JP2013537525A - 新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカーによって重合体キャリアに共有的に連結された新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを有効成分として含む肥満の予防および治療用薬学的組成物に関する。本発明による持続型グルカゴン結合体は、生体内持続性および安定性が向上し、抗肥満薬物との併用投与時、血糖のゆらぎのような何らの副作用もなく体重および飲食物の摂取を減少させる相乗効果を有する。したがって、本発明による持続型ペプチド結合体は、肥満の予防および治療に極めて効果的である。
【選択図】図１

Description

本発明は、新規な持続型グルカゴン結合体（ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびこれを含む肥満の予防および治療用薬学的組成物に関する。具体的には、本発明は、グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカー（ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）によって重合体キャリア（ｐｏｌｙｍｅｒ ｃａｒｒｉｅｒ）に共有的に連結された新規な持続型グルカゴン結合体およびこれを有効成分として含む肥満の予防および治療用薬学的組成物に関する。本発明による持続型グルカゴン結合体は、生体内持続性および安定性が顕著に向上し、抗肥満薬物との併用投与時、薬物の投与量を画期的に減少させながら血糖のグルコースレベルにゆらぎのない改善された服薬順応度を示す。したがって、本発明の持続型グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に極めて有用に使用できる。

近年、経済成長や生活方式の変化に伴い、食習慣にも多くの変化がある。特に、忙しい現代人は高熱量食事と少ない運動量によって過体重および肥満が増加している。国際保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ）によれば、全世界的に１０億人以上の成人が過体重で、そのうち少なくとも３００万人以上が臨床的に重症の肥満と診断されており、毎年２５，０００人が過体重または肥満関連疾患によって死亡していることが報告された（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｎ Ｄｉｅｔ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ，２００４）。

過体重および肥満は、血圧と血液のコレステロール数値を高めて心臓疾患、糖尿病、関節炎などを含む多様な成人病の発病を増加させている。そればかりか、過体重および肥満は、成人だけでなく、子供や青少年の間においても、動脈硬化、高血圧、高脂血症または心臓疾患などのような成人病の発病を増加させる主要な要因となっている。

肥満は、全世界的に深刻な疾病であり、各種疾患の原因として認識されているが、容易に治療できない疾病である。医学専門家らは、肥満は、単なる自制力の問題ではなく、食欲の調節とエネルギー代謝と密接に関連する複雑な疾患であると認識している。肥満は、消費エネルギーに比べて摂取エネルギーが過度であるが故に誘発される。個々人のレベルでは、過度の飲食エネルギー摂取と身体活動不足の組み合わせで肥満のほとんどの場合を説明すると考えられている。したがって、これを予防または治療するための長期的観点から、食餌療法および運動と並行して使用できる効果的かつ安全な医薬品の開発が切実に求められているのが現状である。

最近、肥満に関連する研究において注目される医薬品は、オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）であり、プレグルカゴン（ｐｒｅ−ｇｌｕｃａｇｏｎ）に由来し、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に結合できる。このようなオキシントモジュリンの二重機能性（ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に基づいて抗肥満薬物を開発するための研究が盛んに行われている。

グルカゴン様ペプチド−１（以下、「ＧＬＰ−１」とする）は、糖尿病患者の高血糖症に対して開発中の物質であり、インスリン合成と分泌促進、グルカゴンの分泌の減少、胃の内容排出の抑制、グルコースの使用増進、および飲食物の摂取を減少させる様々な生理的機能を有する。また、ＧＬＰ−１と約５０％のアミノ酸相同性を有する、トカゲの毒液（ｌｉｚａｒｄ ｖｅｎｏｍ）によって分泌され、ＧＬＰ−１と約５０％のアミノ酸相同性を示すエキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４は、ＧＬＰ−１受容体を活性化させて糖尿病患者の高血糖症を減少させることが知られている。

グルカゴンは、例えば薬物治療または疾病、ホルモンまたは酵素欠乏に起因し、血糖レベルがあまりにも低下した場合、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）から分泌される。グルカゴンは、肝臓でグリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）をグルコースまで分解し、血流でより多くのグルコースを放出するように信号を出し、これは血中のグルコースレベルを高める結果をもたらす。

ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体の両方に作動剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として作用するオキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１のような飲食物摂取を減少させる機能とグルカゴンのようなグリコーゲンを分解する機能を有している。したがって、抗肥満治療剤としての潜在性を有する。

オキシントモジュリンの誘導体として、現在臨床１相進行中のデュアルアゴニスト（Ｄｕａｌ ａｇｏｎｉｓｔ、Ｍｅｒｃｋ）、および前臨床試験進行中のＺＰ２９２９（Ｚｅａｌａｎｄ、ＷＯ２００／８１５２４０３Ａ１）がある。デュアルアゴニストのペプチド（Ｍｅｒｃｋ）はオキシントモジュリンであり、このジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下、「ＤＰＰ−ＩＶ」とする）に対する抵抗性は２番目のアミノ酸のＬ−ＳｅｒをＤ−Ｓｅｒに置換して増加し、血中半減期はそのＣ末端にコレステロールモイエティを結び付けて延長される。ＺＰ２９２９（Ｚｅａｌａｎｄ）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−ＳｅｒをＤ−Ｓｅｒに置換してＤＰＰ−ＩＶに対する抵抗性を高め、１７番目のアミノ酸ＡｒｇをＡｌａに置換してプロテアーゼに対する抵抗性を高め、２７番目のアミノ酸ＭｅｔをＬｙｓに置換して酸化的安定性を増加させ、２０番目および２４番目のアミノ酸Ｇｌｎと２８番目のアミノ酸ＡｓｎをそれぞれＡｓｐ、ＡｌａおよびＳｅｒに置換して脱アミド化安定性（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を増加させることを含むオキシントモジュリンの誘導体である。

ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体に同時に作用するオキシントモジュリンの能力は、抗肥満治療剤としての開発の可能性を提供する。しかし、オキシントモジュリンを治療的用途に用いるのに問題となるのは非常に短い半減期である。デュアルアゴニストのオキシントモジュリンの血中半減期は天然型オキシントモジュリンの半減期よりは長くなったものの、依然として７時間で生体内半減期が極めて短い。さらに薬物の投与用量が数ｍｇ／ｋｇと極めて高い水準である。したがって、現在使用されているオキシントモジュリンまたはその誘導体は、短い半減期と低い効能により多量の薬物を毎日投与しなければならないという欠点がある。有効成分としてこのようなペプチドを含むタンパク質薬物の場合、血中レベルおよび力価を維持するために薬物を注射形態で頻繁に投与しなければならないため、患者にとって極めて苦痛となる。したがって、高い血中レベルおよび適当な効能の維持は肥満治療剤の開発において先決の課題である。

一方、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、長期間かけてこの血中薬物の水準を高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続いてきた。このためタンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触および腎臓消失を抑制するために、ＰＥＧのような高分子を使用し、薬物の表面を化学的に変更させる方法が開発されてきた。しかし、その方法は、ＰＥＧの分子量が増加するほど標的タンパク質との反応性が低下し、ペグ化の収率が減少する問題があった。代案として、国際公開公報第２００２／４６２２７号は、遺伝子組み換えによって標的タンパク質をヒト血液アルブミンまたは兔疫グロブリン領域（Ｆｃ）とカップリングすることによって製造したタンパク質について記述する。米国特許第６，７５６，４８０号は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびその類似体をFc領域とカップリングすることによって製造したＦｃ融合タンパク質について記述している。これらの方法は、低いペグ化収率と非特異性のような問題を克服できるものの、依然として血中半減期増加の効果が予想に比べて大差を示さず、時には、力価もまた低いという問題を抱えている。血中半減期増加の効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されたが、免疫反応を引き起こす可能性がある。しかも、ジスルフィド結合を持つペプチドを使用する場合、ミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の確率が極めて高い。

