JP2018011525A - Genome editing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、CRISPR/Casシステムを利用したゲノム編集方法、該方法に用いるキット、組成物等に関する。 The present invention relates to a genome editing method using a CRISPR / Cas system, a kit used for the method, a composition, and the like.
ガイドRNAとCasタンパク質との組合せにより、細胞のゲノム上の特定配列にDNA2本鎖切断を発生させることができる。このDNA切断端ではDNAのランダムな削り込み又は付加等の変異が高頻度に起こるため、ガイドRNAとCasタンパク質との組合せにより、容易に遺伝子破壊が可能である（特許文献１）。また、DNA切断端付近のDNA配列を含むドナープラスミド、或いは1本鎖DNAオリゴがゲノムDNAにうまく取り込まれた場合（比較的低頻度ではあるものの）、意図した通りにゲノムを編集することが可能である。意図した通りにゲノムを編集する技術は、疾患モデル細胞や動物の作成に有用なだけでなく、遺伝子治療にも応用可能な技術である。これらの技術は、CRISPR/Casシステムといわれており、近年、急速に開発・改良が進められている。 The combination of guide RNA and Cas protein can generate DNA double-strand breaks at specific sequences on the cell's genome. Since mutations such as random cutting or addition of DNA occur frequently at this DNA cut end, gene disruption can be easily performed by a combination of guide RNA and Cas protein (Patent Document 1). In addition, if a donor plasmid containing a DNA sequence near the DNA break or a single-stranded DNA oligo is successfully incorporated into the genomic DNA (although it is relatively infrequent), the genome can be edited as intended. It is. The technique of editing the genome as intended is not only useful for creating disease model cells and animals, but also applicable to gene therapy. These technologies are said to be CRISPR / Cas systems and have been developed and improved rapidly in recent years.
CRISPR/Casシステムとしては、ニッカーゼ型Casタンパク質と、100塩基対以内のDNA配列内を認識する2つのガイドRNAとを用いる技術（ニックを2ヶ所発生させることでDNA2本鎖切断を発生させることができる）も報告されている。この技術はDNA2本鎖切断を発生させることが重要であるところ、1つのガイドRNAしか用いない場合等、DNA2本鎖切断が起こらない場合は、意図した通りのゲノム編集は起こりにくいといわれている。 The CRISPR / Cas system uses a nickase-type Cas protein and two guide RNAs that recognize DNA sequences within 100 base pairs (by generating two nicks, DNA double-strand breaks can be generated. Can also be reported. In this technology, it is important to generate DNA double-strand breaks, but when DNA double-strand breaks do not occur, such as when only one guide RNA is used, it is said that genome editing as intended is unlikely to occur. .
しかしながら、DNA2本鎖切断によるゲノム編集は、DNAのランダムな削り込み又は付加による遺伝子破壊のみが目的である場合は非常に有用であるものの、意図した通りのゲノム編集を実施しようとする場合は、それに失敗した細胞ではDNAのランダムな削り込み又は付加等の予測できない変異が高頻度に発生してしまうので望ましくない。また、常染色体上の遺伝子である場合、一方のアリルで意図通りのゲノム編集に成功したとしても、もう一方のアリルやガイドRNAのオフターゲット部位では予測できない変異が高頻度に発生するため、遺伝子治療法として用いるための安全性を確保できない。また、大動物ではバッククロスが不可能なため、このような予測できない変異を高頻度で起こしてしまう技術は、精度の高い疾患モデル動物を作り出すための障壁となる。 However, genome editing by DNA double-strand breaks is very useful when the purpose is only gene disruption by random cutting or addition of DNA, but if you intend to perform genome editing as intended, In cells that fail to do so, unpredictable mutations such as random cutting or addition of DNA occur frequently, which is undesirable. In addition, in the case of a gene on an autosome, even if successful genome editing with one allele is successful, mutations that cannot be predicted occur frequently at the off-target site of the other allele or guide RNA. Safety for use as a treatment cannot be ensured. In addition, since backcrossing is impossible in large animals, the technology that frequently causes such unpredictable mutations becomes a barrier for creating highly accurate disease model animals.
本発明は、DNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度がより低いながらも、意図した通りのゲノム編集をより高い効率で行うことができるゲノム編集方法を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a genome editing method capable of performing genome editing as intended with higher efficiency while the frequency of unintended mutations such as random cutting or addition of DNA is lower. To do.
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、（a）ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記sgRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種を用いてゲノム編集を行うことにより、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor has found that (a) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette, (b) nickase-type Cas At least one selected from the group consisting of a protein and an expression cassette thereof, (c) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the sgRNA 1 target site, The above problem can be solved by performing genome editing using donor DNA and (d) at least one selected from the group consisting of guide RNA 2 targeting an arbitrary site in the donor DNA and its expression cassette. I found. As a result of further research based on this finding, the present invention was completed.
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１． （a）ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法．
項２． 前記ドナーDNAが2本鎖DNAである、項１に記載のゲノム編集方法．
項３． 前記ドナーDNAが環状DNAである、項２に記載のゲノム編集方法．
項４． 前記ガイドRNA 1の標的鎖及び前記ガイドRNA 2の標的鎖が、いずれもセンス鎖である、或いはいずれもアンチセンス鎖である、項２又は３に記載のゲノム編集方法．
項５． 前記ガイドRNA 1の標的部位の近傍領域内に疾患関連変異部位又はそれに対応する非変異部位を含む、項２〜４のいずれかに記載のゲノム編集方法．
項６． 前記近傍領域が、前記ガイドRNA 1の標的部位の標的鎖5´末端の塩基を起点（0）とした場合の−200〜＋100の領域である、項５に記載のゲノム編集方法．
項７． 前記相同配列内の前記変異が同義置換である、項２〜６のいずれかに記載のゲノム編集方法．
項８． 前記ガイドRNA 2の標的部位が前記相同配列以外の部位である、項２〜７のいずれかに記載のゲノム編集方法．
項９． 前記ドナーDNAが1本鎖DNAであり、且つ前記ガイドRNA 2の標的部位が前記ゲノムDNA及び前記相同配列の両方に存在する、項１に記載のゲノム編集方法．
項１０． （a）ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法．
項１１． 項１０に記載の製造方法で得られた細胞又は非ヒト生物．
項１２． （a）ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用組成物．
項１３． （a）ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用キット．
That is, the present invention includes the following embodiments:
Item 1. (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A genome editing method comprising a step of introducing at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof into a cell or a non-human organism.
Item 2. Item 2. The genome editing method according to Item 1, wherein the donor DNA is a double-stranded DNA.
Item 3. Item 3. The genome editing method according to Item 2, wherein the donor DNA is circular DNA.
Item 4. Item 4. The genome editing method according to Item 2 or 3, wherein the target strand of the guide RNA 1 and the target strand of the guide RNA 2 are both sense strands, or both are antisense strands.
Item 5. Item 5. The genome editing method according to any one of Items 2 to 4, comprising a disease-related mutation site or a non-mutation site corresponding to the disease-related mutation site in a region near the target site of the guide RNA 1.
Item 6. Item 6. The genome editing method according to Item 5, wherein the neighboring region is a region of -200 to +100 when the base at the 5 'end of the target strand of the target site of the guide RNA 1 is the origin (0).
Item 7. Item 7. The genome editing method according to any one of Items 2 to 6, wherein the mutation in the homologous sequence is synonymous substitution.
Item 8. Item 8. The genome editing method according to any one of Items 2 to 7, wherein the target site of the guide RNA 2 is a site other than the homologous sequence.
Item 9. Item 2. The genome editing method according to Item 1, wherein the donor DNA is single-stranded DNA, and the target site of the guide RNA 2 is present in both the genomic DNA and the homologous sequence.
Item 10. (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A method for producing a genome-edited cell or non-human organism, comprising introducing at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof into the cell or non-human organism.
Item 11. Item 10. A cell or non-human organism obtained by the production method according to Item 10.
Item 12. (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A composition for genome editing comprising at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof.
Item 13. (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A genome editing kit comprising at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof.
本発明によれば、DNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度がより低いながらも、意図した通りのゲノム編集をより高い効率で行うことができるゲノム編集方法を提供することができる。このゲノム編集方法を利用すれば、遺伝子治療や疾患モデル動物の創出等を、より高い精度で且つより効率的に実施することも可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a genome editing method capable of performing genome editing as intended with higher efficiency while the frequency of unintentional mutation such as random cutting or addition of DNA is lower. it can. If this genome editing method is used, gene therapy, creation of disease model animals, and the like can be performed with higher accuracy and more efficiently.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In this specification, the expressions “containing” and “including” include the concepts of “containing”, “including”, “consisting essentially of”, and “consisting only of”.
