JP2013533227A - FGF21 analogs and derivatives - Google Patents
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Abstract
糖尿病治療に対する特性が改善された線維芽細胞増殖因子21の誘導体は、組換え法によって調製することができる。 Derivatives of fibroblast growth factor 21 with improved properties for treating diabetes can be prepared by recombinant methods.
Description
本発明は、新規な線維芽細胞増殖因子21(FGF21)の類似体に関し、さらに、修飾部分が共有結合しているその誘導体に関する。本発明はまた、特に糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群、および/または、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の治療のための、こうした類似体および誘導体の医薬用途にも関する。 The present invention relates to novel fibroblast growth factor 21 (FGF21) analogues and further to derivatives thereof in which the modifying moiety is covalently linked. The invention also relates to the pharmaceutical use of such analogs and derivatives, particularly for the treatment of diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome, and / or nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Also related.
本発明の誘導体は長期型であり、例えば、血中グルコースレベルが低い状態を長期間維持することができ、in vivoでのFGF21の半減期を増大することができ、および/またはFGF21のクリアランスの低下をもたらす。 The derivatives of the present invention are long-term, for example, can maintain a low blood glucose level for a long period of time, can increase the half-life of FGF21 in vivo, and / or of clearance of FGF21 Bring about a decline.
線維芽細胞増殖因子は、発達組織及び成体組織で発現するポリペプチドである。線維芽細胞増殖因子は、例えば代謝調節および細胞分化を含めた、いくつかの生理機構に関与する。ファミリー全体で20を超える線維芽細胞増殖因子が存在する(FGFファミリー)。FGF19、FGF21及びFGF23を含むFGFファミリーの3メンバーは、代謝調節に関与する内分泌因子として機能するサブファミリーを形成する。 Fibroblast growth factor is a polypeptide that is expressed in developmental and adult tissues. Fibroblast growth factor is involved in several physiological mechanisms including, for example, metabolic regulation and cell differentiation. There are over 20 fibroblast growth factors across the family (FGF family). Three members of the FGF family, including FGF19, FGF21 and FGF23, form a subfamily that functions as endocrine factors involved in metabolic regulation.
線維芽細胞増殖因子21またはFGF-21(本明細書ではFGF21と略す)は、優先的に肝臓で発現し、ホルモン様代謝的効果を発揮することが示されている。例えば、FGF21は、トランスジェニックマウスで過剰発現させた場合には、マウス脂肪細胞におけるグルコースの取込みを活性化し食事性肥満からマウスを保護し、糖尿病のげっ歯類に投与した場合には、血中グルコースおよびトリグリセリドレベルを低下させることが示されている(Kharitonenkovら、J. Clin. Invest. (2005)、115:1627〜1635)。血中グルコースおよびトリグリセリドに対するFGF21の低減効果は、糖尿病のサルでも示されている。糖尿病のサルにおいて、FGF21は、LDLを減少させ、HDLを有意に増加させることもできた(Kharitonenkovら、Endocrinology (2007)、148(2):774〜81)。 Fibroblast growth factor 21 or FGF-21 (abbreviated herein as FGF21) is preferentially expressed in the liver and has been shown to exert hormone-like metabolic effects. For example, FGF21, when overexpressed in transgenic mice, activates glucose uptake in mouse adipocytes to protect mice from dietary obesity, and when administered to diabetic rodents, It has been shown to reduce glucose and triglyceride levels (Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. (2005), 115: 1627-1635). The reducing effect of FGF21 on blood glucose and triglycerides has also been shown in diabetic monkeys. In diabetic monkeys, FGF21 could also reduce LDL and significantly increase HDL (Kharitonenkov et al., Endocrinology (2007), 148 (2): 774-81).
食事性肥満マウスおよびob/obマウスにおいて、FGF21は、主にエネルギー消費を増大させ脂肪蓄積を減少させることによって、体重を減少させることがさらに示された(Coskunら、Endocrinology (2008)、149(12):6018〜6027)。 In dietary obese and ob / ob mice, FGF21 was further shown to reduce body weight, primarily by increasing energy expenditure and decreasing fat accumulation (Coskun et al., Endocrinology (2008), 149 ( 12): 6018-6027).
これらの結果に基づいて、FGF21は、糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患およびメタボリック症候群を治療する可能性のある薬物として示唆されている。メタボリック症候群には、インスリン抵抗性、脂質異常症、内臓型肥満および高血圧のような態様が含まれ、例えば、Grundyら、Circulation (2004)、(109):433〜438のメタボリック症候群の定義を指参照されたい。 Based on these results, FGF21 has been suggested as a potential drug for treating diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease and metabolic syndrome. Metabolic syndrome includes aspects such as insulin resistance, dyslipidemia, visceral obesity and hypertension, and refers to the definition of metabolic syndrome, for example, Grundy et al., Circulation (2004), (109): 433-438. Please refer.
FGF21は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を治療する可能性のある薬物としてさらに使用することができる。上記で引用したCoskunらEndocrinology、2008およびXuら、Diabetes(2009、58(1):250〜9、印刷版出版前に2008年10月7日に電子出版)を参照されたい。NAFLDは、印刷物に先立ち2008年12月12日に電子出版されたErickson、J.Lipid Res. (2008)によって定義されている。Yieらは、受容体の相互作用および活性化におけるFGF21のN末端およびC末端の役割を研究した。FEBS Letters、583 (2009)、19〜24を参照されたい。 FGF21 can be further used as a drug that may treat non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). See Coskun et al. Endocrinology cited above, 2008 and Xu et al., Diabetes (2009, 58 (1): 250-9, electronic publishing on October 7, 2008 prior to print publication). NAFLD is defined by Erickson, J. Lipid Res. (2008), published electronically on December 12, 2008 prior to print. Yie et al. Studied the role of the N- and C-termini of FGF21 in receptor interaction and activation. See FEBS Letters, 583 (2009), 19-24.
WO2003/011213A2は、FGF21前駆体のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するFGF21化合物を使用することによる、1型および2型の糖尿病または肥満の治療方法を開示している。WO2003/061712A1は、薬学的特性が向上したFGF21の変異タンパク質、例えばA145Eを開示している。 WO2003 / 011213A2 discloses a method for treating type 1 and type 2 diabetes or obesity by using an FGF21 compound having at least 95% identity to the amino acid sequence of the FGF21 precursor. WO2003 / 061712A1 discloses a FGF21 mutant protein, eg A145E, with improved pharmaceutical properties.
WO2005/091944A2は、FGF21、FGF21-K59CおよびFGF21-K122Cのペグ化された誘導体を開示している。 WO2005 / 091944A2 discloses PEGylated derivatives of FGF21, FGF21-K59C and FGF21-K122C.
WO2005/113606A2は、IgG4免疫グロブリンのFc部分またはヒト血清アルブミンを有する様々なFGF21融合タンパク質を開示している。 WO2005 / 113606A2 discloses various FGF21 fusion proteins having the Fc portion of IgG4 immunoglobulin or human serum albumin.
WO2006/028595A2は、酵母で発現させると、O-グリコシル化能力(capacity)が低下するFGF21のさらなる変異タンパク質、例えばL118C-A134C-S167Aを開示している。 WO2006 / 028595A2 discloses further mutated proteins of FGF21, such as L118C-A134C-S167A, which have a reduced O-glycosylation capacity when expressed in yeast.
WO2006/028714A1は、酵母で発現させると、タンパク質分解に対する感受性が低下するFGF21の別の変異タンパク質、例えばL153Iを開示している。 WO2006 / 028714A1 discloses another mutated protein of FGF21, such as L153I, that is less sensitive to proteolysis when expressed in yeast.
WO2006/065582A2は、アミド分解が低下したFGF21のさらに別の変異タンパク質、例えばdes-HPIP-L118C-A134C-N121Dを開示している。 WO2006 / 065582A2 discloses yet another mutant protein of FGF21 with reduced deamidation, such as des-HPIP-L118C-A134C-N121D.
WO2006/078463A2は、天然の成熟FGF21またはそれらの特定の変異体を使用することによる、心血管疾患の治療方法を開示している。 WO2006 / 078463A2 discloses a method for treating cardiovascular disease by using natural mature FGF21 or specific variants thereof.
WO2008/121563は、非天然にコードされたアミノ酸ならびにそれらの誘導体を含むように修飾されたFGF21ポリペプチドを開示している。 WO2008 / 121563 discloses FGF21 polypeptides modified to include non-naturally encoded amino acids as well as derivatives thereof.
本発明の目的は、従来技術の少なくとも1つの欠点を克服または改善することであり、または有用な代替物を提供することである。 The object of the present invention is to overcome or ameliorate at least one drawback of the prior art or to provide a useful alternative.
本発明の別の態様は、例えばヒトFGF21と比較して、糖尿病治療に関する特性が改善されたFGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the present invention relates to the provision of analogs or derivatives of FGF21 with improved properties for treating diabetes compared to, for example, human FGF21.
本発明の別の態様は、例えばヒトFGF21と比較して、肥満治療に関する特性が改善されたFGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the present invention relates to the provision of analogues or derivatives of FGF21 with improved properties relating to the treatment of obesity compared to, for example, human FGF21.
本発明の別の態様は、例えばヒトFGF21と比較して、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)治療に関する特性が改善された、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the invention relates to the provision of analogs or derivatives of FGF21 that have improved properties for the treatment of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), for example compared to human FGF21.
本発明の別の態様は、大腸菌(E. coli)で比較的容易に組換え体を調製することができる、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the present invention relates to the provision of analogs or derivatives of FGF21 that allow relatively easy preparation of recombinants in E. coli.
本発明の別の態様は、N末端の分解に対して保護された、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the invention relates to the provision of analogs or derivatives of FGF21 that are protected against N-terminal degradation.
本発明の別の態様は、例えばヒトFGF21と比較して、3T3-L1細胞において、グルコースの取込みに関する効力が増大した、FGF21の類似体または誘導体の提供に関する。 Another aspect of the invention relates to the provision of analogs or derivatives of FGF21 that have increased potency for glucose uptake, eg, in 3T3-L1 cells compared to human FGF21.
本発明の別の態様は、Met-FGF-21の平均半減期と比較して平均半減期が延長された、FGF-21の類似体および誘導体の提供に関する。下記の実施例9の試験を参照されたい。 Another aspect of the invention relates to the provision of analogs and derivatives of FGF-21 that have an extended average half-life compared to the average half-life of Met-FGF-21. See the test of Example 9 below.
本発明のさらなる目的は、高血圧、重篤疾患、メタボリック症候群、てんかん、癌、先端巨大症、脂質異常症(高TG、高LDLおよび低HDC)および心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症を治療するために効果的に使用することができる化合物を提供することである。 Further objects of the present invention include hypertension, serious illness, metabolic syndrome, epilepsy, cancer, acromegaly, dyslipidemia (high TG, high LDL and low HDC) and cardiovascular diseases such as atherosclerosis and high It is to provide a compound that can be used effectively to treat cholesterolemia.
