JP2016084297A

JP2016084297A - Lipid membrane structure

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Publication number: JP2016084297A
Application number: JP2014217011A
Authority: JP
Inventors: 原島　秀吉; Hideyoshi Harashima; 秀吉原島; 悠介佐藤; Yusuke Sato; 守兵藤; Mamoru Hyodo; 浩人畠山; Hiroto Hatakeyama; 小原　道法; Michinori Obara; 道法小原; 山本　直樹; Naoki Yamamoto; 直樹山本
Original assignee: Hokkaido University NUC; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Current assignee: Hokkaido University NUC; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-05-19
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: JP6384863B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a lipid membrane structure as a carrier which can efficiently delivery nucleic acid such as siRNA to cytoplasm of a liver parenchymal cell and the like.SOLUTION: The present invention provides a lipid membrane structure comprising a compound represented by formula (I) (R is a group represented by formula (A) or formula (B) (n is an integer of 2 to 4, m is an integer of 2 to 5)) as constituent lipid.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明はsiRNAなどの核酸を肝実質細胞の細胞質などに効率的に送達することができる脂質膜構造体に関する。 The present invention relates to a lipid membrane structure capable of efficiently delivering a nucleic acid such as siRNA to the cytoplasm of hepatocytes.

B型肝炎ウィルス(HBV)持続感染者は世界で約4億人存在すると推定されており、本邦におけるHBV感染率は1%に上る。感染後にウィルスの活動性が持続すると慢性肝炎から肝硬変、肝細胞がん、肝不全に進展する。現在、B型肝炎治療にはポリエチレングリコール(PEG)化インターフェロン(IFN)及び核酸アナログであるエンテカビルが用いられている。PEG化IFNは免疫賦活作用や高ウィルス作用を有し、セロコンバージョン例では高効率で効果が持続するものの、高頻度かつ多彩な副作用が生じることが大きな問題である。また、エンテカビルはウィルスの複製阻害によりHBV DNA量を減少させるものの、その薬効は投与の中止によって速やかに消失し、肝炎が再燃してしまうという問題がある。このような問題点から、従来とは異なるメカニズムの新規治療法の開発が強く望まれている。 It is estimated that there are about 400 million people with persistent hepatitis B virus (HBV) infection worldwide, and the HBV infection rate in Japan is 1%. If viral activity persists after infection, it progresses from chronic hepatitis to cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and liver failure. Currently, polyethylene glycol (PEG) interferon (IFN) and nucleic acid analog entecavir are used for the treatment of hepatitis B. PEGylated IFN has an immunostimulatory action and a high virus action. In the case of seroconversion, the effect is sustained with high efficiency, but a large problem is that frequent and various side effects occur. Entecavir reduces the amount of HBV DNA by inhibiting viral replication, but its medicinal effect disappears rapidly upon discontinuation of administration, causing hepatitis to relapse. Because of these problems, development of a novel treatment method with a mechanism different from the conventional one is strongly desired.

siRNAはRNA干渉により標的遺伝子がコードするタンパク質の合成を抑制する機能性核酸であり、迅速に分子設計が可能であることから、新規B型肝炎治療薬として期待されている。siRNAは塩基配列によって遺伝子抑制効果が大きく異なることから、HBV遺伝子発現を強力に抑制可能なsiRNA配列を見出すことが重要である。また、様々なHBVゲノタイプに対しても効果的な配列の設計も重要である。さらに、siRNAは親水性高分子化合物であるため、それ単独では細胞膜を透過できず、また、血中から速やかに腎排泄を受ける。そのため、siRNAをHBV感染細胞である肝実質細胞の細胞質へ効率的に送達可能なキャリアの開発が重要である。 siRNA is a functional nucleic acid that suppresses the synthesis of the protein encoded by the target gene by RNA interference, and is expected to be a novel therapeutic agent for hepatitis B because of its rapid molecular design. Since siRNA has greatly different gene suppression effects depending on the base sequence, it is important to find an siRNA sequence that can strongly suppress HBV gene expression. It is also important to design effective sequences for various HBV genotypes. Furthermore, since siRNA is a hydrophilic polymer compound, it cannot permeate cell membranes alone, and rapidly undergoes renal excretion from the blood. Therefore, it is important to develop a carrier that can efficiently deliver siRNA to the cytoplasm of hepatocytes that are HBV-infected cells.

shRNAを発現するウィルスベクターの開発が試みられているが、安全性に問題があり、大量製造が困難であるという問題もある。そのため、siRNAを標的細胞へ効率的に送達可能な人工キャリアの開発が盛んに行われている。ドラッグ・デリバリ・システム(DDS)としてリポソームなどの脂質膜構造体が汎用されおり、HBV標的siRNAを搭載したリポソーム型のキャリアについての報告もあるが、その効果は部分的である(Nature Biotechnol., 23, pp.1002-1007, 2005; Mol. Pharmaceutics, 6, pp.706-717, 2009)。これは、HBV感染細胞である肝実質細胞の細胞質へのsiRNA送達効率が不十分であることが原因であると考えられている。DDSとしての脂質膜構造体には、薬物などの送達すべき物質を保持する能力、生体内での安定性、物質を送達すべき特定の細胞(標的細胞)に対する選択性、標的細胞内への移行性、及び標的細胞内での物質の放出性等の様々な特性が求められるが、特に標的細胞の細胞質に核酸を送達するための脂質膜構造体には、標的細胞に対する選択性のほか、細胞内への優れた移行性が求められる。 Attempts have been made to develop viral vectors that express shRNA, but there are also problems with safety and the difficulty of mass production. Therefore, the development of artificial carriers capable of efficiently delivering siRNA to target cells has been actively conducted. Lipid membrane structures such as liposomes have been widely used as drug delivery systems (DDS), and there have been reports on liposome-type carriers loaded with HBV target siRNA, but the effect is partial (Nature Biotechnol., 23, pp. 1002-1007, 2005; Mol. Pharmaceutics, 6, pp. 706-717, 2009). This is thought to be due to insufficient efficiency of siRNA delivery to the cytoplasm of hepatocytes that are HBV-infected cells. Lipid membrane structures as DDS have the ability to hold substances to be delivered, such as drugs, stability in vivo, selectivity for specific cells (target cells) to which substances are to be delivered, Various properties such as transferability and release of a substance in the target cell are required. In particular, the lipid membrane structure for delivering a nucleic acid to the cytoplasm of the target cell is not only selective to the target cell, Excellent transferability into cells is required.

一方、人工siRNAキャリアとして使用可能な多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)が本発明者らにより報告されており、siRNA導入効率に優れるpH応答性カチオン性脂質YSK05(1-メチル-4,4-ビス[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ピペリジン)を脂質組成に含むYSK05-MENDが開発されている(J. Control. Release, 163, pp.267-276, 2012; Yakugaku Zasshi, 132, pp.1355-1363, 2012; YSK05については特開2013-245190号公報を参照のこと)。YSK05-MENDはin vivo肝臓において内因性遺伝子発現を投与量依存的に抑制し、ED₅₀で0.06 mg/kgを示す。しかしながら、YSK05-MENDの遺伝子抑制活性は、siRNA医薬をリードするAlnylam社のpH応答性脂質MC3を含むキャリアと比較して劣っている。 On the other hand, a multifunctional envelope nanostructure (MEND) that can be used as an artificial siRNA carrier has been reported by the present inventors, and is a pH-responsive cationic lipid YSK05 (1-methyl-4, YSK05-MEND containing 4-bis [(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dien-1-yloxy] piperidine) in the lipid composition has been developed (J. Control. Release, 163, pp.267- 276, 2012; Yakugaku Zasshi, 132, pp.1355-1363, 2012; For YSK05, see JP 2013-245190 A). YSK05-MEND is endogenous gene expression and dose-dependently inhibited the in vivo liver, indicating a 0.06 mg / kg in ED _50. However, the gene suppression activity of YSK05-MEND is inferior to that of carriers containing pH-responsive lipid MC3 from Alnylam, a leader in siRNA drugs.

上記のように、in vivoにおいてRNA干渉による強いHBV抑制活性を実現するためには、HBVに対する強力なsiRNAと、siRNAを肝実質細胞へ効率的に送達可能なキャリアを適切に組み合わせることで初めて実現可能であるが、現状でそのような報告例はほとんどない。なお、核酸を送達するためのキャリアとしての脂質膜構造体に使用可能な脂質化合物が国際公開WO 2011/143230に開示されている。 As described above, in order to achieve strong HBV inhibitory activity due to RNA interference in vivo, this is the first time realized by appropriately combining a powerful siRNA against HBV and a carrier that can efficiently deliver siRNA to hepatocytes. Although it is possible, there are few such reports at present. A lipid compound that can be used in a lipid membrane structure as a carrier for delivering a nucleic acid is disclosed in International Publication WO 2011/143230.