これらの問題を解決するために、本発明者らは、生理活性ポリペプチドと兔疫グロブリンＦｃ断片を、非ペプチドリンカーを用いて相互に共有結合によって連結させ、これによって薬物の活性の減少を維持させながら血中の安全性を向上させる持続型タンパク質結合体を提案している（大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号）。特に、エキセンディン−４およびその誘導体が、兔疫グロブリンＦｃ断片に非ペプチドリンカーを介して連結された持続型エキセンディン−４結合体が延長した生体内持続性を示すことを確認した（大韓民国特許出願公開第１０−２００８−００６４７５０号）。

さらに、本発明者らは、生体内持続性および安定性が増加した抗肥満治療剤を開発するために、持続型エキセンディン−４結合体を適用することを試みた。これに関連してＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体を同時に刺激するように、前記持続型エキセンディン−４結合体（週１回）と天然型グルカゴン（毎日１回）を併用投与した。天然型グルカゴンと併用投与する場合、持続型エキセンディン−４結合体は単独投与時と比較して、画期的な体重減少効果を確認することができた。しかし、前記併用投与は、血糖のグルコースレベルの激しいゆらぎをもたらし、試験動物に毒性が示された。

したがって、本発明者らは、グルカゴンの血中半減期を増加させながら生体内活性を維持させる方法を開発するために努力した結果、グルカゴンまたはその誘導体に、非ペプチドリンカーを用いて兔疫グロブリンＦｃ断片のような重合体キャリアを共有的に連結した新規な持続型グルカゴン結合体を発明するに至った。本発明の持続型グルカゴン結合体は、生体内持続性および安定性が改善されることを確認した。したがって、本発明にかかる持続型グルカゴン結合体を抗肥満薬物とともに使用する場合、極めて少ない投与量でも体重と飲食物の摂取を効果的に減少させることができる。さらに、そのような併用投与は、血中グルコースレベルに激しいゆらぎを誘導しないと共に、改善された服薬順応度を示した。したがって、本発明の持続型グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。

したがって、本発明の一つの目的は、生体内持続性および安定性が向上した持続型グルカゴン結合体を提供することである。

本発明の他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体の製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体を有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記薬学的組成物を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、肥満を予防または治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記持続型グルカゴン結合体の、肥満の予防または治療用
薬の製造のための使用を提供することである。

上記の目的を達成するための一態様として、本発明は、グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカーによって重合体キャリアに共有的に連結された新規な持続型グルカゴン結合体を提供する。

本発明のグルカゴンまたはその誘導体の持続型グルカゴン結合体は、延長した血中半減期と改善された生体内持続性および安定性を示す。したがって、抗肥満薬物と組み合わせて投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体は顕著に低い投与量で投与することができ、血中グルコースレベルのゆらぎなく服薬順応度が改善されることを示す。したがって、本発明の持続性グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。

持続型ＣＡ−グルカゴン結合体と持続型ＣＡ−エキセンディン−４結合体を併用投与した後、８日間のＤＩＯ（Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ）マウスに体重の変化を示したグラフである。 持続型ＣＡ−グルカゴン結合体と持続型ＣＡ−エキセンディン−４結合体を併用投与後した後、８日間のＤＩＯマウスの飼料摂取量の変化を示したグラフである。 持続型ＣＡ−グルカゴン結合体と持続型ＣＡ−エキセンディン−４結合体を併用投与後した後、８日間のＤＩＯマウス血中グルコースレベルの変化を示したグラフである。 天然型グルカゴンペプチドと持続型ＣＡエキセンディン−４結合体を併用投与した後、１２日間のＤＩＯマウスの体重の変化を示したグラフである。 天然型グルカゴンペプチドと持続型ＣＡエキセンディン−４結合体を併用投与した後、１２日間のＤＩＯマウスにの血中グルコースレベルの変化を示したグラフである。

本発明において使用される用語、「グルカゴン」は、ランゲルハンス島のアルファ細胞から分泌し、合成されるポリペプチドホルモンを指しており、配列番号１の２９個のアミノ酸で構成されている。グルカゴンは、血中グルコースレベルを維持するのに役立つ。グルカゴンは、肝臓でグリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）を分解してグルコースを血流に放出するように信号を出す。また、グルカゴンは、インスリン分泌を刺激し、インスリン依存的組織によってグルコースが吸収されて使用されるようにする。したがって、グルカゴンとインスリンは、フィードバックシステムの一部分であり、これは血中グルコースレベルを適正水準に維持させる。

本発明において使用される用語、「グルカゴン誘導体」は、グルカゴンの受容体に結合してグルカゴンと同様の生物学的活性を示す物質を意味する。グルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンに対して、アミノ酸配列において少なくとも８０％の相同性を有し、一部アミノ酸残基において化学的に置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。本発明に適合するグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンの作動剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）およびこれらの組み合わせからなる群より選択できる。

本発明において使用される用語、「グルカゴン作動剤」は、グルカゴンの構造とは関係なく、グルカゴンの受容体に結合してグルカゴンと同様の生物学的活性を示す物質を意味する。

本発明において使用される用語、「グルカゴン誘導体」は、天然型グルカゴンのアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するグルカゴン活性を示すペプチドを意味しており、一部のアミノ酸残基において化学的に置換（例；α―メチル化、α―ヒドロキシル化）、除去（例；ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）または修飾（例；Ｎ−メチル化）を含むことができる。

本発明において使用される用語、「グルカゴン断片」は、天然型グルカゴンのＮ末端またはＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸が追加または削除された、グルカゴン活成を有するペプチドを意味する。グルカゴンペプチドは天然に存在しないアミノ酸（例：Ｄ型アミノ酸）がこれに追加されたペプチドであってもよい。

本発明において使用される用語、「グルカゴン変異体」は、天然型グルカゴンと少なくとも１個のアミノ酸配列が異なる、グルカゴン活性を有するペプチドを意味する。

好ましくは、本発明のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンの少なくとも１個のＮ末端アミノ酸の置換、除去または修飾によって製造することが出来、グルカゴンの活性を有するペプチド、これらの断片およびこれらの変異体からなる群より選択できる。より好ましくは、グルカゴン誘導体は天然型グルカゴンのＮ末端の１番目のアミノ酸であるヒスチジンのα炭素またはこれに結合されたアミン基が置換、修飾または除去されることが出来るペプチドであってもよい。最も好ましくは、本発明のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が除去されたペプチド、そのＮ末端アミン基がヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）に置換されたペプチド、そのＮ末端アミン基が２個のメチル基で修飾されたペプチド、そのＮ末端ヒスチジンのアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたペプチドからなる群れより選択され得る。

本発明に適合するグルカゴン誘導体は、下記の下記化学式１ないし４で表示できる。

前記化学式１ないし４において、「ペプチド」は、天然型グルカゴンである。

前記化学式１のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が除去されたデス−アミノ−ヒスチジルグルカゴン（以下、「ＤＡ−グルカゴン」とする）である。

化学式２のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたベータ−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニルグルカゴン（以下、「ＨＹ−グルカゴン」とする）である。

化学式３のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が２個のメチル基で修飾されたジメチルヒスチジルグルカゴン（以下、「ＤＭ−グルカゴン」とする）である。

化学式４のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたイミダゾアセチルグルカゴン（以下、「ＣＡ−グルカゴン」とする）である。

本発明において使用される用語、「持続型グルカゴン結合体」は、非ペプチドリンカーを介して重合体キャリアに共有結合で連結されたグルカゴンまたはその誘導体を意味し、これは延長した血中半減期および向上した生体内活性を有する。本発明の持続型グルカゴン結合体は、天然型グルカゴンまたはその誘導体に比べて１０％以上、好ましくは５０％以上増加した血中半減期を有する。

本発明において使用される用語、「非ペプチドリンカー」は、繰返し単位が２個以上結合された生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）重合体を意味し、前記繰返し単位は、ペプチド結合でない任意の共有結合を通じて相互に連結された２個以上の繰返し単位を 含む生体適合性重合体を指している。本発明に適合した非ペプチドリンカーは両末端に官能基を有するため、一方の末端にはグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結され、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結できる。

