JP2015059898A - Immunoassay analysis method and device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イムノアッセイ分析方法およびイムノアッセイ分析装置に関し、特に、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance:SPR)を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に好適なイムノアッセイ分析方法およびイムノアッセイ分析装置に関する。 The present invention relates to an immunoassay analysis method and an immunoassay analyzer, and more particularly, to a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon for detecting a substance to be detected contained in a sample liquid using surface plasmon resonance (SPR). The present invention relates to an immunoassay analysis method and an immunoassay analyzer suitable for a resonance fluorescence analysis method.
タンパク質やDNAなどの生体物質を検出する測定において、わずかな量の被検出物質を迅速に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、わずかな量の被検出物質に起因する微弱な光を、迅速にかつ高感度で検出する分析方法および分析装置が求められている。当該被検出物質を高感度で検出する1つの方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析(表面プラズモン励起増強蛍光分光(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy):SPFS)法が知られている。 In a measurement for detecting a biological substance such as protein or DNA, if a small amount of a substance to be detected can be detected quickly, it is possible to immediately grasp the patient's condition and perform treatment. Therefore, there is a need for an analysis method and an analysis apparatus that can detect faint light caused by a small amount of a substance to be detected quickly and with high sensitivity. As one method for detecting the target substance with high sensitivity, a surface plasmon resonance fluorescence analysis (Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy: SPFS) method is known.
SPFS法は、金や銀などからなる金属膜が所定の面上に形成されたプリズムを用いる。そして、表面プラズモン共鳴が生じる角度でプリズムを介して励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により金属膜上に捕捉された被検出物質、あるいは被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、励起された被検出物質あるいは蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、上記被検出物質の存在やその量の検出が可能である。 The SPFS method uses a prism in which a metal film made of gold or silver is formed on a predetermined surface. Then, when the metal film is irradiated with excitation light through the prism at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light can be generated on the surface of the metal film. The detected substance captured on the metal film or the fluorescent substance that labels the detected substance is selectively excited by the localized field light, and the fluorescence emitted from the excited detected substance or the fluorescent substance is detected. Thus, the presence of the substance to be detected and the amount thereof can be detected.
微弱な光を高い定量性で検出するためには、高感度な受光センサーを用いることが欠かせない。当該受光センサーとして、光電子増倍管(Photomultiplier:PMT)およびアバランシェフォトダイオード(APD)が用いられる。 In order to detect faint light with high quantitativeness, it is indispensable to use a highly sensitive light receiving sensor. As the light receiving sensor, a photomultiplier (PMT) and an avalanche photodiode (APD) are used.
受光センサーは、測定光量の範囲(以下、「検出レンジ」とも言う)を切り替えることによって、例えば、微量の被検出物質から十分量の被検出物質まで検出することが可能である。検出レンジを切り替える方法には、機械的な方法と電気的な方法とがある。機械的な方法とは、受光センサーに入射する光の光路に対して、ND(減光)フィルターを出し入れする方法であり、これにより、受光センサーに入射する光量を減少させ、検出レンジを切り替える(例えば、特許文献1参照)。電気的な方法とは、受光センサーの制御電圧を変更する方法であり、これにより、受光センサーの検出レンジを電気的に変更し、検出レンジを切り替える(例えば、非特許文献1参照)。 The light receiving sensor can detect, for example, from a very small amount of a substance to be detected to a sufficient amount of a substance to be detected by switching the range of the measurement light quantity (hereinafter also referred to as “detection range”). There are a mechanical method and an electrical method for switching the detection range. The mechanical method is a method in which an ND (attenuation) filter is put in and out of the optical path of light incident on the light receiving sensor, thereby reducing the amount of light incident on the light receiving sensor and switching the detection range ( For example, see Patent Document 1). The electrical method is a method of changing the control voltage of the light receiving sensor, whereby the detection range of the light receiving sensor is electrically changed and the detection range is switched (for example, see Non-Patent Document 1).
検出レンジは、通常、被検出物質を標識している蛍光物質からの蛍光の光量を受光センサーで一度検出し、検出された光量に基づいて判定される。そして、判定結果に基づいて、最適な検出レンジが選択される。そして、受光センサーの検出レンジは、当該最適な検出レンジに上記のいずれかの方法によって切り替えられる。その後、最適な検出レンジの受光センサーによって、被検出物質に係る上記蛍光の光量が検出される。 The detection range is usually determined based on the detected light amount once the light amount of the fluorescence from the fluorescent substance labeling the substance to be detected is detected once by the light receiving sensor. Then, an optimal detection range is selected based on the determination result. Then, the detection range of the light receiving sensor is switched to the optimum detection range by any one of the methods described above. Thereafter, the light amount of the fluorescence related to the substance to be detected is detected by the light receiving sensor having the optimum detection range.
上記の方法で検出レンジを切り替える場合には、被検出物質を蛍光標識した後に、検出レンジを切り替える時間がさらに必要となる。検出レンジを切り替える時間とは、上記機械的な方法では、NDフィルターを上記光路に対して進出、後退させる時間である。また、上記電気的な方法では、受光センサーの検出レンジを変更してから受光センサーが電気的に安定するまでの時間である。いずれの方法においても、検出レンジを切り替えには、例えば10秒程度を要する。 When the detection range is switched by the above method, it is necessary to further switch the detection range after the target substance is fluorescently labeled. The time for switching the detection range is the time for the ND filter to advance and retreat with respect to the optical path in the mechanical method. In the electrical method described above, it is the time from when the detection range of the light receiving sensor is changed until the light receiving sensor is electrically stabilized. In either method, for example, about 10 seconds are required to switch the detection range.
しかしながら、生化学反応によって被検出物質を蛍光物質で標識する場合では、標識した後に上記蛍光を測定するタイミングによっては、蛍光の測定の精度や再現性などが低下することがある。これは、生化学反応による被検出物質の蛍光標識化は、通常、被検出物質と蛍光物質との相互作用を利用しており、被検出物質の蛍光標識化が終了した時点から、被検出物質と蛍光物質との解離が経時的に発生するためである。このため、イムノアッセイ分析方法では、被検出物質の蛍光標識後、可能な限り迅速に上記蛍光を測定することが望まれている。 However, when the substance to be detected is labeled with a fluorescent substance by a biochemical reaction, the measurement accuracy or reproducibility of the fluorescence may decrease depending on the timing of measuring the fluorescence after labeling. This is because the fluorescent labeling of a substance to be detected by a biochemical reaction usually uses the interaction between the substance to be detected and the fluorescent substance, and the substance to be detected is detected after the fluorescent labeling of the substance to be detected is completed. This is because dissociation of the fluorescent substance with time occurs. For this reason, in the immunoassay analysis method, it is desired to measure the fluorescence as quickly as possible after fluorescent labeling of the substance to be detected.
本発明の目的は、受光センサーの検出レンジを切り替えても、当該切り替えのための超過時間を生じないイムノアッセイ分析方法およびイムノアッセイ分析装置を提供することである。 An object of the present invention is to provide an immunoassay analysis method and an immunoassay analyzer that do not cause an excess time for switching even if the detection range of a light receiving sensor is switched.
本発明は、蛍光物質で標識された被検出物質が流路中に固定化されている分析チップに向けて励起光を照射し、励起された前記蛍光物質からの蛍光を受光センサーで検出して、前記被検出物質の量を測定するイムノアッセイ分析方法において、前記蛍光物質とともに前記被検出物質を前記分析チップの流路に供給して、前記蛍光物質で標識化された前記被検出物質を前記流路中に固定化する第一固定化工程の後に、前記流路中の余剰な前記蛍光物質を除去するよう前記流路を洗浄する蛍光物質洗浄工程を行う際には、前記第一固定化工程後より前記蛍光物質洗浄工程が行われているまでの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第一放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第一全反射光の光量を検出する第一光量検出工程を行い、あるいは、前記被検出物質を前記分析チップの前記流路中に固定化する第二固定化工程の後に前記流路を洗浄する第一洗浄工程を行い、その後前記蛍光物質を前記流路に供給して前記流路中に固定化された前記被検出物質を前記蛍光物質で標識化する標識化工程を行い、その後前記流路中の余剰な前記蛍光物質を除去するよう前記流路を洗浄する第二洗浄工程を行う際には、前記第二固定化工程後より前記標識化工程の前までの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第二放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第二全反射光の光量を検出する第二光量検出工程を行い、または、前記標識化工程後より前記第二洗浄工程が行われているまでの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第三放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第三全反射光の光量を検出する第三光量検出工程を行い、前記被検出物質の量を測定するための前記蛍光物質からの前記蛍光を検出するために前記分析チップに向けて前記励起光を照射する前に、前記第一光量検出工程、前記第二光量検出工程および前記第三光量検出工程の少なくともいずれかにより検出された光量に基づいて、前記受光センサーの複数の検出レンジの中から一つの前記検出レンジを選択して、選択された前記検出レンジへの切り替えを行い、その後、前記被検出物質の量を測定するために、前記検出レンジが切り替えられた前記受光センサーにより前記蛍光物質からの前記蛍光を検出する、イムノアッセイ分析方法、を提供する。 The present invention irradiates excitation light toward an analysis chip in which a target substance labeled with a fluorescent substance is immobilized in a flow path, and detects fluorescence from the excited fluorescent substance with a light receiving sensor. In the immunoassay analysis method for measuring the amount of the substance to be detected, the substance to be detected is supplied to the flow path of the analysis chip together with the fluorescent substance, and the substance to be detected labeled with the fluorescent substance is supplied to the flow. When performing the fluorescent substance washing step of washing the flow path so as to remove excess fluorescent substance in the flow path after the first immobilization process of immobilizing in the path, the first immobilization process Before the fluorescent substance cleaning step is performed, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the amount of first emission light emitted from the analysis chip by the excitation light irradiation or For irradiation of the excitation light A first light quantity detection step for detecting the light quantity of the first total reflected light reflected by the analysis chip, or a second immobilization step for immobilizing the substance to be detected in the flow path of the analysis chip A first washing step for washing the flow path after the labeling, and then supplying the fluorescent substance to the flow path and labeling the target substance immobilized in the flow path with the fluorescent substance When performing the second washing step of washing the flow path so as to remove excess fluorescent substance in the flow path after the process, from after the second immobilization process to before the labeling process During this time, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the amount of second emission light emitted from the analysis chip by the irradiation of the excitation light or reflected by the analysis chip by the irradiation of the excitation light. Second to detect the amount of second total reflected light A quantity detection step is performed, or during the period from the labeling step until the second washing step is performed, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the analysis is performed by irradiation with the excitation light. Performing a third light quantity detection step of detecting a light quantity of the third emitted light emitted from the chip or a third total reflected light reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light, and the amount of the substance to be detected is determined. Before irradiating the excitation light toward the analysis chip to detect the fluorescence from the fluorescent material for measurement, the first light amount detection step, the second light amount detection step, and the third light amount detection Based on the amount of light detected by at least one of the steps, one detection range is selected from a plurality of detection ranges of the light receiving sensor, and switching to the selected detection range is performed. Then, in order to measure the amount of the substance to be detected, an immunoassay analysis method is provided in which the fluorescence from the fluorescent substance is detected by the light receiving sensor whose detection range is switched.
