JP2018080943A - Method of detecting nash - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、患者試料中のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定値を利用したＮＡＳＨの検出／診断方法に関する。 The present invention relates to a NASH detection / diagnosis method using measured values of CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp in a patient sample.
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）はアルコールを発生原因としない脂肪肝の総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌へと進行する可能性がある非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（以下、「ＮＡＳＨ」と記載する）と、進行せず良性の経過をたどる非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ）（以下、「ＮＡＦＬ」と記載する）とに区別される。日本国内においては、約１００万〜２００万人がＮＡＳＨに罹患していると考えられている。 Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a general term for fatty liver that does not cause alcohol to develop. NAFLD includes nonalcoholic steatohepatitis (hereinafter referred to as “NASH”) that may progress to cirrhosis and liver cancer, and nonalcoholic fatty liver (nonalcoholic) that does not progress and has a benign course. a “fatigue liver” (hereinafter referred to as “NAFL”). In Japan, about 1 to 2 million people are thought to suffer from NASH.
現在、ＮＡＳＨの確定診断は、肝生検により行われることが一般的である。しかしながら、肝生検は部位による肝組織像の差異（サンプリングエラー）が生じ得、例えば、５１例のＮＡＦＬＤ患者の２つの肝生検サンプルについて、各々のグレーディング（ｇｒａｄｉｎｇ）及びステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）を行ったところ、肝脂肪化について４１例（７８％）、線維化について２１例（４１％）の一致率が示され、２つのサンプル間で差が生じたことが報告されている（非特許文献１）。また、左葉と右葉からの肝生検サンプルにおいて、線維化のステージで１段階以上の違いが約３０％認められたとの報告もある。さらに、肝生検は肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取する工程を含むものであることから、患者、臨床現場、及び医療経済に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを生ずるものとなっている。このように様々な問題を生じ得ることから、肝生検に代わる新たなＮＡＳＨ診断法の開発が切望されている。 Currently, a definitive diagnosis of NASH is generally performed by liver biopsy. However, liver biopsy can cause differences in liver histology (sampling error) depending on the site. For example, grading and staging of two liver biopsy samples from 51 NAFLD patients are performed. As a result, the agreement rate of 41 cases (78%) for hepatic steatosis and 21 cases (41%) for fibrosis was shown, and it was reported that there was a difference between the two samples (Non-Patent Document 1). ). There is also a report that about 30% difference in one or more stages in fibrosis stage was observed in liver biopsy samples from left lobe and right lobe. Furthermore, since a liver biopsy includes a process of collecting a part of tissue or cells by inserting a needle into the liver, it imposes an excessive burden on patients, clinical sites, and the medical economy, as well as complications, etc. It is a risk. Since various problems can occur as described above, development of a new NASH diagnostic method to replace the liver biopsy is eagerly desired.
近年、患者血清におけるバイオマーカーの発現量を指標にして、ＮＡＳＨを検出・判定する方法が開発されている。このようなバイオマーカーには、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、血小板、血糖、空腹時インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、レプチン、アディポネクチン、レチノール結合タンパク質４、脂質過酸化物、酸化ＬＤＬ、チオレドキシン、ＴＮＦ−α、高感度ＣＲＰ，フェリチン、ペントラキシン３、ＩＬ−６、オステオプロテグリン、ＣＣ−ケモカインリガンド−２、ＩＣＡＭ−１、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）の断片、ヒアルロン酸、４型コラーゲン７Ｓ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ１、ＤＨＥＡ−Ｓ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、エンドセリン−１、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）等が含まれる。例えば、ＣＫ−１８の断片は、健常者やＮＡＦＬＤ患者と比べてＮＡＳＨ患者において高値を示すことが報告されている（非特許文献２−４）。また、Ｆｕｃ−ＨｐｔとＭａｃ−２ｂｐの２つのバイオマーカーを組み合わせて利用することによってＮＡＳＨを良好に検出・判定できることが報告されている（非特許文献５）。
In recent years, methods for detecting and determining NASH have been developed using the expression level of a biomarker in patient serum as an index. Such biomarkers include AST, ALT, AST / ALT ratio, platelets, blood glucose, fasting insulin, HOMA-IR, leptin, adiponectin, retinol binding protein 4, lipid peroxide, oxidized LDL, thioredoxin, TNF- α, high sensitivity CRP, ferritin,
しかしながら、バイオマーカーを利用したＮＡＳＨの検出・判定方法は、いずれも研究段階であり、実用化に至ってはおらず、一般臨床レベルで利用可能な高い精度を有する手法の確立が切望されている。 However, NASH detection / determination methods using biomarkers are all in the research stage, have not yet been put into practical use, and there is an urgent need to establish a method with high accuracy that can be used at the general clinical level.
一般的に、病気の検出・判定方法の「精度」は、「感度」及び「特異度」によって評価することができる。「感度」及び「特異度」は、病気の検出・判定の結果と病気の有無に基づいて表すことができ、「感度」は、（真陽性）／（真陽性＋偽陰性）の割合で、「特異度」は、（真陰性）／（真陰性＋偽陽性）の割合で示される。感度を高めることにより、病気の検出能を高めることができ、病気の見落としが生じる可能性を低下させることができる。一方、特異度を高めることによって、病気でないものを病気と誤判定する可能性を低下させることができる。「感度」及び「特異度」はトレードオフの関係にあり、いずれを重要視するかは、病気の種類や検出・判定方法の目的に応じて異なる。 In general, the “accuracy” of a disease detection / determination method can be evaluated by “sensitivity” and “specificity”. “Sensitivity” and “specificity” can be expressed based on the result of disease detection / determination and the presence or absence of disease, and “sensitivity” is a ratio of (true positive) / (true positive + false negative), “Specificity” is expressed as a ratio of (true negative) / (true negative + false positive). By increasing the sensitivity, the ability to detect a disease can be increased, and the possibility of oversight of the disease can be reduced. On the other hand, by increasing the specificity, it is possible to reduce the possibility of misjudging non-disease as a disease. “Sensitivity” and “specificity” are in a trade-off relationship, and which one is important depends on the type of disease and the purpose of the detection / determination method.
ＮＡＳＨの検出・判定方法においては、ＮＡＦＬＤ患者の中からＮＡＳＨ患者を見落とすことなく拾い上げることができる高い感度と、ＮＡＳＨ患者とＮＡＦＬ患者とを区別して検出・判定することができる高い特異度が要求される。 The NASH detection / judgment method requires high sensitivity that allows NASH patients to be picked up without overlooking NAFLD patients, and high specificity that can distinguish and detect NASH patients from NAFL patients. The
本発明は、一般臨床レベルで利用可能な高い感度と高い特異度を有すると共に、簡便・容易に実施することを可能とする、新たなＮＡＳＨの検出・判定方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new NASH detection / determination method that has high sensitivity and high specificity that can be used at a general clinical level, and that can be easily and easily implemented.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定し、得られた測定値を利用して、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを高い精度で判定／診断し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that cytokeratin 18 (CK-18) and / or a fragment thereof, fucosylated haptoglobin (Fuc-Hpt), and Mac- in a sample collected from a patient. The amount of 2-binding protein (Mac-2bp) is measured, and the obtained measurement value is used to determine / diagnose whether or not the patient suffers from NASH with high accuracy and detect the presence or absence of NASH in the patient The present inventors have found that the present invention can be accomplished and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ 非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法であって、
患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定すること、
得られた測定値と参照値とを用いて、患者がＮＡＳＨであるか否かを判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することを含む、方法。
［２］ ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定値が、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法により得られる、［１］の方法。
［３］ ＣＫ−１８及び／又はその断片の量を、Ｍ５抗体及びＭ６抗体ならびに／あるいはＭ３０抗体及びＭ５抗体もしくはＭ６抗体を用いて測定することを含む、［２］の方法。
［４］ さらに、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の活性を測定し測定値を得ることを含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ ＮＡＳＨの診断方法において使用するためのキットであって、患者より採取された試料におけるＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐのそれぞれに対する抗体を含む、キット。
［６］ ＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐをそれぞれ標識するための抗体及び／又は化合物をさらに含む、［５］のキット。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A method for detecting non-alcoholic steatohepatitis (NASH), comprising:
Measuring the amount of cytokeratin 18 (CK-18) and / or fragments thereof, fucosylated haptoglobin (Fuc-Hpt), and Mac-2 binding protein (Mac-2bp) in a sample taken from a patient;
Using the obtained measured value and the reference value to determine whether or not the patient is NASH and detecting the presence or absence of NASH in the patient.
[2] The method according to [1], wherein measured values of CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp are obtained by an enzyme-linked immunosorbent (ELISA) method.
[3] The method according to [2], comprising measuring the amount of CK-18 and / or a fragment thereof using M5 antibody and M6 antibody and / or M30 antibody and M5 antibody or M6 antibody.
