JP2016021883A - Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205 - Google Patents

Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205 Download PDF

Info

Publication number
JP2016021883A
JP2016021883A JP2014146632A JP2014146632A JP2016021883A JP 2016021883 A JP2016021883 A JP 2016021883A JP 2014146632 A JP2014146632 A JP 2014146632A JP 2014146632 A JP2014146632 A JP 2014146632A JP 2016021883 A JP2016021883 A JP 2016021883A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna aptamer
human colon
colon cancer
dna
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2014146632A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
古性 均
Hitoshi Kosho
均 古性
敬太郎 吉本
Keitaro Yoshimoto
敬太郎 吉本
有希 稲見
Yuki Inami
有希 稲見
美弥子 山中
Miyako Yamanaka
美弥子 山中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissan Chemical Corp
Original Assignee
Nissan Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissan Chemical Corp filed Critical Nissan Chemical Corp
Priority to JP2014146632A priority Critical patent/JP2016021883A/en
Publication of JP2016021883A publication Critical patent/JP2016021883A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide novel DNA aptamers which are involved in human colon cancer (Colo205) and are useful such as for detection, diagnosis, treatment, and prevention of metastasis, of human colon cancer.SOLUTION: The invention provides a DNA aptamer which comprises a nucleotide sequence represented by a specific sequence or another specific sequence and specifically binds to human colon cancer cell. In a preferred embodiment, the DNA aptamer may be linked to a primer recognition sequence, a fluorescent label, biotin, avidin or streptavidin, or the other specific binding tag peptide, at the 5' terminal or 3' terminal thereof for facilitating detection.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、ヒト大腸癌(Colo205)細胞に対して特異的に結合し得る核酸及びその核酸を含む組成物等に関する。   The present invention relates to a nucleic acid that can specifically bind to human colon cancer (Colo205) cells, a composition containing the nucleic acid, and the like.

大腸癌は、近年日本人の発症傾向増加が顕著に認められる癌としてその診断・治療に関する研究が急がれている。大腸癌は、2015年には現在羅患者数が第一位である肺癌を抜くことが予想されており、2012年の統計によると、特に死亡率において男性では、肺癌、肝臓癌に次いで第3位に、女性では既に1位となっている。大腸癌は、早期発見すれば手術により良好な予後が得られることが知られているため、早期癌検診の対象となり、数多くの検査法が開発されてきた。また、大腸癌においては、癌の転移を抑制することが重要とされ様々な研究が行われている。転移の過程には転移性癌細胞と種々の宿主細胞(血小板、リンパ球、内皮細胞)と細胞外マトリックスや基底膜との相互作用が関与していることが知られている。   In recent years, research on diagnosis and treatment of colorectal cancer has been urgently studied as a cancer in which the increase in the onset tendency of Japanese people is remarkably observed. Colorectal cancer is expected to surpass lung cancer, which is currently the number one patient in 2015, and according to statistics in 2012, the third in mortality, especially in men, next to lung cancer and liver cancer. It ’s already ranked first among women. Since colorectal cancer is known to have a good prognosis by surgery if detected at an early stage, it has been the subject of early cancer screening, and numerous testing methods have been developed. In colorectal cancer, it is important to suppress cancer metastasis, and various studies have been conducted. It is known that the process of metastasis involves the interaction between metastatic cancer cells, various host cells (platelets, lymphocytes, endothelial cells), extracellular matrix and basement membrane.

ヒト大腸癌細胞の特性や、免疫細胞との相互作用を解析するために、ヒト大腸腺癌患者からいくつかの細胞株が樹立された(例えば、非特許文献1参照)。Colo205は、ヒト大腸癌患者の腹水から単離された1つの細胞株であり、上皮様の細胞形態を有し、大量のCEAを産生する、悪性の腫瘍細胞株である。また、Colo205細胞は、増殖駆動性癌遺伝子BRAFに変異を有し、その増幅がMEK1/2阻害薬に対する耐性の獲得に寄与していることも知られている。   In order to analyze the characteristics of human colon cancer cells and the interaction with immune cells, several cell lines have been established from human colon adenocarcinoma patients (see, for example, Non-Patent Document 1). Colo205 is a cell line isolated from the ascites of human colon cancer patients, a malignant tumor cell line that has an epithelial cell morphology and produces large amounts of CEA. Colo205 cells are also known to have a mutation in the growth-driven oncogene BRAF, and that amplification contributes to the acquisition of resistance to MEK1 / 2 inhibitors.

CA50と称される腫瘍マーカーは、ヒト大腸癌由来培養細胞株Colo-205をマウスに免疫して作成したモノクローナル抗体C-50が認識する糖鎖抗原で、I型糖鎖に属するルイスAを抗原決定基にもつ。大腸癌に限らず、膵癌、肝細胞癌、胆道癌、膵・胆道系良性疾患、透析患者、未透析腎不全患者、肝硬変においても上昇し陽性率も低いのでスクリーニングには不適であるものの、治療効果判定や再発腫瘍の発見のモニタリングとして利用される。一方、特許文献1には、変異型のKRAS又はBRAF遺伝子を含む対象における癌を治療する方法が開示されている。この方法は、ヒト結腸癌細胞系のColo205に対する結合でモノクローナル抗体SC104と競合するような、抗体又はその抗原結合性フラグメントを対象に投与するステップを含む。しかしながら、この抗原結合部位の正確な構造は明らかではない。   The tumor marker called CA50 is a sugar chain antigen recognized by monoclonal antibody C-50 prepared by immunizing mice with human colon cancer-derived cultured cell line Colo-205, and Lewis A belonging to type I sugar chain as an antigen. It has a determinant. Not only for colorectal cancer, but also suitable for screening because pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer, benign pancreatic / biliary system benign disease, dialysis patients, undialyzed renal failure patients, cirrhosis, and the positive rate is low. It is used as an effect judgment and monitoring of the detection of recurrent tumors. On the other hand, Patent Document 1 discloses a method for treating cancer in a subject containing a mutant KRAS or BRAF gene. The method includes administering to the subject an antibody or antigen-binding fragment thereof that competes with monoclonal antibody SC104 for binding to Colo205 of a human colon cancer cell line. However, the exact structure of this antigen binding site is not clear.

Colo205を含む全ての細胞は、その細胞が産生するタンパク質によりその細胞膜表面が覆われている。これら発現したタンパク質又はそれに結合する糖鎖に対して特定の配列を有する核酸が吸着することは既に多くの文献に紹介されている。(例えば、特許文献2及び3)これら特定のターゲットに対して特異的に吸着しうる核酸配列はアプタマーと呼ばれている。これらアプタマーは化学合成法による製造が可能であることが特徴である。従って、従来病因タンパク質と特異的に吸着するものの代表的存在であった抗体のように、生体内で合成する必要がない。これらアプタマーを診断に用いる場合は蛍光標識を行い蛍光顕微鏡での検出が多く用いられている(例えば、非特許文献3)。   All cells including Colo205 have their cell membrane surfaces covered with proteins produced by the cells. Numerous literatures have already introduced that nucleic acids having specific sequences adsorb to these expressed proteins or sugar chains bound to them. (For example, Patent Documents 2 and 3) Nucleic acid sequences that can specifically adsorb to these specific targets are called aptamers. These aptamers are characterized in that they can be produced by chemical synthesis methods. Therefore, it is not necessary to synthesize in vivo like an antibody which has been a typical presence of what specifically adsorbs with a pathogenic protein. When these aptamers are used for diagnosis, fluorescent labeling is often performed and detection with a fluorescence microscope is used (for example, Non-Patent Document 3).

タンパク質や細胞に対して特異的に吸着する新規のアプタマーの探索には試験管内進化法(in vitro selection法)が最も有効な手段として用いられている。特にSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の2ステップがある。(例えば、特許文献4)この選別と増幅を、選択圧を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法や、低分子やタンパク質だけでなく細胞や組織(正確には、表面に存在する分子)に結合するアプタマーを得る手法(Cell−SELEX法;例えば、非特許文献4)などが報告されている。この手法は従来のSELEX法に比べ、膜タンパク質の解析が不要であること、細胞表面に存在する様々な膜タンパク質のアプタマーを同時に選別できること、さらに、目的細胞とより特異的に結合するアプタマーを選抜できると言った特徴がある。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾も安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない様々な利点がある。   The in vitro selection method (in vitro selection method) is used as the most effective means for searching for new aptamers that specifically adsorb to proteins and cells. Particularly, the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) method is roughly divided into two steps: selection of the target nucleic acid molecule and amplification of the selected aptamer. (For example, Patent Document 4) By repeating this selection and amplification while increasing the selection pressure, a nucleic acid fragment having high affinity can be obtained. In addition, various improvements have been made in recent years, and aptamers can be recovered with fewer cycles. The method is excellent in efficiency and selectivity, and not only small molecules and proteins but also cells and tissues (exactly on the surface) A technique for obtaining an aptamer that binds to (molecule) (Cell-SELEX method; for example, Non-Patent Document 4) has been reported. Compared to the conventional SELEX method, this method requires no analysis of membrane proteins, can simultaneously select aptamers of various membrane proteins present on the cell surface, and selects aptamers that bind more specifically to the target cell. There is a feature that you can do. These aptamers can be synthesized chemically in a short time, not to mention their high affinity and specificity for the target, which is also a characteristic of antibodies that have been used for diagnosis and treatment in the past. There are various advantages of antibodies that can be performed inexpensively, have a simple mechanism of action, and have little immunogenicity.