本発明に適合した非ペプチドリンカーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＧＡ）のような生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸などが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ポリエチレングリコールが非ペプチドリンカーとして使用できる。

通常のインフレーム融合（ｉｎｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ）方法で製造された融合タンパク質に使用されるペプチドリンカーは、生体内でタンパク質の加水分解性酵素によって容易に切断され、これによってペプチド薬物の血中半減期増加効果を期待通りに得ることができないという欠点がある。しかし、本発明では、タンパク質の加水分解性酵素に耐性を有する非ペプチドリンカーを用いて、ペプチド薬物の血中半減期を高く維持することができる。したがって、タンパク質の加水分解性酵素に耐性を示すものであれば種類に制限なく使用することができる。

本発明において、非ペプチドリンカーは、分子量が１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲であることがよい。また、本発明において、非ペプチドリンカーは、一種類のリンカーだけでなく、相異なる種類のリンカーの組み合わせで使用されてもよい。

本発明に適合した非ペプチドリンカーは、その両末端に官能基を有する。非ペプチドリンカーの官能基は、アルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミドおよびスクシンイミド誘導体からなる群より選択されることが好ましい。本発明に適合したスクシンイミド誘導体の例として、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートが含まれ得るが、これらに限られるものではない。特に、非ペプチドリンカーが両末端にアルデヒド基を有する場合、非特異的反応を最小化しながら、非ペプチドリンカーの両末端にグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアがそれぞれ結合するのに効果的である。しかも、アルデヒド基による結合は、アミド基によって連結されたものよりはるかに安定である。

前記非ペプチドリンカーの両末端官能基は互いに同一でも異なっていてもよい。例えばペプチドリンカーは、一方の末端にはマレイミド基を、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有することができる。両末端にヒドロキシ基を有するＰＥＧを非ペプチドリンカーとして使用する場合には、公知の化学反応によってヒドロキシ基を多様な官能基に活性化することができる。他の方法としては、商業的に入手可能な両末端に変形した官能基を有するＰＥＧを使用することができる。

本発明の非ペプチドリンカーは、グルカゴンまたはその誘導体の多様な部位に結合可能であり、それらの間に結合部位に応じて活性差を示すことができる。例えば、ペプチドリンカーはペプチドのＮ末端またはＮ末端以外のＣ末端を含む他のを部位にそれぞれ結合することができ、これは生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）活性の差を誘導する。非ペプチドリンカーのアルデヒドは、低いｐＨではグルカゴンまたはその誘導体のＮ末端に選択的に反応する反面、高いｐＨ、(例えば、ｐＨ９．０)ではグルカゴンまたはその誘導体のリシン残基に共有結合を形成することができる。反応ｐＨを異にしてペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）反応を進行した後、イオン交換カラムをクロマトグラフィー用いて反応混合物から結果として生じる異性体を分離することができる。

非ペプチドリンカーが生体内活性に重要な部位であるＮ末端以外のペプチドの他の位置に結合する場合、修飾しようとするアミノ酸残基の位置にチオール基を導入し、ペプチドのチオール基と非ペプチドリンカーのマレイミド基との間に共有結合を形成する可能性がある。

また、ペプチドリンカーが生体内活性に重要な部位であるＮ末端以外のペプチドの他の位置にカップリングする場合、修飾しようとするアミノ酸残基の位置にアミン基を導入し、ペプチドのアミン基と非ペプチドリンカーのアルデヒド基との間に共有結合を形成する可能性がある。

非ペプチドリンカーのアルデヒド基は、グルカゴンのＮ末端および１２番目のリシン残基にあるアミン基と反応することができる。ここで、選択的に反応収率を向上させるために、変形した形態のペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドの唯一のアミノ基を、このＮ末端を遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）する方法、他のアミノ酸としてリシン残基を置換する方法、Ｃ末端にアミン基を導入する方法等を用い、所望の位置に維持することができる。このような変形を介して、ペグ化および非ペプチドリンカーとペプチドとの間のカップリング反応の収率を向上させることができる。ペプチドのＮ末端は、これらにより限定されるものではない。ジメチル化（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）またはアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）等のような方法によって遮断することができる。

本発明の好ましい実施態様として、持続型グルカゴン結合体は、グルカゴン受容体に結合する能力を維持しながら、グルカゴンまたはその誘導体のＮ末端以外の天然グルカゴンまたはその誘導体のアミン基に、非ペプチドリンカーを介して重合体キャリアが共有的に連結された構造を有する。

本発明において使用される用語、「重合体キャリア」は、薬物に結合され薬物の生理活性を増加、減少または除去する物質を意味する。しかし、本発明における目的に対して重合体キャリアは、結合されるグルカゴンまたはその誘導体の生理活性の減少を最小化しながら、同時にこれらの生体内安定性を増加させるためのものである。本発明に適合した重合体キャリアとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体等が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。重合体キャリアとして、兔疫グロブリンＦｃ断片を使用することが好ましい。

兔疫Ｆｃ断片は、生体内で代謝する生分解性ポリペプチドであるため、薬物のキャリアとしての使用に安全である。また、兔疫グロブリンＦｃ断片は、兔疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製および収率の面で有利である。兔疫グロブリンＦｃ断片がＦａｂ断片を維持しないため、これは同質性が大きく増加し、血中抗原性の誘発の可能性が低下すると見られる。

本発明において使用される用語、「兔疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃ断片」は、兔疫グロブリンの重鎖不変領域２(Ｃ_H2)および重鎖不変領域３（Ｃ_H3）部分を含むが、重鎖と軽鎖の可変領域である免疫グロブリンの重鎖不変領域１（Ｃ_H1）と軽鎖不変領域（Ｃ_L1）を含まないタンパク質を意味する。これはさらに重鎖不変領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片は、天然型と実質的に同等であるかまたは向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体のＣ_H1および／またはＣ_L1を含む拡張されたＦｃ断片であり得る。また、IgG Fc断片はＣ_H2および／またはＣ_H3に相当する、極めて長い一部のアミノ酸配列が除去された断片であってもよい。すなわち、本発明の兔疫グロブリンＦｃ断片は、１）Ｃ_H1ドメイン、Ｃ_H2ドメイン、Ｃ_H3ドメインおよびＣ_H4ドメイン、２）Ｃ_H1ドメインおよびＣ_H2ドメイン、３）Ｃ_H1ドメインおよびＣ_H3ドメイン、４）Ｃ_H2ドメインおよびＣ_H3ドメイン、５）１個以上の前記ドメインとＩｇＧヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）の組み合わせ、および６）重鎖不変領域の各ドメインおよび軽鎖不変領域の二量体であり得る。

また、本発明のＩｇＧ Ｆｃ断片は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（ｍｕｔａｎｔ）を含む。本発明に使用される用語、「配列誘導体」とは、一個以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって天然アミノ酸配列の中で異なる配列を意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番の位置からアミノ酸残基が変形のために適当な標的として使用できる。また、これらの誘導体はジスルフィド結合を形成できる部位が除去されるか、天然型ＦｃでＮ末端の特定のアミノ酸残基が除去されるか、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が導入されることによって製造できる。さらに、エフェクター機能を除去するために、補体結合部位（例として、Ｃ１ｑ結合部位）が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような配列誘導体の製造は当該技術分野、例えば国際特許公開第１９９７／３４６３１号、国際特許公開第１９９６／３２４７８号でよく知られている。

タンパク質およびペプチドにおいて、分子の活性を全体的に変更させないアミノ酸交換は、当該分野で公知のものである（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常的に起こる交換は、両側の方向からアミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。

また、前記Ｆｃ断片は、必要によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などによって修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ断片と同様の生物学的活性、または例えば熱、ｐＨ等に対する向上した構造的安定性を有する誘導体であってもよい。

