shown in FIG. 2), or sequence of XENP24321: 1C11B3 [CD8] _H1L1Fab-Fc heavy chain (chain 1), 1C11B3 [CD8] _H1L1 light chain (chain 2), and an empty Fc (chain 3). In other cases, as shown in FIG. 90, the anti-CD8 ABD of the heterodimer protein has the sequence of XENP15075 (OKT8_H1L1_IgG1_PVA_ / S267K). In certain cases, as shown in FIG. 91, the anti-CD8 ABD of the heterodimeric protein is the sequence of XENP24920, ie OKT8 [CD8] _H2_IgG1_PVA_ / S267K / S364K / E357Q heavy chain (chain 2) and OKT8 [CD8] _L1. It has a light chain (chain 3). The anti-CD8 ABD of the heterodimeric protein has the sequence of XENP26223: OKT8 [CD8] _H2.157_IgG1_PVA_ / S267K / S364K / E357Q heavy chain (chain 2) and OKT8 [CD8] _L1.103 light chain (chain 2) as shown in FIG. 97A. It has a chain 3). In some examples, the heterodimeric protein anti-CD8 ABD has the sequence of XENP26585: OKT8 [CD8] _H2.157_IgG1_PVA_ / S267K / S364K / E357Q / M428L / N434S heavy chain (chain 2) and It has OKT8 [CD8] _L1.103 light chain (chain 3).

いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ８に結合する１つ以上のＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＣＤ８およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。 In some embodiments, the invention provides a heterodimer Fc fusion protein comprising one or more ABD and IL-15 / IL-15Rα fusion proteins that bind to CD8, in any format shown in FIGS. 57A-57F. Can be. In one embodiment, the heterodimer Fc fusion protein comprising two antigen binding domains that bind to the CD8 and IL-15 / IL-15Rα fusion proteins can be in any of the forms shown in FIGS. 57G-57K.

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、スキューバリアント、特に、ＥＵ付番によるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｗ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｌ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される有用なスキューバリアントを有するＦｃドメインを含む。 In some embodiments, the IL-15 / IL-15Rα x anti-CD8 heterodimer fusion protein is a skew variant, in particular S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370W: S364K, L368E / L370S: by EU numbering: S364K, T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, K370S: S364K / E357Q, T366S / L368A / Y407V: T366W, and T366W / L368A / Y407V Contains Fc domains with useful skew variants.

他の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、ｐＩバリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用なｐＩバリアントはＥＵ付番によるＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄである。 In other embodiments, the IL-15 / IL-15Rα × anti-CD8 heterodimer fusion protein comprises an Fc domain having a pI variant, and a particularly useful pI variant is EU numbered N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D. Is.

別の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、切除バリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用な切除バリアントはＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋである。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＦｃＲｎバリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用なＦｃＲｎバリアントはＥＵ付番による４２８Ｌ／４３４Ｓである。 In another embodiment, the IL-15 / IL-15Rα × anti-CD8 heterodimer fusion protein comprises an Fc domain having a resection variant, and a particularly useful resection variant is E233P / L234V / L235A / G236del / S267K. In yet another embodiment, the IL-15 / IL-15Rα × anti-CD8 heterodimer fusion protein comprises an Fc domain having an FcRn variant, and a particularly useful FcRn variant is EU numbered 428L / 434S.

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、およびＸＥＮＰ２６５８５のうちのいずれかを含むことができる。有用なフォーマットは、図６６Ａ、６６Ｂ、７９Ａ、７９Ｂ、８７、９２Ａ、９２Ｂ、９２Ｃ、９７Ａ、および９７Ｂに示す。 Illustrative embodiments of the IL-15 / IL-15Rα x anti-CD8 heterodimer fusion protein include XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP24736, XENP24917, XENP24726, XENP24917, XENP2419, Any of XENP26227, XENP26229, and XENP26585 can be included. Useful formats are shown in FIGS. 66A, 66B, 79A, 79B, 87, 92A, 92B, 92C, 97A, and 97B.

他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合する。ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ２６７１５に記載されている。当業者は、ＮＫＧ２Ａがすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＮＫＧ２Ａ ＡＢＤは、図６０Ａおよび６０Ｂに示すように、モナリズマブ［ＮＫＧ２Ａ］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖およびモナリズマブ［ＮＫＧ２Ａ］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫＧ２Ａに結合するＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＮＫＧ２ＡおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＮＫＧ２Ａヘテロダイマー融合タンパク質（例えば、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα× 抗ＮＫＧ２ＡＦａｂ形式）の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、およびＸＥＮＰ２７１４６のうちのいずれかを含むことができる。 In other embodiments, the antigen binding domain specifically binds to human NKG2A. The human NKG2A polypeptide sequence can be described, for example, in Uniprot Accession No. It is described on page 26715. Those skilled in the art will appreciate that NKG2A includes all isoform variants. In some examples, the anti-NKG2A ABD of the heterodimer protein of the invention has sequences of monarizumab [NKG2A] _H1L1Fab-Fc heavy chain and monarizumab [NKG2A] _H1L1 light chain, as shown in FIGS. 60A and 60B. In some embodiments, the invention provides a bifunctional heterodimer Fc fusion protein comprising an ABD that binds to NKG2A and an IL-15 / IL-15Rα fusion protein, in any format shown in FIGS. 57A-57F. possible. In one embodiment, the bifunctional heterodimer Fc fusion protein comprising two antigen binding domains that bind to the NKG2A and IL-15 / IL-15Rα fusion proteins can be in any of the forms shown in FIGS. 57G-57K. An exemplary embodiment of an IL-15 / IL-15Rα x anti-NKG2A heterodimer fusion protein (eg, scIL-15 / Rα x anti-NKG2AFab form) may comprise any of XENP24531, XENP24532, and XENP27146. it can.

別の実施形態では、抗原結合ドメインはヒトＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。ヒトＮＫＧ２Ｄポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ２６７１８に記載されている。当業者は、ＮＫＧ２Ｄがすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＮＫＧ２Ｄ ＡＢＤは、図６１Ａおよび６１Ｂに示すように、ＭＳ［ＮＫＧ２Ｄ］＿Ｈ０Ｌ０Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖およびＭＳ［ＮＫＧ２Ｄ］＿Ｈ０Ｌ０軽鎖の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合するＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＮＫＧ２ＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＮＫＧ２Ｄヘテロダイマー融合タンパク質（例えば、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＮＫＧ２Ｄ Ｆａｂ形式）の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５のうちのいずれかを含むことができる。 In another embodiment, the antigen binding domain specifically binds to human NKG2D. The human NKG2D polypeptide sequence can be described, for example, in Uniprot Accession No. It is described on P26718. Those skilled in the art will appreciate that NKG2D includes all isoform variants. In some examples, the anti-NKG2D ABD of the heterodimer protein of the invention has the sequences of the MS [NKG2D] _H0L0Fab-Fc heavy chain and the MS [NKG2D] _H0L0 light chain, as shown in FIGS. 61A and 61B. In some embodiments, the invention provides a bifunctional heterodimer Fc fusion protein comprising an ABD that binds to NKG2D and an IL-15 / IL-15Rα fusion protein, in any format shown in FIGS. 57A-57F. possible. In one embodiment, the bifunctional heterodimer Fc fusion protein comprising two antigen binding domains that bind to the NKG2D and IL-15 / IL-15Rα fusion proteins can be in any of the forms shown in FIGS. 57G-57K. An exemplary embodiment of an IL-15 / IL-15Rα x anti-NKG2D heterodimer fusion protein (eg, scIL-15 / Rα x anti-NKG2D Fab form) comprises any of XENP24533, XENP24534, and XENP27145. Can be done.

いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｗ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｌ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］、および［Ｔ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。他の場合には、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの例では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による４２８Ｌ／４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）からなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。 In some embodiments, the first and second Fc domains are EU numbered [S364K / E357Q: L368D / K370S], [S364K / E357Q: L368E / K370S], [L368D / K370W: S364K], [L368D / K370S: S364K], [L368E / L370S: S364K], [L368E / K370S: S364K], [T411T / K360E / Q362E: D401K], [L368D / K370S: S364K / E357L], [K367L] ], [T366S / L368A / Y407V: T366W], [T366S / L368A / Y407V / Y394C: T366W / S354C], and [T366W / L368A / Y407V / Y349C: T366W / S354C]. You can have a set. In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including N208D / Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In other cases, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. In some examples, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions consisting of 428L / 434S (eg, M428L / N434S) by EU numbering.

他の態様では、本発明で提供されるのは、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質である。 In another aspect, provided in the present invention are XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP243736, XENP24736, XENP2 A bifunctional heterodimer protein selected from the group consisting of XENP26227, XENP26229, XENP26585, XENP27145, and XENP27146.

これらのタンパク質を作製する方法および本タンパク質を用いて患者を治療する方法に加えて、核酸、発現ベクター、および宿主細胞もすべて同様に提供される。 In addition to methods of making these proteins and treating patients with the proteins, nucleic acids, expression vectors, and host cells are all provided as well.

一態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、またはＩＬ−１５タンパク質は、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、（ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む重鎖、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖（例えばＶＬ−ＣＬ）を含む抗原結合ドメインモノマーとを、を含み、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマーはＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはＦａｂである。ヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα（ｓｕｓｈｉ）×Ｆａｂ」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、または図６６Ａ、図６６Ｂ、図６０Ａ、もしくは図６１Ａに示したものである。他の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質はまた、ドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインも含み、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。そのようなヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４５４８または図７９Ｂに示すものであり得る。 In one aspect, the heterodimeric protein described herein is (a) an IL-15 / IL-15Rα fusion protein comprising an IL-15Rα protein, an IL-15 protein, and a first Fc domain, IL. The -15Rα protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15 protein using a first domain linker and the IL-15 protein is covalently attached to the N-terminus of the first Fc domain using a second domain linker. The IL-15 protein is covalently attached or co-linked to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a first domain linker and the IL-15Rα protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a second domain linker. The IL-15 / IL-15Rα fusion protein covalently attached to the N-terminus of the Fc domain of 1 and (b) VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is a variable heavy chain and CH2-CH3). Contains a heavy chain containing (is the second Fc domain), and an antigen binding domain monomer containing a light chain containing a variable light chain and a light constant domain (eg, VL-CL), the first and second Fc domains of S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T431T / It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of / K370S: S364K / E357L and K370S: S364K / E357Q. In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In some embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P /. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of L234V / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. The IL-15 protein can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) and SEQ ID NO: 2 (shortened human IL-15), and the IL-15Rα protein It has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15Rα) and SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In some embodiments, the IL-15 and IL-15Rα proteins are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: respectively. It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of G38C, E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of D61N, N65D, and Q108E. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N, N65D, or Q108E. In other embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D, D61N / Q108E, or N65D / Q108E. In certain embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D / Q108E. In some embodiments, the antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In other words, the antigen-binding domain monomer may bind to CD8. The antigen-binding domain monomer may bind to NKG2A. In some cases, the antigen binding domain monomer may bind to NKG2D. In some embodiments, the antigen binding domain monomer is Fab. Heterodimer proteins may be referred to herein as "scIL-15 / Rα (sushi) x Fab". In some embodiments, the heterodimer protein is shown in XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, or FIG. 66A, FIG. 66B, FIG. 60A, or FIG. 61A. In other embodiments, the heterodimeric protein also comprises an antigen-binding domain covalently bound to the N-terminus of the IL-15 or IL-15Rα protein using a domain linker, wherein the antigen-binding domain is a second. Contains variable heavy chain domain and second variable light chain domain, not Fc domain. Such a heterodimer protein can be one shown in XENP24548 or FIG. 79B.

別の態様では、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、（ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、第１のタンパク質ドメインがドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している融合タンパク質と、（ｂ）第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、（ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む重鎖、および可変軽鎖および軽定常ドメイン（例えば、ＶＬ−ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含む。第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができ、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。特定の実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマーはＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはＦａｂである。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」と呼ばれ得る。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２５１３７または図５７Ｅおよび図９２Ｃに示すものであり得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはｓｃＦｖであり、Ｆａｂではない。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書では「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、図５７Ｂに示される。 In another aspect, the bifunctional heterodimer protein described herein is (a) a fusion protein comprising a first protein domain and a first Fc domain, wherein the first protein domain is a domain linker. A fusion protein that is co-bound to the N-terminal of the first Fc domain using, (b) a second protein domain that is non-covalently bound to the first protein domain, and (c) VH-CH1-hinge- A heavy chain containing a CH2-CH3 monomer (VH is a variable heavy chain and CH2-CH3 is a second Fc domain), and a light chain containing a variable light chain and a light constant domain (eg, VL-CL). Includes, including, and contains antigen-binding domain monomers. The first and second Fc domains are S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T by EU numbering. It can have a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q, the first protein domain containing the IL-15Rα protein, the first Two protein domains contain the IL-15 protein, or the first protein domain contains the IL-15 protein and the second protein domain contains the IL-15Rα protein. In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. In certain embodiments, the first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of / L235A / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. The IL-15 protein can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) and SEQ ID NO: 2 (shortened human IL-15), and the IL-15Rα protein It can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15Rα) and SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various embodiments, the IL-15 and IL-15Rα proteins are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. , E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C have a set of amino acid substitutions selected from the group. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of D61N, N65D, and Q108E. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N, N65D, or Q108E. In other embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D, D61N / Q108E, or N65D / Q108E. In certain embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D / Q108E. In some embodiments, the antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In other words, the antigen-binding domain monomer may bind to CD8. The antigen-binding domain monomer may bind to NKG2A. In some cases, the antigen binding domain monomer may bind to NKG2D. In some embodiments, the antigen binding domain monomer is Fab. Such a heterodimer protein may be referred to herein as "ncIL-15 / Rα × Fab". In some examples, the heterodimer protein can be that shown in XENP25137 or FIGS. 57E and 92C. In certain embodiments, the antigen binding domain monomer is scFv, not Fab. Such a heterodimer protein is referred to herein as "ncIL-15 / Rα × scFv" and is shown in FIG. 57B.

他の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、１つ以上のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質および／またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。例えば、２０１７年６月３０日出願のＵＳ６２／５２７，８９８の図１Ｉ、１Ｌ、または１Ｋに示されるヘテロダイマータンパク質などである。 In other embodiments, the heterodimeric protein comprises an antigen-binding domain covalently bound to the N-terminus of the IL-15 and / or IL-15Rα proteins using one or more domain linkers. It contains a second variable heavy chain domain and a second variable light chain domain, and does not contain an Fc domain. For example, the heterodimer protein shown in FIGS. 1I, 1L, or 1K of US62 / 527,898 filed June 30, 2017.

別の態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）を含む第１の重鎖、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む第１の抗原結合ドメインモノマーと、ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む第２の重鎖、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む第２の抗原結合ドメインモノマーと、ｃ）第２の抗原結合ドメインモノマーの第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーまたは第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２の抗原結合ドメインモノマーはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を形成する。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ得る。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２５１３７または図５７Ｇおよび図７９Ａに示すものであり得る。 In another aspect, the heterodimeric proteins described herein are (a) a first VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the first variable heavy chain and CH2-CH3 is the first. A first heavy chain comprising), and a first antigen-binding domain monomer comprising a first variable light chain and a first light constant domain, and b) a second. 2nd heavy chain, 2nd variable light chain and containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the second variable heavy chain and CH2-CH3 is the second Fc domain). A second light chain containing a second light constant domain, and a second antigen binding containing a first protein domain covalently attached to the C-terminal of the second Fc domain using a first domain linker. The first and second Fc domains include a domain monomer and c) a second protein domain that is bound or non-covalently bound to the first protein domain of the second antigen-binding domain monomer. Depending on the numbering, S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S364K, T411T / K360S / 364K, T411T / K360E / 36 It has a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of E357L and K370S: S364K / E357Q. In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. The first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235A / G236. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. The IL-15 protein can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) and SEQ ID NO: 2 (shortened human IL-15), and the IL-15Rα protein It can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15Rα) and SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various embodiments, the IL-15 and IL-15Rα proteins are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. , E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C have a set of amino acid substitutions selected from the group. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of D61N, N65D, and Q108E. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N, N65D, or Q108E. In other embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D, D61N / Q108E, or N65D / Q108E. In certain embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D / Q108E. In a preferred embodiment, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. In a preferred embodiment, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. In some embodiments, the first antigen-binding domain monomer and the second antigen-binding domain monomer bind to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In another embodiment, the first antigen-binding domain monomer or the second antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In other words, the antigen-binding domain monomer (s) may bind to CD8. The antigen-binding domain monomer (s) may bind to NKG2A. In some cases, the antigen-binding domain monomer (s) may bind to NKG2D. In some embodiments, the first and second antigen-binding domain monomers form a monoclonal antibody (mAb). Such heterodimer proteins may be referred to herein as "mAb-scIL-15 / Rα". In some examples, the heterodimer protein can be XENP25137 or that shown in FIGS. 57G and 79A.

別の態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、第１の抗原結合ドメインは、第１のドメインリンカーを使用して、ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、抗原結合ドメインは、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、（ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含むＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、第２の抗原結合ドメインは、第３のドメインリンカーを使用して、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第４のドメインリンカーを使用して、第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第２抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーまたは第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４５４７であるか、図５７Ｊおよび図７９Ｂに表したとおりである。 In another aspect, the heterodimeric protein described herein is an IL-15 fusion protein comprising (a) an IL-15 protein, a first antigen binding domain, and a first Fc domain. The antigen-binding domain of 1 is covalently bound to the N-terminal of the IL-15 protein using the first domain linker, and the IL-15 protein is the first Fc domain using the second domain linker. The IL-15 fusion protein, which is covalently attached to the N-terminal of the above, contains a first variable heavy chain domain and a first variable light chain domain and does not contain an Fc domain, and (b) IL-15Rα. An IL-15Rα fusion protein comprising a protein, a second antigen-binding domain, and a second Fc domain, the second antigen-binding domain using a third domain linker to N of the IL-15Rα protein. Covalently attached to the terminal, the IL-15Rα protein is covalently attached to the N-terminal of the second Fc domain using a fourth domain linker, the second antigen binding domain is the second variable heavy chain domain and The first Fc domain and the second Fc domain contain the IL-15Rα fusion protein, which contains a second variable light chain domain and does not contain an Fc domain, and the first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K. / S364K / E357Q; S364K / E357Q: L368D / K370S; L368D / K370S: S364K; L368E / K370S: S364K; T411T / K360E / Q362E: D401K; L368D / K370S: S368D / K370S: Has a set of amino acid substitutions selected from. In some embodiments, the first and / or second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions, including Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. The first and / or second Fc domains are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235A / G236. It has an additional set of amino acid substitutions consisting of / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. The IL-15 protein can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) and SEQ ID NO: 2 (shortened human IL-15), and the IL-15Rα protein It can have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15Rα) and SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). In various embodiments, the IL-15 and IL-15Rα proteins are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, respectively. , E53C: L42C, C42S: A37C, and L45C: A37C have a set of amino acid substitutions selected from the group. The IL-15 protein may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of D61N, N65D, and Q108E. In some embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N, N65D, or Q108E. In other embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D, D61N / Q108E, or N65D / Q108E. In certain embodiments, the IL-15 protein has an amino acid substitution of D61N / N65D / Q108E. In a preferred embodiment, the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. In some embodiments, the first antigen-binding domain monomer and the second antigen-binding domain monomer bind to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In another embodiment, the first antigen-binding domain monomer or the second antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of CD8, NKG2A, and NKG2D. In other words, the antigen-binding domain monomer (s) may bind to CD8. The antigen-binding domain monomer (s) may bind to NKG2A. In some cases, the antigen-binding domain monomer (s) may bind to NKG2D. In some embodiments, the heterodimer protein is XENP24547 or is as shown in FIGS. 57J and 79B.

本明細書では、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のいずれか１つをコードする１つ以上の核酸を含む核酸組成物も提供する。別の態様では、本発明は、１つ以上の発現ベクターが本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質のいずれか１つをコードするように各ベクターが核酸を含む、１つ以上の発現ベクターを含む発現ベクター組成物を提供する。他の態様では、核酸組成物または発現ベクター組成物のいずれか１つを含む宿主細胞が提供される。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質のいずれか１つを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）そのような宿主細胞を、ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で培養することと、（ｂ）ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む。さらに別の態様では、本発明は、本明細書に開示される治療有効量のヘテロダイマータンパク質を患者に投与することを含む、患者（例えばヒト患者）の癌を治療する方法を提供する。いくつかの例では、本明細書で提供されるのは、必要とする患者の癌を治療する方法である。 Also provided herein are nucleic acid compositions comprising one or more nucleic acids encoding any one of the bifunctional heterodimer proteins described herein. In another aspect, the invention comprises one or more expression vectors, each containing a nucleic acid such that one or more expression vectors encode any one of the heterodimeric proteins described herein. An expression vector composition is provided. In another aspect, a host cell comprising either the nucleic acid composition or the expression vector composition is provided. In another aspect, the invention provides a method of producing any one of the heterodimeric proteins described herein. The method comprises (a) culturing such host cells under suitable conditions in which the heterodimer protein is expressed, and (b) recovering the heterodimer protein. In yet another aspect, the invention provides a method of treating cancer in a patient (eg, a human patient), comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a heterodimeric protein disclosed herein. In some examples, what is provided herein is a method of treating cancer in a patient in need.