特表2013−509451号公報Special table 2013-509451 gazette 特開2006−149302号公報JP 2006-149302 A 特開2011−92138号公報JP 2011-92138 A 国際公開WO91/19813号公報International Publication No. WO91 / 19813

Semple, TU et al., Cancer Research. 38, 1345-1355, 1978Semple, TU et al., Cancer Research. 38, 1345-1355, 1978 Little, AS et al., Sci. Signal., 4, ra17, 2011Little, AS et al., Sci. Signal., 4, ra17, 2011 Yen-An Shieh, Shu-Jyuan Yang, Ming-Feng Wei and Ming-JiumShieh., ACS NANO., Vol.4, No.3, 1433-1442, 2010.Yen-An Shieh, Shu-Jyuan Yang, Ming-Feng Wei and Ming-JiumShieh., ACS NANO., Vol.4, No.3, 1433-1442, 2010. Guo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008Guo, et al., Int. J. Mol. Sci., 9 (4): 668,2008

以上のような背景の下に、本発明は、大腸癌の検出、診断、治療、及び転移予防等に有用なヒト大腸癌(Colo205)に関わる新規DNAアプタマーを提供することを課題とするものである。   Under the background as described above, an object of the present invention is to provide a novel DNA aptamer related to human colon cancer (Colo205) useful for detection, diagnosis, treatment, metastasis prevention, etc. of colon cancer. is there.

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、Cell−SELEX法を用いることによってヒト大腸癌Colo205細胞に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有するDNAがヒト大腸癌Colo205細胞に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have identified a nucleotide sequence having specific binding ability to human colon cancer Colo205 cells by using the Cell-SELEX method. The inventors have newly found that a DNA having the sequence can function as a specific aptamer for human colon cancer Colo205 cells, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、一つの態様において、配列番号1又は2で示されるヌクレオチド配列からなり、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマーを提供する。本発明の好ましい態様では、上記DNAアプタマーは、検出を容易とするために、その5’末端又は3’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。   That is, the present invention provides, in one embodiment, a DNA aptamer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and specifically binding to human colon cancer cells. In a preferred embodiment of the present invention, the DNA aptamer has a primer recognition sequence, a fluorescent label, biotin, avidin or streptavidin, or other specific binding tag peptide at its 5 ′ end or 3 ′ end to facilitate detection. It may be connected with.

本発明の異なる態様では、上記本発明のDNAプライマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用組成物、検出用キット又は検出方法を提供する。好ましい態様では、前記DNAアプタマーをヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する工程を含む。   In a different aspect of the present invention, there is provided a composition, a detection kit or a detection method for detecting human colorectal cancer cells comprising the DNA primer of the present invention. In a preferred embodiment, the step of bringing the DNA aptamer into contact with a sample collected from a living body selected from the group consisting of human colon cells, colon tissue, blood, serum and plasma, and a response by binding of the sample to the DNA aptamer Detecting the presence of human colon cancer cells by observing.

本発明のさらに異なる態様において、ヒト大腸癌細胞の治療用医薬組成物、ヒト大腸癌の治療用医薬組成物の製造のための上記本発明のDNAプライマーの使用、又は本発明のDNAプライマーを含む、ヒト大腸癌の治療用ドラッグデリバリーシステムを提供する。   In still another embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for treating human colon cancer cells, the use of the DNA primer of the present invention for the production of a pharmaceutical composition for treating human colon cancer, or the DNA primer of the present invention is included. A drug delivery system for treating human colorectal cancer is provided.

本発明によれば、ヒト大腸癌の発症や転移の検出、癌の予後や悪性度の診断を可能とするために有用な新規な材料としてのDNAアプタマーを提供することができる。すなわち、ヒト大腸癌に特異的に結合しうる新規DNAアプタマーを提供することにより、ヒト大腸癌における新たな抗原結合部位の探索や、従来の抗体とは親和性の異なるDNAアプタマーを選択することができると考えられる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the DNA aptamer as a novel material useful in order to enable the onset of a human colon cancer, detection of a metastasis, diagnosis of cancer, and a diagnosis of a malignancy can be provided. That is, by providing a novel DNA aptamer that can specifically bind to human colorectal cancer, it is possible to search for a new antigen-binding site in human colorectal cancer or select a DNA aptamer having a different affinity from conventional antibodies. It is considered possible.

また、DNAアプタマーは、蛍光標識等、検出手段に合わせた化学修飾が容易であるため、癌の検出キットを作製するうえで抗体を利用するよりも有利であり、さらに、抗癌剤等の薬物をコンジュゲートさせることで、当該薬剤をターゲット部位に確実に作用させることが可能である。また、化学合成が容易であることから、抗体のような大がかりな培養装置を必要とせず、製造のための手間やコストを抑制できるという利点もある。   In addition, since DNA aptamers can be easily chemically modified in accordance with detection means such as fluorescent labels, they are more advantageous than using antibodies in preparing cancer detection kits. Furthermore, drugs such as anticancer agents are conjugated. By making the gate, it is possible to reliably cause the drug to act on the target site. In addition, since chemical synthesis is easy, there is an advantage that a large-scale culture apparatus such as an antibody is not required and labor and cost for production can be suppressed.

磁性微粒子を用いた2本鎖DNAの1本鎖化を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows single strand conversion of double stranded DNA using a magnetic microparticle. 配列番号1で示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の実像図である。It is a real image figure of Colo205 cell dye | stained with the DNA aptamer which has a base sequence shown by sequence number 1. 配列番号1で示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の蛍光イメージング図である。It is a fluorescence imaging figure of Colo205 cell dye | stained with the DNA aptamer which has a base sequence shown by sequence number 1. 配列番号2で示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の実像図である。It is a real image figure of Colo205 cell dye | stained with the DNA aptamer which has a base sequence shown by sequence number 2. 配列番号2で示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の蛍光イメージング図である。It is a fluorescence imaging figure of Colo205 cell dye | stained with the DNA aptamer which has a base sequence shown by sequence number 2.

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.

1.DNAアプタマー
本願において「DNAアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴDNAを意味し、本発明に係るDNAアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴDNAである。
本発明に係るDNAアプタマーの結合ターゲットとしては、好ましくは大腸癌細胞であり、より好ましくはヒト大腸癌細胞であり、より好ましくはColo205細胞である。Colo205細胞は、例えば、ATCC(American Type Culture Collection)などの生物資源バンクから入手可能であり、あるいは研究用ヒト細胞株として市販されている。典型的な態様において、本発明に係るDNAアプタマーは、以下に示す配列番号1又は2で表されるヌクレオチド配列を有する。なお、本明細書においては、ヌクレオチド配列は、5’末端から3’末端方向に左から右に記載する。
1. DNA aptamer In the present application, “DNA aptamer” means a single-stranded oligo DNA capable of specifically recognizing a target molecule or substance. The DNA aptamer according to the present invention is specific to human colon cancer cells. It is a single-stranded oligo DNA having a function of binding.
The binding target of the DNA aptamer according to the present invention is preferably colon cancer cells, more preferably human colon cancer cells, and more preferably Colo205 cells. Colo205 cells are available from, for example, biological resource banks such as ATCC (American Type Culture Collection), or are commercially available as research human cell lines. In a typical embodiment, the DNA aptamer according to the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 shown below. In the present specification, nucleotide sequences are described from left to right in the direction from the 5 ′ end to the 3 ′ end.