定義
天然のヒトFGF21タンパク質の配列は、アクセッション番号Q9NSA1でUNIPROTデータベースから入手可能である。209アミノ酸の前駆体タンパク質には、シグナルペプチド(アミノ酸1〜28)および成熟タンパク質(アミノ酸29〜209)が含まれる。本明細書において成熟タンパク質は、配列番号1(アミノ酸1〜181)として、シグナルペプチドは配列番号2(アミノ酸1〜28)として含まれる。
Definitions The sequence of the native human FGF21 protein is available from the UNIPROT database under accession number Q9NSA1. 209 amino acid precursor proteins include signal peptides (amino acids 1-28) and mature proteins (amino acids 29-209). In the present specification, the mature protein is contained as SEQ ID NO: 1 (amino acids 1 to 181), and the signal peptide is contained as SEQ ID NO: 2 (amino acids 1 to 28).
本明細書において配列番号1の成熟タンパク質の146番目にLeuの代わりにProを有する、天然ヒトFGF21のアイソフォームまたは対立遺伝子型は、特にUS2001012628A1(刊行済みの米国出願の配列番号2の残基番号174)により既知である。 The isoform or allelic form of native human FGF21, which has Pro instead of Leu at position 146 of the mature protein of SEQ ID NO: 1 herein, is specifically US2001012628A1 (residue number of SEQ ID NO: 2 in published US application 174).
本明細書において配列番号2の23番目のLeuが欠失している短いシグナルペプチドを有する別のアイソフォームは、WO2003/011213により既知である(27アミノ酸残基のシグナルペプチドが載っている国際公開刊行物の配列番号2を参照されたい)。 Another isoform having a short signal peptide in which the 23rd Leu of SEQ ID NO: 2 is deleted herein is known from WO2003 / 011213 (International publication containing a 27 amino acid residue signal peptide) See the publication SEQ ID NO: 2).
したがって、天然のヒトFGF21の特定例は、配列番号1、置換L146Pを有する配列番号1ならびに上記の27または28アミノ酸のシグナルペプチドが先行するこれらの配列のいずれかである。天然のヒトFGF21の好ましい例は、成熟部分、すなわち配列番号1およびそのL146Pアイソフォームである。 Thus, a specific example of natural human FGF21 is either SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 with the substitution L146P, or any of these sequences preceded by the 27 or 28 amino acid signal peptide described above. A preferred example of natural human FGF21 is the mature portion, ie SEQ ID NO: 1 and its L146P isoform.
FGF21と関連して本明細書において言及する用語「類似体」、すなわちFGF21類似体は、天然のFGF21から、特に配列番号1から、そのアミノ酸配列の修飾によって、推定されるもしくは由来するまたは推定され得るもしくは由来し得るポリペプチドを指す。そのような修飾、修正または変更には、1つまたは複数のアミノ酸の置換、除去および/または付加が含まれてよい。例えば、アミノ酸をN末端に付加することができる。 The term “analog” referred to herein in connection with FGF21, ie, an FGF21 analog, is deduced or derived or deduced from the native FGF21, in particular from SEQ ID NO: 1, by modification of its amino acid sequence. A polypeptide that can be obtained or derived. Such modifications, modifications or changes may include substitution, removal and / or addition of one or more amino acids. For example, an amino acid can be added to the N-terminus.
FGF21の修飾と関連して本明細書において言及する用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」には、タンパク質生合成おいて細胞で使用され、遺伝暗号によって指定される20種の標準α-アミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる(アミノ酸残基は、アミノ基から水素が除去されたおよび/またはカルボキシ基からヒドロキシ基が除去されたならびに任意のメルカプト基から水素が除去された、対応する残基である)。本明細書において、アミノ酸は、好ましくは遺伝子工学によって調整することができるアミノ酸である。 The term “amino acid” or “amino acid residue” referred to herein in connection with modification of FGF21 includes the twenty standard α-amino acids used in cells in protein biosynthesis and designated by the genetic code, That is, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine (amino acid residues are A corresponding residue in which hydrogen has been removed from the amino group and / or hydroxy group has been removed from the carboxy group and hydrogen has been removed from any mercapto group). As used herein, an amino acid is preferably an amino acid that can be adjusted by genetic engineering.
本目的に関しては、標準アミノ酸の認知されている2つのコード(1文字及び3文字)を互換的に使用し、または時々アミノ酸名を完全にスペルアウトする。当然ながら、こうした用語は、完全に同等であるとみなされる(例えばS=Seｒ=セリン)。 For this purpose, the two recognized codes for standard amino acids (one letter and three letters) are used interchangeably, or sometimes the amino acid name is spelled out completely. Of course, these terms are considered to be completely equivalent (eg S = Ser = serine).
本明細書で使用する場合、用語「誘導体」は、共有結合的に修飾されたFGF21類似体を指す。この用語は、それ自体限定的ではなく、FGF21ポリペプチド構成成分それ自体にされる変更(「類似体」)とFGF21化合物への側鎖の共有結合(このことによって化合物が「誘導体化」される)とを区別することが意図されるため、むしろ記述的である。必要に応じて、この用語は、他の一般的な化学用語、例えば化合物を代わりに用いてもよい。 As used herein, the term “derivative” refers to a covalently modified FGF21 analog. The term is not limiting per se, but the modifications made to the FGF21 polypeptide component itself ("analogs") and the covalent attachment of the side chain to the FGF21 compound (thus derivatizing the compound) ) Is intended to be distinct, and is rather descriptive. If desired, this term may be substituted with other general chemical terms, such as compounds.
命名法:本明細書において、類似体および誘導体は、問題になっている技術的事項の理解を容易にするのに最も適するとみなされるものはどんなものでも、ポリペプチド命名法、有機化合物命名法および化学式またはそれらの混合を互換的に用いて命名される。例えば、誘導体名S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21は、[71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21が、71番目のCysのチオール基で、{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチルによって修飾されることを意味する。 Nomenclature: As used herein, analogs and derivatives are whatever are considered best suited to facilitate understanding of the technical matter in question, polypeptide nomenclature, organic compound nomenclature And chemical formulas or mixtures thereof are named interchangeably. For example, the derivative name S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino)] Butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21 is [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21 is the thiol group of the 71st Cys, {2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy- It is meant to be modified by 4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl.
例えば類似体における置換は、「元のアミノ酸-位置-置換後のアミノ酸」(または「位置-置換後のアミノ酸」として)として示すことができる。3文字または1文字コードを使用することができる。したがって、表記「S71C」または「Ser71Cys」は、類似体が、ヒトFGF21(配列番号1)の71番目のアミノ酸に対応するアミノ酸位置のセリンがシステインで置換されていることを含むことを意味する。 For example, substitutions in analogs can be indicated as “original amino acid-position-substituted amino acid” (or “position-substituted amino acid”). Three letter or one letter code can be used. Thus, the notation “S71C” or “Ser71Cys” means that the analog includes a substitution of serine at the amino acid position corresponding to the 71st amino acid of human FGF21 (SEQ ID NO: 1).
例えば置換などの複数の修飾は、コンマで分ける(コンマの後にスペースを伴う)ことができ、必要に応じて、それらが同じ変異体に属することを明確にするために括弧で囲んでよい。したがって、[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21と称される類似体は、1番目にAla(A)、166番目にPhe(F)、168番目にLeu(L)、174番目にVal(V)および179番目にPhe(F)を有するヒトFGF21である。 Multiple modifications, such as substitutions, can be separated by commas (with a comma after the comma) and optionally enclosed in parentheses to clarify that they belong to the same variant. Therefore, [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] The analog called FGF21 is Ala (A) first, Phe (F) 166th, Leu (L) 168th, 174th Human FGF21 with Val (V) and 179th Phe (F).
重ねて関連する技術的ポイントの理解を容易にするために、伸長は、位置番号の付加(連続した、C末端における正数およびN末端における負数)によって、またはより単純に、それらの正しい配列を使用して、FGF21などの慣用名が与えられることが多い問題とする化合物に問題の伸長アミノ酸を付加することによって、配列番号1を参照することにより説明することができる。したがって、[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21は、[L166F, M168L, G174V, Y179F] Ala-FGF21と称することもできる。 To facilitate understanding of the technical points that are related to each other, the extension is performed by adding position numbers (sequential, positive numbers at the C-terminus and negative numbers at the N-terminus) or, more simply, their correct sequences. It can be explained by reference to SEQ ID NO: 1 by adding the extended amino acid in question to the compound in question which is often given a common name such as FGF21. Therefore, [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21 can also be referred to as [L166F, M168L, G174V, Y179F] Ala-FGF21.
用語「化合物」は、類似体および誘導体を全体としてカバーする。 The term “compound” covers analogs and derivatives as a whole.
簡潔に述べると、本発明は、下記の請求項および項目において定義される通りである。 Briefly, the present invention is as defined in the following claims and items.
本発明は、新規なFGF21の類似体および誘導体に関する。前記誘導体では、修飾基がFGF21類似体に共有結合的に結合する。本発明は、医薬組成物における前記類似体および誘導体の使用にも関し、特に糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群、および/または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の治療のための使用にも関する。 The present invention relates to novel analogues and derivatives of FGF21. In the derivative, the modifying group is covalently bound to the FGF21 analog. The invention also relates to the use of said analogues and derivatives in pharmaceutical compositions, in particular for the treatment of diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome and / or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Also relates to the use for.
本発明の誘導体は長期型であり、例えば血糖値が低い状態を長期間維持することができ、in vivoでのFGF21の半減期を増大することができ、および/またはFGF21のクリアランスの低下をもたらす。このFGF21誘導体は、十分な生物活性を保持し、元となったFGF21類似体よりも少ない頻度で投与することができる。さらに前記誘導体は、アミド分解の危険性が低下している。 The derivatives of the present invention are long-term, for example, can maintain a low blood glucose level for a long period of time, can increase the half-life of FGF21 in vivo, and / or cause a decrease in clearance of FGF21 . This FGF21 derivative retains sufficient biological activity and can be administered less frequently than the original FGF21 analog. Furthermore, the derivatives have a reduced risk of deamidation.
一態様では、本発明はFGF21類似体に関する。 In one aspect, the invention relates to FGF21 analogs.
一態様では、本発明の類似体および誘導体は、[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに71番目にCysを含み、71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体である。 In one aspect, analogs and derivatives of the invention are [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21, optionally one of the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 173A and / or des181 Or an analogue of FGF21 that includes the plural, optionally has no more than 4 additional mutations, and / or is optionally absent of 179 and / or 180 amino acids [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] , And the sulfur atom of the mercapto group present in the 71st cysteine residue containing Cys at the 71st position, and the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- ( CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (wherein n is 10 to An integer in the range of 20, m is an integer in the range of 1 to 3, p is an integer in the range of 1 to 3, and q is an integer in the range of 2 to 4). A derivative of said analogue.