特開2013-245190号公報JP 2013-245190 A 国際公開WO 2011/143230International publication WO 2011/143230

Nature Biotechnol., 23, pp.1002-1007, 2005Nature Biotechnol., 23, pp.1002-1007, 2005 Mol. Pharmaceutics, 6, pp.706-717, 2009Mol. Pharmaceutics, 6, pp.706-717, 2009 J. Control. Release, 163, pp.267-276, 2012J. Control. Release, 163, pp.267-276, 2012 Yakugaku Zasshi, 132, pp.1355-1363, 2012Yakugaku Zasshi, 132, pp.1355-1363, 2012

本発明の課題は、siRNAなどの核酸を肝実質細胞の細胞質などに効率的に送達することができるキャリアーとしての脂質膜構造体を提供することにある。
また、本発明の別の課題は、上記の脂質膜構造体を用いて肝実質細胞内に薬剤、好ましくは核酸、さらに好ましくはsiRNAを送達し、肝臓疾患を予防及び／又は治療する手段を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a lipid membrane structure as a carrier capable of efficiently delivering a nucleic acid such as siRNA to the cytoplasm of hepatocytes.
Another object of the present invention is to provide a means for preventing and / or treating liver disease by delivering a drug, preferably a nucleic acid, more preferably siRNA into hepatocytes using the lipid membrane structure described above. There is to do.

先に説明したように、本発明者らはpH応答性カチオン性脂質YSK05を用いて肝実質細胞へのsiRNA導入効率に優れるYSK05-MENDを報告している(J. Control. Release, 163, pp.267-276, 2012; 特開2013-245190号公報)。本発明者らは肝実質細胞の細胞質内にさらに効率的にsiRNAを導入すべく鋭意研究を行ったところ、脂質化合物として下記の一般式(I)で表される化合物を脂質構成成分として用いると、脂質膜構造体にpH依存性カチオン性が付加され、細胞内に核酸などを極めて効率的に送達できることを見出した。また、この脂質膜構造体が、特に肝実質細胞の細胞質内に薬物や核酸、より好ましくはsiRNAを送達するためのキャリアとして優れた性質を有していることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。 As described above, the present inventors have reported YSK05-MEND having excellent siRNA introduction efficiency into hepatocytes using the pH-responsive cationic lipid YSK05 (J. Control. Release, 163, pp. .267-276, 2012; JP 2013-245190 A). The present inventors have conducted intensive research to introduce siRNA more efficiently into the cytoplasm of hepatocytes, and when using a compound represented by the following general formula (I) as a lipid component as a lipid component: The present inventors have found that a pH-dependent cationic property is added to a lipid membrane structure, so that nucleic acids and the like can be delivered into cells extremely efficiently. The present inventors have also found that this lipid membrane structure has excellent properties as a carrier for delivering drugs and nucleic acids, more preferably siRNA, particularly in the cytoplasm of hepatocytes. The present invention has been completed based on these findings.

すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
(式中、Rは式(A)で表される基又は式(B)で表される基：
(式中、nは2から4の整数を示し、mは2から5の整数を示す)を示す）で表される化合物、及び脂質膜構造体にpH依存性のカチオン性を付与するための上記化合物が提供される。好ましくはRは式(A)で表される基であり、nは2又は3である。 That is, according to the present invention, the following general formula (I):
(In the formula, R is a group represented by the formula (A) or a group represented by the formula (B):
(Wherein n represents an integer of 2 to 4 and m represents an integer of 2 to 5)), and a lipid membrane structure for imparting pH-dependent cationicity The above compounds are provided. Preferably R is a group represented by the formula (A), and n is 2 or 3.

また、本発明により、上記の一般式(I)で表される化合物を構成脂質として含む脂質膜構造体、及び送達すべき物質が内部に封入された上記の脂質膜構造体が提供される。送達すべき物質としては、核酸、例えば遺伝子を含む核酸やsiRNAなどの機能性核酸を用いることができ、送達の標的となる細胞としては肝実質細胞などが好ましい。 The present invention also provides a lipid membrane structure containing the compound represented by the above general formula (I) as a constituent lipid, and the above lipid membrane structure in which a substance to be delivered is encapsulated. As a substance to be delivered, a nucleic acid, for example, a functional nucleic acid such as a nucleic acid containing a gene or siRNA can be used, and a liver parenchymal cell or the like is preferable as a delivery target cell.

さらに、本発明により、肝実質細胞に核酸、好ましくはsiRNAなどの機能性核酸、さらに好ましくはB型肝炎に対する予防及び／又は治療効果を有するsiRNAを送達するために用いる上記の一般式(I)で表される化合物を構成脂質として含む脂質膜構造体が提供される。上記の脂質膜構造体の製造のために用いる上記の一般式(I)で表される化合物の使用も本発明により提供される。 Furthermore, according to the present invention, a nucleic acid, preferably a functional nucleic acid such as siRNA, more preferably siRNA having a preventive and / or therapeutic effect against hepatitis B is delivered to the hepatocytes according to the above general formula (I) A lipid membrane structure comprising a compound represented by the formula: The use of the compound represented by the above general formula (I) used for the production of the above lipid membrane structure is also provided by the present invention.

別の観点からは、肝実質細胞への物質の送達方法であって、送達すべき物質が内部に封入された上記の脂質膜構造体をヒトを含む哺乳類動物に投与する方法が本発明により提供される。送達すべき物質としては、核酸、例えば遺伝子を含む核酸やsiRNAなどの機能性核酸を用いることができ、送達の標的となる細胞としては肝実質細胞などが好ましい。 From another aspect, the present invention provides a method for delivering a substance to hepatocytes, wherein the above lipid membrane structure encapsulating the substance to be delivered is administered to mammals including humans. Is done. As a substance to be delivered, a nucleic acid, for example, a functional nucleic acid such as a nucleic acid containing a gene or siRNA can be used, and a liver parenchymal cell or the like is preferable as a delivery target cell.

さらに別の観点からは、B型肝炎の予防及び／又は治療のための医薬であって、B型肝炎に対する予防及び／又は治療効果を有するsiRNAが内部に封入された上記の脂質膜構造体を含む医薬；B型肝炎の予防及び／又は治療方法であって、B型肝炎に対する予防及び／又は治療効果を有するsiRNAが内部に封入された上記の脂質膜構造体をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。 From another point of view, there is provided a medicament for the prevention and / or treatment of hepatitis B, wherein the above-mentioned lipid membrane structure in which siRNA having a prevention and / or treatment effect on hepatitis B is encapsulated is contained. A medicament comprising: a method for the prevention and / or treatment of hepatitis B, wherein the above lipid membrane structure encapsulating siRNA having a preventive and / or therapeutic effect against hepatitis B is administered to mammals including humans A method comprising the steps of:

本発明の一般式(I)で表される化合物を脂質膜構造体の構成脂質として使用することにより、脂質膜構造体にpH依存性のカチオン性を付与することができる。pH依存性のカチオン性を付与された脂質膜構造体は、pHの低下に伴って生体膜との膜融合能が向上する性質を有しており、標的細胞の細胞質内に取り込まれた後にエンドソーム膜と効率的に膜融合して、細胞質内に送達すべき物質を効率的に放出することができる。また、本発明の脂質膜構造体は脂質膜pKaが低いことから肝実質細胞内に効率的に移行することができることから、送達すべき物質としてsiRNAを内包させておくことにより、効率的にsiRNAを肝実質細胞の細胞質に送達することが可能になる。例えば、B型肝炎に対する予防及び／又は治療効果を有するsiRNAが内部に封入された本発明の脂質膜構造体を用いて該siRNAを肝実質細胞の細胞質内に送達することにより、B型肝炎を予防及び／又は治療することが可能になる。 By using the compound represented by the general formula (I) of the present invention as a constituent lipid of the lipid membrane structure, a pH-dependent cationic property can be imparted to the lipid membrane structure. Lipid membrane structures with pH-dependent cationic properties have the property of improving membrane fusion ability with biological membranes as pH decreases, and after being incorporated into the cytoplasm of target cells, endosomes Efficient membrane fusion with the membrane can efficiently release the substance to be delivered into the cytoplasm. In addition, since the lipid membrane structure of the present invention has a low lipid membrane pKa, it can efficiently migrate into hepatocytes, so that siRNA can be efficiently contained by encapsulating it as a substance to be delivered. Can be delivered to the cytoplasm of hepatocytes. For example, hepatitis B can be prevented by delivering the siRNA into the cytoplasm of hepatocytes using the lipid membrane structure of the present invention in which siRNA having a preventive and / or therapeutic effect against hepatitis B is encapsulated. It becomes possible to prevent and / or treat.