ＶＩＩＩ．本発明の核酸
本発明はさらに、本発明の二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質をコードする核酸組成物を提供する。 VIII. Nucleic Acids of the Invention The present invention further provides nucleic acid compositions encoding the bifunctional IL-15 / IL-15Rα × antigen binding domain heterodimer fusion proteins of the invention.

当業者には理解されるように、核酸組成物は二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質のフォーマットに依存するだろう。したがって、例えば、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とするとき、３つの核酸配列を発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかのフォーマットは２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに入れることができる。 As will be appreciated by those skilled in the art, the nucleic acid composition will depend on the format of the bifunctional heterodimer fusion protein. Thus, for example, when the format requires three amino acid sequences, the three nucleic acid sequences can be incorporated into one or more expression vectors for expression. Similarly, some formats require only two nucleic acids, and likewise they can be placed in one or two expression vectors.

当技術分野で既知のとおり、本発明の構成要素をコードする核酸は、当技術分野において既知のとおり、そして本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。 As is known in the art, the nucleic acids encoding the components of the invention are as known in the art and depending on the host cell used to produce the bifunctional heterodimer fusion protein of the invention. Can be incorporated into an expression vector. In general, nucleic acids are operably linked to any number of regulatory elements (promoters, origins of replication, selectable markers, ribosome binding sites, inducers, etc.). The expression vector can be an extrachromosomal vector or an integrated vector.

次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、多くの実施形態において使用される、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫および／または真菌細胞を含む当技術分野において周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で形質転換する。 The nucleic acid and / or expression vector of the invention is then used in many embodiments of any number of different types known in the art, including mammalian, bacterial, yeast, insect and / or fungal cells. Transform host cells with mammalian cells (eg, CHO cells).

いくつかの実施形態では、各モノマーをコードする核酸は、フォーマットに応じて適用可能なように、それぞれ一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸のそれぞれは異なる発現ベクターに含まれる。本明細書および米国仮出願第６２／０２５，９３１号、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、および国際特許公開第ＷＯ２０１５／１４９０７７号（すべて参照により本明細書に組み入れられる）に示されるように、異なるベクター配給量を使用してヘテロダイマー形成を駆動することができる。つまり、驚くべきことに、タンパク質は、１：１：２の比率で第１のモノマー：第２のモノマー：軽鎖（ヘテロダイマー抗体を含む３つのポリペプチドを有する実施形態など）を含むが、これらは最良の結果をもたらす比率ではない。 In some embodiments, the nucleic acids encoding each monomer are contained within a single expression vector, each generally under different or the same promoter control, as applicable depending on the format. In embodiments specifically used in the present invention, each of these two or three nucleic acids is contained in a different expression vector. As set forth herein and US Provisional Application No. 62 / 025,931, US Patent Application Publication No. 2015/0307629, and International Patent Publication No. WO2015 / 149077 (all incorporated herein by reference). , Different vector rations can be used to drive heterodimer formation. That is, surprisingly, the protein contains a first monomer: a second monomer: a light chain in a ratio of 1: 1: 2, such as an embodiment having three polypeptides comprising a heterodimer antibody. These are not the ratios that give the best results.

本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質は、当技術分野において周知のように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の融合タンパク質または抗体精製工程が実施される。本明細書で考察されるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。すなわち、各モノマーが異なる等電点（ｐＩ）を有し、ヘテロダイマーも異なるｐＩを有するように、各モノマーのｐＩを変化させるｐＩ置換を含むことによって、ヘテロダイマーの等電点精製（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー）を促進する。これらの置換はまた、精製後の任意の混入したホモダイマーの特定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。 The bifunctional heterodimer fusion protein of the present invention is produced by culturing a host cell containing an expression vector (s), as is well known in the art. Once produced, conventional fusion protein or antibody purification steps, including ion exchange chromatography steps, are performed. As discussed herein, the difference in pI between the two monomers by at least 0.5 results in ion exchange chromatography or isoelectric focusing, or separation by other methods sensitive to isoelectric points. It is possible. That is, isoelectric point purification of the heterodimer (eg, by including a pI substitution that changes the pI of each monomer so that each monomer has a different isoelectric point (pI) and the heterodimer also has a different pI. Anion exchange chromatography, cation exchange chromatography) is promoted. These substitutions also help identify and monitor any contaminating homodimers after purification (eg, IEF gels, cIEFs, and analytical IEX columns).

ＩＸ．二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質の生物学的および生化学的機能
一般に、本発明の二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質は、本明細書に記載されるようないくつかの方法で、癌患者に投与され、有効性を評価する。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、リンパ節（ＬＮ）関与、転移等といった他の測定と併せて、免疫状態（例えば、イピリムマブ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を実施することができる。このため、以下のいずれかまたはすべてを評価することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活性および／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇に対するＰＶＲＩＧの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖ならびにＴｒｅｇもしくは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するチェックポイントの増強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α産生に対するチェックポイントの効果。 IX. Biological and biochemical functions of the bifunctional IL-15 / IL-15Rα × antigen-binding domain heterodimer fusion protein In general, the bifunctional IL-15 / IL-15Rα × antigen-binding domain heterodimer fusion protein of the present invention. Is administered to cancer patients and evaluated for efficacy in several ways, as described herein. Thus, while standard assays for efficacy can be performed, such as assessing cancer volume, tumor size, presence or extent of metastasis, immuno-oncological treatment can also be assessed based on immune status assessment. This can be done in several ways, including both in vitro and in vivo assays. For example, assessment of changes in immune status (eg, the presence of ICOS + CD4 + T cells after ipilimumab treatment) can be performed in conjunction with other measurements such as tumor mass, size, invasiveness, lymph node (LN) involvement, metastasis, etc. it can. Therefore, any or all of the following can be evaluated. CD4 + T cell activation or proliferation, CD8 + T (CTL) cell activation or proliferation, CD8 + T cell-mediated cytotoxic activity and / or CTL-mediated cytotoxicity, NK cell activity and PVRIG inhibitory effect on NK-mediated cell depletion, Treg Checkpoint enhancing effects on cytotoxicity and proliferation and Treg or bone marrow-derived suppressor cell (MDSC) -mediated immunosuppression or immune resistance, and / or inflammatory cytokine production by immune cells, such as IL by T cells or other immune cells. -2, The effect of checkpoints on IFN-γ, or TNF-α production.

いくつかの実施形態では、処理の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞の増殖を評価することによって実施される。 In some embodiments, evaluation of the process, for example, CFSE dilution method, Ki67 intracellular staining of immune effector cells, and 3 H- using thymidine incorporation method is carried out by evaluating the proliferation of immune cells To.

いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって行われる。 In some embodiments, the evaluation of treatment comprises one or more of the cellular degranulations measured by surface expression of CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40, and CD107A of gene expression. It is done by assessing the increased protein levels of the increased or activation-related markers.

一般に、遺伝子発現アッセイは、当技術分野で既知のとおり行われる。 In general, gene expression assays are performed as known in the art.

一般に、タンパク質発現測定も同様に、当技術分野で既知のとおり実施される。 In general, protein expression measurements are also performed as known in the art.

いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性等の多数の細胞パラメーターを推測することによる標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが挙げられるが、これらに限定されない。 In some embodiments, evaluation of treatment is by inferring a number of cellular parameters such as enzyme activity (including protease activity), cell membrane permeability, cell adhesion, ATP production, coenzyme production, and nucleotide uptake activity. This is done by assessing cytotoxic activity as measured by target cell viability detection. Specific examples of these assays include trypan blue or PI staining, 51 Cr or 35 S release methods, LDH activity, MTT and / or WST assay, calcein-AM assay, luminescent system assay, and others. However, it is not limited to these.

いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。 In some embodiments, evaluation of treatment is performed by assessing T cell activity as measured by cytokine production and using well-known techniques, IFNγ, TNFα, GM-CSF, IL2, IL6, IL4. , IL5, IL10, IL13, but not limited to cytokines, are measured intracellularly in culture supernatant.

したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる。（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβおよび／またはγδのＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性を減少させるかまたは排除すること。 Therefore, evaluation of treatment can be performed using an assay that evaluates one or more of the following: (I) to increase the immune response, (ii) to increase the activation of αβ and / or γδ T cells, (iii) to increase the cytotoxic T cell activity, (iv) NK and / or Increasing NKT cell activity, (v) reducing T cell suppression of αβ and / or γδ, (vi) increasing proinflammatory cytokine secretion, (vii) increasing IL-2 secretion, Increasing (viii) interferon-γ production, increasing (ix) Th1 response, decreasing (x) Th2 response, (xi) at least one cell number of regulatory T cells (Treg) and / Or to reduce or eliminate activity.

Ａ．有効性および効力を測定するアッセイ
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当技術分野において既知の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 A. Assays to Measure Efficacy and Efficacy In some embodiments, T cell activation is assessed using a mixed lymphocyte reaction (MLR) assay known in the art. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される、免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in the immune response, measured, for example, by phosphorylation or dephosphorylation of different factors, or by measuring other post-translational modifications. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by cytokine secretion or proliferation, or by altered expression of activation markers such as CD137, CD107a, PD1, etc., αβ and / or γδ. The increase or decrease in T cell activation is measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is performed, for example, by direct killing of a target cell such as a cancer cell, by cytokine secretion, or by proliferation, or of an activation marker such as CD137, CD107a, PD1 and the like. The increase or decrease in cytotoxic T cell activity, as measured by changes in expression, is measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、またはＣＤ１０７ａ等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by direct killing of target cells such as cancer cells, or by cytokine secretion, or by altered expression of activation markers such as in CD107a. The increase or decrease in NK and / or NKT cell activity is measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by cytokine secretion or proliferation, or by altered expression of activation markers such as CD137, CD107a, PD1, etc., αβ and / or γδ. Measure the increase or decrease in T cell inhibition. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、炎症促進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured by, for example, ELISA, or Luminex, by multiplex bead-based methods, by intracellular staining and FACS analysis, or by Alispot and the like, pro-inflammatory cytokine secretion. Measure the increase or decrease of. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、ＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured by, for example, ELISA, or Luminex, by a multiplex bead system method, by intracellular staining and FACS analysis, or by Alispot, etc., of IL-2 secretion. Measure increase or decrease. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、インターフェロン−γ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is of interferon-γ production, as measured by, for example, ELISA, or Luminex, by multiplex bead-based methods, by intracellular staining and FACS analysis, or by Alispot and the like. Measure increase or decrease. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in Th1 response, measured, for example, by cytokine secretion or by altered expression of activation markers. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in Th2 response, measured, for example, by cytokine secretion or by altered expression of an activation marker. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in the number and / or activity of at least one of the regulatory T cells (Tregs) measured, for example, by flow cytometry or by IHC. .. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｍ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in the number of M2 macrophage cells, measured, for example, by flow cytometry or by IHC. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｍ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in M2 macrophage tumorigenesis promoting activity, measured, for example, by cytokine secretion or by altered expression of activation markers. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｎ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in N2 neutrophilia, measured, for example, by flow cytometry or by IHC. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in N2 neutrophil tumorigenic activity as measured, for example, by cytokine secretion or by altered expression of activation markers. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is of T cell activation, measured, for example, by cytokine secretion or proliferation, or by altered expression of activation markers such as CD137, CD107a, PD1 and the like. Measure the increase or decrease in inhibition. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is performed, for example, by direct killing of a target cell such as a cancer cell, or by cytokine secretion, or by proliferation, or of an activation marker such as CD137, CD107a, PD1 and the like. The increase or decrease in inhibition of CTL activation, as measured by changes in expression, is measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。 In one embodiment, the signaling pathway assay measures an increase or decrease in αβ and / or γδ T cell depletion, measured, for example, by changes in the expression of activation markers. Decreased response indicates immunostimulatory activity. The appropriate decrease is the same as for the increase outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by cytokine secretion or proliferation, or by altered expression of activation markers such as CD137, CD107a, PD1, etc., αβ and / or γδ. Measure the increase or decrease in T cell response. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is a stimulation of an antigen-specific memory response, measured, for example, by cytokine secretion or by proliferation, or by altered expression of activation markers such as CD45RA, CCR7, etc. Measure the increase or decrease of. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞のアポトーシスまたは細胞溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is performed, for example, by a cytotoxic assay such as MTT, 15 Cr release, calcein AM, or by a flow cytometric assay such as, for example, CFSE dilution or propidium iodide staining. Measure the increase or decrease in apoptosis or cell lysis of cancer cells to be measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、またはＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞に作用する細胞傷害性または細胞増殖抑制性の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by a cytotoxic assay such as MTT, 15 Cr release, Calcane AM, or by a flow cytometric assay such as CFSE dilution or propidium iodide staining. To measure the increase or decrease of cytotoxic or cell growth inhibitory stimuli that act on cancer cells. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is performed, for example, by a cytotoxic assay such as MTT, 15 Cr release, calcein AM, or by a flow cytometric assay such as, for example, CFSE dilution or propidium iodide staining. Measure the increase or decrease in direct killing of cancer cells to be measured. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイ測定は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, signal transduction pathway assay measurements measure an increase or decrease in Th17 activity, measured, for example, by cytokine secretion or by proliferation, or by altered expression of activation markers. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、またはＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、補体依存性細胞障害作用および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用の誘導の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。 In one embodiment, the signaling pathway assay is measured, for example, by a cytotoxic assay such as MTT, 15 Cr release, calcein AM, or by a flow cytometric assay such as CFSE dilution or propidium iodide staining. , To measure the increase or decrease in induction of complement-dependent cytotoxic effects and / or antibody-dependent cell-mediated cytotoxic effects. Increased activity indicates immunostimulatory activity. Appropriate increases in activity are outlined below.

一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加が、癌細胞殺傷の増強と一致する免疫調節を示し得る。 In one embodiment, T cell activation is performed, for example, by direct killing of a target cell such as a cancer cell, by cytokine secretion, or by proliferation, or of an activation marker such as CD137, CD107a, PD1 and the like. Measured by changes in expression. For T cells, cell surface markers of proliferation, activation (eg, CD25, CD69, CD137, PD1), cytotoxicity (ability to kill target cells), and cytokine production (eg, IL-2, IL-4). , IL-6, IFNγ, TNF-a, IL-10, IL-17A) may indicate immunomodulation consistent with enhanced cancer cell killing.

一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、またはＣＤ１０７ａなどの例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加が、癌細胞殺傷の増強と一致する免疫調節を示し得る。 In one embodiment, NK cell activation is measured, for example, by direct killing of target cells such as cancer cells, or by cytokine secretion, or by altered expression of activation markers such as in CD107a. For NK cells, proliferation, cytotoxicity (ability to kill target cells and increase expression of CD107a, granzyme, and perforin), cytokine production (eg IFNγ and TNF), and cell surface receptor expression (eg CD25). ) May indicate immunomodulation consistent with enhanced cancer cell killing.

一実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。 In one embodiment, γδ T cell activation is measured, for example, by cytokine secretion or proliferation, or by altered expression of activation markers.

一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。 In one embodiment, Th1 cell activation is measured, for example, by cytokine secretion or by altered expression of activation markers.

活性または応答の適切な増加（または必要に応じて上で概説した減少）とは、基準試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質を含まない試験試料におけるシグナルと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、参照対象または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の増加が有効性を示す。 Appropriate increase in activity or response (or decrease outlined above if necessary) is either a reference sample or a control sample, eg, IL-15 / IL-15Rα × antigen binding domain heterodimer fusion of the present invention. At least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 98-99% percent compared to the signal in the protein-free test sample. It is an increase. Similarly, an increase of at least 1-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold or 5-fold is effective compared to the reference or control sample.

Ｘ．治療
一旦生成されると、本発明の組成物は、一般に、本発明のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の結合Ｔ細胞活を用いて性化を促進すること（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）による、癌治療によって、いくつかの腫瘍学適用に使用される。 X. Therapeutic Once generated, the compositions of the invention are generally by promoting sexualization using the binding T cell activity of the heterodimeric Fc fusion proteins of the invention (eg, T cells are no longer suppressed). Used by some oncology applications by cancer treatment.

したがって、本発明の二機能性ヘテロダイマー組成物はこれらの癌の治療に使用される。 Therefore, the bifunctional heterodimer compositions of the present invention are used in the treatment of these cancers.

Ａ．インビボ投与のための二機能性ヘテロダイマータンパク質組成物
いくつかの実施形態では、本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、別個の抗体と同時投与される。当業者に理解されるように、同時投与は、同時にまたは連続して実施することができる。 A. Bifunctional Heterodimer Protein Composition for In vivo Administration In some embodiments, the bifunctional heterodimer protein of the invention is co-administered with a separate antibody. As will be appreciated by those skilled in the art, co-administration can be performed simultaneously or sequentially.

本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般に概説されるとおり）と混合することによって、保存のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。許容される担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。 Formulations of antibodies used in accordance with the present invention include antibodies of the desired purity, optionally pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. et al. Prepared in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions for storage by mixing with Ed. [As generally outlined in 1980]. Acceptable carriers, buffers, excipients, or stabilizers are non-toxic to the recipient at the dosage and concentration used and buffers such as phosphoric acid, citrate, and other organic acids. Antioxidants containing ascorbic acid and methionine; preservatives (octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl, or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl or propylparaben; Catecol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol Salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg, Zn-protein complexes); and / or nonionic surfactants such as TWEEN ™, PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG).

Ｂ．投与様式
本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの既知の方法に従って、化学療法剤とともに対象に投与することができる。二機能性ヘテロダイマータンパク質および化学療法剤の投与は、当業者によって理解されるように、同時にまたは連続して実施することができる。 B. Dosage regimen The bifunctional heterodimer protein of the invention can be administered to a subject with a chemotherapeutic agent according to known methods such as intravenous administration as a bolus or continuous infusion over a period of time. Administration of the bifunctional heterodimer protein and chemotherapeutic agent can be performed simultaneously or consecutively, as will be appreciated by those skilled in the art.

Ｃ．治療法
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。 C. Therapeutic Methods In the methods of the invention, therapies are used to provide a positive therapeutic response with respect to a disease or condition. A "positive therapeutic response" is intended to improve the disease or condition and / or the symptoms associated with the disease or condition. For example, a positive therapeutic response can refer to one or more of the following ameliorations in the disease: (1) decrease in tumor cell number, (2) increase in tumor cell death, (3) tumor cell survival. Inhibition of, (5) inhibition of tumor growth (ie, some slowdown, preferably cessation), (6) increased patient survival, and (7) some of the symptoms associated with the disease or condition. release.

任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評価され得る。 A positive therapeutic response in any given disease or condition can be determined by standardized response criteria specific to that disease or condition. Tumor responses include tumors including magnetic resonance imaging (MRI) scans, X-rays, computed tomography (CT) scans, bone scans, endoscopy, and bone marrow aspiration (BMA) and counting of circulating tumor cells. Screening techniques such as biopsy sampling can be used to assess changes in tumor morphology (ie, systemic tumor tissue mass, tumor size, etc.).

これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。 In addition to these positive therapeutic responses, the subject being treated may experience the beneficial effects of ameliorating disease-related symptoms.

本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量および期間で有効な量をいう。 Treatment according to the present invention includes a "therapeutically effective amount" of the drug used. "Therapeutically effective amount" refers to an amount effective at the dosage and duration required to achieve the desired therapeutic result.

治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、二機能性ヘテロダイマータンパク質、抗原結合ドメイン、またはそれらの部分のいかなる毒性または有害な影響よりも治療上有益な効果が勝る量である。 The therapeutically effective amount may depend on factors such as the individual's disease state, age, gender, and body weight, and the ability of the drug to elicit the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also an amount that outweighs any toxic or detrimental effects of the bifunctional heterodimer protein, antigen binding domain, or parts thereof in a therapeutically beneficial effect.

腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。 A "therapeutically effective amount" for tumor therapy can also be measured by its ability to stabilize disease progression. The ability of compounds to inhibit cancer may be evaluated in animal model systems that predict efficacy in human tumors.

あるいは、組成物のこの特性は、当業者に既知のインビトロアッセイによって、化合物または組成物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を調べることによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。 Alternatively, this property of the composition may be assessed by examining the ability of the compound or composition to inhibit cell proliferation or induce apoptosis by an in vitro assay known to those of skill in the art. A therapeutically effective amount of a therapeutic compound may reduce tumor size or otherwise alleviate the subject's symptoms. One of ordinary skill in the art will be able to determine such amounts based on factors such as the size of the subject, the severity of the subject's symptoms, and the particular composition or route of administration selected.

