JP2012210172A - Liposome varying inner material composition responding to external environment - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、外部環境に応答して内部の物質組成を変化させるリポソームの分野に関連する。 The present invention relates to the field of liposomes that change the internal material composition in response to an external environment.
リポソームは、生物学的膜のモデルとして長らく研究されてきた。リポソームは、その内部と外部とを物理的に遮断し、親水性物質を透過させないという特徴を有することから、生物化学的反応を行なう微小区画として利用する手法も開発されている（特許文献１）。しかしながら、リポソームは脂質膜に囲まれており、この脂質膜は脂溶性のバリアとして作用する（非特許文献１〜２）。このリポソームの遮断性に起因して、リポソーム内部に外部から物質（特に、親水性物質）を導入することは困難であると考えられている。そして、リポソーム内部での反応ないし物質組成をリポソーム外部から制御することは不可能であると考えられていた。 Liposomes have long been studied as a model for biological membranes. Liposomes have the characteristics of physically blocking the inside and the outside and not allowing permeation of hydrophilic substances. Therefore, a method of utilizing liposomes as microcompartments that perform biochemical reactions has also been developed (Patent Document 1). . However, the liposome is surrounded by a lipid membrane, and this lipid membrane acts as a fat-soluble barrier (Non-Patent Documents 1 and 2). Due to the blocking property of the liposome, it is considered difficult to introduce a substance (particularly a hydrophilic substance) into the liposome from the outside. And it was considered impossible to control the reaction or substance composition inside the liposome from the outside of the liposome.
リポソームは、その遮断性のために薬物送達の担体として使用することも提唱されている（特許文献２）。上記のとおり、リポソームの遮断性に起因して、一旦、リポソーム内に封入された物質の組成を変更することは、不可能であると考えられていた。 Liposomes have also been proposed for use as drug delivery carriers because of their blocking properties (Patent Document 2). As described above, it was considered impossible to change the composition of the substance once enclosed in the liposome due to the blocking property of the liposome.
外部環境に応答して内部の物質組成を変えるリポソームを提供することを本発明の課題とする。 It is an object of the present invention to provide a liposome that changes an internal substance composition in response to an external environment.
上記課題は、例えば、以下を提供することによって解決された。
（項目１）
以下：
（ａ）プロモーター配列、リボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。
（項目２）
前記リボスイッチ配列が、テオフィリン、および、チアミンピロリン酸からなる選択される化合物に応答する配列である、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目３）
前記リボスイッチ配列が、チアミンピロリン酸に応答する配列であって、以下：
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目４）
前記リボスイッチ配列が、テオフィリンに応答する配列であって、以下：
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目５）
前記プロモーター配列および前記ＲＮＡポリメラーゼが、原核生物由来である、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目６）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）、Ｔ５プロモーター配列（配列番号４）、Ｓｐ６プロモーター配列（配列番号５）、および、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）からなる群から選択される、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目７）
前記プロモーター配列が、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）である、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目８）
さらに、
（ｅ）前記（ａ）と同一のポリメラーゼによって転写される第２のプロモーター配列、前記（ａ）のリボスイッチ配列と同一の化合物に対して応答する第２のリボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、前記（ａ）のプロモーター配列および該第２のプロモーター配列からの転写を行なうポリメラーゼのコード配列を含む第２のＤＮＡ
をさらに含む、項目１に記載の一枚膜リポソーム。
（項目９）
前記（ａ）のリボスイッチ配列が、チアミンピロリン酸に応答する配列であって、前記代２のリボスイッチ配列が、以下：
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目８に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１０）
前記（ａ）のリボスイッチ配列が、テオフィリンに応答する配列であって、前記代２のリボスイッチ配列が、以下：
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目８に記載の一枚膜リポソーム。
（項目１１）
リポソーム内の物質組成を変化させる方法であって、以下：
（１）項目１または８に記載の一枚膜リポソームを提供する工程；および、
（２）前記リボスイッチ配列が応答する化合物と、該一枚膜リポソームとを接触させる工程；
を包含する、方法。
（項目１２）
前記リボスイッチ配列が、テオフィリン、および、チアミンピロリン酸からなる選択される化合物に応答する配列である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記リボスイッチ配列が、チアミンピロリン酸に応答する配列であって、以下：
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記リボスイッチ配列が、テオフィリンに応答する配列であって、以下：
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記プロモーター配列および前記ＲＮＡポリメラーゼが、原核生物由来である、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）、Ｔ５プロモーター配列（配列番号４）、Ｓｐ６プロモーター配列（配列番号５）、および、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記プロモーター配列が、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）である、項目１１に記載の方法。
The above problems have been solved, for example, by providing the following.
(Item 1)
Less than:
(A) DNA comprising a promoter sequence, a riboswitch sequence, a translation initiation sequence, and a polypeptide coding sequence;
(B) RNA polymerase;
(C) ribonucleotides; and
(D) a cell-free protein synthesis system,
Single-membrane liposomes.
(Item 2)
Item 2. The single membrane liposome according to item 1, wherein the riboswitch sequence is a sequence that responds to a selected compound consisting of theophylline and thiamine pyrophosphate.
(Item 3)
The riboswitch sequence is responsive to thiamine pyrophosphate, the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
The single membrane liposome according to item 1, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
(Item 4)
The riboswitch sequence is a sequence that responds to theophylline and is:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
The single membrane liposome according to item 1, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
(Item 5)
The single membrane liposome according to item 1, wherein the promoter sequence and the RNA polymerase are derived from prokaryotes.