[4] The method according to any one of [1] to [3], further comprising measuring the activity of AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase) to obtain a measurement value.
[5] A kit for use in a NASH diagnostic method, comprising an antibody against each of CK-18 or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp in a sample collected from a patient.
[6] The kit according to [5], further comprising an antibody and / or a compound for labeling CK-18 or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp, respectively.
本発明によれば、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを高い精度で、簡便かつ容易に診断／判定することができ、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することができる。 According to the present invention, whether or not a patient suffers from NASH can be easily and easily diagnosed / determined with high accuracy, and the presence or absence of NASH in the patient can be detected.
また、本発明によれば、肝生検を用いることなく、低侵襲性な手法により、ＮＡＦＬＤ患者より、ＮＡＳＨ患者を高い精度で選別することができる。 Further, according to the present invention, NASH patients can be selected with higher accuracy than NAFLD patients by a minimally invasive technique without using a liver biopsy.
１．ＮＡＳＨの診断／検出方法
本発明は、患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）等のタンパク質マーカーの量を測定し、当該測定値を利用して、該患者がＮＡＳＨに罹患しているか否か診断／判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出する方法に関する。
1. Diagnosis / detection method of NASH The present invention relates to cytokeratin 18 (CK-18) and / or a fragment thereof, fucosylated haptoglobin (Fuc-Hpt), and Mac-2 binding protein (Mac-) in a sample collected from a patient. The present invention relates to a method for measuring the amount of a protein marker such as 2 bp) and diagnosing / determining whether or not the patient suffers from NASH using the measured value, and detecting the presence or absence of NASH in the patient.
（タンパク質マーカーの定量）
本発明において「患者」とは、明らかな飲酒歴のない（エタノール換算で１日２０ｇ未満の飲酒量）脂肪肝患者（いわゆるＮＡＦＬＤ患者）が挙げられる。ＮＡＦＬＤ患者には、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者が含まれ得るが、本発明によればＮＡＳＨ患者を、ＮＡＦＬＤ患者の集団より高い精度で選別することができる。
(Quantification of protein markers)
In the present invention, “patient” includes fatty liver patients (so-called NAFLD patients) who have no apparent alcohol consumption (the amount of alcohol consumed is less than 20 g per day in terms of ethanol). Although NAFLD patients can include NASH patients and NAFL patients, according to the present invention, NASH patients can be screened with higher accuracy than a population of NAFLD patients.
本発明において「患者より採取された試料」としては、患者由来の体液を挙げることができ、患者より比較的低侵襲的に採取可能な試料を用いることができる。体液としては例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、患者より採取された試料は、血液、血清、又は血漿であり、より好ましくは血清である。 In the present invention, examples of the “sample collected from the patient” include patient-derived body fluids, and a sample that can be collected relatively invasively from the patient can be used. Examples of the body fluid include, but are not limited to, blood, serum, plasma, lymph, spinal fluid, urine, semen, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, and the like. Preferably, the sample collected from the patient is blood, serum, or plasma, more preferably serum.
本発明において、患者より採取された試料は、そのまま利用してもよいし、あるいは採取された試料より目的のタンパク質マーカーが精製又は粗精製された形態のものを利用してもよい。 In the present invention, a sample collected from a patient may be used as it is, or a sample obtained by purifying or roughly purifying a target protein marker from a collected sample may be used.
目的のタンパク質マーカーの精製又は粗精製は、タンパク質の精製もしくは粗精製に一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過カラム、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）、フィルター法、ポリマーによる沈殿法、抗体やレクチンによる吸着法等の一又は複数を組み合わせた手法により行うことができる。 The target protein marker can be purified or roughly purified by a technique generally used for protein purification or crude purification, such as ultracentrifugation, ultrafiltration, gel filtration column, high performance liquid chromatography. (High performance liquid chromatography, HPLC), filter method, polymer precipitation method, adsorption method using antibody or lectin, etc.
本発明の「タンパク質マーカー」としては、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐが挙げられる。 Examples of the “protein marker” of the present invention include CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp.
ヒトのＣＫ−１８は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０５７８３．２；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿９５４６５７．１；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００２１５．１等）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。 Human CK-18 is known, and known databases such as GenBank (for example, UniProtKB / Swiss-Prot: P05783.2; NCBI Reference Sequence: NP_954657.1; NCBI Reference Sequence: NP_000215.1 sequence etc.) Information, gene sequence information, and the like are disclosed, and such information can be used in the present invention.
本発明において利用可能なＣＫ−１８の断片は、検出・定量可能なＣＫ−１８の断片であればよく、特に限定されるものではないが、ＣＫ−１８がカスパーゼにより切断されて生じる断片等が挙げられる。ＣＫ−１８がカスパーゼにより切断されて生じる断片は公知であり、ＣＫ−１８のＡｓｐ・Ａｌａ・Ｌｅｕ・Ａｓｐ−Ｓｅｒ部位をカスパーゼが認識・切断し生じた断片のうち、Ｃ末端にＡｓｐ・Ａｌａ・Ｌｅｕ・Ａｓｐのアミノ酸配列を有する断片を利用することができる（Ｔｈｏｍａｓ Ｌｕｆｔら、ＢＬＯＯＤ，ＶＯＬ．１１０，Ｎｏ．１３，ｐｐ．４５３５−４５４２，２００７）。本明細書において、ＣＫ−１８の断片を「ＣＫ−１８Ｆ」と記載する場合がある。 The CK-18 fragment that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a CK-18 fragment that can be detected and quantified. Examples of the fragment include CK-18 cleaved by caspase. Can be mentioned. Fragments generated by cleaving CK-18 by caspases are known. Among the fragments generated by caspase recognition and cleavage of Asp / Ala / Leu / Asp-Ser sites of CK-18, Asp / Ala / A fragment having the amino acid sequence of Leu · Asp can be used (Thomas Luft et al., BLOOD, VOL. 110, No. 13, pp. 4535-4542, 2007). In the present specification, a fragment of CK-18 may be referred to as “CK-18F”.
「Ｆｕｃ−Ｈｐｔ」は、ヒトのハプトグロビンにおけるＮ末端（メチオニン末端）より１８４番目、２０７番目、２１１番目、及び２４１番目より選択される一以上の位置におけるアスパラギンに結合した糖鎖にフコースが結合して修飾（フコシル化）されてなるハプトグロビンである（特開２００９−１６８４７０号公報）。ヒトのハプトグロビンは公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８０８０．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨ００３３４４．２等）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。 In “Fuc-Hpt”, fucose is bound to a sugar chain bound to asparagine at one or more positions selected from the 184th, 207th, 211th, and 241st positions from the N-terminus (methionine terminus) in human haptoglobin. The haptoglobin is modified (fucosylated) (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-168470). Human haptoglobin is known, and its amino acid sequence information and gene sequence information are disclosed in known databases such as GenBank (for example, GenBank: AAA8808080.1; GenBank: AH003344.2, etc.). Such information can be used.
「Ｍａｃ−２ｂｐ」は公知であり、ヒトのＭａｃ−２ｂｐはＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３６１９３．１；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１３２１０．１）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。本発明において、Ｍａｃ−２ｂｐはレクチンと結合していても、していなくてもよいが、好ましくは、Ｍａｃ−２ｂｐに関し、下記「捕捉手段」及び「標識手段」としてレクチンは利用しない。 “Mac-2bp” is publicly known, and human Mac-2bp is disclosed in its public database such as GenBank (for example, GenBank: AAA36193.1; GenBank: L13210.1), and its amino acid sequence information and gene sequence information are disclosed. In the present invention, these pieces of information can be used. In the present invention, Mac-2bp may or may not bind to a lectin, but preferably, Mac-2bp does not utilize a lectin as the following “capturing means” and “labeling means”.
本発明の「タンパク質マーカー」には、上記ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐに加えて、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＶＣＡＭ−１、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ、ヒアルロン酸等から選択される一又は複数を含めることができる。これらはＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースにそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。例えば、ＡＳＴはＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ３７４００．１やＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５５６３．１にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、また、ＡＬＴはＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００５３００．１やＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１０３５５．１にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐに加えて、さらにこれらのタンパク質マーカーを利用することによってＮＡＳＨの診断／検出の精度をより高めることができる。 The “protein marker” of the present invention includes AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), VCAM-1 in addition to the above CK-18 and / or fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp. , Type IV collagen · 7S, hyaluronic acid or the like can be included. The amino acid sequence information and gene sequence information of these are disclosed in a known database such as GenBank, and these information can be used in the present invention. For example, AST has its amino acid sequence information and gene sequence information disclosed in GenBank: M37400.1 and GenBank: AAA355563.1, and ALT has its information in NCBI Reference Sequence: NP_005300.1 and GenBank: D10355.1. Amino acid sequence information, gene sequence information, and the like are disclosed, and such information can be used in the present invention. In addition to CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp, the accuracy of diagnosis / detection of NASH can be further enhanced by utilizing these protein markers.