実施例で製造した脂質膜構造体の脂質膜pKaを示した図である。It is the figure which showed the lipid membrane pKa of the lipid membrane structure manufactured in the Example. 肝実質細胞特異的遺伝子である第7凝固因子(FVII)に対するsiRNA(siFVII)を封入したYSK13-MEND又はYSK15-MENDをICRマウスに静脈内投与し、48 hr後に採血して血漿中FVII酵素活性を測定した結果を示した図である。YSK13-MEND or YSK15-MEND encapsulating siRNA (siFVII) against the seventh coagulation factor (FVII), a hepatocyte-specific gene, was intravenously administered to ICR mice, and blood was collected 48 hours later and plasma FVII enzyme activity It is the figure which showed the result of having measured. Cy5標識siRNA又はDiDで蛍光標識したYSK13-MENDをICRマウスに静脈内投与し、30 min後の肝臓、肺、腎臓、脾臓を回収して、各組織ホモジネート中のCy5(A)又はDiD(B)由来の蛍光強度を測定してYSK13-MENDの各組織への移行量を評価した結果を示した図である。YSK13-MEND fluorescently labeled with Cy5-labeled siRNA or DiD was intravenously administered to ICR mice, and the liver, lung, kidney, and spleen after 30 min were collected, and Cy5 (A) or DiD (B ) -Derived fluorescence intensity was measured to show the result of evaluating the amount of YSK13-MEND transferred to each tissue. Cy5標識siRNA封入YSK13-MENDをICRマウスに静脈内投与し、25 min後にFITC標識イソレクチンB4を40μg/mouseで静脈内投与し、さらに5 min後に肝臓を回収してHoechst33342で核染色後に共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてsiRNAの肝臓内分布を観察した結果を示した図である。Cy5-labeled siRNA-encapsulated YSK13-MEND was intravenously administered to ICR mice, 25 minutes later, FITC-labeled isolectin B4 was intravenously administered at 40 μg / mouse, and the liver was collected 5 minutes later, followed by nuclear staining with Hoechst33342 and confocal laser It is the figure which showed the result of having observed the distribution in the liver of siRNA using the scanning microscope. YSK13-C3-MENDをICRマウスに静脈内投与し、24時間後に血液を回収して血清中のAST及びALT活性を定量して肝毒性を評価した結果を示した図である。It is the figure which showed the result of having administered YSK13-C3-MEND intravenously to an ICR mouse | mouth, collect | recovering blood 24 hours later, and quantifying AST and ALT activity in serum, and evaluating hepatotoxicity. siRNAの合成にあたり16種類の遺伝子配列を比較して高度に保存している領域を選択して標的領域の設定する手法を示した図である。It is the figure which showed the method of selecting the area | region highly preserve | saved by comparing 16 types of gene sequences in the synthesis | combination of siRNA, and setting a target area | region. HBV-siRNAsを封入したYSK13-C3-MENDをHBVが持続感染しているヒト肝臓キメラマウス初代培養肝細胞へ1回添加し、siRNA添加後4、7、11、及び14日目の培養上清中HBs抗原、HBe抗原、HBV-DNA量の変化を定量してHBV阻害活性を評価した結果を示した図である。YSK13-C3-MEND encapsulated with HBV-siRNAs was added once to primary cultured hepatocytes of human liver chimera mice that were persistently infected with HBV, and culture supernatants at 4, 7, 11, and 14 days after addition of siRNA It is the figure which showed the result of having quantified the change of the amount of middle HBs antigen, HBe antigen, and HBV-DNA, and evaluating HBV inhibitory activity. HBV-siRNAsを3種類(si758、si1804、si2460)混合してYSK13-C3-MENDに封入し、遺伝子型CのHBVが持続感染しているヒト肝臓キメラマウスに1回投与し、そのHBV阻害活性および毒性を評価した結果を示した図である。3 types of HBV-siRNAs (si758, si1804, si2460) mixed and enclosed in YSK13-C3-MEND, once administered to human liver chimeric mice that are persistently infected with genotype C HBV, and their HBV inhibitory activity It is the figure which showed the result of having evaluated toxicity.

本発明の脂質膜構造体を構成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸などが挙げられるが、これらに限定されることはない。 Examples of the lipid constituting the lipid membrane structure of the present invention include, but are not limited to, phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.

リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸などを挙げることができ、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。 Examples of phospholipids and phospholipid derivatives include phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol phosphate, 1 , 2-dimyristoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, phosphatidic acid and the like, and these can be used alone or in combination of two or more. Fatty acid residues in these phospholipids are not particularly limited, and examples thereof include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 20 carbon atoms. Specific examples include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearin Mention may be made of acyl groups derived from fatty acids such as acids, oleic acid and linoleic acid. Moreover, phospholipids derived from natural products such as egg yolk lecithin and soybean lecithin can also be used.

糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）などが挙げられる。 Examples of the glycolipid include glyceroglycolipid (eg, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), sphingoglycolipid (eg, galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside) and the like. Can be mentioned.

ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）などが挙げられる。 Examples of sterols include animal-derived sterols (for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterol) (for example, stigmasterol, sitosterol, campesterol, Brush castrol), sterols derived from microorganisms (for example, timosterol, ergosterol) and the like.

飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。また、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどの飽和又は不飽和の脂肪族アルコールを用いることもできる。さらに、モノアシルグリセリドなどのグリセリン脂肪酸エステル、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライドなどのカチオン性脂質、両帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質などを用いてもよい。脂質膜構造体に使用可能な脂質類などについては、特開2013-245190号公報に具体例が挙げられている。上記公開公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。 Examples of the saturated or unsaturated fatty acid include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid. In addition, saturated or unsaturated aliphatic alcohols such as oleyl alcohol, stearyl alcohol, lauryl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol, and linoleyl alcohol can also be used. Furthermore, glycerin fatty acid esters such as monoacylglycerides, cationic lipids such as dioctadecyldimethylammonium chloride, neutral lipids including bi-charged lipids and uncharged lipids, and the like may be used. Specific examples of lipids that can be used in the lipid membrane structure are described in JP-A-2013-245190. The entire disclosure of the above publication is incorporated herein by reference.

脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション、W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の好ましい形態としてリポソームを挙げることができる。以下、本発明の脂質膜構造体の好ましい態様としてリポソームについて説明する場合があるが、本発明の脂質膜構造体はリポソームに限定されることはない。 The form of the lipid membrane structure is not particularly limited. For example, as a form dispersed in an aqueous solvent, a single membrane liposome, a multilamellar liposome, an O / W emulsion, a W / O / W emulsion, a spherical micelle, a string micelle Or an irregular layered structure. A preferred form of the lipid membrane structure of the present invention is a liposome. Hereinafter, although a liposome may be described as a preferred embodiment of the lipid membrane structure of the present invention, the lipid membrane structure of the present invention is not limited to liposomes.

脂質膜構造体の表面をポリアルキレングリコールで修飾することによりリポソームの血中滞留性を高めることができる。その手段については、例えば、特開平1-249717号公報、特開平2-149512号公報、特開平4-346918号公報、特開2004-10481号公報などに記載されている。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば300〜10,000程度、好ましくは500〜10,000、さらに好ましくは1,000〜5,000程度である。 By modifying the surface of the lipid membrane structure with polyalkylene glycol, the retention in the blood of the liposome can be enhanced. The means is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-249717, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-149512, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-346918, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-10481, and the like. As polyalkylene glycol, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol and the like can be used. The molecular weight of the polyalkylene glycol is, for example, about 300 to 10,000, preferably about 500 to 10,000, and more preferably about 1,000 to 5,000.

ポリアルキレングリコールによる脂質膜構造体の表面修飾は、例えばポリアルキレングリコール修飾脂質を脂質膜構成脂質として用いて脂質膜構造体を構築することにより容易に行なうことができる。例えば、ポリエチレングリコールによる修飾を行う場合にはステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸PEG45(STR-PEG45)など）を用いることができる。その他、N-[カルボニル−メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、n-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-750]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン、N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000]-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミンなどのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール化脂質はこれらに限定されることはない。 Surface modification of a lipid membrane structure with polyalkylene glycol can be easily performed by constructing a lipid membrane structure using, for example, a polyalkylene glycol-modified lipid as a lipid membrane constituent lipid. For example, when the modification with polyethylene glycol is performed, stearyl polyethylene glycol (for example, PEG45 stearate (STR-PEG45) or the like) can be used. Others, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000] -1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, n- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000] -1,2-dipalmitoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-750] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol -2000] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, N- [carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-5000] -1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol Polyethylene glycol derivatives such as amines can also be used, but polyalkylene glycolated lipids are not limited to these.