本明細書において、用語「特異的」とは、Colo205細胞に対する本発明に係るDNAアプタマーの選択的結合を指す。アプタマーは、Colo205細胞又はその細胞膜上の適切な抗原に対する結合を、所定の条件下において、無関係の細胞若しくは抗原または抗原混合物に対する結合と比較することによって、結合特異性について試験され得る。本発明に係るDNAアプタマーは、Colo205細胞又はその細胞膜上の適切な抗原に対して、無関係の細胞若しくは抗原または抗原混合物に対してよりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍、好ましくは少なくとも10倍結合する場合に、そのアプタマーは特異的であると考えられる。「無関係の細胞」とは、正常細胞又はヒト大腸癌以外の癌細胞であればよく、その由来、性質及び形態等の少なくとも1つがヒト大腸癌細胞と異なればよい。その細胞膜上の抗原も、必ずしもヒト大腸癌細胞にのみ存在する必要はないが、細胞膜上における発現量や立体構造の違いなど何らかの要因により、ヒト大腸癌細胞膜上に存在する場合に本発明に係るDNAアプタマーと特異的に結合するものであればよい。
本発明のDNAアプタマーは、特定の塩基配列に基づいて特定の立体構造を形成しうることから、一本鎖DNAによる非特異的な吸着ではなく、ヒト大腸癌細胞、特にColo205細胞に特異的に結合すると考えられる。
As used herein, the term “specific” refers to the selective binding of a DNA aptamer according to the present invention to Colo205 cells. Aptamers can be tested for binding specificity by comparing binding to the appropriate antigen on Colo205 cells or their cell membranes to binding to unrelated cells or antigens or antigen mixtures under predetermined conditions. The DNA aptamer according to the present invention is at least 2-fold, at least 5-fold, at least 7-fold, preferably at least 2-fold relative to an appropriate antigen on Colo205 cells or their cell membranes relative to unrelated cells or antigens or antigen mixtures. An aptamer is considered specific when it binds 10-fold. The “irrelevant cell” may be a normal cell or a cancer cell other than human colorectal cancer, and only needs to be different from the human colorectal cancer cell in at least one of its origin, nature and form. The antigen on the cell membrane does not necessarily need to be present only in human colon cancer cells, but when present on the human colon cancer cell membrane due to some factor such as the expression level or three-dimensional structure difference on the cell membrane, the present invention is concerned. Any substance that specifically binds to a DNA aptamer may be used.
Since the DNA aptamer of the present invention can form a specific three-dimensional structure based on a specific base sequence, it is not nonspecific adsorption by a single-stranded DNA, but is specific to human colon cancer cells, particularly Colo205 cells. It is thought to combine.

<配列番号1>
5’−CCGTGTGGTGGGGGTTGGGGGTTGTCGTTCGCCG−3’
<配列番号2>
5’−CGAGTGGGGGTATGCTTGGGGGTGTCGTTCGCCG−3’
<SEQ ID NO: 1>
5'-CCGTGGTGTGGGGGTTGGGGGGTTGTCGTCCGCG-3 '
<SEQ ID NO: 2>
5′-CGAGTGGGGGTATGCTTGGGGGTGTCGTTCGCCG-3 ′

本発明に係るDNAアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号1又は2に示す配列における1もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、1〜3個であり、より好ましくは1又は2個であり、さらに好ましくは1個である。   As long as the DNA aptamer according to the present invention has a function of specifically binding to human colon cancer cells, one or more nucleotides in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 are substituted, deleted, or added. It may be an array. Preferably, the number of nucleotides to be substituted, deleted or added is 1 to 3, more preferably 1 or 2, and still more preferably 1.

また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係るDNAアプタマーの配列は、上記配列番号1又は2のそれぞれと90%以上、好ましくは93%以上、さらに好ましくは96%以上の相同性である配列(以下、「相同体」という場合がある。)であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって(例えば、Karlin及びAltschul,1990,PNAS 87:2264−2268;Karlin及びAltschul,1993,PNAS 90:5873−5877)または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。   When such nucleotide substitution, deletion, or addition is present, the sequence of the DNA aptamer according to the present invention is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 96, with each of the above SEQ ID NOs: 1 or 2. % Or more homologous sequences (hereinafter sometimes referred to as “homologues”). Here, as used herein, the term “homology” refers to the generally accepted meaning in the art. The term is typically referred to when examined by sequence analysis programs (eg, Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87: 2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90: 5873-5877) or by visual inspection. The number of nucleotides of the subject nucleic acid sequence that match the same nucleotides of the nucleic acid sequence.

1もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準DNA/RNAの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう(例えば、Loakesら,1997,J.Mol.Bio.270:426−435)。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、C−フェニル、C−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド(carbozamide)、ならびにニトロアゾール誘導体(3’−ニトロピロール、4−ニトロインドール、5−ニトロインドール、及び6−ニトロインドールなど)が挙げられる(Loakes,2001,Nucleic Acids Res.29:2437)。   When one or more nucleotides are substituted, the substitution can be made with a universal base. The term “universal base” indicates its commonly accepted meaning in the art. That is, the term generally refers to nucleotide base analogs that form base pairs with each base of standard DNA / RNA almost indistinguishably and are recognized by intracellular enzymes (see, eg, Loakes et al., 1997, J. MoI. Mol.Bio.270: 426-435). Non-limiting examples of universal bases include C-phenyl, C-naphthyl and other aromatic derivatives, inosine, azole carbozamide, and nitroazole derivatives (3′-nitropyrrole, 4-nitro Indole, 5-nitroindole, and 6-nitroindole) (Loakes, 2001, Nucleic Acids Res. 29: 2437).

また、本発明に係るDNAアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態におけるDNAアプタマーの長さは、上限としては、例えば200塩基以下、好ましくは150塩基以下、より好ましくは100塩基以下である。   In addition, the DNA aptamer according to the present invention has no upper limit as long as it has a function of specifically binding to human colon cancer cells. However, in consideration of easiness of synthesis, antigenicity problems, etc., the upper limit of the length of the DNA aptamer in the present embodiment is, for example, 200 bases or less, preferably 150 bases or less, more preferably 100 bases or less. .

全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号1又は2における塩基数以上、すなわち34塩基以上である。DNAアプタマーは1本鎖(ssDNA)であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に2本鎖構造を形成する場合であっても、そのDNAアプタマーの長さは1本鎖の長さとして計算するものとする。 When the total number of bases is small, chemical synthesis and mass production are easier, and the cost advantage is great. Moreover, chemical modification is easy, safety in the living body is high, and toxicity is low. The lower limit is the number of bases in SEQ ID NO: 1 or 2 or more, that is, 34 bases or more. The DNA aptamer is preferably single-stranded (ssDNA), but even when a double-stranded structure is partially formed by taking a hairpin loop structure, the length of the DNA aptamer is one. Calculate as the length of the chain.

好ましい実施態様において、本発明に係るDNAアプタマーは、上記配列番号1又は2のいずれかの配列、及びその5’及び3’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該DNAアプタマーは、
5’−P−X−P−3’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Xは、配列番号1又は2で示される配列から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。P及びPは、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である。好ましくは、Pは、GCCTGTTGTGAGCCTCCT(配列番号3)であり、及びPは、CGCTTATTCTTGTCTCCC(配列番号4)である。
In a preferred embodiment, the DNA aptamer according to the present invention may be a nucleotide sequence comprising either the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 and a primer recognition sequence on the 5 ′ and 3 ′ terminal sides thereof. That is, in this case, the DNA aptamer is
5′-P 1 -XP 2 -3 ′
It has the nucleotide sequence represented by these. Here, X is a nucleotide sequence selected from the sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or a sequence comprising 1 to 3 nucleotide substitutions, deletions or additions in those sequences. P 1 and P 2 are the first and second primer recognition sequence introduced for the PCR amplification. Preferably, P 1 is GCCTGTTGGAGCCCTCCT (SEQ ID NO: 3) and P 2 is CGCTTATTTCTTGCTCCC (SEQ ID NO: 4).

本発明に係るDNAアプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換(例えば、2’−0メチル化)、リン酸エステル部分での化学的置換(例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アセチル基等)、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、5’又は3’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常5塩基以下である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug−3’、uu−3’、tg−3’、tt−3’、ggg−3’、guuu−3’、gttt−3’、ttttt−3’、uuuuu−3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。   The DNA aptamer according to the present invention may be chemically modified in order to increase stability in vivo. Non-limiting examples of such chemical modifications include chemical substitution at the sugar chain moiety (eg 2′-0 methylation), chemical substitution at the phosphate ester moiety (eg phosphorothioation, amino group) , Lower alkylamino groups, acetyl groups, and the like), and chemical substitution at the base moiety. Similarly, it can have additional bases at the 5 'or 3' end. The length of the additional base is usually 5 bases or less. The additional base may be DNA or RNA, but if DNA is used, the stability of the aptamer may be improved in some cases. Examples of such an additional base sequence include ug-3 ′, uu-3 ′, tg-3 ′, tt-3 ′, ggg-3 ′, guuu-3 ′, gttt-3 ′, and tttt-3. Examples of such sequences include, but are not limited to, ', uuuu-3'.

また、本発明に係るDNAアプタマーは、後述のヒト大腸癌細胞の検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば5’末端又は3’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。   In addition, the DNA aptamer according to the present invention can have a detection label linked to, for example, the 5 'end or the 3' end for use in the human colorectal cancer cell detection method described later or the detection kit. As the detection label, a fluorescent label is preferable, but a Raman scattering label, an enzyme label, and an infrared label may be used.

蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。 As the fluorescent label, a fluorescent labeling agent commonly used in the art can be used. For example, green fluorescent protein (GFP), fluorescent protein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 6-carboxyfluorocein-amino Hexyl, fluorescein derivative, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 750, rhodamine, 6-carboxytetramethylrhodamine, TAMRA®, phycoerythrin (PE), phycocyanin (PC) ), PC5, PC7, Cy dye, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TexasRed, allophycocyanin (APC), amino Methylcoumarin acetate (AMCA), Marina Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Pacific Blue, SPRD, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), R110, mC1B, CellTracker dye, CFSE, JC-1, HKD, FKD, HKD , FDA, Calcein AM, nitrobenzooxadiazole (NBD) group, dimethylaminosulfonylbenzooxadiazole group, acidine (Acd), dansyl (Dns), 7-dimethylaminocoumarin-4-acetic acid (DMACA), 5-((2-Aminoethyl) amino) naphthalene-1-sulfonic acid (EDANS), naphthalene, anthracene Fluorophore can be mentioned can be introduced in commercially available oligonucleotide solid phase synthesis services such fine protoporphyrin 9.

さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー(消光物質)がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。   Furthermore, a quencher (quenching substance) that absorbs fluorescence energy emitted from the fluorescent substance may be further bound in the vicinity of the fluorescent substance. In such an embodiment, the fluorescence is detected by separating the fluorescent substance and the quencher during the detection reaction.

酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを標識剤として用いてもよい。   Examples of enzyme labels include β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like. Further, as a luminescent substrate, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, or the like may be used as a labeling agent.

ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば5’末端又は3’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール(SH)基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、銅、鉄、珪素、量子ドットなどを用いることができる。   The Raman scattering label is not particularly limited as a substituent having the ability to bind to the metal surface, for example, at the 5 ′ end or 3 ′ end of the fluorescently labeled aptamer, but a thiol (SH) group, an alkylamino group Then, by introducing an aromatic amino group and a carboxyl group and adsorbing them on the surface of, for example, a gold nanoparticle, cell recognition is performed by detecting enhanced Raman scattered light emitted from the aptamer adsorbing metal particle. In this case, although not particularly limited, gold, silver, copper, iron, silicon, quantum dots, or the like can be used as the metal nanoparticles.

2.DNAアプタマーの選別
本発明のDNAアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment:SELEX法)が用いられる。
2. Selection of DNA aptamer The DNA aptamer of the present invention can be selected and obtained using in vitro selection methods well known in the art. As a preferable example of such a technique, an in vitro evolution method (System Evolution of Ligands by EXPERIMENTAL ENRICHEMENT: SELEX method) is used.

当該SELEX法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド(アプタマー)の選別と、PCR(Polymerase Chain Reaction)による指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより、ターゲット物質に親和性を有する核酸分子(一本鎖DNA、RNA)を得るというものである。   In the SELEX method, nucleic acid ligands (aptamers) that bind to a target substance are selected multiple times and exponential amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction) is repeated a plurality of times. Strand DNA, RNA).

また、その改良手法として、例えばGuo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008(非特許文献4)に記載されているようなCell−SELEX法を用いることが好ましい。この手法は、ターゲットとして細胞自体を用いることができるため、従来のSELEX法と比較して、細胞表面に膜タンパク質の解析が不要であること、細胞表面に結合し得る複数のアプタマーを同時に選抜できること、及びターゲット細胞に対してより特異的に結合するアプタマーを選抜できるといった利点を有するものである。   Further, as an improved technique, for example, Guo, et al. , Int. J. Mol. Sci. 9 (4): 668, 2008 (Non-Patent Document 4), it is preferable to use the Cell-SELEX method. Since this method can use the cell itself as a target, it does not require analysis of membrane proteins on the cell surface and can simultaneously select multiple aptamers that can bind to the cell surface, compared to the conventional SELEX method. And an aptamer that more specifically binds to the target cell can be selected.

なお、これら以外にも当該技術分野において周知の方法を用いて本発明のDNAアプタマーを選別及び取得することもできる。   In addition to these, the DNA aptamer of the present invention can be selected and obtained using a method well known in the art.

上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール(いわゆる、DNAプール)からターゲットとする分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。当該選択されたアプタマー分子のみをPCR法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができるというものである。   As described above, the “in vitro selection method” selects an aptamer molecule having affinity for a target molecule or cell from a pool of nucleic acid molecules (so-called DNA pool) containing a random nucleotide sequence, and determines the affinity. It is a method of eliminating molecules that do not have. By repeating the cycle of amplifying only the selected aptamer molecule by PCR or the like, and further selecting by affinity, aptamer molecules having strong binding ability can be concentrated.

具体的には、まず、20〜300塩基、好ましくは30〜150、より好ましくは30〜100塩基程度のランダムなヌクレオチド配列(塩基配列)領域を含む1本鎖核酸分子、例えば、オリゴDNAを調製する。オリゴDNAは、PCR増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。   Specifically, first, a single-stranded nucleic acid molecule containing a random nucleotide sequence (base sequence) region of about 20 to 300 bases, preferably 30 to 150 bases, more preferably about 30 to 100 bases, for example, oligo DNA is prepared. To do. In order to enable PCR amplification, it is preferable to use an oligo DNA having a base sequence to serve as a primer at both ends.

プライマー認識配列部分は、PCR増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約20〜50、好ましくは20〜30塩基程度である。また、PCR増幅後の1本鎖DNAを電気泳動などで分離可能とするために、5’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。 The primer recognition sequence portion may have an appropriate restriction enzyme site so that the primer portion can be excised with a restriction enzyme after PCR amplification. The length of the primer recognition sequence portion to be used is not particularly limited, but is about 20 to 50, preferably about 20 to 30 bases. Further, in order to make it possible to separate the single-stranded DNA after PCR amplification by electrophoresis or the like, the 5 ′ end may be labeled with a radiolabel, a fluorescent label, or the like.

次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸分子(ライブラリープール)と、ターゲット細胞とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を遠心機にかけて、核酸分子−ターゲット細胞複合体と遊離核酸分子とを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた核酸分子−ターゲット細胞複合体を用いてPCR反応を行うことで細胞結合性核酸配列の増幅を行う。この後、ターゲット細胞と複合体を形成している核酸分子を当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうち細胞結合能を有するssDNAを分離することができ、さらにDNAポリメラーゼなどのPCR反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたssDNAをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。   Next, the nucleic acid molecule (library pool) having the random nucleotide sequence obtained above and the target cell are mixed at an appropriate concentration ratio and incubated under an appropriate condition. After incubation, the mixture is centrifuged to separate the nucleic acid molecule-target cell complex and free nucleic acid molecule. The supernatant portion of the separation solution is removed, and a cell-bound nucleic acid sequence is amplified by performing a PCR reaction using the obtained nucleic acid molecule-target cell complex. Thereafter, the nucleic acid molecule forming a complex with the target cell is made into a single strand according to a technique well known in the art. As such a technique, for example, separation utilizing the binding of streptavidin-immobilized magnetic particles and biotin can be mentioned. Thereby, ssDNA having cell binding ability can be separated from the amplified nucleic acid duplex, and unnecessary coexisting substances contained in the PCR reaction solution such as DNA polymerase can be removed. Thereafter, the same operation is performed using the recovered ssDNA as a library pool.

上述の核酸分子とターゲット細胞との混合、ターゲット細胞と結合した核酸分子の分離、PCR増幅、増幅された核酸分子を再びターゲット細胞との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸分子は、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。   A series of operations from mixing the above-described nucleic acid molecule and target cell, separation of the nucleic acid molecule bound to the target cell, PCR amplification, and use of the amplified nucleic acid molecule again for binding to the target cell are performed in several rounds. By repeating rounds, nucleic acid molecules that bind to target cells more specifically can be selected. The obtained nucleic acid molecule can be subjected to sequence analysis by a technique well known in the art.

3.癌細胞の検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係るDNAアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合する機能を有することから、当該ヒト大腸癌細胞の検出において好適に用いることができ、本発明のDNAアプタマーを含む検出用組成物は、ヒト大腸癌に対する腫瘍マーカーとしても用いることができる。
3. Composition for detecting cancer cell, detection method and kit As described above, the DNA aptamer according to the present invention has a function of specifically binding to human colon cancer cells. The detection composition containing the DNA aptamer of the present invention can be suitably used for detection, and can also be used as a tumor marker for human colorectal cancer.

具体的には、本発明のDNAアプタマーを含む検出用組成物をヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答(シグナルの有無)を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する。   Specifically, the detection composition containing the DNA aptamer of the present invention is brought into contact with a sample collected from a living body selected from the group consisting of human colon cells, colon tissue, blood, serum and plasma, and then the sample The presence of human colorectal cancer cells is detected by observing the response (the presence or absence of a signal) due to the binding between the DNA and the aptamer.