試料中の各タンパク質マーカーの定量は、タンパク質の定量解析において一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法（サンドイッチ法、競合法）、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、ナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標））等を利用することができるが、これらに限定はされない。好ましくはＥＬＩＳＡ法である。 Quantification of each protein marker in a sample can be performed by a technique generally used in quantitative analysis of proteins. For example, enzyme-linked immunosorbent (ELISA) method (sandwich method, competitive method), flow cytometry method, Western blotting, nanotracking (Nanosite (registered trademark)), and the like can be used, but are not limited thereto. The ELISA method is preferred.
例えば、本発明の一例においては、固相担体に結合された各タンパク質マーカーに対する抗体（捕捉手段）と、試料とを接触させ、さらに、各タンパク質マーカーに結合可能な標識手段を接触させ、これにより捕捉抗体−タンパク質マーカー−標識手段からなるサンドイッチ複合体を形成する。次いで、当該複合体における標識手段を検出・定量することによって、試料中の各タンパク質マーカーを検出・定量することができる。 For example, in one example of the present invention, an antibody (capture means) to each protein marker bound to a solid phase carrier is brought into contact with a sample, and a labeling means capable of binding to each protein marker is further brought into contact, thereby A sandwich complex consisting of a capture antibody-protein marker-labeling means is formed. Subsequently, each protein marker in the sample can be detected and quantified by detecting and quantifying the labeling means in the complex.
「捕捉手段」として利用可能な抗体は、標的となるタンパク質マーカーと結合可能なものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、標的となるタンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。 The antibody that can be used as the “capturing means” may be any antibody that can bind to the target protein marker, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a target. It is a monoclonal antibody that enables specific detection of protein markers.
抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。また、抗体には、標的となるタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。本発明において利用可能な「抗体断片」には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｃｂ、Ｆｄ等が含まれるが、これらに限定はされない。 The type of antibody is not particularly limited, and any type of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD can be used. The antibody also includes an antibody fragment capable of binding to a target protein marker. “Antibody fragments” that can be used in the present invention include, but are not limited to, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, Facb, Fd, and the like.
捕捉手段を固相化するための固相担体には、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等（これらに限定はされない）の材質、ならびにこれらの組み合わせからなるものを利用することができる。固相担体の形状は特に限定されることなく、プレート、ディッシュ、ビーズ、球、スティック等の形状とすることができる。固相担体への捕捉手段となる抗体の結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。一つの固相担体に対して、標的となるタンパク質マーカーが異なる複数種の捕捉手段が固相化されていてもよいし、あるいは、異なる捕捉手段はそれぞれ別々の固相担体に固相化されていてもよい。 Solid support for solidifying the capture means includes latex, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics Alternatively, a material made of a magnetic material or the like (but not limited thereto) and a combination thereof can be used. The shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and may be a plate, dish, bead, sphere, stick or the like. The antibody serving as a capture means to the solid phase carrier can be bound by a method well known to those skilled in the art, for example, physical adsorption method, covalent bond method, ion bond method and the like. Plural types of capture means with different target protein markers may be immobilized on one solid phase carrier, or different capture means may be immobilized on separate solid phase carriers. May be.
「標識手段」としては、標的となるタンパク質マーカーと結合可能な抗体や化合物を利用することができる。 As the “labeling means”, an antibody or a compound capable of binding to a target protein marker can be used.
標識手段となる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、標的となるタンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体には、標的となるタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。本発明において利用可能な「抗体断片」には、上述したものが挙げられる。 The antibody that serves as the labeling means may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody that enables specific detection of a target protein marker. The antibody also includes an antibody fragment capable of binding to a target protein marker. Examples of “antibody fragments” that can be used in the present invention include those described above.
標識手段として利用される抗体と、捕捉手段として利用される抗体とは、互いの結合が干渉しないように両者の結合部位（エピトープ）は異なるものであることが好ましい。また、標識手段として利用される抗体と、捕捉手段として利用される抗体とは、両者を区別して検出できるように、異なる動物種から産生されたものを利用することができる。 It is preferable that the antibody used as the labeling means and the antibody used as the capturing means have different binding sites (epitope) so that the binding does not interfere with each other. The antibody used as the labeling means and the antibody used as the capturing means can be those produced from different animal species so that they can be detected separately.
本発明において捕捉手段、及び標識手段として利用可能な抗体は、抗体製造において一般的に用いられる手法（Ｋｅｎｎｅｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）によって製造されたものを用いても良いし、あるいは市販のものを用いても良い。 Antibodies that can be used as capture means and labeling means in the present invention are generally used in antibody production (Kennet et al., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, Plenum Press, New York, 19 80). A manufactured product may be used, or a commercially available product may be used.
例えば、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段又は標識手段として利用可能な抗体としては、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）を認識・結合できる抗体を利用することができ、またＣＫ−１８の断片の捕捉手段又は標識手段として利用可能な抗体としては、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体を利用することができる。 For example, as an antibody that can be used as a capture means or labeling means for CK-18 and / or a fragment thereof, an antibody that can recognize and bind to the intermediate part of CK-18 (amino acid position from positions 284 to 396) should be used. As an antibody that can be used as a capture means or a labeling means for a CK-18 fragment, an antibody that can specifically recognize and bind Asp at the C-terminal of the CK-18 fragment can be used.
例えば、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段として、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用し、標識手段として、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体を使用してもよいし、あるいは、標識手段として、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用してもよい。標識手段として、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体、及び、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用する場合には、それぞれ別個の解析系において用いることが好ましい。 For example, as a means for capturing CK-18 and / or a fragment thereof, an antibody capable of recognizing and binding to a region corresponding to the middle part of CK-18 (amino acid positions from positions 284 to 396) is used. An antibody capable of specifically recognizing and binding Asp at the C-terminus of the -18 fragment may be used, or as a labeling means, corresponding to the middle part of CK-18 (amino acid position from position 284 to 396) An antibody capable of recognizing and binding the region to be used may be used. As a labeling means, an antibody capable of specifically recognizing and binding Asp at the C-terminus of the CK-18 fragment, and a region corresponding to the middle part of CK-18 (amino acid positions from 284 to 396) are recognized and bound. When antibodies that can be used are used, it is preferable to use them in separate analysis systems.
本発明においては、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段又は標識手段として、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができる。好ましくは、捕捉手段として抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、又は抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができ、標識手段として、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、又は抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができる。なお、本明細書中、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）」を単に「Ｍ５抗体」、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を単に「Ｍ６抗体」、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を単に「Ｍ３０抗体」と呼ぶ場合がある。上述のＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体には「Ｍ３０抗体」が含まれ、ＣＫ−１８及びその断片に含まれるサイトケラチン１８の中間部（サイトケラチン１８の２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体には、「Ｍ５抗体」及び「Ｍ６抗体」が含まれる。なお、本明細書中、「ＣＫ−１８及びその断片」を、単に「ＣＫ−１８」と記載する場合がある。
In the present invention, anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden), anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M6; VLVbio AB Nacka, Sweden) are used as means for capturing or labeling CK-18 and / or fragments thereof. An anti-CK18 fragment antibody (M30; VLVbio AB Nacka, Sweden) can be used. Preferably, an anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden) or an anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M6; VLVbio AB Nacka, Sweden) can be used as a capture means, and an anti-CK18 fragment as a labeling means. An antibody (M30; VLVbio AB Nacka, Sweden), anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden), or anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M6; VLVbio AB Nacka, Sweden) can be used. In this specification, anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden) ”is simply“ M5 antibody ”, and anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M6; VLVbio AB Nacka, Sweden) is simply“ M6 antibody ”. An anti-CK18 fragment antibody (M30; VLVbio AB Nacka, Sweden) may be simply referred to as “M30 antibody”. Antibodies capable of specifically recognizing and binding Asp at the C-terminal of the above-mentioned CK-18 fragment include “M30 antibody”, and an intermediate part of cytokeratin 18 (
Ｆｕｃ−Ｈｐｔの捕捉手段として利用される抗体は、標識手段として利用するレクチンの非特異的な結合を回避すべく、Ｆｃ部分の糖鎖よりフコースを除去する（脱フコシル化）か、Ｆｃ部分を除去した抗体断片を用いることが好ましい。 An antibody used as a capture means for Fuc-Hpt removes fucose from the sugar chain of the Fc part (defucosylation) in order to avoid non-specific binding of the lectin used as a labeling means, or removes the Fc part. It is preferable to use the removed antibody fragment.