また、このようなＦｃ断片は、ヒトおよび牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットのような動物から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型兔疫グロブリンから取得する方法は、全体の兔疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解性酵素を処理して得ることができる。パパインは天然兔疫グロブリンをＦａｂおよびＦｃ断片に切断し、ペプシンを処理した場合にはｐＦｃ’およびＦ（ａｂ）₂を生産する。切断された断片を例えば、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いてＦｃまたはＦｃ’を分離することができる。好ましくは、ヒト由来の兔疫グロブリンＦｃ断片は微生物から収得した組み換え型兔疫グロブリンＦｃ断片である。

さらに、本発明の兔疫グロブリンＦｃ断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖を有する形態であるとか、または非糖鎖糖化した形態であってもよい。兔疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が利用できる。ここで、兔疫グロブリンＦｃからの糖鎖の除去は１番目の補体成分Ｃ₁のＣ_1q部分に結合親和力が著しく低下し、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ＡＤＣＣ)または補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)が減少または除去されるため、これによって生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、糖鎖がされたり、非糖鎖化された形態である兔疫グロブリンＦｃ断片は薬物キャリアとして本発明の目的により適合していると言える。

本発明において使用される用語、「糖鎖の除去（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、酵素学的にＦｃ断片から糖を除去することを意味し、用語、「非糖鎖化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、Ｆｃ断片が原核動物、好ましくは、大膓菌によって糖鎖化されていない形態で生産されることを意味する。

一方、兔疫グロブリンＦｃ断片は、ヒトまたは牛、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットを含む他の動物由来であってもよく、好ましくは、ヒト由来である。また、兔疫グロブリンＦｃ断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはこれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）によって造られたＦｃ断片であってもよい。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なタンパク質の中でＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものとして公知のＩｇＧ由来である。

一方、本発明において使用される用語、「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の単鎖兔疫グロブリンＦｃ断片をコード化するポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、二量体または多量は、ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ３ Ｆｃ、およびＩｇＧ４ Ｆｃ断片からなる群より選択された２個以上の断片から形成されることができる。

本発明において使用される用語、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の兔疫グロブリンＦｃ断片内に異なる起源の２個以上の兔疫グロブリンＦｃ断片をコード化する配列を意味する。本発明において、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ドメインハイブリッドは、ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ３ ＦｃおよびＩｇＧ４ ＦｃのＣ_H1、Ｃ_H2、Ｃ_H3およびＣ_H4からなる群より選択された１個〜４個のドメインからなることができ、ヒンジ領域を含むことができる。

一方、ＩｇＧも、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたはこれらのハイブリッドも可能である。好ましくは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のサブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)のようなエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）がほとんどないＩｇＧの４Ｆｃ断片である。

すなわち、本発明の重合体キャリア用として、最も好ましい兔疫グロブリンＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ断片である。ヒト由来のＦｃ断片は、非ヒト由来のＦｃ断片よりさらに好ましく、これはヒトの体内で抗原として作用することができ、抗体に対する新たな抗体を生成するなどの、好ましくない免疫反応を誘発しない。

好ましい実施態様において、本発明にかかる持続型グルカゴン結合体は、下記化学式５で表示することができる。

前記式中、Ｒ１は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、デス−アミノ−ヒスチジル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジル、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピルおよび４−イミダゾアセチルからなる群より選択され、

Ｒ２は、−ＮＨ₂、−ＯＨおよび−リシン（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、

Ｘは、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴであり、

Ｙは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、

Ｚは、兔疫グロブリンＦｃ断片である。

本発明の好ましい実施態様にかかる、持続型グルカゴン結合体において、ＰＥＧの両末端がそれぞれＣＡ−グルカゴン（すなわち、前記化学式５において、Ｒ１が４−イミダゾアセチルの場合）の１２番目のリシン（Ｌｙｓ１２）と兔疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に相互共有的に連結されたものである。

他の態様として、本発明は、前記持続型グルカゴン結合体の製造方法を提供する。
本発明による製造方法は：

１）天然型グルカゴンまたはその誘導体を、両末端に官能基を有する非ペプチドリンカーと反応させるステップと、

２）ステップ１）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端に天然型グルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結された複合体を分離するステップと、

３）ステップ２）で分離された複合体を重合体キャリアと反応させるステップ、および

４）ステップ３）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端には天然型グルカゴンまたはその誘導体が、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップとを含むことができる。

本発明において使用される用語、「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、非ペプチドリンカーの一方の末端に天然のグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結された中間体を意味する。本発明の方法によれば、複合体は非ペプチドリンカーの他方の末端と重合体キャリアの間に共有結合を形成するように注入される。

ステップ１）において、非ペプチドリンカーとグルカゴンまたはその誘導体を反応させ、それらの間に複合体を形成する。このステップで、配列番号１のアミノ酸配列を有する天然型グルカゴンまたはその誘導体が使用できる。誘導体の例は下記に含まれる：天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が除去された化学式１のＤＡ−グルカゴン；天然型グルカゴンのＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換された化学式２のＨＹ−グルカゴン、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が２個のメチル基で修飾された化学式３のＤＭ−グルカゴン、天然型グルカゴンのＮ末端ヒスチジンのアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された化学式４のＣＡ−グルカゴンが使用できる。

ステップ１）において使用された非ペプチドリンカーは、両末端に官能基を有する。非ペプチドリンカーの官能基は、好ましくは、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群より選択される。本発明に適合したスクシンイミド誘導体の例として、これらに限定されないが、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートを含んでもよい。前記非ペプチドリンカーの両末端官能基は互いに同一でも異なっていてもよい。好ましくは、非ペプチドリンカーとして、両末端にアルデヒド基を有するＰＥＧを使用する。非ペプチドリンカーのこのようなアルデヒド基は非特異的反応を最小化しながら、非ペプチドリンカーの両末端にグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアがそれぞれ結合するのに効果的である。また、アルデヒド基による結合は、アミド基によるものよりはるかに安定である。

ステップ１）において、ペプチドリンカーが天然型グルカゴンまたはその誘導体のＮ末端以外のアミノ酸残基、好ましくは、１２番目のリシン残基に共有的に連結される。ステップ１）において、Ｎ末端以外のアミノ酸残基、好ましくは、１２番目のリシン残基で非ペプチドリンカーの選択的結合のために、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカーをｐＨ７．５〜１０．０、好ましくはｐＨ９．０の条件で反応させる。この時、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカー間の反応モル比は、１：５〜１：５０の範囲、好ましくは１：２０〜１：３０の範囲であり得る。ステップ１）において、Ｎ末端の除去または保護された形態のグルカゴン誘導体の使用は、非ペプチドリンカーがグルカゴン誘導体のＮ末端に結合するのを未然に防止することができる。

ステップ１）の反応は、非ペプチドリンカーの両末端の官能基の種類を考慮して、選択的に還元剤の存在下で実施できる。好ましい還元剤の例としては、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ₃）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩またはピリジンホウ酸塩などが含まれるが、これに制限されない。

ステップ２）においては、ステップ１）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結されたグルカゴン−非ペプチドリンカー複合体が分離される。ステップ２）において分離される複合体は、グルカゴン−非ペプチドリンカーの構造を有している。要求される純度および生成された産物の分子量および電荷量のような特性を考慮して、分離段階はタンパク質の分離に用いられる通常の方法の中から、必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。必要によっては、より高純度に精製するために、複数の互いに異なる方法を組み合わせて用いることができる。

ステップ３）においては、ステップ２）で分離されたグルカゴン−非ペプチドリンカー複合体を重合体キャリアと反応させ、非ペプチドリンカーの露出した末端に重合体キャリアを共有結合で連結する。このステップに適合した重合体キャリアは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体からなる群より選択できるが、これらに限定されない。好ましくは、兔疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃ断片が重合体キャリアとして使用できる。

このステップにおいて、複合体と重合体キャリアは、１：２〜１：１０、好ましくは１：４〜１：８の反応モル比で、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．０で反応する。この時、反応に加わる非ペプチドリンカーの両末端官能基の種類を考慮して、必要に応じて還元剤の存在下で実施できる。還元剤の例として、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ₃）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩などが含まれ得るが、これに限定されない。