投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。 The dosing regimen is adjusted to provide the optimal desired response (eg, therapeutic response). For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased as indicated by the urgency of the treatment situation. Good. Parenteral compositions may be formulated in unit dosage form for ease of administration and dosage homogeneity. Unit dosage forms as used herein refer to physically separate units suitable as a single dosage for a subject to be treated, each unit in relation to the required pharmaceutical carrier. It contains a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect.

本発明の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。 The specification of unit dosage form forms of the present invention is the field of formulating such active compounds for (a) the unique characteristics of active compounds and the particular therapeutic effect to be achieved, and (b) the treatment of susceptibility in individuals. It is affected by and directly dependent on the restrictions that follow.

本発明で使用される二機能性ヘテロダイマータンパク質の効率的な投薬量及び投薬レジメンは、治療される疾患または病態に依存し、当業者によって決定され得る。 Efficient dosages and dosing regimens of the bifunctional heterodimer protein used in the present invention will depend on the disease or condition being treated and can be determined by one of ordinary skill in the art.

すべての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。 All citations are expressly incorporated herein by reference in their entirety.

本発明の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。 Although specific embodiments of the present invention have been described above for illustrative purposes, those skilled in the art will be able to make numerous modifications of the details without departing from the invention as described in the appended claims. Will be understood.

本発明を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で論じられるすべての定常領域位置について、付番は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により全体が組み込まれる）と同様のＥＵインデックスに従う。抗体の技術分野の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的な付番からなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への標準的な基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続配列に対応しない。 Examples are provided below to illustrate the invention. These examples are not meant to limit the invention to any particular application or theory of operation. For all steady-state region positions discussed in the present invention, the numbers are Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Information, 5th Ed., United States Public Health, See, United States Public Health, Inc., United States Public Health Service. Follows the same EU index as). Those skilled in the art of antibodies will appreciate that this rule consists of discontinuous numbering of immunoglobulin sequences in specific regions, allowing standard reference to conserved positions in the immunoglobulin family. Will do. Therefore, the position of any given immunoglobulin as defined by the EU index does not necessarily correspond to its contiguous sequence.

一般的および具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、および国際特許出願第ＷＯ２０１４／１４５８０６号に概説されており、それらはすべて、特にその中で概説される技術に関して、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。 General and specific science and technology are outlined in U.S. Patent Application Publication Nos. 2015/0387629, 2014/0288275, and International Patent Application WO2014 / 145806, all of which are in particular. With respect to the techniques outlined, the references explicitly incorporate them in their entirety.

実施例１：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合タンパク質
１Ａ：ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の操作
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロダイマーの短い半減期に対処するために、産生の促進および複合体のＦｃＲｎ媒介リサイクルの促進および半減期の延長を目的として、Ｆｃ融合体としてＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体（以下、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と呼ばれる）を生成した。 Example 1: IL-15 / IL-15Rα Fc fusion protein 1A: Manipulation of IL-15 / Rα-Fc fusion protein Promotion and combination of production to address the short half-life of the IL-15 / IL-15Rα heterodimer. An IL-15 / IL-15Rα (sushi) complex (hereinafter referred to as IL-15 / Rα-Fc fusion protein) was produced as an Fc fusion for the purpose of promoting FcRn-mediated recycling of the body and prolonging the half-life. ..

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインをコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質フォーマットの略図を図１６Ａ〜１６Ｇに示す。 A plasmid encoding the IL-15 or IL-15Rαshsi domain was constructed by standard gene synthesis followed by subcloning into a pTT5 expression vector containing an Fc fusion partner (eg, the constant region shown in FIG. 8). Schematic representations of an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein format are shown in FIGS. 16A-16G.

ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃフォーマット（図１６Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５が含まれ、その配列を図１７に示す。ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｂ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２１４７８およびＸＥＮＰ２１９９３が含まれ、その配列を図１８に示す。ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｃ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６、およびＸＥＮＰ２４３４８が含まれ、それらの配列を図１９に示す。二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマットの（図１６Ｄ）の例示的タンパク質はＸＥＮＰ２１９７８であり、その配列は図２０に示す。二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｅ）の例示的タンパク質の配列を図２１に示す。Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図１６Ｆ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３７およびＸＥＮＰ２２６３８が含まれ、その配列を図２２に示す。Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図１６Ｇ）の例示的タンパク質の配列を図２３に示す。 Illustrative proteins in the IL-15 / Rα hetero-Fc format (FIG. 16A) include XENP20818 and XENP21475, the sequences of which are shown in FIG. Illustrative proteins in the scIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 16B) include XENP21478 and XENP21993, the sequences of which are shown in FIG. Illustrative proteins in the ncIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 16C) include XENP21479, XENP22366, and XENP24348, the sequences of which are shown in FIG. An exemplary protein in the divalent ncIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 16D) is XENP21978, the sequence of which is shown in FIG. The sequence of exemplary proteins in the divalent scIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 16E) is shown in FIG. Illustrative proteins in the Fc-ncIL-15 / Rα format (FIG. 16F) include XENP22637 and XENP22638, the sequences of which are shown in FIG. The sequence of exemplary proteins in the Fc-scIL-15 / Rα format (FIG. 16G) is shown in FIG.

タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５と１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。 The protein is produced by transient transfection in HEK293E cells and is 5-40 with protein A chromatography (GE Healthcare) and anion exchange chromatography (50 mM Tris pH 8.5 and 50 mM Tris pH 8.5 containing 1M NaCl). Purified by a two-step purification process involving a HiTrapQ 5 mL column with a% gradient).

上述のような様々なフォーマットのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の４日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５（Ｈｉ１００）で染色し、以下の細胞型についてゲートした：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。Ｋｉ６７は細胞増殖と厳密に関連するタンパク質であり、そして細胞内Ｋｉ６７についての染色は抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）およびＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して実施された。上述の細胞型に対するＫｉ６７の割合は、ＦＡＣＳを使用して測定された（図２４Ａ〜２４Ｃおよび２５Ａ〜２５Ｃに示す）。様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の強い増殖を誘導した。特に、増殖活性の差異は、ＩＬ−１５−Ｆｃ側のリンカーの長さに依存していた。特に、ＸＥＮＰ２１４７１、ＸＥＮＰ２１４７４、およびＸＥＮＰ２１４７５を含む、リンカーを有さない（ヒンジのみ）構築物は、より弱い増殖活性を示した。 Various formats of IL-15 / Rα-Fc fusion proteins as described above were tested in cell proliferation assays. Human PBMCs were treated with test materials at specified concentrations. 4 days after treatment, PBMC was treated with anti-CD8-FITC (RPA-T8), anti-CD4-PerCP / Cy5.5 (OKT4), anti-CD27-PE (M-T271), anti-CD56-BV421 (5.1H11), anti-CD8-BV421 (5.1H11) Stained with CD16-BV421 (3G8) and anti-CD45RA-BV605 (Hi100) and gated for the following cell types: CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells (CD56 + / CD16 +). Ki67 is a protein closely associated with cell proliferation, and staining for intracellular Ki67 uses anti-Ki67-APC (Ki-67) and Foxp3 / transcription factor staining buffer set (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass). It was carried out. The ratio of Ki67 to the above cell types was measured using FACS (shown in FIGS. 24A-24C and 25A-25C). Various IL-15 / Rα-Fc fusion proteins induced strong proliferation of CD8 + T cells and NK cells. In particular, the difference in proliferative activity depended on the length of the linker on the IL-15-Fc side. In particular, linker-free (hinge-only) constructs containing XENP21471, XENP21474, and XENP21475 showed weaker proliferative activity.

１Ｂ：操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の安定性をさらに向上させ、半減期を延ばすために、ＩＬ−１５／Ｒα境界面においてジスルフィド結合を操作した。ＩＬ−１５／Ｒα複合体の結晶構造を調べることによって、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）ソフトウェアを用いてモデリングすることによって、図２６に示されるように、共有ジスルフィド結合を形成するためにシステインで置換し得るＩＬ−１５／Ｒα境界面の残基を予測した。さらに、ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに続く３個までのアミノ酸を、操作するシステインの足場としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端に付加した（その例示的な配列を図２７に示す）。システインで操作された例示的なＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列をそれぞれ図２８および２９に示す。 1B: IL-15 / Rα-Fc fusion protein with engineered disulfide bond At the IL-15 / Rα interface to further improve the stability and extend the half-life of the IL-15 / Rα-Fc fusion protein. The disulfide bond was manipulated. Shared as shown in FIG. 26 by investigating the crystal structure of the IL-15 / Rα complex and by modeling using the Molecular Operating Environment (MOE, Chemical Computing Group, Montreal, Queuebec, Canada) software. Predicted residues on the IL-15 / Rα interface that could be replaced with cysteine to form disulfide bonds. In addition, up to three amino acids following the sushi domain of IL-15Rα were added to the C-terminus of IL-15Rα (sushi) as a scaffold for the cysteine to be manipulated (an exemplary sequence is shown in FIG. 27). The sequences of exemplary IL-15 and IL-15Rα (sushi) variants engineered with cysteine are shown in FIGS. 28 and 29, respectively.

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された残基を、標準的な変異導入技術によってシステインで置換した。操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の略図を図３０Ａ〜３０Ｄに示す。 A plasmid encoding IL-15 or IL-15Rα (sushi) was constructed by standard gene synthesis followed by subcloning into a pTT5 expression vector containing an Fc fusion partner (eg, the constant region shown in FIG. 8). The residues identified as described above were replaced with cysteine by standard mutagenesis techniques. Schematic representations of IL-15 / Rα-Fc fusion proteins with engineered disulfide bonds are shown in FIGS. 30A-30D.

ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃフォーマット（図３０Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７が含まれ、それらの配列を図３１に示す。ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３０Ｂ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１が含まれ、それらの配列を図３２に示す。二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３０Ｃ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、ＸＥＮＰ２２６３６、およびＸＥＮＰ２２６８７が含まれ、それらの配列を図３３に示す。Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図３０Ｄ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０が含まれ、それらの配列を図３４に示す。 Illustrative proteins in the dsIL-15 / Rα-hetero Fc format (FIG. 30A) include XENP22013, XENP22014, XENP22015, and XENP22017, the sequences of which are shown in FIG. Illustrative proteins in the dsIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 30B) include XENP22357, XENP22358, XENP22359, XENP22684, and XENP22361, the sequences of which are shown in FIG. Illustrative proteins in the divalent dsIL-15 / Rα-Fc format (FIG. 30C) include XENP22634, XENP22635, XENP22636, and XENP22687, the sequences of which are shown in FIG. Illustrative proteins in the Fc-dsIL-15 / Rα format (FIG. 30D) include XENP22639 and XENP22640, the sequences of which are shown in FIG.

タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５と１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。 The protein is produced by transient transfection in HEK293E cells and is 5-40 with protein A chromatography (GE Healthcare) and anion exchange chromatography (50 mM Tris pH 8.5 and 50 mM Tris pH 8.5 containing 1M NaCl). Purified by a two-step purification process involving a HiTrapQ 5 mL column with a% gradient).

タンパク質が精製された後、それらは純度および均質性についてキャピラリー等電点電気泳動（ＣＥＦ）によって分析された。製造者の使用説明書を使用して実施したＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ ＬａｂＣｈｉｐおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用するＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ）を使用してＣＥＦを実施した。試料は、一方を還元下（ジチオトレイトールを用いて）、他方を非還元条件下で二重に試験した。変性非還元ＣＥＦによって示されるように、多くのジスルフィド結合が正しく形成され、操作されたジスルフィド結合を含まない対照と比較した場合、共有結合複合体のより大きい分子量が観察され得る（図３５）。 After the proteins were purified, they were analyzed for purity and homogeneity by capillary isoelectric focusing (CEF). LabChip GXII Touch HT (PerkinElmer, Waltham, Waltham) using Protein Express Assay LabChip and Protein Express Assay Reagent Kit performed using the manufacturer's instructions. Samples were doubly tested, one under reducing (using dithiothreitol) and the other under non-reducing conditions. As shown by the modified non-reducing CEF, many disulfide bonds are correctly formed and higher molecular weights of the covalent complex can be observed when compared to controls that do not contain engineered disulfide bonds (FIG. 35).

次いでタンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作されたジスルフィド結合を有する場合または有さない場合）または対照をＰＢＭＣとともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を図３６Ａ〜３６Ｃに示す。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＬ−１５対照のそれぞれが、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。 The protein was then tested in a cell proliferation assay. IL-15 / Rα-Fc fusion proteins (with or without engineered disulfide bonds) or controls were incubated with PBMCs for 4 days. After incubation, PBMC was treated with anti-CD4-PerCP / Cy5.5 (RPA-T4), anti-CD8-FITC (RPA-T8), anti-CD45RA-BV510 (HI100), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD56-BV421 ( Various cell populations were labeled with HCD56), anti-CD27-PE (O323), and anti-Ki67-APC (Ki-67) and analyzed by FACS. The proliferation of NK cells, CD4 + T cells, and CD8 + T cells exhibited by Ki67 expression is shown in FIGS. 36A-36C. Each of the IL-15 / Rα-Fc fusion protein and IL-15 control induced strong proliferation of NK cells, CD8 + T cells, and CD4 + T cells.

１Ｃ：より低い効力およびＰＫおよび半減期を増加させるために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＰＫをさらに改善し半減期を延長するために、ＩＬ−１５の効力を低下させることが抗原シンクを減少させるので、半減期を増加させるだろうと推論した。ＩＬ−１５：ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−１５：共通γ鎖の界面の結晶構造を調べることによって、ならびにＭＯＥソフトウェアを使用してモデリングすることによって、効力を低減させるために置換され得るこれらの境界面における残基を予測した。図３７は、（免疫原性のリスクを低減するために）等配電子置換を操作した推定残基の位置を示すＩＬ−１５：受容体複合体の構造モデルを示す。効力低下のために設計された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を図３に示す。 1C: IL-15 / Rα-Fc fusion protein engineered to increase PK and half-life with lower potency To further improve PK and prolong half-life, reduce IL-15 potency It was inferred that it would increase the half-life because it would reduce the antigen sink. IL-15: IL-2Rβ and IL-15: These interface which can be replaced to reduce efficacy by examining the crystal structure of the interface of the common γ chain and by modeling using MOE software. Predicted residues in. FIG. 37 shows a structural model of the IL-15: receptor complex showing the location of putative residues that have been engineered for isotopic electron substitution (to reduce the risk of immunogenicity). The sequence of exemplary IL-15 variants designed for reduced efficacy is shown in FIG.

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８Ａ〜８Ｄに示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された置換を、標準的な変異導入技術によって組み込んだ。効力低下のために操作された「ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図３９Ａ〜３９Ｅに示す。効力低下のために操作された「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４０Ａ〜４０Ｄに示す。効力低下のために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４１Ａ〜４１Ｂに示す。効力低下のために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーの配列を図４２に示す。効力低下のために操作された「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４３に示す。効力低下のために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４４に示す。 A plasmid encoding IL-15 or IL-15Rα (sushi) was constructed by standard gene synthesis followed by subcloning into a pTT5 expression vector containing an Fc fusion partner (eg, the constant region shown in FIGS. 8A-8D). .. The substitutions identified as described above were incorporated by standard mutagenesis techniques. The sequences of exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "IL-15 / Rα hetero-Fc" format engineered for reduced potency are shown in Figures 39A-39E. The sequences of exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "scIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced potency are shown in Figures 40A-40D. The sequences of exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion proteins in the "ncIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced potency are shown in FIGS. 41A-41B. An exemplary ncIL-15 / Rα heterodimer sequence engineered for reduced efficacy is shown in FIG. The sequence of an exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein in the "divalent nc IL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced efficacy is shown in FIG. An exemplary IL-15 / Rα-Fc fusion protein sequence in the "dsIL-15 / Rα-Fc" format engineered for reduced efficacy is shown in FIG.

タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５と１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。 The protein is produced by transient transfection in HEK293E cells and is 5-40 with protein A chromatography (GE Healthcare) and anion exchange chromatography (50 mM Tris pH 8.5 and 50 mM Tris pH 8.5 containing 1M NaCl). Purified by a two-step purification process involving a HiTrapQ 5 mL column with a% gradient).

１Ｃ（ａ）：効力の低下のために操作されたバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性
バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をいくつかの細胞増殖アッセイで試験した。 1C (a): In vitro activity of variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein engineered for reduced potency Variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was tested in several cell proliferation assays.

最初の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作された置換を有する場合または有さない場合）または対照をＰＢＭＣとともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ６０５（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を図４５〜４６に示す。ほとんどのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は各細胞集団の増殖を誘導したが、活性は特定の操作された置換に依存して変化した。 In the first cell proliferation assay, IL-15 / Rα-Fc fusion proteins (with or without engineered substitutions) or controls were incubated with PBMCs for 4 days. After incubation, PBMC was subjected to anti-CD4-Evolve605 (SK-3), anti-CD8-PerCP / Cy5.5 (RPA-T8), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), anti-CD16-eFluor450 (CB16), anti-CD56- Various cell populations were labeled by staining with eFluor450 (TULY56), anti-CD3-FITC (OKT3), and anti-Ki67-APC (Ki-67) and analyzed by FACS. The proliferation of NK cells, CD8 + T cells, and CD4 + T cells exhibited by Ki67 expression is shown in FIGS. 45-46. Most IL-15 / Rα-Fc fusion proteins induced proliferation in each cell population, but activity varied depending on the particular engineered substitution.

第２の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作された置換を有する場合または有さない場合）をＰＢＭＣとともに３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ ６０４（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（２０Ｒａｊ１）抗体で染色して様々な細胞集団をマークした。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次にリンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートした。ＣＤ３発現について陰性の細胞をさらにＣＤ１６発現に基づいてゲートしてＮＫ細胞（ＣＤ１６＋）を同定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を同定するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡ発現についてゲートした。最後に、様々な細胞集団の増殖を、Ｋｉ６７発現の割合に基づいて決定し、データを図４７Ａ〜Ｄに示す。ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に対してＣＤ４＋Ｔ細胞よりも感受性であり、そして上述のように、増殖活性は特定の操作された置換に応じて変化した。図４７Ｄは、対照ＸＥＮＰ２０８１８に対する様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＥＣ５０の倍率変化を示す。図４８Ａおよび４８Ｂは、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション前後のＣＤ６９およびＣＤ２５（Ｔ細胞活性化マーカー）の発現についてゲートすることによって、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による処理後のリンパ球の活性化をさらに示す。 In the second cell proliferation assay, IL-15 / Rα-Fc fusion proteins (with or without engineered substitutions) were incubated with PBMCs for 3 days. After incubation, PBMC was treated with anti-CD3-FITC (OKT3), anti-CD4-Evolve 604 (SK-3), anti-CD8-PerCP / Cy5.5 (RPA-T8), anti-CD16-eFluor450 (CB16), anti-CD56-eFluor450. Various cell populations were marked by staining with (TULY56), anti-CD27-PE (O323), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100) and anti-Ki67-APC (20Raj1) antibodies. First, lymphocytes were gated based on backscatter (SSC) and forward scatter (FSC). Lymphocytes were then gated based on CD3 expression. Cells negative for CD3 expression were further gated based on CD16 expression to identify NK cells (CD16 +). CD3 + T cells were further gated based on CD4 and CD8 expression to identify CD4 + T cells, CD8 + T cells, and γδ T cells (CD3 + CD4-CD8-). CD4 + and CD8 + T cells were gated for CD45RA expression. Finally, the proliferation of various cell populations was determined based on the rate of Ki67 expression and the data are shown in Figures 47A-D. NK and CD8 + T cells were more sensitive to the IL-15 / Rα-Fc fusion protein than CD4 + T cells, and as mentioned above, proliferative activity changed in response to specific engineered substitutions. FIG. 47D shows the magnification changes of EC50 of various IL-15 / Rα-Fc fusion proteins relative to control XENP20818. Figures 48A and 48B show activation of lymphocytes after treatment with the IL-15 / Rα-Fc fusion protein by gated for expression of CD69 and CD25 (T cell activation markers) before and after incubation with PBMC and XENP22821. Is further shown.

第３の実験において、追加のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＳＢ６００（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞の増殖を図４９Ａ〜４９Ｄに示す。 In a third experiment, an additional variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was incubated with human PBMCs at 37 ° C. for 3 days. After incubation, PBMC was treated with anti-CD3-FITC (OKT3), anti-CD4-SB600 (SK-3), anti-CD8-PerCP / Cy5.5 (RPA-T8), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), anti-CD16- Various cell populations were labeled with eFluor450 (CB16), anti-CD25-PE (MA251), and anti-Ki67-APC (Ki-67) and analyzed by FACS. Proliferation of CD8 + (CD45RA-) T cells, CD4 + (CD45RA-) T cells, γδ T cells, and NK cells indicated by Ki67 expression is shown in FIGS. 49A-49D.

