JP2019168223A - Detection method of protein present in exosome membrane - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting a protein present in an exosome membrane.
エクソソームは、細胞から分泌される直径約40nm〜約150nmの小胞であり、タンパク質、mRNA、miRNAなどの分子を内包している。腫瘍細胞から分泌されるエクソソームは腫瘍細胞種によって異なる分子を内包しているため、エクソソーム由来の分子はバイオマーカーとして注目されている。近年、血清中の癌細胞由来のエクソソームを腫瘍マーカーとして用いた癌の診断が報告されている（非特許文献１及び２）。しかしながら、エクソソームの膜上に存在するとされるタンパク質の測定は、CD９、CD63、CD81などの分子に限られており、細胞機能に関係するとされるCEAファミリーやインテグリンなどの膜タンパク質は、多数存在するにも関わらず、エクソソームの膜上のそれらのタンパク質を測定した報告はない。 Exosomes are vesicles having a diameter of about 40 nm to about 150 nm that are secreted from cells, and encapsulate molecules such as proteins, mRNAs, and miRNAs. Since exosomes secreted from tumor cells contain different molecules depending on tumor cell types, exosome-derived molecules are attracting attention as biomarkers. In recent years, cancer diagnosis using exosomes derived from cancer cells in serum as tumor markers has been reported (Non-patent Documents 1 and 2). However, the measurement of proteins that are supposed to be present on the exosome membrane is limited to molecules such as CD9, CD63, and CD81, and there are many membrane proteins such as CEA family and integrins that are related to cell function. Nevertheless, there are no reports measuring these proteins on the exosome membrane.
現在、血液中の癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、CEA、CEACAM 5）は、臨床において一般的な腫瘍マーカーであり、大腸癌などの再発の診断に用いられている。CEAは分子量約20万の糖タンパク質であり、ヒト大腸癌組織及び胎児腸管において発見され、また、CEAと似た構造を有する複数のタンパク質も発見された。これらは、CEAファミリーとして、統一された新しい名称と分類が決められ、それによりCEAファミリーは、CEACAM（CEA-related cell adhesion molecule）及びPSG（pregnancy-specific glycoprotein）の2つのグループに分類されることとなった。CEAはCEACAM 1、CEACAM 3、CEACAM 4、CEACAM 6、CEACAM 7及びCEACAM 8と共にCEACAMのグループに属する。しかしながら、CEAは癌の再発の診断マーカーとして用いられているが、癌の早期診断のためのマーカーとして用いられているとの報告はない。そして、CEA以外のCEAファミリーメンバーは腫瘍マーカーとして用いられているとの報告もない。 Currently, carcinoembryonic antigen (CEA, CEACAM 5) in blood is a common tumor marker in the clinic, and is used for diagnosis of recurrence such as colorectal cancer. CEA is a glycoprotein having a molecular weight of about 200,000 and was found in human colon cancer tissue and fetal intestinal tract, and a plurality of proteins having a structure similar to CEA was also found. These are defined as the CEA family by a new unified name and classification, and the CEA family is classified into two groups: CEACAM (CEA-related cell adhesion molecule) and PSG (pregnancy-specific glycoprotein). It became. CEA belongs to the CEACAM group together with CEACAM 1, CEACAM 3, CEACAM 4, CEACAM 6, CEACAM 7, and CEACAM 8. However, although CEA is used as a diagnostic marker for cancer recurrence, there is no report that it is used as a marker for early diagnosis of cancer. There is no report that CEA family members other than CEA are used as tumor markers.
また、一般に、CEAなどのタンパク質を腫瘍マーカーとして用いた癌の診断では、偽陽性や偽陰性が散見され、偽陽性のために必要のない検査が行われたり、偽陰性のために癌の再発の発見が遅れたりして、患者に不要な負担が生じる。したがって、精度の高いタンパク質の検出方法が求められている。 Also, in general, in the diagnosis of cancer using CEA or other protein as a tumor marker, false positives and false negatives are occasionally found, tests that are not necessary for false positives are performed, and cancer recurrence occurs due to false negatives. The patient's discovery is delayed, causing unnecessary burden on the patient. Therefore, there is a need for a highly accurate protein detection method.
本発明は、エクソソームの膜に存在するタンパク質について、精度の高い検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、癌の検出、特に癌の遠隔転移の検出方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a highly accurate detection method for a protein present in an exosome membrane. Another object of the present invention is to provide a method for detecting cancer, particularly a method for detecting distant metastasis of cancer.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、単に血清から得たエクソソームを検出するだけでは、エクソソームの膜に存在するCEAを検出することが出来ないが、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin ; BSA）の存在下であれば、エクソソームの膜に存在するCEAの検出が可能であることを偶然にも見出した。また、エクソソームの膜に存在するCEAの測定値を用いて大腸癌の遠隔転移診断をしたところ、精度の高い診断が可能であることも見出した。 The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, it is not possible to detect CEA present in the exosome membrane simply by detecting exosomes obtained from serum, but bovine serum albumin (bovine It was discovered by chance that CEA present in the exosome membrane can be detected in the presence of serum albumin (BSA). In addition, when a remote metastasis diagnosis of colorectal cancer was performed using the measured value of CEA present in the exosome membrane, it was also found that a highly accurate diagnosis was possible.
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりのものを提供する。
［１］生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質の検出方法であって、
ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、該タンパク質と該抗体との複合体を検出する工程を含む、方法。
［２］前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）である、［１］に記載の方法。
［３］前記ウシ血清アルブミン溶液の濃度が１％（ｗ／ｖ）である、［２］に記載の方法。
［４］前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の１．５倍〜１０倍である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の２．５倍〜５倍である、［４］に記載の方法。
［６］生体試料が凍結された試料である場合、当該試料を４℃〜６０℃で融解する工程をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］融解する工程を４℃〜３７℃で行う、［６］記載の方法。
［８］エクソソームの膜に存在するタンパク質が糖タンパク質である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］糖タンパク質がＣＥＡファミリーメンバーである、［８］に記載の方法。
［１０］ＣＥＡファミリーメンバーが、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ １、及びＣＥＡＣＡＭ ６からなる群から選ばれる１以上である、［９］に記載の方法。
［１１］生体試料が体液である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］体液が血清又は血漿である、［１１］に記載の方法。
［１３］癌の遠隔転移を検出するための、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、［１３］に記載の方法。
［１５］癌が大腸癌である、［１４］に記載の方法。
［１６］癌の遠隔転移の診断のための検査方法であって、
（１）[１]に記載の方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質を検出し、該タンパク質の濃度を測定すること、
（２）（１）により得られたタンパク質の濃度と基準値とを比較することを含み、
被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる、方法。
［１７］基準値が、遠隔転移の有無が既知の患者集団におけるＲＯＣ曲線に基づいて設定されるカットオフポイントである、［１６］に記載の方法。
［１８］癌が大腸癌、胃癌、及び食道癌からなる群から選ばれる１以上である、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］癌が大腸癌である、［１８］に記載の方法。
As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention provides the following.