また、本発明は、分析チップの流路に固定された被検出物質を蛍光物質で標識し、前記流路における前記被検出物質が固定された部分に向けて光源から励起光を照射したとき、励起された前記蛍光物質からの蛍光を受光センサーで検出して、前記被検出物質の量を測定するためのイムノアッセイ分析装置において、前記被検出物質が固定された部分に向けて励起光を照射するための光源と、前記流路で発生する前記蛍光の光量を検出するための第一の受光センサーと、少なくとも前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの検出レンジを設定する制御部と、を有し、以下の(A)または(B)を満たす、イムノアッセイ分析装置。
(A)前記制御部は、前記蛍光物質で前記被検出物質が標識された後に前記流路が洗浄されている間または前記洗浄前(すなわち、前記被検出物質が固定された工程終了後、前記流路内の過剰な蛍光物質を洗浄除去されている間(洗浄完了)まで)に前記被検出物質が固定された部分に向けて前記励起光を照射することにより前記流路から放出される放出光の、前記第一の受光センサーによって検出された光量から、前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中から選択し、遅くとも前記流路の洗浄が完了するまでに、前記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの前記検出レンジへの切り替えを完了させる。
(B)前記光源から前記被検出物質が固定された部分に向けての前記励起光の照射により発生する前記分析チップでの全反射光の光量を検出するための第二の受光センサーをさらに有し、前記制御部は、前記被検出物質が固定されている、前記流路が前記洗浄される前または前記洗浄されている間(すなわち、前記被検出物質が固定された工程終了後、前記流路内の過剰な蛍光物質を洗浄除去されている間(洗浄完了)まで)に前記被検出物質が固定された部分に向けて前記励起光を照射することにより発生する前記全反射光の、前記第二の受光センサーによって検出された光量から、前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中からを選択し、遅くとも前記流路の洗浄が完了するまでに、前記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの前記検出レンジへの切り替えを完了させる。
Further, the present invention is to label the substance to be detected fixed in the flow path of the analysis chip with a fluorescent substance, and when irradiating excitation light from a light source toward the portion where the substance to be detected in the flow path is fixed, In an immunoassay analyzer for detecting the fluorescence from the excited fluorescent substance with a light receiving sensor and measuring the amount of the detected substance, the excitation light is irradiated toward the part where the detected substance is fixed. And a control for setting a detection range of the first light receiving sensor for detecting at least the light amount of the fluorescent light, and a first light receiving sensor for detecting the light amount of the fluorescent light generated in the flow path. And an immunoassay analyzer that satisfies the following (A) or (B).
(A) The control unit is configured so that the flow path is washed after the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance or before the washing (that is, after the process of fixing the substance to be detected is completed, Emission emitted from the channel by irradiating the excitation light toward the portion where the substance to be detected is fixed while the excess fluorescent substance in the channel is being cleaned and removed (until cleaning is completed) One detection range of the first light receiving sensor when detecting the light amount of the fluorescence is selected from a plurality of detection ranges from the light amount detected by the first light receiving sensor of the light, and the flow is at the latest. By the time the cleaning of the road is completed, the switching of the detection range of the first light receiving sensor to one detection range is completed.
(B) A second light receiving sensor for detecting the amount of total reflected light on the analysis chip generated by irradiation of the excitation light from the light source toward the portion where the substance to be detected is fixed is further provided. Then, the control unit fixes the detected substance, before the flow path is cleaned, or while the flow path is being cleaned (that is, after completion of the process of fixing the detected substance, The total reflected light generated by irradiating the excitation light toward the portion where the substance to be detected is fixed while the excessive fluorescent substance in the path is being washed away (until washing is completed), One detection range of the first light receiving sensor for detecting the light amount of the fluorescence is selected from a plurality of detection ranges from the light amount detected by the second light receiving sensor, and the flow path is washed at the latest. Until , The detection range of the first light receiving sensor to complete the switch to one of the detection range.
本発明によれば、蛍光物質によって被検出物質を標識した後の流路の洗浄操作が終了するときには、受光センサーの検出レンジを最適な検出レンジに切り替え終えることが可能である。よって、本発明によれば、受光センサーの検出レンジを、例えば最適な検出レンジに切り替えることができ、かつ当該切り替えのための時間が測定の準備に要する時間から超過しない。その結果、流路の洗浄後に直ちに被検出物質の量を測定することができるので、イムノアッセイ分析において、被検出物質と蛍光物質との解離の影響を低減することができる。よって、本発明によれば、被検出物質の量の多少に関わらず、迅速にかつ高い定量性で被検出物質の量を検出することができる。 According to the present invention, when the cleaning operation of the flow path after the detection target substance is labeled with the fluorescent substance is completed, the detection range of the light receiving sensor can be switched to the optimum detection range. Therefore, according to the present invention, the detection range of the light receiving sensor can be switched to, for example, an optimal detection range, and the time for the switching does not exceed the time required for preparation for measurement. As a result, since the amount of the substance to be detected can be measured immediately after washing the channel, the influence of dissociation between the substance to be detected and the fluorescent substance can be reduced in the immunoassay analysis. Therefore, according to the present invention, the amount of the substance to be detected can be detected quickly and with high quantitativeness regardless of the amount of the substance to be detected.
本発明に係るイムノアッセイ分析方法は、分析チップに励起光を照射し、分析チップに配置された被検出物質を標識する蛍光物質の励起によって発生する蛍光の光量を受光センサーにより検出することで、被検出物質の量を測定する。上記イムノアッセイ分析方法の例には、表面プラズモン共鳴蛍光分析(SPFS)法が含まれる。以下、本発明の実施の一形態として、SPFS法による実施形態を説明する。まず、本発明の一実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置(以下「SPFS装置」とも言う)を説明する。 The immunoassay analysis method according to the present invention irradiates an analysis chip with excitation light, and detects the amount of fluorescence generated by excitation of a fluorescent substance that labels the detection target substance arranged on the analysis chip by a light receiving sensor. Measure the amount of the detected substance. Examples of the immunoassay analysis method include surface plasmon resonance fluorescence analysis (SPFS). Hereinafter, an embodiment using the SPFS method will be described as an embodiment of the present invention. First, a surface plasmon resonance fluorescence analyzer (hereinafter also referred to as “SPFS apparatus”) according to an embodiment of the present invention will be described.
図1は、本発明の一実施の形態に係るSPFS装置100の構成を示す模式図である。SPFS装置100は、誘電体プリズム上の金属膜に対して励起光を表面プラズモン共鳴が生じる角度で入射することで、金属膜表面上に局在場光(一般に「増強されたエバネッセント波」または「増強電場」とも呼ばれる)を発生させることができる。この局在場光により金属膜上に配置された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光の光量を検出することで、被検出物質の濃度または量を検出する。
FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of an
SPFS装置100は、図1に示されるように、励起光学系ユニット110、受光光学系ユニット120、送液ユニット130および制御部160から構成される。SPFS装置100は、被検出物質の測定では、不図示のチップホルダーに分析チップ10を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ10について先に説明し、その後にSPFS装置100の各構成要素について説明する。
As shown in FIG. 1, the
分析チップ10は、図1に示されるように、入射面21、成膜面22および出射面23を有するプリズム20と、成膜面22に形成された金属膜30と、成膜面22または金属膜30上に配置された流路蓋40とを有する。通常、分析チップ10は、分析のたびに交換される。分析チップ10は、好ましくは、各片の長さが数mm〜数cmである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
As shown in FIG. 1, the
プリズム20は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム20は、入射面21、成膜面22および出射面23を有する。入射面21は、励起光学系ユニット110からの励起光αをプリズム20の内部に入射させる。成膜面22の上には、金属膜30が形成される。プリズム20の内部に入射した励起光αは、金属膜30で反射する。より具体的にはプリズム20と金属膜30との界面(成膜面22)で反射する。出射面23は、金属膜30で反射した励起光αをプリズム20の外部に出射させる。
The
プリズム20の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム20の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面22であり、一方の脚に対応する面が入射面21であり、他方の脚に対応する面が出射面23である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面21と出射面23とが対称になり、励起光αのS波成分がプリズム20内に滞留しにくくなる。