第４の実験において、ヒトＰＢＭＣを示された濃度の追加のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃバリアントとともに３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（ＳＢ６００）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。処理後のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５０に示す。 In a fourth experiment, human PBMCs were incubated with additional IL-15 / Rα-Fc variants at the indicated concentrations for 3 days. After incubation, PBMC was treated with anti-CD3-FITC (OKT3), anti-CD4 (SB600), anti-CD8-PerCP / Cy5.5 (RPA-T8), anti-CD16-eFluor450 (CB16), anti-CD25-PE (MA251). , Anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), and anti-Ki67-APC (Ki67) and analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to treated CD8 + T cells, CD4 + T cells, and NK cells is shown in FIG.

第５の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（２ＳＴ８．５Ｈ７）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５１Ａ〜５１Ｅに示す。 In a fifth experiment, the variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was incubated with human PBMCs at 37 ° C. for 3 days. After incubation, cells are subjected to anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (SK1), anti-CD8β-APC (2ST8.5H7), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD8 Stain with CD25-PerCP / Cy5.5 (MA251), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), anti-CD56-BV605 (NCAM16.2), and anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) and FACS Analyzed by. The ratio of Ki67 to CD8 + T cells, CD4 + T cells, γδ T cells, and NK cells is shown in FIGS. 51A to 51E.

第６の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５２Ａ〜５２Ｅに示す。 In the sixth experiment, the variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was incubated with human PBMCs at 37 ° C. for 3 days. After incubation, cells are subjected to anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (SK1), anti-CD8β-APC (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD25- Stained with PerCP / Cy5.5 (M-A251), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), anti-CD56-BV605 (NCAM16.2), and anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) and analyzed by FACS. did. The ratio of Ki67 to CD8 + T cells, CD4 + T cells, γδ T cells, and NK cells is shown in FIGS. 52A to 52E.

第７の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を指定濃度でヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を図５３Ａ〜Ｄに示す。データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。各ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、増殖を誘導することにおいてＸＥＮＰ２１４７９よりも効力が弱かったが、差異はリンカーの長さと特定の操作された置換の両方に依存していた。 In the seventh experiment, the variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was incubated with human PBMCs at specified concentrations for 3 days at 37 ° C. After incubation, PBMC was subjected to anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8-APC (RPA-T8), anti-CD16-BV605 (3G8), anti-CD25-PerCP / Cy5.5 ( It was stained with M-A251), anti-CD45RA-APC / Fire750 (HI100), and anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) and analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to CD8 + T cells, CD4 + T cells, γδ T cells, and NK (CD16 +) cells is shown in FIGS. 53A to 53D. The data show that the ncIL-15 / Rα-Fc fusion protein XENP21479 is the most potent inducer of proliferation of CD8 + T cells, CD4 + T cells, NK (CD16 +) cells, and γδ T cells. Each scIL-15 / Rα-Fc fusion protein was less potent than XENP21479 in inducing proliferation, but the difference was dependent on both linker length and specific engineered substitutions.

第８の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を指定濃度でヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を、それぞれ図５４Ａ〜Ｄに示す。上述のように、データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。特に、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２４３４９）へのＱ１０８Ｅ置換の導入は、野生型（ＸＥＮＰ２１４７９）と比較してその増殖活性を劇的に減少させる。 In the eighth experiment, the variant IL-15 / Rα-Fc fusion protein was incubated with human PBMC at specified concentrations for 3 days at 37 ° C. After incubation, PBMC was subjected to anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8-APC (RPA-T8), anti-CD16-BV605 (3G8), anti-CD25-PerCP / Cy5.5 ( It was stained with M-A251), anti-CD45RA-APC / Fire750 (HI100), and anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) and analyzed by FACS. The ratios of Ki67 to CD8 + T cells, CD4 + T cells, γδ T cells, and NK (CD16 +) cells are shown in FIGS. 54A to 54D, respectively. As mentioned above, the data show that the ncIL-15 / Rα-Fc fusion protein XENP21479 is the most potent inducer of proliferation of CD8 + T cells, CD4 + T cells, NK (CD16 +) cells, and γδ T cells. In particular, the introduction of Q108E substitutions into the ncIL-15 / Rα-Fc format (XENP24349) dramatically reduces its proliferative activity compared to the wild type (XENP21479).

１Ｃ（ｂ）：効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＰＫ
効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質が半減期およびＰＫを改善したかどうかを調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＫ試験においてこれらのバリアントを調べた。０日目に、２コホートのマウス（１コホートあたり試験試料あたり５匹のマウス）にＩＶ−ＴＶによって０．１ｍｇ／ｋｇの指定の試験物質を投与した。投与６０分後に、次いでコホート１では２、４、および７日目、そしてコホート２では１、３、および８日目に血清を採取した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の血清レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗ＩＬ−１５および抗ＩＬ−１５Ｒα抗体を用いて決定した。結果を図５５に示す。図５６は、試験物質の効力と半減期の間の相関関係を示す。予想通り、効力が低下したバリアントは実質的により長い半減期を示した。特に、半減期は、野生型対照ＸＥＮＰ２０８１８の０．５日と比較して、約９日まで改善された（ＸＥＮＰ２２８２１およびＸＥＮＰ２２８２２を参照）。 1C (b): PK of IL-15 / Rα-Fc fusion protein engineered for reduced efficacy
These variants were examined in PK studies in C57BL / 6 mice to determine if IL-15 / Rα-Fc fusion proteins engineered for reduced efficacy improved half-life and PK. On day 0, 2 cohorts of mice (5 mice per test sample per cohort) were administered 0.1 mg / kg of the designated test substance by IV-TV. Serum was collected 60 minutes after dosing, then on days 2, 4, and 7 in cohort 1, and on days 1, 3, and 8 in cohort 2. Serum levels of the IL-15 / Rα-Fc fusion protein were determined using anti-IL-15 and anti-IL-15 Rα antibodies in sandwich ELISA. The results are shown in FIG. FIG. 56 shows the correlation between potency and half-life of the test substance. As expected, the reduced efficacy variants showed a substantially longer half-life. In particular, the half-life was improved to about 9 days compared to 0.5 days for wild-type control XENP20818 (see XENP22821 and XENP22822).

例２：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合の操作
腫瘍が免疫除去から逃れるための１つの戦略は、Ｔ細胞による認識を避けるためのＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションによるものである（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。バックアップとして、ＮＫ細胞はＭＨＣ Ｉの非存在下で癌細胞を認識することができ、実際、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションを感作し得るする可能性があります（Ｚａｍａｉ，Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかし、癌患者ではＮＫ細胞数が減少していることが判明している（Ｌｅｖｙ，ＥＭ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。したがって、ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化構築物は、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体をＴｒｅｇから遠ざけるだけでなく、ＮＫ細胞を選択的に標的化し拡大させることを目的として生成された。 Example 2: NKG2A Targeting and NKG2D Targeting IL-15 / Rα-Fc Fusion Manipulation One strategy for tumors to escape immunoremoval is by down-regulation of MHC class I to avoid recognition by T cells. There is (Garrido, F et al., 2016). As a backup, NK cells can recognize cancer cells in the absence of MHC I and, in fact, may be able to sensitize downregulation of MHC class I by tumor cells (Zamai, Let al. , 2007). However, it has been found that the number of NK cells is reduced in cancer patients (Levy, EM et al., 2011). Therefore, NKG2A targeting and NKG2D targeting constructs were generated with the aim of not only keeping the IL-15 / Rα-Fc fusion away from the Treg, but also selectively targeting and expanding NK cells.

２Ａ：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の操作
モナリズマブのＶＨおよびＶＬ配列（２０１４年１２月２日発行の米国特許第８，９０１，２８３号に開示）は、概念実証としてのＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するために、Ｆａｂフォーマットでヒト化され操作された。二価フォーマットのモナリズマブ（キメラおよびヒト化）の配列は、図５８にＸＥＮＰ２４５４１およびＸＥＮＰ２４５４２として示す。 2A: NKG2A Targeted and NKG2D Targeted IL-15 / Rα-Fc Fusion Manipulation The VH and VL sequences of monarizumab (disclosed in US Pat. No. 8,901,283, issued December 2, 2014) are concepts. Humanized and engineered in Fab format for use as a component of the NKG2A targeted IL-15 / Rα-Fc fusion as a proof. The sequences of the divalent format monarizumab (chimera and humanized) are shown in FIG. 58 as XENP24541 and XENP24542.

抗ＮＫＧ２ＤのＶＨおよびＶＬ配列（２０１１年２月１日発行の米国特許第７，８７９，９８５号に開示）は、プロトタイプＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するためにＦａｂフォーマットで操作された。二価ｍＡｂ形式の配列を図５９にＸＥＮＰ２４３６５として示す。 The anti-NKG2D VH and VL sequences (disclosed in US Pat. No. 7,879,985, issued February 1, 2011) are for use as components of the prototype NKG2D targeted IL-15 / Rα-Fc fusion. It was operated in Fab format. The arrangement in the divalent mAb format is shown in FIG. 59 as XENP24365.

ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、図５７Ｄに示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットで生成され、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）を含む他方側がヘテロダイマーＦｃ領域の他方側のＮ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。例示的なＮＫＧ２Ａ標的ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２およびＸＥＮＰ２７１４６の配列を図６０に示し、例示的なＮＫＧ２Ｄ標的ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５の配列を図６１Ａ〜６１Ｂに示す。 The NKG2A and NKG2D targeted IL-15 / Rα-Fc fusions were produced in the scIL-15 / Rα × Fab format shown in FIG. 57D and contained a VH fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region by a variable length linker. The other side containing IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 (called "scIL-15 / Rα") fuses to the N-terminus of the other side of the heterodimer Fc region, but the corresponding light chain contains VH. Transfected separately to form a Fab. The sequences of exemplary NKG2A target IL-15 / Rα-Fc fusions XENP24531, XENP24532 and XENP27146 are shown in FIG. 60, and the sequences of exemplary NKG2D target IL-15 / Rα-Fc fusions XENP24533, XENP24534, and XENP27145 It is shown in FIGS. 61A to 61B.

上述のＶＨおよびＶＬ配列、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメイン、軽鎖定常領域、ならびにヘテロダイマー定常領域（図９に示す）をコードするプラスミドは、ギブソンアセンブリによって構築された。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。 The plasmids encoding the VH and VL sequences described above, the IL-15 and IL-15Rα (sushi) domains, the light chain constant region, and the heterodimer constant region (shown in FIG. 9) were constructed by Gibson assembly. The protein was produced by transient transfection on HEK293E cells and was purified by a two-step purification process involving protein A chromatography followed by ion exchange chromatography.

２Ｂ：ＩＬ−１５効力バリアントを含むＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の活性
ワンアームｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合（ＸＥＮＰ２１９９３）、ＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα（ＸＥＮＰ２４５３１）、およびモナリズマブに基づく抗ＮＫＧ２Ａ Ｆａｂアームを有するＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｑ１０８Ｅ）／Ｒα（ＸＥＮＰ２４５３２）が細胞増殖アッセイでテストされた。 2B: Activity of NKG2A-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing IL-15 potency variant One-arm scIL-15 / RαFc fusion (XENP21993), NKG2A targeting reduced efficacy scIL-15 (N65D) / Rα (XENP24531) ), And NKG2A targeted reduced efficacy scIL-15 (Q108E) / Rα (XENP24532) with an anti-NKG2A Fab arm based on monarizumab were tested in a cell proliferation assay.

ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を各試験物質について図６２Ａ〜Ｃに示す。データは、ＸＥＮＰ２１９９３と比較して、ＸＥＮＰ２４５３１およびＸＥＮＰ２４５３２は、増殖中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の効力の低下を示したことを示す。特に、ＸＥＮＰ２４５３２は、ＸＥＮＰ２４５３１と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖における効力を維持しながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖における効力の低下を示した。これは、同じＮＫＧ２Ａ標的化Ｆａｂアームを使用しても、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα側の効力が様々な細胞型を拡大する効力に影響することを示唆する。 Human PBMCs were treated with test materials at specified concentrations. Three days after treatment, PBMCs were analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells is shown in FIGS. 62A-C for each test substance. The data show that compared to XENP21993, XENP24531 and XENP24532 showed reduced efficacy of proliferating CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells. In particular, XENP24532 showed reduced efficacy in CD4 + T cell proliferation while maintaining efficacy in CD8 + T cell proliferation as compared to XENP24531. This suggests that the efficacy on the scIL-15 / Rα side affects the potency of expanding various cell types, even when the same NKG2A targeted Fab arm is used.

２Ｃ：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はＮＫ細胞の選択的増殖を示す
ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、最初にＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＢＶ７８６（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）で染色した。細胞を再度洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２５９Ｄ）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣで染色した。最初に、リンパ球はＳＳＣおよびＦＳＣに基づいてゲートすることによって同定された。次いで、リンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）およびＣＤ３＋Ｔ細胞を同定した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８に基づいてゲートして、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した。次に、ＣＤ４５ＲＡに基づいてさらにゲーティングすることにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞亜集団を特定した。最後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＮＫ細胞の細胞増殖に厳密に関連するタンパク質である、Ｋｉ６７の割合を決定した（それぞれ図６３Ａ〜Ｃに示す）。データは、対照の「ＲＳＶ標的化」効力低下型ワンアームｓｃＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−ＦｃＸＥＮＰ２６００７が、ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）と比較して、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞の増殖における効力を有意に低下させたことを示す。抗ＮＫＧ２Ａまたは抗ＮＫＧ２Ｄ Ｆａｂアーム（ＸＥＮＰ２７１４５およびＸＥＮＰ２７１４６のように）を用いたターゲティングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対して効力を増加させることなくＮＫ細胞の増殖を選択的に誘導する。 2C: NKG2A-targeted and NKG2D-targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusions treated human PBMCs showing selective proliferation of NK cells at specified concentrations with the test substance. Three days after treatment, PBMC was first anti-CD3-PerCP / Cy5.5 (OKT3), anti-CD4-BV786 (RPA-T4), anti-CD8-PE / Cy7 (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421 (3G8), anti It was stained with CD56-BV605 and anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100). Cells were washed again and stained with anti-FoxP3-AF488 (259) anti-FoxP3-AF488 (259) using eBioscience ™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.). Initially, lymphocytes were identified by gated based on SSC and FSC. Lymphocytes were then gated based on CD3 expression to identify NK cells (CD3-CD16 +) and CD3 + T cells. CD3 + T cells were then gated based on CD4 and CD8 to identify CD4 + and CD8 + T cells. The CD4 + and CD8 + memory T cell subpopulations were then identified by further gating based on CD45RA. Finally, the proportions of Ki67, a protein strictly related to cell proliferation of CD4 + T cells (CD3 + CD4 + CD45RA-), CD8 + T cells (CD3 + CD8 + CD45RA-), and NK cells, were determined (shown in FIGS. 63A-C, respectively). Data show that control "RSV targeting" reduced efficacy one-arm scIL-15 (N4D / N65D) / Rα-FcXENP26007 compared to XENP20818 (WT IL-15 / Rα-Fc) CD8 + and CD4 + T cells as well as NK. It shows that the efficacy in cell proliferation was significantly reduced. Targeting with anti-NKG2A or anti-NKG2D Fab arms (such as XENP27145 and XENP27146) selectively induces NK cell proliferation without increasing efficacy against CD8 + T cell and CD4 + T cell proliferation.

サイトカインがその受容体に結合した後、受容体に関連するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）がＳＴＡＴタンパク質をリン酸化し、ＳＴＡＴタンパク質が核に移行してさらに下流のプロセスを調節する。したがって、ＳＴＡＴタンパク質（特に、ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂを含むＳＴＡＴ５）のリン酸化は、ＩＬ−１５がその受容体に結合することによって引き起こされる最も初期のシグナル伝達現象の１つである。 After the cytokine binds to its receptor, the receptor-related Janus kinase (JAK) phosphorylates the STAT protein, which translocates to the nucleus and regulates further downstream processes. Therefore, phosphorylation of STAT proteins, especially STAT5 including STAT5a and STAT5b, is one of the earliest signaling phenomena caused by the binding of IL-15 to its receptor.

したがって、別の実験では、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体による様々なリンパ球集団でのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を調査した。ヒトＰＢＭＣを、指定濃度の次の試験物質：ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６とともに３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後の様々な細胞集団をゲートするために、ＰＢＭＣを室温で３０〜４５分間、抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２４９Ｄ）、抗ＣＤ５６−ＰＥ、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６８７）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、およびＮＫ細胞集団でのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータを図６４に示す。Ｋｉ６７発現を示す上のデータと一致して、ここでのデータは、ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＸＥＮＰ２６００７が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＴｒｅｇおよびＮＫ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において顕著に効力低下させ、抗ＮＫＧ２Ａ Ｆａｂまたは抗ＮＫＧ２Ｄ Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２７１４５およびＸＥＮＰ２７１４６など）を用いてＮＫ細胞を選択的にターゲティングするが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇの好ましいターゲティングは示さない。 Therefore, another experiment investigated the induction of STAT5 phosphorylation in various lymphocyte populations by NKG2A and NKG2D targeted IL-15 / Rα-Fc fusions. Human PBMCs were incubated with specified concentrations of the following test substances: XENP20818 (WT IL-15 / Rα-Fc), XENP24050, XENP27145, and XENP27146 at 37 ° C. for 15 minutes. PBMCs stained with anti-CD3-BUV395 (UCHT1), anti-CD4-BV605 (RPA-T4), and anti-CD8-Alexa700 (SK1) for 30-45 minutes at room temperature to gate various cell populations after incubation. did. Cells were washed and incubated with pre-cooled (-20 ° C.) 90% methanol for 20-60 minutes. After methanol incubation, cells were washed again with anti-CD25-BV421 (MA251), anti-CD45RA-BV510 (HI100), anti-FoxP3-AF488 (249D), anti-CD56-PE, and anti-pSTAT5-Alexa647 (pY687). They were stained and labeled with various cell populations and STAT5 phosphorylation. Data showing the induction of STAT5 phosphorylation in the CD8 + T cell, CD4 + T cell, Treg, and NK cell populations are shown in FIG. Consistent with the above data showing Ki67 expression, the data here show that XENP26007 is significantly less potent in inducing STAT5 phosphorylation in CD8 + T cells and CD4 + T cells, as well as in Treg and NK cells, compared to XENP20818. , Anti-NKG2A Fab or anti-NKG2D Fab (such as XENP27145 and XENP27146) are used to selectively target NK cells, but do not show favorable targeting of CD8 + T cells, CD4 + T cells, or Tregs.

実施例３：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体
３Ａ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の操作
マウス抗ＣＤ８抗体の親可変領域（図６５にＸＥＮＰ１５０７６として示す）をヒト化（２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号に以前に記載されているように）し、プロトタイプＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するためにＦａｂフォーマットで操作した。ヒト化抗ＣＤ８の配列は、二価抗体（ＸＥＮＰ１５２５１）およびＦａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、ならびにワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３１７）としてのヒト化バリアントとして図６５に示す。 Example 3: CD8 Targeted IL-15 / Rα-Fc Fusion 3A: Manipulation of CD8 Targeted IL-15 / Rα-Fc Fusion The parent variable region of a mouse anti-CD8 antibody (shown as XENP15076 in FIG. 65) is human. (As previously described in US Pat. No. 7,657,380 issued February 2, 2010) as a component of the prototype CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion. Manipulated in Fab format for use. The sequence of humanized anti-CD8 is shown in FIG. 65 as humanized variants as divalent antibodies (XENP15251) and Fab (XENP23647), and one-arm mAbs (XENP24317).

ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、図５７Ｄに示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットで生成され、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。このフォーマットの例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、およびＸＥＮＰ２４１１６を含み、それらの配列を図６６に示す。 The CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion contained IL-15Rα (sushi) generated in the scIL-15 / Rα × Fab format shown in FIG. 57D and fused to IL-15 by a variable length linker ("" (Called scIL-15 / Rα), which then fuses to the N-terminus of the heterodimer Fc region, where the variable heavy chain (VH) fuses to the other side of the heterodimer Fc, but the corresponding light chain contains VH. Transfected separately to form a Fab. An exemplary CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion of this format contains XENP24114, XENP24115, and XENP24116, the sequences of which are shown in FIG.

ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はまた、以下のフォーマット：ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされ、ＩＬ−１５は非共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｅに示すＦａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は次いでヘテロダイマーＦｃ領域の一方側のＣ末端にさらに融合する）に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｇに示すｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域の一方側のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされ、ＩＬ−１５は非共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｈに示すｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）のＮ末端に組み替えで融合したＶＨ、およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ヘテロダイマーＦｃの他方側にさらに融合する）のＮ末端に組み替えで融合したＶＨを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｊに示すｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、ならびにＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨ（ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はＩＬ−１５に融合し、次いでヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）、およびヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｋに示すｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットで生成された。これらの代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物の例示的な配列を図７９に示す。 The CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion also contains VH fused to the N-terminus of the heterodimer Fc region in the following format, although IL-15Rα (sushi) fuses to the other side of the heterodimer Fc. , The corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH, and IL-15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex, as shown in FIG. 57E. The Fab × nc IL-15 / Rα format shown, containing VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimer Fc, IL-15 is IL-15Rα (sushi) (IL-15Rα (sushi) is then heterozygous. It fuses to the C-terminus on one side of the Dimer Fc region), but the corresponding light chain is separately transfected to form a Fab containing VH, mAb-scIL-15 / shown in FIG. 57G. The Rα format contains VH fused to the N-terminus of the first and second heterodimeric Fc, IL-15Rα (sushi) fused to the C-terminus of one side of the heterodimeric Fc region, but the corresponding light chain The mAb-nc IL-15 shown in FIG. 57H is separately transfected to form a Fab containing VH and IL-15 is separately transfected to form a non-covalent IL-15 / Rα complex. / Rα format, VH recombinantly fused to the N-terminus of IL-15 (further fused to one side of the heterodimer Fc), and N of IL-15Rα (sushi) (further fused to the other side of the heterodimer Fc) The central-IL-15 / Rα format shown in FIG. 57J, as well as IL-15Rα, which comprises the terminally recombinantly fused VH, but the corresponding light chain is separately transfected to form a VH-containing Fab. Includes VH fused to the N-terminus of shusi) (IL-15Rα (sushi) fused to IL-15 and then further fused to one side of the heterodimer Fc), and VH fused to the other side of the heterodimer Fc. However, the corresponding light chain was produced in the central-scIL-15 / Rα format shown in FIG. 57K, which is separately transfected to form a VH-containing Fab. Illustrative sequences of these alternative formats of CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusions are shown in FIG.

上述のＶＨおよびＶＬ配列、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメイン、軽鎖定常領域、ならびにヘテロダイマー定常領域（図９に示す）をコードするプラスミドは、ギブソンアセンブリによって構築された。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。 The plasmids encoding the VH and VL sequences described above, the IL-15 and IL-15Rα (sushi) domains, the light chain constant region, and the heterodimer constant region (shown in FIG. 9) were constructed by Gibson assembly. The protein was produced by transient transfection on HEK293E cells and was purified by a two-step purification process involving protein A chromatography followed by ion exchange chromatography.

３Ｂ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプによる細胞増殖の誘導
二価抗ＣＤ８抗体（ＸＥＮＰ１５２５１）、ワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合（ＸＥＮＰ２１９９３）、ＸＥＮＰ１５２５１に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを有するＣＤ８標的化ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１４）を、細胞増殖アッセイでテストした。 3B: Induction of cell proliferation by CD8-targeted IL-15Fc fusion prototype CD8-targeted scIL with bivalent anti-CD8 antibody (XENP15251), one-arm scIL-15 / Rα-Fc fusion (XENP21993), anti-CD8Fab arm based on XENP15251 -15 / Rα-Fc (XENP24114) was tested in a cell proliferation assay.

ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。最初に、リンパ球はＳＳＣおよびＦＳＣに基づいてゲートすることによって同定された。次いで、リンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）およびＣＤ３＋Ｔ細胞を同定した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８に基づいてゲートして、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびγδＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を同定した。次に、ＣＤ４５ＲＡに基づいてさらにゲーティングすることにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞亜集団を特定した。最後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＮＫ細胞の細胞増殖に厳密に関連するタンパク質である、Ｋｉ６７の割合を決定した（それぞれ図６７Ａ〜Ｃに示す）。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ワンアームＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導に強力であることを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、Ｆａｂアームの包含に起因するＩＬ−１５活性の低下により、ワンアームＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体よりもＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力が低かった。 Human PBMCs were treated with test materials at specified concentrations. Three days after treatment, PBMC was treated with anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8-APC (RPA-T8), anti-CD16-BV605 (3G8), anti-CD45RA-APC / Fire750 ( HI100) and anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) were stained and analyzed by FACS. Initially, lymphocytes were identified by gated based on SSC and FSC. Lymphocytes were then gated based on CD3 expression to identify NK cells (CD3-CD16 +) and CD3 + T cells. CD3 + T cells were then gated based on CD4 and CD8 to identify CD4 +, CD8 +, and γδT cells (CD3 + CD4-CD8-). The CD4 + and CD8 + memory T cell subpopulations were then identified by further gating based on CD45RA. Finally, the proportions of Ki67, a protein strictly related to cell proliferation of CD4 + T cells (CD3 + CD4 + CD45RA-), CD8 + T cells (CD3 + CD8 + CD45RA-), and NK cells, were determined (shown in FIGS. 67A-C, respectively). The data show that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion is more potent in inducing the proliferation of CD8 + T cells than the one-arm IL-15 / Rα-Fc fusion. In particular, the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion induces more CD4 + T cell proliferation than the one-arm IL-15 / Rα-Fc fusion due to the reduced IL-15 activity resulting from the inclusion of the Fab arm. The ability was low.

３Ｃ：ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプによる細胞増殖の誘導
ワンアームｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２１９９３）、ワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１４）、およびＸＥＮＰ１５２５１に基づく抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを有するＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１６）を、細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図６８Ａ〜６８Ｃに示す。 3C: Induction of cell proliferation by CD8 targeted reduced efficacy IL-15Fc fusion prototype Based on one-arm scIL-15 / RαFc fusion (XENP21993), one-arm reduced efficacy scIL-15 / RαFc fusion (XENP24014), and XENP15251 CD8 targeted reduced efficacy scIL-15 / Rα-Fc (XENP24116) with anti-CD8 Fab arm was tested in a cell proliferation assay. Human PBMCs were treated with test materials at specified concentrations. Three days after treatment, PBMCs were analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells is shown in FIGS. 68A to 68C.

データは、ＸＥＮＰ２１９９３と比較して、ＸＥＮＰ２４０１４が、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効力の低下を示したことを示す。ＸＥＮＰ２４０１４と比較して、ＸＥＮＰ２４１１６は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の効力を増加させ（ＸＥＮＰ２１９９３に相当）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の効力の低下、およびＮＫ細胞に対して同様の効力を示した。 The data show that XENP24014 showed reduced efficacy in the proliferation of NK cells, CD4 + T cells, and CD8 + T cells compared to XENP21993. Compared to XENP24014, XENP24116 increased the proliferative potency of CD8 + T cells (corresponding to XENP21993), reduced the potency of CD4 + T cells, and showed similar potency on NK cells.

３Ｄ：ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプのＴｒｅｇに対する作用
Ｔｒｅｇ増殖（ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＫｉ６７発現率で示される）について、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１６）の作用、ならびにワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１４）、効力低下型ＩＬ−１５（Ｑ１０８Ｅ）／Ｒα−Ｆｃヘテロダイマー（ＸＥＮＰ２２８２２）、および組み換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）を調査した。 3D: Effect of CD8 Targeted Ineffective IL-15Fc Fusion Prototype on Treg For Treg proliferation (indicated by Ki67 expression in CD4 + T cells), CD8 targeted reduced efficacy scIL-15 (N65D) / Rα-Fc Action of (XENP24116), as well as one-arm reduced efficacy scIL-15 (N65D) / RαFc fusion (XENP24014), reduced efficacy IL-15 (Q108E) / Rα-Fc heterodimer (XENP22822), and recombinant human IL-15. (RhIL-15) was investigated.

インビトロでラパマイシン増殖したＴｒｅｇを使用して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の作用を調べた。ラパマイシンはインビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖を促進し、その結果生じる拡大したＴｒｅｇはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することが以前に報告されている（例えば、Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（１２）８３３８−８３４７、およびＳｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｐａｍｙｃｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（１）３２０−３２９）。したがって、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用したネガティブ選択により、２人のドナー（ドナー２１および２３）のヒトＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。Ｔｒｅｇを、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎仔血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して１〜４日間拡大させた。Ｔｒｅｇを０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でコーティングしたＴ７５フラスコに移し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２＋０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８ｍＡｂで培養した。実験は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の初回の濃縮から少なくとも８日後に行われた。１．５×１０５個のラパマイシンで培養したＴｒｅｇを、抗ＣＤ３コーティングプレート（０．５μｇ／ｍＬ ＯＫＴ３）上で３７℃で４日間、指示濃度の指定試験物質とともにインキュベートした。４日目に、細胞をＦＡＣＳにより分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＫｉ６７の割合を、それぞれドナー２１および２３について図６９Ａ〜６９Ｂに示す。ドナー２１および２３についてＣＤ４＋細胞数をそれぞれ図７０Ａ〜Ｂに示す。ＣＤ２５ＭＦＩは、ドナー２１および２３についてそれぞれ図７１Ａ〜Ｂに示されている。 The effects of CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions were investigated using rapamycin-grown Tregs in vitro. It has been previously reported that rapamycin promotes the growth of CD4 + CD25 + FOXP3 + Treg in vitro, and the resulting expanded Treg suppresses the growth of CD4 + and CD8 + T cells (eg, Battaglia et al. (2006) Rapamycin promotion expansion). CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.J Immunol.177 (12) 8338-8347, and Strauss et al. (2007) Selective survival of naturally occurring human CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatory T cells cultured with rapamycin.J Immunol.178 ( 1) 320-329). Therefore, CD4 + T cells were enriched from human PBMCs of two donors (donors 21 and 23) by negative selection using EasySep ™ Human T Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada). Tregs with RPMI1640 + 10% bovine fetal serum + 0.1 μg / ml rapamycin + 500 U / ml IL-2 for 1 to 4 days using Dynabeads ™ Human Treg Expert (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.). .. Transfer the Tregs to a T75 flask coated with 0.5 μg / ml anti-CD3 (OKT3, BioLegend, San Diego, California) and RPMI1640 + 10% fetal bovine serum + 0.1 μg / ml rapamycin + 100 U / ml IL-2 + 0.5 μg / ml. It was cultured with anti-CD28mAb. Experiments were performed at least 8 days after the initial enrichment of PBMC-derived CD4 + T cells. Tregs cultured in 1.5 × 10 5 rapamycin were incubated on an anti-CD3 coated plate (0.5 μg / mL OKT3) at 37 ° C. for 4 days with the indicated test substance at the indicated concentration. On day 4, cells were analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to CD4 + T cells is shown in FIGS. 69A-69B for donors 21 and 23, respectively. The CD4 + cell numbers for donors 21 and 23 are shown in Figures 70A-B, respectively. CD25MFIs are shown in FIGS. 71A-B for donors 21 and 23, respectively.

データは、組み換えヒトＩＬ−１５が最も強固なＴｒｅｇの増殖を誘導することを示す。ＸＥＮＰ２２８２２およびＸＥＮＰ２４０１４はｒｈＩＬ−１５と比較してＴｒｅｇの増殖をそれほど誘発しないが、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体のＸＥＮＰ２４１１６は、Ｔｒｅｇの増殖の最も弱い誘発剤である。 The data show that recombinant human IL-15 induces the most potent Treg growth. Although XENP22822 and XENP24014 do not induce much Treg proliferation compared to rhIL-15, the CD8 targeted reduced efficacy scIL-15 (N65D) / Rα-Fc fusion XENP24116 is the weakest inducer of Treg proliferation. Is.

３Ｅ：抑制アッセイでのＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導
Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞、ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞、およびＮＫ細胞の増殖に対する、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６１Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４１１５）、ならびにワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６１Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１３）の作用を調べた。 3E: Induction of CD8 + T cell proliferation by CD8 targeting reduced efficacy IL-15Fc fusion in suppression assay CD8 targeting efficacy against CD8 + responder T cell, CD4 + responder T cell, and NK cell proliferation in the presence of Treg The effects of the reduced scIL-15 (N61D) / Rα-Fc fusion (XENP24115) and the one-arm reduced efficacy scIL-15 (N61D) / Rα-Fc fusion (XENP24013) were investigated.

ＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣを、抗抗ＣＤ３コーティングプレート（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）上で、５００ｎｇ／ｍＬの指定の試験物質および指定濃度のＴａｇ−ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇ（実施例２Ｃに記載のとおり拡大）とともにインキュベートした。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳで分析し、増殖をＣＦＳＥで測定した。図７２Ａ〜７２Ｃに示すデータはそれぞれ、増殖中のＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合について示す。図７３は、異なるＴｒｅｇ：ＰＢＭＣ比を使用した同様の実験でのＴｒｅｇ数を示す。 CFSE-labeled PBMCs on anti-CD3 coated plates (OKT3, 100 ng / mL) with 500 ng / mL of the specified test substance and the specified concentration of Tag-it Violet-labeled Treg (enlarged as described in Example 2C). Incubated with. After incubation at 37 ° C. for 4 days, cells were analyzed by FACS and proliferation was measured by CFSE. The data shown in FIGS. 72A-72C show the proportion of proliferating CD8 T cells, CD4 T cells and NK cells, respectively. FIG. 73 shows the number of Tregs in a similar experiment using different Treg: PBMC ratios.

データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の増殖を増加させ、増殖を抑制するためにより多くのＴｒｅｇが必要であることを示す。データはまた、ＸＥＮＰ２４１１５もＸＥＮＰ２４０１３もＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞の増殖に影響を与えなかったことを示す。ただし、どちらもＮＫ細胞の増殖を誘発した。特に、図７３は、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体がＴｒｅｇの増殖を依然として誘導する一方で（処理なしの対照と比較して）、その誘導はワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃによる処理から生じる誘導よりも実質的に少ないことを示す。 The data show that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion requires more Tregs to increase and suppress the proliferation of CD8 + responder T cells. The data also show that neither XENP24115 nor XENP24013 affected the proliferation of CD4 + responder T cells. However, both induced the proliferation of NK cells. In particular, FIG. 73 shows that while the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion still induces Treg proliferation (compared to untreated controls), the induction is one-arm scIL-15 / Rα-Fc. It is shown to be substantially less than the induction resulting from treatment with.

さらなる実験では、Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理した後のＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、およびＴｒｅｇの増殖に対する用量反応を調べた。１×１０５個のＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣおよび５×１０４個のＴａｇ−ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇ（実施例３Ｄに記載の拡大、Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ比 １：２）を、抗ＣＤ３コーティングプレート（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）で、４日間、対照の抗ＲＳＶ二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）を含む指定濃度の指定試験物質とともにインキュベートした。増殖は、ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ希釈により測定した。図７４Ａ〜７４Ｃに示すデータはそれぞれ、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、およびＴｒｅｇについて示す。最後に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体による処理後、ＰＢＭＣの非存在下でのＴｒｅｇの増殖に対する投与反応を調査した。１×１０５個のＴａｇ−ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ３コーティングされたプラーク（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）上で、指示濃度の指定試験物質とともに４日間インキュベートした。図７５に示す細胞数は、Ｔａｇ−ｉｔ Ｖｉｏｌｅｔ希釈によって測定された。 In a further experiment, the dose response to proliferation of CD8 + memory T cells, CD4 + memory T cells, and Tregs after treatment with a CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion in the presence of Treg was examined. 1 × 10 5 CFSE-labeled PBMCs and 5 × 10 4 Tag-it Violet-labeled Tregs (enlargement described in Example 3D, Treg: PBMC ratio 1: 2), anti-CD3 coating plate (OKT3, Incubated at 100 ng / mL for 4 days with a designated test substance at a designated concentration containing a control anti-RSV divalent mAb (XENP15074). Growth was measured by CFSE or Tag-it Violet dilution. The data shown in FIGS. 74A-74C show CD8 + memory T cells, CD4 + memory T cells, and Treg, respectively. Finally, after treatment with the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion, the dosing response to Treg proliferation in the absence of PBMC was investigated. 1 × 10 5 Tag-it Violet-labeled Tregs were incubated on anti-CD3-coated plaques (OKT3, 100 ng / mL) with indicated concentrations of designated test material for 4 days. The number of cells shown in FIG. 75 was measured by tag-it Violet dilution.

データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、試験したすべての濃度でワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−ＦｃよりもＣＤ８＋メモリーＴ細胞の増殖を誘導したことを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−ＦｃよりもＣＤ４＋メモリーＴ細胞およびＴｒｅｇの増殖が少ない。 The data show that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion induced proliferation of CD8 + memory T cells more than the one-arm scIL-15 / Rα-Fc at all concentrations tested. In particular, the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion has less proliferation of CD4 + memory T cells and Tregs than the one-arm scIL-15 / Rα-Fc.

３Ｆ：ＧＶＨＤモデルにおけるプロトタイプＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体の活性
ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４１１６）および追加の効力低下型ＩＬ−１５バリアントを、雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ）免疫不全マウスで実施した移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルで評価した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射したとき、ヒトＰＢＭＣはマウス細胞に対して自己免疫応答を引き起こす。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射した後にＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体、ＩＬ−１５バリアントによる処理は、移植されたＴ細胞の増殖を増強する。 3F: Activity of prototype CD8 targeted reduced efficacy IL-15Fc fusion in GVHD model CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc fusion (XENP24116) and additional reduced efficacy IL-15 variants are female It was evaluated in a graft-versus-host disease (GVHD) model performed on NSG (NOD-SCID-γ) immunodeficient mice. When human PBMCs are injected into NSG mice, human PBMCs elicit an autoimmune response against mouse cells. Treatment with CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion, IL-15 variant after injection of human PBMC into NSG mice enhances the proliferation of transplanted T cells.

７日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定の試験物質（０．３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。全血を４日目および７日目に採取し、マウスを１１日目に脾臓のために屠殺して、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数を測定した。図７６Ａ〜７６Ｄはそれぞれ、４日目の全血中のＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との間の相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。図７７Ａ〜７７Ｄはそれぞれ、７日目の全血中のＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８ Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との間の相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞細胞比を示す。図７８Ａ〜７８Ｄはそれぞれ、８日目の脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８ Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。各点は１匹のメスのＮＳＧマウスを表す。データは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を拡大するＩＬ−１５バリアントと比較して、ＸＥＮＰ２４１１６がＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大することを示す。 On day 7, 10 million human PBMCs were transplanted into NSG mice by IV-OSP, followed by administration of the designated test substance (0.3 mg / kg) on day 0. Whole blood was collected on days 4 and 7, mice were sacrificed for the spleen on day 11, and CD4 + and CD8 + T cell counts were measured using FACS. Figures 76A-76D show the CD4 + T cell phenomenon, the CD8 + T cell phenomenon, the correlation between the CD8 + T cell phenomenon and the CD4 + T cell phenomenon, and the CD8 + T cell / CD4 + T cell ratio in whole blood on day 4, respectively. Figures 77A-77D show the correlation between the CD4 + T cell phenomenon, the CD8 T cell phenomenon, the CD8 + T cell phenomenon and the CD4 + T cell phenomenon, and the CD8 + T cell / CD4 + T cell cell ratio in whole blood on day 7, respectively. Figures 78A-78D show the CD4 + T cell phenomenon, the CD8 T cell phenomenon, the correlation between the CD8 + T cell phenomenon and the CD4 + T cell phenomenon, and the CD8 + T cell / CD4 + T cell ratio in the spleen on day 8, respectively. Each point represents one female NSG mouse. The data show that XENP24116 selectively expands CD8 + T cells as compared to the IL-15 variant, which expands both CD4 + T cells and CD8 + T cells.

３Ｇ：代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体
図５７（略画）および図７９（配列）に示すように、いくつかの代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣは、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４７、およびＸＥＮＰ２４５４８で処理された。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図８０に示す。 3G: Alternative Format CD8 Targeted IL-15Fc Fusions Cells with several alternative formats of CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusions, as shown in Figure 57 (schematic) and Figure 79 (sequence). Tested in growth assay. Human PBMCs were treated with XENP24114, XENP24116, XENP24546, XENP24543, XENP24547, and XENP24548. Three days after treatment, PBMCs were analyzed by FACS. The ratio of Ki67 to CD4 + T cells, CD8 + T cells, and NK cells is shown in FIG.

実施例４：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（非ブロッキングＣＤ８結合ドメイン）
４Ａ：ファージディスプレイライブラリーおよびＣＤ８バインダーのスクリーニング
組み換えヒトＣＤ８αおよびカニクイザルＣＤ８αは、ファージパニングのために自家生成された。抗原をコードするプラスミドは、ｐＴＴ５ベクターのＧｉｂｓｏｎアセンブリにより構築した。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクション後、分泌された抗原はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。 Example 4: CD8 Targeted IL-15 / Rα-Fc Fusion (Non-blocking CD8 Binding Domain)
4A: Phage Display Library and CD8 Binder Screening Recombinant human CD8α and cynomolgus monkey CD8α were self-generated for phage panning. The plasmid encoding the antigen was constructed by the Gibson assembly of the pTT5 vector. After transient transfection of HEK293E cells, the secreted antigen was purified by protein A affinity chromatography.