[1] A method for detecting a protein present in an exosome membrane in a biological sample,
A method comprising: contacting an exosome isolated from the biological sample dispersed in a bovine serum albumin solution with an antibody against the protein, and detecting a complex of the protein and the antibody.
[2] The method according to [1], wherein the concentration of the bovine serum albumin solution is 0.5% (w / v) to 5% (w / v).
[3] The method according to [2], wherein the concentration of the bovine serum albumin solution is 1% (w / v).
[4] The concentration of exosomes isolated from the biological sample dispersed in the bovine serum albumin solution is 1.5 to 10 times the concentration of exosomes in the biological sample. 3].
[5] The concentration of exosomes isolated from the biological sample dispersed in the bovine serum albumin solution is 2.5 to 5 times the concentration of exosomes in the biological sample. the method of.
[6] The method according to any one of [1] to [5], further comprising a step of thawing the sample at 4 ° C to 60 ° C when the biological sample is a frozen sample.
[7] The method according to [6], wherein the melting step is performed at 4 ° C to 37 ° C.
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the protein present in the exosome membrane is a glycoprotein.
[9] The method according to [8], wherein the glycoprotein is a CEA family member.
[10] The method according to [9], wherein the CEA family member is one or more selected from the group consisting of CEA, CEACAM 1, and CEACAM 6.
[11] The method according to any one of [1] to [10], wherein the biological sample is a body fluid.
[12] The method according to [11], wherein the body fluid is serum or plasma.
[13] The method according to any one of [1] to [12] for detecting distant metastasis of cancer.
[14] The method according to [13], wherein the cancer is one or more selected from the group consisting of colon cancer, stomach cancer, and esophageal cancer.
[15] The method according to [14], wherein the cancer is colorectal cancer.
[16] A test method for diagnosis of distant metastasis of cancer,
(1) Detecting a protein present in an exosome membrane in a biological sample derived from a subject by the method according to [1] and measuring the concentration of the protein,
(2) comprising comparing the protein concentration obtained in (1) with a reference value;
A method wherein a protein concentration in a subject is higher than a reference value is an indicator of distant metastasis of cancer.
[17] The method according to [16], wherein the reference value is a cut-off point set based on an ROC curve in a patient population with known distant metastasis.
[18] The method according to [16] or [17], wherein the cancer is one or more selected from the group consisting of colon cancer, stomach cancer, and esophageal cancer.
[19] The method according to [18], wherein the cancer is colorectal cancer.
本発明の検出方法によれば、エクソソームの膜に存在するタンパク質について、精度の高い検出が可能である。また、生体試料が凍結された試料である場合も、エクソソームの膜に存在するタンパク質の検出が可能であり、さらに融解温度を適当な温度に設定することで、より精度の高い検出が可能となる。さらに、上記の精度の高い検出方法を用いることにより、癌の検出、特に癌の遠隔転移の検出が可能となる。 According to the detection method of the present invention, it is possible to highly accurately detect a protein present in an exosome membrane. In addition, even when the biological sample is a frozen sample, it is possible to detect the protein present in the exosome membrane, and more accurate detection is possible by setting the melting temperature to an appropriate temperature. . Furthermore, by using the above-described highly accurate detection method, it is possible to detect cancer, particularly detection of distant metastasis of cancer.
本発明は、生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質（以下「エクソソーム膜タンパク質」と略記する。）の検出方法（以下、「本発明の検出方法」と略記する場合がある。）を提供する。当該方法は、
（１）ウシ血清アルブミン（BSA）溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、
（２）該タンパク質と該抗体との複合体を検出することを含む、
また、本発明は、上記検出方法に基づいて、癌の遠隔転移を診断するための検査方法（以下、「本発明の検査方法」と略記する場合がある。）を提供する。当該方法は、
（１）上記の本発明の検出方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を測定すること、及び
（２）（１）により得られた該タンパク質の濃度と基準値とを比較することを含む。比較の結果、被験者における該タンパク質の濃度が基準値よりも高い場合、癌の遠隔転移があると診断することができる。
The present invention provides a method for detecting a protein present in an exosome membrane in a biological sample (hereinafter abbreviated as “exosome membrane protein”) (hereinafter sometimes abbreviated as “the detection method of the present invention”). To do. The method is
(1) contacting an exosome isolated from the biological sample dispersed in a bovine serum albumin (BSA) solution with an antibody against the protein;
(2) detecting a complex of the protein and the antibody,
The present invention also provides a test method for diagnosing distant metastasis of cancer based on the above detection method (hereinafter sometimes abbreviated as “test method of the present invention”). The method is
(1) The concentration of exosome membrane protein in a biological sample derived from a subject is measured by the detection method of the present invention, and (2) the concentration and reference value of the protein obtained in (1) are determined. Including comparing. As a result of the comparison, when the concentration of the protein in the subject is higher than the reference value, it can be diagnosed that there is distant metastasis of cancer.
生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の検出方法
本発明の検出方法に用いる生体試料は、生体から得られた試料であれば特に限定されない。生体から得られた試料としては、例えば、体液及び細胞の培養上清などが挙げられ、好ましくは体液である。体液としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液などが挙げられ、好ましくは血清又は血漿である。細胞の培養上清としては、当該細胞由来のエクソソーム以外のエクソソームを含まない培養上清が挙げられる。そのような培養上清としては、例えば、目的の細胞を適した条件下で培養後、当該細胞由来のエクソソーム以外のエクソソームを除くために培地を無血清培地に交換して培養し、その培養液を遠心して得られる上清などが挙げられる。生体試料は凍結されていなくてもよいし、凍結されていてもよい。
Method for detecting exosome membrane protein in biological sample The biological sample used in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample obtained from a living body. Examples of the sample obtained from a living body include body fluids and cell culture supernatants, preferably body fluids. Examples of the body fluid include blood, serum, plasma, saliva, urine, tears, sweat, milk, nasal discharge, semen, pleural effusion, gastrointestinal secretions, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, and lymph fluid, preferably Serum or plasma. Examples of the culture supernatant of the cell include a culture supernatant containing no exosome other than the exosome derived from the cell. As such a culture supernatant, for example, after culturing the target cell under suitable conditions, the medium is replaced with a serum-free medium in order to remove exosomes other than the cell-derived exosome, and the culture solution is obtained. The supernatant obtained by centrifuging is mentioned. The biological sample may not be frozen or may be frozen.