標識手段となる化合物としては、アプタマーやレクチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。例えば、Ｆｕｃ−Ｈｐｔのフコシル化糖鎖に結合可能なレクチン（ヒイロチャワンタケレクチン、スギタケレクチン等）を利用することができる。 Examples of the compound that serves as a labeling means include aptamers and lectins, but are not limited thereto. For example, a lectin (such as a yellow chawan lectin or a sugitake lectin) that can bind to the fucosylated sugar chain of Fuc-Hpt can be used.
「標識手段」である抗体や化合物は、検出可能な標識化合物により標識することができる。このような標識化合物としては、例えば蛍光色素（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリオジニンクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、酵素（ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性物質、アビジン、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。 Antibodies and compounds that are “labeling means” can be labeled with a detectable labeling compound. Examples of such labeling compounds include fluorescent dyes (FITC (fluorescein isocyanate), PE (phycoerythrin), PerCP (periodinine chlorophyll protein), APC (allophycocyanin), Alexa Fluor (registered trademark)), enzyme ( Peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, glucose oxidase and the like), radioactive substances, avidin, biotin and the like, but are not limited thereto.
標識手段の検出は、標識手段に付された標識化合物を当該化合物の検出に適した方法で検出することによって行うことができる。 The labeling means can be detected by detecting the labeled compound attached to the labeling means by a method suitable for detecting the compound.
試料中の各タンパク質マーカーの定量は、その活性値を検出・定量することによって行っても良い。例えば、ＡＳＴの活性は、確立されたＭＤＨ−ＵＶ法に準拠して行うことができる。すなわち、ＡＳＴは、α−ケトグルタール酸のαケト基とＬ−アスパラギン酸のアミノ基の転移反応を触媒して、オキザロ酢酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）は生成したオキザロ酢酸の存在下で、βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤＨ）をβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）に変える。この時のＮＡＤＨの減少速度を波長３３０〜３５０ｎｍで測定することにより、ＡＳＴの活性を求めることができる。また、ＡＬＴの活性は、確立されたＬＤＨ−ＵＶ法に準拠して行うことができる。すなわちＡＬＴは、α−ケトグルタール酸のαケト基とＬ−アラニンのアミノ基の転移反応を触媒して、ピルビン酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は生成したピルビン酸の存在下で、βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）をβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）に変える。この時のＮＡＤＨの減少速度を波長３３０〜３５０ｎｍで測定することにより、ＡＬＴの活性を求めることができる。 The protein marker in the sample may be quantified by detecting and quantifying the activity value. For example, AST activity can be performed in accordance with established MDH-UV methods. That is, AST catalyzes the transfer reaction of the α-keto group of α-ketoglutaric acid and the amino group of L-aspartic acid to produce oxaloacetic acid and glutamic acid. Coupled with this reaction, malate dehydrogenase (MDH) is converted from β-nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NADH) to β-nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NAD) in the presence of the produced oxaloacetate. Change. The AST activity can be determined by measuring the NADH reduction rate at this time at a wavelength of 330 to 350 nm. Moreover, the activity of ALT can be performed based on the established LDH-UV method. That is, ALT catalyzes the transfer reaction of the α-keto group of α-ketoglutarate and the amino group of L-alanine to produce pyruvic acid and glutamic acid. Coupled with this reaction, lactate dehydrogenase (LDH) converts β-nicotinamide adenine dinucleotide reduced form (NADH) to β-nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NAD) in the presence of the generated pyruvate. . The ALT activity can be determined by measuring the NADH decrease rate at this time at a wavelength of 330 to 350 nm.
（判定方法）
患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値を、各タンパク質マーカーの「参照値」と比較することによって、当該患者がＮＡＳＨに罹患しているか否か診断／判定することができる。なお、本明細書において、ＮＡＳＨを「判定」、「診断」、「検出」するとは、医師によるものではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検査による結果に基づいた、「判定」、「診断」、「検出」の補助であってもよい。
(Judgment method)
By comparing the measured value of the amount of the protein marker in the sample collected from the patient with the “reference value” of each protein marker, it is possible to diagnose / determine whether the patient is suffering from NASH. In this specification, “determination”, “diagnosis”, and “detection” of NASH are not performed by a doctor, but “determination”, “diagnosis”, “detection” based on the results of in vitro examination. ”May be an assist.
本発明においては、ＮＡＳＨ患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値と、ＮＡＦＬ患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値を利用して、ＮＡＳＨ患者群とＮＡＦＬ患者群とを分ける判別式（判別関数）を作成し、当該判別式を利用して、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを判定することができる。 In the present invention, the NASH patient group is separated from the NAFL patient group using the measured value of the protein marker amount in the sample collected from the NASH patient and the measured value of the protein marker amount in the sample collected from the NAFL patient. A discriminant (discriminant function) is created, and the discriminant can be used to determine whether the patient is suffering from NASH.
すなわち、本発明においては、ＮＡＳＨに罹患していることが既知である患者及びＮＡＦＬに罹患していることが既知である患者（すなわち、非ＮＡＳＨ患者）より採取された試料における上述の各タンパク質マーカー量を測定し、これらの測定値を利用して、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者（非ＮＡＳＨ患者）を分類する判別式を作成し、当該判別式に基づいてＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者を判別するカットオフ値（参照値）を求める。次いで、被験者（患者）より採取された試料における各タンパク質マーカー量を同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを判定する。 That is, in the present invention, each of the above-mentioned protein markers in a sample collected from a patient who is known to suffer from NASH and a patient who is known to suffer from NAFL (that is, a non-NASH patient). Cutoff value that measures quantity, creates discriminant to classify NASH patient and NAFL patient (non-NASH patient) using these measured values, and discriminates NASH patient and NAFL patient based on the discriminant (Reference value) is obtained. Next, the amount of each protein marker in the sample collected from the subject (patient) is measured in the same manner, the obtained measurement value is substituted into the discriminant, and the result obtained from the discriminant is compared with the reference value. To determine if the patient is suffering from NASH.
判別式は、線形判別法（ロジスティック回帰分析、フィッシャーの判別分析、ナイーブベイズ分類器、単純パーセプトロン、線形サポートベクターマシン等）や、非線形判別法（カーネル法、ニューラルネットワーク、ｋ近傍法、判別木、アンサンブル法等）等、公知の手法に利用して作成することができる。 Discriminants include linear discriminant methods (logistic regression analysis, Fisher discriminant analysis, naive Bayes classifier, simple perceptron, linear support vector machine, etc.) and nonlinear discriminant methods (kernel method, neural network, k-nearest neighbor method, discriminant tree, It can be created by using a known method such as an ensemble method.
カットオフ値（参照値）は、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１−特異度）」に関し、「真陽性（感度）」−「偽陽性（１−特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。 The cutoff value (reference value) can be obtained from a ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) curve created using a discriminant. Regarding “true positive (sensitivity)” and “false positive (1-specificity)” shown in the ROC curve, a value that maximizes “true positive (sensitivity)”-“false positive (1-specificity)” (Youden index) can be a cut-off value (reference value).
判別式の性能（判定の精度）は、ＲＯＣ曲線下の面積（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）より確認することができる。ＡＵＣは０．５〜１の範囲の数値であらわされ、１に近づくほど高い精度を有することを示す。本発明において好ましくは、ＡＵＣは０．９以上である。 The performance of the discriminant (determination accuracy) can be confirmed from the area under the ROC curve (Area under the curve, AUC). AUC is a numerical value in the range of 0.5 to 1, and indicates that the closer to 1, the higher the accuracy. In the present invention, AUC is preferably 0.9 or more.
本発明において、判別式、ＲＯＣ曲線、及び／又は、カットオフ値（参照値）は、公知の統計解析ソフトを使用して得てもよい。 In the present invention, the discriminant, the ROC curve, and / or the cutoff value (reference value) may be obtained using known statistical analysis software.
本発明の一実施形態においては、ＮＡＳＨに罹患していることが既知である患者及びＮＡＦＬに罹患していることが既知である患者より採取された試料における上述の各タンパク質マーカー量を測定し、これらの測定値よりロジスティック回帰分析に基づいて、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者（非ＮＡＳＨ患者）を分類するロジスティックモデル式（判別式）を作成し、また、当該判別式に基づいてＲＯＣ曲線を作成し、ＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）」−「偽陽性（１−特異度）」が最大となる値をＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者を判別するカットオフ値（参照値）とする。次いで、被験者（患者）より採取された試料における各タンパク質マーカー量を同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果（スコア）を参照値と比較し、当該判別式から得られた結果（スコア）が参照値以上である場合に、当該被験者（患者）がＮＡＳＨに罹患していると判定する。 In one embodiment of the present invention, the amount of each protein marker described above is measured in a sample collected from a patient known to suffer from NASH and a patient known to suffer from NAFL, Based on logistic regression analysis from these measurements, create a logistic model formula (discriminant) that classifies NASH patients and NAFL patients (non-NASH patients), and create an ROC curve based on the discriminant, A value that maximizes “true positive (sensitivity)” — “false positive (1-specificity)” in the ROC curve is set as a cutoff value (reference value) for discriminating between NASH patients and NAFL patients. Next, the amount of each protein marker in the sample collected from the subject (patient) is measured in the same manner, the obtained measurement value is substituted into the discriminant, and the result (score) obtained from the discriminant is used as the reference value. In comparison, if the result (score) obtained from the discriminant is greater than or equal to the reference value, it is determined that the subject (patient) is suffering from NASH.