当該生体から採取された試料は、動物から採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、in vitro細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。 The sample collected from the living body is collected from an animal, and the form thereof is not particularly limited as long as it is a sample that can be secured with minimal invasiveness, a secretory fluid, an in vitro cell culture fluid component sample, or the like.

また、大腸細胞の存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においてはDNAアプタマーの5’末端又は3’末端にTAMRA(登録商標)、FITC等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においてはDNAアプタマーの5’末端又は3’末端にCy3.5(登録商標)、TAMRA(登録商標)、FITC等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール(SH)基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。 In addition, the “response” for detecting the presence of colon cells is preferably a fluorescence response or a Raman scattering response, and as described above, in the fluorescence response, at the 5 ′ end or 3 ′ end of the DNA aptamer. It is preferable to link a fluorescent labeling agent such as TAMRA (registered trademark) or FITC. In the Raman scattering response, a fluorescent labeling agent such as Cy3.5 (registered trademark), TAMRA (registered trademark), FITC or the like is linked to the 5 ′ end or 3 ′ end of the DNA aptamer, and the thiol (SH) group, It is preferable to introduce an alkylamino group, an aromatic amino group, or a carboxyl group and to adsorb it on, for example, the gold nanoparticle surface.

また、本発明のヒト大腸癌細胞の検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるためDNAアプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいてDNAアプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該DNAアプタマーが固相担体上に固定されたDNAアレイの態様で提供されることができる。   In addition, the composition for detecting human colon cancer cells of the present invention can be provided as a kit containing a DNA aptamer in order to improve its convenience and portability. In the kit, the DNA aptamer can be provided usually in the form of an aqueous solution dissolved at an appropriate concentration, or in the form of a DNA array in which the DNA aptamer is immobilized on a solid phase carrier.

例えば、DNAアプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によってDNAアプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。   For example, biotin is bound to the end of a DNA aptamer to form a complex, streptavidin is immobilized on the surface of the solid support, and the DNA aptamer is immobilized on the solid support by the interaction of biotin and streptavidin. can do. The kit may appropriately contain other reagents as necessary. For example, additives such as a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a buffering agent, and a tonicity agent may be used as an additive. These blending amounts can be appropriately selected by those skilled in the art.

4.医薬組成物及びDDS
別の態様において、本発明は、上記DNAアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の検出、診断、転移予防又は治療用医薬組成物を提供するものである。好ましくは、当該医薬組成物は、DNAアプタマーに加えて、有効量のヒト大腸癌の検出、診断、転移予防又は治療のための医薬化合物(有効成分)、及び医薬上許容される担体を含むことができる。例えば、本アプタマーを金ナノ粒子に結合したものを用いて、癌の温熱療法用の試薬として利用できる可能性がある。
4). Pharmaceutical composition and DDS
In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for detecting, diagnosing, preventing or treating metastasis of human colorectal cancer, comprising the above DNA aptamer. Preferably, the pharmaceutical composition contains, in addition to a DNA aptamer, an effective amount of a pharmaceutical compound (active ingredient) for detection, diagnosis, metastasis prevention or treatment of human colorectal cancer, and a pharmaceutically acceptable carrier. Can do. For example, there is a possibility that this aptamer bound to gold nanoparticles can be used as a reagent for cancer thermotherapy.

上記「ヒト大腸癌」は、好ましくはColo205細胞と関連するヒト大腸癌である。「転移予防又は治療」には、癌細胞の遊離、移動、転移、浸潤または増殖の抑制、アポトーシスの誘導が含まれ得る。転移の抑制とは、癌細胞が原発巣から異なる部位に到達し、該部位において癌を二次的に生じることを抑制することを意味する。   The “human colorectal cancer” is preferably human colorectal cancer associated with Colo205 cells. “Metastasis prevention or treatment” can include cancer cell release, migration, metastasis, suppression of invasion or proliferation, induction of apoptosis. Suppression of metastasis means that cancer cells reach different sites from the primary lesion and prevent secondary cancer from occurring at the sites.

本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分は、ヒト大腸癌の転移予防又は治療に有効なものであれば、特に限定されるものではないが、好ましくは抗癌剤である。かかる抗癌剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、化学療法剤、分子標的治療薬、これら以外の他の抗癌剤等が挙げられる。   The active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is effective for preventing or treating metastasis of human colon cancer, but is preferably an anticancer agent. Examples of such anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, chemotherapeutic agents, molecular targeted therapeutic agents, other anticancer agents other than these.

アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、クロラムブチル、ジブロモダルシトール、チオテパ、カルムスチン、ブスルファンなどが挙げられる。 Examples of the alkylating agent include nitrogen mustard, chlorambutyl, dibromodalcitol, thiotepa, carmustine, busulfan and the like.

代謝拮抗剤としては、6−メルカプトプリン、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、シタラビン、エノシタビン、メトトレキセートなどが挙げられる。   Examples of the antimetabolite include 6-mercaptopurine, fluorouracil, tegafur, doxyfluridine, cytarabine, enocitabine, methotrexate and the like.

抗生物質としては、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ドキソルビシン、THP−アドリアマイシン、アクチノマイシンDなど、その他の抗癌剤としては、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロホスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、メシル酸イマニチブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、メルファラン、L−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィランなどが挙げられる。   Antibiotics include mitomycin C, bleomycin, pepromycin, doxorubicin, THP-adriamycin, actinomycin D, and other anticancer agents include amrubicin hydrochloride, irinotecan hydrochloride, ifosfamide, etoposidetate, gefinitib, cyclophosphamide, cisplatin, trastuzumab , Fluorouracil, imatinib mesylate, methotrexate, rituxan, adriamycin, carboplatin, tamoxifen, camptothecin, melphalan, L-asparaginase, acecraton, schizophyllan and the like.

分子標的治療薬の標的は細胞表面抗原、増殖因子・受容体・シグナル伝達系、細胞周期、アポトーシス、テロメア・テロメラーゼ、転移・血管新生などに分類される。   Targets of molecular targeted therapeutic agents are classified into cell surface antigens, growth factors / receptors / signal transduction systems, cell cycle, apoptosis, telomere / telomerase, metastasis / angiogenesis.

細胞表面抗原を標的とする分子標的治療薬は抗体であることが多い。代表はRituximib(Rituxan)、Trastuzumab、Cetuximab 、Oncophage、Provengeなどが挙げられる。   Molecular targeted therapeutics that target cell surface antigens are often antibodies. Representative examples include Rituximb (Rituxan), Trastuzumab, Cetuximab, Oncophage, and Provenge.

増殖因子・受容体・シグナル伝達系にかかわる分子標的治療薬は特に限定するものではないが、Trastzumabやc−kitおよびBCR−ABLチロシンキナーゼ阻害薬、特にEGFRチロシンキナーゼなどが挙げられる。   The molecular targeted therapeutic agent related to the growth factor / receptor / signal transduction system is not particularly limited, and examples thereof include Trastumab, c-kit and BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors, particularly EGFR tyrosine kinase.

大腸癌の分子標的治療薬としては、VEGFそのものに対する抗体であるBevacizumabや、Thalidomide、Lenalidomideなどが挙げられる。   Examples of molecular targeted therapeutic agents for colorectal cancer include Bevacizumab, Thalidomide, Lenalimide, which is an antibody against VEGF itself.

大腸癌の分子標的治療薬として現在検討されているものとして1)抗VEGF抗体Bevacizumab、2)抗EGFR抗体Cetuximab、3)抗EGFR抗体Panitumumabなどが挙げられる。   Currently studied as molecular target therapeutics for colorectal cancer include 1) anti-VEGF antibody Bevacizumab, 2) anti-EGFR antibody Cetuximab, and 3) anti-EGFR antibody Panitumab.

本発明の医薬組成物中に含まれる医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。   Examples of the pharmaceutically acceptable carrier contained in the pharmaceutical composition of the present invention include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, and stearic acid. Lubricants such as magnesium and aerosil, fragrances such as citric acid and menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspending agents such as methylcellulose and polyvinylpyrrolidone, and interfaces Examples include, but are not limited to, dispersants such as active agents, diluents such as water and physiological saline, and base waxes.

本発明の医薬組成物の癌細胞内への導入を促進するために、当該組成物には、さらに核酸導入用試薬を含むこともできる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、DOGS(トランスフェクタム)、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。   In order to promote introduction of the pharmaceutical composition of the present invention into cancer cells, the composition may further contain a reagent for nucleic acid introduction. As the reagent for introducing nucleic acid, cationic lipids such as atelocollagen, liposome, nanoparticle, lipofectin, lipfectamine, DOGS (transfectam), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDAB, HDAB, polybrene, or polyethyleneimine are used. I can do it.

本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to, for example, mammals (eg, humans, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).