本発明の検出方法において、生体試料からエクソソームを単離する方法は特に限定されない。そのような方法としては、例えば、超遠心法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法、免疫沈降法、ポリマー沈殿法、及びサイズ排除法などが挙げられる。また、市販のキットを用いて生体試料からエクソソームを単離することができる。そのようなキットとしては、例えば、ExoQuickTM（System Biosciences）、miRCURYTM Exosome Isolation Kit（タカラバイオ）、Total Exosome Isolation（ライフテクノロジーズ）、ExoTrapTM Exosome Isolation Spin Column Kit for Protein Research（コスモ・バイオ）、exoEasy Maxi Kit（キアゲン）などが挙げられる。 In the detection method of the present invention, the method for isolating exosomes from a biological sample is not particularly limited. Examples of such methods include ultracentrifugation, sucrose cushioning, density gradient centrifugation, immunoprecipitation, polymer precipitation, and size exclusion. In addition, exosomes can be isolated from a biological sample using a commercially available kit. Examples of such kits include ExoQuick ™ (System Biosciences), miRCURY ™ Exosome Isolation Kit (Takara Bio), Total Exosome Isolation (Life Technologies), ExoTrap ™ Exosome Isolation Spin Column Kit for Protein Research (Cosmo Bio), Examples include exoEasy Maxi Kit (Qiagen).
生体試料から単離したエクソソームをウシ血清アルブミン（BSA）溶液中に分散させる方法は特に限定されない。例えば、生体試料から単離したエクソソームのペレットをBSA溶液で分散させる方法や、当該ペレットをMilliQ水などで分散させた後にBSAを添加する方法などが挙げられる。BSA溶液中のBSAの濃度は特に限定されないが、下限は0.5%(w/v)以上が好ましく、0.8%(w/v)以上がより好ましく、1%(w/v)以上がさらに好ましく、上限は5%(w/v)以下が好ましく、4%(w/v)以下がより好ましく、3%(w/v)以下がさらに好ましい。BSAの濃度は0.5%(w/v)〜5%(w/v)が好ましく、0.8%(w/v)〜4%(w/v)がより好ましく、1%(w/v)〜3%(w/v)がさらに好ましく、1%(w/v)が特に好ましい。 A method for dispersing exosomes isolated from a biological sample in a bovine serum albumin (BSA) solution is not particularly limited. For example, a method of dispersing an exosome pellet isolated from a biological sample with a BSA solution, a method of adding BSA after dispersing the pellet with MilliQ water or the like can be mentioned. The concentration of BSA in the BSA solution is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.5% (w / v) or more, more preferably 0.8% (w / v) or more, and further preferably 1% (w / v) or more, The upper limit is preferably 5% (w / v) or less, more preferably 4% (w / v) or less, and further preferably 3% (w / v) or less. The concentration of BSA is preferably 0.5% (w / v) to 5% (w / v), more preferably 0.8% (w / v) to 4% (w / v), 1% (w / v) to 3 % (w / v) is more preferable, and 1% (w / v) is particularly preferable.
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、単に血清からエクソソームを得るだけではエクソソームの膜に存在するCEAを検出することができず、BSAの存在下であれば検出が可能になるメカニズムとしては、BSAが抗原抗体反応を促進する可能性、BSAがエクソソーム同士の結合を阻害していることが推定される。したがって、本発明の検出方法を用いて、従来の検出方法では検出することができなかったエクソソーム膜タンパク質も検出し得る。 Although not wishing to be bound by any theory, it is not possible to detect CEA present in the exosome membrane simply by obtaining exosomes from serum, and detection is possible in the presence of BSA. As the mechanism, it is presumed that BSA may promote the antigen-antibody reaction, and that BSA inhibits binding between exosomes. Therefore, using the detection method of the present invention, exosome membrane proteins that could not be detected by conventional detection methods can also be detected.
本発明の検出方法における検出対象であるエクソソーム膜タンパク質としては、エクソソームの膜に存在し、かつその一部が抗原性を有し抗体と反応可能な程度に膜外に露出しているタンパク質であれば特に制限はないが、例えば、テトラスパニン、細胞接着分子、抗原提示関連タンパク質、サイトカイン受容体等が挙げられる。また、癌患者の体液中のエクソソームの膜に多く存在することが知られているタンパク質などが挙げられる。テトラスパニンとしては、例えば、CD9、CD37、CD63、CD81などが挙げられる。細胞接着分子としては、例えば、インテグリン、CEAファミリーメンバー、ICAM-1（intercellular adhesion molecule-1）、CD31などが挙げられる。抗原提示関連タンパク質としては、例えば、MHC I、MHC IIなどが挙げられる。サイトカイン受容体としては、例えば、EGFRvIIIなどが挙げられる。癌患者の体液中のエクソソームの膜に多く存在することが知られているタンパク質としては、例えば、CD9、CD24、CD91、CD147、caveolin-1、glypican-1、EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule）などが挙げられる。 The exosome membrane protein to be detected in the detection method of the present invention is a protein that is present on the exosome membrane and that is partly exposed to the extent that it has antigenicity and can react with an antibody. For example, tetraspanin, cell adhesion molecule, antigen presentation related protein, cytokine receptor and the like can be mentioned. Moreover, the protein etc. which are known to exist abundantly in the film | membrane of the exosome in the body fluid of a cancer patient are mentioned. Examples of tetraspanin include CD9, CD37, CD63, and CD81. Examples of the cell adhesion molecule include integrin, CEA family member, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), CD31 and the like. Examples of antigen presentation-related proteins include MHC I and MHC II. Examples of cytokine receptors include EGFRvIII. Examples of proteins that are known to exist in many exosome membranes in body fluids of cancer patients include CD9, CD24, CD91, CD147, caveolin-1, glypican-1, and EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule). Can be mentioned.
エクソソーム膜タンパク質のうち、糖タンパク質であるCD9、CD37、CD63、インテグリン、CEAファミリーメンバー、ICAM-1、CD31、MHC I、MHC II、EGFRvIII、CD24、CD147、glypican-1、EpCAMが好ましく、CEAファミリーメンバーがより好ましい。CEAファミリーメンバーとしては、例えば、CEA、CEACAM 1、CEACAM 3、CEACAM 4、CEACAM 6、CEACAM 7、CEACAM 8などが挙げられ、好ましくはCEA、CEACAM 1、CEACAM 6である。 Among exosome membrane proteins, glycoproteins CD9, CD37, CD63, integrin, CEA family members, ICAM-1, CD31, MHC I, MHC II, EGFRvIII, CD24, CD147, glypican-1, EpCAM are preferred, CEA family Members are more preferred. Examples of CEA family members include CEA, CEACAM 1, CEACAM 3, CEACAM 4, CEACAM 6, CEACAM 7, CEACAM 8, and the like, preferably CEA, CEACAM 1, and CEACAM 6.