ステップ４）は、ステップ３）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にはグルカゴンまたはその誘導体が、他の一方の末端には重合体リンカーが共有的に連結された持続型グルカゴ結合体を分離するステップである。要求される純度および生成された産物の分子量および電荷量のような特性を考慮して、分離段階はタンパク質の分離に用いられる通常の方法の中から、必要に応じて適切に選択して行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む多様な公知の方法を使用することができ、必要によっては、より高純度に精製するために、複数の互いに異なる方法を組み合わせて用いることができる。

好ましい一実施態様として、本発明にかかる製造方法は：
１）化学式４のグルカゴン誘導体を、両末端にアルデヒドを有するＰＥＧとｐＨ９．０で反応させるステップと、

２）ステップ１）の反応混合物から、グルカゴン誘導体の１２番目のリシン残基にＰＥＧの一方の末端が共有的に連結されたグルカゴン−ＰＥＧ複合体を分離するステップと、

３）ステップ２）で分離されたグルカゴン誘導体−ＰＥＧ複合体を兔疫グロブリンＦｃ断片と反応させるステップ、および

４）ステップ３）の反応混合物から、ＰＥＧの一方の末端にはグルカゴン誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップとを含むことができる。

さらに他の面において、本発明は、前記持続型グルカゴン結合体を有効成分として含む肥満の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明において使用される用語、「肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）」は、エネルギーの不均衡によって過度の体脂肪を有する状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）または疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）を意味する。本発明による薬学的組成物を個体に投与することにより、体重を著しく減量し食餌摂取を減少させ、肥満を予防または治療することができる。

本発明において使用される用語、「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与で肥満の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。

本発明において使用される用語、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与で肥満の症状が好転するか有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明の薬学的組成物は、延長した血中半減期および向上した生体内持続性および安定性を有する持続型グルカゴン結合体を有効成分として含むため、薬物の投与用量を画期的に減少させながらも血中グルコースレベルのゆらぎのない改善された服薬順応度を示し、肥満の予防および治療に有用に使用できる。

本発明の薬学的組成物は、有効成分として、本発明による持続型グルカゴン結合体のほか、抗肥満薬物をさらに含むことができる。

本発明により、持続型グルカゴン結合体と併用投与するのに適合した抗肥満薬物の例としては、ＧＬＰ−１作動剤、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）作動剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）拮抗剤、Ｙ２／３作動剤、ＭＣ３／４作動剤、胃／膵臓リパーゼ（ｇａｓｔｒｉｃ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ）阻害剤、５ＨＴ_2c作動剤、β３Ａ作動剤、アミリン（ａｍｙｌｉｎ）作動剤およびグレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）拮抗剤等が含まれるが、これらに限定されるものではない。

好ましくは、本発明による薬学的組成物は、抗肥満薬物として、大韓民国特許出願公開第１０−２００８−００６４７５０号に開示された持続型エキセンディン−４結合体を含むことができる。前記持続型エキセンディン−４結合体は、エキセンディン−４（ＧｅｎＢａｃｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ２２００６、配列番号：２）またはその誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンＦｃ断片と共有的に連結された結合体である。好ましい実施様態において、エキセンディン−４のＮ末端アミン基が除去された誘導体（ＤＡ−エキセンディン−４）であるペプチド、天然型エキセンディン−４のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体（ＨＹ−エキセンディン−４）であるペプチド、天然型エキセンディン−４のＮ末端アミン基がジメチル基で修飾された誘導体（ＤＭ−エキセンディン−４）であるペプチド、および天然型エキセンディン−４のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体（ＣＡ−エキセンディン−４）であるペプチドから選択されるエキセンディン−４誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンＦｃ断片と共有的に連結される。

抗肥満薬物と併用投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体は、持続型グルカゴン結合体の単独投与に比べて、体重の減少および食餌摂取の減少に相乗的効果（ｓｙｎｅｒｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が現れる。特に、本発明の持続型グルカゴン結合体を持続型エキセンディン−４結合体のような抗肥満薬物と併用投与すると、持続型グルカゴン結合体 がグルカゴン受容体に作用すると同時に、抗肥満薬物がＧＬＰ−１受容体に作用するため、より効果的に体重を減少させ食餌摂取を減少させることができる。前記持続型ペプチド結合体の併用投与は、画期的に増加した血中半減期および生体内効力持続効果を示し、より安定的な血中グルコースレベルの変化推移を示すだけでなく、投与量を画期的に減少させることができ、改善された服薬順応度を示すため、本発明の薬学的組成物は、肥満の予防または治療に有用に使用できる。

好ましい一実施態様において、食餌性誘導肥満（Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ、ＤＩＯ）マウスに、本発明の持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−４結合体を併用投与した後、体重、飼料摂取量、血糖の変化推移を観察した。その結果、前記薬物の単独投与に比べて、併用投与した場合に、顕著な体重減少および飼料摂取抑制効果が現れ、血中グルコロースレベルの変化もまた安定的な推移を示した（図１ないし図３参照）。これに反し、ＤＩＯマウスに天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−４結合体を併用投与した場合には、体重は減少したものの、血中グルコースレベルが激しくゆらぎながら変化する様相を示した（図４および図５参照）。このような結果と通し、グルカゴンおよびエキセンディン−４とも持続型結合体の時にのみ、血中グルコースレベルのゆらぎのような任意の副作用がない、体重減少および食餌摂取減少の相乗的効果を期待することができ、生体内の持続性および安定性により薬物の投与用量を画期的に減少できることを確認した。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。例えば、経口投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素および香料等を含むことができる。注射投与の場合、薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを使用することができる。局所投与用の場合、薬学的に許容可能な担体は基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。

本発明の薬学的組成物は、前述のような薬剤学的に許容可能な担体と混合して多様な剤形に製造することができる。例えば、経口投与時には薬学的組成物は錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたはウエハーなどの形態で製造することができる。注射剤の場合、薬学的組成物は一回量の投薬形態としてアンプルまたは多数回の服用容器のような投薬形態で製造することができる。薬学的組成物は、その他に溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセルおよび持続型製剤等に剤形化することができる。

一方、本発明の薬学的に許容可能な製剤化に適合した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア・ゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、本発明の薬学的組成物は充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤等をさらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、目的の組織に到逹できる限り、何らかの一般的な経路を介して投与できる。投与の様々な方法としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与等が含まれ得るが、これらに限定されない。

しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は、薬学的組成物の活性成分をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。好ましくは、本発明の薬学的組成物は注射剤の形態で投与できる。また、本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。

本発明の薬学的組成物の投与頻度と投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の重症度等の様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。例えば、抗肥満薬物との併用投与時、本発明の持続型グルカゴン結合体は、１０〜４０００μｇ／ｋｇ、好ましくは５０〜２０００μｇ／ｋｇの用量で毎週投与することができ、そして５〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｋｇの持続型エキセンディン−４結合体を毎週投与することができる。しかし、投与量は投与経路、疾病の重症度および患者の性別、体重および年齢等によって増減することがあるため、前記投与量がどのような方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。生体内持続性および力価に優れているため、本発明の薬学的組成物は投与頻度を著しく減少させることができる。本発明の薬学的組成物は、延長した血中半減期とともに生体内持続性および安全性に優れており、薬物の投与頻度および投与量を顕著に減少させることができる。

さらに他の態様によれば、本発明は、治療学的に有効な量の持続型グルカゴン結合体を、これを必要とする対象に投与することを含む、肥満を予防または治療する方法を提供する。この時、本発明の持続型グルカゴン結合体とともに抗肥満薬物を併用投与することができる。

