JP2013036889A - Pathogen infection diagnosis device of plant body, pathogen infection diagnosis method of plant body - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物体の病原菌感染診断装置及び植物体の病原菌感染診断方法に関する。 The present invention relates to a plant pathogen infection diagnosis apparatus and a plant pathogen infection diagnosis method.
植物体の生育状況を診断する方法として、例えば、特許文献１のように光を用いた診断方法がある。特許文献１の方法では、植物体の生葉から放出される蛍光を観測することにより、植物体が病変、老化、あるいは枯死の状態、もしくはこれらのいずれかの状態への移行過程にあると判別する。 As a method for diagnosing the growth state of a plant body, for example, there is a diagnostic method using light as in Patent Document 1. In the method of Patent Document 1, it is discriminated that the plant body is in a lesion, aging, or withered state, or a transition process to any of these states by observing the fluorescence emitted from the live leaves of the plant body. .
特許文献１の方法では、植物体が何らかの病原菌に感染しているのか否かまでは診断できない。一般的に農作物が何らかの病原菌に感染するとすぐに農場一帯に広まってしまうため、病原菌に感染した農作物をより早期に処分することが重要である。しかしながら、感染初期においては、植物体の感染が疑われる部位を目で見ただけでは、実際に病原菌に感染しているか否かの診断は、専門家でさえも難しい。したがって、農作物が病原菌に感染しているか否かを診断できる技術が必要である。 In the method of Patent Document 1, it cannot be diagnosed whether the plant body is infected with some pathogenic bacteria. It is important to dispose of crops infected with pathogenic bacteria at an earlier stage because, as a general rule, farm products spread to the whole farm as soon as they are infected with some pathogenic bacteria. However, at the initial stage of infection, it is difficult for even an expert to diagnose whether or not a plant is actually infected by simply looking at a site suspected of being infected by a plant. Therefore, there is a need for a technique that can diagnose whether or not agricultural crops are infected with pathogenic bacteria.
そこで本発明は、植物体が病原菌に感染しているか否かを診断できる、植物体の病原菌感染診断装置を提供することを目的とする。 SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a plant pathogen infection diagnosis apparatus that can diagnose whether a plant body is infected with a pathogen or not.
上記課題を解決するため、本発明は、植物体に、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光を照射する励起光照射手段と、上記植物体からの近赤外蛍光及び４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える、植物体の病原菌感染診断装置を提供する。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides an excitation light irradiation means for irradiating a plant body with first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm, near-infrared fluorescence from the plant body and a wavelength of 410 nm or more. There is provided a diagnostic apparatus for diagnosing plant pathogens, comprising fluorescence detection means for detecting visible light fluorescence.
上記病原菌感染診断装置によれば、励起光照射手段により、植物体に３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光が照射される。この第１の励起光はクロロフィルと病原菌体を励起し、クロロフィルから近赤外蛍光、及び、病原菌体から４１０ｎｍ以上の波長の可視光域の自家蛍光が発せられ、それぞれの蛍光が病原菌感染診断装置の蛍光検出手段により検出される。植物体が病原菌に感染している場合、感染部位のクロロフィル量が低下するので、クロロフィルに由来する近赤外蛍光の強度が感染部位で低下する。また、病原菌体に由来する蛍光が感染部位で検出される。本発明の装置は、クロロフィルに由来する近赤外蛍光及び病原菌体に由来する可視光蛍光の両方の蛍光を検出することにより、病原菌に感染しているか否かを確度よく診断することができる。また、本発明の装置を使用すれば、専門家でなくとも容易に感染の有無を診断できる。しかも、植物体が病原菌に感染しているか否かを、植物体を生育させたまま、即座に診断することができる。 According to the above-mentioned pathogen infection diagnosis device, the first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm is irradiated to the plant body by the excitation light irradiation means. This first excitation light excites chlorophyll and pathogenic bacteria, and near-infrared fluorescence is emitted from chlorophyll, and autofluorescence in the visible light region having a wavelength of 410 nm or more is emitted from the pathogenic bacteria, and each fluorescence is diagnostic apparatus for infection with pathogenic bacteria. It is detected by the fluorescence detection means. When a plant body is infected with a pathogenic bacterium, the amount of chlorophyll at the infected site decreases, so that the intensity of near infrared fluorescence derived from chlorophyll decreases at the infected site. In addition, fluorescence derived from pathogenic bacteria is detected at the site of infection. By detecting both near-infrared fluorescence derived from chlorophyll and visible light fluorescence derived from pathogenic bacteria, the apparatus of the present invention can accurately diagnose whether or not the organism is infected with pathogenic bacteria. Moreover, if the apparatus of this invention is used, the presence or absence of an infection can be easily diagnosed even if it is not an expert. In addition, it is possible to immediately diagnose whether the plant body is infected with a pathogen or not while the plant body is grown.
上記励起光照射手段がさらに、６８０ｎｍ以下の波長の第２の励起光を照射することが好ましい。第１の励起光のみによってクロロフィルと病原菌体組織の両方を励起することが可能であるが、第２の励起光を用いることで、より効率的にクロロフィルが励起され、より確度よく診断することが可能となる。 It is preferable that the excitation light irradiation unit further irradiates second excitation light having a wavelength of 680 nm or less. Although it is possible to excite both chlorophyll and pathogenic bacterial tissue only by the first excitation light, the chlorophyll can be more efficiently excited and diagnosed more accurately by using the second excitation light. It becomes possible.
上記励起光照射手段は１つ又は複数の光源であり、上記第１の励起光と上記第２の励起光とが同一の上記１つ又は複数の光源により照射されてもよい。また、上記励起光照射手段は複数の光源であり、上記第１の励起光と上記第２の励起光とがそれぞれ異なる光源により照射されてもよい。 The excitation light irradiation means may be one or a plurality of light sources, and the first excitation light and the second excitation light may be irradiated by the same one or more light sources. The excitation light irradiation means may be a plurality of light sources, and the first excitation light and the second excitation light may be irradiated by different light sources.
また、上記蛍光検出手段は１つ又は複数の蛍光検出器であり、上記近赤外蛍光と上記可視光蛍光とが同一の上記１つ又は複数の蛍光検出器により検出されてもよい。また、上記蛍光検出手段は複数の蛍光検出器であり、上記近赤外蛍光と上記可視光蛍光とがそれぞれ異なる蛍光検出器により検出されてもよい。また、上記蛍光検出手段は１次元蛍光検出器及び２次元蛍光検出器のうち少なくとも１種であることが好ましい。 The fluorescence detection means may be one or a plurality of fluorescence detectors, and the near-infrared fluorescence and the visible light fluorescence may be detected by the same one or a plurality of fluorescence detectors. The fluorescence detection means may be a plurality of fluorescence detectors, and the near-infrared fluorescence and the visible light fluorescence may be detected by different fluorescence detectors. The fluorescence detection means is preferably at least one of a one-dimensional fluorescence detector and a two-dimensional fluorescence detector.
また、上記蛍光検出手段が、上記近赤外蛍光と上記可視光蛍光とを同時に又はそれぞれ異なるタイミングで検出してもよい。また、上記励起光照射手段が、上記第１の励起光と上記第２の励起光とを同時に又はそれぞれ異なるタイミングで照射してもよい。 Further, the fluorescence detection means may detect the near infrared fluorescence and the visible light fluorescence simultaneously or at different timings. Further, the excitation light irradiation means may irradiate the first excitation light and the second excitation light simultaneously or at different timings.
また、上記病原菌が炭疽病菌又はうどん粉病菌であることが好ましい。植物に感染する病原菌の中でもこれらの病原菌は、上記４１０ｎｍ以上の波長の可視光領域に、強い自家蛍光を有するからである。 Moreover, it is preferable that the said pathogenic microbe is an anthrax fungus or a powdery mildew. This is because these pathogens infecting plants have strong autofluorescence in the visible light region having a wavelength of 410 nm or more.