本発明の検出方法に用いられる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、市販の抗体を用いることもできる。当該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。 The antibody used in the detection method of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique. Commercially available antibodies can also be used. The antibody may be an antibody-binding fragment (eg, Fab, F (ab ′) 2 ) or a recombinant antibody (eg, a single chain antibody).
本発明の検出方法において、生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の検出方法は、抗原抗体反応を用いた方法であれば特に限定されない。そのような方法としては、例えば、ELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、化学発光酵素免疫測定法（Chemiluminescent Enzyme Immuno Assay ; CLEIA法）、化学発光免疫測定法（Chemiluminescent Immuno Assay ; CLIA法）、電気化学発光免疫測定法（Electro-chemiluminescence immunoassay ; ECLIA法）、放射免疫測定法（Radioimmunoassay：RIA法）、蛍光抗体法、ラテックス凝集法、ウエスタンブロッティング法などが挙げられる。感度および実施しやすさの観点から、ELISA法が好ましい。また、エクソソーム膜タンパク質に特異的な抗体を含む市販のキットを用いてエクソソーム膜タンパク質を検出することができる。そのようなキットとしては、例えば、CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan)、Human CEACAM-1 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)、Human CEACAM-6 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)、癌胎児性抗原キットCEA・アボット, アーキテクト i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan)などが挙げられる。 In the detection method of the present invention, the method for detecting an exosome membrane protein in a biological sample is not particularly limited as long as it is a method using an antigen-antibody reaction. Examples of such methods include ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), chemiluminescent immunoassay (CLIA), electrochemistry Examples thereof include a chemiluminescence immunoassay (Electro-chemiluminescence immunoassay; ECLIA method), a radioimmunoassay (RIA method), a fluorescent antibody method, a latex agglutination method, and a Western blotting method. From the viewpoint of sensitivity and ease of implementation, the ELISA method is preferred. In addition, the exosome membrane protein can be detected using a commercially available kit containing an antibody specific for the exosome membrane protein. Examples of such kits include CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan), Human CEACAM-1 DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN), and Human CEACAM-6 DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN). ), Carcinoembryonic antigen kit CEA / Abbott, Architect i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan).
生体試料から単離したエクソソームと、エクソソーム膜タンパク質に対する抗体との接触は、これらの抗体と、溶液中の該タンパク質が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、例えば抗体が固相化されたプレートに、該溶液を添加することなどにより行うことができる。また、例えば該溶液中のエクソソーム膜タンパク質をSDS-PAGEなどの手段によって分離し、メンブレンに移して固定した後、抗体と接触させることによっても行うことができる。 Regarding the contact between the exosome isolated from the biological sample and the antibody against the exosome membrane protein, the mode, order, and specific method are not particularly limited as long as these antibodies can interact with the protein in the solution. . The contact can be performed, for example, by adding the solution to a plate on which the antibody is immobilized. Alternatively, for example, the exosome membrane protein in the solution can be separated by means such as SDS-PAGE, transferred to a membrane and fixed, and then contacted with an antibody.
なお、かかる接触を保つ時間は、前記抗体と、エクソソーム膜タンパク質とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒〜十数時間である。また、接触を行う温度条件は、通常4℃〜50℃であり、4℃〜37℃が好ましく、15℃〜30℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行うpH条件は、5.0〜9.0が好ましく、特に6.0〜8.0の中性域が好ましい。 The time for maintaining such contact is not particularly limited as long as it is sufficient for the antibody and exosome membrane protein to bind to form a complex, but is usually several seconds to several tens of hours. Moreover, the temperature conditions which perform a contact are 4 to 50 degreeC normally, 4 to 37 degreeC is preferable and the room temperature of about 15 to 30 degreeC is the most preferable. Furthermore, the pH condition for carrying out the reaction is preferably 5.0 to 9.0, particularly preferably the neutral range of 6.0 to 8.0.
本発明の好ましい態様において、エクソソーム膜タンパク質の検出は、サンドイッチELISA法により行うが、抗原抗体反応を用いた方法であればこの方法に限定されるものではない。サンドイッチELISA法は、例えば次のように行なう。まず、一次抗体をELISA用プレートのウェル表面に固相化する。次いでウェル表面への非特異的な吸着を防ぐためにブロッキングを行なった後、生体試料から単離したエクソソームを添加し、該抗体と接触させて複合体を形成させる。該抗体と結合しなかったエクソソームを洗浄により除去した後、標識した二次抗体をウェルに加えて複合体を形成させ、該標識により検出・定量を行なう。定量は、用いた標識に基づき検出したシグナルを、標準試料を使用して作成した検量線を利用して数値化することや、タンパク質の濃度を測定する等の自体公知の方法により行なうことができる。 In a preferred embodiment of the present invention, exosome membrane protein is detected by sandwich ELISA, but is not limited to this method as long as it uses an antigen-antibody reaction. For example, the sandwich ELISA method is performed as follows. First, the primary antibody is immobilized on the well surface of an ELISA plate. Next, blocking is performed to prevent nonspecific adsorption to the well surface, and then an exosome isolated from a biological sample is added and brought into contact with the antibody to form a complex. After the exosomes that have not bound to the antibody are removed by washing, a labeled secondary antibody is added to the well to form a complex, and detection and quantification are performed using the label. Quantification can be performed by a method known per se, such as quantifying the signal detected based on the label used using a calibration curve created using a standard sample, or measuring the protein concentration. .
生体試料から単離したエクソソームをBSA溶液中に分散させた際、前記BSA溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度より高い場合、さらに精度の高い検出が可能である。そのような場合としては、例えば、生体試料から単離したエクソソームのペレットを当該生体試料よりも少ない量のBSA溶液中に分散させた場合が挙げられる。前記BSA溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームの濃度が、前記生体試料中のエクソソームの濃度の1.5倍〜10倍であることが好ましく、2倍〜7.5倍であることがより好ましく、2.5倍〜5倍であることがさらに好ましい。 When exosomes isolated from a biological sample are dispersed in a BSA solution, the concentration of exosomes isolated from the biological sample dispersed in the BSA solution is higher than the concentration of exosomes in the biological sample, Furthermore, highly accurate detection is possible. Examples of such a case include a case where an exosome pellet isolated from a biological sample is dispersed in a smaller amount of BSA solution than the biological sample. The concentration of exosomes isolated from the biological sample dispersed in the BSA solution is preferably 1.5 to 10 times, more preferably 2 to 7.5 times the concentration of exosomes in the biological sample. More preferably, it is more preferably 2.5 to 5 times.