本発明の脂質膜構造体の製造にあたり、標的細胞選択性リガンドを結合させた上記ポリアルキレングリコールを用いることもできる。ポリアルキレングリコールによる表面修飾を行うにあたり、使用するポリアルキレングリコールの全部又はその一部のポリアルキレングリコールに標的細胞選択性リガンドを結合させることができる。ポリアルキレングリコールに標的細胞選択性リガンドを結合させる位置は特に限定されないが、好ましくはポリアルキレングリコールの先端部分である。本明細書においてポリアルキレングリコールの「先端部」とは、ポリアルキレングリコールの両末端のうち、脂質膜構造体に結合していない側の末端付近を意味している。一般的には直鎖状のポリアルキレングリコールの末端部分、あるいは分枝鎖状のポリアルキレングリコールについては主鎖又は側鎖の末端部分に標的細胞選択性リガンドを結合することができる。標的細胞選択性リガンドは1個のポリアルキレングリコールに複数個結合していてもよい。 In the production of the lipid membrane structure of the present invention, the above polyalkylene glycol combined with a target cell selective ligand can also be used. In performing surface modification with polyalkylene glycol, the target cell-selective ligand can be bound to all or part of the polyalkylene glycol used. The position at which the target cell selective ligand is bound to the polyalkylene glycol is not particularly limited, but is preferably the tip portion of the polyalkylene glycol. In the present specification, the “tip portion” of the polyalkylene glycol means the vicinity of the end of the polyalkylene glycol that is not bonded to the lipid membrane structure. In general, a target cell-selective ligand can be bound to the terminal portion of a linear polyalkylene glycol, or to the terminal portion of the main chain or side chain of a branched polyalkylene glycol. A plurality of target cell selective ligands may be bound to one polyalkylene glycol.

標的細胞選択性リガンドをポリアルキレングリコールに結合する手段は特に限定されないが、例えばステアリル化ポリエチレングリコールなど適当なリン脂質が縮合したポリアルキレングリコールの末端にマレイミド基を導入しておき、そのマレイミド基に対して標的細胞選択性リガンドのチオール基、アミノ基、又は水酸基などの反応性官能基を反応させることができる。標的細胞選択性リガンドとしてオリゴペプチドを用いる場合には、例えば、オリゴペプチドのN末端又はC末端のシステイン(Cys)残基のチオール基を反応させることが好ましい。その典型的な反応例を本明細書の実施例に示した。例えば、J. Pharm., 281, pp.25-33, 2004にはトランスフェリンを結合したPEGで修飾したリポソームが開示されており、J. Pharm., 342, 194-200, 2007にはFab化抗体を結合したPEGで修飾したリポソームが開示されているので、これらの刊行物を参照することにより、当業者は容易ににPEGにリガンドを結合して脂質膜構造体を修飾することができる。標的細胞選択性リガンドの結合量は特に限定されず、リガンド及びレセプターの種類、リガンドとレセプターとの結合力、結合特異性、標的細胞の種類、送達すべき物質の種類などに応じて適宜選択することが可能であり、例えば本明細書の実施例に記載された具体的な手法により任意のリガンドについて適宜の修飾量を決定することができる。例えば標的細胞選択性リガンドを結合したポリアルキレングリコールの修飾量を10〜15 mol%程度とすることにより好ましい結果が得られる場合がある。 The means for binding the target cell selective ligand to the polyalkylene glycol is not particularly limited. For example, a maleimide group is introduced at the terminal of the polyalkylene glycol condensed with an appropriate phospholipid such as stearyl polyethylene glycol, and the maleimide group is bonded to the maleimide group. On the other hand, a reactive functional group such as a thiol group, amino group, or hydroxyl group of the target cell selective ligand can be reacted. When an oligopeptide is used as the target cell-selective ligand, for example, it is preferable to react with a thiol group of a cysteine (Cys) residue at the N-terminus or C-terminus of the oligopeptide. The typical reaction example was shown in the Example of this specification. For example, J. Pharm., 281, pp. 25-33, 2004 discloses liposomes modified with PEG conjugated with transferrin, and J. Pharm., 342, 194-200, 2007 discloses Fab-modified antibodies. Since PEG-modified liposomes with a thiol bond are disclosed, by referring to these publications, those skilled in the art can easily modify a lipid membrane structure by binding a ligand to PEG. The binding amount of the target cell selective ligand is not particularly limited, and is appropriately selected according to the type of ligand and receptor, the binding force between the ligand and the receptor, the binding specificity, the type of target cell, the type of substance to be delivered, etc. For example, an appropriate modification amount can be determined for any ligand by the specific technique described in the examples of the present specification. For example, a preferable result may be obtained by setting the modification amount of the polyalkylene glycol to which the target cell selective ligand is bound to about 10 to 15 mol%.

本明細書において、「標的細胞」とは本発明の脂質膜構造体を用いて核酸や医薬などの物質を送達すべき標的となる細胞を意味している。標的細胞の種類は特に限定されず、送達すべき物質の種類や物質送達の目的などに応じて、適宜の細胞を標的とすることができる。例えば、標的細胞は組織や臓器を形成する細胞であってもよく、あるいは白血病細胞のように単独で存在する細胞であってもよい。固形がん細胞のように正常組織に腫瘍を形成している細胞やリンパ組織や他の組織に浸潤している細胞などであってもよい。本発明において好ましい標的細胞は、肝実質細胞である。 In the present specification, the “target cell” means a target cell to which a substance such as a nucleic acid or a drug is to be delivered using the lipid membrane structure of the present invention. The type of the target cell is not particularly limited, and an appropriate cell can be targeted according to the type of substance to be delivered and the purpose of substance delivery. For example, the target cell may be a cell that forms a tissue or an organ, or may be a cell that exists alone, such as a leukemia cell. It may be a cell forming a tumor in a normal tissue such as a solid cancer cell, a cell infiltrating a lymphoid tissue, or other tissue. Preferred target cells in the present invention are hepatocytes.

本発明の脂質膜構造体には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びpH感受性機能などのいずれか1つ又は2つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、例えば遺伝子を含む核酸などを内包する脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓などの細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質膜構造体を脱出させて細胞質内に移行させることができ、さらには核内において高い遺伝子発現活性を達成することも可能になる場合がある。このような手段については、例えば、国際公開WO2111/135905及び国際公開WO2013/140643などに具体的に記載されている。これらの国際公開の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。 The lipid membrane structure of the present invention can be provided with any one function or two or more functions such as a temperature change sensitivity function, a membrane permeation function, a gene expression function, and a pH sensitivity function. By appropriately adding these functions, for example, the retention of a lipid membrane structure containing a nucleic acid containing a gene in blood is improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen is reduced. At the same time, after endocytosis in the target cell, the lipid membrane structure can be efficiently escaped from the endosome and transferred into the cytoplasm, and further, high gene expression activity can be achieved in the nucleus. There is. Such means are specifically described in, for example, International Publication WO2111 / 135905 and International Publication WO2013 / 140643. All of these internationally disclosed disclosures are incorporated herein by reference.

本発明の脂質膜構造体は、構成脂質として上記の一般式(I)で表される化合物を含むことを特徴としている。一般式(I)で表される化合物は、本明細書の実施例に具体的に示した方法に従って当業者が容易に入手できる化合物である。一般式(I)で表される化合物は酸付加塩の形態で調製されてもよい。また、水和物や溶媒和物の形態で調製される場合もある。一般式(I)で表される化合物において、Rは式(A)又は(B)で表される基を示し、nは2〜4の整数を示し、mは2〜5の整数を示すが、好ましくはRは式(A)で表される基であり、nは2又は3である。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、一般式(I)で表される化合物は各炭化水素鎖に2つの不飽和結合を有し、2つの炭化水素鎖同士が炭素-炭素二重結合を介して結合することで疎水性部位の立体的嵩高さが強調されるという特徴があり、この構造的な特徴により、この化合物を構成脂質として含む脂質膜構造体はエンドソーム膜と効率的に膜融合することが可能となる。また、疎水性部位と親水性部位とをつなぐリンカーであるエステル結合と、第3級アミンとをつなぐ炭素鎖の炭素数が異なることで、様々な脂質膜pKaを示すという特徴がある。 The lipid membrane structure of the present invention is characterized by containing a compound represented by the above general formula (I) as a constituent lipid. The compound represented by the general formula (I) is a compound that can be easily obtained by those skilled in the art according to the methods specifically shown in the examples of the present specification. The compound represented by the general formula (I) may be prepared in the form of an acid addition salt. Moreover, it may be prepared in the form of a hydrate or a solvate. In the compound represented by the general formula (I), R represents a group represented by the formula (A) or (B), n represents an integer of 2 to 4, and m represents an integer of 2 to 5. R is preferably a group represented by the formula (A), and n is 2 or 3. Without being bound by any particular theory, the compound of general formula (I) has two unsaturated bonds in each hydrocarbon chain, and the two hydrocarbon chains are carbon-carbon double bonds. The steric bulk of the hydrophobic site is emphasized by binding via a lipid, and due to this structural feature, the lipid membrane structure containing this compound as a constituent lipid can be efficiently membraned with the endosomal membrane. It becomes possible to merge. In addition, there is a feature that various lipid membranes pKa are exhibited by the difference in the number of carbon atoms of the carbon chain that connects the tertiary amine and the ester bond that is a linker that connects the hydrophobic part and the hydrophilic part.