したがって、上記の態様は、例えば、1)以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数を含む[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、2)(71C、121Q、173Aおよび/またはdes181からなる群から選択されるいずれの変異も除いて)4個以下のさらなる変異を有する[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、3)179および/または180番目のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに4)1)、2)および/または3)の任意の組み合わせを包含する。 Thus, for example, the above embodiments include, for example, 1) the following amino acid substitutions (exchanges): one or more of 71C, 121Q, 173A and / or des181 [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] 2) [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] of FGF21 with 4 or fewer additional mutations (excluding any mutation selected from the group consisting of 71C, 121Q, 173A and / or des181) Analogs, 3) absence of amino acid at position 179 and / or 180 [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] analogs of FGF21, and 4) any combination of 1), 2) and / or 3) Is included.
「4個以下のさらなる変異を有する」という上記の表現は、71C、121Q、173Aおよび/またはdes181からなる群から選択されるいずれの変異も除いて、FGF-21において4個以下のアミノ酸残基が交換、挿入または削除されることを意味する。そのような交換例としては、146番目へのProの挿入がある。 The above expression “having 4 or fewer additional mutations” refers to 4 or fewer amino acid residues in FGF-21, excluding any mutation selected from the group consisting of 71C, 121Q, 173A and / or des181. Means to be replaced, inserted or deleted. An example of such an exchange is the insertion of Pro at position 146.
179および/または180番目のアミノ酸が存在しないFGF-21類似体は、des179および/またはdes180類似体と称することもできる。 FGF-21 analogs that do not have amino acids 179 and / or 180 can also be referred to as des179 and / or des180 analogs.
別の態様では、本発明の類似体および誘導体は、[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しない[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2-CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である) の基が共有結合している前記類似体の誘導体である。 In another embodiment, the analogs and derivatives of the invention are [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21, optionally the following amino acid substitution (exchange): 121Q, 173A and / or one of des181 One or more, optionally having up to 4 additional mutations, and / or optionally absent the 179th and / or 180th amino acid [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] Analogs of FGF21 as well as the sulfur atom of the mercapto group present at the 71st cysteine residue have the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 -CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (wherein n is 10 to 20 Is an integer in the range, m is an integer in the range of 1 to 3, p is an integer in the range of 1 to 3, and q is an integer in the range of 2 to 4). A derivative of said analogue.
別の態様では、本発明の類似体は、[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、ならびに以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含む[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体である。「以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含む[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体」という表現の意味は、前記類似体が、ヒトFGF21(配列番号1)と比較して、1番目にAla(A)、166番目にPhe(F)、167番目にGly(G)、168番目にLeu(L)、174番目にVal(V)、179番目にPhe(F)および180番目にGlu(E)、さらに71番目にCys(C)、121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)および/または181番目にアミノ酸残基なしのいずれかを含むことである。 In another aspect, the analogs of the invention have [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 and the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 171L, 172E, 173A and / or Or [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] further comprising one or more of des181. “The following amino acid substitutions (exchanges): one or more of 71C, 121Q, 171L, 172E, 173A and / or des181 [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] analogs of FGF21 '' Means that the analog is compared to human FGF21 (SEQ ID NO: 1), first Ala (A), 166 Phe (F), 167 Gly (G), 168 Leu (L), 174th Val (V), 179th Phe (F) and 180th Glu (E), 71st Cys (C), 121st Gln (Q), 171st Including either Leu (L), Glu (E) at position 172, Ala (A) at position 173 and / or no amino acid residue at position 181.
別の態様では、本発明の類似体は、[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、および以下のアミノ酸置換(交換):121Ｑ、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含むその[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21類似体である。したがって、これらの類似体は、1番目にAla(A)、71番目にCys(C)、166番目にPhe(F)、167番目にGly(G)、168番目にLeu(L)、174番目にVal(V)、179番目にPhe(F)および180番目にGlu(E)に加えて、さらに121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)および/または181番目にアミノ酸残基なしのいずれかを含む、[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21およびそのFGF21類似体である。したがって、本明細書において「121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)および/または181番目にアミノ酸残基なしのいずれか」という表現は、「121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181」とも表現される。 In another aspect, the analogs of the invention include [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, and the following amino acid substitutions (exchanges): 121Q, 171L, 172E, 173A and / or Or its [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 analog further comprising one or more of des181. Therefore, these analogs are: Ala (A) first, Cys (C) 71, Phe (F) 166, Gly (G) 167, Leu (L) 168, 174 In addition to Val (V), 179th Phe (F) and 180th Glu (E), 121st Gln (Q), 171st Leu (L), 172th Glu (E), [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 and its FGF21 analogs, containing either Ala (A) at position 173 and / or no amino acid residue at position 181. Therefore, in the present specification, any one of “Gln (Q) at 121st, Leu (L) at 171st, Glu (E) at 172th, Ala (A) at 173rd and / or 181th without amino acid residue” The expression “?” Is also expressed as “121Q, 171L, 172E, 173A and / or des181”.
したがって、本発明による一類似体は、[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21であり、これは代わりに、[S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Ala-FGF21または[71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21とも称すことができる。 Thus, one analog according to the present invention is [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, which instead is [S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Ala-FGF21 or [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21 can also be called.
別の態様では、本発明はFGF21類似体の誘導体に関する。一態様では、本発明の誘導体は、前記FGF21類似体の71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、ならびに以下のアミノ酸置換(交換):121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含む[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E]FGF21類似体である。本明細書において、一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(式中、n、m、pおよびqは本明細書において定義された通りである)の基は、修飾部分と称される。この修飾部分は、in vivoの循環時間を増大する能力があることが見出されている。 In another aspect, the invention relates to derivatives of FGF21 analogs. In one embodiment, the derivative of the present invention has the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -at the sulfur atom of the mercapto group present at the 71st cysteine residue of the FGF21 analog. CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (Formula (Where n is an integer in the range of 10-20, m is an integer in the range of 1-3, p is an integer in the range of 1-3, q is an integer in the range of 2-4) [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 and the following amino acid substitutions (exchanges): 121Q, 171L, 172E, 173A and / or des1811 [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 analogs further comprising one or more. In this specification, the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O ) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2 -where n, m, p and q are as defined herein are referred to as modifying moieties. Is done. This modifying moiety has been found to be capable of increasing circulation time in vivo.
上記のFGF21類似体の誘導体は、FGF21類似体と比較して持続性作用を有する。 The above derivatives of FGF21 analogues have a long-lasting effect compared to FGF21 analogues.
FGF21の類似体または誘導体を含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。注射用には、担体は、必要に応じて他の材料、例えば生理食塩水などの食塩水を追加した水でよい。希釈剤および適切な緩衝液などの他の薬学的に許容される薬剤も使用することができる。必要に応じて、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤(filler)、増量剤(bulking agents)、補助剤(adjuvants)、防腐剤、抗酸化剤、着色剤および/または着香剤などの、さらなる薬学的に許容される薬剤も使用することができる。FGF21の類似体または誘導体は、精製ポリペプチドまたはそれらの誘導体の形で使用することができ、または、当技術分野で知られているように、薬学的に許容される適切な賦形剤を使用して製剤化することができる。医薬組成物は、当技術分野で知られているような任意の方法で、例えば注射で、例えば静脈内に(i.v.)または皮下に(s.c.)投与することができる。 A pharmaceutical composition comprising an analog or derivative of FGF21 can further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. For injection, the carrier may be water with the addition of other materials as required, for example saline, such as saline. Other pharmaceutically acceptable agents such as diluents and suitable buffers can also be used. If necessary, such as emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, adjuvants, preservatives, antioxidants, colorants and / or flavoring agents, etc. Additional pharmaceutically acceptable agents can also be used. FGF21 analogs or derivatives can be used in the form of purified polypeptides or their derivatives, or using appropriate pharmaceutically acceptable excipients, as is known in the art And can be formulated. The pharmaceutical composition can be administered in any manner known in the art, for example by injection, for example intravenously (i.v.) or subcutaneously (s.c.).
FGF21の類似体または誘導体は、治療的または予防的に有効な量で医薬組成物に含むことができる。患者に投与される量は、問題とする適応症、治療を必要としている患者の状態、所望の投与経路などの治療目的または予防目的によって決まる。熟練した医師は、これらの要素に従って、当技術分野での常法通りに用量を調整し、投与を修正しなければならないであろう。例えば、本発明の化合物は、1日1回または1週間につき1回または複数回投与することができる。 An analog or derivative of FGF21 can be included in a pharmaceutical composition in a therapeutically or prophylactically effective amount. The amount administered to a patient will depend on the therapeutic or prophylactic purpose, such as the indication in question, the condition of the patient in need of treatment, the desired route of administration. Skilled physicians will have to adjust dosages and modify administration according to these factors, as is routine in the art. For example, the compounds of the present invention can be administered once or multiple times per day or per week.