また、本発明は、植物体の病原菌感染診断方法であって、上記植物体の診断対象部位及び該診断対象部位周辺の健常部位に、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光を照射する励起光照射工程と、上記診断対象部位及び上記健常部位からの近赤外蛍光を検出する第１の蛍光検出工程と、上記診断対象部位及び上記健常部位からの４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光を検出する第２の蛍光検出工程と、診断工程と、を含み、上記診断工程においては、上記第１の蛍光検出工程により検出された上記診断対象部位における蛍光強度が、上記第１の蛍光検出工程により検出された上記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％未満であり、かつ、上記第２の蛍光検出工程により検出された上記診断対象部位の蛍光強度が、上記第２の蛍光検出工程により検出された上記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％より大きい場合に、上記植物体が病原菌に感染していると診断し、上記第１の蛍光検出工程により検出された上記診断対象部位における蛍光強度が、上記第１の蛍光検出工程により検出された上記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％以上であり、かつ、上記第２の蛍光検出工程により検出された上記診断対象部位の蛍光強度が、上記第２の蛍光検出工程により検出された上記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％以下である場合に、上記植物体が上記病原菌に感染していないと診断する、植物体の病原菌感染診断方法を提供する。 The present invention also relates to a method for diagnosing a pathogen infection of a plant body, wherein the excitation site is irradiated with a first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm on a site to be diagnosed of the plant body and a healthy site around the site to be diagnosed. A light irradiation step; a first fluorescence detection step for detecting near-infrared fluorescence from the diagnostic target region and the healthy site; and detection of visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more from the diagnostic target site and the healthy site. A second fluorescence detection step and a diagnosis step, wherein in the diagnosis step, the fluorescence intensity at the diagnosis target site detected by the first fluorescence detection step is determined by the first fluorescence detection step. The fluorescence intensity of the diagnosis target site detected by the second fluorescence detection step is less than 50% when the detected fluorescence intensity of the healthy site is 100%. When the fluorescence intensity at the healthy site detected by the fluorescence detection step is greater than 150% when the fluorescence intensity is 100%, the plant body is diagnosed as infected with a pathogen and detected by the first fluorescence detection step The fluorescence intensity at the diagnosis target site is 50% or more when the fluorescence intensity at the healthy site detected by the first fluorescence detection step is 100%, and the second fluorescence detection step. When the fluorescence intensity of the site to be detected detected by the above is 150% or less when the fluorescence intensity at the healthy site detected by the second fluorescence detection step is 100%, the plant body is Provided is a method for diagnosing plant pathogen infection, which diagnoses that the organism is not infected with a pathogen.
上記植物体の病原菌感染診断方法では、励起光照射工程において、植物体の診断対象部位及び該診断対象部位周辺の健常部位に３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光を照射する。この第１の励起光はクロロフィルと病原菌体の組織を励起し、クロロフィルから近赤外蛍光、及び、病原菌体から４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光が発せられる。それぞれの蛍光を第１の蛍光検出工程及び第２の蛍光検出工程においてそれぞれ検出する。植物体が病原菌に感染して診断対象部位の細胞が破壊されている場合、クロロフィル量が低下するので、クロロフィルに由来する近赤外蛍光の強度が、診断対象部位において、健常部位における蛍光強度よりも低下する。また、診断対象部位に病原菌が存在している場合、病原菌体に由来する可視光蛍光が検出され、その蛍光強度が、診断対象部位において、健常部位における蛍光強度よりも強くなる。本発明の方法は、クロロフィルに由来する近赤外蛍光及び病原菌に由来する可視光蛍光の両方の蛍光を検出することにより、病原菌に感染しているか否かを確度よく診断することができる。しかも、植物体を生育させたまま、即座に診断することができる。 In the method for diagnosing a pathogen infection of a plant body, in the excitation light irradiation step, a first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm is irradiated to a diagnosis target site of the plant body and a healthy site around the diagnosis target site. The first excitation light excites chlorophyll and pathogenic fungus tissue, and near-infrared fluorescence is emitted from chlorophyll and visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more is emitted from the pathogenic fungus. Respective fluorescence is detected in the first fluorescence detection step and the second fluorescence detection step. Since the amount of chlorophyll decreases when the plant body is infected with a pathogen and the cells at the site to be diagnosed are destroyed, the intensity of near-infrared fluorescence derived from chlorophyll is higher than that at the healthy site at the site to be diagnosed. Also decreases. In addition, when a pathogenic bacterium is present in the diagnosis target site, visible light fluorescence derived from the pathogenic bacterium is detected, and the fluorescence intensity at the diagnosis target site is stronger than the fluorescence intensity at the healthy site. By detecting both near-infrared fluorescence derived from chlorophyll and visible light fluorescence derived from pathogenic bacteria, the method of the present invention can accurately diagnose whether or not the pathogenic bacteria are infected. Moreover, it can be diagnosed immediately with the plant growing.
上記本発明の方法では、上記診断対象部位及び上記健常部位に、６８０ｎｍ以下の波長の第２の励起光を照射する励起光照射工程をさらに備えることが好ましい。第２の励起光を照射することで、より効率的にクロロフィルが励起され、さらに確度よく診断することが可能となる。 Preferably, the method of the present invention further includes an excitation light irradiation step of irradiating the diagnosis target site and the healthy site with second excitation light having a wavelength of 680 nm or less. By irradiating the second excitation light, the chlorophyll is more efficiently excited, and the diagnosis can be performed more accurately.
また、上記本発明の方法では、上記第１の蛍光検出工程と上記第２の蛍光検出工程とを、同時に又は異なるタイミングで行うことが好ましい。同時に検出することで、より短い時間で診断できる。また、異なるタイミングで検出することで、検出器が１つの場合でも、植物体からの蛍光が近赤外蛍光又は４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光のどちらの蛍光なのか明確に判別でき、より確度よく診断することができる。 In the method of the present invention, it is preferable that the first fluorescence detection step and the second fluorescence detection step are performed simultaneously or at different timings. By detecting simultaneously, it can diagnose in a shorter time. Moreover, by detecting at different timings, even when there is one detector, it is possible to clearly determine whether the fluorescence from the plant body is near-infrared fluorescence or visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more, and more accurate. Can be diagnosed well.
また、上記本発明の方法では、上記第１の励起光を照射する励起光照射工程と、上記第２の励起光を照射する励起光照射工程とを、同時に又は異なるタイミングで行うことが好ましい。第１の励起光と第２の励起光とを同時に照射することで、近赤外蛍光と４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光の同時検出が容易になる。また、第１の励起光と第２の励起光をそれぞれ異なるタイミングで照射することにより、それぞれの励起光に由来する蛍光を精度よく検出することができる。 In the method of the present invention, it is preferable that the excitation light irradiation step of irradiating the first excitation light and the excitation light irradiation step of irradiating the second excitation light are performed simultaneously or at different timings. By simultaneously irradiating the first excitation light and the second excitation light, simultaneous detection of near-infrared fluorescence and visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more is facilitated. In addition, by irradiating the first excitation light and the second excitation light at different timings, it is possible to accurately detect fluorescence derived from each excitation light.
上記病原菌が炭疽病菌又はうどん粉病菌であることが好ましい。植物に感染する病原菌の中でもこれらの病原菌は、上記４１０ｎｍ以上の波長の可視光領域に強い自家蛍光を有するため、本発明の方法によってさらに確度よく感染の有無を診断することができる。 It is preferable that the pathogenic bacteria is anthrax or powdery mildew. Among pathogens that infect plants, these pathogens have strong autofluorescence in the visible light region having a wavelength of 410 nm or more, and therefore the presence or absence of infection can be diagnosed more accurately by the method of the present invention.
本発明の植物体の病原菌感染診断装置によれば、植物体が病原菌に感染しているか否かを確度よく診断することができる。 According to the plant pathogen infection diagnosis apparatus of the present invention, it is possible to accurately diagnose whether a plant body is infected with a pathogen.
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一要素には同一符号を付すこととし、重複する説明は省略する。図面の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings as necessary. In the drawings, the same elements are denoted by the same reference numerals, and redundant description is omitted. The dimensional ratios in the drawings are not limited to the illustrated ratios.
（植物体の病原菌感染診断装置）
図１は、本発明の一実施形態にかかる植物体の病原菌感染診断装置１００を用いて本発明の方法を実施している様子を表す模式図である。本発明の病原菌感染診断装置１００は、主として励起光照射手段１と、蛍光検出手段２と、を備える。
(Plant pathogen diagnosis device)
FIG. 1 is a schematic diagram showing a state in which the method of the present invention is implemented using a plant pathogen infection diagnosis apparatus 100 according to an embodiment of the present invention. The pathogen infection diagnosis apparatus 100 of the present invention mainly includes excitation light irradiation means 1 and fluorescence detection means 2.