本明細書において、アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc．Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statisticsfor multipl
e high−scoringsegments in molecular sequences．”NatlAcad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、NationalCenter of BiotechnologyInformation（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
In this specification, “identity” of amino acid sequences refers to the degree of amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences. The level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters. Alternatively, the algorithm BLAST (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes” Proc. Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), Karlin S, Altschul SF. “Applications and statisticsfor multipl
e high-scoring segments in molecular sequences. "NatlAcad Sci USA. 90: 5873-7 (1993)). A program called BLASTX based on such BLAST algorithm has been developed. Specific methods of these analysis methods are publicly known. Refer to the website of National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and the “identity” of the nucleotide sequence is defined according to the above. .
本明細書において、保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。 As used herein, conservative substitution means that an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution technique. In addition, amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; alanine, valine, leucine, isoleucine, Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan; amino acid residues with β-branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine, and aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine Similarly, substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
本発明は、4種（（a）、（b）、（c）、及び（d））の特定の材料を利用した、ゲノム編集方法、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集用キット等に関する。以下、これらについて説明する。 The present invention relates to a genome editing method, a genome-edited cell or a method for producing a non-human organism, a genome using four kinds of specific materials ((a), (b), (c), and (d)), a genome The present invention relates to an editing composition, a genome editing kit, and the like. Hereinafter, these will be described.
1．材料（a）
材料（a）は、ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
1． Material (a)
The material (a) is at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette.
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。 The guide RNA is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR / Cas system. For example, the guide RNA can be induced to the target site of the genomic DNA by binding to the target site of the genomic DNA and binding to the Cas protein. Various things can be used.
本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその5´側に隣接する17〜30塩基長（好ましくは18〜25塩基長、より好ましくは19〜22塩基長、特に好ましくは20塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムDNA上の部位である。 In the present specification, the target site refers to a PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence and a 17 to 30 base length adjacent to the 5 ′ side (preferably 18 to 25 base length, more preferably 19 to 22 base length, Particularly preferred is a site on genomic DNA consisting of a DNA strand (target strand) consisting of a sequence of about 20 bases in length) and its complementary DNA strand (non-target strand).
PAM配列は、利用するCasタンパク質の種類によって異なる。例えば、S. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）に対応するPAM配列は5´-CCNであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）に対応するPAM配列は5´-TCNであり、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）に対応するPAM配列は5´-TTCであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）に対応するPAM配列は5´-AWGであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NNAGAAであり、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. aureus由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NGRRT又は5´-NGRRNであり、N. meningitidis由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NNNNGATTであり、T. denticola由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NAAAACである。 The PAM sequence varies depending on the type of Cas protein used. For example, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from S. pyogenes (type II) is 5′-NGG, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from S. solfataricus (type I-A1) is 5′-CCN. Yes, the PAM sequence corresponding to Cas9 protein (type I-A2) from S. solfataricus is 5´-TCN, and the PAM sequence corresponding to Cas9 protein (type IB) from H. walsbyl is 5´-TTC Yes, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from E. coli (IE type) is 5′-AWG, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from E. coli (IF type) is 5′-CC, The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (IF type) derived from P. aeruginosa is 5′-CC, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from S. Thermophilus (type II-A) is 5′-NNAGAA, The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type II-A) derived from S. agalactiae is 5′-NGG, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein derived from S. aureus is 5′-NGRRT or 5′-NGRRN. Yes, N The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from meningitidis is 5′-NNNNGATT, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from T. denticola is 5′-NAAAAC.
ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列（crRNA（CRISPR RNA）配列といわれることもある）を有しており、このcrRNA配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。 The guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a crRNA (CRISPR RNA) sequence) that is involved in binding to the target site of genomic DNA. This crRNA sequence excludes the PAM sequence complementary sequence of the non-target strand. The guide RNA can bind to the target site of the genomic DNA by binding complementarily (preferably complementary and specific) to the sequence.
なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。 Note that “complementary” binding is not only based on perfect complementarity (A and T, and G and C), but also complementary so that it can hybridize under stringent conditions. The case of combining based on the above is also included. Stringent conditions are determined by the melting temperature of the nucleic acid that binds the complex or probe, as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on (Tm). For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned. It is preferable that the hybridized state be maintained even when washed under such conditions. Although there is no particular limitation, the more stringent hybridization conditions are about “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, and the more severe hybridization conditions are “0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”. Can do.
具体的には、crRNA配列は、標的鎖と例えば90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。なお、ガイドRNAの標的部位への結合には、crRNA配列の3´側の12塩基が重要であるといわれている。このため、crRNA配列が標的鎖と完全同一ではない場合、標的鎖と異なる塩基は、crRNA配列の3´側の12塩基以外に存在することが好ましい。 Specifically, the crRNA sequence has, for example, 90%, preferably 95%, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and particularly preferably 100% identity with the target strand. It is said that 12 bases on the 3 ′ side of the crRNA sequence are important for binding of the guide RNA to the target site. For this reason, when the crRNA sequence is not completely identical to the target strand, it is preferable that a base different from the target strand exists other than 12 bases on the 3 ′ side of the crRNA sequence.
ガイドRNAは、Casタンパク質との結合に関与する配列（tracrRNA（trans-activating crRNA）配列といわれることもある）を有しており、このtracrRNA配列が、Casタンパク質に結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。 The guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence) that is involved in the binding to the Cas protein, and this tracrRNA sequence binds to the Cas protein, thereby It can be directed to the target site of genomic DNA.
tracrRNA配列は、特に制限されない。tracrRNA配列は、典型的には、複数（通常、3つ）のステムループを形成可能な50〜100塩基長程度の配列からなるRNAであり、利用するCasタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。tracrRNA配列としては、利用するCasタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。 The tracrRNA sequence is not particularly limited. The tracrRNA sequence is typically an RNA consisting of a sequence of about 50 to 100 bases in length that can form multiple (usually three) stem loops, and the sequence varies depending on the type of Cas protein used . As the tracrRNA sequence, various known sequences can be adopted depending on the type of Cas protein to be used.
ガイドRNAは、通常、上記したcrRNA配列とtracr RNA配列を含む。ガイドRNAの態様は、crRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNAであってもよいし、crRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体であってもよい。 The guide RNA usually includes the above-described crRNA sequence and tracr RNA sequence. The guide RNA may be a single-stranded RNA containing a crRNA sequence and a tracr RNA sequence, or an RNA complex formed by complementarily binding an RNA containing a crRNA sequence and an RNA containing a tracrRNA sequence. May be.
ガイドRNA 1は、ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNAである。本発明のゲノム編集方法においては、ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列を、後述のドナーDNAに含まれる相同配列に置き換えることができる。 Guide RNA 1 is a guide RNA that targets any part of genomic DNA. In the genome editing method of the present invention, an arbitrary sequence containing the target site of guide RNA 1 can be replaced with a homologous sequence contained in donor DNA described later.
ゲノムDNAは、ゲノム編集対象細胞又は生物が有するゲノムDNAであって、CRISPR/Casシステムにより編集可能なDNAである限り特に制限されない。 Genomic DNA is not particularly limited as long as it is genomic DNA possessed by a cell or organism subject to genome editing and can be edited by the CRISPR / Cas system.
ゲノム編集対象細胞及び生物は、CRISPR/Casシステムによりゲノム編集可能な細胞及び生物である限り特に制限されない。ゲノム編集対象細胞としては、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。ゲノム編集対象生物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物； アフリカツメガエル等の両生類動物； ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物； ホヤ等の脊索動物； ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物： シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物： 酵母、アカパンカビ等の菌類： 大腸菌、枯草菌、藍藻等の細菌等が挙げられる。 The cells and organisms subject to genome editing are not particularly limited as long as they are cells and organisms that can be genome-edited by the CRISPR / Cas system. As cells for genome editing, cells derived from various tissues or of various properties such as blood cells, hematopoietic stem cells / progenitor cells, gametes (sperm, ovum), fertilized eggs, fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells , Hepatocytes, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like. Examples of organisms subject to genome editing include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits; amphibian animals such as Xenopus laevis; fish animals such as zebrafish, medaka and tiger pufferfish; ; Arthropods such as Drosophila and silkworms; Animals such as: Arabidopsis, rice, wheat, tobacco, etc .: Fungi such as yeast, red mold, etc .: Bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, cyanobacteria and the like.