本発明者らは、凍結された血清を用いてエクソソームの膜に存在するCEAを検出した場合に、意外なことに、凍結された血清を融解する温度の違いによってCEAの測定値が変化することを見出した。したがって、一実施態様において、本発明の検出方法は、生体試料が凍結された試料である場合に、当該試料を特定の温度で融解する工程をさらに含む。かかる融解温度の下限は4℃以上が好ましく、10℃以上がより好ましく、20℃以上がさらに好ましく、上限は60℃以下が好ましく、50℃以下がより好ましく、40℃以下がさらに好ましく、37℃以下が特に好ましい。融解温度は、4℃〜60℃が好ましく、4℃〜37℃がより好ましく、10℃〜33℃がさらに好ましく、20℃〜30℃がよりさらに好ましく、25℃が特に好ましい。 When the present inventors detected CEA present in the exosome membrane using frozen serum, surprisingly, the measured value of CEA changes depending on the temperature at which the frozen serum is thawed. I found. Therefore, in one embodiment, the detection method of the present invention further includes a step of thawing the sample at a specific temperature when the biological sample is a frozen sample. The lower limit of the melting temperature is preferably 4 ° C or higher, more preferably 10 ° C or higher, further preferably 20 ° C or higher, and the upper limit is preferably 60 ° C or lower, more preferably 50 ° C or lower, further preferably 40 ° C or lower, 37 ° C. The following are particularly preferred: The melting temperature is preferably 4 ° C to 60 ° C, more preferably 4 ° C to 37 ° C, further preferably 10 ° C to 33 ° C, still more preferably 20 ° C to 30 ° C, and particularly preferably 25 ° C.
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、融解温度の違いにより測定値が変化するメカニズムとしては、エクソソーム膜タンパク質が糖タンパク質である場合、凍結融解による糖鎖の水和量の変化が抗体の反応性に変化を与えていることが推定される。したがって、凍結された血清を用いる場合には、検出するエクソソーム膜タンパク質は、糖タンパク質であることが好ましい。 Although not wishing to be bound by any theory, the mechanism by which the measured value changes due to the difference in melting temperature is that when the exosome membrane protein is a glycoprotein, the glycan hydration change due to freezing and thawing Is presumed to change the reactivity of the antibody. Therefore, when using frozen serum, the exosome membrane protein to be detected is preferably a glycoprotein.
本発明の検出方法により、癌の遠隔転移を検出することができる。かかる癌としては、例えば、検出の対象である生体試料中のエクソソーム膜タンパク質がCEAファミリーメンバーである場合には、大腸癌、小腸癌、胆道癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、甲状腺髄様癌、子宮癌、及び卵巣癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、胃癌、及び食道癌であり、より好ましくは大腸癌である。また、検出の対象である生体試料中のエクソソーム膜タンパク質がCD24、EpCAMである場合は卵巣癌等、CD91である場合は肺癌等、CD9、CD147である場合は大腸癌等、CD63、caveolin-1である場合はメラノーマ等、glypican-1である場合は膵臓癌、乳癌等が挙げられるが、これらの組合せに限定されるものではない。 Distant metastasis of cancer can be detected by the detection method of the present invention. As such cancer, for example, when the exosome membrane protein in the biological sample to be detected is a CEA family member, colon cancer, small intestine cancer, biliary tract cancer, stomach cancer, esophageal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, breast cancer , Lung cancer, medullary thyroid cancer, uterine cancer, ovarian cancer, and the like, preferably colon cancer, stomach cancer, and esophageal cancer, more preferably colon cancer. In addition, when the exosome membrane protein in the biological sample to be detected is CD24, EpCAM, ovarian cancer, etc., CD91 is lung cancer, etc., CD9, CD147 is colon cancer, etc., CD63, caveolin-1 In the case of glypican-1, there are pancreatic cancer, breast cancer and the like, but it is not limited to these combinations.
癌の遠隔転移の診断のための検査方法
上述のように、本発明の検出方法を用いて、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を測定し、該タンパク質濃度と基準値とを比較することで、癌の有無、特に癌の遠隔転移の有無を判定することができる。該基準値としては、癌（特に、癌の遠隔転移）の有無が既知の患者集団について作成したROC曲線に基づいて設定されるカットオフポイントや、健常人に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度を挙げることができる。
Test Method for Diagnosis of Distant Metastasis of Cancer As described above, using the detection method of the present invention, the concentration of exosome membrane protein in a biological sample derived from a subject is measured, and the protein concentration and the reference value are calculated. By comparison, the presence or absence of cancer, particularly the presence or absence of distant metastasis of cancer can be determined. The reference value includes a cut-off point set based on an ROC curve prepared for a patient population with known cancer (particularly, distant metastasis of cancer), and an exosome membrane protein in a biological sample derived from a healthy person Can be mentioned.
例えば、本発明の検査方法において、被験者に由来する生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の濃度と基準値とを比較し、被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる。被験者におけるタンパク質の濃度と基準値とを比較して、被験者におけるタンパク質の濃度が高い場合、被験者において癌が遠隔転移している可能性があると判定することができる。また、本発明の検出方法により、エクソソーム膜タンパク質の検出データや該タンパク質の濃度の測定データを収集することや、それらのデータから、癌が存在している、あるいは癌が遠隔転移している確率や可能性などを分析、評価することができる。 For example, in the test method of the present invention, the concentration of exosome membrane protein in a biological sample derived from a subject is compared with a reference value, and that the protein concentration in the subject is higher than the reference value is an indicator of distant metastasis of cancer Become. By comparing the protein concentration in the subject with the reference value, if the protein concentration in the subject is high, it can be determined that there is a possibility that the subject has distantly metastasized cancer. In addition, the detection method of the present invention collects exosome membrane protein detection data and measurement data of the protein concentration, and from these data, the probability that cancer exists or cancer has distantly metastasized. Analyzes and evaluates possibilities.
「カットオフポイント（カットオフ値）」とは、その値を基準として疾患を判定した場合に、高い感度および高い特異度の両方を満足できる値である。例えば、癌を有する被験者のうち、癌の遠隔転移の存在が認められる被験者で高い陽性率を示し、かつ癌の遠隔転移の存在が認めらない被験者で高い陰性率を示す値をカットオフポイントとして設定することができる。本発明の検査方法において、カットオフポイントを用いる場合には、そのカットオフポイントをあらかじめ設定しておくことが望ましい。 The “cut-off point (cut-off value)” is a value that can satisfy both high sensitivity and high specificity when a disease is determined based on the value. For example, among subjects with cancer, a value that shows a high positive rate in subjects with the presence of distant metastasis of cancer and a high negative rate in subjects without the presence of distant metastasis of cancer is used as a cut-off point Can be set. In the inspection method of the present invention, when using a cut-off point, it is desirable to set the cut-off point in advance.