自家製の新規ファージライブラリーを構築してファージコートタンパク質ｐＩＩＩ上にＦａｂバリアントを表示し、４回パニングした。初回の前および各回の後に、ファージを対数期のＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）に加え、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。ＦａｂクローンをそのＶＨおよびＶＬ同一性について配列決定し、そこからギブソンアセンブリによりプラスミドを構築し、ＩｇＧ１定常領域のコード配列を含むｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して上清から精製した。例示的なクローン１Ｃ１１Ｂ３のアミノ酸配列は、図８１の二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４０２５）およびワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３２１）に示す。 A home-made novel phage library was constructed to display Fab variants on phage coat protein pIII and panned four times. Before the first time and after each time, phages were added to log-phase XL1-Blue cells (Agilent, Wilmington, Del.) And incubated overnight at 37 ° C. and 250 rpm. Fab clones were sequenced for their VH and VL identities, from which plasmids were constructed by Gibson assembly and subcloned into a pTT5 expression vector containing the coding sequence for the IgG1 constant region. DNA was transfected into HEK293E for expression and the resulting divalent mAb was purified from the supernatant using protein A affinity chromatography. The amino acid sequences of the exemplary clone 1C11B3 are shown in the divalent mAb (XENP24025) and one-arm mAb (XENP24321) of FIG.

４Ｂ：ファージディスプレイライブラリーとＣＤ８バインダーのスクリーニング
ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（それぞれＸＥＮＰ２４３２１）として再フォーマットされたファージクローン１Ｃ１１Ｂ３を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への結合について試験した。ＸＥＮＰ１５２５１のバリアントに基づくワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３１７、図６５に示す配列）を対照として使用した。 4B: Phage Display Library and CD8 Binder Screening Phage clone 1C11B3 reformatted as a one-arm Fab-Fc antibody (XENP24321, respectively) was tested for binding to CD4 + and CD8 + T cells. A one-arm Fab-Fc antibody based on a variant of XENP15251 (XENP24317, sequence shown in FIG. 65) was used as a control.

ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ヒトＰＢＭＣから精製したＴ細胞を、氷上で１時間、指定濃度の試験物質とインキュベートした。細胞を遠心分離して過剰量の試験物質を除去し、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＨＩＴ３ａ）、抗ＣＤ４−ＰＥ（ＯＫＴ４）、およびＡＰＣと結合した二次抗体で再懸濁し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、染色緩衝液で再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。図８２は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＦＩを示す。データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞へのＸＥＮＰ２４３２１の結合がＸＥＮＰ２４３１７よりも優れていることを示した。 Using the EasySep ™ Human T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canda), T cells purified from human PBMCs were incubated with the specified concentration of test material on ice for 1 hour. Cells were centrifuged to remove excess test material, resuspended with anti-CD3-FITC (HIT3a), anti-CD4-PE (OKT4), and secondary antibody bound to APC and incubated on ice for 45 minutes. .. Cells were washed twice, resuspended in staining buffer and analyzed by FACS. FIG. 82 shows the MFI of CD4 + and CD8 + T cells. The data showed that the binding of XENP24321 to CD8 + T cells was superior to that of XENP24317.

４Ｂ：ＣＤ８とｐＭＨＣＩとの相互作用をブロックしない抗ＣＤ８ ｍＡｂの同定
腫瘍細胞は、ＴＣＲ（ペプチドに特異的）およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ８によって認識されるペプチドフラグメントを提示する主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）を提示する（図８３Ａに示すとおり）。ＣＤ８のｐＭＨＣＩへの結合は、Ｔ細胞の増殖と活性化を引き起こす。抗ＣＤ８抗体は、ＣＤ８によるｐＭＨＣＩの結合をブロックし、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を妨げるように配置するＣＤ８上のエピトープに結合し得る（図８３Ｂ）。活性化を維持するために、ＣＤ８−ＭＨＣＩ相互作用を遮断しない、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体に抗ＣＤ８アームを使用する必要がある。 4B: Identification of anti-CD8 mAb that does not block the interaction of CD8 with pMHCI Major histocompatibility complex class I presenting peptide fragments recognized by TCR (peptide-specific) and CD8 of CD8 + T cells. The molecule (MHCI) is presented (as shown in FIG. 83A). Binding of CD8 to pMHCI causes T cell proliferation and activation. The anti-CD8 antibody can block the binding of pMHCI by CD8 and thereby bind to an epitope on CD8 that is arranged to prevent activation of CD8 + T cells (Fig. 83B). To maintain activation, it is necessary to use an anti-CD8 arm on the CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion that does not block the CD8-MHCI interaction.

４Ｃ（ａ）：ＭＨＣテトラマーアッセイ
ＭＨＣテトラマーアッセイを使用して、上述の抗ＣＤ８ ｍＡｂクローンがＣＤ８とｐＭＨＣＩの相互作用をブロックしたかどうかを調べた。ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチド（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．からのドナー１５３）に特異的な約２００ｋのＴ細胞を、指定濃度の指定の試験物質とともに氷上で３０分間プレインキュベートした。抗ＣＤ８抗体なしでインキュベートした対照試料も使用した。インキュベーション後、試料をｉＴＡｇ Ｔｅｔｒａｍｅｒ／ＰＥ−ＨＬＡ２：０１ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＭＢＬ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＴＨ−１）、および抗ＣＤ４−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＯＫＴ４）で１．５時間染色し、ＦＡＣＳによって分析した。細胞はまずＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートされ、ＣＤ８＋細胞を同定した。ＣＤ３＋細胞上のＭＨＣテトラマーの結合をＰＥ ＭＦＩとして測定した。データは、対照試料に対する結合の割合として図８４に示す。 4C (a): MHC Tetramer Assay The MHC tetramer assay was used to determine if the anti-CD8 mAb clone described above blocked the interaction between CD8 and pMHCI. Approximately 200 k T cells specific for HLA-A2 * 0201 restricted CMV pp65 (NLVPMVATV) peptide (donor 153 from Astarte Biologics, Bothell, Wash.) Are preincubated on ice for 30 minutes with a specified concentration of the specified test substance. did. Control samples incubated without anti-CD8 antibody were also used. After incubation, samples were sampled with iTAg Teramer / PE-HLA2: 01CMV pp65 (NLVPMVATV) (MBL, Woburn, Mass.), Anti-CD3-BUV395 (UCTH-1), and anti-CD4-APC / Fire750 (OKT4) 1.5. It was time stained and analyzed by FACS. Cells were first gated based on CD3 and CD4 expression to identify CD8 + cells. Binding of MHC tetramers on CD3 + cells was measured as PE MFI. The data are shown in FIG. 84 as the percentage of binding to the control sample.

データは、市販のＯＫＴ８ ｍＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．およびＸＥＮＰ１５０７５として自家製された）とのプレインキュベーションにより、対照試料と同等のＭＨＣテトラマー結合が可能になり、他の市販のｍＡｂであるＳＫ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、３２−Ｍ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘ．）、およびＤＫ２５（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）では結合が１５〜８０％減少したことを示し、これはＣｌｅｍｅｎｔらにより報告された結果と一致している。ＸＥＮＰ１５２５１とのプレインキュベーションにより、ＭＨＣテトラマー結合が５０％以上減少した。特に、ＸＥＮＰ２４０２５（１Ｃ１１Ｂ３）とのプレインキュベーションはＭＨＣテトラマー結合を約４％減少させ、クローン１Ｃ１１Ｂ３が非ブロッキングであることを示唆する。 The data were preincubated with a commercially available OKT8 mAb (homemade as Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass. And XENP15075) to allow MHC tetramer binding equivalent to that of a control sample, and the other commercially available mAb, SK1. (BioLegend, San Diego, California.), 32-M4 (Santa Cruz Biotechnology, Waltham, Tex.), And DK25 (Dako, Carpinteria, California) showed a 15-80% reduction in binding, which was Lement. Consistent with the results reported by et al. Preincubation with XENP15251 reduced MHC tetramer binding by more than 50%. In particular, preincubation with XENP24025 (1C11B3) reduces MHC tetramer binding by about 4%, suggesting that clone 1C11B3 is non-blocking.

４Ｃ（ｂ）：サイトカイン放出アッセイ
上述のとおり、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ８のｐＭＨＣＩへの結合がＴ細胞を活性化し、サイトカイン放出をもたらす。したがって、サイトカイン放出アッセイにおいて、抗ＣＤ８ ｍＡｂクローンがＣＤ８とｐＭＨＣＩとの相互作用をブロックするかどうかも調査した。 4C (b): Cytokine Release Assay As described above, binding of TCR and CD8 to pMHCI on CD8 + T cells activates T cells and results in cytokine release. Therefore, it was also investigated in the cytokine release assay whether anti-CD8 mAb clones block the interaction of CD8 with pMHCI.

Ｔ２細胞に５０ｎｇ／ｍｌ ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを室温で一晩ロードした。陰性対照として、Ｔ２細胞にＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを負荷した。一晩ロードした後、Ｔ２細胞をマイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で３７℃で３０分間処理した。ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドに特異的な５０ｋのＴ細胞を、１００μｇ／ｍｌの指定の試験物質で（二重に）プレインキュベートした。次いで、１０ｋペプチドをロードしたＴ２細胞を試料に加え、３７℃で１８時間インキュベートした。抗ＣＤ８プレインキュベーションなしの対照は次のとおりだった。Ａ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたｐｐ６５ペプチドをロードしたＴ２細胞、Ｂ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドをロードしたＴ２細胞、Ｃ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたアンロードＴ２細胞、およびＤ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のみ。上清をを回収し、ＩＦＮγ ＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）で分析した。 T2 cells were loaded with 50 ng / ml HLA-A2 * 0201 restricted CMV pp65 (NLVPMVATV) peptide overnight at room temperature. As a negative control, T2 cells were loaded with the NY-ESO-1 peptide. After loading overnight, T2 cells were treated with mitomycin-C (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) At 37 ° C. for 30 minutes. 50 k T cells specific for the HLA-A2 * 0201 restricted CMV pp65 (NLVPMVATV) peptide were preincubated (double) with 100 μg / ml of the specified test substance. T2 cells loaded with 10 k peptide were then added to the sample and incubated at 37 ° C. for 18 hours. The controls without anti-CD8 preincubation were: A) T2 cells loaded with pp65 peptide incubated with CMV-specific T cells, B) T2 cells loaded with NY-ESO-1 peptide incubated with CMV-specific T cells, C) Incubated with CMV-specific T cells Unloaded T2 cells, and D) CMV-specific T cells only. The supernatant was collected and analyzed by the IFNγ MSD assay (Meso Scale Discovery, Rockville, Md.).

図８５に示すデータは、ＯＫＴ８およびＸＥＮＰ２４０２５とともにプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出が、抗ＣＤ８抗体プレインキュベーションの非存在下でＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出と同等であったことを示すが、ＸＥＮＰ１５２５１と同様に市販の抗体ＳＫ−１、３２−Ｍ４、およびＤＫ２５とともにプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞ではＩＦＮγ放出の減少が観察された。さらに、ＸＥＮＰ２４０２５とプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出は、抗ＣＤ８抗体プレインキュベーションの非存在下でのＣＭＶ特異的Ｔ細胞による放出と同等であった。図８６は、ＩＦＮγ放出とテトラマー結合ＭＦＩとの間の相関関係を示す。 The data shown in FIG. 85 show that IFNγ release by CMV-specific T cells pre-incubated with OKT8 and XENP24025 was equivalent to IFNγ release by CMV-specific T cells in the absence of anti-CD8 antibody preincubation. However, a decrease in IFNγ release was observed in CMV-specific T cells preincubated with the commercially available antibodies SK-1, 32-M4, and DK25 as well as XENP15251. Furthermore, IFNγ release by CMV-specific T cells pre-incubated with XENP24025 was comparable to release by CMV-specific T cells in the absence of anti-CD8 antibody preincubation. FIG. 86 shows the correlation between IFNγ release and tetramer-bound MFI.

４Ｄ：１Ｃ１１Ｂ３を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘導する
ヒトＰＢＭＣを、ＸＥＮＰ２４７３６（１Ｃ１１Ｂ３を含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ、図８７に示す配列）、ＸＥＮＰ２４０５０（ワンアーム効力低下型ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４３２１（１Ｃ１１Ｂ３に基づくワンアーム抗ＣＤ８ ｍＡｂ）、およびＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴ ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）を用いて、指定濃度で３７℃で３日間処理した。次に、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＲＰＡＴ８またはＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ｅＦ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（５．１Ｈ１）で染色した。前述のパネルで染色した後、細胞を室温で３０分間抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図８８に示す。データは、ワンアーム効力低下型ＩＬ１５／Ｒα−Ｆｃ ＸＥＮＰ２４０５０と比較して、１Ｃ１１Ｂ３によるＣＤ８ターゲティングがＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進することを示す。 CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc containing 4D: 1C11B3 produces human PBMCs that selectively induce proliferation of CD8 + T cells over CD4 + T cells, XENP24736 (CD8 targeting reduced efficacy containing 1C11B3) IL-15 (N4D / N65D) / Rα-Fc, sequence shown in FIG. 87), XENP24050 (one-arm reduced efficacy IL-15 (N4D / N65D) / Rα-Fc), XENP24321 (one-arm anti-CD8 mAb based on 1C11B3) , And XENP20818 (WT IL-15 / Rα-Fc) at 37 ° C. for 3 days at the specified concentration. Next, PBMC is placed on ice for 45 minutes, anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (RPAT8 or SK1), anti-CD8β-eF660 (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421. (3G8), anti-CD25-PerCP / Cy5.5 (MA251), anti-CD45RA-APC / Fire750 (HI100), and anti-CD56-BV605 (5.1H1). After staining with the panels described above, cells were stained with anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) for 30 minutes at room temperature and analyzed by FACS for various cell populations and expression of Ki67. Data showing the proportions of CD8 + CD45RA-T cells and CD4 + CD45RA-T cells expressing Ki67 are shown in FIG. 88. The data show that CD8 targeting by 1C11B3 promotes the proliferation of CD8 + T cells compared to the one-arm reduced efficacy IL15 / Rα-Fc XENP24050.

実施例５：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体（ＯＫＴ８系）
５Ａ：ＯＫＴ８のヒト化
先行技術の抗ＣＤ８抗体ＯＫＴ８（ＯＫＴ８＿Ｈ０．１およびＯＫＴ８＿Ｌ０．１として図８９に示される可変領域配列）は、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５分子で使用するためのＦａｂの関連で操作された。ＯＫＴ８は、ストリング含有量最適化を用いてヒト化した（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照）。例示的なヒト化ＯＫＴ８クローンの可変重鎖および軽鎖配列を図８９に示す。上述のとおり、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ヘテロダイマー定常領域のコード配列とともに、前述のＶＨおよびＶＬ配列をコードするギブソン構築プラスミドを使用して作成された（図９に示すとおり）。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。マウスまたはヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列を図９２に示す。 Example 5: CD8 Targeted IL-15Fc Fusion (OKT8 Series)
5A: Humanization of OKT8 Prior art anti-CD8 antibody OKT8 (variable region sequence shown in FIG. 89 as OKT8_H0.1 and OKT8_L0.1) is engineered in the context of Fab for use with CD8 targeting IL-15 molecules. Was done. OKT8 was humanized using string content optimization (see, eg, US Pat. No. 7,657,380 issued February 2, 2010). The variable heavy and light chain sequences of an exemplary humanized OKT8 clone are shown in FIG. As mentioned above, the CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion was created using the Gibson construct plasmid encoding the VH and VL sequences described above, along with the coding sequence for the heterodimer constant region (FIG. 9). As shown). The protein was produced by transient transfection on HEK293E cells and was purified by a two-step purification process involving protein A chromatography followed by ion exchange chromatography. The sequence of an exemplary CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing an anti-CD8 Fab arm based on a mouse or humanized OKT8 variable region is shown in FIG.

５Ａ（ａ）：ＯＫＴ−８系のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的に増殖させる
ヒトＰＢＭＣを、マウスＯＫＴ８またはヒト化ＯＫＴ８の２つのバージョン（Ｈ１Ｌ１およびＨ２Ｌ１）に基づいて、ＣＤ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ二重変異体およびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ三重変異体）で、指定濃度で３７℃で３日間で処理した。処置後、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＲＰＡＴ８またはＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ｅＦ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図９３に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のそれぞれが、対照ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であることを示す。予想外に、ＸＥＮＰ２４９１７（ＯＫＴ８＿Ｈ１Ｌ１）は、ＸＥＮＰ２４９１９（マウスＯＫＴ８）と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する効力が低かった。特に、ＸＥＮＰ２４９１８（代替のヒト化ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１を有する）は、ＸＥＮＰ２４９１７と同様の効力を回復した。さらに、三重変異体およびＯＫＴ＿Ｈ２Ｌ１抗ＣＤ８ ＦａｂアームでＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ効力を低下させたＸＥＮＰ２５１３７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてＸＥＮＰ２４９１８よりも強力だが、ＸＥＮＰ２５１３７はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてＸＥＮＰ２４９１８よりも強力だった。 5A (a): CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion of the OKT-8 lineage produces human PBMCs that selectively proliferate CD8 + T cells over CD4 + T cells in mouse OKT8 or humanized OKT8. With CD8 targeted reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc (N4D / N65D double mutant and D30N / E64Q / N65D triple mutant) containing the CD8 binding domain, based on two versions of (H1L1 and H2L1). , Treated at 37 ° C. for 3 days at the specified concentration. After treatment, PBMC on ice for 45 minutes, anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (RPAT8 or SK1), anti-CD8β-eF660 (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD25-PerCP / Cy5.5 (MA251), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), and anti-CD56-BV605 (NCAM16.2). After staining with the panel, cells were stained with anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) for 30 minutes at room temperature and analyzed by FACS for various cell populations and expression of Ki67. Data showing the proportions of CD8 + CD45RA-T cells and CD4 + CD45RA-T cells expressing Ki67 are shown in FIG. 93. The data show that each of the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions is more selective for CD8 + T cells than CD4 + T cells as compared to control XENP20818. Unexpectedly, XENP24917 (OKT8_H1L1) was less effective in inducing the proliferation of CD8 + T cells than XENP24919 (mouse OKT8). In particular, XENP24918 (having an alternative humanized OKT8_H2L1) regained the same potency as XENP24917. Furthermore, XENP25137, which reduced IL-15 / Rα-Fc potency with the triple mutant and the OKT_H2L1 anti-CD8 Fab arm, was more potent than XENP24918 in inducing CD8 + T cell proliferation, whereas XENP25137 was inducing CD4 + T cell proliferation. Was more powerful than.

５Ａ（ｂ）：ＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおいてインビボでＴ細胞を増殖させ、サイトカイン分泌を促進する
８日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定濃度で指定の試験物質を投与した。図９４Ａ〜Ｂはそれぞれ、７日目のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。データは、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比で示されるように、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に増殖することを示す。特に、データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択性が、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体と抗ＣＤ８の作用の組み合わせではなく、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の標的化によることを示す（ＸＥＮＰ２４０５０とＸＥＮＰ２４９２０の組み合わせで示すとおり）。 5A (b): OKT8-based CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion proliferates T cells in vivo in PBMC-transplanted NSG mice and promotes cytokine secretion in 10 million humans on day 8. PBMC was transplanted into NSG mice by IV-OSP, and then on day 0, the specified test substance was administered at the specified concentration. Figures 94A-B show the numbers of CD8 + and CD4 + T cells on day 7, respectively. The data show that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion selectively proliferates CD8 + T cells over CD4 + T cells, as shown by the CD8 + / CD4 + T cell ratio. In particular, the data show that the selectivity of CD8 + T cells is due to targeting of the IL-15 / Rα-Fc fusion rather than a combination of actions of the IL-15 / Rα-Fc fusion and anti-CD8 (with XENP24050). As shown by the combination of XENP24920).

５Ｂ：カニクイザルＣＤ８親和性のためのＯＫＴ８操作
臨床開発を容易にするために、カニクイザルの薬力学、薬物動態、および毒性など、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の様々なパラメーターを評価することは有用である。しかしながら、１つの例示的なヒト化ＯＫＴ８バリアント（Ｈ２Ｌ１）は、ヒトＣＤ８に対する１２ｎＭ ＫＤ親和性と比較して、カニクイザルＣＤ８に対する２００ｎＭ ＫＤ親和性のみを有していた。したがって、ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１（以下ＨｕＣｙ ＯＫＴ８と呼ぶ）に基づいたバリアントのライブラリーは、ヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ８と同様の親和性を持つように操作された。ライブラリーは、部位特異的突然変異誘発法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ，Ｔｘ．）または標準的な遺伝子合成によって構築された。バリアント重可変領域およびバリアント軽可変領域の配列を図９５に示す。バリアント可変領域に基づくワンアームｍＡｂは、ヘテロダイマーＦｃに結合した重可変領域と、分子の他方側が「Ｆｃのみ」であり、軽定常領域に結合した軽可変領域とともに生成された。そのようなワンアームｍＡｂの例示的な配列を図９１に示す。 5B: OKT8 manipulation for cynomolgus monkey CD8 affinity Evaluate various parameters of CD8 targeting IL-15 / Rα-Fc fusion proteins such as cynomolgus monkey pharmacodynamics, pharmacokinetics, and toxicity to facilitate clinical development. It is useful to do. However, one exemplary humanized OKT8 variant (H2L1) had only a 200 nM KD affinity for cynomolgus monkey CD8 as compared to a 12 nM KD affinity for human CD8. Therefore, a library of variants based on OKT8_H2L1 (hereinafter referred to as HuCy OKT8) was engineered to have similar affinities for CD8 in both humans and cynomolgus monkeys. The library was constructed by site-specific mutagenesis (QuikChange, Stratage, CedarCreek, Tx.) Or standard gene synthesis. The sequences of the variant weight variable region and the variant light variable region are shown in FIG. A one-arm mAb based on the variant variable region was generated with a heavy variable region bound to the heterodimer Fc and a light variable region bound to the light stationary region with the other side of the molecule "Fc only". An exemplary arrangement of such one-arm mAbs is shown in FIG.