ガイドRNA 1の標的鎖は、ゲノム編集効率の観点やDNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度をより低くできるという観点から、後述のガイドRNA 2の標的鎖と同じであることが望ましい。すなわち、ガイドRNA 1の標的鎖及び前記ガイドRNA 2の標的鎖が、いずれもセンス鎖である、或いはいずれもアンチセンス鎖であることが望ましい。 The target strand of guide RNA 1 is the same as the target strand of guide RNA 2 described below from the viewpoint of genome editing efficiency and the possibility of lowering the frequency of unintended mutations such as random cutting or addition of DNA. Is desirable. That is, it is desirable that the target strand of guide RNA 1 and the target strand of guide RNA 2 are both sense strands, or both are antisense strands.
本発明のゲノム編集方法により、ゲノムDNA上のある部位の配列を別配列に置き換えることを目的とした場合、ゲノム編集効率の観点から、置き換えようとする対象部位は、ガイドRNA 1の標的部位の近傍領域内に存在することが好ましい。この「近傍領域」とは、特に制限されないが、例えばガイドRNA 1の標的部位の標的鎖5´末端の塩基を起点（0）とした場合の−200〜＋100、好ましくは−100〜＋50、より好ましくは−50〜＋25、さらに好ましくは−25〜＋12の領域が挙げられる（−（マイナス）は5´側を示し、＋（プラス）は3´側を示す）。 When the genomic editing method of the present invention aims to replace the sequence of a certain site on the genomic DNA with another sequence, the target site to be replaced is the target site of the guide RNA 1 from the viewpoint of genome editing efficiency. It is preferable to exist in the vicinity region. The “neighboring region” is not particularly limited, but, for example, −200 to +100, preferably −100 to +50 when the base at the 5 ′ end of the target strand of the target site of guide RNA 1 is the starting point (0), The region is preferably −50 to +25, more preferably −25 to +12 (− (minus) indicates the 5 ′ side, and + (plus) indicates the 3 ′ side).
置き換えようとする対象部位を、疾患関連変異部位（すなわち、疾患に関する事象（例えば発症頻度、発症確率、発症時期、症状の程度、症状が現れている期間等）に影響を与える変異（例えば塩基の置換、欠失、挿入、付加等）を有する部位）、又は該疾患関連変異部位に対応する非変異部位（すなわち、疾患関連変異部位の相同配列であり、且つ該変異が無い部位）とすれば、本発明のゲノム編集方法により、遺伝子治療や疾患モデル動物の創出等が可能である。 The target site to be replaced is a disease-related mutation site (that is, a mutation that affects a disease-related event (for example, onset frequency, onset probability, onset time, degree of symptom, period of symptom, etc.) A site having substitution, deletion, insertion, addition, etc.), or a non-mutated site corresponding to the disease-related mutation site (that is, a site homologous to the disease-related mutation site and having no such mutation) The genome editing method of the present invention enables gene therapy, creation of disease model animals, and the like.
ガイドRNA 1の発現カセットとは、ゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象生物の細胞内でガイドRNA 1を発現（転写）可能なDNAである限り特に制限されない。例えばガイドRNA 1がcrRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNAである場合は、ガイドRNA 1の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたガイドRNA 1のコード配列を有するDNAが挙げられる。別の例として、ガイドRNA 1がcrRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体である場合は、ガイドRNA 1の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「crRNA配列を含むRNA」コード配列を含む発現カセット（便宜上、「crRNA発現カセット」と示すこともある）と、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「tracrRNA配列を含むRNA」コード配列を含む発現カセット（便宜上、「tracrRNA発現カセット」と示すこともある）との組合せが挙げられる。 The expression cassette for guide RNA 1 is not particularly limited as long as it is a DNA that can express (transcribe) guide RNA 1 in a cell of a genome editing target cell or a genome editing target organism. For example, when the guide RNA 1 is a single-stranded RNA containing a crRNA sequence and a tracr RNA sequence, typical examples of the guide RNA 1 expression cassette include a promoter and the guide RNA 1 arranged under the control of the promoter. Examples include DNA having a coding sequence. As another example, when guide RNA 1 is an RNA complex formed by complementary binding of RNA containing a crRNA sequence and RNA containing a tracrRNA sequence, a typical example of an expression cassette for guide RNA 1 is a promoter. , And an expression cassette (also referred to as “crRNA expression cassette” for convenience) including a coding sequence “RNA containing crRNA sequence” arranged under the control of the promoter, and the promoter and arrangement under the control of the promoter Combination with an expression cassette containing the “RNA containing tracrRNA sequence” coding sequence (which may be referred to as “tracrRNA expression cassette” for convenience).
ガイドRNA 1の発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等が挙げられる。 The promoter included in the guide RNA 1 expression cassette is not particularly limited, and a pol II promoter can be used. However, from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNA, the pol III promoter Is preferred. The pol III promoter is not particularly limited, and examples thereof include mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoter, and human valine-tRNA promoter.
ガイドRNA 1の発現カセットが、crRNA発現カセットとtracrRNA発現カセットとの組合せである場合、これら2つの発現カセットは、同一DNA（1分子のDNA）上に含まれていてもよいし、それぞれが別々のDNA（異なるDNA分子）上に含まれていてもよい。 If the guide RNA 1 expression cassette is a combination of a crRNA expression cassette and a tracrRNA expression cassette, these two expression cassettes may be contained on the same DNA (one molecule of DNA), or each may be separately Of DNA (different DNA molecules).
ガイドRNA 1の発現カセットは、後述のニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセット（材料（b））及びガイドRNA 2の発現カセット（材料（d））からなる群より選択される少なくとも1種と、同一DNA上に含まれていてもよいし、同一DNA（1分子のDNA）上に含まれていてもよいし、別々のDNA（異なるDNA分子）上に含まれていてもよい。 The expression cassette for guide RNA 1 is the same DNA as at least one selected from the group consisting of the expression cassette for nickase-type Cas protein (material (b)) and the expression cassette for guide RNA 2 (material (d)) described later. It may be contained on the same, may be contained on the same DNA (one molecule of DNA), or may be contained on separate DNA (different DNA molecules).
ガイドRNA 1の発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS））を含んでいてもよい。例えば、ガイドRNA 1の発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、crRNA配列のコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとcrRNA配列のコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、crRNA配列のコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。 The expression cassette of guide RNA 1 may contain other elements (for example, a multiple cloning site (MCS)) as necessary. For example, in the expression cassette of guide RNA 1, if the promoter and the crRNA sequence coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side, preferably between the promoter and the crRNA sequence coding sequence (preferably either one or There is an embodiment in which MCS is arranged on the 3 ′ side (preferably adjacent) of the coding sequence of the crRNA sequence. MCS is not particularly limited as long as it contains a plurality (for example, 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10) restriction enzyme sites.
ガイドRNA 1の発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。 The expression cassette of guide RNA 1 may be a vector alone or together with other sequences. Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in the expression vector can be employed. Examples of such sequences include replication origins, drug resistance genes, and the like.
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 Examples of drug resistance genes include chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene and the like.
ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター； レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター； アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。 The type of vector is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; virus vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses, Sendai viruses; and Agrobacterium vectors. It is done.
ガイドRNA 1及びその発現カセットは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写技術等を利用して作製することができる。 Guide RNA 1 and its expression cassette can be easily prepared according to a known genetic engineering technique. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription technology, and the like.
2．材料（b）
材料（b）は、ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
2． Material (b)
The material (b) is at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、2本鎖切断型Casタンパク質が、一方のDNA鎖しか切断できないように変異したものであれば特に制限されない。 The nickase-type Cas protein is not particularly limited as long as the double-strand-cut Cas protein is mutated so that only one DNA strand can be cut.