The shape of the
入射面21は、励起光αが励起光学系ユニット110に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面21に垂直に入射しないように、入射面21の角度が設定される。たとえば、入射面21と成膜面22との角度および成膜面22と出射面23との角度は、いずれも約80°である。
The
なお、分析チップ10の設計により共鳴角(およびその極近傍にある増強角)が凡そ決まる。設計要素は、プリズム屈折率、金属の屈折率、金属の膜厚、金属の消衰係数、励起波長などである。金属膜に固定された被検出物質の量に応じて共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
It should be noted that the resonance angle (and the enhancement angle in the vicinity thereof) is substantially determined by the design of the
プリズム20は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム20の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム20の材料は、好ましくは、屈折率が1.4〜1.6であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
The
金属膜30は、プリズム20の成膜面22上に形成されている。これにより、成膜面22に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜30中の自由電子との間で相互作用、すなわち表面プラズモン共鳴が生じ、金属膜30の表面上に局在場光を生じさせることができる。
The
金属膜30の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜30の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜30は、金薄膜である。金属膜30の形成方法は、特に限定されない。金属膜30の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜30の厚みは、特に限定されないが、30〜70nmの範囲内が好ましい。
The material of the
また、図1では図示しないが、金属膜30のプリズム20と対向しない面(金属膜30の表面)には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されていてもよい。捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜30上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
Although not shown in FIG. 1, a capturing body for capturing a substance to be detected may be fixed to the surface of the
流路蓋40は、金属膜30のプリズム20と対向しない面上に、流路を挟んで配置されている。金属膜30がプリズム20の成膜面22の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋40は、流路を挟んで成膜面22上に配置されていてもよい。流路蓋40は、金属膜30(およびプリズム20)と共に、液体が流れる流路を形成する。当該液体の例には、被検出物質の溶液である試料液および薬液が含まれ、薬液の例には、蛍光物質の溶液および洗浄液が含まれる。捕捉体は、不図示の流路内に露出している。流路の両端は、流路蓋40の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路内へ液体が注入されると、流路内において、当該液体は捕捉体に接触する。
The
流路蓋40は、金属膜30上から放出された光(プラズモン散乱光および蛍光)に対して透明な材料からなる。流路蓋40の材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋40は、これらの光を受光光学系ユニット120に導くことができればよい。たとえば、少なくとも、被検出物質を標識した蛍光物質からの蛍光を外部に取り出す面が光学的に透明であれば、流路蓋40の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋40は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜30またはプリズム20に接合されている。
The
このように、分析チップ10は、プリズム20、プリズム20の一面上に配置された金属膜30、および金属膜30の表面が露出する流路、を含む。上記のように構成される分析チップ10には、流路内に蛍光物質が供給される。そして、金属膜上に供給され、蛍光物質で標識された被検出物質を有する分析チップは、チップホルダーに所定の姿勢で設置保持される。本実施の形態では、蛍光物質による被検出物質の標識と並行して、受光センサー127の検出レンジを調整する。当該検出レンジの調整については、後に詳述する。
As described above, the
励起光学系ユニット110は、励起光αをプリズム20の流路に向けて出射するための構成と、金属膜30への励起光αの入射角度を走査するための構成とを含む。励起光学系ユニット110は、例えば、光源ユニット111、角度調整機構112および光源制御部113によって構成される。ここで、「励起光」とは、被検出物質を標識する蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。「励起光」は、蛍光物質を直接励起させる光であれば、被検出物質に直接照射され、蛍光物質を間接的に励起させる光であれば、分析チップにおける、蛍光物質の励起を発生させる場所に照射される。たとえば、励起光αは、金属膜30の表面上に局在場光を生じさせる光であり、この局在場光により蛍光物質を間接的に励起させる光である。励起光αは、プリズムを介して金属膜30に、表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射される。
The excitation
光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜30表面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット111は、例えば、励起光の光源、ビーム整形光学系、APC機構および温度調整機構(いずれも不図示)を有する。励起光αの光源は、例えば、レーザーダイオード(以下「LD」とも言う)である。
The
上記LDは、チップホルダーに保持された分析チップ10の入射面21に向けて励起光α(シングルモードレーザー光)を出射する。より具体的には、光源ユニット111は、分析チップ10の金属膜30に対して励起光αが表面プラズモン共鳴を生じる角度で、金属膜30に対するP波のみを入射面21に向けて出射する。
The LD emits excitation light α (single mode laser light) toward the
光源ユニット111は、分析チップの上記流路における上記被検出物質が固定された部分(以下、「被検出物質固定部」とも言う)に向けて励起光αを照射するための光源を含む。励起光αは、前述したように、被検出物質を標識する蛍光物質を励起させるのであれば、上記流路中の上記被検出物質固定部以外の分析チップの一部分に照射されてもよい。本実施の形態では、当該光源は、プリズム20と金属膜30との界面に励起光αを照射する。当該光源の種類は、励起光αを出射可能であれば特に限定されず、LDでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
The
光源ユニット111における上記ビーム整形光学系は、例えば、コリメーター、バンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリットおよびズーム手段によって構成される。ビーム整形光学系は、上記の構成要素の全てによって構成されていてもよいし、一部によって構成されていてもよい。コリメーターは、LDから出射された励起光αをコリメートする。LDの出射光は、射出状態で既に形状が扁平であり、且つ偏光方向が概ね一方に偏っている。コリメート化しても、該LDは、全反射条件(浅い角度)で照射される位置において照射面が円形になるように、短軸側から入射するように保持されている。
The beam shaping optical system in the
バンドパスフィルターは、光源ユニット111からの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源ユニット111からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源ユニット111からの励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜30にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜30表面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
The band pass filter turns the excitation light α from the
光源ユニット111における上記APC機構は、コリメートされた後の励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出し、励起光αの光量が一定になるように、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、出力を一定に制御している。
The APC mechanism in the
光源ユニット111における上記温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。LDの出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動する。このため、温度調整機構でLDの温度を一定に保つことにより、当該波長を一定に制御する。
The temperature adjustment mechanism in the
角度調整機構112は、金属膜30(プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22))への励起光αの入射角度を走査して調整する。角度調整機構112は、プリズム20を介して金属膜30(成膜面22)の所定の位置に所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。
The
たとえば、角度調整機構112は、光源ユニット111を励起光αの光軸と直交する軸(図1の紙面に対して垂直な軸)を中心として回動させる。このとき、入射角度を走査しても金属膜30(成膜面22)上での励起光αの入射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。
For example, the
入射光軸と直交する軸を回転軸として光源ユニット111を回転(1軸回転)して励起光αの入射角度を走査することで、プリズム20に、入射角を変えて励起光αを照射する。当該入射角度の走査のための回転を行っても、分析チップ10の金属膜30(成膜面22)上での励起光αの入射位置がほとんどずれないように、上記回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における2つの励起光αの光軸の交点近傍(成膜面22上の励起光αの入射位置と入射面21との間)に設定することで、励起光αの入射位置のズレを極小化することができる。
The
励起光αの入射角度のうち、上記走査によりプラズモン散乱光の光量が最大となる角度が増強角度である。増強角度またはその近傍の角度に励起光αの入射角度を設定することで、大きな強度の蛍光を測定することが可能となる。なお、分析チップに付随のプリズムの材質、形状、金属膜厚、流路内の流体の屈折率などにより基本の励起光入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の材質や量、プリズム側の誤差などにより若干条件のゆらぎが発生する。このため、測定毎に最適な増強角度を求めることが好ましい。増強角度は、例えば、小数点第一位まで求められる。 Among the incident angles of the excitation light α, the angle at which the amount of plasmon scattered light is maximized by the scanning is the enhancement angle. By setting the incident angle of the excitation light α to the enhancement angle or an angle in the vicinity thereof, it becomes possible to measure fluorescence with high intensity. The basic excitation light incident conditions are determined by the prism material, shape, metal film thickness, refractive index of fluid in the flow path, etc. attached to the analysis chip, but the material and amount of the fluorescent substance in the flow path, the prism side A slight fluctuation of the condition occurs due to the error of. For this reason, it is preferable to obtain an optimal enhancement angle for each measurement. The enhancement angle is obtained up to the first decimal place, for example.
光源制御部113は、光源ユニット111を構成する前述した各種機器を作動させ、制御し、光源ユニット111の出射光の出射を制御する。光源制御部113は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The light
受光光学系ユニット120には、金属膜30(成膜面22)への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光や蛍光などの光が入射する。受光光学系ユニット120は、例えば、受光ユニット121、位置切り替え機構122およびセンサー制御部123によって構成される。
Light such as plasmon scattered light or fluorescence generated by irradiation of the excitation light α onto the metal film 30 (deposition surface 22) is incident on the light receiving
受光ユニット121は、分析チップ10の金属膜(成膜面22)の法線方向に配置される。受光ユニット121は、例えば、第一レンズ124、光学フィルター125、第二レンズ126および受光センサー127によって構成される。
The
第一レンズ124は、例えば、集光レンズであり、金属膜30上から出射される光を集光する。第二レンズ126は、例えば、結像レンズであり、第一レンズ124で集光された上記光を受光センサー127の受光面に再結像させる。両レンズの間には、光軸に沿って光が略平行に進む光路が形成される。光学フィルター125は、両レンズの間に配置されている。
The