カットオフポイントの算出方法は、この分野において周知である。例えば、転移の有無が既知の癌患者群における生体試料中のエクソソーム膜タンパク質の測定値に基づいて解析ソフトを用いてROC曲線を作成し、感度と特異度が可能な限り100%に近いときの値（即ち、座標(0,1)に最も近い距離にあるROC曲線上の点に対応するカットオフ値）を求め、その値を被験者における癌の遠隔転移の判定のためのカットオフポイントとすることができる。例えば、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを用いて被験者が大腸癌の遠隔転移を有するか否かを調べる場合、凍結された血清を25℃で融解し、1%(w/v) BSAを用いて血清中のエクソソームのペレットを分散させた（分散させた液体中のエクソソームの濃度は血清中のエクソソームの濃度の5倍）条件下で得られる好適なカットオフポイントは2.29ng/mLであるが、この数値は、母集団の数や他の条件により変動し得るものであり、この数値に限定されるものではない。 The method for calculating the cut-off point is well known in this field. For example, when ROC curves are created using analysis software based on measured values of exosomal membrane proteins in biological samples in a group of cancer patients with known presence or absence of metastasis, when sensitivity and specificity are as close to 100% as possible Find the value (ie, the cut-off value corresponding to the point on the ROC curve that is closest to the coordinates (0,1)) and use that value as the cut-off point for determining the cancer metastasis in the subject be able to. For example, when examining whether a subject has distant metastasis from colorectal cancer using CEA present in the exosome membrane in the serum, thaw the frozen serum at 25 ° C. and 1% (w / v) BSA Is used to disperse the exosome pellet in the serum (the concentration of exosome in the dispersed liquid is 5 times the concentration of exosome in the serum), and a suitable cutoff point is 2.29 ng / mL However, this value can vary depending on the number of populations and other conditions, and is not limited to this value.
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
対象
以下の実施例では、2014年11月〜2016年5月に和歌山県立医科大学第2外科にて手術を施行した大腸癌患者を対象とした。本研究は、和歌山県立医科大学倫理委員会の承認を受けて行った。
Subjects In the following examples, patients with colorectal cancer who underwent surgery at Wakayama Medical University Second Surgery from November 2014 to May 2016 were targeted. This study was conducted with the approval of the Ethics Committee of Wakayama Medical University.
実施例1. 血清中のエクソソームのCEAの測定値変化
同一の患者から得られたエクソソームのペレットを異なる溶媒を用いて分散させ、エクソソームの膜に存在するCEAの測定値の変化を調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち8例を対象とした。
Example 1. Change in CEA measurement value of exosome in serum The exosome pellet obtained from the same patient was dispersed using different solvents, and the change in the measurement value of CEA present in the exosome membrane was examined. This study included 8 patients with colorectal cancer who underwent surgery.
1. エクソソームの調製
大腸癌患者の手術中に7mlの全血を採取した。採取した全血を血清分離試験管に入れて遠心し（1000g、10分、4℃）、血清を分離した。分離した血清をエッペンドルフチューブに250μlずつ分注し、測定に用いるまでの間、-20℃で凍結保存した。
1. Preparation of exosomes 7ml whole blood was collected during surgery for colorectal cancer patients. The collected whole blood was placed in a serum separation test tube and centrifuged (1000 g, 10 minutes, 4 ° C.) to separate the serum. The separated serum was dispensed in 250 μl aliquots into Eppendorf tubes and stored frozen at −20 ° C. until used for measurement.
凍結された血清を25℃で30分間融解した。ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて、血清からエクソソームを得た。具体的には、63μlのExoQuickTM Exosome Precipitation Solutionを融解した250μlの血清に添加し、室温で30分間インキュベートした後に遠心し（1500g、30分、4℃）、上清を吸引除去してエクソソームのペレットを得た。 Frozen serum was thawed at 25 ° C. for 30 minutes. Exosomes were obtained from serum using ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto, CA, USA). Specifically, 63 μl of ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution was added to 250 μl of thawed serum, incubated at room temperature for 30 minutes, then centrifuged (1500 g, 30 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was aspirated to remove exosomes. Pellets were obtained.
2. エクソソームのCEAの測定
250μlの血清から得られたエクソソームのペレットにMilliQ水（250μl又は50μl）、又は1%(w/v) BSA（250μl又は50μl）を添加して、ペレットを分散させた。1例の患者につき、これら4通りの溶液を調製し、エクソソームのCEAを測定した。測定は、CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan)を用いて行った。
2. Measurement of exosome CEA
MilliQ water (250 μl or 50 μl) or 1% (w / v) BSA (250 μl or 50 μl) was added to the exosome pellet obtained from 250 μl of serum to disperse the pellet. For each patient, these four solutions were prepared and exosomal CEA was measured. The measurement was performed using CEA (human) ELISA kit (abnova, Taipei city, Taiwan).
3. 結果
結果を図１に示す。250μlのMilliQ水を用いた場合(1x, H2O)、及び50μlのMilliQ水を用いた場合(5x, H2O)のいずれも、8例ともエクソソームのCEAを測定できなかった。250μlの1%(w/v) BSAを用いた場合(1x, 1%(w/v) BSA)、1例のみエクソソームのCEAを測定できた。50μlの1%(w/v) BSAを用いた場合(5x, 1%(w/v) BSA)、5例においてエクソソームのCEAを測定できた。
3. Results The results are shown in FIG. The exosome CEA could not be measured in either of the 8 cases when 250 μl of MilliQ water was used (1 ×, H 2 O) and 50 μl of MilliQ water (5 ×, H 2 O). When 250 μl of 1% (w / v) BSA was used (1 ×, 1% (w / v) BSA), only one case was able to measure CEA of exosomes. When 50 μl of 1% (w / v) BSA was used (5 ×, 1% (w / v) BSA), exosomal CEA could be measured in 5 cases.
実施例2. 凍結血清の融解温度による血清中エクソソームのCEAの測定値変化
凍結された血清を異なる温度で融解し、血清中のエクソソームの量及びエクソソームの膜に存在するCEAの測定値の変化を調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち8例を対象とした。
Example 2. Change in measured value of CEA of exosome in serum by melting temperature of frozen serum Thaw frozen serum at different temperatures, and change the amount of exosome in serum and the measured value of CEA present in exosome membrane. Examined. This study included 8 patients with colorectal cancer who underwent surgery.
1. エクソソームの定量及びエクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、同一の患者から採取して凍結された血清を4℃、25℃、又は37℃で30分間融解した点を除き、実施例1と同様の方法により行った。エクソソームの定量は、EXOCET Exosome Quantitation Kit (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて行った。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。
1. Exosome quantification and exosome CEA measurement Exosome preparation is the same as in Example 1 except that frozen serum collected from the same patient was thawed at 4 ° C, 25 ° C, or 37 ° C for 30 minutes. The same method was used. Exosome quantification was performed using EXOCET Exosome Quantitation Kit (System Bioscience, Palo Alto, CA, USA). Exosome CEA was measured in the same manner as in Example 1 except that 50 μl of 1% (w / v) BSA was used to disperse the exosome pellet.