2本鎖切断型Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を2本鎖切断できるものを各種使用することができる。2本鎖切断型Casタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばS. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. aureus由来のCas9タンパク質、N. meningitidis由来のCas9タンパク質、T. denticola由来のCas9タンパク質等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはCas9タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプとコッカス属に属する細菌が内在的に有するCas9タンパク質が挙げられる。各種Casタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBI等の各種データベース上で容易に得ることができる。 The double-strand-cut Cas protein is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR / Cas system. For example, it binds to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA, and the target site is 2 Various types that can cleave this strand can be used. As the double-strand-cut Cas protein, those derived from various organisms are known. For example, a Cas9 protein derived from S. pyogenes (type II), a Cas9 protein derived from S. solfataricus (type I-A1), and S. pyogenes. Cas9 protein derived from solfataricus (type I-A2), Cas9 protein derived from H. walsbyl (type IB), Cas9 protein derived from E. coli (type IE), Cas9 protein derived from E. coli (type IF), P. Cas9 protein derived from aeruginosa (IF type), Cas9 protein derived from S. Thermophilus (type II-A), Cas9 protein derived from S. agalactiae (type II-A), Cas9 protein derived from S. aureus, derived from N. meningitidis Cas9 protein, Cas9 protein derived from T. denticola, and the like. Among these, Cas9 protein is preferable, and Cas9 protein inherently possessed by bacteria belonging to the genus Strep and Coccus is more preferable. Information on the amino acid sequences of various Cas proteins and their coding sequences can be easily obtained on various databases such as NCBI.
2本鎖切断型Casタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（RuvCドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（HNHドメイン）を含む。ニッカーゼ型Casタンパク質としては、例えば2本鎖切断型Casタンパク質のこれら2つのドメインの内のいずれかのドメインにおいて、その切断活性を損なわせる（例えば、その切断活性を1/2、1/5、1/10、1/100、1/1000以下にする）変異を有するタンパク質が挙げられる。このような変異としては、例えば2本鎖切断型Casタンパク質がS. pyogenes由来のCas9タンパク質（アミノ酸配列は配列番号37）である場合であれば、例えばN末端から10番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（D10A：RuvCドメイン内の変異）、N末端から840番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（H840A：HNHドメイン内の変異）、N末端から863番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（N863A：HNHドメイン内の変異）、N末端から762番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（E762A：RuvCIIドメイン内の変異）、N末端から986番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（D986A：RuvCIIIドメイン内の変異）等が挙げられる。 The double-strand-cut Cas protein usually includes a domain involved in target strand cleavage (RuvC domain) and a domain involved in non-target strand cleavage (HNH domain). As the nickase-type Cas protein, for example, in any one of these two domains of the double-strand-cut Cas protein, the cleavage activity is impaired (for example, the cleavage activity is reduced to 1/2, 1/5, 1/10, 1/100, 1/1000 or less). As such a mutation, for example, when the double-strand break Cas protein is a Cas9 protein derived from S. pyogenes (amino acid sequence is SEQ ID NO: 37), for example, the 10th amino acid (aspartic acid) from the N-terminus. Mutation to alanine (D10A: mutation in the RuvC domain), mutation from the N-terminal to the 840th amino acid (histidine) to alanine (H840A: mutation in the HNH domain), and the 863th amino acid from the N-terminal (asparagine) Mutation to alanine (N863A: mutation in the HNH domain), mutation of the 762nd amino acid (glutamic acid) from the N-terminal to alanine (E762A: mutation in the RuvCII domain), amino acid 986 from the N-terminal (aspartic acid) ) To alanine (D986A: mutation in RuvCIII domain) and the like.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、野生型である2本鎖DNA切断型Casタンパク質における上記変異の他にも、その活性を損なわない限りにおいて、他の変異を有していてもよい。この観点から、ニッカーゼ型Casタンパク質は、その元となる野生型2本鎖DNA切断型Casタンパク質のアミノ酸配列と、例えば85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位の標的鎖又は非標的鎖を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。或いは、同様の観点から、ニッカーゼ型Casタンパク質は、その元となる野生型2本鎖DNA切断型Casタンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば2〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜20個、さらに好ましくは2〜10個、よりさらに好ましくは2〜5個、特に好ましくは2個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位の標的鎖又は非標的鎖を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。なお、上記「活性」は、in vitro又はin vivoにおいて、公知の方法に従って又は準じて評価することができる。また、他の変異は、保存的置換であることが望ましい。 The nickase-type Cas protein may have other mutations in addition to the above mutations in the wild-type double-stranded DNA-cutting Cas protein as long as the activity is not impaired. From this point of view, the nickase-type Cas protein is, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and more preferably, the amino acid sequence of the original wild-type double-stranded DNA-cut Cas protein. It consists of an amino acid sequence with 98% or more identity, and its activity (activity of binding to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleaving the target strand or non-target strand of the target site) ). Alternatively, from the same viewpoint, the nickase-type Cas protein has one or more (for example, 2 to 100, preferably 2 to 50) amino acid sequences of the original wild-type double-stranded DNA-cut Cas protein. More preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, even more preferably 2 to 5 and particularly preferably 2) amino acid sequences comprising substitutions, deletions, additions or insertions of amino acids. And a protein having the activity (activity of binding to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleaving the target strand or non-target strand of the target site). The “activity” can be evaluated in vitro or in vivo according to or according to a known method. In addition, other mutations are preferably conservative substitutions.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、上記「活性」を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。 The nickase-type Cas protein may be chemically modified as long as it has the above “activity”.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO−）、アミド（−CONH2）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。 The nickase-type Cas protein may be any one of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR) at the C-terminus.
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。 Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group is used.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。 In the nickase-type Cas protein, a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus may be amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
さらに、ニッカーゼ型Casタンパク質には、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。 Furthermore, in the nickase-type Cas protein, the amino group of the amino acid residue at the N-terminus is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group). N-terminal glutamine residue that can be cleaved in vivo is pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, Indole group, guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (for example, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) or sugar chain is bound Such so-called glycoproteins are also included.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、上記「活性」を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。 The nickase-type Cas protein may be one to which a known protein tag is added as long as it has the above “activity”. Examples of protein tags include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, and PA tag.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩； アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。 The nickase-type Cas protein may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base. The salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be employed. Examples of acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple Organic acid salts such as acid salts, citrate salts, methanesulfonate salts, paratoluenesulfonate salts; and amino acid salts such as aspartate salts and glutamate salts. Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
ニッカーゼ型Casタンパク質は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。 The nickase-type Cas protein may be in the form of a solvate. The solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
ニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットとは、ゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象生物の細胞内でニッカーゼ型Casタンパク質を発現可能なDNAである限り特に制限されない。例えばニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたニッカーゼ型Casタンパク質のコード配列を有するDNAが挙げられる。 The expression cassette for the nickase-type Cas protein is not particularly limited as long as it is DNA capable of expressing the nickase-type Cas protein in the cells of the genome editing target cell or the genome editing target organism. For example, a typical example of an expression cassette for a nickase-type Cas protein includes a promoter and DNA having a nickase-type Cas protein coding sequence arranged under the control of the promoter.
ニッカーゼ型Casタンパク質に含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。 The promoter included in the nickase-type Cas protein is not particularly limited. For example, various pol II promoters can be used. For example, the pol III promoter is not particularly limited. For example, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 Examples include promoters, MSCV promoters, hTERT promoters, β-actin promoters, and CAG promoters.
ニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットは、前述のガイドRNA 1の発現カセット（材料（a））及びガイドRNA 2の発現カセット（材料（d））からなる群より選択される少なくとも1種と、同一DNA上に含まれていてもよいし、同一DNA（1分子のDNA）上に含まれていてもよいし、別々のDNA（異なるDNA分子）上に含まれていてもよい。 The expression cassette for the nickase-type Cas protein is the same DNA as at least one selected from the group consisting of the above-mentioned guide RNA 1 expression cassette (material (a)) and guide RNA 2 expression cassette (material (d)). It may be contained on the same, may be contained on the same DNA (one molecule of DNA), or may be contained on separate DNA (different DNA molecules).
ニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS））を含んでいてもよい。例えば、ニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、ニッカーゼ型Casタンパク質のコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとニッカーゼ型Casタンパク質のコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、ニッカーゼ型Casタンパク質のコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。 The expression cassette for the nickase-type Cas protein may contain other elements (for example, a multicloning site (MCS)) as necessary. For example, in the expression cassette of the nickase-type Cas protein, if the promoter and the nickase-type Cas protein coding sequence are arranged in this order from the 5 'side (preferably between the promoter and the nickase-type Cas protein coding sequence) Includes an embodiment in which MCS is arranged on the 3 ′ side (preferably adjacent to) the coding sequence of the nickase-type Cas protein. MCS is not particularly limited as long as it contains a plurality (for example, 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10) restriction enzyme sites.
ニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。 The expression cassette of the nickase-type Cas protein may be a vector alone or together with other sequences. Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in the expression vector can be employed. Examples of such sequences include replication origins, drug resistance genes, and the like.
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 Examples of drug resistance genes include chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene and the like.
ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター； レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター； アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。 The type of vector is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; virus vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses, Sendai viruses; and Agrobacterium vectors. It is done.
ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して作製することができる。 The nickase-type Cas protein and its expression cassette can be easily prepared according to a known genetic engineering technique. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription / translation technology, recombinant protein production technology, and the like.
3．材料（c）
材料（c）は、前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNAである。
3． Material (c)
The material (c) is a donor DNA containing a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site.
ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列とは、ゲノムDNAにおける、ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列であり、その長さは、特に制限されるものではない。該長さは、ゲノム編集効率の観点から、ガイドRNA 1の標的部位の5´側にも3´側にもより長い方が好ましく、例えばガイドRNA 1の標的部位の標的鎖5´末端の塩基を起点（0）とした場合（−（マイナス）は5´側を示し、＋（プラス）は3´側を示す）、該任意配列の5´末端は、例えば−100以下、より好ましくは−200以下、よりさらに好ましくは−300以下、よりさらに好ましくは−500以下であり、該任意配列の3´末端は、例えば＋100以上、好ましくは＋200以上、さらに好ましくは＋300以上、よりさらに好ましくは＋500以上である。また、該任意配列の長さは、細胞内へのドナーDNA導入効率等の観点から、例えば10000塩基長以下である。 The arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1 is an arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1 in genomic DNA, and the length thereof is not particularly limited. From the viewpoint of genome editing efficiency, the length is preferably longer on both the 5 ′ side and 3 ′ side of the target site of guide RNA 1, for example, the base at the 5 ′ end of the target strand of the target site of guide RNA 1 Is the starting point (0) (-(minus) indicates the 5 'side and + (plus) indicates the 3' side), the 5 'end of the arbitrary sequence is, for example, -100 or less, more preferably- 200 or less, more preferably −300 or less, even more preferably −500 or less, and the 3 ′ end of the arbitrary sequence is, for example, +100 or more, preferably +200 or more, more preferably +300 or more, and even more preferably +500. That's it. The length of the arbitrary sequence is, for example, 10,000 bases or less from the viewpoint of the efficiency of introducing donor DNA into cells.
ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列とは、該任意配列と相同な配列である。該相同配列においては、ガイドRNA 1標的部位に変異を有している。すなわち、該相同配列においては、該任意配列におけるガイドRNA 1標的部位に対応する部位があるが、その部位の塩基配列は変異している。この変異は、ガイドRNA 1が該相同配列を標的とすることができなくなる変異である限り特に制限されない。該変異としては、例えばPAM配列が非PAM配列となるような変異や、PAM配列の5´側に隣接する12塩基内の変異が挙げられる。なお、ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列及びその上記相同配列がタンパク質のアミノ酸配列をコードしている場合、この変異は同義置換であることが好ましい。 The homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1 is a sequence homologous to the arbitrary sequence. The homologous sequence has a mutation in the guide RNA 1 target site. That is, in the homologous sequence, there is a site corresponding to the guide RNA 1 target site in the arbitrary sequence, but the base sequence at that site is mutated. This mutation is not particularly limited as long as it is a mutation that prevents guide RNA 1 from targeting the homologous sequence. Examples of the mutation include a mutation in which the PAM sequence becomes a non-PAM sequence, and a mutation in 12 bases adjacent to the 5 ′ side of the PAM sequence. In addition, when the arbitrary sequence containing the target site | part of guide RNA 1 and the said homologous sequence have encoded the amino acid sequence of protein, it is preferable that this variation | mutation is synonymous substitution.
この相同配列は、上記変異以外の他の変異を有していてもよい。この観点から、該相同配列は、その元となる「ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列」と、例えば85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなる。或いは、該相同配列は、その元となる「ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列」に対して1若しくは複数個（例えば2〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜20個、さらに好ましくは2〜10個、よりさらに好ましくは2〜5個）の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなる。 This homologous sequence may have a mutation other than the above mutation. From this viewpoint, the homologous sequence is, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98%, with the “arbitrary sequence containing the target site of guide RNA 1”. It consists of a base sequence having the above identity. Alternatively, the homologous sequence may be one or more (for example, 2 to 100, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 20) with respect to the original “arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1”. Individual, more preferably 2 to 10 and even more preferably 2 to 5 bases) is composed of an amino acid sequence substituted, deleted, added or inserted.
ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列における「置き換えようとする対象部位（上述の「1．材料（a）」）」を疾患関連変異部位又はそれに対応する非変異部位とする場合であれば、他の変異として、これらの部位の変異を採用することにより、本発明のゲノム編集方法により、遺伝子治療や疾患モデル動物の創出等が可能となる。 If the target site to be replaced in the arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1 (the above-mentioned “1. Material (a)”) is a disease-related mutation site or a corresponding non-mutation site, By adopting mutations at these sites as other mutations, gene therapy, creation of disease model animals, and the like can be performed by the genome editing method of the present invention.
ドナーDNAは、1本鎖DNAであってもよく、2本鎖DNAであってもよい。ゲノム編集効率の観点から、ドナーDNAは、2本鎖DNAであることが好ましい。 The donor DNA may be single-stranded DNA or double-stranded DNA. From the viewpoint of genome editing efficiency, the donor DNA is preferably a double-stranded DNA.
ドナーDNAは、鎖状DNAであってもよく、環状DNAであってもよい。ゲノム編集において、DNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度をより低減できるという観点から、ドナーDNAは、環状DNAであることが好ましい。 The donor DNA may be a chain DNA or a circular DNA. In genome editing, the donor DNA is preferably circular DNA from the viewpoint that the frequency of unintended mutations such as random cutting or addition of DNA can be further reduced.
ドナーDNAは、ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列以外にも、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、特に制限されず、例えばドナーDNAを適当なベクターに組み込んだ状態の環状DNAとして用いる場合であれば、該ベクター配列が挙げられる。 Donor DNA may contain other sequences in addition to the homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of guide RNA 1. Other sequences are not particularly limited, and for example, when used as circular DNA in a state in which donor DNA is incorporated into an appropriate vector, the vector sequence may be mentioned.
ドナーDNAは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術等を利用して作製することができる。 Donor DNA can be easily prepared according to a known genetic engineering technique. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, and the like.
4．材料（d）
材料（d）は、前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
Four. Material (d)
The material (d) is at least one selected from the group consisting of guide RNA 2 targeting an arbitrary site in the donor DNA and its expression cassette.
ガイドRNAについては、上記「1．材料（a）」における説明と同様である。 The guide RNA is the same as described above in “1. Material (a)”.
ガイドRNA 2は、ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNAである。 Guide RNA 2 is a guide RNA that targets an arbitrary site in donor DNA.
ガイドRNA 2の標的部位は、ドナーDNA内の「ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列」内の部位であってもよく、該相同配列以外の部位であってもよい。前者である場合は、ガイドRNA 2は、該相同配列の元となるゲノムDNA内の「任意配列」をも標的とし得ることとなる。 The target site of the guide RNA 2 may be a site in “a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1” in the donor DNA, or may be a site other than the homologous sequence. In the former case, the guide RNA 2 can also target an “arbitrary sequence” in the genomic DNA from which the homologous sequence is based.
ガイドRNA 2の標的鎖は、ゲノム編集効率の観点やDNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度をより低くできるという観点から、前述のガイドRNA 1の標的鎖と同じであることが望ましい。すなわち、ガイドRNA 1の標的鎖及び前記ガイドRNA 2の標的鎖が、いずれもセンス鎖である、或いはいずれもアンチセンス鎖であることが望ましい。 The target strand of guide RNA 2 is the same as the target strand of guide RNA 1 described above from the viewpoint of genome editing efficiency and the possibility of lowering the frequency of unintended mutations such as random cutting or addition of DNA. Is desirable. That is, it is desirable that the target strand of guide RNA 1 and the target strand of guide RNA 2 are both sense strands, or both are antisense strands.