持続型グルカゴン結合体と併用投与できる抗肥満薬物は、好ましくは、大韓民国特許出願公開第１０−２００８−００６４７５０号に開示された持続型エキセンディン−４結合体である。前記持続型エキセンディン−４結合体は、エキセンディン−４またはその誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンＦｃ断片と共有的に連結された結合体である。好ましい持続型エキセデイン−４結合体において、エキセンディン−４のＮ末端アミン基が除去された誘導体（ＤＡ−エキセンディン−４）、Ｎ末端アミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体（ＨＹ−エキセンディン−４）、Ｎ末端アミン基が２個のメチル基で修飾された誘導体（ＤＭ−エキセンディン−４）およびエキセンディン−４のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体（ＣＡ−エキセンディン−４）から選択されるエキセンディン−４誘導体が、非ペプチドリンカーを介して兔疫グロブリンＦｃ断片と共有的に連結されるが、本発明がこれに限定されるものではない。

本発明において使用される用語、「投与」は、何らかの適切な方法で患者に有効成分を導入することを意味する。投与経路は、有効成分が標的組織に到逹できる限り、任意の一般的な経路を介して投与できる。投与経路の例は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与を含むことができるが、これらに限定されない。しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は、有効成分をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。好ましくは、活性成分は注射剤の形態で剤形化できる。また、持続性製剤は、有効成分を標的細胞に伝達できる任意の装置を用いて投与できる。

治療となる対象の例としては、ヒト、猿、牛、馬、羊、豚、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、猫、犬、マウス、ネズミ、ウサギおよびモルモットを含むが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳類である。より好ましくは、ヒトである。

有効成分の文脈で使用された用語、「治療学的に有効な量」は、疾患を予防または治療するために有効な量を意味し、即ち肥満を適切な利益／危険の割合で治療または予防するのに有効な量を意味する。

抗肥満薬物を併用投与する場合、本発明の持続型グルカゴン結合体はグルカゴン受容体に作用し、これと同時に、抗肥満薬物はＧＬＰ−１受容体に作用し、血中グルコースレベルのゆらぎのような任意の副作用なくより効果的に体重を減少させ食餌摂取を減少させることができる。したがって、本発明の持続型ペプチド結合体は、肥満を予防または治療するのに極めて効果的である。

本発明のよりよい理解は、例示すために記された下記の実施例を介して得られるが、発明を限定するものとして解釈されるものではない。

実施例１：イミダゾ−アセチルグルカゴン−兔疫グロブリンＦｃ結合体の製造

イミダゾ−アセチル（ｉｍｉｄａｚｏ−ａｃｅｔｙｌ）グルカゴン（ＣＡ−グルカゴン、ＡＰ、米国）を、ＣＡ−グルカゴンの１２番目のリシン（Ｌｙｓ１２）残基にペグ化させるために３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にプロピオンアルデヒド基を有するＰＥＧ、ＩＤＢ Ｉｎｃ．、大韓民国）に反応させた。この時、ＣＡ−グルカゴンとＰＥＧのモル比を１：３０にし、ペプチドの濃度を３ｍｇ/ｍＬとし、室温で３時間反応させた。さらに、反応は、還元剤として２０ｍＭＳＣＢの存在下で、１００ｍＭホウ酸ナトリウム（Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ）緩衝液中(ｐＨ９．０) で行われた。反応終了後、収得された生成物である、ＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ複合体を下記の条件でＳＯＵＲＣＥ Ｓカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたクロマトグラフィーを行い、精製した。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ０％→溶出液Ｂ５０％（Ａ：２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＫＣｌ）で５０分間溶出

前記の精製されたＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ複合体を兔疫グロブリン(ＩｇＧ)Ｆｃ断片（大韓民国特許登録第１０−７２５３１５号に従って製造）と１：８のモル比で混合し、ペプチド濃度を２０ｍｇ／ｍＬにし、４℃で２０時間反応させた。この時、反応は、還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢの存在下で、ｐＨ６．０の１００ｍＭ Ｋ−Ｐ緩衝液中で行われた。反応終了後、反応混合物を下記の条件でＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラム（ＨＲ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた２つの段階のクロマトグラフィーを行い精製した。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ（ＨＲ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：７．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ１００％→０％（Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５＋２Ｍ ＮａＣｌ）
で６０分間溶出

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ０％→溶出液Ｂ２０％（Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）で７０分間溶出

まず、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いて、結合反応に加わらない多量の免疫グロブリンＦｃを除去した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ ＮａＣｌを用いて塩勾配を与え、相対的に結合親和力の弱いＩｇＧＦｃを、まず溶出させ、その直後にＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を溶出させた。一次精製によってある程度免疫グロブリンＦｃ断片が除去されるが、ＩｇＧＦｃ断片とＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は互いに結合力の差が大きくなく、完全な分離が難しかった。二次精製工程のために、２つの物質の疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を利用した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を用いて一次精製された試料をＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムにカップリングさせた。試料を１Ｍ ＮａＣｌで塩勾配を与えながら溶出した。ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムにおいて、弱い結合親和力を有する免疫グロブリンＦｃ断片が先に溶出され、強い結合親和力を有するＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ複合体がその後溶出された。逆相ＨＰＬＣで分析した結果、前記の精製されたＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ複合体は９５．８％の純度を示した。

実施例２：イミダゾ−アセチルエキセンディン−４−兔疫グロブリンＦｃ結合体の製造

イミダゾ−アセチルエキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４、ＡＰ、米国）を３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端にプロピオンアルデヒド基を有するＰＥＧ、ＩＤＢ Ｉｎｃ．、韓国）とＣＡ−エキセンディン−４の２７番目のリシン（Ｌｙｓ２７）残基にペグ化させるために反応させた。この時、ＣＡ−エキセンディン−４とＰＥＧのモル比を１：３０にし、ペプチドの濃度を３ｍｇ／ｍＬにして４℃で１２時間反応させた。さらに、反応は還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢの存在下で、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液中(ｐＨ７．５)で行われた。反応終了後、収得された生成物のＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ複合体を下記の条件でＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＳＯＵＲＣＥ Ｓカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた２つの段階のクロマトグラフィーを行い精製した。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ ０％→溶出液Ｂ２０％（Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、Ｂ：Ａ＋
１Ｍ ＮａＣｌ）で７０分間溶出

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ０％→溶出液Ｂ５０％（Ａ：２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０、Ｂ：Ａ＋
１Ｍ ＫＣｌ）で５０分間溶出

具体的には、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムによって一次的にモノペグ化された（ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ペプチドをＳＯＵＲＣＥＱカラムによって精製し、続いてＳＯＵＲＣＥＱカラムによって異性体を分離した。Ｎ末端がペグ化された（Ｎ−ｔｅｒｍ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ペプチドのピークが先に溶出され、その後、リシンがペグ化された（Ｌｙｓ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）２個のピークが溶出された。２個のリシンーペグ化されたピークのペプチドマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）は、先に溶出されたピークのペグ化された分画が１２番目のリシン（Ｌｙｓ１２）にペグ化された複合体であり、一番後に溶出された分画が２７番目のリシン（Ｌｙｓ２７）にペグ化された複合体であることを示した。

したがって、得られたＬｙｓ２７ペグ化したＣＡ−エキセンディン−４ＰＥＧ複合体を兔疫グロブリンＦｃ断片（大韓民国特許登録第１０−７２５３１５号に従って製造）と１：８のモル比で混ぜ、続いて全体のペプチド濃度を２０ｍｇ／ｍＬにし、４℃で２０時間反応させた。この時、反応は、還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢの存在下で、１００ｍＭ Ｋ−Ｐ緩衝液中（ｐＨ６．０）で行われた。反応終了後、反応混合物を下記の条件でＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯカラム（ＨＲ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた２つの段階のクロマトグラフィーを行い、精製した。

カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：２．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ０％→溶出液Ｂ２０％（Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）で７０分間溶出

カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ（ＨＲ１６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
流速：７．０ｍＬ／分
勾配：溶出液Ａ１００％→０％６０分（Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５＋１．５Ｍ硫酸アンモニウム）で６０分間溶出