（励起光照射手段）
励起光照射手段１は、植物体３に３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光７１を照射する。励起光照射手段１としては、例えば、３００〜５００ｎｍの波長の光を照射できる光源である。このような光源としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー半導体（ＬＤ）、固体レーザー、液体レーザー、ガスレーザー、自由電子レーザー、化学レーザー等のレーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ナトリウムランプ、重水素ランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯を挙げることができ、この中でも水銀ランプ、重水素ランプ、キセノンランプ並びに半導体光源であるＬＥＤ及びＬＤが好ましい。
(Excitation light irradiation means)
The excitation light irradiation means 1 irradiates the plant body 3 with the first excitation light 71 having a wavelength of 300 to 500 nm. As the excitation light irradiation means 1, it is a light source which can irradiate the light of a wavelength of 300-500 nm, for example. Examples of such light sources include light-emitting diodes (LEDs), laser semiconductors (LDs), solid-state lasers, liquid lasers, gas lasers, free electron lasers, chemical lasers, lasers such as mercury lamps, xenon lamps, metal halide lamps, and sodium. Examples include lamps, deuterium lamps, halogen lamps, and fluorescent lamps. Among these, mercury lamps, deuterium lamps, xenon lamps, and LEDs and LDs that are semiconductor light sources are preferable.
（第１の励起光）
第１の励起光７１は、３００〜５００ｎｍの波長の光である。この波長の光は、植物体に感染する病原菌体を励起することができ、さらに植物体中のクロロフィルも励起することができる。第１の励起光７１は、３００〜５００ｎｍの波長の光であり、より好ましくは３００〜４５０ｎｍの波長の光であり、さらに好ましくは３２０〜４２０ｎｍの波長の光である。第１の励起光７１は、波長範囲の幅が狭いことが好ましい。波長範囲の幅が狭ければ、励起光照射によって得られる蛍光の感度が上がる。好ましくは波長範囲の幅は、２０ｎｍ以下である。また、所望の波長範囲の光を得るために、励起光照射手段１に分光素子４１を設けてもよい。分光素子４１としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルターが挙げられる。また、第１の励起光７１は、植物体に照射される光強度が、植物体への影響を低減するために、低い照射強度が好ましく、例えば、検出器がＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０１〜１００ルクスが好ましく、検出器が冷却ＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０００００００１〜０．０１ルクスが好ましい。
(First excitation light)
The first excitation light 71 is light having a wavelength of 300 to 500 nm. Light of this wavelength can excite pathogenic bacteria that infect plant bodies, and can also excite chlorophyll in the plant bodies. The first excitation light 71 is light having a wavelength of 300 to 500 nm, more preferably light having a wavelength of 300 to 450 nm, and still more preferably light having a wavelength of 320 to 420 nm. The first excitation light 71 preferably has a narrow wavelength range. If the width of the wavelength range is narrow, the sensitivity of fluorescence obtained by excitation light irradiation increases. Preferably, the width of the wavelength range is 20 nm or less. Further, in order to obtain light in a desired wavelength range, the spectroscopic element 41 may be provided in the excitation light irradiation unit 1. Examples of the spectroscopic element 41 include a band pass filter, a long wavelength cut filter, and a short wavelength cut filter. In addition, the first excitation light 71 is preferably low in light intensity so that the light intensity applied to the plant body reduces the influence on the plant body. For example, when the detector is a CCD, The intensity is preferably 0.01 to 100 lux, and when the detector is a cooled CCD, the intensity on the light receiving surface is preferably 0.00000001 to 0.01 lux.
（蛍光検出手段）
蛍光検出手段２は、植物体３から、４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１と近赤外蛍光８２とを検出する。図１において、植物体からの光８が分光素子５１，５２によってそれぞれ４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１と近赤外蛍光８２とに分光され、蛍光検出手段２に検出される。蛍光検出手段２としては、４１０ｎｍ以上の波長の可視光と近赤外蛍光とを検出できる蛍光検出器であればよい。このような蛍光検出器としては、例えば、ラインセンサー型のＣＣＤ、ラインセンサー型のＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、フォトダイオードアレイや、スポット型検出器であるフォトダイオード、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ、光電子増倍管）等の１次元蛍光検出器や、２次元ＣＣＤや２次元ＣＭＯＳ等の２次元蛍光検出器を挙げることができる。１次元蛍光検出器では、検出した蛍光の蛍光強度をそのまま数値として測定することができる。２次元蛍光検出器では、検出した蛍光の蛍光強度を画像として確認することができる。また、２次元蛍光検出器を用いた場合でも、画像の画素から蛍光強度を数値として測定することができる。１次元蛍光検出器を用いた場合、装置の構成が簡単になるという利点があり、２次元蛍光検出器を用いた場合、蛍光を視覚的に確認できるという利点がある。なお、１次元蛍光検出器を用いる場合であっても、ラインセンサー型ＣＣＤやラインセンサー型ＣＭＯＳを用いてスキャンしたり、ＰＭＴ等のスポット型検出器を用いてスキャンしたりすることによって、植物体３からの蛍光を２次元で検出することは可能である。なお、蛍光検出手段２が４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１と近赤外蛍光８２とを分光可能であれば、分光素子５１，５２を設けなくてもよい。
(Fluorescence detection means)
The fluorescence detection means 2 detects visible light fluorescence 81 and near infrared fluorescence 82 having a wavelength of 410 nm or more from the plant body 3. In FIG. 1, light 8 from a plant body is split into visible light fluorescence 81 and near-infrared fluorescence 82 having a wavelength of 410 nm or more by the spectroscopic elements 51 and 52, and detected by the fluorescence detection means 2. The fluorescence detection means 2 may be any fluorescence detector that can detect visible light having a wavelength of 410 nm or longer and near infrared fluorescence. Examples of such a fluorescence detector include a line sensor type CCD, a line sensor type CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor), a photodiode array, a photodiode that is a spot type detector, a PMT (Photomultiplier Tube), and a photomultiplier. And a two-dimensional fluorescence detector such as a two-dimensional CCD and a two-dimensional CMOS. In the one-dimensional fluorescence detector, the fluorescence intensity of the detected fluorescence can be measured as a numerical value as it is. In the two-dimensional fluorescence detector, the fluorescence intensity of the detected fluorescence can be confirmed as an image. Even when a two-dimensional fluorescence detector is used, the fluorescence intensity can be measured as a numerical value from the pixels of the image. When a one-dimensional fluorescence detector is used, there is an advantage that the configuration of the apparatus is simplified, and when a two-dimensional fluorescence detector is used, there is an advantage that fluorescence can be visually confirmed. Even when a one-dimensional fluorescence detector is used, the plant body is scanned by scanning using a line sensor type CCD or line sensor type CMOS, or by using a spot type detector such as PMT. It is possible to detect the fluorescence from 3 in two dimensions. Note that the spectroscopic elements 51 and 52 may not be provided as long as the fluorescence detection unit 2 can split the visible light fluorescence 81 and the near-infrared fluorescence 82 having a wavelength of 410 nm or more.
（近赤外蛍光）
近赤外蛍光８２は、クロロフィルに由来する蛍光を含む光であり、近赤外光から赤外光までの波長の範囲の光である。近赤外蛍光８２の波長の範囲としては、好ましくは６８０ｎｍ〜４１００ｎｍ、より好ましくは６８０〜２５００ｎｍ、さらに好ましくは６８０〜１０００ｎｍである。近赤外蛍光８２は、波長範囲の幅が狭いことが、クロロフィルに由来する蛍光の測定感度が向上するため好ましい。波長範囲の幅は、好ましくは７００〜８５０ｎｍである。近赤外蛍光８２の波長範囲を狭めるために、蛍光検出手段２に分光素子５２を設けてもよい。分光素子５２としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルターが挙げられる。
(Near-infrared fluorescence)
The near-infrared fluorescence 82 is light including fluorescence derived from chlorophyll, and is light in a wavelength range from near-infrared light to infrared light. The wavelength range of the near infrared fluorescence 82 is preferably 680 nm to 4100 nm, more preferably 680 to 2500 nm, and further preferably 680 to 1000 nm. It is preferable that the near-infrared fluorescence 82 has a narrow wavelength range because measurement sensitivity of fluorescence derived from chlorophyll is improved. The width of the wavelength range is preferably 700 to 850 nm. In order to narrow the wavelength range of the near-infrared fluorescence 82, the spectroscopic element 52 may be provided in the fluorescence detection means 2. Examples of the spectroscopic element 52 include a band pass filter, a long wavelength cut filter, and a short wavelength cut filter.