本発明の医薬組成物は、多様な製剤形態、例えば、カプセル剤、錠剤、液剤等の剤形をとることができ、限定はしないが、より一般的には、液剤化され、注射剤とされるか、または、経口剤とされるか、又は徐放剤とされる。   The pharmaceutical composition of the present invention can take various dosage forms, for example, capsules, tablets, liquids and the like, but is not limited, but more generally, it is liquefied and made into injections. Or an oral agent or a sustained-release agent.

当該注射剤は、当該技術分野における周知の方法より調製することができる。例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等の適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。   The injection can be prepared by a well-known method in the technical field. For example, it can be prepared by dissolving in an appropriate solvent such as sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc., sterilizing by filtration with a filter or the like, and then filling in an aseptic container.

経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化される。   Oral preparations are formulated into dosage forms such as tablets, granules, fine granules, powders, soft or hard capsules, solutions, emulsions, suspensions, syrups and the like.

徐放剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、マイクロカプセル等の剤形に製剤化される。製剤化する場合には、好ましくは、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等の安定化剤が添加され得る。   As a sustained release agent, it is formulated into dosage forms such as tablets, granules, fine granules, powders, soft or hard capsules, microcapsules and the like. In the case of formulating, a stabilizer such as albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol or the like can be preferably added.

さらに、本発明の医薬組成物の製剤化においては、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等の必要な補助添加物を含んでもよい。   Furthermore, in the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention, necessary auxiliary additives such as excipients, solubilizers, antioxidants, soothing agents, tonicity agents and the like may be included.

液状製剤とした場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。   In the case of a liquid preparation, it is desirable to store it after removing moisture by freeze storage or freeze drying. The freeze-dried agent is used by re-dissolving it by adding distilled water for injection at the time of use.

また、徐放剤とした場合、徐放用担体として例えば、可溶性コラーゲン又は可溶性コラーゲン誘導体、ゼラチン等の蛋白質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。   In the case of a sustained release agent, examples of sustained release carriers include soluble collagen or soluble collagen derivatives, proteins such as gelatin, ceramic porous bodies, polyamino acids, polylactic acid, chitin or chitin derivatives, water-swellable polymer gels, etc. Can be used.

本発明の医薬組成物は、その形態に応じた適切な投与経路により投与され得る。経口的に又は非経口的投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。また、徐放剤の形態にして生体内、例えば患部、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by an appropriate administration route depending on the form. It can be administered orally or parenterally, but is preferably administered parenterally. For example, it can be administered into a vein, artery, subcutaneous, intramuscular, etc. in the form of an injection. Moreover, it can administer by implanting in the living body, for example, an affected part, subcutaneous, intramuscular, etc. in the form of a sustained release agent.

投与量及び投与回数等は、投与の目的、投与方法、癌の種類、大きさ、投与対象者の状況(性別、年齢、体重など)によって異なるが、基本的には上記有効成分における望ましい投与形態に従う。   The dose and frequency of administration vary depending on the purpose of administration, administration method, type and size of cancer, and the situation (gender, age, body weight, etc.) of the subject of administration, but basically a desirable dosage form for the above active ingredients Follow.

また、本発明のDNAアプタマーをリポソームやナノ粒子等の輸送材料の表面に付着もしくは内包させることによって、当該輸送材料中に含まれる医薬成分をヒト大腸癌細胞に選択的に輸送することができる。従って、更なる態様において、本発明は上記DNAアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステムを提供するものである。   In addition, by attaching or encapsulating the DNA aptamer of the present invention to the surface of a transport material such as a liposome or a nanoparticle, a pharmaceutical component contained in the transport material can be selectively transported to human colon cancer cells. Accordingly, in a further aspect, the present invention provides a drug delivery system for preventing or treating metastasis of human colorectal cancer, comprising the above DNA aptamer.

当該ドラッグデリバリーシステムによって輸送され得る医薬成分は、典型的には上述の抗癌剤であるが、ヒト大腸癌の転移予防又は治療に有用な物質である限り、それら以外にもトキシン、癌成長阻害遺伝子、自殺遺伝子、又は、ヒト大腸癌の成長及び転移に重要な役割を果たす遺伝子の発現を阻害するsiRNA(small interfering RNA)等であることもできる。   The pharmaceutical ingredient that can be transported by the drug delivery system is typically the above-described anticancer agent, but as long as it is a substance useful for preventing or treating metastasis of human colon cancer, in addition to these, a toxin, a cancer growth inhibitory gene, It can also be a siRNA (small interfering RNA) that inhibits the expression of a suicide gene or a gene that plays an important role in the growth and metastasis of human colon cancer.

本発明は、プレターゲティングストラテジーを用いて、本発明のDNAアプタマーを標的化可能なコンジュゲートに結合して被験者に投与し、所望により非標的化部位に残存するDNAアプタマーをクリアリングした後、診断物質又は治療物質を標的化部位に結合させることができる。アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチンに基づくプレターゲティングストラテジーは、「Detection and Therapy of Lesions with Biotin/Avidin Conjugates.」と題されたGoldenbergの米国特許第5,525,338号に記載されるように用いられ得る。アビジン/ストレプトアビジン系は、高度に多用途であり、そしていくつかの構成で用いられている。本発明のDNAアプタマーは、ストレプトアビジンまたはビオチンとカップリングされ得る。この後に、それぞれ、ビオチンとまたはアビジン/ストレプトアビジンとコンジュゲートされている診断物質又は治療物質が投与される。別の構成は、ビオチンコンジュゲートされた本発明のDNAアプタマーを最初に標的化する3ステップアプローチを用いることができ、その後にストレプトアビジン/アビジンによる架橋が続き、次いでビオチンコンジュゲートされた診断剤又は治療剤が与えられる。本発明のDNAアプタマーに対するビオチンおよびアビジン/ストレプトアビジンコンジュゲートの合成方法は、当分野において周知である。   The present invention uses a pretargeting strategy to bind the DNA aptamer of the present invention to a targetable conjugate and administer it to a subject, optionally clearing the DNA aptamer remaining at the non-targeted site, and then diagnosis. The substance or therapeutic substance can be bound to the targeting site. A pre-targeting strategy based on avidin or streptavidin and biotin can be used as described in Goldenberg US Pat. No. 5,525,338 entitled “Detection and Therapy of Lesions with Biotin / Avidin Conjugates.” . The avidin / streptavidin system is highly versatile and has been used in several configurations. The DNA aptamer of the present invention can be coupled with streptavidin or biotin. This is followed by administration of a diagnostic or therapeutic substance conjugated with biotin or avidin / streptavidin, respectively. Another configuration can use a three-step approach that initially targets biotin-conjugated DNA aptamers of the invention, followed by streptavidin / avidin cross-linking, followed by biotin-conjugated diagnostic agent or A therapeutic agent is given. Methods for synthesizing biotin and avidin / streptavidin conjugates for the DNA aptamers of the present invention are well known in the art.

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited by these.

[実施例1] アプタマーの選別
Cell−SELEX法を用いて、34塩基のランダムな配列を有するDNAプールからCOLO205大腸がん細胞に対し特異的に結合するアプタマーの選別を行った。Cell−SELEX法の各工程は以下のとおりである。
用いるランダムDNAは1本鎖であるが、これを以後センス鎖とする。
[Example 1] Selection of aptamers Aptamers that specifically bind to COLO205 colon cancer cells were selected from a DNA pool having a random sequence of 34 bases using the Cell-SELEX method. Each step of the Cell-SELEX method is as follows.
The random DNA to be used is a single strand, which is hereinafter referred to as a sense strand.

DNAプールは、以下の配列を有する全長が70塩基でランダム配列部分(N)が34塩基のオリゴDNAを用いた。
DNA pool:Random34(日本遺伝子研究所社製)
・配列: 5’−GCC TGT TGT GAG CCT CCT(N34)CGC TTA TTC TTG TCT CCC−3’(配列番号5)
・長さ: 70塩基(ランダム配列は中央の34塩基)
・分子量: 21391.3 g/mol
・モル吸光係数: 630475 L/mol・cm
The DNA pool used was an oligo DNA having the following sequence with a total length of 70 bases and a random sequence part (N) of 34 bases.
DNA pool: Random 34 (manufactured by Nippon Genetic Institute)
- sequence: 5'-GCC TGT TGT GAG CCT CCT (N 34) CGC TTA TTC TTG TCT CCC-3 '( SEQ ID NO: 5)
・ Length: 70 bases (random base is 34 bases in the center)
Molecular weight: 21391.3 g / mol
Molar extinction coefficient: 630475 L / mol · cm