本発明の好ましい特徴
上記の要約および補足のために、本発明の特徴および項目は次の通りである。
1. [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つまたは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに71番目にCysを含み、71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している誘導体。
2. 前記項目に記載の、[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体。
3. 前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換): 121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しない[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体。
4. 可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、場合によっては4個以下のさらなる変異を有し、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180のアミノ酸が存在しない[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体。
5. 可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含む[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体、ならびに71番目にCysを含み、71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に、一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体。
6. [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、ならびに以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/またはdes181の1つまたは複数をさらに含む[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体。
7. 可能な範囲で、前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、場合によっては以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含み、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体、ならびに71番目にCysを含み、71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に、一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体。
8. [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、171L、172E、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数をさらに含み、ならびに/または場合によっては179および/もしくは180のアミノ酸が存在しない[-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体
9. 可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, S71C, L166F,S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、または以下のアミノ酸置換(交換)、121Q、171L、172E、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数をさらに含む[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体、ならびに71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である) の基が共有結合しているその誘導体。
10. 可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の、[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21、または以下のアミノ酸置換(交換)、121Q、171L、172E、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数をさらに含む[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21の類似体。
11. 以下のアミノ酸交換:121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)または181番目にアミノ酸なしのうちの１つのみを含む、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
12. 以下のアミノ酸交換:121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)または181番目にアミノ酸なしのうちの２つのみを含む、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載のよる類似体。
13. 以下のアミノ酸交換:121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)または181番目にアミノ酸なしのうちの３つのみを含む、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
14. 以下のアミノ酸交換:121番目にGln(Q)、171番目にLeu(L)、172番目にGlu(E)、173番目にAla(A)または181番目にアミノ酸なしのうちの４つのみを含む、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
15. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
16. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181]FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
17. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
18. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L,P171L, S172E, Q173A,G174V, Y179F, A180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
19. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
20. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
21. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
22. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
23. [-1A, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
24. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
25. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
26. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
27. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
28. [-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]FGF-21;[-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,des179-181]FGF-21,[-1A,71C,121Q,166F,168L,173A,174V,179F]FGF-21または[-1A,71C,121Q,166F,168L,174V,179F,180E,des181]FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体。
29. 71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に、項目1で言及した一般式の基が共有結合している、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
30. nが14である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
31. nが16である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
32. nが18である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
33. nが14、16または18である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
34. mが2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
35. pが2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
36. qが2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
37. qが3である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
38. qが4である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
39. nが14であり、m、pおよびqがそれぞれ2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
40. nが16であり、m、pおよびqがそれぞれ2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
41. nが18であり、m、pおよびqがそれぞれ2である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
42. 元となったFGF21類似体が[-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
43. 元となったFGF21類似体が[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181]FGF-21;[-1A,S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E]FGF-21;[-1A,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]FGF-21;[-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,des179-181]FGF-21,[-1A,71C,121Q,166F,168L,173A,174V,179F]FGF-21または[-1A,71C,121Q,166F,168L,174V,179F,180E,des181]FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
44. 元となったFGF21類似体が[-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
45. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
46. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
47. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
48. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
49. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
50. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
51. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
52. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
53. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
54. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
55. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
56. S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,des179-181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,167G,168L,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,168L,173A,174V,179F]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,166F,167G,168L,174V,179F,180E]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,166F,167G,168L,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21;S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181]Ala-FGF21またはS-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[-1A,71C,121Q,166F,168L,174V,179F,180E,des181]FGF21である、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の誘導体。
57. Met-FGF21の効力に対して少なくとも1%、好ましくは少なくとも5%、より好ましくは少なくとも10%、または最も好ましくは少なくとも20%の効力を有し、効力は3T3-L1脂肪細胞においてグルコースの取込みにより決定される、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体または誘導体。
58. Met-FGF21の効力に対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、または最も好ましくは少なくとも70%の効力を有する、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体または誘導体。
59. Met-FGF21の効力に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも100%、さらにより好ましくは少なくとも110%、または最も好ましくは少なくとも120%の効力を有する、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体または誘導体。
60. Met-FGF21の効力に対して少なくとも100%、好ましくは少なくとも120%、より好ましくは少なくとも140%、さらにより好ましくは少なくとも160%、または最も好ましくは少なくとも180%の効力を有する、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体または誘導体。
61. Met-FGF21の効力に対して少なくとも200%、好ましくは少なくとも250%、より好ましくは少なくとも300%、さらにより好ましくは少なくとも350%または最も好ましくは少なくとも400%の効力を有する、可能な範囲で前記項目のいずれか一項に記載の類似体または誘導体。
62. 具体例などで、特に実施例1以下のいずれか一つで本明細書において特に言及した化合物のいずれか一つである、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
63. 医薬として使用するための、または医薬において使用するための、前記項目のいずれか一項に記載の化合物。
64. 糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の治療または予防のための、前記プロダクト項目のいずれか一項に記載の化合物。
65. 糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の治療または予防用の医薬を調製するための、前記項目のいずれか一項に記載の化合物の使用。
66. 糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群、および/または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の治療用の医薬組成物を調製するための、前記プロダクト項目のいずれか一項に記載の化合物の使用。
67. 糖尿病、脂質異常症、肥満、心血管疾患、メタボリック症候群および/または非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を治療または予防する方法であって、治療有効量の前記プロダクト項目のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
68. 本明細書に記載の任意の新規な特徴または特徴の組み合わせ、特に項目または請求項に記載の特徴。
Preferred Features of the Invention For the above summary and supplement, the features and items of the invention are as follows.
1. [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21, optionally including one or more of the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 173A and / or des181, optionally 4 or less And / or the absence of the 179th and / or 180th amino acid in some cases [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21 analogs, and 71 contains Cys, 71 The sulfur atom of the mercapto group present in the 2nd cysteine residue has the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (modifying moiety) (wherein n is an integer in the range of 10 to 20, m is A group in which a group of 1 to 3 is covalently bonded, p is an integer in the range of 1 to 3, and q is an integer in the range of 2 to 4.
2. [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21 as described above, optionally including one or more of the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 173A and / or des181, An analog of FGF21 that optionally has no more than 4 additional mutations and / or is optionally absent of amino acids 179 and / or 180 [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F].
3. [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21, optionally one of the following amino acid substitutions (exchanges): 121Q, 173A and / or des181 according to any one of the preceding items Or a plurality, optionally having 4 or fewer additional mutations, and / or optionally absent the 179th and / or 180th amino acid [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21 As well as the mercapto group sulfur atom present at the 71st cysteine residue with the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (where n is in the range of 10-20) Wherein m is an integer in the range of 1-3, p is an integer in the range of 1-3, and q is an integer in the range of 2-4). Derivative of the body.
4. [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21, optionally following amino acid substitutions (exchanges): 121Q, 173A and / or as described in any one of the preceding items to the extent possible contains one or more of des181, optionally with up to 4 additional mutations, and / or optionally 179 and / or 180 amino acids absent [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] Analog of FGF21.
5. [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, and optionally the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, as described in any one of the above items to the extent possible [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Analogs of FGF21, and 71st Cys, 71st cysteine further comprising one or more of 171L, 172E, 173A and / or des181 The sulfur atom of the mercapto group present in the residue has the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH -(CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (modifying moiety) (wherein n is an integer in the range of 10 to 20, and m is 1 to A derivative of said analogue in which a group of 3 is covalently bonded, wherein p is an integer in the range of 1-3 and q is an integer in the range of 2-4.
6. [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 and the following amino acid substitutions (exchanges): further including one or more of 71C, 121Q, 171L, 172E, 173A and / or des181 [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Analogs of FGF21.
7. To the extent possible, [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, optionally with the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q 171L, 172E, 173A and / or des181 and / or optionally 179 and / or 180 amino acids are absent [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Analogs of FGF21, as well as the sulfur atom of the mercapto group present at the 71st cysteine residue containing Cys at the 71st position, have the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) , N is an integer in the range of 10-20, m is an integer in the range of 1-3, p is an integer in the range of 1-3, and q is an integer in the range of 2-4) A derivative of said analogue in which the group is covalently bonded.
8. [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, further comprising one or more of the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 171L, 172E, 173A and / or des181, And / or optionally 179 and / or 180 amino acids are absent [-1A, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21 analogs
9. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, or the following amino acid substitutions (exchange), 121Q, 171L, as described in any one of the above items to the extent possible [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] analogues of FGF21, and the mercapto group present at the 71st cysteine residue further comprising one or more of 172E, 173A and / or des181 The general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (modifying moiety) (wherein n is an integer in the range of 10-20, m is an integer in the range of 1-3, p is an integer in the range of 1 to 3, and q is an integer in the range of 2 to 4).
10. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21, or the following amino acid substitutions (exchange), 121Q, 171L, as described in any one of the above items to the extent possible [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] Analogs of FGF21 further comprising one or more of 172E, 173A and / or des181.
11. The following amino acid exchange: Gln (Q) at 121st, Leu (L) at 171st, Glu (E) at 172th, Ala (A) at 173th, or 181th without amino acid To the extent possible, an analogue according to any one of the preceding items.
12. The following amino acid exchange: Gln (Q) at 121st, Leu (L) at 171st, Glu (E) at 172th, Ala (A) at 173th, or 181th without amino acid only To the extent possible, an analogue according to any one of the preceding items.
13. The following amino acid exchange: Gln (Q) at 121st, Leu (L) at 171st, Glu (E) at 172th, Ala (A) at 173th, or 181th without amino acid only To the extent possible, an analogue according to any one of the preceding items.
14. The following amino acid exchanges: 121 Gln (Q), 171 Leu (L), 172 Glu (E), 173 Ala (A), 181 No amino acid To the extent possible, an analogue according to any one of the preceding items.
15. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] The analogue according to any one of the preceding items, to the extent possible, which is FGF21.
16. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] analogue according to any one of the preceding items to the extent possible .
17. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] The analogue according to any one of the preceding items to the extent possible, which is FGF21.
18. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
19. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
20. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
21. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible, which is FGF21.
22. [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
23. [-1A, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
24. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
25. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] The analogue according to any one of the preceding items to the extent possible, which is FGF21.
26. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
27. [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible, which is FGF21.
28. [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [- 1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF-21; [- 1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF-21, [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] FGF-21 or [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] An analogue according to any one of the preceding items to the extent possible.
29. The derivative according to any one of the above items, to the extent possible, wherein the group of the general formula mentioned in item 1 is covalently bonded to the sulfur atom of the mercapto group present in the 71st cysteine residue.
30. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 14.
31. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 16.
32. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 18.
33. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 14, 16 or 18.
34. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein m is 2.
35. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein p is 2.
36. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein q is 2.
37. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein q is 3.
38. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein q is 4.
39. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 14 and m, p and q are each 2.
40. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 16 and m, p and q are each 2.
41. The derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, wherein n is 18 and m, p and q are each 2.
42. The derivative according to any one of the above items, to the extent possible, wherein the original FGF21 analogue is [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF21.
43. The original FGF21 analog is [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181] FGF-21; [-1A, S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E] FGF-21; [-1A, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] FGF-21; [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] FGF-21, [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] FGF-21 or [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] derivative according to any one of the preceding items to the extent possible.
44. The original FGF21 analog is [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] The derivative according to claim 1.
45. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21, The derivative according to any one of the above items to the extent possible.
46. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (15-carboxypentadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21, The derivative according to any one of the above items to the extent possible.
47. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21, possible A derivative according to any one of the preceding items in scope.
48. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] Ala-FGF21, possible A derivative according to any one of the preceding items in scope.
49. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21 to the extent possible The derivative | guide_body as described in any one of these.
50. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21, to the extent possible, any one of the preceding items The derivative according to item.
51. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21, possible A derivative according to any one of the preceding items in scope.
52. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21, to the extent possible, any one of the preceding items The derivative according to item.
53. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21, to the extent possible, any of the preceding items The derivative according to claim 1.
54. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (19-carboxynonadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21 The derivative according to any one of the above items, to the extent possible.
55. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21 to the extent possible The derivative according to any one of the above.
56. S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (15-carboxypentadecanoylamino) butyrylamino] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S- 71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) Acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy ) Acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71 -({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetyl) Amino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, des179-181] Ala-FGF21; S-71-({2- [ 2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) Acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2 -(2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C , 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4- Carboxy-4- ( 17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoyl Amino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy ) Acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C, 166F, 167G, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] Ala-FGF21; S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (19-carboxynonadecanoylamino) bu Rylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, des181] Ala -FGF21 or S-71-({2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ] Ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] FGF21 The derivative | guide_body as described in any one of these.
57. Has an efficacy of at least 1%, preferably at least 5%, more preferably at least 10%, or most preferably at least 20% relative to the efficacy of Met-FGF21, and the efficacy of glucose in 3T3-L1 adipocytes The analogue or derivative according to any one of the preceding items, to the extent possible, determined by uptake.