（４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光）
４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１は、病原菌体由来の蛍光を含む光である。可視光蛍光８１の波長の範囲としては、好ましくは４１０ｎｍ〜６８０ｎｍ、より好ましくは４１０〜６００ｎｍ、さらに好ましくは４１０〜５００ｎｍある。可視光蛍光８１は、波長範囲の幅が狭いことが、特定の病原菌体に由来する蛍光の測定感度が向上するため好ましい。波長範囲の幅は、好ましくは２０ｎｍ以下である。可視光蛍光８１の波長範囲を狭めるために、蛍光検出手段２に分光素子５１を設けてもよい。分光素子５１としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルターが挙げられる。
(Visible fluorescence with a wavelength of 410 nm or more)
Visible light fluorescence 81 having a wavelength of 410 nm or more is light containing fluorescence derived from pathogenic bacteria. The wavelength range of the visible light fluorescence 81 is preferably 410 nm to 680 nm, more preferably 410 to 600 nm, and still more preferably 410 to 500 nm. It is preferable that the visible light fluorescence 81 has a narrow wavelength range because the measurement sensitivity of fluorescence derived from a specific pathogen is improved. The width of the wavelength range is preferably 20 nm or less. In order to narrow the wavelength range of the visible light fluorescence 81, a spectroscopic element 51 may be provided in the fluorescence detection means 2. Examples of the spectroscopic element 51 include a band pass filter, a long wavelength cut filter, and a short wavelength cut filter.
（第２の励起光）
励起光照射手段１はさらに、第２の励起光７２を照射することが好ましい。図２は、励起光照射手段１が第１の励起光に加えて第２の励起光７２を照射する実施形態にかかる植物体の病原菌感染診断装置１１０を示す図である。第２の励起光７２は、植物体中のクロロフィルを励起する光である。クロロフィルの吸収波長は、３００〜５００ｎｍ、５８０〜６８０ｎｍである。したがって、第１の励起光７１のみによってクロロフィルと病原菌体の両方を励起することが可能であるが、第２の励起光７２を用いることで、より効率的にクロロフィルが励起され、より確度よく植物体の病原菌感染を診断することが可能となる。すなわち、図２の実施形態において、第１の励起光７１に励起されて病原菌体が発する蛍光が４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１であり、第２の励起光７２に励起されてクロロフィルが発する蛍光が近赤外蛍光８２である。第２の励起光７２は、６８０ｎｍ以下の波長の光であればよいが、好ましくは３００〜６８０ｎｍの波長の光であり、より好ましくは５８０〜６８０ｎｍの波長の光であり、さらに好ましくは６２０〜６８０ｎｍの波長の光である。また、所望の波長範囲の光を得るために、励起光照射手段１に分光素子４２を設けてもよい。分光素子４２としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルターが挙げられる。また、第２の励起光７２は、植物体に照射される光強度が、植物体への影響を低減するために、低い照射強度が好ましく、例えば、検出器がＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０１〜１００ルクスが好ましく、検出器が冷却ＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０００００００１〜０．０１ルクスが好ましい。
(Second excitation light)
It is preferable that the excitation light irradiation means 1 further irradiates the second excitation light 72. FIG. 2 is a diagram illustrating a plant pathogen infection diagnosis apparatus 110 according to an embodiment in which the excitation light irradiation unit 1 irradiates the second excitation light 72 in addition to the first excitation light. The second excitation light 72 is light that excites chlorophyll in the plant body. The absorption wavelength of chlorophyll is 300 to 500 nm and 580 to 680 nm. Therefore, it is possible to excite both chlorophyll and pathogenic fungus body only by the first excitation light 71, but by using the second excitation light 72, the chlorophyll is more efficiently excited and the plant is more accurately detected. It becomes possible to diagnose the pathogen infection of the body. That is, in the embodiment of FIG. 2, the fluorescence emitted from the pathogenic fungus when excited by the first excitation light 71 is the visible light fluorescence 81 having a wavelength of 410 nm or more, and is excited by the second excitation light 72 and emits chlorophyll. The fluorescence is near infrared fluorescence 82. The second excitation light 72 may be light having a wavelength of 680 nm or less, preferably light having a wavelength of 300 to 680 nm, more preferably light having a wavelength of 580 to 680 nm, and further preferably 620 to 620 nm. It is light with a wavelength of 680 nm. Further, in order to obtain light in a desired wavelength range, the spectroscopic element 42 may be provided in the excitation light irradiation unit 1. Examples of the spectroscopic element 42 include a band pass filter, a long wavelength cut filter, and a short wavelength cut filter. In addition, the second excitation light 72 is preferably low in intensity so that the light intensity applied to the plant body is less affected by the plant body. For example, when the detector is a CCD, The intensity is preferably 0.01 to 100 lux, and when the detector is a cooled CCD, the intensity on the light receiving surface is preferably 0.00000001 to 0.01 lux.
励起光照射手段は、第１の励起光と第２の励起光とを同時に照射してもよいし、それぞれ異なるタイミングで照射してもよい。第１の励起光と第２の励起光とを同時に照射する場合、近赤外蛍光と４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光の同時検出が容易になる。また、第１の励起光と第２の励起光とをそれぞれ異なるタイミングで照射する場合、それぞれの励起光に由来する蛍光を精度よく検出することができる。第１の励起光と第２の励起光とを同時に照射するために、第１の励起光と第２の励起光とを通過させるフィルター等の分光素子を用いてもよい。また、第１の励起光と第２の励起光とをそれぞれ異なるタイミングで照射するために、図２のように、それぞれの励起光７１，７２を通過させるためのフィルター４１，４２を入れ替えて使用してもよい。 The excitation light irradiation means may irradiate the first excitation light and the second excitation light at the same time, or may irradiate at different timings. When simultaneously irradiating the first excitation light and the second excitation light, simultaneous detection of near-infrared fluorescence and visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more is facilitated. Further, when the first excitation light and the second excitation light are irradiated at different timings, the fluorescence derived from each excitation light can be accurately detected. In order to irradiate the first excitation light and the second excitation light simultaneously, a spectroscopic element such as a filter that allows the first excitation light and the second excitation light to pass therethrough may be used. Further, in order to irradiate the first excitation light and the second excitation light at different timings, the filters 41 and 42 for passing the respective excitation lights 71 and 72 are used interchangeably as shown in FIG. May be.
植物体に照射される光は、第１の励起光７１及び第２の励起光７２以外の波長の光を含んでいてもよいが、含まないことが好ましい。植物体に照射される光の総光強度を１００％としたときに、第１の励起光７１及び第２の励起光７２以外の光の光強度は、好ましくは０．１％未満、より好ましくは０．０１％未満、さらに好ましくは０．００１％未満である。 Although the light irradiated to a plant body may contain the light of wavelengths other than the 1st excitation light 71 and the 2nd excitation light 72, it is preferable not to contain. The light intensity of light other than the first excitation light 71 and the second excitation light 72 is preferably less than 0.1%, more preferably when the total light intensity of the light irradiated to the plant body is 100%. Is less than 0.01%, more preferably less than 0.001%.
励起光照射手段は、図２に示すように１つの光源であってもよいし、複数の光源であってもよい。図３は、複数の光源を用いて第１の励起光と第２の励起光とを照射する実施形態にかかる、植物体の病原菌感染診断装置１２０を示す図である。第１の励起光７１と第２の励起光７２とは、それぞれ異なる光源１１，１２から照射される。ただし、分光素子を用いたり、異なるタイミングで照射したりすることによって、光源１１，１２それぞれが第１の励起光７１と第２の励起光７２との両方を照射することも可能である。 The excitation light irradiation means may be one light source as shown in FIG. 2 or a plurality of light sources. FIG. 3 is a diagram showing a plant pathogen infection diagnosis apparatus 120 according to an embodiment in which the first excitation light and the second excitation light are irradiated using a plurality of light sources. The first excitation light 71 and the second excitation light 72 are emitted from different light sources 11 and 12, respectively. However, each of the light sources 11 and 12 can irradiate both the first excitation light 71 and the second excitation light 72 by using a spectroscopic element or irradiating at different timings.