２．ＮＡＳＨの診断／検出方法において使用するためのキット
本発明はまた、上述の方法において使用するためのキットに関する。
2. Kits for use in NASH diagnostic / detection methods The present invention also relates to kits for use in the methods described above.
本キットには、上述のタンパク質マーカーを捕捉するための各捕捉手段を含めることができる。捕捉手段には、上述のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐと結合することが可能な抗体を含めることができる。例えば、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体（Ｍ５抗体やＭ６抗体）等を含めることができる。好ましくは捕捉手段である抗体は固相担体に結合されている。 The kit can include each capturing means for capturing the above-described protein marker. The capture means can include an antibody capable of binding to the above-described CK-18 and / or fragments thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp. For example, an antibody (M5 antibody or M6 antibody) that can recognize and bind to a region corresponding to the middle part of CK-18 (amino acid positions of positions 284 to 396) can be included. Preferably, the antibody serving as a capture means is bound to a solid phase carrier.
加えて／あるいは、本キットには、上述のタンパク質マーカーを標識するための各標識手段を含めることができる。標識手段には、上述のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐと結合することが可能な抗体や化合物を含めることができる。例えば、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体（Ｍ３０抗体等）やＦｕｃ−Ｈｐｔのフコシル化糖鎖に結合可能なレクチン（ヒイロチャワンタケレクチン、スギタケレクチン等）等を含めることができる。 In addition or alternatively, the present kit may include each labeling means for labeling the above-described protein marker. The labeling means can include an antibody or a compound capable of binding to the above-mentioned CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp. For example, an antibody (such as M30 antibody) capable of specifically recognizing and binding Asp at the C-terminus of the CK-18 fragment, a lectin capable of binding to a fucosylated sugar chain of Fuc-Hpt (such as a yellow chawan lectin, sugitake lectin) Can be included.
本キットにはさらに、タンパク質マーカーと捕捉手段／標識手段と結合反応に適当な緩衝液、当該結合反応の非特異的な結合を阻害するためのブロッキング試薬、標識手段を検出するための検出試薬等を含めることができる。 The kit further includes a buffer suitable for the binding reaction between the protein marker and the capturing / labeling means, a blocking reagent for inhibiting non-specific binding of the binding reaction, a detection reagent for detecting the labeling means, etc. Can be included.
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１：ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定
１．測定系及び測定条件
（１−１）Ｍ３０抗体を用いたＣＫ−１８の断片のＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
Example 1: Measurement of CK-18 and / or fragments thereof, Fuc-Hpt, and Mac-2bp Measurement system and measurement conditions (1-1) Preparation of ELISA measurement system for CK-18 fragment using M30 antibody Anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden) was washed with 100 mM carbonate buffer (pH 9). In 5), the antibody solution prepared at a concentration of 5 μg / mL was filled in a 96-well microtiter plate at 100 μL / well, and incubated at 4 ° C. overnight to be immobilized.
次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ＰＢ）（ブロッキング液）を各ウェル充填し、４℃一晩インキュベートしてブロッキングを行った。 Next, after washing three times with 0.1% Tween 20-containing phosphate buffer (PBS-T), each well is filled with a phosphate buffer (PB) (blocking solution) containing 3% bovine serum albumin, Blocking was performed by incubation overnight at 4 ° C.
次いで、ブロッキング液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、以下の実験に利用した。 Next, the blocking solution was removed and the plate was washed twice with PBS-T, and then used for the following experiment.
（１−２）検体におけるＣＫ−１８の断片の検出・測定
ＣＫ−１８の断片の検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。
組換えヒトＣＫ１８の断片を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
(1-2) Detection and Measurement of CK-18 Fragment in Specimen For detection of CK-18 fragment, an anti-CK18 fragment antibody (M30; VLVbio AB Nacka, Sweden) labeled with peroxidase (HRP) was used.
A recombinant human CK18 fragment was diluted with PBS-T containing 1% BSA to prepare a calibration standard.
試験検体２５μＬ及び検量標準品２５μＬをそれぞれ、（１−１）で作製した測定系のウェルに添加し、続いてＨＲＰ標識した抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０）７５μＬを添加して、２５℃で１時間インキュベートした。 25 μL of a test sample and 25 μL of a calibration standard were added to each well of the measurement system prepared in (1-1), followed by 75 μL of HRP-labeled anti-CK18 fragment antibody (M30), and then at 25 ° C. for 1 hour. Incubated.
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、テトラメチルベンジジン（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａ／Ｓ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，デンマーク）の溶液１００μＬを基質として各ウェルに添加した。暗所にて、室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を終了させた。 After completion of the incubation, each well was washed 5 times with PBS-T, and 100 μL of a solution of tetramethylbenzidine (Kem-En-Tec Diagnostics A / S, Taastrup, Denmark) was added to each well as a substrate. After incubation for 30 minutes at room temperature in the dark, 100 μL of 1 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction.
各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｅ−Ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ＣＫ−１８の断片量を測定した。 The absorbance of each well (wavelength 450 nm) was measured for the amount of CK-18 fragment using a microplate reader (E-Max; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).
（２−１）Ｆｕｃ−ＨｐｔのＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ヒトハプトグロビン抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）をパパイン消化してＦａｂ断片とし、これを１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
(2-1) Preparation of Fuc-Hpt ELISA Measurement System Anti-human haptoglobin antibody (Dako, Carpinteria, Calif.) Was digested with papain to form a Fab fragment, which was 5 μg in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5). The antibody solution prepared at a concentration of / mL was filled in a 96-well microtiter plate at 100 μL / well, and incubated at 4 ° C. overnight to be immobilized.
次に、上記（１−１）に記載したのと同様の手法にてブロッキングを行い、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、以下の実験に利用した。 Next, blocking was performed in the same manner as described in (1-1) above, and after washing with PBS-T, it was used for the following experiment.
（２−２）検体におけるＦｕｃ−Ｈｐｔの検出・測定
Ｆｕｃ−Ｈｐｔの検出は、ビオチンで標識したヒイロチャワンタケレクチン（Ｊ−オイルミルズ）、及びＨＲＰで標識したアビジン（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＬＬＣ）を使用した。
組換えＦｕｃ−Ｈｐｔを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
(2-2) Detection and measurement of Fuc-Hpt in a specimen Fuc-Hpt was detected using biochar-labeled herochawantake lectin (J-oil mills) and HRP-labeled avidin (Novus biologic, LLC). .
Recombinant Fuc-Hpt was diluted with PBS-T containing 1% BSA to prepare a calibration standard.
試験検体５０μＬ及び検量標準品５０μＬをそれぞれ、（２−１）で作製した測定系のウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。 50 μL of the test specimen and 50 μL of the calibration standard were added to the wells of the measurement system prepared in (2-1), respectively, and incubated at room temperature for 1 hour.
続いて、１／１０００希釈したビオチン化ヒイロチャワンタケレクチン５０μＬを添加して、室温にて１時間インキュベートした。 Subsequently, 50 μL of biotinylated herochawantake lectin diluted 1/1000 was added and incubated at room temperature for 1 hour.
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識アビジン５０μＬを添加して、室温にて１時間インキュベートした。 After completion of the incubation, each well was washed 3 times with PBS-T, and then 50 μL of HRP-labeled avidin was added and incubated at room temperature for 1 hour.
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて測定した。 After completion of the incubation, the reaction was terminated in the same manner as described in (1-2) above, and then the absorbance (wavelength 450 nm) of each well was the same as described in (1-2) above. Measured by the method.