光学フィルター125は、蛍光成分のみを受光センサー127に導き、高いS/N比で当該蛍光成分を検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光)を除去する。光学フィルター125の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター125は、例えば、所定の光成分を反射することで除去する多層膜からなるフィルターであるが、所定の光成分を一般的には吸収することで除去する色ガラスフィルターであってもよい。
The
受光センサー127は、微少量の被検出物質からの微弱な蛍光を検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー127は、上記蛍光の光量を検出するための受光センサーである。受光センサー127は、例えば、ヘッドオンタイプの光電子増倍管(PMT)である。
The
位置切り替え機構122は、光学フィルター125の位置を、受光ユニット121における光路中の位置または当該光路から外れた位置に切り替える。位置切り替え機構122は、例えば、回転駆動部と、光学フィルター125を有するターンテーブルやラックアンドピニオンなどの、回転運動によって光学フィルター125を上記光路に対して進出させ、当該光路から後退させる公知の機構とによって構成される。
The
センサー制御部123は、受光センサー127による光量の検出や、受光センサー127の検出レンジの管理、変更、などを制御する。センサー制御部123は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The
なお、受光ユニット121は、励起光αが金属膜30の裏面に入射したときに金属膜30の表面側に発生する光が受光センサー127の受光面に入射したときの入射領域を、上記受光面よりも小さくするように、構成されている。
In addition, the
送液ユニット130は、分析チップ10に試料液または薬液を供給する。送液ユニット130は、例えば、薬液チップ131、シリンジポンプ132および送液ポンプ駆動機構133によって構成される。
The
薬液チップ131は、試料液および薬液を収容する容器である。薬液チップ131は、通常、試料液および薬液の種類に応じて複数配置される。
The
シリンジポンプ132は、シリンジ134と、シリンジ134内を往復動作可能なプランジャー135とによって構成される。プランジャー135の往復運動によって、試料液または薬液の吸引および排出が定量的に行われる。
The
シリンジ134が交換可能であると、シリンジ134の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などの影響を抑える観点から好ましい。シリンジ134が交換可能に構成されていないと、シリンジ134内を洗浄する構成をさらに有することにより、シリンジ134を交換せずに使用することが可能となる。このため、シリンジ134の消費を抑制する観点から好ましい。
If the
送液ポンプ駆動機構133は、例えば、プランジャー135の駆動装置と、シリンジポンプ132の移動装置とによって構成される。
The liquid feed
プランジャー135の駆動装置は、プランジャー135を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む当該駆動装置は、シリンジポンプ132の送液量や送液速度を一定に管理し、分析チップ10の残液量を一定に管理する観点から好ましい。
The drive device of the
シリンジポンプ132の移動装置は、例えば、シリンジポンプ132を、シリンジ134の軸方向(例えば垂直方向)と、当該軸方向を横断する方向(例えば水平方向)との二方向に自在に動かす装置である。シリンジポンプ132の移動装置は、例えば、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
The moving device of the
送液ユニット130は、シリンジ134の先端の位置を検出する装置をさらに有することが、シリンジ134と分析チップ10との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ10内での残液量を一定に管理する観点から好ましい。
The
送液ユニット130は、薬液チップ131より各種の薬液などの液体を吸引し、分析チップ10まで移動し、当該薬液を分析チップ10に供給する。この際、プランジャー135を、分析チップ10に対して進出、後退する方向、例えば上下方向、に動かすことで、分析チップ10中の流路内を液体が往復し、当該流路内の液体が攪拌される。上記の操作を行う観点から、分析チップ10における、分析チップ10に供給されるべき液体が収容される液挿入部は、多層フィルムで保護されており、シリンジ134が当該液体の供給のために当該多層フィルムを貫通した時に、上記液挿入部を密閉するように、分析チップ10およびシリンジ134が構成されていることが好ましい。
The
上記の操作により、当該液体の濃度の均一化や、分析チップ10の所定位置への被検出物質の固定化反応の促進などが行われる。反応後の液体は、再びシリンジポンプ132で吸引され、薬液チップ131などに排出される。上記の動作の繰り返しにより、各種薬液による反応、洗浄などを実施し、分析チップ10の所定位置に、被検出物質が配置され、当該被検出物質が蛍光物質によって標識される。
By the above operation, the concentration of the liquid is made uniform, and the immobilization reaction of the substance to be detected at a predetermined position of the
制御部160は、角度調整機構112、光源制御部113、位置切り替え機構122、センサー制御部123および送液ポンプ駆動機構133を駆動させ、制御する。制御部160は、受光センサー127の検出レンジの設定を始め、種々の操作を実行させ、制御する。制御部160は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The
本実施の形態において、SPFS装置100は、プリズム20の一面上に配置された金属膜30に対して、プリズム20を介して励起光αを照射し、金属膜30上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質を選択的に励起させ、蛍光物質から放出された蛍光を検出して被検出物質の量を測定する。また、本実施の形態において、SPFS装置100は、当該測定前の洗浄操作が終了する前に、受光センサー127の検出レンジの判定と、受光センサー127の検出レンジの適切な範囲への切り替えとを完了する。SPFS装置100におけるシーケンス制御の一例に基づき、SPFS装置100によるSPFS方法の実施を説明する。
In the present embodiment, the
まず、制御部160は、図2に示されるように、チップホルダーに保持された分析チップ10に対し、以下の操作を行う。
First, as illustrated in FIG. 2, the
分析チップ10の流路内には、保湿剤が塗布されている場合がある。たとえば、分析チップ10の金属膜30上に、被検出物質を捕捉する固相膜が配置されている場合では、当該固相膜での当該被検出物質を捕捉する基質特異性が長期間の固定の間に低下しないよう、通常、当該固相膜に保湿剤が塗布される。当該固相膜は、例えば、前述した捕捉体を含む膜である。当該固相膜が金属膜30に配置されている場合、制御部160は、送液ユニット130に、分析チップ10の流路内の保湿剤を洗浄させる(ステップ201)。当該洗浄により、分析チップ10における被検出物質を捕捉する高い基質特異性が回復する。
A humectant may be applied in the flow path of the
次いで、制御部160は、送液ユニット130に、試料液を薬液チップ131から分析チップ10の流路内に供給させる(ステップ202)。それにより、免疫反応(1次反応)によって、上記流路中(金属膜30の表面の固相膜)に被検出物質が捕捉される。次いで、制御部160は、送液ユニット130に、余剰な試料液を上記流路から除去させ、pH緩衝液などの適当な洗浄液で上記流路を洗浄させる(ステップ203)。
Next, the
次いで、制御部160は、励起光反射フィルターなどの光学フィルター125が受光ユニット121に配置されている場合には、位置切り替え機構122に、光学フィルター125を受光ユニット121における光路から退避させる(ステップ204)。
Next, when the
さらに、制御部160は、励起光学系ユニット110と受光光学系ユニット120を協働させて、増強角を測定させ(ステップ205)、励起光学系ユニット110に、増強角が得られる位置および向きに光源ユニット111を配置させる(ステップ206)。次いで、制御部160は、受光光学系ユニット120に、受光ユニット121における光路中に光学フィルター125を配置させる(ステップ207)。受光光学系ユニット120中に減光フィルターを配置している場合には、制御部160は、必要に応じて、減光フィルターを上記光路中から退避させる。
Further, the
そして、制御部160は、光学フィルター125が介在するときに受光センサー127で検出された光量の受光センサー127の出力値(光学ブランク値)を記録する(ステップ208)。
Then, the
次いで、制御部160は、送液ユニット130に、蛍光物質を含む薬液を薬液チップ131から分析チップ10の流路内に供給させ、抗原標識化反応(2次反応)によって、当該流路中に固定された上記被検出物質に上記蛍光物質を結合させる(ステップ209)。
Next, the
こうして上記被検出物質が蛍光物質で標識化され、被検出物質の量に応じた光量の蛍光が得られる。標識化反応後、余剰な蛍光物質は、被検出物質の量に関わりなく発光し、ノイズとなる。よって、制御部160は、送液ユニット130に、上記流路中の余剰な蛍光物質を除去させ、当該流路を洗浄させる。制御部160は、当該洗浄と並行して、受光センサー127の検出レンジを判定し、設定する。洗浄操作と判定、設定操作の並行する二つの操作をそれぞれ説明する。
In this way, the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance, and fluorescence having a light amount corresponding to the amount of the substance to be detected is obtained. After the labeling reaction, the excess fluorescent substance emits light regardless of the amount of the substance to be detected, resulting in noise. Therefore, the
[洗浄操作]
制御部160は、図3に示されるように、送液ユニット130に、洗浄操作を複数回、例えば三回、に分けて実施させる。制御部160は、送液ユニット130に、流路中の上記薬液を吸引、除去させ、洗浄液を上記流路に供給させ、上記流路から吸引、除去させる一回目の洗浄を行わせる(ステップ210)。次いで、制御部160は、送液ユニット130に、洗浄液を上記流路に供給させ、上記流路から吸引、除去させる二回目の洗浄を行わせる。さらに、制御部160は、送液ユニット130に、二回目の洗浄と同じ操作による三回目の洗浄を行わせる(ステップ211)。
[Cleaning operation]
As shown in FIG. 3, the
[判定、設定操作]
制御部160は、上記の洗浄操作を実施させる一方で、図4に示されるように、受光センサー127の検出レンジを調整する。たとえば、制御部160は、二回目の洗浄における洗浄液の供給後(洗浄中)に、励起光学系ユニット110に、上記増強角で励起光αを分析チップ10に入射させ、受光光学系ユニット120に、蛍光の光量を検出させる(ステップ411)。当該検出後、制御部160は、分析チップ10の二回目の洗浄における洗浄液の吸引、除去が行われ、次いで三回目の洗浄が行われる。
[Judgment and setting operations]
The
制御部160は、分析チップ10の洗浄を行う一方で、ステップ411における光量の検出によって得られた出力値と、受光センサー127の現在の検出レンジとを比較し、例えば、当該出力値の桁数に応じて予め設定されている検出レンジから最適な検出レンジを選択する(ステップ412)。次いで、制御部160は、受光光学系ユニット120に、必要に応じて受光センサー127の制御電圧を変更させ、受光センサー127の検出レンジを、選択された最適な検出レンジに切り替える(ステップ413)。検出レンジが切り替えられた受光センサー127の感度は、遅くとも三回目の洗浄の終了前には安定する。
While cleaning the
三回目の洗浄の終了後、直ちに、制御部160は、励起光学系ユニット110に、分析チップ10に向けて励起光αを出射させるとともに、受光光学系ユニット120に、蛍光の光量を検出させる(ステップ212)。当該蛍光の光量は、上記の判定、設定操作によって選択され、切り替えられた最適な検出レンジの受光センサー127によって検出される。
Immediately after completion of the third cleaning, the
蛍光の測定において、プリズム20へ導かれた励起光αは、入射面21からプリズム20内に入射し、金属膜30を照射する。すると、表面プラズモン共鳴により金属膜30の表面上に発生したプラズモン散乱光および蛍光が、受光ユニット121へ出射する。
In the measurement of fluorescence, the excitation light α guided to the
プラズモン散乱光は、光学フィルター125により反射または吸収され、蛍光は、受光センサー127に入射する。受光センサー127における当該蛍光の光量に係る出力値(蛍光シグナル)(S)は、受光センサー127から出力され、制御部160またはセンサー制御部123に記憶され、蛍光シグナル(S)から、ステップ208で測定された光学ブランク値(oB)を引いた差が算出され、被検出物質の量に相関する蛍光強度(ΔS)が求められる(下記式参照)。そして、被検出物質の量が求められる。上記の計算は、制御部160が行ってもよいし、センサー制御部123で行われてもよい。
ΔS=S−oB
The plasmon scattered light is reflected or absorbed by the
ΔS = S−oB
以上に説明したように、SPFS装置100は、SPFS方法を実施する。
As described above, the
SPFS装置100は、高い定量性で被検出物質の量を迅速に測定することができる。これは、被検出物質の標識化後の流路の洗浄中に受光センサー127の検出レンジの最適化が完了するためである。以下、流路の洗浄と検出レンジの最適化についてさらに説明する。なお、以下の説明において、三回の洗浄操作のそれぞれにおいて、流路中の液体の95%が除去されるものとする。
The
標識化後の流路には、標識化で余った蛍光物質の全てが残存している。この残存している蛍光物質の流路中の量を「100%」とすると、一回目の洗浄(ステップ210)中の流路中の蛍光物質の量は、100×0.05より「5%」となる。二回目の洗浄中の流路中の蛍光物質の量は、100×0.05×0.05より「0.25%」となり、三回目の洗浄中の流路中の蛍光物質の量は、100×0.05×0.05×0.05より「0.0125%」となる(図3)。 In the flow path after labeling, all of the fluorescent material remaining after labeling remains. Assuming that the amount of the remaining fluorescent material in the channel is “100%”, the amount of the fluorescent material in the channel during the first cleaning (step 210) is “5%” from 100 × 0.05. " The amount of the fluorescent substance in the flow path during the second cleaning is “0.25%” from 100 × 0.05 × 0.05, and the amount of the fluorescent substance in the flow path during the third cleaning is It becomes “0.0125%” from 100 × 0.05 × 0.05 × 0.05 (FIG. 3).