ヒトおよびカニクイザルＣＤ８のＨｕＣｙ ＯＫＴ８バリアントに基づくワンアームｍＡｂの親和性を、ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）ベースの方法であるＯｃｔｅｔで評価した。Ｏｃｔｅｔの実験工程は、一般的に以下を含んでいた。試験物質の親和性を決定するための、固定化（バイオセンサー上へのリガンドの捕捉）、会合（分析物の連続希釈物を含むウェルにリガンドコーティングしたバイオセンサーの浸漬）、解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサーを戻すこと）。緩衝液のみを含む参照ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。特に、ヒトまたはカニクイザルのＣＤ８を捕捉し、複数の濃度のＯＫＴ８バリアントに浸漬した。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図９６に示す。データは、多数のバリアントがＯＫＴ＿Ｈ２Ｌ１と比較してカニクイザルＣＤ８に対する親和性を改善した一方で、いくつかのバリアントのみがヒトおよびカニクイザルＣＤ８の両方に対して同様の親和性を示したことを示す。 The affinity of the one-arm mAb based on the HuCy OKT8 variant of human and cynomolgus monkey CD8 was evaluated in Octet, a BioLayer Interferometri (BLI) based method. Octet's experimental steps generally included: Immobilization (capture of ligand on biosensor), association (immersion of ligand-coated biosensor in wells containing serial dilutions of analyte), dissociation (buffer solution) to determine affinity of test material Return the biosensor to the containing well). Reference wells containing only buffer were also included in the method for background correction during data processing. In particular, human or cynomolgus monkey CD8s were captured and immersed in multiple concentrations of OKT8 variants. The resulting dissociation constants (K D), the association rate (k a), and a dissociation rate (k d) shown in FIG. 96. The data show that while many variants improved their affinity for cynomolgus monkey CD8 compared to OKT_H2L1, only some variants showed similar affinity for both human and cynomolgus monkey CD8.

５Ｃ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＨｕＣｙ ＯＫＴ８）は、ヒトＴ細胞の増殖において活性である
ＨｕＣｙ ＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８ Ｆａｂアームを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、実施例５Ａに一般的に記載されているように産生され、例示的な分子の配列は図９７および図１０２に示されている。 5C: CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion (HuCy OKT8) is a CD8-targeted IL-15 / Rα- containing an anti-CD8 Fab arm based on the HuCy OKT8 variable region that is active in human T cell proliferation. Fc fusions are produced as generally described in Example 5A, and exemplary molecular sequences are shown in FIGS. 97 and 102.

５Ｃ（ａ）：ＨｕＣｙ ＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はインビトロで活性である
ヒトＰＢＭＣを、例示的なＨｕＣｙ ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃおよびワンアーム効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ ＸＥＮＰ２４０５０（対照として）で、指定濃度で３７℃で３日間、処理した。処置後、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図９８に示す。データは、ＣＤ８標的化分子（ＨｕＣｙ ＯＫＴ８結合ドメインを持つ分子を含む）のそれぞれが、ＸＥＮＰ２４０５０よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導に強力であったことを示す。 5C (a): CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing HuCy OKT8 is an in vitro active human PBMC, CD8 targeting reduced efficacy IL-15 / containing an exemplary HuCy OKT8 binding domain Treatment with Rα-Fc and one-arm reduced efficacy IL-15 / Rα-Fc XENP24050 (as a control) at a specified concentration at 37 ° C. for 3 days. After treatment, PBMC on ice for 45 minutes, anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (SK1), anti-CD8β-PE / Cy7 (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD25-PerCP / Cy5.5 (MA251), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), and anti-CD56-BV605 (NCAM16.2). After staining with the panel, cells were stained with anti-Ki67-PE / Cy7 (Ki-67) for 30 minutes at room temperature and analyzed by FACS for various cell populations and expression of Ki67. Data showing the proportions of CD8 + CD45RA-T cells and CD4 + CD45RA-T cells expressing Ki67 are shown in FIG. 98. The data show that each of the CD8 targeting molecules, including molecules with the HuCy OKT8 binding domain, was more potent in inducing the proliferation of CD8 + T cells than XENP24050.

別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で室温で３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、抗ＣＤ５６−ＰＥ、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６９４）で室温で１時間染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を、ＴｒｅｇのＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現と同様に、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ８発現に基づいてゲートし、亜集団を、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞でのＳＴＡＴ５リン酸化を示すデータを図９９に示す。Ｋｉ６７を発現する細胞の割合を示す上記のデータと一致して、ＨｕＣｙ ＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的である。 In another experiment, fresh PBMCs were incubated with designated test materials at designated concentrations for 15 minutes. After incubation, PBMCs were stained with anti-CD3-BUV395 (UCHT1), anti-CD4-BV605 (RPA-T4), and anti-CD8-Alexa700 (SK1) for 30-45 minutes at room temperature. Cells were washed and incubated with pre-cooled (-20 ° C.) 90% methanol for 20-60 minutes. After methanol incubation, cells were washed again with anti-CD25-BV421 (MA251), anti-CD45RA-BV510 (HI100), anti-FoxP3-Alexa488 (259D), anti-CD56-PE, and anti-pSTAT5-Alexa647 (pY694). Staining at room temperature for 1 hour was labeled with various cell populations and STAT5 phosphorylation. First, lymphocytes were gated based on backscatter (SSC) and forward scatter (FSC). CD4 + T cells were then gated based on CD3 and CD4 expression. Subpopulations of CD4 + T cells were further gated based on CD45RA expression, similar to Treg FoxP3 and CD25 expression. CD8 + T cells were gated based on CD3 and CD8 expression, and subpopulations were further gated based on CD45RA expression. Data showing STAT5 phosphorylation in CD8 + CD45RA-T cells and CD4 + CD45RA-T cells are shown in FIG. Consistent with the above data showing the percentage of cells expressing Ki67, the HuCy OKT8 series CD8 targeted IL-15 / Rα-Fc fusion is selective for CD8 + T cells over CD4 + T cells.

５Ｃ（ｂ）：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＨｕＣｙ ＯＫＴ８）は、ＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスでインビボでＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
８日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定濃度で指定の試験物質を投与した。図１００は、７日目のマウス血液中のＣＤ４５＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞数（ならびにＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比）を示す。データは、ＨｕＣｙ ＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ４５＋細胞およびＴ細胞の拡大において、ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃと同様の活性を示した。重要なことに、ＨｕＣｙ ＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的拡大を保持した。 5C (b): CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion (HuCy OKT8) selectively expands CD8 + T cells in vivo in PBMC-transplanted NSG mice to 10 million cells on day 8. Human PBMCs were transplanted into NSG mice by IV-OSP, followed by administration of the specified test substance at the specified concentration on day 0. FIG. 100 shows the number of CD45 + cells, CD8 + T cells, and CD4 + T cells (and CD8 + / CD4 + T cell ratio) in mouse blood on day 7. The data showed that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing HuCy OKT8 was as active as the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc containing OKT8_H2L1 in expanding CD45 + cells and T cells. .. Importantly, the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing HuCy OKT8 retained a selective expansion of CD8 + T cells over CD4 + T cells.

５Ｄ：ＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はカニクイザルＴ細胞の増殖において活性である
次に、ＨｕＣｙ ＯＫＴ８結合ドメインを含む上記のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、カニクイザルリンパ球を増殖できるかどうかを調べた。Ｃｙｎｏ ＰＢＭＣを指定の試験物質とともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で氷上で４５分間染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図１０１に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のそれぞれがカニクイザルＴ細胞を増殖させることができたことを示す。実施例５Ａ（ａ）に示すデータと一致して、ＣＤ８標的化分子はＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であった。 5D: OKT8-based CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion is active in cynomolgus monkey T cell proliferation Next, the above CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion containing the HuCy OKT8 binding domain , We investigated whether cynomolgus monkey lymphocytes could be proliferated. Cyno PBMCs were incubated with the specified test material for 4 days. After incubation, PBMC was treated with anti-CD3-PE (OKT3), anti-CD4-FITC (RPA-T4), anti-CD8α-BV510 (SK1), anti-CD8β-PE / Cy7 (SIDI8BEE), anti-CD16-BV421 (3G8), anti-CD8 Stained on ice with CD25-PerCP / Cy5.5 (MA251), anti-CD45RA-APC / Cy7 (HI100), and anti-CD56-BV605 (NCAM16.2) for 45 minutes. After staining with the panel, cells were stained with anti-Ki67-APC (Ki-67) for 30 minutes at room temperature and analyzed by FACS for various cell populations and expression of Ki67. Data showing the proportions of CD8 + CD45RA-T cells and CD4 + CD45RA-T cells expressing Ki67 are shown in FIG. The data show that each of the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions was able to proliferate cynomolgus monkey T cells. Consistent with the data shown in Example 5A (a), the CD8 targeting molecule was selective for CD8 + T cells over CD4 + T cells.

実施例６：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇよりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的である
６Ａ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、インビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇよりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
ヒトＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに３７℃で、２、５、１０、１５、３０、６０、１８０、および３６０分間インキュベートした。タイミングは、すべての反応が同時に停止されるように、異なる時間に試験物質を追加することで達成した。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で室温で３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ５１０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を、ＴｒｅｇのＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現と同様に、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ８発現に基づいてゲートし、亜集団を、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。様々な集団でのＳＴＡＴ５リン酸化を示すデータを図１０３に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、Ｔｒｅｇを含むＣＤ４＋Ｔ細胞を回避しながらＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させることを示し、ＣＤ８標的化分子は、ＷＴ ＩＬ−１５ならびにＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であることを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６５８５）の濃度がはるかに高いと、組み換えＩＬ−１５およびＷＴ ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化のベースラインレベルが刺激された。 Example 6: CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion is selective for CD8 + T cells over CD4 + T cells and Tregs 6A: CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion The body selectively expands CD4 + T cells and CD8 + T cells over Tregs in vitro human PBMCs with designated test substances at 37 ° C., 2, 5, 10, 15, 30, 60, 180, And incubated for 360 minutes. Timing was achieved by adding test material at different times so that all reactions were stopped at the same time. After incubation, PBMCs were stained with anti-CD3-BUV395 (UCHT1), anti-CD4-BV605 (RPA-T4), and anti-CD8-Alexa700 (SK1) for 30-45 minutes at room temperature. Cells were washed and incubated with pre-cooled (-20 ° C.) 90% methanol for 20-60 minutes. After methanol incubation, cells were washed again and stained with anti-CD25-BV510 (MA251), anti-CD45RA-BV510 (HI100), anti-FoxP3-Alexa488 (259D), and anti-pSTAT5-Alexa647, with various cell populations and Labeled with STAT5 phosphorylation. First, lymphocytes were gated based on backscatter (SSC) and forward scatter (FSC). CD4 + T cells were then gated based on CD3 and CD4 expression. Subpopulations of CD4 + T cells were further gated based on CD45RA expression, similar to Treg FoxP3 and CD25 expression. CD8 + T cells were gated based on CD3 and CD8 expression, and subpopulations were further gated based on CD45RA expression. Data showing STAT5 phosphorylation in various populations are shown in FIG. The data show that the CD8 targeting IL-15 / Rα-Fc fusion activates CD8 + T cells while avoiding Treg-containing CD4 + T cells, and the CD8 targeting molecules are WT IL-15 and IL-15. It is shown to be selective for CD8 + T cells as compared to the / Rα-Fc fusion. In particular, much higher concentrations of CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc (XENP26585) compared to recombinant IL-15 and WT IL-15 / Rα-Fc fusion XENP20818, CD4 + T cells and Treg STAT5 Baseline levels of phosphorylation were stimulated.

６Ｂ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、カニクイザルのＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
次に、カニクイザルのＴ細胞を拡大する際に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のインビボ作用を調べた。カニクイザル（１グループあたり３匹）に指定の試験物質を０日目に投与し、３週間モニターした。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の倍率変化を示すデータを図１０４に示す。Ｋｉ６７発現陽性の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図１０５に示す。リンパ節のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞に対するＫｉ６７の割合を示すデータを図１０６に示す。実施例５Ｄに示すカニクイザルＰＢＭＣの拡大に関するインビトロデータ、ならびにＰＢＭＣ移植マウスにおけるヒトＰＢＭＣの拡大に関するインビトロデータと一致して、ここでのデータは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させていることを示す。 6B: CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion selectively expands CD8 + T cells over CD4 + T cells in crab monkeys Next, when expanding T cells in crab quizzes, CD8 targeting The in vivo effect of the IL-15 / Rα-Fc fusion was investigated. The designated test substance was administered to cynomolgus monkeys (3 animals per group) on day 0 and monitored for 3 weeks. Data showing the change in magnification of CD8 + T cells and CD4 + T cells is shown in FIG. 104. Data showing the proportion of CD4 + CD45RA-T cells and CD8 + CD45RA-T cells in Ki67 expression-positive peripheral blood is shown in FIG. 105. Data showing the ratio of Ki67 to CD8 + CD45RA-T cells in the lymph nodes is shown in FIG. Consistent with the in vitro data on the expansion of cynomolgus monkey PBMC shown in Example 5D and the in vitro data on the expansion of human PBMC in PBMC-transplanted mice, the data here were selected by the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion. It shows that CD8 + T cells are expanded more than CD4 + T cells.

実施例７：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は薬力学の増強を示す
カニクイザルの後続試験では、Ｘｔｅｎｄ（ＸＥＮＰ２４２９４、図４０に示す配列）を含むワンアームｓｃＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−ＦｃおよびＸｔｅｎｄ（ＸＥＮＰ２６５８５、図１０２に示す配列）を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃを調査した。１日目と１６日目にカニクイザル（１グループあたり３匹）に試験物質を投与し、Ｔ細胞の拡大を調べるために経時的に採血した。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞数、ならびにＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示すデータを図１０７に示す。実施例６Ｂに示す試験と一致して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大し、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を高めた。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、より長間のＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大によって示されるワンアーム分子よりも薬力学が改善された。 Example 7: CD8 Targeted IL-15 / Rα-Fc Fusion Shows Enhanced Pharmacodynamics In a subsequent study of cynomolgus monkeys, one-arm scIL-15 (N4D / N65D) containing Xtend (XENP24294, sequence shown in FIG. 40). CD8-targeted IL-15 (N4D / N65D) / Rα-Fc containing / Rα-Fc and Xtend (XENP26585, sequence shown in FIG. 102) was investigated. Test substances were administered to cynomolgus monkeys (3 per group) on days 1 and 16, and blood was drawn over time to examine T cell expansion. Data showing the number of CD8 + T cells and CD4 + T cells, and the CD8 + / CD4 + T cell ratio are shown in FIG. Consistent with the test shown in Example 6B, the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion selectively expanded CD8 + T cells over CD4 + T cells, increasing the CD8 + / CD4 + T cell ratio. In particular, the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusion had improved pharmacodynamics over the one-arm molecule exhibited by longer CD8 + T cell expansion.

実施例８：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の同種異系抗腫瘍活性を増強する（インビトロ）
製造元の指示に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ（ＣＭＶ＋ＨＬＡ−Ａ０２０１）から精製した。精製Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識化親ＭＣＦ−７腫瘍細胞（この実施例ではグループ１と指定）またはＣＦＳＥ標識化ｐｐ６５発現ＭＣＦ−７腫瘍細胞（この実施例ではグループ１と指定）を１９：１のＥ：Ｔ比で、指定の試験物質とともにを４日間インキュベートした。３日目に、ブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）および抗ＣＤ１０７ａ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＬＡＭＰ−１）を細胞に加えた。インキュベーション後、細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて室温で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＣＤ４−ＡＰＣ／ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８ｂ−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、および抗ＣＤ６９−ＢＶ６０５（ＦＮ５０）を使用して、氷上で１時間染色した。細胞を再度洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して、抗ＩＦＮγ−ＢＶ４２１（４Ｓ．Ｂ３）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣで染色した。様々な細胞集団について、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。標的細胞はＣＦＳＥ染色に基づいて同定され、死亡標的細胞はＺｏｍｂｉｅ染色に基づいて同定された。エフェクター細胞（ＣＦＳＥ−）は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現に基づいてゲートした。 Example 8: CD8-targeted IL-15Fc fusion enhances allogeneic antitumor activity of CD8 + T cells (in vitro)
T cells were purified from human PBMC (CMV + HLA-A0201) using EasySep ™ Human T Cell Engineering Kit (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) according to the manufacturer's instructions. Purified T cells are 19: 1 CFSE-labeled parent MCF-7 tumor cells (designated as Group 1 in this example) or CFSE-labeled pp65-expressing MCF-7 tumor cells (designated as Group 1 in this example). E: T ratio was incubated with the specified test material for 4 days. On day 3, Breferdin A (BioLegend, San Diego, California) and anti-CD107a-PerCP / Cy5.5 (LAMP-1) were added to the cells. After incubation, cells were incubated with Zombie Aqua ™ Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, California) at room temperature for 30 minutes. The cells were washed and used with anti-CD4-APC / eFluor780 (RPA-T4), anti-CD8b-PE / Cy7 (SIDI8BEE), anti-CD25-PE (MA251), and anti-CD69-BV605 (FN50). Stained on ice for 1 hour. The cells were washed again and stained with anti-IFNγ-BV421 (4S.) Anti-IFNγ-BV421 (4. Cells were analyzed by flow cytometry for various cell populations. Target cells were identified based on CFSE staining and dead target cells were identified based on Zombie staining. Effector cells (CFSE-) were gated based on the expression of CD4 and CD8.

Ｋｉ６７はタンパク質の増殖と厳密に関連するタンパク質であるが、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生は細胞溶解活性を示す。図１０８Ａ〜１０８Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮγ＋の割合を示す。図１０９Ａ〜１０９Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋の割合を示す。図１１０Ａ〜１１０Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋／ＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１１Ａ〜１１１Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１２Ａ〜１１２Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋の割合を示す。図１１３Ａ〜１１３Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋／ＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１４Ａ〜１１４Ｂはそれぞれ、２つのグループの残りの標的細胞（ｐｐ６５を形質導入したＭＣＦ−７または親ＭＣＦ−７のいずれか）を示す。全体として、データは、本発明のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が腫瘍細胞の同種異系殺滅を増強するだけでなく、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体がＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大することを示す。 Although Ki67 is a protein that is closely associated with protein proliferation, the production of IFNγ by T cells exhibits cytolytic activity. Figures 108A-108B show the percentage of IFNγ + in CD8 + T cells in the two groups, respectively. Figures 109A-109B show the percentage of Ki-67 + of CD8 + T cells in the two groups, respectively. Figures 110A-110B show the percentage of Ki-67 + / IFNγ + of CD8 + T cells in the two groups, respectively. Figures 111A-111B show the percentage of IFNγ + of CD4 + T cells in the two groups, respectively. Figures 112A-112B show the percentage of Ki-67 + of CD4 + T cells in the two groups, respectively. Figures 113A-113B show the percentage of Ki-67 + / IFNγ + of CD4 + T cells in the two groups, respectively. Figures 114A-114B show the remaining target cells of the two groups (either MCF-7 transduced with pp65 or parent MCF-7), respectively. Overall, the data show that the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions of the present invention not only enhance allogeneic killing of tumor cells, but also the CD8-targeted IL-15 / Rα-Fc fusions. It is shown that CD8 + T cells are selectively expanded over CD4 + T cells.