（３−１）Ｍａｃ−２ｂｐのＥＬＩＳＡ測定系の作製
Ｃ末端にＦＬＡＧタグを含む完全及び部分長組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓを、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＲ Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製した。得られた組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓタンパク質を免疫抗原としてマウスに投与し、常法に従って、抗ヒトＭａｃ−２ｂｐｓマウスモノクローナル抗体を作製し、ヒトＭａｃ−２ｂｐｓに対して特に強い反応性を示した二つのクローン、８Ａ２及び６７Ａ１を得、これらの抗体を以下の実験に利用した。
(3-1) Preparation of Mac-2bp ELISA measurement system Full- and partial-length recombinant human Mac-2bps containing a FLAG tag at the C-terminus were expressed in HEK293 cells, and an ANTI-FLAGR M2 affinity gel (Sigma-Aldrich) The product was purified using The obtained recombinant human Mac-2 bps protein was administered to mice as an immunizing antigen, and an anti-human Mac-2 bps mouse monoclonal antibody was prepared according to a conventional method, and showed particularly strong reactivity with human Mac-2 bps. Two clones, 8A2 and 67A1, were obtained and these antibodies were used in the following experiments.
８Ａ２をペプシン消化してのＦ（ａｂ’）２断片とし、これを１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に０．５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。 8A2 was digested with pepsin to give an F (ab ′) 2 fragment, and an antibody solution prepared in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 0.5 μg / mL was added to a 96-well microtiter. Plates were loaded at 100 μL / well and incubated at 4 ° C. overnight to immobilize.
次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ＰＢ）（ブロッキング液）２００μＬを各ウェル充填し、４℃一晩インキュベートしてブロッキングを行った。 Next, after washing three times with 0.1% Tween 20-containing phosphate buffer (PBS-T), phosphate buffer (PB) containing 1% bovine serum albumin and 0.05% sodium azide (blocking) Solution) 200 μL of each well was filled and incubated at 4 ° C. overnight for blocking.
次いで、ブロッキング液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、以下の実験に利用した。 Next, the blocking solution was removed and the plate was washed twice with PBS-T, and then used for the following experiment.
（３−２）検体におけるＭａｃ−２ｂｐの検出・測定
Ｍａｃ−２ｂｐの検出は、ＨＲＰで標識した６７Ａ１を使用した。
組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
(3-2) Detection and Measurement of Mac-2bp in Specimen For detection of Mac-2bp, 67A1 labeled with HRP was used.
Recombinant human Mac-2 bps was diluted with PBS-T containing 1% BSA to prepare a calibration standard.
試験検体１００μＬ及び検量標準品１００μＬをそれぞれ、（３−１）で作製した測定系のウェルに添加し、４℃にて１時間インキュベートした。 100 μL of the test sample and 100 μL of the calibration standard were added to the wells of the measurement system prepared in (3-1), respectively, and incubated at 4 ° C. for 1 hour.
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰ標識６７Ａ１を添加して、４℃にて３０分間インキュベートした。 After completion of the incubation, each well was washed 4 times with PBS-T, and then 100 μL of HRP-labeled 67A1 was added and incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて測定した。 After completion of the incubation, the reaction was terminated in the same manner as described in (1-2) above, and then the absorbance (wavelength 450 nm) of each well was the same as described in (1-2) above. Measured by the method.
（４−１）Ｍ５抗体を用いたＣＫ−１８及びその断片のＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
(4-1) Preparation of ELISA measurement system for CK-18 and fragments thereof using M5 antibody Anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M6; VLVbio AB Nacka, Sweden) was added in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5). The antibody solution prepared at a concentration of 5 μg / mL was filled in a 96-well microtiter plate at 100 μL / well, and incubated at 4 ° C. overnight for immobilization.
次に、上記（１−１）に記載したのと同様の手法にてブロッキングを行い、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、以下の実験に利用した。 Next, blocking was performed in the same manner as described in (1-1) above, and after washing with PBS-T, it was used for the following experiment.
（４−２）検体におけるＣＫ−１８及びその断片の検出・測定
ＣＫ−１８及びその断片の検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ ＡＢ Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。
(4-2) Detection / Measurement of CK-18 and its Fragments in Specimens CK-18 and its fragments are detected using an anti-CK18 mouse monoclonal antibody (M5; VLVbio AB Nacka, Sweden) labeled with peroxidase (HRP). did.
上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、試験検体２５μＬ及び検量標準品２５μＬをそれぞれ、（４−１）で作製した測定系のウェルに添加し、続いてＨＲＰ標識した抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５）７５μＬを添加して、２５℃で１時間インキュベートした。 In the same manner as described in (1-2) above, 25 μL of the test sample and 25 μL of the calibration standard were respectively added to the wells of the measurement system prepared in (4-1), and then the HRP-labeled anti-antibody 75 μL of CK18 mouse monoclonal antibody (M5) was added and incubated at 25 ° C. for 1 hour.
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、ＣＫ−１８及びその断片の量を測定した。 After completion of the incubation, the reaction was terminated in the same manner as described in (1-2) above, and then the absorbance (wavelength 450 nm) of each well was the same as described in (1-2) above. The amount of CK-18 and its fragments was measured by the method.
（５−１）検体におけるＡＳＴ活性の検出・測定
ＡＳＴ活性は、確立されたＭＤＨ−ＵＶ法にしたがって、ＡＳＴ試薬・Ｌ「コクサイ」（シスメックス株式会社）を製造元の指示書に従って利用して行った。
(5-1) Detection and Measurement of AST Activity in Specimens AST activity was performed according to the established MDH-UV method using AST reagent L “Kokusai” (Sysmex Corporation) according to the manufacturer's instructions. .
（６−１）検体におけるＡＬＴ活性の検出・測定
ＡＬＴ活性は、確立されたＬＤＨ−ＵＶ法にしたがって、ＡＬＴ試薬・Ｌ「コクサイ」（シスメックス株式会社）を製造元の指示書に従って利用して行った。
(6-1) Detection and Measurement of ALT Activity in Specimen ALT activity was performed according to the established LDH-UV method using ALT reagent L “Kokusai” (Sysmex Corporation) according to the manufacturer's instructions. .
２．試験検体
試験検体として、ＮＡＦＬ患者（５８名）、及びＮＡＳＨ患者（９５名）それぞれより採取された血清試料を用いた。
2. Test samples Serum samples collected from NAFL patients (58 patients) and NASH patients (95 patients) were used as test samples.
３．測定結果
上記各ＥＬＩＳＡ測定系を用いた、ＮＡＦＬ患者及びＮＡＳＨ患者の血清試料におけるＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ及びＭａｃ−２ｂｐの測定結果を図１〜４に示す。
3. Measurement Results FIGS. 1 to 4 show measurement results of CK-18 and / or a fragment thereof, Fuc-Hpt and Mac-2bp in serum samples of NAFL patients and NASH patients using the above ELISA measurement systems.
図１は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）をそれぞれプロットした結果を示す。 FIG. 1 shows the results of plotting the amounts of CK-18 fragments (detected by HRP-labeled M30 antibody) measured based on serum samples of NAFL patients (left) and NASH patients (right), respectively.
図２は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＦｕｃ−Ｈｐｔ量をそれぞれプロットした結果を示す。 FIG. 2 shows the results of plotting the amount of Fuc-Hpt measured based on the serum samples of NAFL patients (left) and NASH patients (right), respectively.
図３は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＭａｃ−２ｂｐ量をそれぞれプロットした結果を示す。 FIG. 3 shows the results of plotting the amount of Mac-2bp measured based on serum samples of NAFL patients (left) and NASH patients (right), respectively.
図４は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）をそれぞれプロットした結果を示す。 FIG. 4 shows the results of plotting CK-18 measured based on serum samples of NAFL patients (left) and NASH patients (right) and their fragment amounts (detection by HRP-labeled M5 antibody), respectively.
また、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ又は、Ｍａｃ−２ｂｐの各測定値に基づくＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線を図５〜８に示す。ＲＯＣ曲線は、ロジスティック回帰分析による判別式に基づき、ＪＭＰ Ｐｒｏ１１．０ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＶＣ）を用いて作成した。ＲＯＣ曲線の横軸は偽陽性（１−特異度）を、縦軸は真陽性（感度）を示す。得られたＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）−偽陽性（１−特異度）」の値が最大となる点をカットオフ値として示す。 Moreover, the ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) curve about NASH diagnostic ability based on each measured value of CK-18 and / or its fragment, Fuc-Hpt, or Mac-2bp is shown in FIGS. The ROC curve was created using JMP Pro 11.0 software (SAS Institute Inc, Cary, VC) based on the discriminant by logistic regression analysis. The horizontal axis of the ROC curve indicates false positive (1-specificity), and the vertical axis indicates true positive (sensitivity). A point at which the value of “true positive (sensitivity) −false positive (1-specificity)” is maximum in the obtained ROC curve is shown as a cutoff value.
図５は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）は０．７３３であり、カットオフ値（Ｕ／Ｌ）は３３１．０を示し、その時の感度（％）は７１．６、特異度（％）は６９．０を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３０程度であることが示された。 FIG. 5 shows an ROC curve based on the amount of CK-18 fragment (detection by HRP-labeled M30 antibody), AUC (Area Under Curve) is 0.733, and the cut-off value (U / L) is 331. 0 was shown, the sensitivity (%) at that time was 71.6, and the specificity (%) was 69.0. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 30.