SPFS方法では、金属膜30の表面上の蛍光物質を選択的に励起させる。このため、基本的には、金属膜30の表面に捕捉された被検出物質と結合した蛍光物質が優先的に励起される。とはいえ、流路内に存在する蛍光物質も多少は励起される。したがって、蛍光物質の流路内の濃度が高ければ、流路中の蛍光物質は、測定値に影響を及ぼす。
In the SPFS method, the fluorescent material on the surface of the
このため、流路の洗浄中に蛍光の光量を検出しても、得られる出力値は、被検出物質の測定値としては正確ではない。しかしながら、流路がある程度洗浄されていれば、当該流路の蛍光の光量による出力値から、本測定(被検出物質の測定)の蛍光の光量のオーダー(桁数)程度であれば、十分正確に判定することが可能である。たとえば、本測定における蛍光物質の量が、5pg〜50ng程度であり、受光センサー127の設定されている複数の検出レンジのそれぞれは、蛍光物質の濃度に換算して2〜3桁の範囲であるとする。
For this reason, even if the amount of fluorescent light is detected during cleaning of the flow path, the obtained output value is not accurate as the measured value of the substance to be detected. However, if the flow path has been washed to some extent, it is sufficiently accurate if it is about the order (number of digits) of the amount of fluorescent light in this measurement (measurement of the substance to be detected) from the output value by the amount of fluorescent light in the flow path. Can be determined. For example, the amount of the fluorescent substance in this measurement is about 5 pg to 50 ng, and each of the plurality of detection ranges in which the
一回目の洗浄中の流路には、蛍光物質の量は、「5%」もある。したがって、一回目の洗浄中の流路中の蛍光物質の量は、本測定における蛍光物質の量に比べて大きすぎる。このため、一回目の洗浄中に流路の蛍光の光量を検出しても、得られる出力値は、本測定で検出されるべき蛍光の光量による出力値よりも大きすぎる。よって、当該本測定用の受光センサー127の検出レンジの判定の材料としては適切ではない。しかしながら、二回目の洗浄中の流路における蛍光物質の量は「0.25%」である。また、三回目の洗浄中の流路における蛍光物質の量は「0.0125%」である。このように流路中の蛍光物質の量は、洗浄回数に応じて指数的に低下する。よって、二回目の洗浄中、より好ましくは3回目の洗浄中に、流路の蛍光の光量を検出すると、流路内に残存する蛍光物質の影響が十分に小さいので、本測定の測定レンジの判定材料として適した受光センサー127の出力値が得られる。
The amount of the fluorescent material is “5%” in the flow path during the first cleaning. Therefore, the amount of the fluorescent substance in the channel during the first cleaning is too large compared to the quantity of the fluorescent substance in this measurement. For this reason, even if the amount of fluorescent light in the flow path is detected during the first cleaning, the output value obtained is too larger than the output value based on the amount of fluorescent light to be detected in this measurement. Therefore, it is not suitable as a material for determining the detection range of the
検出レンジの最適化は、前述したように、光学フィルターの移動や受光センサーの制御電圧の安定などのための所定の待機時間を要する。しかしながら、当該待機時間は、概ね10秒前後であり、予め予測することが可能である。したがって、三回目の洗浄で流路から液体の吸引、除去するのに必要な排液時間が、上記待機時間よりも短い場合には、前述したように、二回目の洗浄中に、検出レンジの判定のための流路の光の光量の検出が行われる。三回目の洗浄における上記排液時間が上記待機時間よりも長い場合には、三回目の洗浄中に、検出レンジの判定のための光照射を行うことができる。なお、受光センサー127の検出レンジの切り替えを要さない場合には、当該検出レンジの切り替えは省略され、その後の待機時間は不要である。
As described above, optimization of the detection range requires a predetermined waiting time for moving the optical filter, stabilizing the control voltage of the light receiving sensor, and the like. However, the waiting time is approximately 10 seconds, and can be predicted in advance. Therefore, if the drain time required to suck and remove the liquid from the flow path in the third washing is shorter than the waiting time, as described above, the detection range is not changed during the second washing. The amount of light in the flow path for determination is detected. When the drainage time in the third cleaning is longer than the standby time, light irradiation for determination of the detection range can be performed during the third cleaning. In addition, when it is not necessary to switch the detection range of the
以上の説明から明らかなように、SPFS装置100は、被検出物質の蛍光標識後の上記流路の洗浄中に受光センサー127の最適な検出レンジを選択し、前記流路の洗浄が完了するまでに選択された最適な検出レンジへの切り替えを完了する。このため、SPFS装置100では、上記流路の洗浄後、直ちに、最適な検出レンジで本測定における蛍光の光量を検出することが可能である。よって、SPFS装置100は、受光センサー127の検出レンジを最適な検出レンジに切り替えても、当該切り替えに伴う操作時間の超過を生じずに、イムノアッセイ分析を行うことが可能となる。その結果、SPFS装置100は、被検出物質と蛍光物質との解離の影響を低減することができ、被検出物質の量の多少に関わらずに迅速かつ高い定量性で被検出物質の量を検出することができる。
As is clear from the above description, the
また、SPFS装置100は、受光センサー127の検出レンジを判定する際に、二回目の洗浄中の流路の蛍光の光量に基づいて、受光センサー127の最適な検出レンジを選択する。よって、受光センサー127の検出レンジを高い精度で最適化することが可能である。
Further, when the
また、SPFS装置100は、洗浄中の上記流路の蛍光の光量に基づいて受光センサー127の検出レンジを判定している。当該蛍光は、本測定の際に測定される光と同種の光である。よって、当該検出レンジの判定の精度をより高めることが可能である。
Further, the
なお、SPFS装置100では、上記蛍光以外の光の検出結果に基づいて、上記検出レンジを判定することが可能である。たとえば、増強角の測定(ステップ205)で測定された増強角と、被検出物質を固定する前の分析チップ10の既知の増強角の値(基準増強角)とを比較して、測定された増強角のシフト量を求める。当該シフト量は、金属膜30の表面に固定されている前記被検出物質の量を間接的に反映している。このため、当該シフト量から被検出物質の量が推定可能である。よって、制御部160は、上記の増強角の測定値と上記基準増強角との比較から求められる増強角のシフト値、予め求められている被検出物質の存在量と当該シフト値との関係、および、予め求められている被検出物質の存在量と検出される蛍光の光量との関係、の三者から、本測定における受光センサー127の最適な検出レンジを決定することが可能である。
Note that the
また、本発明では、上記増強角ではなく、共鳴角の測定値に基づいて受光センサー127の検出レンジを判定することも可能である。共鳴角を測定可能なSPFS装置を図5に示す。SPFS装置500は、図5に示されるように、フォトダイオード527をさらに有する以外は、前述したSPFS装置100と同じに構成されている。フォトダイオード527は、光源ユニット111から出射された励起光αが、分析チップ10で、例えば、金属膜30の面のうち、流路における上記被検出物質固定部とは反対側の面(金属膜30の裏面)で全反射した全反射光を受光するための第二の受光センサーである。励起光αは、分析チップ10における、流路における上記被検出物質固定部に局在場光を発生させる位置に照射され、この時、励起光αの成分のうち、局在場光の発生に寄与しない光の成分は、全反射する。フォトダイオード527は、例えば、全反射光の光軸と直交する軸(図5の紙面に対して垂直な軸)を中心として、分析チップ10に対して相対的に回動するように、配置されている。
In the present invention, it is also possible to determine the detection range of the
共鳴角の測定は、図6に示されるように、例えば、ステップ205における増強角の測定からステップ211における流路の三回目の洗浄までの操作と並行される。制御部160は、増強角の測定時における光源ユニット111からの入射光の入射角度を走査させながら、金属膜30の裏面で全反射した全反射光の光量をフォトダイオード527に検出させ、共鳴角を測定させる(ステップ611)。共鳴角は、フォトダイオード527で検出される全反射光の光量が最も小さいときの上記入射光の入射角度である。
As shown in FIG. 6, the measurement of the resonance angle is performed in parallel with, for example, the operation from the measurement of the enhancement angle in step 205 to the third cleaning of the flow path in step 211. The
そして、制御部160は、測定された当該共鳴角と、被検出物質を固定する前の分析チップ10の既知の共鳴角の値(基準共鳴角)とを比較して、測定された共鳴角のシフト量を求める。当該シフト量も、前記被検出物質の量を間接的に反映している。このため、当該シフト量から、金属膜30の表面に固定されている被検出物質の量が推定可能である。よって、制御部160は、上記の共鳴角の測定値と上記基準共鳴角との比較から求められる共鳴角のシフト値、予め求められている被検出物質の存在量と当該シフト値との関係、および、予め求められている被検出物質の存在量と検出される蛍光の光量との関係、の三者から、受光センサー127の本測定における最適な検出レンジを決定し(ステップ612)、受光センサー127の検出レンジを当該最適な検出レンジに設定する(ステップ613)。
Then, the
なお、上記の基準増強角および基準共鳴角には、例えば、分析チップ10の製造時に測定された分析チップ10に固有の値を利用することが可能である。しかしながら、当該基準増強角および基準共鳴角は、被検出物質を固定する前の分析チップ10から測定された値であってもよい。また、被検出物質の量と増強角または共鳴角のシフト値との相関や、被検出物質の量と蛍光の光量との相関などは、たとえば予め作成された検量線から求めることが可能である。さらに、受光センサー127の検出レンジの設定は、洗浄中の分析チップ10の流路の蛍光、増強角のシフト値、および共鳴角のシフト値のいずれか一つに基づいて行うことが可能であるが、これらの二以上または全てに基づいて行うことも可能である。
For the reference enhancement angle and the reference resonance angle, for example, values specific to the
また、SPFS装置100、500では、受光センサー127の制御電圧を変更することにより、受光センサー127の検出レンジを設定している。しかしながら、受光センサー127の検出レンジの設定方法は、他の方法であってもよい。たとえば、受光センサー127の検出レンジは、受光ユニット121の光路中に対して、光学フィルター125としてNDフィルターを進出、後退させることによって、変更させることが可能である。NDフィルターによる当該検出レンジの変更は、上記制御電圧の変更と並行してもよい。
In the
なお、前述した受光センサー127の検出レンジの調整は、SPFS装置100、500以外のイムノアッセイ分析装置にも適用可能である。たとえば、イムノアッセイ分析装置700は、図7に示されるように、光源ユニット711および受光ユニット727を有する。光源ユニット711から分析チップ70に入射した励起光は、分析チップ70の流路における上記被検出物質固定部に照射され、分析チップ70の流路に固定されている蛍光標識された被検出物質の蛍光物質を励起させる。励起によって発生する蛍光は、受光センサー727に入射し、検出される。このようなイムノアッセイ分析装置700にも、上記蛍光による受光センサー727の検出レンジの調整を適用することが可能である。
The adjustment of the detection range of the
また、被検出物質の固定化、蛍光物質による被検出物質の蛍光標識、流路の洗浄、および、上記被検出物質固定部の光量の検出、の各操作は、前述した順序に限定されず、本発明の効果が得られる範囲において、様々な順序で行うことが可能である。 In addition, the operations of immobilizing the substance to be detected, fluorescent labeling of the substance to be detected by the fluorescent substance, washing the flow path, and detecting the light amount of the substance to be detected fixed part are not limited to the order described above. As long as the effects of the present invention can be obtained, it can be performed in various orders.
たとえば、上記蛍光物質とともに上記被検出物質を上記分析チップの流路に供給して、上記蛍光物質で標識化された上記被検出物質を上記流路中に固定化する第一固定化工程の後に、上記流路中の余剰な上記蛍光物質を除去するよう上記流路を洗浄する蛍光物質洗浄工程を行うことが可能である。この場合には、上記第一固定化工程後より上記蛍光物質洗浄工程が行われているまでの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、第一放出光の光量または第一全反射光の光量を検出する第一光量検出工程を行うことができる。当該第一放出光は、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される光であり、例えば上記蛍光や上記プラズモン散乱光などである。上記第一全反射光は、上記励起光の照射により上記分析チップで反射された光である。 For example, after the first immobilization step of supplying the detected substance together with the fluorescent substance to the flow path of the analysis chip and immobilizing the detected substance labeled with the fluorescent substance in the flow path It is possible to perform a fluorescent substance cleaning step of cleaning the flow path so as to remove excess fluorescent substance in the flow path. In this case, during the period from the first immobilization step until the fluorescent substance washing step is performed, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the light amount of the first emitted light or the first A first light amount detection step for detecting the amount of total reflected light can be performed. The first emitted light is light emitted from the analysis chip by irradiation with the excitation light, and is, for example, the fluorescence or the plasmon scattered light. The first total reflected light is light reflected by the analysis chip by irradiation with the excitation light.