実施例９：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、インビボでＴ細胞の同種異系抗腫瘍作用を増強し、チェックポイント遮断と相乗的に結びつく
次に、本発明のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ抗腫瘍作用、ならびにそれらがチェックポイント遮断とのスタッキングに適しているかどうかを調べた。使用したチェックポイント遮断抗体は、ＸＥＮＰ１６４３２（エフェクター機能が除去されたニボルマブに基づく二価抗ＰＤ−１ ｍＡｂであり、図１２に示された配列）である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（１グループあたり１０匹）に、１４日目に、背腹部に３×１０６個のｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を皮内移植した。０日目に、マウスに、Ｔ細胞ｐｐ６５反応性（または対照マウスのＰＢＳ）に対して陽性とスクリーニングされたＨＬＡ適合ＣＭＶ＋ドナーからの５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内に移植した。マウスを指定の試験物質またはＰＢＳ（対照マウス用）で４週間（合計４回）投与した。腫瘍体積はキャリパー測定によりモニターされ、そのデータを図１１５Ａ〜１１５Ｂに示す（初回投与後の日数）。図１１６Ａ〜１１６Ｅに示すように、７、１２、１９、および２６日目に採血し、フローサイトメトリーで分析して、様々なリンパ球集団を数えた。 Example 9: CD8 targeting IL-15 / Rα-Fc fusion enhances allogeneic antitumor activity of T cells in vivo and synergistically binds to checkpoint blockade Next, the CD8 targeting of the present invention. The in vivo antitumor effects of IL-15 / Rα-Fc fusion proteins, as well as their suitability for stacking with checkpoint blockade, were investigated. The checkpoint blocking antibody used was XENP16432, a nivolumab-based divalent anti-PD-1 mAb from which effector function had been removed, the sequence shown in FIG. NOD SCID gamma (NSG) mice (10 per group) were intradermally transplanted with 3 × 10 6 pp65-expressing MCF-7 cells in the dorsoventral region on day 14. On day 0, mice were intraperitoneally transplanted with 5 × 10 6 human PBMCs from HLA-matched CMV + donors screened positive for T cell pp65 reactivity (or PBS in control mice). Mice were administered with the specified test substance or PBS (for control mice) for 4 weeks (4 times in total). Tumor volume is monitored by caliper measurements and the data are shown in Figures 115A-115B (days after initial dosing). Blood was drawn on days 7, 12, 19, and 26 and analyzed by flow cytometry to count various lymphocyte populations, as shown in FIGS. 116A-116E.

上記は、単に本発明の原理を説明するに過ぎない。当業者は、本明細書で明示的に説明または図示されていないが、本発明の原理を具体化し、その主旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案できることを理解されたい。さらに、本明細書に列挙されるすべての例および条件付き言語は、主に、そのような具体的に列挙される例および条件に限定されない本発明の原理を読者が理解するのを助けることを意図している。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその特定の例を列挙する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような等価物には、現在知られている等価物および将来開発される等価物、つまり構造に関係なく同じ機能を実行する開発された任意の要素が含まれることが意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載され、示される例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および主旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。上記の実施例は、当業者に本発明の組成物、システム、および方法の実施形態をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を与えるために提供されており、そして本発明者らが自分たちの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかである本発明を実施するための上記の様式の修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で言及されているすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。本開示において引用されたすべての参考文献は、あたかも各参考文献が参照によりその全体が個別に組み込まれているのと同程度に参照により組み込まれる。 The above merely describes the principles of the present invention. It will be appreciated by those skilled in the art that, although not expressly described or illustrated herein, the principles of the invention can be embodied and various configurations within the gist and scope thereof can be devised. Moreover, all examples and conditional languages listed herein will primarily help the reader to understand the principles of the invention, not limited to such specifically listed examples and conditions. Intended. Moreover, all descriptions herein listing the principles, aspects, and embodiments of the invention and specific examples thereof are intended to include both their structural and functional equivalents. In addition, such equivalents are intended to include currently known equivalents and future developed equivalents, that is, any developed element that performs the same function regardless of structure. .. Therefore, the scope of the invention is not intended to be limited to the exemplary embodiments described and shown herein. Rather, the scope and gist of the present invention are embodied by the appended claims. The above examples are provided to give those skilled in the art full disclosure and description of how to make and use embodiments of the compositions, systems, and methods of the invention, and the present invention. It is not intended to limit the scope of what they consider to be their invention. Modifications of the above form for practicing the present invention that are apparent to those skilled in the art are intended to be within the scope of the appended claims. All patents and publications referred to herein indicate the level of skill in the art to which this invention relates. All references cited in this disclosure are incorporated by reference as if each reference were individually incorporated by reference in its entirety.

すべての見出しおよびセクションの指定は、明確さおよび参照目的のためだけに使用されているにすぎず、決して限定的であるとみなされるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨および範囲に従って、必要に応じて異なる見出しおよびセクションからの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。 All heading and section designations are used for clarity and reference purposes only and should never be considered restrictive. For example, one of ordinary skill in the art will recognize the usefulness of combining various aspects from different headings and sections as needed, according to the gist and scope of the invention described herein.

本明細書に引用されたすべての参考文献は、あたかも各個々の刊行物または特許または特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度にそれらの全体がすべての目的のために本明細書に参照により組み込まれる。 All references cited herein are as if each individual publication or patent or patent application is specifically and individually indicated so that it is incorporated by reference in its entirety for all purposes. To a degree all of them are incorporated herein by reference for all purposes.

当業者には明らかなように、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正および変形をなすことができる。本明細書に記載された特定の実施形態および実施例は例としてのみ提供され、特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。 As will be apparent to those skilled in the art, many modifications and variations of this application can be made without departing from the spirit and scope of this application. The particular embodiments and examples described herein are provided by way of example only, and the claims are limited by the terms of the appended claims, along with the full range of entitled equivalents. Should be.

Claims (59)

二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、または
前記ＩＬ−１５タンパク質が、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）および軽定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。 A bifunctional heterodimer protein
a) An IL-15 / IL-15Rα fusion protein containing an IL-15Rα protein, an IL-15 protein, and a first Fc domain.
The IL-15Rα protein covalently binds to the N-terminus of the IL-15 protein using a first domain linker, and the IL-15 protein uses a second domain linker to cooperate with the first Fc. The IL-15 protein is covalently attached to the N-terminus of the domain, or the IL-15 protein is covalently attached to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a first domain linker, and the IL-15Rα protein is second. IL-15 / IL-15Rα fusion protein, which is covalently attached to the N-terminus of the first Fc domain using the domain linker of
b) Heavy chains containing VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomers (VH is the variable heavy chain and CH2-CH3 is the second Fc domain), as well as variable light chains (VL) and light constant domains (VL). Contains an antigen-binding domain monomer containing a light chain containing CL), and
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S , T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q with a set of amino acid substitutions selected from the group.
A bifunctional heterodimer protein in which the antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer of claim 1, wherein the first Fc domain and / or the second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions comprising Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. protein. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１または２に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The first Fc domain and / or the second Fc domain are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235. The bifunctional hetero according to claim 1 or 2, having an additional set of amino acid substitutions consisting of / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. Dimer protein. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein is SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15). The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 3, which has an amino acid sequence of IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). 前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein and the IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, E53C: L42C, respectively. , C42S: A37C, and L45C: The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 4, having a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of A37C. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 5, wherein the IL-15 protein has one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. .. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 6, wherein the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. 前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer proteins are XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP2491, XENP264918, XENP2491, XENP26223, XENP262 The bifunctional heterodimer protein according to any one of 1 to 7. ドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質または前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 It further comprises an antigen-binding domain covalently bound to the N-terminus of the IL-15 protein or the IL-15Rα protein using a domain linker, wherein the antigen-binding domain is a second variable heavy chain domain and a second variable light. The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 8, which comprises a chain domain and does not contain an Fc domain. 二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４８である、請求項９に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to claim 9, wherein the bifunctional heterodimer protein is XENP24548. 核酸組成物であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１〜１０のうちの一項に記載の前記抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸と、
ｃ）任意選択的に、請求項９に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。 Nucleic acid composition
a) The first nucleic acid encoding the IL-15 / IL-15Rα fusion protein according to any one of claims 1 to 10.
b) A second nucleic acid encoding the antigen-binding domain monomer according to any one of claims 1 to 10.
c) A nucleic acid composition optionally comprising a third nucleic acid encoding the antigen binding domain according to claim 9. 発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項１１に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１１に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）任意選択的に、請求項１１に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 An expression vector composition
a) A first expression vector containing the first nucleic acid according to claim 11.
b) A second expression vector containing the second nucleic acid according to claim 11.
c) An expression vector composition comprising, optionally, a third expression vector comprising the third nucleic acid according to claim 11. 請求項１２に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。 A host cell containing the expression vector composition according to claim 12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。 The host cell according to claim 13, which is a method for producing the bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 1 to 10, and under the condition that the bifunctional heterodimer protein is expressed. A method comprising culturing and recovering the heterodimer protein. 二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、融合タンパク質と、
ｂ）前記第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、
ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、
前記抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。 A bifunctional heterodimer protein
a) A fusion protein comprising a first protein domain and a first Fc domain, wherein the first protein domain is covalently linked to the N-terminus of the first Fc domain using a domain linker. , Fusion protein,
b) A second protein domain that is non-covalently bound to the first protein domain,
c) A heavy chain containing a VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is a variable heavy chain and CH2-CH3 is a second Fc domain), and a light chain containing a variable light chain and a light constant domain. Contains and contains antigen-binding domain monomers.
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S , T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q with a set of amino acid substitutions selected from the group.
The first protein domain comprises an IL-15Rα protein and the second protein domain comprises an IL-15 protein, or the first protein domain comprises an IL-15 protein and said a second protein domain. Contains IL-15Rα protein
A bifunctional heterodimer protein in which the antigen-binding domain monomer binds to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. 前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質がシステイン残基を含み、前記ＩＬ−１５タンパク質がシステイン残基を含み、それによりジスルフィド結合を形成する、請求項１５に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to claim 15, wherein the IL-15Rα protein contains a cysteine residue and the IL-15 protein contains a cysteine residue to form a disulfide bond. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１５または１６に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctionality of claim 15 or 16, wherein the first Fc domain and / or the second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions comprising Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. Heterodimer protein. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１５〜１７のうちの１つに記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The first Fc domain and / or the second Fc domain are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235. 10. One of claims 15-17, comprising an additional set of amino acid substitutions consisting of / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. Bifunctional heterodimer protein. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein is SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15). The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 18, which has the amino acid sequence of IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (the shishi domain of human IL-15Rα). 前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein and the IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, E53C: L42C, respectively. , C42S: A37C, and L45C: A37C. The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 19, having a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of A37C. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 20, wherein the IL-15 protein has one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. .. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 21, wherein the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. 前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２５１３７である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 22, wherein the bifunctional heterodimer protein is XENP25137. １つ以上のドメインリンカーを使用して、前記ＩＬ−１５タンパク質および／または前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 Using one or more domain linkers, the IL-15 protein and / or the IL-15Rα protein further comprises an antigen-binding domain covalently bound to the N-terminus, wherein the antigen-binding domain is a second variable heavy chain. The bifunctional heterodimeric protein according to any one of claims 15 to 23, which comprises a domain and a second variable light chain domain and does not contain an Fc domain. 核酸組成物であって、
ａ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記第２のタンパク質ドメインをコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第３の核酸と、
ｄ）任意選択的に、請求項２４に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第４の核酸と、を含む、核酸組成物。 Nucleic acid composition
a) A first nucleic acid encoding the fusion protein according to any one of claims 16 to 23.
b) The second nucleic acid encoding the second protein domain according to any one of claims 16 to 23.
c) With the third nucleic acid encoding the antigen-binding domain according to any one of claims 16 to 23.
d) A nucleic acid composition comprising, optionally, a fourth nucleic acid encoding the antigen-binding domain according to claim 24. 発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項２５に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項２５に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項２５に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、
ｄ）任意選択的に、請求項２５に記載の前記第４の核酸を含む第４の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 An expression vector composition
a) A first expression vector containing the first nucleic acid according to claim 25,
b) A second expression vector containing the second nucleic acid according to claim 25,
c) A third expression vector containing the third nucleic acid according to claim 25,
d) An expression vector composition comprising, optionally, a fourth expression vector comprising the fourth nucleic acid according to claim 25. 請求項２６に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。 A host cell comprising the expression vector composition according to claim 26. 請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項２７に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。 The host cell according to claim 27, which is a method for producing the bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 15 to 24, and under conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed. A method comprising culturing and recovering the heterodimer protein. 二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第１の重鎖（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む、第１の抗原結合ドメインモノマーと、
ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第２の重鎖（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む、第２の抗原結合ドメインモノマーと、
ｃ）前記第２の抗原結合ドメインモノマーの前記第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、
前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒタンパク質であるか、または前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質であり、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１の抗原結合ドメインモノマーおよび前記第２の抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。 A bifunctional heterodimer protein
a) A first heavy chain containing a first VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the first variable heavy chain, CH2-CH3 is the first Fc domain), and a first. A first antigen-binding domain monomer comprising a variable light chain and a first light chain comprising a first light constant domain,
b) A second heavy chain containing a second VH-CH1-hinge-CH2-CH3 monomer (VH is the second variable heavy chain and CH2-CH3 is the second Fc domain), the second Includes a second light chain containing a variable light chain and a second light constant domain, and a first protein domain covalently attached to the C-terminus of the second Fc domain using a first domain linker. , A second antigen-binding domain monomer,
c) Containing a second protein domain that is bound or non-covalently bound to the first protein domain of the second antigen binding domain monomer.
The first protein domain is the IL-15Rα protein and the second protein domain is the IL-15R protein, or the first protein domain is the IL-15 protein and the second protein domain. Is the IL-15Rα protein,
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S , T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q with a set of amino acid substitutions selected from the group.
A bifunctional heterodimer protein in which the first antigen-binding domain monomer and the second antigen-binding domain monomer bind to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項２９に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 29. The bifunctional heterodimer of claim 29, wherein the first Fc domain and / or the second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions comprising Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. protein. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項２９または３０に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The first Fc domain and / or the second Fc domain are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235. 29 or 30, claim 29 or 30, having an additional set of amino acid substitutions consisting of / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. Dimer protein. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) or SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein is SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15). The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 31, having the amino acid sequence of IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (the shishi domain of human IL-15Rα). 前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein and the IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, E53C: L42C, respectively. , C42S: A37C, and L45C: The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 32, which comprises a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of A37C. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 33, wherein the IL-15 protein has one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. .. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 34, wherein the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. 前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４６である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 35, wherein the bifunctional heterodimer protein is XENP24546. 核酸組成物であって、
ａ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第１の抗原結合ドメインモノマーをコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第２の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第２のタンパク質ドメインをコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。 Nucleic acid composition
a) The first nucleic acid encoding the first antigen-binding domain monomer according to any one of claims 29 to 36.
b) With the second nucleic acid encoding the second antigen-binding domain monomer according to any one of claims 29 to 36.
c) A nucleic acid composition comprising a third nucleic acid encoding the second protein domain according to any one of claims 29 to 36. 発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項３７に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項３７に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項３７に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 An expression vector composition
a) A first expression vector containing the first nucleic acid according to claim 37,
b) A second expression vector containing the second nucleic acid according to claim 37,
c) An expression vector composition comprising a third expression vector comprising the third nucleic acid according to claim 37. 請求項３８に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。 A host cell comprising the expression vector composition according to claim 38. 請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項３９に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。 The host cell according to claim 39, which is a method for producing the bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 29 to 36, under the condition that the bifunctional heterodimer protein is expressed. A method comprising culturing and recovering the heterodimer protein. 二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、
前記第１の抗原結合ドメインが、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記抗原結合ドメインが、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
前記第２の抗原結合ドメインが、第３のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第４のドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。 A bifunctional heterodimer protein
a) An IL-15 fusion protein comprising an IL-15 protein, a first antigen binding domain, and a first Fc domain.
The first antigen-binding domain covalently binds to the N-terminus of the IL-15 protein using a first domain linker, and the IL-15 protein covalently binds to the N-terminus of the IL-15 protein using a second domain linker. An IL-15 fusion protein covalently attached to the N-terminus of the Fc domain, wherein the antigen-binding domain contains a first variable heavy chain domain and a first variable light chain domain and does not contain an Fc domain.
b) An IL-15Rα fusion protein comprising an IL-15Rα protein, a second antigen binding domain, and a second Fc domain.
The second antigen-binding domain covalently binds to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a third domain linker, and the IL-15Rα protein covalently binds to the N-terminus of the IL-15Rα protein using a fourth domain linker. With an IL-15Rα fusion protein covalently attached to the N-terminus of the Fc domain, wherein the second antigen-binding domain comprises a second variable heavy chain domain and a second variable light chain domain and does not contain an Fc domain. , Including
The first Fc domain and the second Fc domain are EU numbered S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q, S364K / E357Q: L368D / K370S, L368D / K370S: S364K, L368E / K370S: S , T411T / K360E / Q362E: D401K, L368D / K370S: S364K / E357L, and K370S: S364K / E357Q with a set of amino acid substitutions selected from the group.
A bifunctional heterodimer protein in which the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain bind to an antigen selected from the group consisting of human CD8, human NKG2A, and human NKG2D. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項４１に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 42. The bifunctional heterodimer of claim 41, wherein the first Fc domain and / or the second Fc domain has an additional set of amino acid substitutions comprising Q295E / N384D / Q418E / N421D by EU numbering. protein. 前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項４１または４２に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The first Fc domain and / or the second Fc domain are EU numbered G236R / L328R, E233P / L234V / L235A / G236del / S239K, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K, E233P / L234V / L235. The bifunctional hetero according to claim 41 or 42, which has an additional set of amino acid substitutions consisting of / G236del / S239K / A327G, E233P / L234V / L235A / G236del / S267K / A327G, and E233P / L234V / L235A / G236del. Dimer protein. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein has the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (full-length human IL-15) and SEQ ID NO: 2 (mature human IL-15), and the IL-15Rα protein is SEQ ID NO: 3 (full-length human IL-15). The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 43, which has the amino acid sequence of IL-15Rα) or SEQ ID NO: 4 (sushi domain of human IL-15Rα). 前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The IL-15 protein and the IL-15Rα protein are E87C: D96 / P97 / C98, E87C: D96 / C97 / A98, V49C: S40C, L52C: S40C, E89C: K34C, Q48C: G38C, E53C: L42C, respectively. The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 44, which comprises a set of amino acid substitutions selected from the group consisting of, C42S: A37C, and L45C: A37C. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 45, wherein the IL-15 protein has one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of N4D, D61N, N65D, and Q108E. .. 前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 46, wherein the IL-15 protein comprises an amino acid substitution of N4D / N65D or D30N / E64Q / N65D. 前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４７である、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。 The bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 47, wherein the bifunctional heterodimer protein is XENP24547. 核酸組成物であって、
ａ）請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。 Nucleic acid composition
a) The first nucleic acid encoding the IL-15 fusion protein according to any one of claims 41 to 48.
b) A nucleic acid composition comprising a second nucleic acid encoding the IL-15Rα fusion protein according to any one of claims 41-48. 発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項４９に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項４９に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 An expression vector composition
a) A first expression vector containing the first nucleic acid according to claim 49,
b) An expression vector composition comprising a second expression vector comprising the second nucleic acid according to claim 49. 請求項５０に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。 A host cell containing the expression vector composition according to claim 50. 請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項５１に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。 The host cell according to claim 51, which is a method for producing the bifunctional heterodimer protein according to any one of claims 41 to 48, under the condition that the bifunctional heterodimer protein is expressed. A method comprising culturing and recovering the heterodimer protein. ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される、二機能性ヘテロダイマータンパク質。 XENP24114, from XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP24919, XENP25137, XENP26223, XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585, XENP27145, and the group consisting of XENP27146 The bifunctional heterodimer protein of choice. ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、核酸組成物。 XENP24114, from XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24548, XENP24736, XENP24917, XENP24918, XENP24919, XENP25137, XENP26223, XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585, XENP27145, and the group consisting of XENP27146 A nucleic acid composition comprising one or more nucleic acids encoding a bifunctional heterodimer protein of choice. １つ以上の発現ベクターを含み、前記１つ以上の発現ベクターがＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードするようにそれぞれ核酸を含む、発現ベクター組成物。 Includes one or more expression vectors, the one or more expression vectors being XENP24114, XENP24115, XENP24116, XENP24531, XENP24532, XENP24533, XENP24534, XENP24543, XENP24546, XENP24547, XENP24546, XENP2547, XENP24548, XENP245448, , XENP26224, XENP26227, XENP26229, XENP26585, XENP27145, and XENP27146, respectively, an expression vector composition comprising nucleic acids encoding a bifunctional heterodimer protein selected from the group. 請求項５４に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。 A host cell comprising the nucleic acid composition of claim 54. 請求項５７に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。 A host cell comprising the expression vector composition according to claim 57. 請求項５３に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を製造する方法であって、（ａ）前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で、請求項５６または５７に記載の宿主細胞を培養することと、（ｂ）前記タンパク質を回収することと、を含む、方法。 The host cell according to claim 56 or 57, which is a method for producing the bifunctional heterodimer protein according to claim 53, wherein (a) the host cell according to claim 56 or 57 under suitable conditions in which the bifunctional heterodimer protein is expressed. A method comprising culturing the protein and (b) recovering the protein. 癌を治療することを必要とする患者において癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項５３に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を前記患者に投与することを含む、方法。 A method of treating a cancer in a patient in need of treating the cancer, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the bifunctional heterodimer protein according to claim 53.
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