図６は、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７５９であり、カットオフ値（Ｕ／ｍＬ）は５４４．２を示し、その時の感度（％）は６９．５、特異度（％）は７２．４を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ４０程度であることが示された。 FIG. 6 shows an ROC curve based on the amount of Fuc-Hpt, AUC is 0.759, cut-off value (U / mL) is 544.2, sensitivity (%) at that time is 69.5, specific The degree (%) was 72.4. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 40.
図７は、Ｍａｃ−２ｂｐ量に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８６８であり、カットオフ値（μｇ／ｍＬ）は１．２６を示し、その時の感度（％）は９２．６、特異度（％）は７０．７を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６０程度であることが示された。 FIG. 7 shows an ROC curve based on the amount of Mac-2bp, AUC is 0.868, cut-off value (μg / mL) is 1.26, sensitivity (%) at that time is 92.6, specific The degree (%) was 70.7. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 60.
図８は、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７８３であり、カットオフ値（Ｕ／Ｌ）は６２７．０を示し、その時の感度（％）は７３．１、特異度（％）は７５．９を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ２８程度であることが示された。 FIG. 8 shows an ROC curve based on CK-18 and its fragment amount (detection with HRP-labeled M5 antibody), AUC is 0.783, cut-off value (U / L) is 627.0, The sensitivity (%) at that time was 73.1, and the specificity (%) was 75.9. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 28.
さらに、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＡＳＴ及びＡＬＴより選択される２以上のタンパク質マーカーの組み合せの測定値に基づくＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ曲線を図９〜１４に示す。各判別式において、得られたＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）−偽陽性（１−特異度）」の値が最大となるｐの値をカットオフ値として示す。 Furthermore, ROC curves for NASH diagnostic ability based on measured values of combinations of two or more protein markers selected from CK-18 and / or fragments thereof, Fuc-Hpt, Mac-2bp, AST and ALT are shown in FIGS. Shown in In each discriminant, the value of p that maximizes the value of “true positive (sensitivity) −false positive (1-specificity)” in the obtained ROC curve is shown as a cutoff value.
図９は、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−３．７４４＋０．００１９×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋１．７１１×Ｍａｃ−２ｂｐ；（Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８９６であり、カットオフ値（ｐ）は０．４４２を示し、その時の感度（％）は８８．４、特異度（％）は７５．９を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。
FIG. 9 shows the following discriminant for the combination of Fuc-Hpt amount and Mac-2bp amount:
Logit (p) = − 3.744 + 0.0019 × Fuc-Hpt + 1.711 × Mac-2bp; (Fuc-Hpt represents the value of Fuc-Hpt, and Mac-2bp represents the value of Mac-2bp)
The ROC curve based on the AUC is 0.896, the AUC is 0.896, the cutoff value (p) is 0.442, the sensitivity (%) at that time is 88.4, and the specificity (%) is 75.9. It was. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 70.
図１０は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）及びＦｕｃ−Ｈｐｔ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−１．４０２＋０．００１７×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．００１８×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８００であり、カットオフ値（ｐ）は０．５０９であり、その時の感度（％）は７７．９、特異度（％）は６７．２を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ４０程度であることが示された。
FIG. 10 shows the following discriminant formula for the combination of the amount of CK-18 fragment (detection with HRP-labeled M30 antibody) and the amount of Fuc-Hpt:
Logit (p) = − 1.402 + 0.0017 × Fuc-Hpt + 0.0018 × CK-18F; (Fuc-Hpt indicates the value of Fuc-Hpt, CK-18F indicates the value of the amount of CK-18 fragment)
The ROC curve based on the AUC is 0.800, the AUC is 0.800, the cutoff value (p) is 0.509, the sensitivity (%) at that time is 77.9, and the specificity (%) is 67.2. It was. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 40.
図１１は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−３．３３９＋１．７０７×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１８×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８８３であり、カットオフ値（ｐ）は０．４６６であり、その時の感度（％）は８９．５、特異度（％）は７２．４を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６５程度であることが示された。
FIG. 11 shows the following discriminant formula for the combination of the amount of CK-18 fragment (detection with HRP-labeled M30 antibody) and the amount of Mac-2bp:
Logit (p) = − 3.339 + 1.707 × Mac-2bp + 0.0018 × CK-18F; (Mac-2bp represents the value of Mac-2bp, CK-18F represents the value of fragment of CK-18)
Shows an ROC curve based on AUC, 0.883, cut-off value (p) is 0.466, sensitivity (%) at that time is 89.5, and specificity (%) is 72.4. It was. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 65.
図１２は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−４．３２＋１．７２０×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１７×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．００１５×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９０６であり、カットオフ値（ｐ）は０．５６３であり、その時の感度（％）は８６．３、特異度（％）は７９．３を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。カットオフ値（ｐ）が０．７４７である場合に、特異度（％）が９０を示す。
FIG. 12 shows the following discriminant formula for the combination of the amount of CK-18 fragment (detection by HRP-labeled M30 antibody), the amount of Fuc-Hpt and the amount of Mac-2bp:
Logit (p) = − 4.32 + 1.720 × Mac-2bp + 0.0017 × Fuc-Hpt + 0.0015 × CK-18F; (Mac-2bp is the value of Mac-2bp, Fuc-Hpt is the value of Fuc-Hpt Value, CK-18F indicates the value of the fragment amount of CK-18)
The ROC curve based on the AUC is 0.906, the cutoff value (p) is 0.563, the sensitivity (%) at that time is 86.3, and the specificity (%) is 79.3. It was. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 70. When the cutoff value (p) is 0.747, the specificity (%) indicates 90.
図１３は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−４．２８＋１．６４１×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１８×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ−０．０００５５×ＣＫ−１８Ｆ＋０．００１２×ＣＫ−１８；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を、ＣＫ−１８はＣＫ−１８及び／又はその断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９０８であり、カットオフ値は０．４８９であり、その時の感度（％）は８９．３、特異度（％）は７７．６を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。カットオフ値（ｐ）が０．７５５である場合に、特異度（％）が９０を示す。
FIG. 13 shows the combinations of the amount of CK-18 fragment (detection with HRP-labeled M30 antibody), the amount of CK-18 and its fragment (detection with HRP-labeled M5 antibody), the amount of Fuc-Hpt and the amount of Mac-2bp. Discriminant of:
Logit (p) = − 4.28 + 1.641 × Mac−2bp + 0.0018 × Fuc−Hpt−0.00055 × CK−18F + 0.0012 × CK−18; (Mac-2bp represents the value of Mac-2bp, Fuc -Hpt indicates the value of Fuc-Hpt, CK-18F indicates the value of fragment of CK-18, CK-18 indicates the value of CK-18 and / or its fragment)
The ROC curve based on the AUC was 0.908, the AUC was 0.908, the cut-off value was 0.489, the sensitivity (%) at that time was 89.3, and the specificity (%) was 77.6. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 70. When the cutoff value (p) is 0.755, the specificity (%) indicates 90.
図１４は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−５．２４＋１．５８４×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１６×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．０００３３×ＣＫ−１８Ｆ−０．０００１１×ＣＫ−１８＋０．０７６１×ＡＳＴ−０．０２４×ＡＬＴ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を、ＣＫ−１８はＣＫ−１８及びその断片量の値を、ＡＳＴはＡＳＴ活性の値を、ＡＬＴはＡＬＴ活性の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９２８であり、カットオフ値は０．６６７を示し、その時の感度（％）は７９．６、特異度（％）は９１．４を示した。カットオフ値（ｐ）が０．６４８である場合に、特異度（％）が９０を示す。
FIG. 14 shows the amount of CK-18 fragment (detection by HRP-labeled M30 antibody), the amount of CK-18 and its fragment (detection by HRP-labeled M5 antibody), the amount of Fuc-Hpt, the amount of Mac-2bp, and the AST activity value. And the following discriminant for combinations of ALT activity values:
Logit (p) = − 5.24 + 1.584 × Mac-2bp + 0.0016 × Fuc-Hpt + 0.00033 × CK-18F-0.00011 × CK-18 + 0.0761 × AST−0.024 × ALT; (Mac-2bp Is the value of Mac-2bp, Fuc-Hpt is the value of Fuc-Hpt, CK-18F is the value of fragment of CK-18, CK-18 is the value of CK-18 and its fragment, AST shows the value of AST activity, ALT shows the value of ALT activity)
The ROC curve based on the AUC was 0.928, the AUC was 0.928, the cutoff value was 0.667, the sensitivity (%) at that time was 79.6, and the specificity (%) was 91.4. When the cut-off value (p) is 0.648, the specificity (%) indicates 90.