あるいは、上記被検出物質を上記分析チップの上記流路中に固定化する第二固定化工程の後に上記流路を洗浄する第一洗浄工程を行い、その後上記蛍光物質を上記流路に供給して上記流路中に固定化された上記被検出物質を上記蛍光物質で標識化する標識化工程を行い、その後上記流路中の余剰な上記蛍光物質を除去するよう上記流路を洗浄する第二洗浄工程を行うことが可能である。この場合には、上記第二固定化工程後より上記標識化工程の前までの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、第二放出光の光量または第二全反射光の光量を検出する第二光量検出工程を行うことができる。当該第二放出光は、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される光であり、例えば上記プラズモン散乱光である。上記第二全反射光は、上記励起光の照射により上記分析チップで反射された光である。 Alternatively, after the second immobilization step of immobilizing the substance to be detected in the flow channel of the analysis chip, a first washing step of washing the flow channel is performed, and then the fluorescent material is supplied to the flow channel. A labeling step of labeling the substance to be detected immobilized in the flow path with the fluorescent material, and then washing the flow path to remove excess fluorescent material in the flow path. Two cleaning steps can be performed. In this case, between the second immobilization step and before the labeling step, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the amount of the second emitted light or the second total reflected light is irradiated. A second light quantity detection step for detecting the light quantity can be performed. The second emitted light is light emitted from the analysis chip by irradiation with the excitation light, for example, the plasmon scattered light. The second total reflected light is light reflected by the analysis chip by irradiation with the excitation light.
または、上記被検出物質を上記分析チップの上記流路中に固定化する第二固定化工程の後に上記流路を洗浄する第一洗浄工程を行い、その後上記蛍光物質を上記流路に供給して上記流路中に固定化された上記被検出物質を上記蛍光物質で標識化する標識化工程を行い、その後上記流路中の余剰な上記蛍光物質を除去するよう上記流路を洗浄する第二洗浄工程を行うことが可能である。この場合には、上記標識化工程後より上記第二洗浄工程が行われているまでの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、第三放出光の光量または第三全反射光の光量を検出する第三光量検出工程を行うことができる。当該第三放出光は、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される光であり、例えば上記蛍光や上記プラズモン散乱光などである。上記第三全反射光は、上記励起光の照射により上記分析チップで反射された光である。 Alternatively, after the second immobilization step of immobilizing the substance to be detected in the flow channel of the analysis chip, a first washing step of washing the flow channel is performed, and then the fluorescent material is supplied to the flow channel. A labeling step of labeling the substance to be detected immobilized in the flow path with the fluorescent material, and then washing the flow path to remove excess fluorescent material in the flow path. Two cleaning steps can be performed. In this case, during the period from the labeling step to the time when the second washing step is performed, the excitation light is irradiated toward the analysis chip, and the amount of the third emitted light or the third total reflection is irradiated. A third light quantity detection step for detecting the quantity of light can be performed. The third emission light is light emitted from the analysis chip by irradiation of the excitation light, and is, for example, the fluorescence or the plasmon scattered light. The third total reflected light is light reflected by the analysis chip by irradiation with the excitation light.
そして、上記被検出物質の量を測定するための上記蛍光物質からの上記蛍光を検出するために上記分析チップに向けて上記励起光を照射する前に、上記第一光量検出工程、上記第二光量検出工程および上記第三光量検出工程の少なくともいずれかにより検出された光量に基づいて、上記受光センサーの複数の検出レンジの中から一つの上記検出レンジを選択して、選択された上記検出レンジへの切り替えを行う。その後、上記被検出物質の量を測定するために、上記検出レンジが切り替えられた上記受光センサーにより上記蛍光物質からの上記蛍光を検出する。 And before irradiating the said excitation light toward the said analysis chip in order to detect the said fluorescence from the said fluorescent substance for measuring the quantity of the said to-be-detected substance, said 1st light quantity detection process, said 2nd Based on the light amount detected by at least one of the light amount detection step and the third light amount detection step, one detection range is selected from the plurality of detection ranges of the light receiving sensor, and the selected detection range is selected. Switch to. Thereafter, in order to measure the amount of the substance to be detected, the fluorescence from the fluorescent substance is detected by the light receiving sensor whose detection range is switched.
前述の実施の形態の説明から明らかなように、本実施の形態では、蛍光物質で被検出物質が標識された後の分析チップの流路が洗浄されている間に、分析チップにおける上記流路における上記被検出物質固定部(本実施の形態ではプリズム20の成膜面22)に向けて励起光を照射し、または、被検出物質が固定され、上記流路が洗浄される前に、上記被検出物質固定部に向けて励起光を照射する。そして、励起光の照射により流路から発生する光の光量を、第一の受光センサー(受光センサー127)によって検出し、または、励起光の照射による分析チップでの全反射光の光量を、第二の受光センサー(フォトダイオード527)によって検出する。そして、第一の受光センサーまたは第二の受光センサーによって検出された上記光または全反射光の光量に基づいて、上記蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの最適な検出レンジを選択し、遅くとも上記流路の洗浄が完了するまでに、上記第一の受光センサーの検出レンジの、上記最適な検出レンジへの切り替えを完了する。このように、本実施の形では、被検出物質の蛍光標識化後の流路の洗浄が完了する前に、受光センサーの広いダイナミックレンジからの検出レンジの最適化が完了する。
As is clear from the description of the above-described embodiment, in this embodiment, the flow path in the analysis chip is washed while the flow path of the analysis chip after the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance. Before irradiating excitation light toward the detected substance fixing portion (in this embodiment, the
たとえば、本実施の形態では、
(A)上記蛍光物質とともに上記被検出物質を上記分析チップの流路に供給して、上記蛍光物質で標識化された上記被検出物質を上記流路中に固定化する第一固定化工程の後に、上記流路中の余剰な上記蛍光物質を除去するよう上記流路を洗浄する蛍光物質洗浄工程を行う際には、上記第一固定化工程後より上記蛍光物質洗浄工程が行われているまでの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される第一放出光の光量または上記励起光の照射により上記分析チップで反射された第一全反射光の光量を検出する第一光量検出工程を行い、あるいは、
(B1)上記被検出物質を上記分析チップの上記流路中に固定化する第二固定化工程の後に上記流路を洗浄する第一洗浄工程を行い、その後上記蛍光物質を上記流路に供給して上記流路中に固定化された上記被検出物質を上記蛍光物質で標識化する標識化工程を行い、その後上記流路中の余剰な上記蛍光物質を除去するよう上記流路を洗浄する第二洗浄工程を行う際には、上記第二固定化工程後より上記標識化工程の前までの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される第二放出光の光量または上記励起光の照射により上記分析チップで反射された第二全反射光の光量を検出する第二光量検出工程を行い、
(B2)または、上記標識化工程後より上記第二洗浄工程が行われているまでの間に、上記分析チップに向けて上記励起光を照射し、上記励起光の照射により上記分析チップから放出される第三放出光の光量または上記励起光の照射により上記分析チップで反射された第三全反射光の光量を検出する第三光量検出工程を行い、
(C)上記被検出物質の量を測定するための上記蛍光物質からの上記蛍光を検出するために上記分析チップに向けて上記励起光を照射する前に、上記第一光量検出工程、上記第二光量検出工程および上記第三光量検出工程の少なくともいずれかにより検出された光量に基づいて、上記受光センサーの複数の検出レンジの中から一つの上記検出レンジを選択して、選択された上記検出レンジへの切り替えを行い、
(D)その後、上記被検出物質の量を測定するために、上記検出レンジが切り替えられた上記受光センサーにより上記蛍光物質からの上記蛍光を検出する。
For example, in this embodiment,
(A) supplying a substance to be detected together with the fluorescent substance to the flow path of the analysis chip, and immobilizing the substance to be detected labeled with the fluorescent substance in the flow path; Later, when performing the fluorescent substance cleaning process for cleaning the flow path so as to remove excess fluorescent substance in the flow path, the fluorescent substance cleaning process is performed after the first immobilization process. Until the analysis chip is irradiated with the excitation light, and the amount of first emission light emitted from the analysis chip by the excitation light irradiation or reflected by the analysis chip by the excitation light irradiation. Performing a first light quantity detection step for detecting the amount of the first total reflected light, or
(B1) After the second immobilization step of immobilizing the substance to be detected in the flow channel of the analysis chip, a first washing step of washing the flow channel is performed, and then the fluorescent material is supplied to the flow channel Then, a labeling step of labeling the target substance immobilized in the flow path with the fluorescent material is performed, and then the flow path is washed so as to remove excess fluorescent material in the flow path. When performing the second washing step, the excitation light is irradiated toward the analysis chip after the second immobilization step and before the labeling step, and the analysis is performed by irradiation with the excitation light. Performing a second light amount detection step of detecting the amount of second emitted light emitted from the chip or the amount of second total reflected light reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light,
(B2) Or, after the labeling step and before the second washing step is performed, the excitation light is irradiated toward the analysis chip and emitted from the analysis chip by the irradiation of the excitation light. Performing a third light quantity detection step of detecting the light quantity of the third emitted light or the third total reflected light reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light,
(C) before irradiating the excitation light toward the analysis chip in order to detect the fluorescence from the fluorescent material for measuring the amount of the substance to be detected, Based on the light quantity detected by at least one of the two light quantity detection process and the third light quantity detection process, one detection range is selected from the plurality of detection ranges of the light receiving sensor, and the selected detection is performed. Switch to the range,
(D) Thereafter, in order to measure the amount of the substance to be detected, the fluorescence from the fluorescent substance is detected by the light receiving sensor whose detection range is switched.
このため、本実施の形態では、洗浄終了後、即座に被検出物質に係る蛍光の光量の検出が可能となる。よって、被検出物質からの蛍光物質の解離の当該測定における影響が低減される。その結果、迅速に、かつ高い定量性で、被検出物質を測定することが可能である。 For this reason, in the present embodiment, it is possible to detect the amount of fluorescence of the substance to be detected immediately after completion of the cleaning. Therefore, the influence in the measurement of the dissociation of the fluorescent substance from the substance to be detected is reduced. As a result, it is possible to measure a substance to be detected quickly and with high quantitativeness.
また、上記第一の受光センサーの制御電圧を変更することによって、上記第一の受光センサーの検出レンジを、上記最適な検出レンジへ切り替えることは、コストの観点からより効果的である。すなわち、上記ダイナミックレンジを電気的に変更可能であることから、NDフィルターなどの物理的手段の設置や操作などに比べ、SPFS装置を小型化することが可能であり、また安価に作製することが可能である。 In addition, it is more effective from the viewpoint of cost to change the detection range of the first light receiving sensor to the optimum detection range by changing the control voltage of the first light receiving sensor. That is, since the dynamic range can be electrically changed, the SPFS device can be downsized and manufactured at a lower cost than the installation and operation of physical means such as an ND filter. Is possible.
また、本実施の形態は、特にSPFS方法に好適である。SPFS方法では、分析チップは、プリズム、上記プリズムの一面上に配置された金属膜、および上記金属膜の表面が露出する上記流路、を含む。そして、表面プラズモン共鳴を発生させる入射角度で上記プリズムを介して上記金属膜の裏面に上記励起光が照射され、上記励起光の照射により上記金属膜の表面上に発生した局在場光により、上記蛍光物質が励起され、上記励起によって発生した上記蛍光の光量が上記第一の受光センサーで検出される。 In addition, this embodiment is particularly suitable for the SPFS method. In the SPFS method, the analysis chip includes a prism, a metal film disposed on one surface of the prism, and the flow path from which the surface of the metal film is exposed. Then, the excitation light is irradiated to the back surface of the metal film through the prism at an incident angle that generates surface plasmon resonance, and the localized field light generated on the surface of the metal film by the irradiation of the excitation light, The fluorescent substance is excited, and the amount of the fluorescence generated by the excitation is detected by the first light receiving sensor.