最初に、反応に加わらない多量の免疫グロブリンＦｃを除去するために、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを用いた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で１Ｍ ＮａＣｌを用いて塩勾配を与え、相対的に結合親和性が弱い免疫グロブリンＦｃ断片を先に溶出し、その後ＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を溶出した。一次精製によってある程度免疫グロブリンＦｃ断片が除去されるが、イオン交換カラムでは免疫グロブリンＦｃ断片とＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体との間に類似した結合親和性によって相互に完全な分離が難しかった。二次精製のために、それらの間に疎水性の違いを活用した。ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯカラムに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いて一次精製された試料をカップリングさせた。その後、徐々に塩濃度の勾配を用いて試料を溶出した。ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯカラムで、結合親和力の弱い免疫グロブリンＦｃ断片が先に溶出され、結合親和力が強いＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体はその後に溶出された。逆相ＨＰＬＣで分析した結果、前記の精製されたＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は９１．６％の純度を示した。

実施例３：持続型グルカゴン結合体と抗肥満薬物の併用投与による相乗的効果

実施例１で製造された持続型グルカゴン結合体と、実施例２で製造された持続型エキセンディン−４結合体の併用投与による相乗的効果を確認するために、食餌性誘導肥満（ＤＩＯ）マウスの体重、飼料摂取量および血中グルコースレベルの変化について分析した。

５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（オリエント社、大韓民国）に、１３週間、高脂肪式ダイエットを実施し、糖尿病モデルとして食餌性誘導肥満(ＤＩＯ)マウスを得た。具体的には、マウスを体重によって１グループあたり５匹ずつ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５の５つのグループに分離した後、高脂肪飼料（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を毎日変えながら、動物が自由に摂取できるようにした。１８週齢（５０ｇ／ｈｅａｄ）になった５つのグループのマウスに、それぞれ対照区として、担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）；ＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＨＭ１１２６０Ｃ）；ＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＨＭ１１２６０Ｃ）＋ＣＡ−グルカゴン；およびＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＨＭ１１２６０Ｃ）＋ＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＬＡＰＳ ＣＡ−グルカゴン）を、用量を異にして約２週間投与した。

この時、Ｇ２グループには毎週２０μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を、Ｇ３グループには毎週２０μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体＋１日２回ずつ１００μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−グルカゴンを、Ｇ４グループには毎週２０μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体＋毎週７００μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を、Ｇ５グループには毎週２０μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体＋毎週１４００μｇ／ｋｇの投与量でＣＡ−グルカゴン−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を投与した。

前記試験物質の投与後、各グループに対して、毎日、体重、飼料摂取量および血糖の変化を測定した。

図１ないし図３に示されたように、持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−４結合体を併用投与したグループから、他のグループに比べて確実な体重減少および飼料摂取量減少効果を確認した。特に、天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−４結合体を併用投与したグループで体重は減少したものの、血中グルコースレベルで激しいゆらぎが観察された。しかし、持続型グルカゴン結合体と持続型エキセンディン−４結合体を併用投与したグループは安定的な血中グルコースレベルの変化推移を示した。

これらの結果は、グルカゴンとエキセンディン−４の双方が持続型結合体の時、併用投与は血中グルコースレベルのゆらぎがなく、体重減少および食餌摂取阻害の相乗効果を誘導することができる。さらに、本発明の持続型結合体は、延長された血中半減期および改善された生体内の持続性により、著しく少ない投与用量で投与できるため、肥満の予防および治療に対する使用が効果的であるといえる。

比較例１：天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−４結合体の併用投与

天然型グルカゴンと実施例２にて製造された持続型エキセンディン−４結合体の併用投与による効果を確認するために、実施例３におけて記述した同様の方法に従って、食餌性誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに対照区として、担体（Ｇ１）；天然型グルカゴンペブチド（Ｇ２）；ＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＨＭ１１２６０Ｃ）（Ｇ３）；および天然型グルカゴン＋ＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（ＨＭ１１２６０Ｃ）（Ｇ４）を、用量を異にして約２週間投与した。

この時、Ｇ２グループには１日２回ずつ２００μｇ／ｋｇの天然型グルカゴンを、Ｇ３グループには毎週２０μｇ／ｋｇのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を、Ｇ４グループには１日２回ずつ２００μｇ／ｋｇの天然型グルカゴン＋毎週２０μｇ／ｋｇのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を投与した。

前記試験物質の投与後、各グループのマウスに対して、毎日、体重、飼料摂取量および血中グルコースレベルの変化を測定した。

図４および図５に示されたように、他のグループに比べて、天然型グルカゴンと持続型エキセンディン−４結合体を併用投与したグループで増加した体重減少効果が確認されたが、血中グルコースレベルが激しくゆらぎながら変化する様相が観察された。

本発明の持続型グルカゴン結合体は、増加した血中半減期と改善された生体内持続性および安定性を示す。したがって、抗肥満薬物との併用投与時、本発明の持続型グルカゴン結合体は、極めてし少量の投与量で投与することができ、血中グルコースレベルのゆらぎなく服薬順応度が改善されることを示す。したがって、本発明の持続性グルカゴン結合体は、肥満の予防および治療に効率的に使用できる。

オキシントモジュリンの誘導体として、現在臨床１相進行中のデュアルアゴニスト（Ｄｕａｌ ａｇｏｎｉｓｔ、Ｍｅｒｃｋ）、および前臨床試験進行中のＺＰ２９２９（Ｚｅａｌａｎｄ、ＷＯ２００８／１５２４０３Ａ１）がある。デュアルアゴニストのペプチド（Ｍｅｒｃｋ）はオキシントモジュリンであり、このジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下、「ＤＰＰ−ＩＶ」とする）に対する抵抗性は２番目のアミノ酸のＬ−ＳｅｒをＤ−Ｓｅｒに置換して増加し、血中半減期はそのＣ末端にコレステロールモイエティを結び付けて延長される。ＺＰ２９２９（Ｚｅａｌａｎｄ）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−ＳｅｒをＤ−Ｓｅｒに置換してＤＰＰ−ＩＶに対する抵抗性を高め、１７番目のアミノ酸ＡｒｇをＡｌａに置換してプロテアーゼに対する抵抗性を高め、２７番目のアミノ酸ＭｅｔをＬｙｓに置換して酸化的安定性を増加させ、２０番目および２４番目のアミノ酸Ｇｌｎと２８番目のアミノ酸ＡｓｎをそれぞれＡｓｐ、ＡｌａおよびＳｅｒに置換して脱アミド化安定性（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を増加させることを含むオキシントモジュリンの誘導体である。

化４のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端アミン基が２個のメチル基で修飾されたジメチルヒスチジルグルカゴン（以下、「ＤＭ−グルカゴン」とする）である。

化３のグルカゴン誘導体は、天然型グルカゴンのＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたイミダゾアセチルグルカゴン（以下、「ＣＡ−グルカゴン」とする）である。

Claims (45)

1. グルカゴンまたはその誘導体が、非ペプチドリンカーによって重合体キャリアに共有的に連結された、持続型グルカゴン結合体。
2. 前記グルカゴン誘導体が、天然型グルカゴンのＮ末端の１番目のアミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素またはそれに結合されたアルファアミン基が置換、修飾または除去されたものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
3. 前記グルカゴン誘導体が、天然型グルカゴンの一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）に置換された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基が２個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の持続型グルカゴン結合体。
4. 前記グルカゴン誘導体が、下記化学式１〜４で表示される誘導体からなる群より選択されるものである、請求項３記載の持続型グルカゴン誘導体：
   