本発明の脂質膜構造体において、一般式(I)で表される化合物を1種又は2種以上組み合わせて用いてもよい。脂質構造体の脂質膜を一般式(I)で表される化合物だけで構成することも可能であるが、一般的には上記に説明した脂質との適宜の組み合わせにより脂質膜を構成することが好ましい。例えば、構成脂質の全モル量に対して一般式(I)で表される化合物の割合が20〜90モル％程度とすることができ、より好ましくは 45〜75モル％程度であり、所望のpH依存性カチオン性が十分に付与されることを指標にして配合量を決定することもできる。脂質膜構造体がpH依存性カチオン性を有するか否かは、定法に従って確認することができるが、例えば、負荷電性のTNS試薬を用いて簡便に確認することができる。TNS試薬はカチオン性の脂質膜に入り込んで蛍光を発する試薬である。種々のpHとなるよう調製した緩衝液中で脂質膜構造体とTNS試薬とを混合した後、緩衝液の蛍光強度を測定することにより、測定した蛍光強度と緩衝液のpHとの相関関係を確認し、pHが小さいほど蛍光強度が大きい場合は、当該脂質膜構造体がpH依存性カチオン性を有すると判断することができる。 In the lipid membrane structure of the present invention, the compounds represented by the general formula (I) may be used alone or in combination of two or more. Although it is possible to construct the lipid membrane of the lipid structure only with the compound represented by the general formula (I), it is generally possible to construct the lipid membrane by an appropriate combination with the lipid described above. preferable. For example, the ratio of the compound represented by the general formula (I) to the total molar amount of the constituent lipid can be about 20 to 90 mol%, more preferably about 45 to 75 mol%, The blending amount can also be determined by using as an index that the pH-dependent cationic property is sufficiently imparted. Whether or not the lipid membrane structure has pH-dependent cationicity can be confirmed according to a conventional method, but can be easily confirmed using, for example, a negatively charged TNS reagent. The TNS reagent is a reagent that enters a cationic lipid membrane and emits fluorescence. After mixing the lipid membrane structure and TNS reagent in buffers prepared to have various pHs, the fluorescence intensity of the buffer solution is measured to determine the correlation between the measured fluorescence intensity and the pH of the buffer solution. When the fluorescence intensity increases as the pH decreases, it can be determined that the lipid membrane structure has pH-dependent cationic properties.

多機能性を付加したエンベロープ型ナノ構造体（MEND）が知られており、本発明の脂質膜構造体として好適に使用することができる。MENDは、例えば、プラスミドDNAなどの核酸とプロタミンなどのカチオン性ポリマーとの複合体をコアとし、このコアがリポソーム形態の脂質エンベロープ膜の内部に封入された構造を有している。MENDの脂質エンベロープ膜には、必要に応じてpH応答性や膜透過性を調節するためのペプチドを配置することができ、脂質エンベロープ膜の外側表面はポリエチレングリコールなどのアルキレングリコールで修飾することができる。MENDの脂質エンベロープの内部には、凝縮化されたDNA及びカチオン性ポリマーが封入されており、効率的に遺伝子発現を達成できるように設計されている。本発明に好適に使用可能なMENDとしては、所望の遺伝子を組み込んだプラスミドDNAとプロタミンとの複合体が内部に封入され、脂質エンベロープの外側表面がオリゴ糖結合PEGで修飾されたMENDが好ましい。また、siRNAを内包し、pH応答性カチオン性脂質YSK05を脂質組成に含むYSK05-MENDが開発されている(J. Control. Release, 163, pp.267-276, 2012; Yakugaku Zasshi, 132, pp.1355-1363, 2012)。本発明の脂質膜構造体の製造にあたっては、YSK05-MENDを開示した上記刊行物を参照することができる。MENDについては、例えばDrug Delivery System, 22-2, pp.115-122, 2007などの総説を参照することができる。上記刊行物の開示及びこの総説において引用された全ての文献の開示を参照により本明細書の開示として含める。 Envelope-type nanostructures (MEND) with multi-functionality are known and can be suitably used as the lipid membrane structure of the present invention. MEND, for example, has a structure in which a core is a complex of a nucleic acid such as plasmid DNA and a cationic polymer such as protamine, and the core is enclosed in a lipid envelope membrane in the form of a liposome. MEND lipid envelope membranes can be equipped with peptides to adjust pH responsiveness and membrane permeability as needed, and the outer surface of lipid envelope membranes can be modified with alkylene glycols such as polyethylene glycol. it can. Inside the lipid envelope of MEND, condensed DNA and cationic polymer are encapsulated, and designed to achieve efficient gene expression. As the MEND that can be suitably used in the present invention, a MEND in which a complex of plasmid DNA incorporating a desired gene and protamine is encapsulated inside and the outer surface of the lipid envelope is modified with oligosaccharide-conjugated PEG is preferable. In addition, YSK05-MEND that contains siRNA and contains pH-responsive cationic lipid YSK05 in the lipid composition has been developed (J. Control. Release, 163, pp. 267-276, 2012; Yakugaku Zasshi, 132, pp .1355-1363, 2012). For the production of the lipid membrane structure of the present invention, reference can be made to the above-mentioned publication that discloses YSK05-MEND. For MEND, refer to reviews such as Drug Delivery System, 22-2, pp.115-122, 2007. The disclosures of the above publications and the disclosures of all documents cited in this review are hereby incorporated by reference.

脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒（例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など）に分散された形態やこの水性分散物を凍結乾燥した形態などが挙げられる。 The form of the lipid membrane structure is not particularly limited, and examples thereof include a form dispersed in an aqueous solvent (for example, water, physiological saline, phosphate buffered physiological saline, etc.) and a form obtained by lyophilizing this aqueous dispersion. It is done.

脂質膜構造体の製造方法も特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームの場合には粒子径が50 nmから5μm程度であり、50 nmから400 nm程度が好ましく、50 nmから300 nm程度が好ましい。例えば抗腫瘍剤などの医薬を内包したリポソームでは粒子径が200 nmから400 nm程度であることが好ましい場合があり、粒子径が300 nm程度であることが特に好ましい場合がある。また、粒子径として150 nmから250 nm程度がさらに好ましい場合もある。粒子径は、例えばDLS(dynamic light scattering)法により測定することができる。 The method for producing the lipid membrane structure is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art can be adopted. For example, all the lipid components are dissolved in an organic solvent such as chloroform, and after forming a lipid film by drying under reduced pressure with an evaporator or spray drying with a spray dryer, the above mixture is dried with an aqueous solvent. And further emulsifying with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsifier. Moreover, it can manufacture also by the method well-known as a method of manufacturing a liposome, for example, a reverse phase evaporation method etc. When it is desired to control the size of the lipid membrane structure, extrusion (extrusion filtration) may be performed under high pressure using a membrane filter having a uniform pore size. The size of the lipid membrane structure in a dispersed state is not particularly limited. For example, in the case of liposome, the particle diameter is about 50 nm to 5 μm, preferably about 50 nm to 400 nm, and about 50 nm to 300 nm. Is preferred. For example, in a liposome encapsulating a medicine such as an antitumor agent, the particle size may be preferably about 200 nm to 400 nm, and the particle size may be particularly preferably about 300 nm. In some cases, the particle size is more preferably about 150 nm to 250 nm. The particle diameter can be measured by, for example, DLS (dynamic light scattering) method.

水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のpHを弱酸性から中性付近（pH3.0から8.0程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。 The composition of the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, and a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, a medium for cell culture, and the like. Can do. These aqueous solvents (dispersion media) can stably disperse lipid membrane structures, but also glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharides, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose. , Disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol (aqueous solutions), glycerin, diglycerin, poly Glycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether, diethylene glycol -Alkyl ether, 1,3-polyhydric alcohol (aqueous solution), such as butylene glycol and the like may be added. In order to stably store the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is desirable to eliminate the electrolyte in the aqueous solvent as much as possible from the viewpoint of physical stability such as aggregation suppression. From the viewpoint of chemical stability of the lipid, it is desirable to set the pH of the aqueous solvent from weakly acidic to neutral (about pH 3.0 to 8.0) and / or to remove dissolved oxygen by nitrogen bubbling or the like. .

得られた脂質膜構造体の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。 When the aqueous dispersion of the obtained lipid membrane structure is freeze-dried or spray-dried, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, inositol, ribose, xylose sugar monosaccharide, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose Stability can be improved by using disaccharides such as maltose, trisaccharides such as raffinose and merezinose, polysaccharides such as cyclodextrin, sugars such as erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, and maltitol (aqueous solutions) There is a case. When the aqueous dispersion is frozen, for example, the saccharides, glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ether If a polyhydric alcohol (aqueous solution) such as diethylene glycol monoalkyl ether or 1,3-butylene glycol is used, stability may be improved.