また、上記蛍光物質で上記被検出物質が標識された後、上記流路内の過剰な蛍光物質が洗浄除去されている間に、上記被検出物質固定部に向けて上記励起光を照射し、上記流路から発生する上記光(例えば、上記第一放出光、上記第二放出光または上記第三放出光など)の光量を上記第一の受光センサーによって検出することは、蛍光の光量による出力値からより直接的に検出レンジを判定し、受光センサーの検出レンジをより適切に判定、設定する観点からより効果的である。 In addition, after the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance, while the excess fluorescent substance in the flow path is washed away, the excitation light is irradiated toward the detected substance fixing part, Detecting the light amount of the light generated from the flow path (for example, the first emission light, the second emission light, or the third emission light) by the first light receiving sensor is an output based on the amount of fluorescence. It is more effective from the viewpoint of determining the detection range more directly from the value and more appropriately determining and setting the detection range of the light receiving sensor.
また、上記被検出物質が固定されている上記金属膜に対する上記励起光の入射角を変化させながら、上記プリズムを介して上記金属膜に励起光を照射するとともに、上記金属膜上に発生する上記光(例えば、上記第一放出光、上記第二放出光または上記第三放出光など)の光量を上記第一の受光センサーによって検出することによって増強角が測定され、上記分析チップの基準増強角に対する上記測定された増強角のシフト量が求められ、上記シフト量から推定される上記被検出物質の量に基づいて、上記被検出物質を標識した上記蛍光物質からの蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの最適な検出レンジが選択される場合では、蛍光物質で標識される前の被検出物質に励起光が照射される。このため、検出レンジの判定に伴う蛍光の減衰を抑制する観点からより効果的である。 In addition, while changing the incident angle of the excitation light to the metal film on which the substance to be detected is fixed, the metal film is irradiated with excitation light through the prism, and the metal film is generated on the metal film. The enhancement angle is measured by detecting the amount of light (for example, the first emission light, the second emission light, or the third emission light) by the first light receiving sensor, and the reference enhancement angle of the analysis chip is measured. When the amount of shift of the measured enhancement angle with respect to is obtained, and the amount of fluorescence from the fluorescent substance labeled with the target substance is detected based on the amount of the target substance estimated from the shift amount In the case where the optimum detection range of the first light receiving sensor is selected, excitation light is irradiated to the detection target substance before being labeled with the fluorescent substance. For this reason, it is more effective from the viewpoint of suppressing the attenuation of the fluorescence accompanying the determination of the detection range.
また、上記被検出物質が固定されている上記金属膜に対する上記励起光の入射角を変化させながら、上記プリズムを介して上記金属膜に励起光を照射するとともに、上記金属膜おける上記全反射光(例えば、上記第一全反射光、上記第二全反射光または上記第三全反射光など)の光量を上記第二の受光センサーによって検出して共鳴角が測定され、上記分析チップの基準共鳴角に対する上記測定された共鳴角のシフト量が求められ、上記シフト量から推定される上記被検出物質の量に基づいて、上記被検出物質を標識した上記蛍光物質からの蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの最適な検出レンジが選択される場合でも、蛍光物質で標識される前の被検出物質に励起光が照射される。このため、検出レンジの判定に伴う蛍光の減衰を抑制する観点からより効果的である。また、共鳴角は、増強角に比べて、金属膜に固定された被検出物質の量の検出性が高い。よって、上記の増強角に比べて、より高い精度で、上記受光センサーの検出レンジを判定する観点から、より効果的である。 In addition, while changing the incident angle of the excitation light to the metal film on which the substance to be detected is fixed, the metal film is irradiated with excitation light through the prism, and the total reflection light in the metal film The resonance angle is measured by detecting the amount of light (for example, the first total reflection light, the second total reflection light, or the third total reflection light) by the second light receiving sensor, and the reference resonance of the analysis chip A shift amount of the measured resonance angle with respect to an angle is obtained, and based on the amount of the detected substance estimated from the shift amount, the amount of fluorescence from the fluorescent substance labeled with the detected substance is detected. Even when the optimal detection range of the first light receiving sensor is selected, the detection target substance before being labeled with the fluorescent substance is irradiated with the excitation light. For this reason, it is more effective from the viewpoint of suppressing the attenuation of the fluorescence accompanying the determination of the detection range. In addition, the resonance angle has a higher detectability of the amount of the detection target substance fixed to the metal film than the enhancement angle. Therefore, it is more effective from the viewpoint of determining the detection range of the light receiving sensor with higher accuracy than the enhancement angle.
また、上記基準増強角または上記基準共鳴角は、上記分析チップの製造時に測定された値である場合では、上記の判定に際して、シフト前における受光センサーの出力値の検出が不要となる。よって、受光センサーの検出レンジの判定および設定の簡易化や高速化などの観点から、より効果的である。 Further, when the reference enhancement angle or the reference resonance angle is a value measured at the time of manufacturing the analysis chip, it is not necessary to detect the output value of the light receiving sensor before the shift at the time of the determination. Therefore, it is more effective from the viewpoint of simplification and speeding up of the detection range and setting of the light receiving sensor.
前述したように、上記イムノアッセイ分析装置は、上記被検出物質が固定された部分に向けて励起光を照射するための光源と、上記流路で発生する上記蛍光の光量を検出するための第一の受光センサーと、少なくとも上記蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの検出レンジを設定する制御部と、を有し、以下の(A)または(B)を満たす。
(A)上記制御部は、上記蛍光物質で上記被検出物質が標識された後に上記流路が洗浄されている間または上記洗浄前に上記被検出物質が固定された部分に向けて上記励起光を照射することにより上記流路から放出される放出光の、上記第一の受光センサーによって検出された光量から、上記蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中から選択し、遅くとも上記流路の洗浄が完了するまでに、上記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの上記検出レンジへの切り替えを完了させる。
(B)上記光源から上記被検出物質が固定された部分に向けての上記励起光の照射により発生する上記分析チップでの全反射光の光量を検出するための第二の受光センサーをさらに有し、上記制御部は、上記被検出物質が固定されている、上記流路が上記洗浄される前または上記洗浄されている間に上記被検出物質が固定された部分に向けて上記励起光を照射することにより発生する上記全反射光の、上記第二の受光センサーによって検出された光量から、上記蛍光の光量を検出するときの上記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中から選択し、遅くとも上記流路の洗浄が完了するまでに、上記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの上記検出レンジへの切り替えを完了させる。
As described above, the immunoassay analyzer includes a light source for irradiating excitation light toward a portion where the substance to be detected is fixed, and a first light source for detecting the amount of fluorescence generated in the flow path. And a control unit that sets a detection range of the first light receiving sensor when detecting at least the amount of fluorescence light, and satisfies the following (A) or (B).
(A) The control unit is configured such that the excitation light is directed toward a portion where the detected substance is fixed while the flow path is cleaned after the fluorescent substance is labeled with the detected substance or before the cleaning. One detection range of the first light receiving sensor when detecting the amount of fluorescent light from the light amount detected by the first light receiving sensor of the emitted light emitted from the flow path by irradiating The detection range is selected from a plurality of detection ranges, and the switching of the detection range of the first light receiving sensor to the one detection range is completed before the cleaning of the flow path is completed at the latest.
(B) A second light receiving sensor for detecting the amount of total reflected light at the analysis chip generated by irradiation of the excitation light from the light source toward the portion where the substance to be detected is fixed is further provided. Then, the control unit directs the excitation light toward a portion where the detection target substance is fixed before the flow path is cleaned or while the flow path is cleaned. One detection range of the first light receiving sensor when detecting the light amount of the fluorescence from the light amount detected by the second light receiving sensor of the total reflected light generated by irradiation is a plurality of detection ranges. The detection range of the first light receiving sensor is switched to one detection range until the cleaning of the flow path is completed at the latest.
よって、当該イムノアッセイ分析装置によれば、上記洗浄操作の完了前に、受光センサーの広いダイナミックレンジから選択される検出レンジの最適化が完了する。このため、洗浄終了後、即座に蛍光の光量の検出が可能となる。よって、捕捉された被検出物質からの蛍光物質の解離の当該測定における影響が低減される。その結果、迅速に、かつ高い定量性で、被検出物質を測定することが可能である。 Therefore, according to the immunoassay analyzer, optimization of the detection range selected from the wide dynamic range of the light receiving sensor is completed before the washing operation is completed. For this reason, it is possible to detect the amount of fluorescent light immediately after cleaning. Therefore, the influence in the measurement of the dissociation of the fluorescent substance from the captured substance to be detected is reduced. As a result, it is possible to measure a substance to be detected quickly and with high quantitativeness.
なお、被検出物質の量の推定のために共鳴角を測定するための励起光の照射は、前述したように、蛍光標識される前の、被検出物質が固定された流路に向けて行うことが好ましいが、蛍光標識後の洗浄中の流路に向けて行うことも可能である。すなわち、共鳴角による被検出物質の量の推定と第一の受光センサーの検出レンジの最適化とは、流路の蛍光標識後の洗浄中に行うことも可能である。 In addition, as described above, the irradiation of the excitation light for measuring the resonance angle to estimate the amount of the detection target substance is performed toward the flow path where the detection target substance is fixed before being fluorescently labeled. Although it is preferable, it is also possible to carry out toward the flow path during washing after the fluorescent labeling. That is, the estimation of the amount of the substance to be detected based on the resonance angle and the optimization of the detection range of the first light receiving sensor can be performed during the cleaning of the flow path after the fluorescent labeling.
また、SPFS装置100、500では、分析チップ10の上記照射位置で、分析チップ10の洗浄、分析チップ10への薬液などの供給、および分析チップ10への励起光αの照射などの各種工程が行われる。よって、SPFS装置100、500は、薬液などの供給位置および上記照射位置のそれぞれに搬送ステージで分析チップ10を搬送するSPFS装置に比べて、前述した洗浄から判定、設定までの操作に要する時間を短縮することが可能である。一方で、SPFS装置100、500は、本発明の効果が得られる範囲において、上記の搬送ステージを有していてもよい。この場合、上記の時間短縮効果は小さくなるが、搬送ステージで分析チップを照射位置から退避させることで、受光光学系ユニットと送液系ユニットの物理的な干渉を回避することが可能となり、設計の自由度が増す効果がSPFS装置100、500にさらにもたらされる。
Further, in the
本発明に係るイムノアッセイ分析方法およびイムノアッセイ分析装置は、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に好適に適用することができ、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。 The immunoassay analysis method and the immunoassay analysis apparatus according to the present invention can be suitably applied to a surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method, and can detect a substance to be detected with high reliability. For example, it is useful for clinical examinations.