ガイドRNA 2の発現カセットとは、ゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象生物の細胞内でガイドRNA 2を発現（転写）可能なDNAである限り特に制限されない。例えばガイドRNA 2がcrRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNAである場合は、ガイドRNA 2の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたガイドRNA 2のコード配列を有するDNAが挙げられる。別の例として、ガイドRNA 2がcrRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体である場合は、ガイドRNA 2の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「crRNA配列を含むRNA」コード配列を含む発現カセット（便宜上、「crRNA発現カセット」と示すこともある）と、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「tracrRNA配列を含むRNA」コード配列を含む発現カセット（便宜上、「tracrRNA発現カセット」と示すこともある）との組合せが挙げられる。 The expression cassette for guide RNA 2 is not particularly limited as long as it is DNA that can express (transcribe) guide RNA 2 in a cell of a genome editing target cell or a genome editing target organism. For example, when the guide RNA 2 is a single-stranded RNA containing a crRNA sequence and a tracr RNA sequence, typical examples of the guide RNA 2 expression cassette include a promoter and a guide RNA 2 placed under the control of the promoter. Examples include DNA having a coding sequence. As another example, when guide RNA 2 is an RNA complex formed by complementary binding of RNA containing a crRNA sequence and RNA containing a tracrRNA sequence, a typical example of an expression cassette for guide RNA 2 is a promoter. , And an expression cassette (also referred to as “crRNA expression cassette” for convenience) including a coding sequence “RNA containing crRNA sequence” arranged under the control of the promoter, and the promoter and arrangement under the control of the promoter Combination with an expression cassette containing the “RNA containing tracrRNA sequence” coding sequence (which may be referred to as “tracrRNA expression cassette” for convenience).
ガイドRNA 2の発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等が挙げられる。 The promoter included in the guide RNA 2 expression cassette is not particularly limited, and a pol II promoter can be used. However, from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNA, the pol III promoter Is preferred. The pol III promoter is not particularly limited, and examples thereof include mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoter, and human valine-tRNA promoter.
ガイドRNA 2の発現カセットが、crRNA発現カセットとtracrRNA発現カセットとの組合せである場合、これら2つの発現カセットは、同一DNA（1分子のDNA）上に含まれていてもよいし、それぞれが別々のDNA（異なるDNA分子）上に含まれていてもよい。 When the guide RNA 2 expression cassette is a combination of a crRNA expression cassette and a tracrRNA expression cassette, these two expression cassettes may be contained on the same DNA (one molecule of DNA), or each is separately Of DNA (different DNA molecules).
ガイドRNA 2の発現カセットは、前述のガイドRNA 1の発現カセット（材料（a））及びニッカーゼ型Casタンパク質の発現カセット（材料（b））からなる群より選択される少なくとも1種と、同一DNA上に含まれていてもよいし、同一DNA（1分子のDNA）上に含まれていてもよいし、別々のDNA（異なるDNA分子）上に含まれていてもよい。 The guide RNA 2 expression cassette is the same DNA as at least one selected from the group consisting of the guide RNA 1 expression cassette (material (a)) and the nickase-type Cas protein expression cassette (material (b)). It may be contained on the same, may be contained on the same DNA (one molecule of DNA), or may be contained on separate DNA (different DNA molecules).
ガイドRNA 2の発現カセットは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（MCS））を含んでいてもよい。例えば、ガイドRNA 2の発現カセットにおいて、5´側から、プロモーター、crRNA配列のコード配列の順に配置されている場合であれば、プロモーターとcrRNA配列のコード配列の間に（好ましくはいずれか一方或いは両方に隣接して）、crRNA配列のコード配列の3´側に（好ましくは隣接して）、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数（例えば2〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10）個の制限酵素サイトを含むものであれば特に制限されない。 The expression cassette of guide RNA 2 may contain other elements (for example, a multicloning site (MCS)) as necessary. For example, in the expression cassette of guide RNA 2, if the promoter and the crRNA sequence coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side, preferably between the promoter and the crRNA sequence coding sequence (preferably either one or There is an embodiment in which MCS is arranged on the 3 ′ side (preferably adjacent) of the coding sequence of the crRNA sequence. MCS is not particularly limited as long as it contains a plurality (for example, 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10) restriction enzyme sites.
ガイドRNA 2の発現カセットは、これのみで、或いは他の配列と共にベクターを構成していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。 The expression cassette of guide RNA 2 may be a vector alone or together with other sequences. Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in the expression vector can be employed. Examples of such sequences include replication origins, drug resistance genes, and the like.
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 Examples of drug resistance genes include chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene and the like.
ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター； レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター； アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。 The type of vector is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; virus vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses, Sendai viruses; and Agrobacterium vectors. It is done.
ガイドRNA 2及びその発現カセットは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写技術等を利用して作製することができる。 Guide RNA 2 and its expression cassette can be easily prepared according to a known genetic engineering technique. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription technology, and the like.
5．ゲノム編集方法、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法
上記材料（a）〜（d）をゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象非ヒト生物に導入する工程を含む方法により、これらの細胞又は生物のゲノムを編集すること、より具体的にはガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列をドナーDNAに含まれる相同配列に置き換えることができる。
Five. Genome editing method, method of producing genome-edited cells or non-human organisms The above-mentioned materials (a) to (d) are introduced into the cells subject to genome editing or non-human organisms subject to genome editing, By editing the genome of an organism, more specifically, any sequence containing the target site of guide RNA 1 can be replaced with a homologous sequence contained in the donor DNA.
材料（a）〜（d）の導入方法は、特に制限されず、対象細胞又は生物の種類、材料の種類（核酸であるのか、タンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。 The method for introducing the materials (a) to (d) is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of the target cell or organism and the type of material (whether it is a nucleic acid or a protein). . Examples of the introduction method include microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, and virus-mediated nucleic acid delivery.
材料（a）〜（d）の導入の態様は、最終的に対象細胞又は生物内に材料（a）〜（d）全てが送達される限りにおいて特に制限されない。材料（a）〜（d）は、同時に、逐次的に、或いは一定期間を空けて別々に導入することができる。 The mode of introduction of the materials (a) to (d) is not particularly limited as long as all the materials (a) to (d) are finally delivered into the target cell or organism. The materials (a) to (d) can be introduced simultaneously, sequentially or separately after a certain period of time.
材料（a）〜（d）を導入してから、一定時間経過後に、対象細胞又は対象生物内でゲノム編集が起こるので、この細胞又は生物を回収することにより、ゲノム編集された（すなわち、ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列をドナーDNAに含まれる相同配列に置き換えられた）細胞又は非ヒト生物を得ることができる。 Since the genome editing occurs in the target cell or target organism after a certain period of time has elapsed since the introduction of the materials (a) to (d), the genome has been edited by collecting the cell or organism (ie, the guide). Cells or non-human organisms can be obtained in which any sequence containing the RNA 1 target site has been replaced with a homologous sequence contained in the donor DNA.
本発明のゲノム編集方法により得られた細胞又は非ヒト生物においては、DNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異の頻度がより低減されている。例えば、本発明により得られたゲノム編集された細胞集団において、意図しない変異が起こっている細胞の割合は、例えば20％以下、好ましくは10％以下、より好ましくは5％以下である。 In cells or non-human organisms obtained by the genome editing method of the present invention, the frequency of unintended mutations such as random cutting or addition of DNA is further reduced. For example, in the genome-edited cell population obtained by the present invention, the proportion of cells in which an unintended mutation has occurred is, for example, 20% or less, preferably 10% or less, more preferably 5% or less.
6．ゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物
上記材料（a）〜（d）は、これらが一体となって含まれるゲノム編集用組成物として利用することもできるし、或いはキットとして利用することもできる。
6． Genome Editing Kit, Genome Editing Composition The above materials (a) to (d) can be used as a genome editing composition in which they are integrated or can be used as a kit. .
ゲノム編集用組成物は、上記材料（a）〜（d）を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。 The composition for genome editing is not particularly limited as long as it contains the materials (a) to (d), and may further contain other components as necessary. The other components are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable components. For example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders , Disintegrating agents, lubricants, thickeners, moisturizers, coloring agents, fragrances, chelating agents and the like.