本発明の脂質膜構造体、例えばリポソームの内部には、標的細胞の細胞質内に送達すべき物質を内包させることができる。内包すべき物質の種類は特に限定されないが、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤などの任意の医薬の有効成分のほか、糖類、ペプチド類、核酸類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を内包させることができる。本発明の脂質膜構造体のうち、特に核酸類を内包する脂質膜構造体が好ましいが、核酸類としてはDNA又はRNAのほか、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸(PNA)やホスホロチオエートDNAなど）が包含される。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、線状又は環状のいずれであってもよい。核酸には遺伝子が含まれていてもよい。遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、DNA、又はRNAのいずれでもよく、特に形質転換などのイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、相同組換え用の正常遺伝子などの遺伝子治療用遺伝子などを挙げることができる。治療用の核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、酵素、サイトカインなどの生理活性物質をコードする遺伝子のほか、遺伝子の発現を調節する機能を有する核酸、例えばsiRNAなどのRNAなどを含む機能性核酸を用いることもでき、これらも本明細書における核酸の用語に含める。本明細書において「核酸」の用語は最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 A substance to be delivered into the cytoplasm of a target cell can be encapsulated in the lipid membrane structure of the present invention, for example, a liposome. The type of substance to be encapsulated is not particularly limited, but in addition to any active pharmaceutical ingredients such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antiviral agents, sugars, peptides, nucleic acids, low molecular weight compounds, metals Any substance such as a compound can be included. Among the lipid membrane structures of the present invention, lipid membrane structures that encapsulate nucleic acids are particularly preferred, but as nucleic acids, in addition to DNA or RNA, analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acids (PNA) and phosphorothioates) DNA etc.) are included. The nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular. The nucleic acid may contain a gene. The gene may be any of oligonucleotide, DNA, or RNA. In particular, a gene for introduction in vitro such as transformation, a gene that acts by expression in vivo, for example, normal for homologous recombination Examples include genes for gene therapy such as genes. Examples of therapeutic nucleic acids include genes encoding physiologically active substances such as antisense oligonucleotides, antisense DNAs, antisense RNAs, enzymes and cytokines, as well as nucleic acids having a function of regulating gene expression, such as siRNAs. Functional nucleic acids including RNA and the like can also be used, and these are also included in the term nucleic acid in the present specification. In this specification, the term “nucleic acid” should be interpreted in the broadest sense, and should not be interpreted in a limited way in any sense.

本発明の脂質膜構造体をB型肝炎の予防及び／又は治療のための医薬組成物として使用する場合には、B型肝炎の予防及び／又は治療を可能にするsiRNAを内包させることが好ましい。例えば、効率的なB型肝炎ウイルス(HBV)抑制を達成するため、多種類のHBV遺伝子配列の比較から高度に保存されている領域を見いだし、それらの領域を標的とするsiRNAを作製することができる。本明細書の実施例にその具体的な手法を示した。本発明の脂質膜構造体にはB型肝炎の予防及び／又は治療を可能にするsiRNAを2種以上組み合わせて内包させてもよい。 When the lipid membrane structure of the present invention is used as a pharmaceutical composition for prevention and / or treatment of hepatitis B, it is preferable to include siRNA that enables prevention and / or treatment of hepatitis B. . For example, in order to achieve efficient hepatitis B virus (HBV) suppression, it is possible to find highly conserved regions from a comparison of many types of HBV gene sequences and to create siRNAs targeting those regions. it can. The specific method was shown in the Example of this specification. The lipid membrane structure of the present invention may contain a combination of two or more siRNAs capable of preventing and / or treating hepatitis B.

また、本発明の脂質膜構造体に核酸を封入する場合には、核酸導入機能を有する化合物を加えることもできる。このような化合物としては、例えば、O,O'-N-ジドデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジテトラデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジヘキサデカノイル-N-(α−トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O'-N-ジオクタデセノイル-N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジエタノールアミンクロリド、O,O',O''-トリデカノイル-N-(ω-トリメチルアンモニオデカノイル)アミノメタンブロミド及びN-[α-トリメチルアンモニオアセチル]-ジドデシル-D-グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキサミド）エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、3-β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロールなどを挙げることができる。これらの核酸導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜の任意の位置に配置されていてもよく、及び／又は脂質膜構造体の内部に充填されていてもよい。 Moreover, when encapsulating a nucleic acid in the lipid membrane structure of the present invention, a compound having a nucleic acid introduction function can also be added. Examples of such compounds include O, O′-N-didodecanoyl-N- (α-trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O′-N-ditetradecanoyl-N- (α-trimethyl). Ammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O'-N-dihexadecanoyl-N- (α-trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O'-N-dioctadecenoyl-N- ( α-trimethylammonioacetyl) -diethanolamine chloride, O, O ', O' '-tridecanoyl-N- (ω-trimethylammoniodecanoyl) aminomethane bromide and N- [α-trimethylammonioacetyl] -didodecyl- D-glutamate, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl) -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate, 1 , 2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide, 3-β- [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol and the like. These compounds having a nucleic acid introduction function may be arranged at any position of the membrane of the lipid membrane structure and / or filled in the lipid membrane structure.

例えば、B型肝炎の予防及び／又は治療を可能にするsiRNAを内包させた本発明の脂質膜構造体は、標的細胞である肝実質細胞の細胞質内にsiRNAを効率的に送達することができるので、この脂質膜構造体をヒトを含む哺乳類動物に投与することにより、肝実質細胞の細胞質内にsiRNAを効率的に送達して、B型肝炎の予防及び／又は治療を達成することができる。投与方法は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、静脈内投与がさらに好ましい。本発明の脂質膜構造体を医薬として使用する場合には、例えば、適宜の製剤用添加物とともに医薬組成物の形態の医薬を調製して投与することができる。 For example, the lipid membrane structure of the present invention encapsulating siRNA that enables prevention and / or treatment of hepatitis B can efficiently deliver siRNA into the cytoplasm of hepatocytes that are target cells. Therefore, by administering this lipid membrane structure to mammals including humans, siRNA can be efficiently delivered into the cytoplasm of liver parenchymal cells to achieve prevention and / or treatment of hepatitis B. . The administration method is not particularly limited, but parenteral administration is preferable, and intravenous administration is more preferable. When the lipid membrane structure of the present invention is used as a medicine, for example, a medicine in the form of a pharmaceutical composition can be prepared and administered together with an appropriate formulation additive.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
式(I)の化合物のうちRが式(A)の基である化合物(YSK13)を以下の合成スキームに示す方法に従ってリノレン酸から合成した。得られた化合物の物理化学的性状は以下のとおりである。
n=2の場合(YSK13-C2)
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d: 5.66 (1H, s), 5.29-5.41 (8H, m), 4.17 (2H, t), 2.77 (4H, t), 2.58 (2H, t), 2.29 (6H, s), 1.97-2.13 (12H, m), 1.20-1.47 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
n=3の場合(YSK13-C3
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d: 5.60 (1H, s), 5.29-5.40 (8H, m), 4.10 (2H, t), 2.76 (4H, t), 2.57 (2H, t), 2.33 (2H, t), 2.21 (6H, s), 2.12 (2H, t), 1.97-2.09 (8H, m), 1.81 (2H, m), 1.20-1.45 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
n=4の場合(YSK13-C4)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d: 5.59 (1H, s), 5.27-5.40 (8H, m), 4.08 (2H, t), 2.76 (4H, t), 2.56 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.21 (6H, s), 2.12 (2H, t), 1.97-2.09 (8H, m), 1.65 (2H, m), 1.20-1.45 (38H, m), 0.88 (6H, t) ppm. EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
Example 1
Of the compounds of formula (I), compound (YSK13) in which R is a group of formula (A) was synthesized from linolenic acid according to the method shown in the following synthesis scheme. The physicochemical properties of the obtained compound are as follows.
When n = 2 (YSK13-C2)
¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.66 (1H, s), 5.29-5.41 (8H, m), 4.17 (2H, t), 2.77 (4H, t), 2.58 (2H, t), 2.29 (6H, s), 1.97-2.13 (12H, m), 1.20-1.47 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
When n = 3 (YSK13-C3
¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.60 (1H, s), 5.29-5.40 (8H, m), 4.10 (2H, t), 2.76 (4H, t), 2.57 (2H, t), 2.33 (2H, t), 2.21 (6H, s), 2.12 (2H, t), 1.97-2.09 (8H, m), 1.81 (2H, m), 1.20-1.45 (36H, m), 0.88 (6H, t ) ppm.
When n = 4 (YSK13-C4)
¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.59 (1H, s), 5.27-5.40 (8H, m), 4.08 (2H, t), 2.76 (4H, t), 2.56 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.21 (6H, s), 2.12 (2H, t), 1.97-2.09 (8H, m), 1.65 (2H, m), 1.20-1.45 (38H, m), 0.88 (6H, t ) ppm.