また、蛍光検出手段は、図１〜３に示すように１つの検出器であってもよいし、複数の検出器であってもよい。図４は、複数の検出器を用いて近赤外蛍光と４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光とを検出する実施形態にかかる、植物体の病原菌感染診断装置１３０を示す図である。第１の励起光７１と第２の励起光７２とが、それぞれ異なる光源１１，１２から照射され、植物体からの光８が分光素子５１，５２によってそれぞれ４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１と近赤外蛍光８２とに分光され、それぞれ異なる蛍光検出器２１，２２によって検出される。２つの蛍光を異なる蛍光検出器によって検出する場合、２つの蛍光の同時検出が容易になる。なお、蛍光検出器２１，２２がそれぞれ可視光蛍光８１と近赤外蛍光８２とを検出可能であれば、分光素子５１，５２は設けなくてもよい。また、この複数の検出器を用いる実施形態において、第１の励起光７１と第２の励起光７２とは、同一の光源から照射されてもよく、また、１つの光源から照射されてもよい。さらに、分光素子を用いたり、異なるタイミングで検出したりすることによって、近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１との両方を検出する蛍光検出器を複数用いることも可能である。 The fluorescence detection means may be one detector as shown in FIGS. 1 to 3 or a plurality of detectors. FIG. 4 is a diagram showing a plant pathogen infection diagnosis apparatus 130 according to an embodiment in which near infrared fluorescence and visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more are detected using a plurality of detectors. The first excitation light 71 and the second excitation light 72 are irradiated from different light sources 11 and 12, respectively, and the light 8 from the plant body is visible light fluorescence 81 having a wavelength of 410 nm or more by the spectroscopic elements 51 and 52, respectively. The light is split into near-infrared fluorescence 82 and detected by different fluorescence detectors 21 and 22. When two fluorescences are detected by different fluorescence detectors, simultaneous detection of the two fluorescences is facilitated. In addition, if the fluorescence detectors 21 and 22 can detect the visible light fluorescence 81 and the near-infrared fluorescence 82, respectively, the spectroscopic elements 51 and 52 may not be provided. In the embodiment using the plurality of detectors, the first excitation light 71 and the second excitation light 72 may be emitted from the same light source or may be emitted from one light source. . Furthermore, it is possible to use a plurality of fluorescence detectors that detect both the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 by using a spectroscopic element or by detecting at different timings.
蛍光検出手段２は、近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とを同時に検出してもよいし、それぞれ異なるタイミングで検出してもよい。近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とを同時に検出する場合、測定時間が短くなり、診断に要する時間が短くなる。また、近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とをそれぞれ異なるタイミングで検出する場合、検出器が１つの場合でも確度よく測定を行える。近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とを同時に検出するために、近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とを通過させるバンドパスフィルター等の分光素子を用いてもよい。また、近赤外蛍光８２と可視光蛍光８１とをそれぞれ異なるタイミングで検出するために、図１〜図３のように、それぞれの蛍光８１，８２を通過させるための分光素子５１，５２を入れ替えて使用してもよい。 The fluorescence detection means 2 may detect the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 simultaneously, or may detect them at different timings. When near-infrared fluorescence 82 and visible light fluorescence 81 are detected simultaneously, the measurement time is shortened and the time required for diagnosis is shortened. Further, when the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 are detected at different timings, measurement can be performed with high accuracy even when there is only one detector. In order to detect the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 simultaneously, a spectroscopic element such as a band-pass filter that allows the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 to pass therethrough may be used. Further, in order to detect the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 at different timings, the spectroscopic elements 51 and 52 for passing the respective fluorescence 81 and 82 are exchanged as shown in FIGS. May be used.
（病原菌感染診断方法）
次に、図１の実施形態の病原菌感染診断装置１００を用いた植物体の病原菌感染診断方法について説明する。
(Pathogen infection diagnosis method)
Next, a pathogen infection diagnosis method for a plant body using the pathogen infection diagnosis apparatus 100 of the embodiment of FIG. 1 will be described.
本発明の植物体の病原菌感染診断方法は、植物体３の診断対象部位３３及び診断対象部位３３周辺の健常部位３４に、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光７１を照射する第１の励起光照射工程と、診断対象部位３３及び健常部位３４からの近赤外蛍光８２を検出する第１の蛍光検出工程と、診断対象部位３３及び健常部位３４からの４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１を検出する第２の蛍光検出工程と、診断工程と、を含む。 In the method for diagnosing a plant pathogen infection according to the present invention, the first excitation light 71 having a wavelength of 300 to 500 nm is applied to the diagnosis target region 33 of the plant body 3 and the healthy region 34 around the diagnosis target region 33. An excitation light irradiation step, a first fluorescence detection step for detecting near-infrared fluorescence 82 from the diagnostic target region 33 and the healthy region 34, and a visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more from the diagnostic target region 33 and the healthy region 34 A second fluorescence detecting step for detecting 81 and a diagnostic step.
（第１の励起光照射工程）
第１の励起光照射工程は、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光７１を照射する工程である。第１の励起光照射工程により、植物体に感染する病原菌体を励起し、さらに植物体のクロロフィルも励起する。
(First excitation light irradiation step)
The first excitation light irradiation step is a step of irradiating the first excitation light 71 having a wavelength of 300 to 500 nm. In the first excitation light irradiation step, pathogenic bacteria that infect the plant body are excited, and chlorophyll of the plant body is also excited.
（第１の蛍光検出工程）
第１の蛍光検出工程は、診断対象部位３３及び健常部位３４からの近赤外蛍光８２を検出する工程である。第１の蛍光検出工程により、植物体のクロロフィルに由来する蛍光を検出する。
(First fluorescence detection step)
The first fluorescence detection step is a step of detecting near-infrared fluorescence 82 from the diagnosis target portion 33 and the healthy portion 34. The fluorescence derived from the chlorophyll of the plant body is detected by the first fluorescence detection step.
（第２の蛍光検出工程）
第２の蛍光検出工程は、診断対象部位３３及び健常部位３４からの４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光８１を検出する工程である。第２の蛍光検出工程により、植物体に感染した病原菌体に由来する蛍光を検出する。
(Second fluorescence detection step)
The second fluorescence detection step is a step of detecting visible light fluorescence 81 having a wavelength of 410 nm or more from the diagnosis target portion 33 and the healthy portion 34. In the second fluorescence detection step, fluorescence derived from the pathogenic fungus infected with the plant body is detected.
第１の蛍光検出工程と、第２の蛍光検出工程とを、同時に行ってもよいし、又は異なるタイミングで行ってもよい。同時に行うことで、計測時間を短くし、診断に要する時間を短くすることができる。また、異なるタイミングで行うことで、用いる検出器が一つの場合でも、近赤外蛍光８２又は可視光蛍光８１のどちらの蛍光に由来する蛍光かを確度よく判別できる。異なるタイミングで行う場合、第１の蛍光検出工程と第２の蛍光検出工程のどちらを先に行ってもよい。 The first fluorescence detection step and the second fluorescence detection step may be performed simultaneously or at different timings. By carrying out simultaneously, measurement time can be shortened and the time required for diagnosis can be shortened. Moreover, by performing at different timings, it is possible to accurately determine whether the fluorescence is derived from the near-infrared fluorescence 82 or the visible light fluorescence 81 even when only one detector is used. When performing at different timings, either the first fluorescence detection step or the second fluorescence detection step may be performed first.
（診断工程）
診断工程においては、以下のようにして、植物体３が病原菌に感染しているか否かの診断を行う。
まず、第１の蛍光検出工程により検出された、診断対象部位３３における蛍光強度と、健常部位３４における蛍光強度とを比較する。
同様に、第２の蛍光検出工程により検出された、診断対象部位３３における蛍光強度と、健常部位３４における蛍光強度とを比較する。
そして、第１の蛍光検出工程により検出された診断対象部位３３における蛍光強度が健常部位３４における蛍光強度を１００％としたときに５０％未満であり、かつ、第２の蛍光検出工程により検出された診断対象部位３３における蛍光強度が健常部位３４における蛍光強度を１００％としたときに１５０％より大きい場合に、植物体３が病原菌に感染していると診断する。
一方、第１の蛍光検出工程により検出された診断対象部位３３における蛍光強度が健常部位３４における蛍光強度を１００％としたときに５０％以上であり、かつ、第２の蛍光検出工程により検出された診断対象部位３３における蛍光強度が健常部位３４における蛍光強度を１００％としたときに１５０％以下である場合に、植物体３が病原菌に感染していないと診断する。
なお、２次元検出器を用いた場合、蛍光強度は精確な値を測定しなくとも、明らかに診断対象部位３３における蛍光が健常部位３４における蛍光に対して明るいこと、又は、暗いことが視認できる場合がある。そのような場合は、精確な値を測定しなくとも診断対象部位３３における蛍光強度が健常部位３４における蛍光強度に対して、上記の基準値より大きい又は未満であると判断してよい。
(Diagnosis process)
In the diagnosis step, a diagnosis is made as to whether or not the plant body 3 is infected with a pathogen.
First, the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 detected by the first fluorescence detection step is compared with the fluorescence intensity at the healthy site 34.
Similarly, the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 detected by the second fluorescence detection step is compared with the fluorescence intensity at the healthy site 34.