ゲノム編集用キットは、上記材料（a）〜（d）を別々に或いは一体となって含まれている限りにおいて特に制限されず、必要に応じて核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。 The genome editing kit is not particularly limited as long as the materials (a) to (d) are included separately or integrally, and if necessary, a nucleic acid introduction reagent, a protein introduction reagent, a buffer solution, etc. Other reagents and instruments necessary for carrying out the genome editing method of the present invention may be included as appropriate.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例1：ゲノム編集効率の評価試験1
非蛍光型変異EGFPのコード配列が組み込まれた細胞に、各種Casタンパク質及び各種ガイドRNAの発現ベクターと共に、蛍光型正常EGFPのコード配列が組み込まれたドナーベクターを導入し、EGFP由来の蛍光を発する細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。試験の概要を図１Ａに示す。この細胞の割合が高い程、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列が、ドナーベクターにおける該変異部位の対応配列に組み替えられた細胞（すなわち目的のゲノム編集が起こった細胞）の割合が高いこと、すなわちゲノム編集効率が高いことを示す。具体的には以下のように行った。
Example 1: Genome editing efficiency evaluation test 1
Introduce a donor vector with a fluorescent normal EGFP coding sequence together with expression vectors for various Cas proteins and various guide RNAs into cells into which the non-fluorescent mutant EGFP coding sequence has been incorporated, and emit EGFP-derived fluorescence The percentage of cells was measured by flow cytometry. An outline of the test is shown in FIG. 1A. The higher the percentage of these cells, the higher the percentage of cells in which the coding sequence of the non-fluorescent mutant EGFP mutation site is recombined with the corresponding sequence of the mutation site in the donor vector (ie, the cell in which the target genome editing occurred). That is, the genome editing efficiency is high. Specifically, it was performed as follows.
＜実施例1-1：非蛍光型変異EGFPのコード配列が組み込まれた細胞の作製＞
EGFPコード配列（配列番号1）において5´末端から321番目のCGに変異（これにより、N末端から107番目のアミノ酸（チロシン）のコドンが終止コドンとなる）させた非蛍光型変異EGFPコード配列を、レンチウイルスベクター（pMX-puro）に組み込んだ。得られたベクターとパッケージングプラスミドを293T細胞に導入し、定法に従ってウイルス粒子を得た。該ウイルス粒子を293T細胞に感染させ、ピューロマイシンを1μg/mLの濃度で含む培地中で一定期間培養した後、pMX-puro内にコードされる蛍光タンパク質（mCherry）由来の蛍光を発する細胞を、セルソーター（Aria II、BD Biosciences社製）を用いて分離した。分離した細胞の1つを培養して増殖させ、目的の細胞を得た。
<Example 1-1: Production of cells into which coding sequence of non-fluorescent mutant EGFP is incorporated>
Mutation (Thus, codon 107 amino acids from the N-terminus (tyrosine) is the stop codon) from the 5 'end to 321 th C G in EGFP coding sequence (SEQ ID NO: 1) is non-fluorescent mutant EGFP coding was The sequence was incorporated into a lentiviral vector (pMX-puro). The obtained vector and packaging plasmid were introduced into 293T cells, and virus particles were obtained according to a conventional method. After infecting 293T cells with the virus particles and culturing in a medium containing puromycin at a concentration of 1 μg / mL for a certain period of time, cells emitting fluorescence derived from the fluorescent protein (mCherry) encoded in pMX-puro, Separation was performed using a cell sorter (Aria II, manufactured by BD Biosciences). One of the separated cells was cultured and proliferated to obtain the target cell.
＜実施例1-2：Casタンパク質及びガイドRNAの発現ベクターの作製・準備＞
CMVエンハンサー及びトリβアクチンプロモーターで発現制御されている野生型Cas9又はニッカーゼ型Cas9（D10A）発現カセットを含むベクター（pSpCas9(BB)-2A-Puro又はpSpCas9n(BB)-2A-Puro）を準備した。このベクターにおいては、5´側からU6プロモーター、2つのBbsI認識サイト、及びトレーサーRNA配列が配置された発現カセットがある。これを利用して、ベクターをBbsIで切断し、そこにガイドRNA標的配列からPAM配列が除かれてなる配列を含む2本鎖DNA（2つの1本鎖DNAをアニールさせて作製）を組み込むことにより、ベクター内にガイドRNA発現カセットを作製した。なお、標的配列は、ガイドRNA作製プログラム（CRISPR Design、http://crispr.mit.edu/）を用いて設計した。標的配列の配列番号、及び標的配列の組み込みに用いた1本鎖DNAの配列番号を以下の表1に示す。
<Example 1-2: Preparation and preparation of expression vector of Cas protein and guide RNA>
A vector (pSpCas9 (BB) -2A-Puro or pSpCas9n (BB) -2A-Puro) containing a wild-type Cas9 or nickase-type Cas9 (D10A) expression cassette controlled by a CMV enhancer and avian β-actin promoter was prepared. . In this vector, there is an expression cassette in which a U6 promoter, two BbsI recognition sites, and a tracer RNA sequence are arranged from the 5 ′ side. Using this, the vector is cleaved with BbsI, and double-stranded DNA (prepared by annealing two single-stranded DNAs) containing a sequence obtained by removing the PAM sequence from the guide RNA target sequence is incorporated therein. Thus, a guide RNA expression cassette was prepared in the vector. The target sequence was designed using a guide RNA preparation program (CRISPR Design, http://crispr.mit.edu/). The sequence number of the target sequence and the sequence number of the single-stranded DNA used for incorporation of the target sequence are shown in Table 1 below.
＜実施例1-3：ドナーベクターの作製・準備＞
1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列78as（配列番号14）、標的配列285as、及び標的配列332sのPAM配列及びその近傍配列をCasタンパク質が認識できないように同義置換させた配列を、ドナーベクター用プラスミド（pUC57）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。これと同様にして、1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列41s、標的配列260s、及び標的配列360as（配列番号15）のPAM配列及びその近傍配列をCasタンパク質が認識できないように同義置換させた配列を、ドナーベクター用プラスミド（pUC57）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。
<Example 1-3: Preparation and preparation of donor vector>
In the coding sequence of EGFP from which the first to third bases have been deleted, the PAM sequence of target sequence 78as (SEQ ID NO: 14), target sequence 285as, and target sequence 332s and their neighboring sequences are synonymously substituted so that the Cas protein cannot be recognized. This sequence was incorporated into a multi-cloning site of a donor vector plasmid (pUC57). Similarly, the Cas protein recognizes the PAM sequence of the target sequence 41s, target sequence 260s, and target sequence 360as (SEQ ID NO: 15) and its neighboring sequences in the EGFP coding sequence from which the first to third bases are deleted. The sequence that was synonymously substituted so that it could not be incorporated was incorporated into the multicloning site of the donor vector plasmid (pUC57).
＜実施例1-3：レポーターアッセイ＞
293T細胞を24ウェルプレート（BD Bioscience社製）の1ウェル当り4×104個／培地700μL播種した。24時間後、Casタンパク質及びガイドRNAの発現ベクター2種（それぞれ40 ng）、及びドナーベクター（400 ng）を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後に、細胞を培地に植え継いだ。トランスフェクションから4日後、細胞をトリプシン処理によりウェルから剥がし、フローサイトメトリー（FACS Calibur、BD Bioscience社製）によりEGFP由来の蛍光を発する細胞の割合を測定した。
<Example 1-3: Reporter assay>
293T cells were seeded at 4 × 10 4 cells / 700 μL of medium per well of a 24-well plate (BD Bioscience). After 24 hours, cells were transfected with two expression vectors of Cas protein and guide RNA (each 40 ng) and donor vector (400 ng). Two days after transfection, the cells were passaged into the medium. Four days after the transfection, the cells were detached from the wells by trypsin treatment, and the ratio of cells emitting fluorescence derived from EGFP was measured by flow cytometry (FACS Calibur, BD Bioscience).
＜結果＞
結果を図１に示す。図１に示されるように、ニッカーゼ型Cas9を利用し、且つガイドRNA標的配列をタンデムに2つ設計した場合（「Cas9(D10A)」における「41s/332s」及び「260s/332s」）に、ゲノム編集効率（非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列が、ドナーベクターにおける該変異部位の対応配列に組み替えられた細胞の割合）が顕著に高かった。
<Result>
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, when using nickase-type Cas9 and designing two guide RNA target sequences in tandem (“41s / 332s” and “260s / 332s” in “Cas9 (D10A)”), The genome editing efficiency (the ratio of cells in which the coding sequence of the mutation site of the non-fluorescent mutant EGFP was recombined with the corresponding sequence of the mutation site in the donor vector) was remarkably high.
実施例2：ゲノム編集効率の評価試験2
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1と同様にしてゲノム編集効率を評価した。
Example 2: Genome editing efficiency evaluation test 2
The genome editing efficiency was evaluated in the same manner as in Example 1 except that nickase-type Cas9 was expressed as a Cas protein and the combination of the synonymous substitution site in the EGFP coding sequence of the donor vector and the guide RNA target sequence was changed.