10、70 分析チップ
20 プリズム
21 入射面
22 成膜面
23 出射面
30 金属膜
40 流路蓋
100、500 SPFS装置
110 励起光学系ユニット
111、711 光源ユニット
112 角度調整機構
113 光源制御部
120 受光光学系ユニット
121、727 受光ユニット
122 位置切り替え機構
123 センサー制御部
124 第一レンズ
125 光学フィルター
126 第二レンズ
127 受光センサー
130 送液ユニット
131 薬液チップ
132 シリンジポンプ
133 送液ポンプ駆動機構
134 シリンジ
135 プランジャー
160 制御部
527 フォトダイオード
700 イムノアッセイ分析装置
α 励起光
DESCRIPTION OF
Claims (8)
前記蛍光物質とともに前記被検出物質を前記分析チップの流路に供給して、前記蛍光物質で標識化された前記被検出物質を前記流路中に固定化する第一固定化工程の後に、前記流路中の余剰な前記蛍光物質を除去するよう前記流路を洗浄する蛍光物質洗浄工程を行う際には、
前記第一固定化工程後より前記蛍光物質洗浄工程が行われているまでの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第一放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第一全反射光の光量を検出する第一光量検出工程を行い、あるいは、
前記被検出物質を前記分析チップの前記流路中に固定化する第二固定化工程の後に前記流路を洗浄する第一洗浄工程を行い、その後前記蛍光物質を前記流路に供給して前記流路中に固定化された前記被検出物質を前記蛍光物質で標識化する標識化工程を行い、その後前記流路中の余剰な前記蛍光物質を除去するよう前記流路を洗浄する第二洗浄工程を行う際には、
前記第二固定化工程後より前記標識化工程の前までの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第二放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第二全反射光の光量を検出する第二光量検出工程を行い、または、前記標識化工程後より前記第二洗浄工程が行われているまでの間に、前記分析チップに向けて前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記分析チップから放出される第三放出光の光量または前記励起光の照射により前記分析チップで反射された第三全反射光の光量を検出する第三光量検出工程を行い、
前記被検出物質の量を測定するための前記蛍光物質からの前記蛍光を検出するために前記分析チップに向けて前記励起光を照射する前に、前記第一光量検出工程、前記第二光量検出工程および前記第三光量検出工程の少なくともいずれかにより検出された光量に基づいて、前記受光センサーの複数の検出レンジの中から一つの前記検出レンジを選択して、選択された前記検出レンジへの切り替えを行い、
その後、前記被検出物質の量を測定するために、前記検出レンジが切り替えられた前記受光センサーにより前記蛍光物質からの前記蛍光を検出する、
イムノアッセイ分析方法。 The detection substance labeled with the fluorescent substance is irradiated with excitation light toward the analysis chip fixed in the flow path, and the fluorescence from the excited fluorescent substance is detected by the light receiving sensor, and the detection target is detected. In an immunoassay analysis method for measuring the amount of a substance,
After the first immobilization step of supplying the substance to be detected together with the fluorescent substance to the flow path of the analysis chip and immobilizing the substance to be detected labeled with the fluorescent substance in the flow path, When performing the fluorescent substance cleaning step of cleaning the flow path so as to remove excess fluorescent substance in the flow path,
After the first immobilization process and before the fluorescent substance cleaning process is performed, the analysis chip is irradiated with the excitation light, and is emitted from the analysis chip by the excitation light irradiation. Performing a first light quantity detection step of detecting a light quantity of one emitted light or a first total reflected light reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light, or
After the second immobilization step of immobilizing the substance to be detected in the flow channel of the analysis chip, a first washing step of washing the flow channel is performed, and then the fluorescent material is supplied to the flow channel to A second cleaning is performed in which a labeling step of labeling the target substance immobilized in the flow path with the fluorescent material is performed, and then the flow path is cleaned so as to remove excess fluorescent material in the flow path. When performing the process,
Between the second immobilization step and before the labeling step, the analysis chip is irradiated with the excitation light, and the second emission light emitted from the analysis chip by the excitation light irradiation. A second light quantity detection step for detecting the light quantity or the second total reflected light reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light is performed, or the second cleaning process is performed after the labeling process. Until the analysis chip is irradiated with the excitation light, and the amount of third emission light emitted from the analysis chip by irradiation of the excitation light or reflected by the analysis chip by irradiation of the excitation light. Performing a third light amount detection step for detecting the amount of the third totally reflected light,
Before irradiating the excitation light toward the analysis chip to detect the fluorescence from the fluorescent substance for measuring the amount of the substance to be detected, the first light quantity detection step, the second light quantity detection Selecting one detection range from a plurality of detection ranges of the light receiving sensor based on the amount of light detected by at least one of the step and the third light amount detection step, to the selected detection range Switch
Then, in order to measure the amount of the substance to be detected, the fluorescence from the fluorescent substance is detected by the light receiving sensor whose detection range is switched.
Immunoassay analysis method.
前記イムノアッセイ分析方法は、
表面プラズモン共鳴を発生させる入射角度で前記プリズムを介して前記金属膜に前記励起光を照射し、
表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により、前記蛍光物質を励起させ、
前記励起によって発生した前記蛍光の光量を前記受光センサーで検出する、
表面プラズモン共鳴蛍光分析方法である、
請求項1または2に記載の、イムノアッセイ分析方法。 The analysis chip includes a prism having a metal film on one surface, and the flow path from which the surface of the metal film is exposed,
The immunoassay analysis method comprises:
Irradiating the metal film with the excitation light through the prism at an incident angle that generates surface plasmon resonance;
Exciting the fluorescent material by localized field light based on surface plasmon resonance,
The light receiving sensor detects the amount of fluorescence generated by the excitation,
A surface plasmon resonance fluorescence analysis method,
The immunoassay analysis method according to claim 1 or 2.
前記第一放出光、前記第二放出光および前記第三放出光の少なくともいずれかの光量を前記受光センサーによって検出する、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の、イムノアッセイ分析方法。 After the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance, the excitation light is irradiated toward the portion where the substance to be detected is fixed while the excessive fluorescent substance in the flow path is washed and removed. ,
Detecting the light quantity of at least one of the first emission light, the second emission light, and the third emission light by the light receiving sensor;
The immunoassay analysis method according to any one of claims 1 to 3.
前記被検出物質が固定される前の前記分析チップの基準増強角に対する前記測定された増強角のシフト量を求め、
前記シフト量から推定される前記被検出物質の量に基づいて、前記被検出物質を標識した前記蛍光物質からの蛍光の光量を検出するときの前記受光センサーの検出レンジを選択する、
請求項3に記載の、イムノアッセイ分析方法。 While irradiating the metal film with the excitation light through the prism while changing the incident angle of the excitation light to the metal film on which the detection target substance is fixed, the first generated on the metal film The light receiving sensor detects the light quantity of at least one of the emitted light, the second emitted light and the third emitted light, and measures the enhancement angle,
Obtaining a shift amount of the measured enhancement angle with respect to a reference enhancement angle of the analysis chip before the detection target substance is fixed;
Based on the amount of the substance to be detected estimated from the shift amount, a detection range of the light receiving sensor when detecting the amount of fluorescence from the fluorescent substance labeled with the substance to be detected is selected.
The immunoassay analysis method according to claim 3.
前記被検出物質が固定される前の前記分析チップの基準共鳴角に対する前記測定された共鳴角のシフト量を求め、
前記シフト量から推定される前記被検出物質の量に基づいて、前記被検出物質を標識した前記蛍光物質からの蛍光の光量を検出するときの前記受光センサーの最適な検出レンジを選択する、
請求項3に記載の、イムノアッセイ分析方法。 While changing the incident angle of the excitation light to the metal film on which the detection target substance is fixed, the metal film is irradiated with excitation light through the prism, and the first total reflected light in the metal film , By measuring the amount of light of at least one of the second total reflected light and the third total reflected light by the light receiving sensor to measure the resonance angle,
Obtaining a shift amount of the measured resonance angle with respect to a reference resonance angle of the analysis chip before the detection target substance is fixed;
Based on the amount of the substance to be detected estimated from the shift amount, an optimum detection range of the light receiving sensor when detecting the amount of fluorescence from the fluorescent substance labeled with the substance to be detected is selected.
The immunoassay analysis method according to claim 3.
前記被検出物質が固定された部分に向けて励起光を照射するための光源と、
前記流路で発生する前記蛍光の光量を検出するための第一の受光センサーと、
少なくとも前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの検出レンジを設定する制御部と、を有し、
以下の(A)または(B)を満たす、
イムノアッセイ分析装置。
(A)前記制御部は、前記蛍光物質で前記被検出物質が標識された後に前記流路が洗浄されている間または前記洗浄前に前記被検出物質が固定された部分に向けて前記励起光を照射することにより前記流路から放出される放出光の、前記第一の受光センサーによって検出された光量から、前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中から選択し、遅くとも前記流路の洗浄が完了するまでに、前記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの前記検出レンジへの切り替えを完了させる。
(B)前記光源から前記被検出物質が固定された部分に向けての前記励起光の照射により発生する前記分析チップでの全反射光の光量を検出するための第二の受光センサーをさらに有し、
前記制御部は、前記被検出物質が固定されている、前記流路が前記洗浄される前または前記洗浄されている間に前記被検出物質が固定された部分に向けて前記励起光を照射することにより発生する前記全反射光の、前記第二の受光センサーによって検出された光量から、前記蛍光の光量を検出するときの前記第一の受光センサーの一つの検出レンジを複数の検出レンジの中から選択し、遅くとも前記流路の洗浄が完了するまでに、前記第一の受光センサーの検出レンジの、一つの前記検出レンジへの切り替えを完了させる。
The fluorescent substance excited when a substance to be detected fixed in the flow path of the analysis chip is labeled with a fluorescent substance and excitation light is irradiated from a light source toward a portion where the substance to be detected is fixed in the flow path In an immunoassay analyzer for measuring the amount of the substance to be detected by detecting fluorescence from a light receiving sensor,
A light source for irradiating excitation light toward a portion where the substance to be detected is fixed;
A first light receiving sensor for detecting the amount of fluorescence generated in the flow path;
A control unit for setting a detection range of the first light receiving sensor when detecting at least the amount of fluorescence light,
Satisfy the following (A) or (B),
Immunoassay analyzer.
(A) The control unit may emit the excitation light toward a portion where the target substance is fixed while the flow path is cleaned after the target substance is labeled with the fluorescent substance or before the cleaning. One detection range of the first light receiving sensor when detecting the amount of fluorescent light from the light amount detected by the first light receiving sensor of the emitted light emitted from the flow path by irradiating The detection range is selected from a plurality of detection ranges, and the switching of the detection range of the first light receiving sensor to the one detection range is completed by the time the cleaning of the flow path is completed at the latest.
(B) A second light receiving sensor for detecting the amount of total reflected light on the analysis chip generated by irradiation of the excitation light from the light source toward the portion where the substance to be detected is fixed is further provided. And
The control unit irradiates the excitation light toward a portion where the target substance is fixed before or while the flow path is cleaned, where the target substance is fixed. One detection range of the first light receiving sensor when detecting the light amount of the fluorescence from the light amount detected by the second light receiving sensor of the total reflected light generated by And the switching of the detection range of the first light receiving sensor to one of the detection ranges is completed before the cleaning of the flow path is completed at the latest.
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