Then, the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 detected by the first fluorescence detection step is less than 50% when the fluorescence intensity at the healthy site 34 is 100%, and is detected by the second fluorescence detection step. When the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 is greater than 150% when the fluorescence intensity at the healthy site 34 is 100%, it is diagnosed that the plant body 3 is infected with a pathogen.
On the other hand, the fluorescence intensity in the diagnosis target region 33 detected by the first fluorescence detection step is 50% or more when the fluorescence intensity in the healthy region 34 is 100%, and is detected by the second fluorescence detection step. When the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 is 150% or less when the fluorescence intensity at the healthy site 34 is taken as 100%, it is diagnosed that the plant body 3 is not infected with a pathogen.
When a two-dimensional detector is used, the fluorescence intensity at the diagnostic target region 33 is clearly brighter or darker than the fluorescence at the healthy region 34 without measuring an accurate value of the fluorescence intensity. There is a case. In such a case, even if an accurate value is not measured, it may be determined that the fluorescence intensity at the diagnosis target site 33 is greater than or less than the reference value with respect to the fluorescence intensity at the healthy site 34.
（第２の励起光照射工程）
本発明の病原菌感染診断方法は、図２のように、診断対象部位３３及び健常部位３４に、６８０ｎｍ以下の波長の第２の励起光７２を照射する励起光照射工程をさらに備えることが好ましい。第２の励起光照射工程により、植物体のクロロフィルを効率よく励起することができ、より確度のよい診断が行える。
(Second excitation light irradiation step)
The pathogen infection diagnosis method of the present invention preferably further includes an excitation light irradiation step of irradiating the second excitation light 72 having a wavelength of 680 nm or less to the diagnosis target site 33 and the healthy site 34 as shown in FIG. By the second excitation light irradiation step, the chlorophyll of the plant body can be excited efficiently, and a more accurate diagnosis can be performed.
本発明の病原菌感染診断方法が第２の励起光照射工程を備える場合、第１の励起光照射工程と、第２の励起光照射工程とは、同時に行ってもよいし、又は異なるタイミングで行ってもよい。同時に行うことで、近赤外蛍光８２及び可視光蛍光８１の同時検出が容易になる。また、異なるタイミングで行うことで、簡易な分光素子により、一つの光源で両方の励起光照射を行える。異なるタイミングで行う場合、第１の励起光照射工程と第２の励起光照射工程のどちらを先に行ってもよい。 When the pathogen infection diagnosis method of the present invention includes the second excitation light irradiation step, the first excitation light irradiation step and the second excitation light irradiation step may be performed simultaneously or at different timings. May be. By carrying out simultaneously, simultaneous detection of the near-infrared fluorescence 82 and the visible light fluorescence 81 becomes easy. Moreover, by performing at different timing, both excitation light irradiation can be performed with one light source with a simple spectroscopic element. When performing at different timings, either the first excitation light irradiation step or the second excitation light irradiation step may be performed first.
（病原菌）
本発明の方法により感染の有無を診断できる病原菌としては、植物が感染する病原菌であれば種類を問わないが、好ましくは、炭疽病菌やうどん粉病菌である。炭疽病菌としては、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属等の炭疽病菌が挙げられ、例えば、グロメレラ・シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、コレトトリカム・アキュテータム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。うどん粉病菌としては、ウドンコカビ科（Ｅｒｙｓｉｐｈａｃｅａｅ）に属する子嚢菌類が挙げられ、例えば、スファエロテカ・パンノサ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｐａｎｎｏｓａ）、スファエロテカ・フムリ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｈｕｍｕｌｉ）、スファエロテカ・キュキュルビタエ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）、スファエロテカ・フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、オイディウム・リコペルシシ（Ｏｉｄｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ウンシヌラ・シムランス（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ）、エリシフェ・ポリゴニ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｐｏｌｙｇｏｎｉ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィラクチニア・モリコラ（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ ｍｏｒｉｃｏｌａ）等が挙げられる。
(Pathogenic bacteria)
The pathogen that can diagnose the presence or absence of infection by the method of the present invention is not limited as long as it is a pathogen that infects plants, but is preferably an anthrax fungus or powdery mildew. Examples of the anthrax fungus include anthrax fungi such as Glomerella genus, Colletotrichum genus, and the like. Collototricum gloesporoides) and the like. Examples of powdery mildew include ascomycetes belonging to the family Erysiphaceae, such as Sphaerotheca pannosa, Sphaerotheca humuli, Sphaeroteca humuli, and Sphaeroteca fuliginea, Oidium lycopersici, Uncinula simulans, Erysiphe necator, Elysipe polygilia ria graminis), include the Firakuchinia-Morikora (Phyllactinia moricola) and the like.
（植物体）
本発明の方法により診断できる植物としては、草本でも木本でもよい。また、種子植物、シダ植物、コケ植物であってもよいが、種子植物が好ましい。その中でも、イチゴ、スイカ、メロン、キュウリ、トウガン、カボチャ、ナス、トウガラシ、ピーマン、トマト、ムギ、マンゴー、ナシ、カキ、リンゴ、ブドウ、シクラメン、ベゴニア、バラ、ユリ、シバ、チャが好ましい。
(Plant)
The plant that can be diagnosed by the method of the present invention may be herbaceous or woody. Moreover, although a seed plant, a fern plant, and a moss plant may be sufficient, a seed plant is preferable. Among them, strawberry, watermelon, melon, cucumber, cucumber, pumpkin, eggplant, pepper, pepper, tomato, wheat, mango, pear, oyster, apple, grape, cyclamen, begonia, rose, lily, shiba and cha are preferred.
診断に用いる診断対象部位３３及び健常部位３４は、病原菌が感染する部位であれば、根、茎、葉、果実等、植物体のいずれの部位でもよいが、蛍光測定が容易なことから好ましくは葉や果実である。クロロフィルが豊富なことから葉がより好ましい。また、植物を生育させたまま診断できるのも本発明の利点である。もちろん、診断対象部位３３及び健常部位３４を含む組織を採取した後に測定してもよい。植物体の特定部位に、病原菌の感染が疑われる症状、例えば黒斑、白斑、褐斑、萎縮等が生じている場合、該部位を診断対象部位３３として、本発明の方法により病原菌の感染の有無を確認することができる。 The site to be diagnosed 33 and the healthy site 34 used for diagnosis may be any part of a plant body such as root, stem, leaf, fruit, etc., as long as the pathogen is infected, but it is preferable because fluorescence measurement is easy Leaves and fruits. Leaves are more preferred because they are rich in chlorophyll. Further, it is an advantage of the present invention that diagnosis can be performed while growing a plant. Of course, the measurement may be performed after collecting a tissue including the diagnosis target region 33 and the healthy region 34. When a symptom suspected of being infected with a pathogenic bacterium, for example, black spots, vitiligo, brown spots, atrophy, etc., has occurred in a specific part of a plant body, the part of the plant is regarded as a diagnosis target part 33 and the method of the present invention is used to The presence or absence can be confirmed.
なお、本発明は上記説明した実施形態に限定されず様々な変形態様が可能である。 The present invention is not limited to the embodiment described above, and various modifications can be made.
（実施例１）
（クロロフィルの励起波長及び蛍光波長の検討）
イチゴ生葉にＬＥＤを光源として、３７５ｎｍの紫外領域の波長の励起光を照射し、７１０ｎｍ以上の波長の近赤外蛍光をＣＣＤカメラで検出した。図５に近赤外蛍光画像を示す。クロロフィルが明るく光る蛍光画像が取得できたことから、クロロフィルを励起する励起光の励起波長として紫外領域の波長でさえも利用できることが示された。
Example 1
(Examination of excitation wavelength and fluorescence wavelength of chlorophyll)
Strawberry fresh leaves were irradiated with excitation light having a wavelength in the ultraviolet region of 375 nm using an LED as a light source, and near-infrared fluorescence having a wavelength of 710 nm or more was detected with a CCD camera. FIG. 5 shows a near-infrared fluorescence image. Since it was possible to obtain a fluorescent image in which chlorophyll shines brightly, it was shown that even the wavelength in the ultraviolet region can be used as the excitation wavelength of excitation light for exciting chlorophyll.