式(I)の化合物のうちRが式(B)の基である化合物(YSK15)を以下の合成スキームに示す方法に従ってリノレン酸から合成した。得られた化合物の物理化学的性状は以下のとおりである。
m=2の場合(YSK15-C2)
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.59 (2H, d), 2.77 (4H, t), 2.61 (2H, t), 2.47 (2H, t), 2.23 (6H, s), 1.94-2.07 (12H, m), 1.20-1.42 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
m=3の場合(YSK15-C3)
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.32 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.20 (6H, s), 1.95-2.08 (12H, m), 1.78 (2H, m), 1.20-1.40 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
m=4の場合(YSK15-C4)
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.32 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.20 (6H, s), 1.95-2.10 (12H, m), 1.64 (2H, m), 1.49 (2H, m), 1.20-1.40 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
m=5の場合(YSK15-C5)
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.35-2.57 (6H, br), 2.31 (2H, t), 1.93-2.09 (12H, m), 1.63 (4H, m), 1.20-1.40 (40H, m), 0.88 (6H, t) ppm. Among compounds of formula (I), compound (YSK15) in which R is a group of formula (B) was synthesized from linolenic acid according to the method shown in the following synthesis scheme. The physicochemical properties of the obtained compound are as follows.
When m = 2 (YSK15-C2)
¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.59 (2H, d), 2.77 (4H, t), 2.61 (2H, t), 2.47 (2H, t), 2.23 (6H, s), 1.94-2.07 (12H, m), 1.20-1.42 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
When m = 3 (YSK15-C3)
¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.32 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.20 (6H, s), 1.95-2.08 (12H, m), 1.78 (2H, m), 1.20-1.40 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
When m = 4 (YSK15-C4)
¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.32 (2H, t), 2.28 (2H, t), 2.20 (6H, s), 1.95-2.10 (12H, m), 1.64 (2H, m), 1.49 (2H, m), 1.20-1.40 (36H, m), 0.88 (6H, t) ppm.
When m = 5 (YSK15-C5)
¹ H NMR (500 MHz, CDCl ₃ ) d: 5.28-5.41 (9H, m), 4.58 (2H, d), 2.76 (4H, t), 2.35-2.57 (6H, br), 2.31 (2H, t) , 1.93-2.09 (12H, m), 1.63 (4H, m), 1.20-1.40 (40H, m), 0.88 (6H, t) ppm.

例2
例1で得られたYSK13を構成脂質に含むMENDを以下のようにして製造した。YSK13-MENDはアルコール希釈法を用いて調製した。総脂質量が1545 nmolとなるようにYSK13、コレステロール(chol)、メトキシエチレングリコール2000(PEG-DMG)を含む90% tert-ブタノール溶液400 μLに、撹拌下でsiRNA 40μgを含む水溶液200μLを添加した。さらに20 mMクエン酸緩衝液(pH4.0) 2 mLに、撹拌下で脂質-siRNA混合溶液を注入した。続いて10-14 mLのPBSを添加後に限外濾過精製を計2回行った。調製したYSK13-MENDの平均粒子径は80 nm程度、siRNA封入率は90%程度であった。 Example 2
MEND containing YSK13 obtained in Example 1 as a constituent lipid was produced as follows. YSK13-MEND was prepared using the alcohol dilution method. To a total lipid content of 1545 nmol, 200 μL of an aqueous solution containing 40 μg of siRNA was added with stirring to 400 μL of a 90% tert-butanol solution containing YSK13, cholesterol (chol), and methoxyethylene glycol 2000 (PEG-DMG). . Furthermore, the lipid-siRNA mixed solution was injected into 2 mL of 20 mM citrate buffer (pH 4.0) with stirring. Subsequently, ultrafiltration purification was performed twice after adding 10-14 mL of PBS. The prepared YSK13-MEND had an average particle size of about 80 nm and an siRNA encapsulation rate of about 90%.

0.5 mMの脂質濃度に調整したsiRNA未封入YSK13-MEND、0.6 mM 6-(p-トルイジノ)-2-ナフタレンスルホン酸ナトリウム(TNS)、20 mM緩衝液(3.5≦pH≦9.5)をそれぞれ12μL、4μL、184μLずつ混合し、蛍光強度を測定した(excitation: 321 nm、emission: 447 nm)。その結果、YSK13-C2-MEND、YSK13-C3-MEND、YSK13-C4-MENDの脂質膜pKaはそれぞれ5.70、6.45、6.80を示した(図1)。YSK15-C2-MEND、YSK15-C3-MEND、YSK15-C4-MEND、YSK15-C5-MENDの脂質膜pKaはそれぞれ5.80、6.65、7.10、7.25を示した (図1B) 。また、YSK15-C2とYSK15-C3を2:5のモル比で混合して調製したMENDの脂質膜pKaは6.45を示した。 12 μL each of siRNA unencapsulated YSK13-MEND adjusted to 0.5 mM lipid concentration, 0.6 mM 6- (p-toluidino) -2-naphthalene sulfonate (TNS), 20 mM buffer (3.5 ≦ pH ≦ 9.5), 4 μL and 184 μL were mixed, and the fluorescence intensity was measured (excitation: 321 nm, emission: 447 nm). As a result, YSK13-C2-MEND, YSK13-C3-MEND, and YSK13-C4-MEND lipid membranes pKa showed 5.70, 6.45, and 6.80, respectively (FIG. 1). The lipid membranes pKa of YSK15-C2-MEND, YSK15-C3-MEND, YSK15-C4-MEND and YSK15-C5-MEND were 5.80, 6.65, 7.10 and 7.25, respectively (FIG. 1B). The lipid membrane pKa of MEND prepared by mixing YSK15-C2 and YSK15-C3 at a molar ratio of 2: 5 was 6.45.

肝実質細胞特異的遺伝子である第7凝固因子(FVII)に対するsiRNA(siFVII)を封入したYSK13-MENDを0.03 mg siRNA/kgでICRマウス(雄性、4週齢)に静脈内投与し、48 hr後に採血し血漿を得た。呈色反応により血漿中FVII酵素活性を測定した。その結果、YSK13-MEND及びYSK15-MENDは共に脂質膜pKa 6.45で最大活性を示した(図2A及び2B)。また、YSK13-C3-MENDは50%有効量(ED₅₀)で0.015 mg/kgを示し、公知のYSK05-MENDと比較して4倍高い活性を有していた。また、YSK13-C3-MENDは、Alnylam社pH応答性脂質MC3を用いたキャリアと同程度の高い活性を有していた(図2C)。 YSK13-MEND encapsulating siRNA (siFVII) against 7th coagulation factor (FVII), a hepatocyte-specific gene, was intravenously administered to ICR mice (male, 4 weeks old) at 0.03 mg siRNA / kg for 48 hr. Later, blood was collected to obtain plasma. Plasma FVII enzyme activity was measured by a color reaction. As a result, YSK13-MEND and YSK15-MEND both showed maximum activity at lipid membrane pKa 6.45 (FIGS. 2A and 2B). YSK13-C3-MEND was 0.015 mg / kg at a 50% effective dose (ED ₅₀ ), and was 4 times higher than the known YSK05-MEND. YSK13-C3-MEND was as highly active as the carrier using Alnylam pH-responsive lipid MC3 (FIG. 2C).

Cy5標識siRNA又はDiDで蛍光標識したYSK13-MENDをICRマウス(雄性、4週齢)に0.5 mg siRNA/kgで静脈内投与し、30 min後の肝臓、肺、腎臓、脾臓を回収した。各組織ホモジネート中のCy5(図3A)又はDiD(図3B)由来の蛍光強度を測定することで、YSK13-MENDの各組織への移行量を評価した。その結果、いずれのYSK13-MENDも大部分が肝臓へ移行し、その中でもYSK13-C3-MENDにおいてsiRNAの最も高い肝臓移行性が認められた。 Cy5-labeled siRNA or YSK13-MEND fluorescently labeled with DiD was intravenously administered to ICR mice (male, 4 weeks old) at 0.5 mg siRNA / kg, and the liver, lung, kidney and spleen after 30 min were collected. The amount of YSK13-MEND transferred to each tissue was evaluated by measuring the fluorescence intensity derived from Cy5 (FIG. 3A) or DiD (FIG. 3B) in each tissue homogenate. As a result, most of all YSK13-MENDs migrated to the liver. Among them, YSK13-C3-MEND showed the highest liver migratory property of siRNA.

Cy5標識siRNA封入YSK13-MENDをICRマウス(雄性、4週齢)に1 mg siRNA/kgで静脈内投与し、25 min後にFITC標識イソレクチンB4を40μg/mouseで静脈内投与し、さらに5 min後に肝臓を回収した。肝臓をHoechst33342で核染色後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてsiRNAの肝臓内分布を観察した。その結果、脂質膜pKaの比較的低いYSK13-C2-MENDとYSK13-C3-MENDは血管外に存在する肝実質細胞へ多く移行していた(図4A及びB)。脂質膜pKaの高いYSK13-C4-MENDの多くは血管に局在しており、肝実質細胞への移行量はYSK13-C2-MEND及びYSK13-C3-MENDに比べて少なかった(図4C)。 CySK-labeled siRNA-encapsulated YSK13-MEND was intravenously administered to ICR mice (male, 4 weeks old) at 1 mg siRNA / kg, and after 25 min, FITC-labeled isolectin B4 was intravenously administered at 40 μg / mouse. Liver was collected. After liver staining with Hoechst33342, the distribution of siRNA in the liver was observed using a confocal laser scanning microscope. As a result, YSK13-C2-MEND and YSK13-C3-MEND, which have a relatively low lipid membrane pKa, were largely transferred to hepatocytes existing outside the blood vessels (FIGS. 4A and B). Most of YSK13-C4-MEND with a high lipid membrane pKa was localized in blood vessels, and the amount transferred to hepatic parenchymal cells was small compared to YSK13-C2-MEND and YSK13-C3-MEND (FIG. 4C).