   式中、「ペプチド」は、天然型グルカゴンである。
5. 前記非ペプチドリンカーの一方の末端がグルカゴンまたはその誘導体に、他方の末端は重合体キャリアに共有的に連結されるものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
6. 前記非ペプチドリンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
7. 前記非ペプチドリンカーが、１〜１００ｋＤａの範囲の分子量を有するものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
8. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にそれぞれグルカゴンまたはその誘導体および重合体キャリアと共有的に連結できる官能基を有するものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
9. 前記作用基がアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミジルプロピオン酸、ヒドロキシスクシンイミジルカルボキシメチルおよびスクシンイミジルカーボネートからなる群より選択される官能基を有するものである、請求項８に記載の持続型グルカゴン結合体。
10. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にアルデヒド基を有するものである、請求項９に記載の持続型グルカゴン結合体。
11. 前記非ペプチドリンカーが、両末端にアルデヒド基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１０に記載の持続型グルカゴン結合体。
12. 前記重合体キャリアが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、アルブミン、ゼラチン、兔疫グロブリン断片、デキストラン、脂肪酸、ポリサッカライドおよび高分子重合体からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の持続型グルカゴン結合体。
13. 前記重合体キャリアが、兔疫グロブリンＦｃ断片である、請求項１２に記載の持続型グルカゴン結合体。
14. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、非糖鎖化されたものである、請求項１３に記載の持続型グルカゴン結合体。
15. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインからなる群より選択される１個〜４個のドメインからなるものである、請求項１３に記載の持続型グルカゴン結合体。
16. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、ヒンジ領域をさらに含むものである、請求項１３に記載の持続型グルカゴン結合体。
17. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群より選択された兔疫グロブリンに由来するものである、請求項１３に記載の持続型グルカゴン結合体。
18. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、ＩｇＧ４Ｆｃ断片である、請求項１３に記載の持続型グルカゴン結合体。
19. 前記兔疫グロブリンＦｃ断片が、非糖鎖化したヒトＩｇＧ４Ｆｃ断片である、請求項１８に記載の持続型グルカゴン結合体。
20. 下記化学式５で表示される構造を有する、請求項１記載の持続型グルカゴン結合体：
    式中、Ｒ１は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、デス−アミノ−ヒスチジル、Ｎ−ジメチル−ヒスチジル、ベータ−ヒドロキシイミダゾプロピルおよび４−イミダゾアセチルからなる群より選択され、
    Ｒ２は、−ＮＨ₂、−ＯＨおよびリシン（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、
    Ｘは、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴであり、
    Ｙは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
    Ｚは、兔疫グロブリンＦｃ断片である。
21. 下記のステップを含む請求項１による持続型グルカゴン結合体の製造方法：
    １）グルカゴンまたはその誘導体を、両末端に官能基を有する非ペプチドリンカーと反応させるステップと、
    ２）ステップ１）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にグルカゴンまたはその誘導体が共有的に連結された複合体を分離するステップと、
    ３）ステップ２）で分離された複合体を重合体キャリアと反応させるステップと、
    ４）ステップ３）の反応混合物から、非ペプチドリンカーの一方の末端にはグルカゴンまたはその誘導体が、他方の末端には重合体キャリアが共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップ。
22. ステップ１）において、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカーとの反応が、１：５〜１：５０の反応モル比で、ｐＨ７．５〜１０．０の条件で行われるものである、請求項２１に記載の製造方法。
23. ステップ１）において、グルカゴンまたはその誘導体と非ペプチドリンカーとの反応が、還元剤の存在下で行われるものである、請求項２１に記載の製造方法。
24. 前記還元剤が、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ₃）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩からなる群より選択されるものである、請求項２３に記載の製造方法。
25. ステップ２）で分離された複合体が、ペプチドリンカーがグルカゴンまたはその誘導体のＮ末端以外のアミノ酸残基に非ペプチドリンカーの一方の末端が共有的に連結された、グルカゴン−非ペプチドリンカーの構造を有するものである、請求項２１に記載の製造方法。
26. 前記アミノ酸残基が、グルカゴンまたはその誘導体の１２番目のリシン残基である、請求項２５に記載の製造方法。
27. ステップ３）において、複合体と重合体キャリアの反応が、１：２〜１：１０の反応モル比で、ｐＨ５．０〜８．０で行われるものである、請求項２１に記載の製造方法。
28. ステップ３）において、複合体と重合体キャリアの反応が、還元剤の存在の下に行われるものである、請求項２１に記載の製造方法。
29. 還元剤が、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ₃）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩およびピリジンホウ酸塩からなる群より選択されるものである、請求項２８に記載の製造方法。
30. ステップ４）で分離された持続型グルカゴン結合体が、グルカゴン−非ペプチドリンカー−重合体キャリアの構造を有するものである、請求項２１に記載の製造方法。
31. 下記のステップを含むものである、請求項２１に記載の製造方法：
    １）化学式４のグルカゴン誘導体を両末端にアルデヒドを有するＰＥＧとｐＨ９．０で反応させるステップ：
    ２）ステップ１）の反応混合物から、グルカゴン誘導体の１２番目のリシン残基にＰＥＧの一方の末端が共有的に連結されたグルカゴン−ＰＥＧ複合体を分離するステップ；
    ３）ステップ２）で分離されたグルカゴン誘導体−ＰＥＧ複合体を兔疫グロブリンＦｃ断片と反応させるステップ；および
    ４）ステップ３）の反応混合物から、ＰＥＧの一方の末端にはグルカゴン誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された持続型グルカゴン結合体を分離するステップ。
32. 有効成分として請求項１記載の持続型グルカゴン結合体および薬学的に許容可能な担体を含む、肥満の予防または治療用薬学的組成物。
33. 抗肥満薬物をさらに含むものである、請求項３２に記載の薬学的組成物。
34. 前記抗肥満薬物が、ＧＬＰ−１作動剤、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）作動剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、メラニン濃縮ホルモン（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＭＣＨ）拮抗剤、Ｙ２／３作動剤、ＭＣ３／４作動剤、胃／膵臓リパーゼ（ｇａｓｔｒｉｃ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ）阻害剤、５ＨＴ_2c作動剤、β３Ａ作動剤、アミリン（ａｍｙｌｉｎ）作動剤、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）拮抗剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項３３に記載の薬学的組成物。
35. 前記ＧＬＰ−１作動剤が、エキセンディン−４、エキセンディン−４誘導体およびこれらの持続型結合体である、請求項３４に記載の薬学的組成物。
36. 前記エキセンディン−４誘導体が、天然型エキセンディン−４の一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基が２個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
37. 前記持続型エキセンディン−４結合体が、非ペプチドリンカーを介してエキセンディン−４またはその誘導体と兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
38. 前記持続型エキセンディン−４結合体が、非ペプチドリンカーの一方の末端にはエキセンディン−４誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項３７に記載の薬学的組成物。
39. 治療学的に有効な量の請求項１記載の持続型グルカゴン結合体を、これを必要とする対象に投与するステップを含む、肥満を予防または治療する方法。
40. 前記持続型グルカゴン結合体とともに抗肥満薬物を併用投与するものである、請求項３９に記載の方法。
41. 前記抗肥満薬物が、ＧＬＰ−１作動剤、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）作動剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、メラニン濃縮ホルモン（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＭＣＨ）拮抗剤、Ｙ２／３作動剤、ＭＣ３／４作動剤、胃／膵臓リパーゼ（ｇａｓｔｒｉｃ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ）阻害剤、５ＨＴ_2c作動剤、βＡ作動剤、アミリン（ａｍｙｌｉｎ）作動剤、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）拮抗剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項４０に記載の方法。
42. 前記ＧＬＰ−１作動剤が、エキセンディン−４、エキセンディン−４誘導体およびこれらの持続型結合体である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記エキセンディン−４誘導体が、天然型エキセンディン−４一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基が除去された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアミン基がヒドロキシル基に置換された誘導体、その一番目のＮ末端ヒスチジン残基アミン基が２個のメチル基で修飾された誘導体およびその一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去された誘導体からなる群より選択されるものである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記持続型エキセンディン−４結合体が、非ペプチドリンカーを介してエキセンディン−４またはその誘導体と兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された構造を有するものである、請求項４２に記載の方法。
45. 前記持続型エキセンディン−４結合体が、非ペプチドリンカーの一方の末端にはエキセンディン−４誘導体が、他方の末端には兔疫グロブリンＦｃ断片が共有的に連結された構造を有し、前記エキセンディン−４誘導体がその一番目のＮ末端ヒスチジン残基のアルファ炭素およびアルファ炭素に結合されたアミン基が除去されたものである、請求項４４に記載の方法。