（実施例２）
（炭疽病菌の励起波長及び蛍光波長の検討）
炭疽病菌に由来する蛍光波長を測定した。炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）の分生子と菌糸の混合懸濁液を調製し、該混合懸濁液に、３６０ｎｍ、３８０ｎｍ、４００ｎｍの励起光を照射し、それぞれの励起光に対応する蛍光スペクトルを測定した。図６に蛍光スペクトル（４４０〜５４０ｎｍ）を示す。３８０ｎｍ、４００ｎｍの励起光を照射したとき、蛍光スペクトルのピークは、両方の励起光ともに、４４８ｎｍ、４６７ｎｍ、４８２ｎｍ、４９２ｎｍ付近に見られた。３６０ｎｍの波長の励起光を照射したときは、蛍光強度はスペクトル全体で弱いものの、やはり３８０ｎｍと４００ｎｍの波長の励起光を照射したときと同じ部分にピークが見られた。励起波長を変えても蛍光スペクトルのピークが変わらないことから、該ピークは炭疽病菌由来の蛍光に起因するものであることが分かった。
(Example 2)
(Examination of excitation wavelength and fluorescence wavelength of anthrax)
The fluorescence wavelength derived from the anthrax fungus was measured. Prepare a mixed suspension of conidia and mycelium of Glomerella singulata, irradiate the mixed suspension with excitation light of 360 nm, 380 nm and 400 nm, and measure the fluorescence spectrum corresponding to each excitation light did. FIG. 6 shows the fluorescence spectrum (440 to 540 nm). When the excitation light of 380 nm and 400 nm was irradiated, the peak of the fluorescence spectrum was observed in the vicinity of 448 nm, 467 nm, 482 nm, and 492 nm for both excitation lights. When irradiated with excitation light with a wavelength of 360 nm, the fluorescence intensity was weak throughout the spectrum, but peaks were also observed in the same part as when irradiated with excitation light with wavelengths of 380 nm and 400 nm. Since the peak of the fluorescence spectrum did not change even when the excitation wavelength was changed, it was found that the peak was caused by fluorescence derived from anthrax.
（実施例３）
（炭疽病菌の励起波長及び蛍光波長の検討）
励起光の波長を変化させて、炭疽病菌に由来する蛍光を測定した。炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）の分生子と菌糸の混合懸濁液を調製し、該混合懸濁液に、３００〜４００ｎｍの波長の励起光を、波長を変化させて照射し、４１０ｎｍの波長の蛍光を測定した。図７に励起光スペクトル（３００〜４００ｎｍ）を示す。最短３００ｎｍの波長の励起光により、炭疽病菌に由来する４１０ｎｍの波長の蛍光を取得できることが分かった。
(Example 3)
(Examination of excitation wavelength and fluorescence wavelength of anthrax)
The fluorescence derived from the anthrax fungus was measured by changing the wavelength of the excitation light. A mixed suspension of conidia and mycelium of Glomerella singulata was prepared, and the mixed suspension was irradiated with excitation light having a wavelength of 300 to 400 nm while changing the wavelength, and fluorescence having a wavelength of 410 nm. Was measured. FIG. 7 shows an excitation light spectrum (300 to 400 nm). It was found that fluorescence having a wavelength of 410 nm derived from anthracnose fungus can be obtained by excitation light having a wavelength of 300 nm as short as possible.
（実施例４）
（炭疽病菌の分生子の蛍光画像の取得）
炭疽病菌の分生糸の蛍光を測定した。炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）に水銀ランプを光源として、４００〜４４０ｎｍの波長の励起光を照射し、４７５ｎｍ以上の波長の蛍光をＣＣＤカメラで検出した。図８（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ明視野画像と蛍光画像を示す。図８（Ｂ）には炭疽病菌由来の蛍光が認められた。
Example 4
(Acquisition of fluorescent images of conidia of anthrax)
The fluorescence of conidia of anthrax was measured. Glomerella singulata was irradiated with excitation light having a wavelength of 400 to 440 nm using a mercury lamp as a light source, and fluorescence having a wavelength of 475 nm or more was detected with a CCD camera. FIGS. 8A and 8B show a bright field image and a fluorescence image, respectively. In FIG. 8 (B), fluorescence derived from anthrax was observed.
（実施例５）
（炭疽病菌に感染したイチゴ生葉のクロロフィル由来の蛍光画像の取得）
イチゴの生葉に炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）を接種した。接種後、５〜７日で葉に炭疽病の初期病変が認められ、約１０日で明らかな病変（黒い斑点）となった。接種した生葉に、ＬＥＤを光源として、４０５ｎｍの励起波長を照射し、７１０ｎｍ以上の波長の近赤外蛍光をＣＣＤカメラで検出した。図９（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ明視野画像と近赤外蛍光画像を示す。明視野画像（Ａ）でわずかに認められた黒斑は、近赤外蛍光画像（Ｂ）では明視野画像の黒斑よりも大きな黒斑となった（図９（Ａ）（Ｂ）中、丸で囲まれた部分）。病変部ではクロロフィルが欠損し、病変部周辺の健常部位に存在するクロロフィルの蛍光強度に対して、病変部における蛍光強度が低くなったためと考えられる。なお、病変部の近赤外蛍光の蛍光強度は病変部周辺の健常部位の蛍光強度を１００％としたときに、約３０％となっていた。図１０に病変部を横断する線でスキャンした近赤外蛍光イメージングプロファイルを示す。蛍光強度を表すＡ．Ｕ．（任意単位：ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）が著しく低くなっているところが病変部、その他の部分が健常部位である。
(Example 5)
(Acquisition of fluorescence image derived from chlorophyll of fresh strawberry leaves infected with anthrax)
Fresh leaves of strawberry were inoculated with Glomerella cingula. An initial lesion of anthrax was observed on the leaves 5 to 7 days after the inoculation, and apparent lesions (black spots) were observed on about 10 days. The inoculated fresh leaves were irradiated with an excitation wavelength of 405 nm using an LED as a light source, and near-infrared fluorescence having a wavelength of 710 nm or more was detected with a CCD camera. FIGS. 9A and 9B show a bright-field image and a near-infrared fluorescence image, respectively. The black spots slightly observed in the bright field image (A) became larger black spots in the near-infrared fluorescent image (B) than in the bright field image (in FIGS. 9A and 9B). Circled part). This is probably because chlorophyll was lost in the lesion, and the fluorescence intensity in the lesion was lower than the fluorescence intensity of chlorophyll present in healthy sites around the lesion. The fluorescence intensity of the near-infrared fluorescence of the lesioned part was about 30% when the fluorescence intensity of the healthy site around the lesioned part was 100%. FIG. 10 shows a near-infrared fluorescence imaging profile scanned with a line traversing the lesion. A. Fluorescence intensity U. The part where the arbitrary unit (arbitrary unit) is significantly low is the lesioned part, and the other part is the healthy part.
（実施例６）
（炭疽病菌に感染したイチゴ生葉の炭疽病菌由来の蛍光画像の取得）
イチゴの生葉に炭疽病菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）を接種した。接種後、５〜７日で葉に炭疽病の初期病変が認められ、約１０日で明らかな病変（黒い斑点）となった。接種した生葉に、水銀ランプを光源として、４００〜４４０ｎｍの励起波長を照射し、４７５ｎｍ以上の波長の蛍光をＣＣＤで検出した。図１１（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ明視野画像と蛍光画像を示す。明視野画像（Ａ）で認められた黒斑部位から、蛍光画像（Ｂ）で黄緑色の蛍光が認められた（図１１（Ａ）及び（Ｂ）中、丸で囲まれた部分）。該蛍光は炭疽病菌の菌体に由来する蛍光と考えられる。病変部（丸で囲まれた部分）の上記蛍光波長における蛍光強度は、病変部周辺の健常部位の蛍光強度を１００％としたときに約２００％となっていた。
(Example 6)
(Acquisition of fluorescent images derived from anthracnose fungi on fresh strawberry leaves infected with anthracnose fungi)
Fresh leaves of strawberry were inoculated with Glomerella cingula. An initial lesion of anthrax was observed on the leaves 5 to 7 days after the inoculation, and apparent lesions (black spots) were observed on about 10 days. The inoculated fresh leaves were irradiated with an excitation wavelength of 400 to 440 nm using a mercury lamp as a light source, and fluorescence with a wavelength of 475 nm or more was detected by CCD. FIGS. 11A and 11B show a bright field image and a fluorescence image, respectively. Yellow-green fluorescence was observed in the fluorescent image (B) from the black spot site observed in the bright field image (A) (the part circled in FIGS. 11A and 11B). The fluorescence is considered to be fluorescence derived from the cells of anthrax. The fluorescence intensity at the fluorescence wavelength of the lesioned part (the part surrounded by a circle) was about 200% when the fluorescence intensity of the healthy site around the lesioned part was taken as 100%.