ランダム配列の両末端の塩基配列はPCRの時に用いるプライマー配列である。
1μM濃度に調製したDNAプール100μLを準備する。シャーレ上で培地RPMI−1640により培養したCOLO205細胞(細胞濃度1×10セル/mL)をEDTA含有0.5%トリプシン溶液ではがし取り、これを再度同培地200μLに分散させたものと、準備した1μMのDNAプール100μLとを混合した。その後、37℃インキュベーター内に1時間放置し、細胞とDNAの相互作用を促した。その後ターゲット結合性DNAと非結合性DNAを1500rpm5分間の遠心操作により分離し、上澄み液を取り除いたのち沈降した細胞をリン酸バッファー1mLで洗浄した。この洗浄操作を2度繰り返したのち、細胞に200mLのリン酸バッファーを添加し、95℃で10分加熱し、細胞に吸着したDNAをはがした。終了後細胞を混合せずに13000×g、5分間の遠心操作を行い、上澄み液を回収した。
The base sequences at both ends of the random sequence are primer sequences used during PCR.
Prepare 100 μL of DNA pool prepared to a concentration of 1 μM. COLO205 cells (cell concentration 1 × 10 6 cells / mL) cultured on a petri dish with a culture medium RPMI-1640 were removed with an EDTA-containing 0.5% trypsin solution and dispersed again in 200 μL of the same medium; The prepared 1 μM DNA pool (100 μL) was mixed. Thereafter, it was left in a 37 ° C. incubator for 1 hour to promote the interaction between cells and DNA. Thereafter, target-binding DNA and non-binding DNA were separated by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitated cells were washed with 1 mL of phosphate buffer. After repeating this washing operation twice, 200 mL of phosphate buffer was added to the cells, and the cells were heated at 95 ° C. for 10 minutes to peel off the DNA adsorbed on the cells. After completion, the cells were not mixed and centrifuged at 13000 × g for 5 minutes, and the supernatant was collected.

回収した上澄み液には細胞吸着性能を有するセンス鎖DNAが含まれているので、これを、PCR法を用いて増幅した。プライマーは、上記ランダムDNAの共通配列と相補的な18塩基のプライマ−を用いた。アンチセンス鎖を構成するプライマ−の5’末端側には、後述するように1本鎖DNA(センス鎖)の分離を可能にするためビオチン修飾を施してある。増幅したDNAは2重鎖構造をしているため、この2重鎖から目的とするセンス鎖を、磁性粒子を用いて図1に示した方法により回収した。すなわち、増幅したDNAにストレプトアビジンを加えて磁性微粒子に吸着させ、磁石により磁性微粒子を回収した後上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性微粒子と結合していない1本鎖DNAを回収した。
この回収した1本鎖DNAを再びターゲットとする細胞と混合し、上記手順を繰り返した。6サイクルしたところで次世代シークエンサーionPGMTMを用いて配列解析し、相同鎖1000本以上見出された配列のDNAのみ5’末端に赤色蛍光色素(CY3.5)を導入し細胞の認識試験を行った。
実際に用いたDNAの構造は以下のとおりである。
Since the collected supernatant liquid contains sense strand DNA having cell adsorption ability, it was amplified using PCR. As a primer, an 18-base primer complementary to the common sequence of the random DNA was used. As will be described later, biotin modification is applied to the 5 ′ end side of the primer constituting the antisense strand to enable separation of single-stranded DNA (sense strand). Since the amplified DNA has a double-stranded structure, the target sense strand was recovered from this double strand by the method shown in FIG. 1 using magnetic particles. That is, streptavidin is added to the amplified DNA and adsorbed on the magnetic fine particles. After collecting the magnetic fine particles with a magnet, the supernatant is removed, and then the single-stranded DNA that is not bound to the magnetic fine particles is recovered in the supernatant by denaturation with an alkaline buffer. did.
The recovered single-stranded DNA was mixed with the target cells again, and the above procedure was repeated. After 6 cycles, sequence analysis was performed using the next-generation sequencer ionPGM , and a red fluorescent dye (CY3.5) was introduced into the 5 ′ end of only DNA having a sequence of 1000 or more homologous strands to perform a cell recognition test. It was.
The structure of the actually used DNA is as follows.

<配列番号1>
5’−CCGTGTGGTGGGGGTTGGGGGTTGTCGTTCGCCG−3’
<配列番号2>
5’−CGAGTGGGGGTATGCTTGGGGGTGTCGTTCGCCG−3’
<SEQ ID NO: 1>
5'-CCGTGGTGTGGGGGTTGGGGGGTTGTCGTCCGCG-3 '
<SEQ ID NO: 2>
5′-CGAGTGGGGGTATGCTTGGGGGTGTCGTTCGCCG-3 ′

[実施例2]蛍光標識DNAアプタマーによる大腸がん細胞COLO205の染色
COLO205細胞を培養シャーレで培養し、細胞数が10〜10になるまで培養した。これにシークエンサー解析により見出されたCOLO205細胞に対して親和性のあるDNAアプタマーの5’末端をCY3.5(商標)で修飾したものの100μM溶液を調製した。これを、培養シャーレに分散させながら最終濃度10μMになるように添加した。これを37℃1時間インキュベーターに静置した。その後、HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)で細胞を3回洗浄した後、さらにHBSSを2mL添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡IX51により観察した。
[Example 2] Staining of colon cancer cells COLO205 with fluorescently labeled DNA aptamer COLO205 cells were cultured in a culture dish and cultured until the number of cells reached 10 6 to 10 7 . A 100 μM solution was prepared by modifying the 5 ′ end of a DNA aptamer having affinity for COLO205 cells found by sequencer analysis with CY3.5 (trademark). This was added to a final concentration of 10 μM while being dispersed in the culture dish. This was left still in an incubator at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the cells were washed three times with HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), and further observed with an inverted fluorescence microscope IX51 made by Olympus in a state where 2 mL of HBSS was added.

その結果を図2〜図5に示す。
図2は、配列番号1に示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の実像であり、図3は、その蛍光イメージングを表した図である。
また、図4は、配列番号2に示す塩基配列を有するDNAアプタマーで染色したColo205細胞の実像であり、図5は、その蛍光イメージングを表した図である。
これらの結果より明らかなように、ほとんどの細胞において、特に、培養シャーレに接着する細胞で強い蛍光を示すことが分かる。
The results are shown in FIGS.
FIG. 2 is a real image of Colo205 cells stained with a DNA aptamer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and FIG. 3 is a diagram showing the fluorescence imaging thereof.
4 is a real image of Colo205 cells stained with a DNA aptamer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and FIG. 5 is a diagram showing the fluorescence imaging thereof.
As is clear from these results, it can be seen that, in most cells, strong fluorescence is exhibited particularly in cells that adhere to the culture dish.

Claims (19)