58. Possible range with a potency of at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, even more preferably at least 60%, or most preferably at least 70% of the potency of Met-FGF21 And an analogue or derivative according to any one of the preceding items.
59. Possible range with a potency of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 100%, even more preferably at least 110%, or most preferably at least 120% of the potency of Met-FGF21 And an analogue or derivative according to any one of the preceding items.
60. A possible range having a potency of at least 100%, preferably at least 120%, more preferably at least 140%, even more preferably at least 160%, or most preferably at least 180% of the potency of Met-FGF21 And an analogue or derivative according to any one of the preceding items.
61. To the extent possible, having a potency of at least 200%, preferably at least 250%, more preferably at least 300%, even more preferably at least 350% or most preferably at least 400% of the potency of Met-FGF21 An analogue or derivative according to any one of the preceding items.
62. A compound according to any one of the preceding items, which is any one of the compounds specifically mentioned herein in any one of Examples 1 and below, in particular examples.
63. A compound according to any one of the preceding items for use as a medicament or for use in a medicament.
64. A compound according to any one of the preceding items for the treatment or prevention of diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome and / or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
65. Any of the preceding items for preparing a medicament for the treatment or prevention of diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome and / or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Use of the described compounds.
66. Any of the preceding items for preparing a pharmaceutical composition for the treatment of diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome, and / or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Use of the compound according to item.
67. A method for treating or preventing diabetes, dyslipidemia, obesity, cardiovascular disease, metabolic syndrome and / or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), comprising a therapeutically effective amount of any one of the above product items. A method comprising administering a compound according to paragraph to a subject in need thereof.
68. Any novel feature or combination of features described herein, particularly a feature described in an item or claim.
本明細書に記載の項目および実施形態の1つまたは複数を組み合わせることによって、場合によっては、下記の請求項の1つまたは複数とも組み合わせることによって、さらなる例がもたらされ、そして本発明は、前記項目、実施形態および請求項の全ての可能な組み合わせに関する。本明細書の項目および請求項のいくつかにおいて、前記請求項または項目はそれぞれ、可能な範囲で前記項目または請求項のいずれか一項にそれぞれ従っていることが言及される。当業者ならだれでも、どの程度これが可能かを決定することができる。したがって、たとえ特にそう述べられていないとしても、そのような項目および請求項は、それぞれ前記項目および請求項のいくつかに従っているだけでよい。用語「前記項目または請求項のいずれか一項」は、それぞれ前記項目または請求項の任意の論理番号、例えば、それぞれそれらの前記項目および請求項の1、2、3または4をカバーする。 Combining one or more of the items and embodiments described herein, optionally in combination with one or more of the following claims, provides further examples, and the invention provides: It relates to all possible combinations of said items, embodiments and claims. In the specification and in some of the claims, it is mentioned that each claim or item follows each of the claims or each of the claims to the extent possible. Anyone skilled in the art can determine how much this is possible. Thus, such items and claims may only obey some of said items and claims, respectively, unless expressly stated otherwise. The term “any one of the items or claims” covers any logical number of the items or claims, respectively, for example, 1, 2, 3 or 4 of the items and claims, respectively.
以下の実施例は例示として提供するものであり、限定するものではない。 The following examples are provided by way of illustration and are not limiting.
略語
アルファベット順の次の略語を以下の通り使用する:BGは血中グルコースであり、BWは体重であり、DCMはジクロロメタンであり、DICはジイソプロピルカルボジイミドであり、DIPEAはジイソプロピルエチルアミンであり、DPBSはDulbeccoのリン酸緩衝食塩水であり、DVBはジビニルベンゼンであり、EDACは(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド塩酸塩であり、Fmocは9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルであり、HEPESは4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸であり、HOAtは1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールであり、HOBtは1-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、HPβCDはヒドロキシプロピルβシクロデキストリンであり、HPLCは高速液体クロマトグラフィーであり、IBMXは3-イソブチル-1-メチルキサンチンであり、Inpはイソニペコチン酸であり、IPTGはイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドcheck(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside check)であり、LCMSは液体クロマトグラフィー質量分光であり、MALDI-TOF MSはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分光であり、MeOHはメタノールであり、NanoES-MSはナノエレクトロスプレータンデム質量分析であり、NMPは1-メチル-ピロリジン-2-オンであり、OEGは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸であり、OtBuはtert.ブチルエステルであり、PBSはリン酸緩衝食塩水であり、RTは室温であり、TFAはトリフルオロ酢酸であり、TGはトリグリセリドであり、THFはテトラヒドロフランであり、TIPSはトリイソプロピルシランであり、トリスはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオールであり、Trxはトラネキサム酸であり、TSTUはO-(N-スックイミジル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩であり、UPLCは超高速液体クロマトグラフィーである。
Abbreviations The following abbreviations in alphabetical order are used as follows: BG is blood glucose, BW is body weight, DCM is dichloromethane, DIC is diisopropylcarbodiimide, DIPEA is diisopropylethylamine, DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline, DVB is divinylbenzene, EDAC is (3-dimethylaminopropyl) ethylcarbodiimide hydrochloride, Fmoc is 9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl, HEPES is 4 -(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid, HOAt is 1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOBt is 1-hydroxybenzotriazole, HPβCD is hydroxypropyl β cyclodextrin HPLC is high performance liquid chromatography, IBMX is 3-isobutyl-1-methylxanthine, and Inp is Pecotic acid, IPTG is isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside check, LCMS is liquid chromatography mass spectrometry, MALDI-TOF MS is matrix Assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectroscopy, MeOH is methanol, NanoES-MS is nanoelectrospray tandem mass spectrometry, NMP is 1-methyl-pyrrolidin-2-one, OEG is 8 -Amino-3,6-dioxaoctanoic acid, OtBu is tert. Butyl ester, PBS is phosphate buffered saline, RT is room temperature, TFA is trifluoroacetic acid, TG is triglyceride THF is tetrahydrofuran, TIPS is triisopropylsilane, Tris is tris (hydroxymethyl) aminomethane or 2-amino-2-hydroxymethylpropane-1,3-diol Trx is tranexamic acid, TSTU is O-(N-Sukkuimijiru) -N, N, N ', an N'- tetramethyluronium tetrafluoroborate, UPLC is ultra high performance liquid chromatography.
一般的方法
LCMS方法1(LCMS1)
Agilent TechnologiesのLC/MSD TOF(G1969A)質量分析計を使用して、Agilent1200シリーズHPLCシステムから溶離した後の試料の質量を同定した。タンパク質スペクトルのデコンボリューションをAgilentのプロテインコンファメーション(protein confirmation)ソフトウェアを使用して計算した。
溶離液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸入りの水
B:0.1%トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
グラジエント:15分かけて25%〜95%アセトニトリル
General method
LCMS method 1 (LCMS1)
An Agilent Technologies LC / MSD TOF (G1969A) mass spectrometer was used to identify the mass of the sample after elution from the Agilent 1200 Series HPLC system. The deconvolution of the protein spectrum was calculated using Agilent's protein confirmation software.
Eluent:
A: Water with 0.1% trifluoroacetic acid
B: Acetonitrile column with 0.1% trifluoroacetic acid: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8 x 50 mm
Gradient: 25% to 95% acetonitrile over 15 minutes
LCMS方法2(LCMS2)
Perkin ElmerのSciex API3000質量分析計を使用して、Perkin Elmerシリーズ200HPLCシステムから溶離した後の試料の質量を同定した。
溶離液:
A:0.05%トリフルオロ酢酸入りの水
B:0.05%トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム:WatersのXterra MS C-18×3mm id 5μm
グラジエント:1.5ml/minで7.5分かけて5%〜90%アセトニトリル
LCMS method 2 (LCMS2)
A Perkin Elmer Sciex API3000 mass spectrometer was used to identify the mass of the sample after elution from the Perkin Elmer series 200 HPLC system.
Eluent:
A: Water with 0.05% trifluoroacetic acid
B: Acetonitrile column with 0.05% trifluoroacetic acid: Waters Xterra MS C-18 × 3mm id 5μm
Gradient: 5% to 90% acetonitrile over 7.5 minutes at 1.5 ml / min
LCMS方法3(LCMS3)
WatersのMicromass ZQ質量分析計を使用して、Waters Alliance HT HPLCシステムから溶離した後の試料の質量を同定した。
溶離液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸入りの水
B:0.1%トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリル
カラム:Phenomenex、Kinetex C18 50×4.60mm id 2.6μm、100AA
グラジエント:1.0ml/minで7.5分かけて10%〜90%B
LCMS method 3 (LCMS3)
A Waters Micromass ZQ mass spectrometer was used to identify the mass of the sample after elution from the Waters Alliance HT HPLC system.
Eluent:
A: Water with 0.1% trifluoroacetic acid
B: Acetonitrile column with 0.1% trifluoroacetic acid: Phenomenex, Kinetex C18 50 × 4.60mm id 2.6μm, 100AA
Gradient: 10% -90% B over 7.5 minutes at 1.0 ml / min
FGF21のクローニングおよび発現
ヒトFGF21のDNA配列およびアミノ酸配列は、例えばNishimuraらによってBiochim. Biophys. Acta 1492(1):203〜206(2000)で開示されている。これらの配列は、それぞれEMBL:AB021975およびUNIPROT:Q9NSA1のアクセッション番号で公的なデータベースからも入手可能である。
Cloning and expression of FGF21 The DNA and amino acid sequences of human FGF21 are disclosed, for example, by Nishimura et al. In Biochim. Biophys. Acta 1492 (1): 203-206 (2000). These sequences are also available from public databases with accession numbers of EMBL: AB021975 and UNIPROT: Q9NSA1, respectively.
天然のポリペプチドは、分泌のための28アミノ酸のシグナルペプチドを有して合成される。
1 MDSDETGFEH SGLWVSVLAG LLLGACQAHP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY
51 TDDAQQTEAH LEIREDGTVG GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR
101 FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK
151 SPHRDPAPRG PARFLPLPGL PPALPEPPGI LAPQPPDVGS SDPLSMVGPS
201 QGRSPSYAS
Natural polypeptides are synthesized with a 28 amino acid signal peptide for secretion.
1 MDSDETGFEH SGLWVSVLAG LLLGACQAHP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY
51 TDDAQQTEAH LEIREDGTVG GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR
101 FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK
151 SPHRDPAPRG PARFLPLPGL PPALPEPPGI LAPQPPDVGS SDPLSMVGPS
201 QGRSPSYAS
上記でイタリック体により示されたシグナルペプチドは、配列番号2として添付の配列表に含まれる。残りの181アミノ酸から構成される成熟FGF21ポリペプチドは、配列番号1として配列表に含まれる。 The signal peptide shown in italics above is included in the attached sequence listing as SEQ ID NO: 2. The mature FGF21 polypeptide composed of the remaining 181 amino acids is included in the sequence listing as SEQ ID NO: 1.