2. 結果
結果を図２に示す。エクソソームの量に関しては、融解温度の違いによる一定の傾向は認められなかった(図２Ａ)。エクソソームのCEAの測定値に関しては、融解温度の違いによる一定の傾向は認められず、融解温度によって測定値が変化することが示された(図２Ｂ)。
2. Results The results are shown in FIG. With respect to the amount of exosome, a certain tendency due to the difference in melting temperature was not observed (FIG. 2A). Regarding the measured value of CEA of exosome, a certain tendency due to the difference in melting temperature was not observed, and it was shown that the measured value changed depending on the melting temperature (FIG. 2B).
実施例3.血清中のエクソソームのCEA値を用いた遠隔転移診断率の凍結血清の融解温度による変化
凍結された血清を異なる温度で融解し、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを測定してROC曲線を作成し、大腸癌患者の遠隔転移の有無を比較検討した。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち32例を対象とした。
Example 3. Change in the diagnosis rate of distant metastasis using the CEA value of exosomes in serum with the melting temperature of frozen serum Thaw frozen serum at different temperatures and measure CEA present in the exosome membrane in the serum. An ROC curve was created to compare the presence or absence of distant metastasis in colorectal cancer patients. This study included 32 patients with colorectal cancer who underwent surgery.
1. エクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、同一の患者から採取して凍結された血清を4℃、25℃、又は37℃で30分間融解した点を除き、実施例1と同様の方法により行った。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。また、比較のために、血液採取後すぐに分離した血清を用いて、血清中のCEAを測定した。血清の分離は実施例1と同様の方法により行った。血清中のCEAの測定は、癌胎児性抗原キットCEA・アボット, アーキテクト i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan)を用いて行った。
1. Measurement of exosome CEA Exosome was prepared in the same manner as in Example 1 except that frozen serum collected from the same patient was thawed at 4 ° C, 25 ° C, or 37 ° C for 30 minutes. went. Exosome CEA was measured in the same manner as in Example 1 except that 50 μl of 1% (w / v) BSA was used to disperse the exosome pellet. For comparison, CEA in serum was measured using serum separated immediately after blood collection. Serum was separated by the same method as in Example 1. Serum CEA was measured using the carcinoembryonic antigen kit CEA Abbott, Architect i2000 (Abbott Japan, Chiba, Japan).
2. 統計
エクソソームのCEA及び血清中のCEAについてROC曲線を作成した。精度はarea under the ROC curve （ROC曲線下面積）に基づいて検討した。ROC曲線から適切なカットオフポイントを選択し、感度、特異度、及び正しい分類を示した。統計処理にはSTATA software program ver. 13 (StataCorp, College Station, TX, USA)を用いた。
2. Statistics ROC curves were prepared for exosome CEA and serum CEA. The accuracy was examined based on the area under the ROC curve. Appropriate cut-off points were selected from the ROC curve and showed sensitivity, specificity, and correct classification. For statistical processing, the STATA software program ver. 13 (StataCorp, College Station, TX, USA) was used.
3. 結果
結果を図３に示す。それぞれの温度で融解した血清から得られたエクソソームのCEAのarea under the ROC curveは、4℃で融解した場合は0.7276（4 degrees Celsius ROC area）、25℃で融解した場合は0.8654（25 degrees Celsius ROC area）、37℃で融解した場合は0.8077（37 degrees Celsius ROC area）であった（図３Ａ）。血清中のCEAのarea under the ROC curveは0.7692（CEA ROC area）であった（図３Ｂ）。本結果より、25℃で融解した血清から得られたエクソソームのCEA値は、他の温度で融解した血清から得られたエクソソームのCEA値及び血清中のCEA値と比べて優れている可能性が示唆された。また、適切なカットオフポイント（Cut point）を選択し、感度（Sensitivity）、特異度（Specificity）、正しい分類（Correctly Classified）を比較した表を以下に示す（表１）。25℃で融解した血清から得られたエクソソームのCEAのカットオフポイントを2.29ng/mLとした場合、感度は83.33％、特異度は96.15％、正しい分類は93.75％であった。本結果より、エクソソームのCEA値を用いた大腸癌の遠隔転移診断は、診断精度が高い可能性が示唆された。
3. Results The results are shown in FIG. The exosomal CEA area under the ROC curve from serum thawed at each temperature is 0.7276 (4 degrees Celsius ROC area) when thawed at 4 ° C and 0.8654 (25 degrees Celsius when thawed at 25 ° C). ROC area) and 0.8077 (37 degrees Celsius ROC area) when melted at 37 ° C. (FIG. 3A). The area under the ROC curve of CEA in serum was 0.7692 (CEA ROC area) (FIG. 3B). Based on this result, the CEA value of exosomes obtained from serum thawed at 25 ° C may be superior to the CEA value of exosomes obtained from serum thawed at other temperatures and the CEA value in serum. It was suggested. Moreover, the table which selected the appropriate cutoff point (Cut point), and compared sensitivity (Sensitivity), specificity (Specificity), and correct classification (Correctly Classified) is shown below (Table 1). When the cut-off point of CEA of exosome obtained from serum thawed at 25 ° C was 2.29 ng / mL, the sensitivity was 83.33%, the specificity was 96.15%, and the correct classification was 93.75%. This result suggests that the diagnosis of distant metastasis of colorectal cancer using the exosome CEA value may have high diagnostic accuracy.
実施例4. 血清中のエクソソームのCEAと血清中のCEAを用いた遠隔転移診断率の比較―Validation study―
凍結された血清を25℃で融解し、血清中のエクソソームの膜に存在するCEAを測定してROC曲線を作成し、大腸癌患者の遠隔転移の有無を比較検討した。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち100例を対象とした。
Example 4. Comparison of Remote Metastasis Diagnosis Rates Using Serum Exosome CEA and Serum CEA -Validation study-
Frozen serum was thawed at 25 ° C., and CEA present in the exosome membrane in the serum was measured to create an ROC curve to compare the presence or absence of distant metastasis in colorectal cancer patients. This study included 100 patients with colorectal cancer who underwent surgery.
1. エクソソームのCEAの測定
エクソソームの調製は、実施例1と同様の方法により行った。すなわち、凍結された250μlの血清を25℃で30分間融解し、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて血清からエクソソームのペレットを得た。エクソソームのCEAの測定は、50μlの1%(w/v) BSAを用いてエクソソームのペレットを分散させた点を除き、実施例1と同様の方法により行った。また、比較のために、実施例3と同様の方法により血清中のCEAを測定した。
1. Measurement of CEA of Exosome Exosome was prepared in the same manner as in Example 1. That is, 250 μl of frozen serum was thawed at 25 ° C. for 30 minutes, and an exosome pellet was obtained from the serum using ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto, Calif., USA). Exosome CEA was measured in the same manner as in Example 1 except that 50 μl of 1% (w / v) BSA was used to disperse the exosome pellet. For comparison, serum CEA was measured by the same method as in Example 3.