YSK13-C3-MENDをICRマウス(雄性、4週齢)に1 mg siRNA/kgで静脈内投与し、24時間後に血液を回収した。遠心分離法により得られた血清中のaspartate aminotransferase(AST)及びalanine aminotransferase(ALT)活性を呈色反応により定量することで肝毒性を評価した(図5A及びB)。また、全身的な毒性の指標としてYSK13-C3-MEND投与直前から24時間後の体重変化を算出した(図5C)。その結果、YSK13-C3-MENDの投与による肝毒性及び全身毒性は観察されなかった。ED₅₀の約100倍量である1 mg/kgの投与量において毒性が認められなかったことから、YSK13-C3-MENDは広い治療域を有することが示された。 YSK13-C3-MEND was intravenously administered to ICR mice (male, 4 weeks old) at 1 mg siRNA / kg, and blood was collected 24 hours later. Hepatotoxicity was evaluated by quantifying aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities in serum obtained by centrifugation using a color reaction (FIGS. 5A and B). In addition, the change in body weight 24 hours after immediately before administration of YSK13-C3-MEND was calculated as an index of systemic toxicity (FIG. 5C). As a result, hepatotoxicity and systemic toxicity due to administration of YSK13-C3-MEND were not observed. No toxicity was observed at a dose of 1 mg / kg, which is about 100 times the ED ₅₀ , indicating that YSK13-C3-MEND has a wide therapeutic window.

例3
siRNAの合成にあたり、標的領域の設定は次の16種類の遺伝子配列を比較して高度に保存している領域を選択した(Genotype A: AB246338, AY161149, X51970, AM282986, AF297621; Genotype B: AB246341, AB073858, AB033554, D00329, D00330, AF100309; Genotype C: AB246345, AB048704, AB014381, AY123041, AB033556, AB231908)(図6)。選択された領域について25塩基からなるsiRNAを合成した(ライフテクノロジーズジャパン)。合成したアンチセンスsiRNAの配列情報を次に示す。
5'-uugagagaaguccaccacgagucua-3' (si249)
5'-aauugagagaaguccaccacgaguc-3' (si251)
5'-ucaagauguuguacagacuuggccc-3' (si758)
5'-cagaggugaagcgaagugcacacgg-3' (si1575)
5'-gugaaaaaguugcauggugcuggug-3' (si1804)
5'-uuuccggaaguguugauaagauagg-3' (si2312)
5'-uaaaguuucccaccuuaugagucca-3' (si2460)
また、陰性コントロールとして siRNA 5'-cuaauacaggccaauacauuu-3'を用いた。 Example 3
In the synthesis of siRNA, the target region was set by selecting the highly conserved region by comparing the following 16 gene sequences (Genotype A: AB246338, AY161149, X51970, AM282986, AF297621; Genotype B: AB246341, AB073858, AB033554, D00329, D00330, AF100309; Genotype C: AB246345, AB048704, AB014381, AY123041, AB033556, AB231908) (FIG. 6). For the selected region, an siRNA consisting of 25 bases was synthesized (Life Technologies Japan). The sequence information of the synthesized antisense siRNA is shown below.
5'-uugagagaaguccaccacgagucua-3 '(si249)
5'-aauugagagaaguccaccacgaguc-3 '(si251)
5'-ucaagauguuguacagacuuggccc-3 '(si758)
5'-cagaggugaagcgaagugcacacgg-3 '(si1575)
5'-gugaaaaaguugcauggugcuggug-3 '(si1804)
5'-uuuccggaaguguugauaagauagg-3 '(si2312)
5'-uaaaguuucccaccuuaugagucca-3 '(si2460)
Moreover, siRNA 5'-cuaauacaggccaauacauuu-3 'was used as a negative control.

合成したHBV-siRNAsをYSK13-C3-MENDに封入した。これをHBVが持続感染しているヒト肝臓キメラマウス初代培養肝細胞へ１回添加してHBV阻害活性を評価した。評価はsiRNA添加後4、7、11、及び14日目の培養上清中HBs抗原、HBe抗原、HBV-DNA量の変化を定量することで行った。阻害活性の程度を図7に示した。HBs抗原は si251、si1575、及びsi1804 siRNAs の投与により遺伝子型A、B、及びCともに14日間にわたり減少した(図7B)。HBe抗原は si251、si1575及びsi1804、si2312、si2460、siRNAs の投与により、遺伝子型A、Cともに14日間にわたり減少した(図7C)。HBV-DNAは si251、si1575及び si1804、si2312、si2460、siRNAsの投与により遺伝子型A、B、及びCともに14日間にわたり減少した(図7D)。以上のとおり、合成したHBV-siRNAsをYSK13-C3-MENDに封入した場合には、エンテカビルに匹敵する高いHBV DNA抑制効果及びエンテカビルを上回るHBsAg及びHBeAgの減少が認められた。 The synthesized HBV-siRNAs were enclosed in YSK13-C3-MEND. This was added once to primary cultured hepatocytes of human liver chimeric mice in which HBV was persistently infected, and the HBV inhibitory activity was evaluated. Evaluation was performed by quantifying changes in the amounts of HBs antigen, HBe antigen, and HBV-DNA in the culture supernatants on days 4, 7, 11, and 14 after addition of siRNA. The degree of inhibitory activity is shown in FIG. HBs antigen was decreased over 14 days for both genotypes A, B, and C by administration of si251, si1575, and si1804 siRNAs (FIG. 7B). HBe antigen was decreased over 14 days for both genotypes A and C by administration of si251, si1575 and si1804, si2312, si2460, siRNAs (FIG. 7C). HBV-DNA was decreased over 14 days for both genotypes A, B, and C by administration of si251, si1575 and si1804, si2312, si2460, siRNAs (FIG. 7D). As described above, when the synthesized HBV-siRNAs were encapsulated in YSK13-C3-MEND, a high HBV DNA inhibitory effect comparable to entecavir and a decrease in HBsAg and HBeAg exceeding entecavir were observed.

合成したHBV-siRNAsを3種類(si758, si1804, si2460)混合してYSK13-C3-MENDに封入した。これを遺伝子型CのHBVが持続感染しているヒト肝臓キメラマウス個体へ5mg/kgで１回投与し、そのHBV阻害活性を評価した(図8A)。評価はsiRNA添加後1, 3, 5, 7, 10日目の血清中HBV-DNA量の変化を定量することで行った。この間の体重及びALTの変化は認められず、安全性に問題は無かった(図8B)。１回の投与で10日間にわたり血清中のHBs抗原、HBe抗原、HBV-DNA産生が強く阻害されていた(図8C)。 Three kinds of synthesized HBV-siRNAs (si758, si1804, si2460) were mixed and enclosed in YSK13-C3-MEND. This was once administered at 5 mg / kg to a human liver chimeric mouse individual that was persistently infected with genotype C HBV, and its HBV inhibitory activity was evaluated (FIG. 8A). The evaluation was performed by quantifying the change in the amount of serum HBV-DNA on days 1, 3, 5, 7, and 10 after addition of siRNA. During this period, changes in body weight and ALT were not observed, and there was no problem in safety (FIG. 8B). The HBs antigen, HBe antigen, and HBV-DNA production in the serum were strongly inhibited for 10 days after one administration (FIG. 8C).

Claims

The following general formula (I):
(In the formula, R is a group represented by the formula (A) or a group represented by the formula (B):
(Wherein n represents an integer of 2 to 4 and m represents an integer of 2 to 5)).

The compound represented by the general formula (I) according to claim 1, which is used for imparting pH-dependent cationicity to a lipid membrane structure.

A lipid membrane structure comprising the compound represented by the general formula (I) according to claim 1 as a constituent lipid.

The lipid membrane structure according to claim 3, wherein a substance to be delivered is encapsulated therein.

The lipid membrane structure according to claim 4, wherein the delivery target cell is a hepatocyte.

The lipid membrane structure according to claim 5, wherein the substance to be delivered is a nucleic acid.

The lipid membrane structure according to claim 5, wherein the substance to be delivered is siRNA having a preventive and / or therapeutic effect on hepatitis B.

A medicament for the prevention and / or treatment of hepatitis B comprising the lipid membrane structure according to claim 7 as an active ingredient.