成熟FGF21ポリペプチドをクローニングして、シグナルペプチドを有さないが、N末端メチオニンまたは大腸菌でプロセシングされてN末端がAla(-1Ala)となるN末端Met-Alaが付加された細胞内タンパク質として大腸菌で発現させた。より詳細には、Met用のATGコドンを3'末端にならびにNde1およびBamH1の制限酵素部位をそれぞれ3'および5'末端に含む550bpのコード領域を、ファージT7プロモーター制御下で発現ベクターのpET11cのNde1-BamH1に挿入し、大腸菌B BL21(DE3)に導入した。この細胞を100ug/mLのアンピシリンを含むLBで、OD450が0.5まで生育させ、0.3mMのIPTGを使用して37℃で4時間発現を誘導した。細胞の粗抽出物を超音波処理で作製し、FGF21の発現を解析した。 Cloning mature FGF21 polypeptide and without signal peptide, but N-terminal methionine or Escherichia coli as an intracellular protein with N-terminal Met-Ala added to N-terminal Ala (-1Ala) processed by E. coli It was expressed in. More specifically, a 550 bp coding region containing the ATG codon for Met at the 3 ′ end and the restriction enzyme sites of Nde1 and BamH1 at the 3 ′ and 5 ′ ends, respectively, was expressed in the expression vector pET11c under the control of the phage T7 promoter. It was inserted into Nde1-BamH1 and introduced into E. coli B BL21 (DE3). The cells were grown in LB containing 100 ug / mL ampicillin to an OD 450 of 0.5, and expression was induced for 4 hours at 37 ° C. using 0.3 mM IPTG. A crude cell extract was prepared by sonication and the expression of FGF21 was analyzed.
クマシー染色したSDS-PAGEにより、FGF21の発現が成功したことが示され、FGF21は可溶性上清画分に主に確認され、不可溶性ペレットにはほとんど確認されなかった。このように発現させたFGF21(Met-FGF21)(化合物A)の計算MWは19.5kDであるにもかかわらず、25kDタンパク質としてゲルを移動した。これは、タンパク質の移動を遅らせる、高含量のプロリンが原因であると考えられる。 Coomassie-stained SDS-PAGE showed that FGF21 expression was successful, and FGF21 was mainly confirmed in the soluble supernatant fraction and hardly in the insoluble pellet. Although the calculated MW of FGF21 (Met-FGF21) (compound A) expressed in this way was 19.5 kD, the gel was moved as a 25 kD protein. This is thought to be due to a high content of proline, which slows protein migration.
FGF21類似体のクローニングおよび発現
以下のFGF21の特定の類似体は、当技術分野で公知のように調整することができ、実施例1に概説されているように大腸菌で発現させることができる。
Cloning and Expression of FGF21 Analogs The following specific analogs of FGF21 can be prepared as known in the art and expressed in E. coli as outlined in Example 1.
同じFGF21類似体を、適切でこの生物で本来公知の方法で、出芽酵母(S. cerevisiae)で発現させ、調整することができる。 The same FGF21 analogue can be expressed and adjusted in S. cerevisiae in a suitable and known manner in this organism.
FGF21類似体の精製
実施例1〜2に記載したFGF21類似体は、以下のようにまたは同様な技術を使用してさらに精製することができる。
Purification of FGF21 analogs The FGF21 analogs described in Examples 1-2 can be further purified as follows or using similar techniques.
pH7.5の10mMリン酸カリウム緩衝液中の大腸菌のスラリー(20%w/v)を超音波処理した(5分間氷上で3秒のオン/オフ間隔)。ポリペプチドを遠心分離(10,000×g、30分間)によりペレット化し、超音波処理によって50mMのトリスpH8.0に再度可溶させ、残渣を遠心分離(10,000×g、30分間)によって除去した。得られた上清中のポリペプチドを、Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes、Robert K.第3版、1994に概説されるように、Q Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)を使用した陰イオン交換クロマトグラフィー(50mMトリスpH8.0、50〜250mM NaCl)によって精製した。いくつかの例では、50mMトリスpH8.0および200mM NaClを用いて操作する、HiLoad26/60Superdex pg75カラム(GE Healthcare)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。保存のためにポリペプチドをDPBSに移し、凍結保存した。 A slurry of E. coli (20% w / v) in 10 mM potassium phosphate buffer at pH 7.5 was sonicated (3 sec on / off interval on ice for 5 min). The polypeptide was pelleted by centrifugation (10,000 × g, 30 minutes), resolubilized in 50 mM Tris pH 8.0 by sonication, and the residue was removed by centrifugation (10,000 × g, 30 minutes). Polypeptides in the resulting supernatant were purified using Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare) as outlined in Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd Edition, 1994. Was purified by anion exchange chromatography (50 mM Tris pH 8.0, 50-250 mM NaCl). In some examples, it was further purified by size exclusion chromatography using a HiLoad26 / 60 Superdex pg75 column (GE Healthcare) operating with 50 mM Tris pH 8.0 and 200 mM NaCl. The polypeptide was transferred to DPBS for storage and stored frozen.
類似体番号11:[-1A,S71C,N121Q,L166F,M168L,Q173A,G174V,Y179F]FGF21
LCMS1:理論的質量:19495.03;実測質量:19500.40
Analogue number 11: [-1A, S71C, N121Q, L166F, M168L, Q173A, G174V, Y179F] FGF21
LCMS1: Theoretical mass: 19495.03; Observed mass: 19500.40
FGF21類似体の71番目の遊離Cysの修飾に使用可能な反応試剤の調製
17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨードアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}-エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸の調製
Preparation of reaction reagent usable for modification of 71st free Cys of FGF21 analogue
17-{(S) -1-carboxy-3- [2- (2-{[2- (2-{[2- (2-iodoacetylamino) ethylcarbamoyl] methoxy} -ethoxy) ethylcarbamoyl] methoxy} Of Ethoxy) ethylcarbamoyl] propylcarbamoyl} heptadecanoic acid
工程1:17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノエチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]-エトキシ}エチルカルバモイル)-1-カルボキシプロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸。
エタノール(10ml)およびエチレンジアミン(1ml)の溶液に、17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]-エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸(500mg、WO2009/083549に以前記載したように調製した)を加えた。室温で一晩撹拌後、この混合液を40℃で真空濃縮した。残留物を分取HPLC(10〜65%アセトニトリル、0.1%TFA、20mL/min、C18、30mm×250mm、110Å)によって精製した。収量332mg(70%)。
LCMS:理論的質量:776.0実測質量:776.6(M+1)
Step 1: 17-[(S) -3- (2- {2-[(2- {2-[(2-aminoethylcarbamoyl) methoxy] ethoxy} ethylcarbamoyl) methoxy] -ethoxy} ethylcarbamoyl) -1 -Carboxypropylcarbamoyl] heptadecanoic acid.
To a solution of ethanol (10 ml) and ethylenediamine (1 ml) was added 17-((S) -1-carboxy-3- {2- [2-({2- [2- (2,5-dioxopyrrolidine-1- Yloxycarbonylmethoxy) ethoxy] ethylcarbamoyl} methoxy) ethoxy] -ethylcarbamoyl} propylcarbamoyl) heptadecanoic acid (500 mg, prepared as previously described in WO2009 / 083549) was added. After stirring overnight at room temperature, the mixture was concentrated in vacuo at 40 ° C. The residue was purified by preparative HPLC (10-65% acetonitrile, 0.1% TFA, 20 mL / min, C18, 30 mm × 250 mm, 110Å). Yield 332 mg (70%).
LCMS: Theoretical mass: 776.0 Actual mass: 776.6 (M + 1)
工程2:17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨードアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸
アセトニトリル(1ml)にヨード酢酸(92mg)を入れた溶液にTSTU(142mg)およびDIPEA(0.085ml)を加えた。室温で60分間撹拌後、0.1M Na2CO3(12ml)に17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-アミノエチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)メトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)-1-カルボキシプロピルカルバモイル]ヘプタデカン酸(0.320g)を入れた溶液を加えた。120分間撹拌後、混合液のpHを1N HClで1に調整した。沈殿物を濾過し、水で洗浄して、真空乾燥させた。収量350mg(90%)。
LCMS3:理論的質量:943.9実測質量:944.6(M+1)
Step 2: 17-{(S) -1-carboxy-3- [2- (2-{[2- (2-{[2- (2-iodoacetylamino) ethylcarbamoyl] methoxy} ethoxy) -ethylcarbamoyl ] Methoxy} ethoxy) ethylcarbamoyl] propylcarbamoyl} heptadecanoic acid To a solution of acetonitrile (1 ml) in iodoacetic acid (92 mg) was added TSTU (142 mg) and DIPEA (0.085 ml). After stirring at room temperature for 60 minutes, 0.1M Na 2 CO 3 (12 ml) was added to 17-[(S) -3- (2- {2-[(2- {2-[(2-aminoethylcarbamoyl) methoxy] ethoxy } Ethylcarbamoyl) methoxy] ethoxy} ethylcarbamoyl) -1-carboxypropylcarbamoyl] heptadecanoic acid (0.320 g) was added. After stirring for 120 minutes, the pH of the mixture was adjusted to 1 with 1N HCl. The precipitate was filtered, washed with water and dried in vacuo. Yield 350 mg (90%).
LCMS3: Theoretical mass: 943.9 Actual mass: 944.6 (M + 1)
FGF類似体の修飾に次の反応試剤が有用であり得、それらは同様な方法で調製することができる。 The following reaction reagents may be useful for modification of FGF analogs and they can be prepared in a similar manner.
修飾基を用いた、71CysでのFGF21化合物の誘導体化
FGF21類似体の71Cys誘導体の調製
誘導体番号102(-1A,71C,121Q,166F,168L,173A,174V,179F)FGF21誘導体S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチル)[71C,121Q,166F,168L,73A,174V,179F]Ala-FGF21の調製
実施例2および3に概説したように調製した(-1A,71C,121Q,166F,168L,173A,174V,179F)FGF21類似体11の71番目のCys残基を、上記のように調製した次の反応試剤:
Derivatization of FGF21 compounds with 71Cys using modifying groups
Preparation of 71Cys derivative of FGF21 analog Derivative number 102 (-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F) FGF21 derivative S-71-({2- [2- (2- {2- [2 -(2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl) [71C , 121Q, 166F, 168L, 73A, 174V, 179F] Preparation of Ala-FGF21 Prepared as outlined in Examples 2 and 3 (-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 173A, 174V, 179F) Similar to FGF21 The following reaction reagent prepared as described above for the 71st Cys residue of body 11:
を用いて71番目のチオール基において修飾した。 Was used to modify the 71st thiol group.