2. 結果
エクソソームのCEA及び血清中のCEAについて、実施例3と同様の方法によりROC曲線を作成した。結果を図４に示す。エクソソームのCEAのarea under the ROC curve（eCEA ROC area）は0.8793であった。また、適切なカットオフポイントを選択し、感度、特異度、正しい分類を比較した表を以下に示す（表２）。エクソソームのCEAのカットオフポイントを2.29ng/mLとした場合、感度は76.92％、特異度は95.40％、正しい分類は93.00％であった。本結果より、血清中のCEA値と比べて、エクソソームのCEA値を用いた大腸癌の遠隔転移診断は、診断精度が高い可能性が示唆された。
2. Results ROC curves were prepared in the same manner as in Example 3 for CEA in exosomes and CEA in serum. The results are shown in FIG. The area under the ROC curve (eCEA ROC area) of CEA of exosome was 0.8793. In addition, a table comparing the sensitivity, specificity, and correct classification by selecting appropriate cut-off points is shown below (Table 2). When the exosome CEA cutoff point was 2.29 ng / mL, the sensitivity was 76.92%, the specificity was 95.40%, and the correct classification was 93.00%. From these results, it was suggested that the diagnosis of distant metastasis of colorectal cancer using the CEA value of exosomes may have higher diagnostic accuracy than the CEA value in serum.
実施例5. エクソソームのCEACAMs（CEACAM 1及びCEACAM 6）を用いた遠隔転移診断の可能性
CEAファミリーメンバーであるCEACAM 1及びCEACAM 6についても、大腸癌の遠隔転移診断に用いることが可能であるかを調べた。本試験は、手術を施行した大腸癌患者のうち16例を対象とした。
Example 5. Possibility of remote metastasis diagnosis using exosomal CEACAMs (CEACAM 1 and CEACAM 6)
It was investigated whether CEACAM 1 and CEACAM 6 which are CEA family members can also be used for diagnosis of distant metastasis of colorectal cancer. This study included 16 patients with colorectal cancer who underwent surgery.
1. エクソソームのCEACAM 1及びCEACAM 6の遠隔転移診断の可能性
エクソソームの調製は、実施例1と同様の方法により行った。すなわち、凍結された250μlの血清を25℃で30分間融解し、ExoQuickTMExosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto,CA, USA)を用いて血清からエクソソームのペレットを得た。エクソソームのCEACAM 1の測定は、エクソソームのペレットに100μlの1%(w/v) BSAを添加してペレットを分散させ、Human CEACAM-1 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて行った。エクソソームのCEACAM 6の測定は、Human CEACAM-6 DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いた点を除き、エクソソームのCEACAM 1の測定と同様の方法により行った。また、比較のために、血清中のCEACAM 1及びCEACAM 6を測定した。測定には-20℃で凍結保存していた血清を用いた。血清中のCEACAM 1及びCEACAM 6の測定は、Human CEACAM-1 DuoSet及びHuman CEACAM-6 DuoSetを用いて行った。
1. Possibility of diagnosis of distant metastasis of exosomes of CEACAM 1 and CEACAM 6 Preparation of exosomes was performed in the same manner as in Example 1. That is, 250 μl of frozen serum was thawed at 25 ° C. for 30 minutes, and an exosome pellet was obtained from the serum using ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution (System Bioscience, Palo Alto, Calif., USA). Measurement of exosome CEACAM 1 was performed using Human CEACAM-1 DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) After adding 100 μl of 1% (w / v) BSA to the exosome pellet and dispersing the pellet. Exosome CEACAM 6 was measured in the same manner as exosome CEACAM 1 except that Human CEACAM-6 DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) Was used. For comparison, CEACAM 1 and CEACAM 6 in serum were measured. Serum that had been stored frozen at −20 ° C. was used for the measurement. Serum CEACAM 1 and CEACAM 6 were measured using Human CEACAM-1 DuoSet and Human CEACAM-6 DuoSet.
2. 結果
結果を表３に示す。エクソソームのCEACAM 1（eCEACAM1）及びエクソソームのCEACAM 6（eCEACAM6）の測定値は、遠隔転移を有するステージであるステージ4で高値となった。本結果より、エクソソームのCEACAM 1及びCEACAM 6の測定値は、癌診断、特に遠隔転移診断に有用である可能性が示唆された。
2. Results Table 3 shows the results. The measured values of exosome CEACAM 1 (eCEACAM1) and exosome CEACAM 6 (eCEACAM6) were high in stage 4, a stage with distant metastasis. From these results, it was suggested that the measured values of CEACAM 1 and CEACAM 6 of exosome may be useful for cancer diagnosis, particularly for remote metastasis diagnosis.
本発明の検出方法によれば、エクソソーム膜タンパク質について、精度の高い検出が可能である。また、生体試料が凍結された試料である場合もエクソソーム膜タンパク質について、精度の高い検出が可能である。さらに、上記検出方法を用いて、癌の遠隔転移の検出が可能である。 According to the detection method of the present invention, it is possible to detect exosome membrane protein with high accuracy. Further, even when the biological sample is a frozen sample, it is possible to detect exosome membrane protein with high accuracy. Furthermore, it is possible to detect distant metastasis of cancer using the above detection method.
Claims (19)
ウシ血清アルブミン溶液中に分散させた、該生体試料から単離したエクソソームと、該タンパク質に対する抗体とを接触させ、該タンパク質と該抗体との複合体を検出する工程を含む、方法。 A method for detecting a protein present in an exosome membrane in a biological sample, comprising:
A method comprising: contacting an exosome isolated from the biological sample dispersed in a bovine serum albumin solution with an antibody against the protein, and detecting a complex of the protein and the antibody.
（１）請求項１に記載の方法により、被験者に由来する生体試料中のエクソソームの膜に存在するタンパク質を検出し、該タンパク質の濃度を測定すること、
（２）（１）により得られたタンパク質の濃度と基準値とを比較することを含み、
被験者におけるタンパク質の濃度が基準値よりも高いことが癌の遠隔転移の指標となる、方法。 A test method for diagnosis of distant metastasis of cancer,
(1) Detecting a protein present in an exosome membrane in a biological sample derived from a subject by the method according to claim 1 and measuring the concentration of the protein,
(2) comprising comparing the protein concentration obtained in (1) with a reference value;
A method wherein a protein concentration in a subject is higher than a reference value is an indicator of distant metastasis of cancer.
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| JP6386995B2 (en) * | 2013-04-08 | 2018-09-05 | テオリアサイエンス株式会社 | Colorectal cancer detection method |
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| CN107430121B (en) * | 2015-03-13 | 2020-06-23 | 希森美康株式会社 | Method for detecting test substance and kit used in the method |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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