（実施例７）
（うどん粉病菌に感染したイチゴ生葉のうどん粉病菌由来の蛍光画像の取得）
イチゴの生葉にイチゴうどん粉病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ａｐｈａｎｉｓ）を接種した。接種後、葉が粉状に白くなり、うどん粉病の病変が認められた。接種した生葉に、ＬＥＤを光源として、４０５ｎｍの励起波長を照射し、バンドパスフィルターを使用して４２８〜４９１ｎｍの波長の蛍光をＣＣＤカメラで検出した。図１２（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ明視野画像と蛍光画像を示す。明視野画像（Ａ）で白く認められた病変部から、明るく白い蛍光が発せられているのが蛍光画像（Ｂ）で観察された。（Ｂ）で観察された蛍光は、イチゴうどん粉病の菌体に由来する蛍光と考えられる。病変部の上記蛍光波長における蛍光強度は、病変部周辺の健常部位の蛍光強度を１００％としたときに約２５０％となっていた。図１３に、病変部を横断する線でスキャンした、波長４２８〜４９１ｎｍの蛍光のイメージングプロファイルを示す。蛍光強度を表すＡ．Ｕ．（任意単位：ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）が著しく高くなっているところが病変部、その他の部分が健常部位である。
(Example 7)
(Acquisition of fluorescent image derived from powdery mildew of fresh strawberry leaves infected with powdery mildew)
Fresh strawberry leaves were inoculated with strawberry powdery mildew (Sphaerotheca aphanis). After inoculation, the leaves turned white and powdery mildew lesions were observed. The inoculated fresh leaves were irradiated with an excitation wavelength of 405 nm using an LED as a light source, and fluorescence with a wavelength of 428 to 491 nm was detected with a CCD camera using a bandpass filter. FIGS. 12A and 12B show a bright field image and a fluorescence image, respectively. It was observed in the fluorescent image (B) that bright white fluorescence was emitted from the lesion part recognized as white in the bright field image (A). The fluorescence observed in (B) is considered to be fluorescence derived from strawberry powdery mildew. The fluorescence intensity at the fluorescence wavelength of the lesioned part was about 250% when the fluorescence intensity of the healthy site around the lesioned part was taken as 100%. FIG. 13 shows an imaging profile of fluorescence having a wavelength of 428 to 491 nm scanned with a line traversing the lesion. A. Fluorescence intensity U. The part where the arbitrary unit (arbitrary unit) is remarkably high is the lesioned part, and the other part is the healthy part.
（実施例８）
（うどん粉病菌に感染したイチゴ生葉のうどん粉病菌及びクロロフィル由来の蛍光画像の取得）
イチゴの生葉にイチゴうどん粉病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ａｐｈａｎｉｓ）を接種した。接種後、葉が粉状に白くなり、うどん粉病の病変が認められた。接種した生葉に、ＬＥＤを光源として、３７５ｎｍの励起波長を照射し、バンドパスフィルターを使用して４２８〜４９１ｎｍの波長の蛍光をＣＣＤカメラで検出した。また、同じ生葉に、ＬＥＤを光源として、３７５ｎｍの励起波長を照射し、７１０ｎｍ以上の波長の近赤外蛍光をＣＣＤカメラで検出した。図１４（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ波長４２８〜４９１ｎｍの蛍光画像と波長７１０ｎｍ以上の近赤外蛍光画像を示す。（Ａ）で明るく白く光っている病変部が、（Ｂ）では黒くなっているのが観察された。病変部について、（Ａ）では病原菌体由来の蛍光が観察され、（Ｂ）ではクロロフィルの欠損により近赤外蛍光が弱くなったためである。図１４（Ａ）（Ｂ）に示す白線に沿ってスキャンした、波長４２８〜４９１ｎｍ、７１０ｎｍ以上の蛍光のイメージングプロファイルをそれぞれ図１５（Ａ）（Ｂ）に示す。図１５（Ａ）において蛍光強度を表すＡ．Ｕ．（任意単位：ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）が著しく高くなっているところが病変部、その他の部分が健常部位である。図１５（Ａ）で蛍光強度が高くなっている部分が、図１５（Ｂ）では蛍光強度が低くなっていた。なお、病変部の蛍光波長４２８〜４９１ｎｍにおける蛍光強度は、病変部周辺の健常部位の蛍光強度を１００％としたときに約２００％となっていた。また、病変部の蛍光波長７１０ｎｍ以上における蛍光強度は、病変部周辺の健常部位の蛍光強度を１００％としたときに約３０％となっていた。
(Example 8)
(Acquisition of fluorescent images derived from powdery mildew and chlorophyll of fresh strawberry leaves infected with powdery mildew)
Fresh strawberry leaves were inoculated with strawberry powdery mildew (Sphaerotheca aphanis). After inoculation, the leaves turned white and powdery mildew lesions were observed. The inoculated fresh leaves were irradiated with an excitation wavelength of 375 nm using an LED as a light source, and fluorescence with a wavelength of 428 to 491 nm was detected with a CCD camera using a bandpass filter. Further, the same fresh leaf was irradiated with an excitation wavelength of 375 nm using an LED as a light source, and near-infrared fluorescence having a wavelength of 710 nm or more was detected with a CCD camera. FIGS. 14A and 14B show a fluorescence image having a wavelength of 428 to 491 nm and a near-infrared fluorescence image having a wavelength of 710 nm or more, respectively. It was observed that the lesion which was bright and white in (A) and black in (B). This is because the fluorescence from the pathogenic fungus was observed in (A), and the near-infrared fluorescence was weakened in (B) due to chlorophyll loss. FIGS. 15A and 15B show fluorescence imaging profiles of wavelengths 428 to 491 nm and 710 nm or more scanned along the white lines shown in FIGS. 14A and 14B, respectively. In FIG. U. The part where the arbitrary unit (arbitrary unit) is remarkably high is the lesioned part, and the other part is the healthy part. The portion where the fluorescence intensity is high in FIG. 15 (A) is low in FIG. 15 (B). In addition, the fluorescence intensity in the fluorescence wavelength 428-491 nm of a lesioned part was about 200% when the fluorescence intensity of the healthy site | part around a lesioned part was set to 100%. Further, the fluorescence intensity of the lesioned part at a fluorescence wavelength of 710 nm or more was about 30% when the fluorescence intensity of a healthy site around the lesioned part was taken as 100%.
Claims (15)
前記植物体からの近赤外蛍光及び４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える、
植物体の病原菌感染診断装置。 An excitation light irradiation means for irradiating the plant body with first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm;
A fluorescence detection means for detecting near-infrared fluorescence from the plant body and visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more, and
A device for diagnosing plant pathogens.
前記植物体の診断対象部位及び該診断対象部位周辺の健常部位に、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光を照射する励起光照射工程と、
前記診断対象部位及び前記健常部位からの近赤外蛍光を検出する第１の蛍光検出工程と、
前記診断対象部位及び前記健常部位からの４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光を検出する第２の蛍光検出工程と、
診断工程と、を含み、
前記診断工程においては、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位における蛍光強度が、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％未満であり、かつ、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位の蛍光強度が、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％より大きい場合に、前記植物体が病原菌に感染していると診断し、
前記第１の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位における蛍光強度が、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％以上であり、かつ、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位の蛍光強度が、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％以下である場合に、前記植物体が前記病原菌に感染していないと診断する、
植物体の病原菌感染診断方法。 A method for diagnosing a pathogen infection of a plant,
An excitation light irradiation step of irradiating a first excitation light having a wavelength of 300 to 500 nm to a diagnosis target site of the plant body and healthy sites around the diagnosis target site;
A first fluorescence detection step for detecting near-infrared fluorescence from the diagnosis target site and the healthy site;
A second fluorescence detection step of detecting visible light fluorescence having a wavelength of 410 nm or more from the diagnosis target site and the healthy site;
A diagnostic process,
In the diagnosis step, when the fluorescence intensity at the diagnosis target site detected by the first fluorescence detection step is 100% of the fluorescence intensity at the healthy site detected by the first fluorescence detection step The fluorescence intensity at the diagnosis target site detected by the second fluorescence detection step is less than 50%, and the fluorescence intensity at the healthy site detected by the second fluorescence detection step is 100%. Diagnoses that the plant is infected with a pathogen, sometimes greater than 150%,
The fluorescence intensity at the diagnostic target site detected by the first fluorescence detection step is 50% or more when the fluorescence intensity at the healthy site detected by the first fluorescence detection step is 100%, In addition, the fluorescence intensity of the diagnosis target site detected by the second fluorescence detection step is 150% or less when the fluorescence intensity at the healthy site detected by the second fluorescence detection step is 100%. In some cases, the plant is diagnosed as not infected with the pathogen.
A method for diagnosing plant pathogen infection.
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