[71C,166F,167G,168L,171L,172E,173A,174V,179F]Ala-FGF21(17mg、0.00087mmol)を20mMトリスおよび0.5M NaCl pH8.28に入れたものに、17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-ヨードアセチルアミノ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸(4.05mg 0.0035mmol)を0.1M NaHCO3(0.081ml)に入れたものを加えた。3時間後に、MiliQ水を加えて伝導率を8.0mS/cmへ低下させた。この混合液を、緩衝液A:20mMトリス、pH7.5;緩衝液B:20mMトリス、500mM NaCl、pH7.5、流速0.5mL/min、グラジエント:0〜100%B60CV超を使用して、MonoQ10/100カラムで陰イオン交換を用いて精製した。HiPrep26/10脱塩カラムを使用して、回収画分をリン酸塩緩衝液にバッファー交換した。溶出液を回収し、0.22umの滅菌Millex GVを通して濾過した。収量:4.65mg
MS-TOF:理論的質量:20311.03、実測質量:20311.44
[71C, 166F, 167G, 168L, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F] Ala-FGF21 (17 mg, 0.00087 mmol) in 20 mM Tris and 0.5 M NaCl pH8.28, 17-{(S) -1-carboxy-3- [2- (2-{[2- (2-{[2- (2-iodoacetylamino) ethylcarbamoyl] methoxy} ethoxy) ethylcarbamoyl] methoxy} ethoxy) ethylcarbamoyl] propylcarbamoyl } Heptadecanoic acid (4.05mg 0.0035mmol) in 0.1M NaHCO3 (0.081ml) was added. After 3 hours, MiliQ water was added to reduce the conductivity to 8.0 mS / cm. This mixture was added to MonoQ10 using Buffer A: 20 mM Tris, pH 7.5; Buffer B: 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.5, flow rate 0.5 mL / min, gradient: 0-100% B60CV. Purified using anion exchange on a / 100 column. The recovered fraction was buffer exchanged into phosphate buffer using a HiPrep26 / 10 desalting column. The eluate was collected and filtered through 0.22 um sterile Millex GV. Yield: 4.65mg
MS-TOF: Theoretical mass: 20311.03, Observed mass: 20311.44
次の表では、特定のFGF21類似体を述べることおよび特定の修飾剤を述べることによって、本発明による特定のFGF21誘導体をいくつか例示する。この表では、本発明のこれら全ての化合物は誘導体番号で識別される。本発明のこれら全ての化合物は、上記と同様の方法で調製することができる。この表では、修飾部分が共有結合的に結合する特定のFGF21類似体のいずれも、上記の実施例2の表で述べた「類似体番号」で識別される。さらにこの表では、特定のFGF21類似体を修飾するのに使用される反応試剤のいずれも、上記の実施例4の表で述べた「修飾反応試剤番号」で識別される。下記の表に例示される全ての誘導体では、修飾反応試剤は、FGF21類似体の71番目のCysに存在するメルカプト基と反応する。 The following table illustrates some specific FGF21 derivatives according to the present invention by describing specific FGF21 analogs and by describing specific modifiers. In this table, all these compounds of the invention are identified by derivative numbers. All these compounds of the invention can be prepared in a similar manner as described above. In this table, any particular FGF21 analog to which the modifying moiety is covalently bound is identified by the “analog number” described in the table of Example 2 above. Furthermore, in this table, any of the reaction reagents used to modify a particular FGF21 analog is identified by the “modification reaction reagent number” described in the table of Example 4 above. In all the derivatives exemplified in the table below, the modification reaction reagent reacts with the mercapto group present at the 71st Cys of the FGF21 analog.
例えば、誘導体102は、71番目のシステインの遊離チオールが修飾部分III({4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチルカルバモイル}メチル)で修飾され、それによりS-71-{4-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]ブチルカルバモイル}メチル[S71C,121Q,L166F,M168L,G174V,Y179F]Ala-FGF21を形成するように、(-1A,S71C,121Q,L166F,M168L,Q173A,G174V,Y179F)-FGF21である類似体11を、17-{(S)-1-カルボキシ-3-[2-(2-{[2-(2-{[4-(2-ヨードアセチルアミノ)ブチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸と共に反応させることにより調製することができる。 For example, derivative 102 has a free thiol at the 71st cysteine in the modifying moiety III ({4- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] butylcarbamoyl} methyl), thereby modified with S-71- {4- [2- (2- { 2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17-carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] butylcarbamoyl} Analog 11 that is (-1A, S71C, 121Q, L166F, M168L, Q173A, G174V, Y179F) -FGF21 to form methyl [S71C, 121Q, L166F, M168L, G174V, Y179F] Ala-FGF21, 17-{(S) -1-carboxy-3- [2- (2-{[2- (2-{[4- (2-iodoacetylamino) butylcarbamoyl] methoxy} ethoxy) ethylcarbamoyl] methoxy} ethoxy ) Ethylcarbamo It can be prepared by reacting with Le] propylcarbamoyl} heptadecanoic acid.
上記の誘導体番号1〜120を有する本発明の化合物では、71Cysのメルカプト基由来の硫黄原子に共有結合的に結合する修飾部分が、対応する修飾反応試剤で使用したものと同じ「修飾部分番号」を使用して次の表で述べられている。 In the compounds of the present invention having the above derivative numbers 1 to 120, the modified moiety that is covalently bonded to the sulfur atom derived from the mercapto group of 71 Cys is the same “modified moiety number” as used in the corresponding modification reaction reagent. Is described in the following table.
効力アッセイ-3T3-L1脂肪細胞におけるグルコースの取込み
次のアッセイにより、本発明のFGF21化合物の生物活性または効力を決定した。
Potency Assay-3 Glucose Uptake in 3T3-L1 Adipocytes The following assay determined the biological activity or potency of FGF21 compounds of the invention.
マウス3T3-L1線維芽細胞(例えばカタログ番号CL-173でATCCから入手可能)を基本培地(10%ウシ胎仔血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシン入りのDMEM(4500mg/lグルコース))で維持する。細胞は、集密に到達させずに、(目視で)約60%の集密度に達する前に(新しいバイアルに移して)継代しなければならない。 Mouse 3T3-L1 fibroblasts (available from ATCC, eg, catalog number CL-173) are maintained in basal medium (DMEM (4500 mg / l glucose) with 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin / streptomycin). Cells must be passaged (transferred to a new vial) before reaching confluence (visually) before reaching approximately 60% confluence.
グルコースの取込みアッセイのために、24ウェルプレートに80,000細胞/ウェルまたは96ウェルプレートに20,000細胞/ウェルで細胞を播種し、細胞が集密に達した時に(高密度、分化した脂肪細胞を得る目的で)、培地を基本培地からトログリタゾン、IBMX、デキサメタゾン(例えばSigmaから市販品として入手可能)およびヒトインスリン(例えばNovo Nordisk A/Sから市販品として入手可能)を含む基本培地に変更する。 For glucose uptake assays, seed cells at 80,000 cells / well in a 24-well plate or 20,000 cells / well in a 96-well plate, when the cells reach confluence (to obtain high density, differentiated adipocytes The medium is changed from basal medium to basal medium containing troglitazone, IBMX, dexamethasone (eg commercially available from Sigma) and human insulin (eg commercially available from Novo Nordisk A / S).
細胞は、分化を開始して7〜14、好ましくは7〜10日後に使用する。細胞を、基本培地でFGF21ポリペプチドまたは本発明の誘導体の濃度を増大させて(0〜300nM)20時間刺激する。3H-デオキシグルコース(以下トレーサー)を加える前に温かい(約37℃)アッセイバッファー(1mM MgCl2および2mMCaCl2入りのPBS)、HEPESおよび0.1%ヒト血清アルブミン)で細胞を洗浄して、トレーサーと共に細胞を1時間インキュベートする。このインキュベーションを、氷冷のアッセイバッファー中で2回洗浄することにより終了させる。細胞をTriton X-100で溶解し、溶解物を96ウェルプレートに移し、microscint-40(例えばPerkin Elmerから市販品として入手可能)を加え、TOP-counter(例えばPerkin ElmerのPackard top-counter)中でトレーサー量をカウントする。問題とするポリペプチドのEC50を計算する。下記のTable 1(表5)に示す結果は、Met-FGF21のEC50(効力)に対する本発明のFGF21化合物のEC50(効力)を示す。 The cells are used 7 to 14, preferably 7 to 10 days after initiating differentiation. Cells are stimulated for 20 hours with increasing concentrations of FGF21 polypeptide or derivative of the invention (0-300 nM) in basal medium. Before adding 3H-deoxyglucose (hereinafter tracer), wash the cells with warm (about 37 ° C) assay buffer (PBS with 1 mM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 , HEPES and 0.1% human serum albumin) and add the cells together with the tracer Incubate for 1 hour. The incubation is terminated by washing twice in ice-cold assay buffer. Cells are lysed with Triton X-100, the lysate is transferred to a 96-well plate, microscint-40 (e.g. commercially available from Perkin Elmer) is added and in a TOP-counter (e.g. Packard top-counter from Perkin Elmer) To count the amount of tracer. Calculate the EC 50 of the polypeptide in question . Table 1 The results shown in (Table 5) below shows an EC 50 of FGF21 compounds of the invention for EC 50 for Met-FGF21 (potency) (potency).
概して本発明のFGF21化合物はMet-FGF21の効力と比較して効力が改善されていることがTable 1(表5)の結果から明らかである。 It is clear from the results in Table 1 that the efficacy of the FGF21 compound of the present invention is generally improved compared to that of Met-FGF21.
HEK293/β-クロトーErkリン酸化アッセイ
Erkリン酸化アッセイを、ヒトβ-クロトーが安定的にトランスフェクションされたHEK293細胞において実施した。HEK293T/b-クロトー安定細胞を96-ウェルプレート上に30000細胞/ウェルで播種した。2日後、新鮮な培地を加え、さらに2時間以上後にFGF21タンパク質を加えた。このプレートを12分間インキュベートした。そして、製造業者の指示に従って、AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2アッセイキット(Perkin Elmer、Waltham、MA)を使用して総ERKリン酸化を評価し、EnVision Multilabel Microplate Readerモデル2103(Perkin Elmer)をAlphaScreen HTS Turboオプションと共に使用して、シグナルを検出した。データは平均+/-S.E.Mとして表わされる。EC50値を、GraphPad Prismバージョン5.02を使用して、4-パラメータロジスティック非線形回帰分析により決定した。参考文献:Yie, Jら:FGF21 N- and C-termini play different roles in receptor interaction and activation、FEBS Letters583(2009)19〜24、およびMicanovic Rら:Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21. J. Cell. Physiol. 2009May;219(2):227〜34。
HEK293 / β-Klotho Erk phosphorylation assay
Erk phosphorylation assay was performed in HEK293 cells stably transfected with human β-Klotho. HEK293T / b-Klotho stable cells were seeded on 96-well plates at 30000 cells / well. Two days later, fresh medium was added, and FGF21 protein was added two more hours later. The plate was incubated for 12 minutes. The total ERK phosphorylation was then evaluated using the AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1 / 2 assay kit (Perkin Elmer, Waltham, MA) according to the manufacturer's instructions, and the EnVision Multilabel Microplate Reader model 2103 (Perkin Elmer) was Used with Turbo option to detect signal. Data are expressed as mean +/- SEM. EC50 values were determined by 4-parameter logistic nonlinear regression analysis using GraphPad Prism version 5.02. References: Yie, J et al: FGF21 N- and C-termini play different roles in receptor interaction and activation, FEBS Letters 583 (2009) 19-24, and Micanovic R et al: Different roles of N- and C-termini in the functional. activity of FGF21. J. Cell. Physiol. 2009 May; 219 (2): 227-34.