以上の結果より、ＮＡＳＨ患者の血清中におけるＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−ＨｐｔならびにＭａｃ−２ｂｐの各測定値は、ＮＡＦＬ患者の血清中におけるそれらの値よりも有意に高いことが確認された（図１−図４）。 From the above results, it was confirmed that the measured values of CK-18 and / or fragments thereof, Fuc-Hpt and Mac-2bp in the serum of NASH patients were significantly higher than those in the serum of NAFL patients. (FIGS. 1-4).
また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の３つの組み合せ、また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の４つの組み合せ、さらに、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の６つの組み合せ、に基づくＲＯＣ曲線においては、いずれもＡＵＣが０．９を超え、このＡＵＣ値は、ＣＫ−１８及び／又はその断片を単独で、Ｆｕｃ−Ｈｐｔを単独で、Ｍａｃ−２ｂｐを単独で、Ｆｕｃ−ＨｐｔとＭａｃ−２ｂｐとの２つの組み合せで、ＣＫ−１８の断片とＦｕｃ−Ｈｐｔとの２つの組み合せで、又はＣＫ−１８の断片とＭａｃ−２ｂｐとの２つの組み合せで用いた場合に得られたＡＵＣ値と比べて高いものであり、より優れた診断能を有することが確認された。そして、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の３つの組み合せ、また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の４つの組み合せ、さらに、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の６つの組み合せを用いた場合には、特異度（％）が９０である場合においても、およそ７０程度の感度（％）を有し、これらタンパク質マーカーを用いた手法が特異度及び感度がいずれも優れた判定を実現できることが確認された。 In addition, CK-18 fragment amount (detection with HRP-labeled M30 antibody), three combinations of Fuc-Hpt amount and Mac-2bp amount, and CK-18 fragment amount (detection with HRP-labeled M30 antibody), Four combinations of CK-18 and its fragment amount (detection by HRP-labeled M5 antibody), Fuc-Hpt amount and Mac-2bp amount, CK-18 fragment amount (detection by HRP-labeled M30 antibody), CK In the ROC curve based on -18 and its fragment amount (detection by HRP-labeled M5 antibody), Fuc-Hpt amount, Mac-2bp amount, AST activity value and ALT activity value, AUC is 0 This AUC value is greater than CK-18 and / or fragments thereof, Fuc-Hpt alone, Mac-2b Alone, in two combinations of Fuc-Hpt and Mac-2bp, in two combinations of CK-18 fragment and Fuc-Hpt, or in two combinations of CK-18 fragment and Mac-2bp. It was higher than the AUC value obtained when it was used, and it was confirmed that it had a better diagnostic ability. And CK-18 fragment amount (detection with HRP-labeled M30 antibody), three combinations of Fuc-Hpt amount and Mac-2bp amount, CK-18 fragment amount (detection with HRP-labeled M30 antibody), Four combinations of CK-18 and its fragment amount (detection by HRP-labeled M5 antibody), Fuc-Hpt amount and Mac-2bp amount, CK-18 fragment amount (detection by HRP-labeled M30 antibody), CK When 6 combinations of -18 and its fragment amount (detection by HRP-labeled M5 antibody), Fuc-Hpt amount, Mac-2bp amount, AST activity value and ALT activity value were used, the specificity (%) was Even in the case of 90, it has a sensitivity (%) of about 70, and the method using these protein markers has no specificity and sensitivity. It was confirmed that can realize a determination is also excellent.
実施例２：その他スコアリングシステムによるＮＡＳＨの診断
近年、タンパク質マーカーに限定されることなく、一般臨床検査で測定可能な複数の因子を組み合わせたスコアリングシステムが、ＮＡＳＨの診断に利用することが報告されている。以下に、代表的なスコアリングシステムを示す。
Example 2: Diagnosis of NASH by other scoring systems In recent years, it has been reported that a scoring system that combines a plurality of factors that can be measured by a general clinical test is used for diagnosis of NASH without being limited to protein markers. Has been. A typical scoring system is shown below.
１）ＮＡＦＬＤ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｃｏｒｅ（ＮＦＳ）
計算式：−１．６７５＋０．０３７×Ａｇｅ（年）＋０．０９４×ＢＭＩ（ｋｇ／ｍ２）＋１．１３×ＩＦＧ／糖尿病（あり＝１、なし＝０）＋０．９９×ＡＳＴ／ＡＬＴ−０．０１３×血小板数（×１０９／Ｌ）−０．６６×アルブミン（ｇ／ｄｌ）
２）ＦＩＢ４ ｉｎｄｅｘ
計算式：Ａｇｅ×ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）／血小板数（×１０９／Ｌ）／√ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）
３）ＢＡＲＤ ｓｃｏｒｅ
計算式：スケール０〜４点；ＢＭＩ≧２８ｋｇ／ｍ２ １点；ＡＳＴ／ＡＬＴ≧０．８ ２点；糖尿病あり １点
1) NAFLD fibrosis score (NFS)
Calculation formula: −1.675 + 0.037 × Age (year) + 0.094 × BMI (kg / m 2 ) + 1.13 × IFG / diabetes (yes = 1, none = 0) + 0.99 × AST / ALT-0 .013 × platelet count (× 10 9 /L)−0.66×albumin (g / dl)
2) FIB4 index
Calculation formula: Age × AST (U / L) / platelet count (× 10 9 / L) / √ALT (U / L)
3) BARD score
Calculation formula:
上記各スコアリングシステムに基づき、ＪＭＰ Ｐｒｏ１１．０ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＶＣ）を用いて、ＲＯＣ曲線を作成した（図１５〜１７）。ＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ曲線を図１５〜１７に示す。ＲＯＣ曲線の横軸は偽陽性（１−特異度）を、縦軸は真陽性（感度）を示す。 Based on the above scoring systems, ROC curves were created using JMP Pro 11.0 software (SAS Institute Inc, Cary, VC) (FIGS. 15 to 17). ROC curves for NASH diagnostic ability are shown in FIGS. The horizontal axis of the ROC curve indicates false positive (1-specificity), and the vertical axis indicates true positive (sensitivity).
図１５は、患者１１０名を対象とした、ＮＦＳに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．６１４であり、カットオフ値は−０．６５８を示し、その時の感度（％）は３４．１、特異度（％）は９４．１を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３５程度であることが示された。 FIG. 15 shows an ROC curve based on NFS for 110 patients, with an AUC of 0.614, a cutoff value of −0.658, and the sensitivity (%) at that time is 34.1. Specificity (%) was 94.1. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 35.
図１６は、患者１５３名を対象とした、ＦＩＢ４ ｉｎｄｅｘに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７３８であり、カットオフ値は１．３７を示し、その時の感度（％）は６１．１、特異度（％）は９３．１を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６０程度であることが示された。 FIG. 16 shows an ROC curve based on FIB4 index for 153 patients, AUC is 0.738, cutoff value is 1.37, sensitivity (%) is 61.1, Specificity (%) was 93.1. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 60.
図１７は、患者９４名を対象とした、ＢＡＲＤ ｓｃｏｒｅに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．６９２であり、カットオフ値は２を示し、その時の感度（％）は５２．６、特異度（％）は７７．８を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３５程度であることが示された。 FIG. 17 shows a ROC curve based on BARD score for 94 patients, AUC is 0.692, cutoff value is 2, sensitivity (%) at that time is 52.6, specificity (%) Showed 77.8. Further, when the specificity (%) was 90, the sensitivity (%) was shown to be about 35.
これらのＡＵＣは、上記実施例１のタンパク質マーカーの組み合せによる判別式に基づくＡＵＣと比べて顕著に低く、また特異度（％）が９０であるときの感度（％）も低いことが確認された。このことから実施例１に記載のタンパク質マーカーの組み合せに基づくＮＡＳＨ診断法の高い精度・有用性が確認された。 These AUCs were confirmed to be significantly lower than the AUCs based on the discriminant formula by the combination of the protein markers of Example 1 above, and the sensitivity (%) when the specificity (%) was 90 was also low. . This confirmed the high accuracy and usefulness of the NASH diagnostic method based on the combination of protein markers described in Example 1.
Claims (6)
患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定すること、
得られた測定値と参照値とを用いて、患者がＮＡＳＨであるか否かを判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することを含む、方法。 A method for detecting non-alcoholic steatohepatitis (NASH), comprising:
Measuring the amount of cytokeratin 18 (CK-18) and / or fragments thereof, fucosylated haptoglobin (Fuc-Hpt), and Mac-2 binding protein (Mac-2bp) in a sample taken from a patient;
Using the obtained measured value and the reference value to determine whether or not the patient is NASH and detecting the presence or absence of NASH in the patient.
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