結果を図２に示す。この結果より、ニッカーゼ型Casタンパク質を用いてゲノム編集効率をより高めるには、1）非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列近傍（実施例2では332s）を標的とするガイドRNAが、ドナープラスミドを標的とできないように、ドナープラスミドに変異を入れておくこと、及び2）もう1つのガイドRNAがドナープラスミドを標的にできること、の2つの要件が必要であることが示唆された（図2中、「332s+41s」及び「332s+41s」における「m332」）。 The results are shown in FIG. From these results, in order to further improve genome editing efficiency using the nickase-type Cas protein, 1) a guide RNA that targets the vicinity of the coding sequence of the non-fluorescent mutant EGFP mutation site (332s in Example 2) is used as a donor. It was suggested that two requirements were necessary: mutations in the donor plasmid so that the plasmid could not be targeted, and 2) that another guide RNA could be targeted to the donor plasmid (Figure 2). Among them, “m332” in “332s + 41s” and “332s + 41s”).
実施例3：ゲノム編集効率の評価試験3
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1と同様にしてゲノム編集効率を評価した。本実施例で新たに用いるガイドRNA標的配列の配列番号、及び標的配列の組み込み（実施例1-2）に用いた1本鎖DNAの配列番号を以下の表2に示す。
Example 3: Genome editing efficiency evaluation test 3
The genome editing efficiency was evaluated in the same manner as in Example 1 except that nickase-type Cas9 was expressed as a Cas protein and the combination of the synonymous substitution site in the EGFP coding sequence of the donor vector and the guide RNA target sequence was changed. Table 2 below shows the sequence number of the guide RNA target sequence newly used in this example and the sequence number of the single-stranded DNA used for incorporation of the target sequence (Example 1-2).
結果を図３に示す。この結果より、ニッカーゼ型Casタンパク質を用いてゲノム編集効率をより高めるには、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列近傍（実施例3では332s）を標的とするガイドRNAと共に、ドナーベクターの任意の部位を標的とするガイドRNAを用いることが重要であることが示唆された。 The results are shown in FIG. From this result, in order to further improve genome editing efficiency using the nickase-type Cas protein, together with the guide RNA targeting the coding sequence near the mutation site of the non-fluorescent mutant EGFP (332s in Example 3), the donor vector It was suggested that it is important to use a guide RNA that targets any site.
実施例4：ゲノム編集効率の評価試験4
ドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び3と同様にしてゲノム編集効率を評価した。なお、本実施例では、新たにドナーベクターとして、1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列332sのPAM配列のみをCasタンパク質が認識できないように同義置換したものを用いた。
Example 4: Genome editing efficiency evaluation test 4
Genome editing efficiency was evaluated in the same manner as in Examples 1 and 3, except that the combination of the synonymous substitution site in the EGFP coding sequence of the donor vector and the guide RNA target sequence was changed. In the present example, a donor vector having a synonymous substitution so that the Cas protein cannot recognize only the PAM sequence of the target sequence 332s in the coding sequence of EGFP from which the first to third bases were deleted was used. .
結果を図４に示す。この結果より、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列近傍（実施例4では332s）を標的とするガイドRNAと共に用いるガイドRNAとして、ドナーベクターのEGFPコード配列（及び対象細胞内の非蛍光型変異EGFPコード配列）を標的とするガイドRNA、及びドナーベクター用プラスミド配列を標的とするガイドRNAのいずれを用いる場合であっても、Cas9野生型を用いた従来法よりもゲノム編集効率が高いことが示された。 The results are shown in FIG. From this result, as the guide RNA used together with the guide RNA targeting the coding sequence near the mutation site of non-fluorescent mutant EGFP (332s in Example 4), the EGFP coding sequence of the donor vector (and the non-fluorescent type in the target cell) Whether using guide RNA targeting mutant EGFP coding sequences) or guide RNA targeting plasmid vectors for donor vectors, genome editing efficiency is higher than conventional methods using Cas9 wild type It has been shown.
実施例5：ゲノム編集効率の評価試験5
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び4と同様にしてゲノム編集効率を評価した。なお、本実施例では、新たにドナーベクターとして、1〜128番目、1〜231番目、又は1〜3及び471〜720番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列332sのPAM配列のみをCasタンパク質が認識できないように同義置換したものを用いた。
Example 5: Genome editing efficiency evaluation test 5
Genomic editing efficiency was evaluated in the same manner as in Examples 1 and 4 except that nickase-type Cas9 was expressed as a Cas protein and the combination of the synonymous substitution site in the EGFP coding sequence of the donor vector and the guide RNA target sequence was changed. In this example, as a new donor vector, only the PAM sequence of the target sequence 332s in the coding sequence of EGFP from which the 1-128th, 1-231th, or 1-3 and 471-720th bases were deleted Was substituted synonymously so that the Cas protein could not be recognized.
結果を図５に示す。この結果より、対象細胞内の非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列のゲノム編集効率は、ドナーベクターにおける該変異部位の対応配列が5´側にも3´側にも長い程、高いことが示唆された。 The results are shown in FIG. From this result, the genome editing efficiency of the coding sequence of the mutation site of the non-fluorescent mutant EGFP in the target cell is higher as the corresponding sequence of the mutation site in the donor vector is longer on both the 5 ′ side and the 3 ′ side. Was suggested.
実施例6：ゲノム編集効率の評価試験6
ドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び3と同様にしてゲノム編集を行った。また、一部のサンプルについては、ゲノム編集を行って得られたEGFP陽性細胞に対して再度ゲノム編集を繰り返して、計3回のゲノム編集を行った。得られたEGFP細胞のゲノムDNAシーケンスを行い、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列のゲノム編集が両アリールで起こった細胞の割合、及び該ゲノム編集が起こっていないアリールにおいて、塩基の挿入又は欠失が起こった細胞の割合を算出した。
Example 6: Evaluation test 6 for genome editing efficiency
Genome editing was performed in the same manner as in Examples 1 and 3 except that the combination of the synonymous substitution site in the EGFP coding sequence of the donor vector and the guide RNA target sequence was changed. For some samples, genome editing was repeated for EGFP positive cells obtained by genome editing, and genome editing was performed three times in total. Performing genomic DNA sequencing of the obtained EGFP cells, the percentage of cells in which the genome editing of the coding sequence of the mutation site of the non-fluorescent mutant EGFP occurred in both aryls, and insertion of bases in the aryl where the genome editing did not occur Alternatively, the percentage of cells in which deletion occurred was calculated.
結果を以下の表３に示す。表３より、Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を用い、且つ非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列近傍（実施例6ではm332）を標的とするガイドRNAと共に、ドナーベクターの任意の部位を標的とするガイドRNAを用いると、従来方法（野生型（2本鎖切断型）Cas9を用い、且つガイドRNAの標的が1ヶ所である方法）に比べて、目的とするゲノム編集が両アリールで起こる効率が顕著に高く、さらに目的とするゲノム編集が起こっていないアリールにおける意図しない変異の割合が遥かに低いことが示された。 The results are shown in Table 3 below. From Table 3, it is possible to target any part of the donor vector together with a guide RNA that uses nickase-type Cas9 as the Cas protein and targets the vicinity of the coding sequence of the non-fluorescent mutant EGFP mutation site (m332 in Example 6). Compared to the conventional method (method using wild-type (double-strand break type) Cas9 and a single guide RNA target), the target genome editing efficiency occurs with both aryls. Was significantly higher, and the rate of unintentional mutations in aryls that did not undergo the targeted genome editing was shown to be much lower.
Claims (13)
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。 (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A genome editing method comprising a step of introducing at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof into a cell or a non-human organism.
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法。 (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A method for producing a genome-edited cell or non-human organism, comprising a step of introducing at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof into the cell or non-human organism.
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用組成物。 (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A composition for genome editing comprising at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof.
（b）ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
（c）前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
（d）前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用キット。 (A) at least one selected from the group consisting of guide RNA 1 targeting an arbitrary site of genomic DNA and its expression cassette;
(B) at least one selected from the group consisting of a nickase-type Cas protein and its expression cassette,
(C) a homologous sequence of an arbitrary sequence including the target site of the guide RNA 1 and including a sequence having a mutation in the guide RNA 1 target site, and (d) an arbitrary site in the donor DNA A genome editing kit comprising at least one selected from the group consisting of a target guide RNA 2 and an expression cassette thereof.
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