[-1A,71C,121Q,166F,168L,174V,179F,180E,des181]FGF21については、Erk値は0.97であった。例えば、この類似体は、上記の修飾部分番号IIIである{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エチルカルバモイル}メチルを71Cysのメルカプト基由来の硫黄原子に共有結合させることにより、誘導体化することができる。 [-1A, 71C, 121Q, 166F, 168L, 174V, 179F, 180E, des181] For FGF21, the Erk value was 0.97. For example, this analog is the modified moiety number III above {2- [2- (2- {2- [2- (2- {2-[(S) -4-carboxy-4- (17- Carboxyheptadecanoylamino) butyrylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethoxy} ethoxy) acetylamino] ethylcarbamoyl} methyl can be derivatized by covalent bonding to a sulfur atom derived from the 71Cys mercapto group.
FGF21化合物のin vivo試験-薬力学
db/dbマウスは、2型糖尿病のマウスモデルである。このマウスはレプチン受容体を欠き、高血糖、インスリン抵抗性、過食および肥満を特徴とする。
In vivo testing of FGF21 compounds-pharmacodynamics
The db / db mouse is a mouse model of type 2 diabetes. This mouse lacks leptin receptors and is characterized by hyperglycemia, insulin resistance, overeating and obesity.
雄のdb/dbマウス(9〜10週齢)を使用して、次のFGF21類似体および誘導体の血中グルコースおよび体重に対する効果を測定した。 Male db / db mice (9-10 weeks old) were used to measure the effects of the following FGF21 analogs and derivatives on blood glucose and body weight.
化合物を、50mMリン酸、145mM NaCl、0.05%Tween-80、pH=7.4(2ml/kg)に入れて0.1mg/kgで、一日一回7日間皮下注射投与した(n=7〜9)。各ビヒクル処理群(コントロール)は、50mMリン酸、145mM NaCl、0.05%Tween-80、pH=7.4、(2ml/kg)の皮下注射で一日一回7日間処理した(n=8〜9)。体重を投薬前とさらに7日間の治療後に測定した。非空腹時血中グルコースを、投薬前とさらに7日目の投薬から2時間後に測定した。血中グルコースを、グルコースアナライザー(Biosen5040)を使用してグルコースオキシダーゼ法に基づいて測定した。結果を下記のTable 3(表7)に示す。 The compound was injected subcutaneously once a day for 7 days at 0.1 mg / kg in 50 mM phosphate, 145 mM NaCl, 0.05% Tween-80, pH = 7.4 (2 ml / kg) (n = 7-9) . Each vehicle treatment group (control) was treated with subcutaneous injection of 50 mM phosphate, 145 mM NaCl, 0.05% Tween-80, pH = 7.4, (2 ml / kg) once daily for 7 days (n = 8-9). . Body weight was measured before dosing and after an additional 7 days of treatment. Nonfasting blood glucose was measured before dosing and 2 hours after dosing on day 7. Blood glucose was measured based on the glucose oxidase method using a glucose analyzer (Biosen5040). The results are shown in Table 3 below.
Table 3(表7)の結果は、本発明のFGF21誘導体はin vivoで生物学的に活性であり、体重および非空腹時/空腹時血中グルコースを効果的に低下させることを示す。 The results in Table 3 show that the FGF21 derivatives of the present invention are biologically active in vivo and effectively reduce body weight and non-fasting / fasting blood glucose.
FGF21化合物のin vivo試験-薬物動態
ミニブタ
Met-FGF21の薬物動態プロファイルは、正常な雄のゲッチンゲンミニブタ、n=4(12〜15月齢、25kg)で試験することができる。試験化合物の血漿濃度を14日間モニターする。Met-FGF21を0.1mg/kg(約5nmol/kg)の単回静脈内投与として投与する。
In vivo testing of FGF21 compounds-pharmacokinetic minipigs
The pharmacokinetic profile of Met-FGF21 can be tested in normal male Göttingen minipigs, n = 4 (12-15 months of age, 25 kg). Plasma concentration of test compound is monitored for 14 days. Met-FGF21 is administered as a single intravenous dose of 0.1 mg / kg (about 5 nmol / kg).
比較化合物Met-FGF21の平均半減期(T1/2)は、標準偏差が2.7時間である10.8時間と決定されている。 The average half-life (T 1/2 ) of the comparative compound Met-FGF21 has been determined to be 10.8 hours with a standard deviation of 2.7 hours.
本発明のFGF21化合物の薬物動態プロファイルを、正常な雄ゲッチンゲンミニブタ、n=4(12〜15月齢、25kg)で試験する。血漿濃度を19日間モニターする。化合物を0.05mg/kg(約2.5nmol/kg)の単回静脈内投与として投与する。 The pharmacokinetic profile of the FGF21 compound of the present invention is tested in normal male Gottingen minipigs, n = 4 (12-15 months of age, 25 kg). Plasma concentration is monitored for 19 days. The compound is administered as a single intravenous dose of 0.05 mg / kg (approximately 2.5 nmol / kg).
試験化合物の平均半減期(T1/2)を決定した。 The average half-life (T 1/2 ) of the test compound was determined.
FGF21化合物の血漿濃度は、Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISA(カタログ番号RD191108200RでBioVendorから入手可能)を使用して決定することができる。PCベースのソフトウェアであるPharsight Corportion, Cary N.C.のWinNonLinバージョン5.2を使用して、薬物動態を計算することができる。 Plasma concentrations of FGF21 compounds can be determined using Fibroblast Growth Factor-21 Human ELISA (available from BioVendor with catalog number RD191108200R). Pharmacokinetics can be calculated using WinNonLin version 5.2 of Pharsight Corportion, Cary N.C., PC-based software.
この試験によって、本発明のFGF21誘導体の長期的効果が確認されることになる。 This test confirms the long-term effect of the FGF21 derivative of the present invention.
刊行物、特許出願および特許を含めた、本明細書中で引用するすべての参考文献は、参照によりその全体が、各文献が個々におよび具体的に示されることにより、参照によって組み込まれかつそのすべてが本明細書で述べられる場合と同じ程度に、本明細書に組み込まれる(法によって認められる最大限の範囲において)。 All references cited herein, including publications, patent applications and patents, are incorporated by reference in their entirety, with each reference individually and specifically indicated. All are incorporated herein (to the maximum extent permitted by law) to the same extent as if set forth herein.
本明細書における特許文献の引用および組み込みは、便宜のためのみに行うものであり、そのような特許文献の有効性、特許性および/または執行力のいかなる見解も反映するものではない。本明細書における参考文献の言及は、それらが従来技術を構成することを認めるものではない。 Citation and incorporation of patent documents herein is done for convenience only and does not reflect any view of the validity, patentability and / or enforceability of such patent documents. References herein to references are not an admission that they constitute prior art.
全ての表題および副題は、便宜のためのみに本明細書において使用され、決して本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。 All headings and subtitles are used herein for convenience only and are not to be construed as limiting the invention in any way.
本明細書で提供される任意の例および全ての例または例示的な言葉(例えば「などの」)の使用は、単に本発明をより明確にすることを意図するに過ぎず、特に要求がない限り、本発明の範囲の制限をもたらすものではない。本明細書のいかなる言葉も、非特許請求していない任意の要素を本発明の実施に不可欠であると示すものと解釈されるべきでない。 Use of any examples and all examples or exemplary words (e.g., "such as") provided herein is merely intended to make the present invention clearer and has no particular requirement. As long as it does not limit the scope of the invention. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention.
本明細書において、単語「含む(comprise)」は、「含む(include)」、「含有する(contain)」または「包括する(comprehend)」を広く意味すると解釈すべきである(EPOガイドラインC、III、4.13を参照されたい)。 In this specification, the word "comprise" should be interpreted broadly to mean "include", "contain" or "comprehend" (EPO Guidelines C, (See III, 4.13).
本発明は、適用可能な法律によって許される限り、本明細書に添付の請求項および項目に記載されている主題のあらゆる変更形態および均等物を含む。 This invention includes all modifications and equivalents of the subject matter recited in the claims and items appended hereto as permitted by applicable law.
Claims (15)
以下のアミノ酸置換(交換):71C、121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含んでいてもよく、4個以下のさらなる変異を有していてもよく、ならびに/または179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しなくてもよい、[-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに
71番目にCysを含み、71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体。 [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21,
May include one or more of the following amino acid substitutions (exchanges): 71C, 121Q, 173A and / or des181, may have 4 or fewer additional mutations, and / or 179 and / or [-1A, L166F, M168L, G174V, Y179F] an analog of FGF21, which may not have the 180th amino acid, and
The mercapto group present at the 71st cysteine residue contains Cys at the 71st and the sulfur atom of the mercapto group has the general formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (wherein n is 10 to 20 A group in which m is an integer in the range 1-3, p is an integer in the range 1-3, and q is an integer in the range 2-4. A derivative of said analogue.
以下のアミノ酸置換(交換):121Q、173Aおよび/もしくはdes181の1つもしくは複数を含んでいてもよく、4個以下のさらなる変異を有していてもよく、ならびに/または179および/もしくは180番目のアミノ酸が存在しなくてもよい、[-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21の類似体、ならびに
71番目のシステイン残基に存在するメルカプト基の硫黄原子に一般式HOOC-(CH2)n-CONH-CH(COOH)-CH2-CH2-CONH-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-(CH2CH2O)p-CH2-CONH-(CH2)q-NHCO-CH2-(修飾部分)(式中、nは10〜20の範囲の整数であり、mは1〜3の範囲の整数であり、pは1〜3の範囲の整数であり、qは2〜4の範囲の整数である)の基が共有結合している前記類似体の誘導体。 [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] FGF21 according to claim 1,
The following amino acid substitutions (exchanges): may include one or more of 121Q, 173A and / or des181, may have no more than 4 further mutations, and / or 179 and / or 180th The amino acids of [-1A, 71C, L166F, M168L, G174V, Y179F] analogs of FGF21, and
General formula HOOC- (CH 2 ) n -CONH-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) m -CH on the sulfur atom of the mercapto group present in the 71st cysteine residue 2 -CONH- (CH 2 CH 2 O) p -CH 2 -CONH- (CH 2 ) q -NHCO-CH 2- (Modifying moiety) (wherein n is an integer in the range of 10 to 20, m Is an integer in the range of 1-3, p is an integer in the range of 1-3, and q is an integer in the range of 2-4).
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