配列番号1又は2で示されるヌクレオチド配列からなり、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー。   A DNA aptamer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and specifically binding to human colon cancer cells. 配列番号1又は2で示されるヌクレオチド配列において、1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするDNAアプタマー。   The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 has a sequence containing 1 to 3 nucleotide substitutions, deletions or additions, and specifically binds to human colon cancer cells DNA aptamer. ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するDNAアプタマーであって、
5’−P1−X−P2−3’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Xは、1)配列番号1又は2で示されるヌクレオチド配列、又は2)配列番号1又は2で示されるヌクレオチド配列において、1〜3個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するヌクレオチド配列であり、
P1及びP2は、PCR増幅のために導入された第1及び第2プライマー認識配列である、DNAアプタマー。
A DNA aptamer that specifically binds to human colon cancer cells,
5'-P1-X-P2-3 '
Having a nucleotide sequence represented by:
X has 1) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or 2) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, which has a sequence containing 1 to 3 nucleotide substitutions, deletions, or additions. And a nucleotide sequence that specifically binds to human colon cancer cells,
P1 and P2 are DNA aptamers that are first and second primer recognition sequences introduced for PCR amplification.
P1は、配列番号3で示される第1プライマー認識配列であり、及び
P2は、配列番号4で示される第2プライマー認識配列である、請求項3に記載のDNAアプタマー。
The DNA aptamer according to claim 3, wherein P1 is a first primer recognition sequence represented by SEQ ID NO: 3, and P2 is a second primer recognition sequence represented by SEQ ID NO: 4.
前記ヒト大腸癌細胞が、Colo205細胞である、請求項1〜4のいずれか1に記載のDNAアプタマー。   The DNA aptamer according to any one of claims 1 to 4, wherein the human colon cancer cells are Colo205 cells. 糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換からなる群より選択される、少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1〜5のいずれか1に記載のDNAアプタマー。   6. The method according to claim 1, comprising at least one chemical modification selected from the group consisting of chemical substitution at the sugar chain moiety, chemical substitution at the phosphate ester moiety, and chemical substitution at the nucleobase moiety. Or a DNA aptamer according to claim 1. 5’末端又は3’末端に蛍光標識を有する、請求項1〜6のいずれか1に記載のDNAアプタマー。   The DNA aptamer according to any one of claims 1 to 6, which has a fluorescent label at the 5 'end or 3' end. 前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン(GFP)、蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 750、ローダミン、6−カルボキシテトラメチルローダミン、TAMRA(登録商標)、フィコエリスリン(PE)、フィコシアニン(PC)、PC5、PC7、Cy色素、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TexasRed、アロフィコシアニン(APC)、アミノメチルクマリンアセテート(AMCA)、Marina Blue、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、 Pacific Blue、 SPRD、 テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R110、mC1B、CellTracker色素、CFSE、JC−1、PKH、DCFH−DA、DHR、FDA、Calcein AM、ニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、acridine(Acd)、dansyl(Dns)、7−ジメチルアミノクマリン−4−アセティックアシッド(DMACA)、5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホニックアシッド(EDANS)、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン9から選ばれる一種以上を含む発光波長421nmから712nmの有機系蛍光団である、請求項7に記載のDNAアプタマー。   The fluorescent label is green fluorescent protein (GFP), fluorescent protein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 6-carboxyfluorocein-aminohexyl, fluorescein derivative, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor. 647, Alexa Fluor 750, rhodamine, 6-carboxytetramethylrhodamine, TAMRA (registered trademark), phycoerythrin (PE), phycocyanin (PC), PC5, PC7, Cy dye, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5. 5, Cy7, Texas Red, allophycocyanin (APC), aminomethylcoumarin acetate (AMCA), Marina Blue, Casc de Blue, Cascade Yellow, Pacific Blue, SPRD, Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), R110, mC1B, CellTracker dye, CFSE, JC-1, PKH, DCFH-DA, DHR, FDA, Calcein AM, Nitrobenzodia Azole (NBD) group, dimethylaminosulfonylbenzooxadiazole group, acidine (Acd), dansyl (Dns), 7-dimethylaminocoumarin-4-acetic acid (DMACA), 5-((2-aminoethyl) amino ) Emission wavelength including one or more selected from naphthalene-1-sulfonic acid (EDANS), naphthalene, anthracene and protoporphyrin 9 to 421 nm to 7 An organic fluorophore 2 nm, DNA aptamer according to claim 7. 請求項1〜8のいずれか1に記載のDNAアプタマーが蛍光発光し得る金属ナノ粒子(量子ドット)表面に吸着されているDNAアプタマー。   A DNA aptamer, wherein the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 8 is adsorbed on the surface of metal nanoparticles (quantum dots) that can emit fluorescence. 5’末端または3’末端に蛍光標識を有する請求項1〜8のいずれかに記載のDNAアプタマーがラマン散乱活性を有する金属である金、銀、銅、鉄及び珪素から選ばれる一種以上の粒子に吸着されているDNAアプタマー。   The one or more particles selected from gold, silver, copper, iron and silicon, wherein the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 8 having a fluorescent label at the 5 'end or the 3' end is a metal having Raman scattering activity DNA aptamer adsorbed on the surface. 5’末端又は3’末端が、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結される、請求項1〜6のいずれか1に記載のDNAアプタマー。   The DNA aptamer according to any one of claims 1 to 6, wherein the 5 'end or 3' end is linked to biotin, avidin or streptavidin or other specific binding tag peptide. 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用組成物。   A composition for detecting human colon cancer cells, comprising the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11. 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用キット。   A kit for detecting human colon cancer cells, comprising the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11. 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを用いることを特徴とする、ヒト大腸癌の検出方法。   A method for detecting human colon cancer, comprising using the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11. 前記DNAアプタマーをヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とDNAアプタマーとの結合による応答を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する工程を含む、請求項14に記載の検出方法。   Contacting the DNA aptamer with a sample collected from a living body selected from the group consisting of human colon cells, colon tissue, blood, serum, and plasma, and observing a response due to the binding between the sample and the DNA aptamer. The detection method of Claim 14 including the process of detecting presence of a human colon cancer cell by. 前記応答が、蛍光応答である、請求項15に記載の検出方法。   The detection method according to claim 15, wherein the response is a fluorescence response. 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用医薬組成物。   A pharmaceutical composition for preventing or treating metastasis of human colorectal cancer, comprising the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11. ヒト大腸癌の転移予防又は治療用医薬組成物の製造のための請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーの使用。   Use of the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11 for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating metastasis of human colon cancer. 請求項1〜11のいずれか1に記載のDNAアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステム。   A drug delivery system for preventing or treating metastasis of human colon cancer, comprising the DNA aptamer according to any one of claims 1 to 11.
JP2014146632A 2014-07-17 2014-07-17 Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205 Pending JP2016021883A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014146632A JP2016021883A (en) 2014-07-17 2014-07-17 Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014146632A JP2016021883A (en) 2014-07-17 2014-07-17 Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016021883A true JP2016021883A (en) 2016-02-08

Family

ID=55269256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014146632A Pending JP2016021883A (en) 2014-07-17 2014-07-17 Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2016021883A (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017094733A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 日産化学工業株式会社 Dna aptamer binding to molecular targeting drug and method for detecting molecular targeting drug using same
CN116426532A (en) * 2023-06-08 2023-07-14 时夕(广州)生物科技有限公司 Targeting aptamer and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09506507A (en) * 1993-12-03 1997-06-30 ゼネカ・リミテッド CA55.1 Antigen-directed binding structure
WO2011158829A1 (en) * 2010-06-15 2011-12-22 日産化学工業株式会社 Metal particles for surface-enhanced raman scattering and molecular sensing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09506507A (en) * 1993-12-03 1997-06-30 ゼネカ・リミテッド CA55.1 Antigen-directed binding structure
WO2011158829A1 (en) * 2010-06-15 2011-12-22 日産化学工業株式会社 Metal particles for surface-enhanced raman scattering and molecular sensing

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 621, JPN6018013039, 2008, pages 101 - 108, ISSN: 0003780062 *
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 37, no. 3, JPN6018013044, 2009, pages 866 - 876, ISSN: 0003780063 *
PLOS ONE, vol. Vol.5, No.12, e14269, JPN6018013037, December 2010 (2010-12-01), pages 1 - 14, ISSN: 0003899496 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017094733A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 日産化学工業株式会社 Dna aptamer binding to molecular targeting drug and method for detecting molecular targeting drug using same
EP3385382A4 (en) * 2015-11-30 2019-05-29 Nissan Chemical Corporation Dna aptamer binding to molecular targeting drug and method for detecting molecular targeting drug using same
US10640772B2 (en) 2015-11-30 2020-05-05 Nissan Chemical Industries, Ltd. DNA aptamers binding to molecular targeted agents and detection method of molecular targeted medicine using the same
CN116426532A (en) * 2023-06-08 2023-07-14 时夕(广州)生物科技有限公司 Targeting aptamer and application thereof
CN116426532B (en) * 2023-06-08 2023-09-12 时夕(广州)生物科技有限公司 Targeting aptamer and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021107463A (en) Use of exosomes for treatment of disease
JP2021152022A (en) Cell penetrating antibodies
JP2017506074A (en) Aptamer construct
Jaiswal et al. Cellular communication via microparticles: role in transfer of multidrug resistance in cancer
WO2016158851A1 (en) Nucleic acid aptamer capable of bonding to vascular endothelial growth factor receptor
WO2007072221A2 (en) Surface marker-directed cancer therapeutics
Li et al. Targeted Delivery of Doxorubicin Using a Colorectal Cancer‐Specific ssDNA Aptamer
US11008575B2 (en) DNA aptamers against cancer and uses thereof in delivery of therapy and diagnosis of cancer
CN107868786B (en) Single-stranded DNA aptamer of multidrug resistant colon cancer cell
EP3149167B1 (en) Aptamer targeting mage-a3 peptide and uses thereof
CN108350459B (en) Cancer cell-binding DNA aptamers
WO2017094733A1 (en) Dna aptamer binding to molecular targeting drug and method for detecting molecular targeting drug using same
US9731032B2 (en) Aptamers for tumor initiating cells
JP2014217311A (en) Dna aptamer bound to cancer cell
JP2016021883A (en) Nucleic acids that specifically bind to human colon cancer cell colo205
JP2015019606A (en) Nucleic acid specifically binding to non-small cell lung cancer
JP2023509902A (en) IMMUNE ANTI-CANCER COMPOSITION FOR CANCER TREATMENT
WO2016129531A1 (en) Dna aptamer capable of binding to non-small cell lung cancer cell (h1975)
JP2023500946A (en) Glypican-3 specific modified aptamer and use thereof
JP2015019607A (en) Nucleic acid specifically binding to mouse colon cancer colon26
US11807854B2 (en) CD44 aptamer
Zhang et al. Multifunctional spiky topological nanocapsules for the discrimination and differential inhibition of inflammation and cancer
WO2022051724A2 (en) Nucleic acid-derivatized therapeutics
JP2017099311A (en) Dna aptamer binding to chronic myelocytic leukemia cell (k562)
JP2016146766A (en) DNA APTAMER BOUND TO NON-SMALL-CELL LUNG CANCER CELL (a431)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170529

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20180320

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180424

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20181023