(Item 6)
The promoter sequence is selected from the group consisting of a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), a T5 promoter sequence (SEQ ID NO: 4), an Sp6 promoter sequence (SEQ ID NO: 5), and a T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6); Item 1. The single membrane liposome according to item 1.
(Item 7)
The single membrane liposome according to item 1, wherein the promoter sequence is a T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6).
(Item 8)
further,
(E) a second promoter sequence transcribed by the same polymerase as in (a), a second riboswitch sequence that responds to the same compound as the riboswitch sequence in (a), a translation initiation sequence, and A second DNA comprising the promoter sequence of (a) and a coding sequence of a polymerase that performs transcription from the second promoter sequence
The monolayer liposome according to Item 1, further comprising:
(Item 9)
The riboswitch sequence of (a) is a sequence that responds to thiamine pyrophosphate, and the riboswitch sequence of the generation 2 is the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
9. The single membrane liposome according to item 8, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
(Item 10)
The riboswitch sequence of (a) is a sequence that responds to theophylline, and the riboswitch sequence of the generation 2 is the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
9. The single membrane liposome according to item 8, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
(Item 11)
A method for changing the composition of a substance in a liposome, comprising:
(1) providing the single membrane liposome according to item 1 or 8; and
(2) contacting the compound to which the riboswitch sequence is responsive with the single membrane liposome;
Including the method.
(Item 12)
Item 12. The method according to Item 11, wherein the riboswitch sequence is a sequence that responds to a selected compound consisting of theophylline and thiamine pyrophosphate.
(Item 13)
The riboswitch sequence is responsive to thiamine pyrophosphate, the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
12. A method according to item 11, consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of.
(Item 14)
The riboswitch sequence is a sequence that responds to theophylline and is:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
12. A method according to item 11, consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of.
(Item 15)
Item 12. The method according to Item 11, wherein the promoter sequence and the RNA polymerase are derived from prokaryotes.
(Item 16)
The promoter sequence is selected from the group consisting of a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), a T5 promoter sequence (SEQ ID NO: 4), an Sp6 promoter sequence (SEQ ID NO: 5), and a T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6); Item 12. The method according to Item11.
(Item 17)
Item 12. The method according to Item 11, wherein the promoter sequence is a T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6).
従来のリポソームは、その内部の物質組成をリポソーム外部の環境に応じて変化させることは不可能であった。これに対して、本発明では、一枚膜リポソーム内部に、リボスイッチ配列を含むＤＮＡを封入し、その結果、リポソームが外部環境に応答して内部の物質組成を変えることが可能となった。 Conventional liposomes cannot change the internal material composition according to the environment outside the liposomes. On the other hand, in the present invention, DNA containing a riboswitch sequence is encapsulated inside a single membrane liposome, and as a result, the liposome can change the internal material composition in response to the external environment.
また、従来のリポソームは内部に薬剤を封入することでドラックデリバリーの手法として使われているが、この場合、一度薬剤をリポソームに封入すると、内部の薬剤の組成を変化させることができない。有効成分を含むリポソームを患者に投与した後に、体内の環境が変わり、その結果、必要な薬剤が変わった場合であっても、薬剤の組成を変えることは不可能であった。本発明を利用することによって、体内環境に応じてリポソーム内の有効成分を変化させるリポソームの製造が可能となった。 Conventional liposomes are used as a drug delivery method by encapsulating a drug inside, but in this case, once the drug is encapsulated in the liposome, the composition of the drug inside cannot be changed. After the liposome containing the active ingredient was administered to the patient, it was impossible to change the composition of the drug even when the environment inside the body changed and, as a result, the required drug changed. By utilizing the present invention, it has become possible to produce liposomes that change the active ingredients in the liposomes according to the body environment.
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。 The description of the preferred embodiment is described below, but it should be understood that this embodiment is an illustration of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to such a preferred embodiment. It should be understood that those skilled in the art can easily make modifications, changes and the like within the scope of the present invention with reference to the following preferred embodiments.
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。 The present invention will be described below. It is to be understood that the terms used in this specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。 Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.
（定義）
本明細書において使用する場合、用語「微小区画」とは、脂質層、および、その内部の水層から構成される閉じられた微小な空間をいう。「微小区画」としては、例えば、リポソームが挙げられるがこれに限定されない。
(Definition)
As used herein, the term “microcompartment” refers to a closed microscopic space composed of a lipid layer and an aqueous layer therein. Examples of the “microcompartments” include, but are not limited to, liposomes.
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）を有してもよい。本発明において使用するリポソームは、好ましくは、脂質二重層からなる膜が一重のみからなる一枚膜リポソームである。一枚膜リポソームの調製法としては、種々の周知の方法が利用可能である。 As used herein, the term “liposome” means a closed vesicle usually composed of a lipid layer assembled in a membrane and an inner aqueous layer. In addition to phospholipids typically used, cholesterol, glycolipids and the like can also be incorporated. In the present invention, the liposome is a structural unit having a functional group that imparts an ester bond (eg, glycolipid, ganglioside, phosphatidylglycerol, etc.) or a structural unit that has a functional group that imparts a peptide bond in order to attach a modifying group. (For example, phosphatidylethanolamine). The liposome used in the present invention is preferably a single membrane liposome in which a membrane composed of a lipid bilayer consists of only a single layer. Various well-known methods can be used as a method for preparing the unilamellar liposome.
本明細書において使用する場合、用語「リポソーム内の物質組成」とは、リポソーム内のあらゆる物質の成分を包含する。リポソーム内の物質組成は、好ましくは、タンパク質の組成である。「リポソーム内の物質組成」が変化する場合としては、限定されることはないが、例えば：
・特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが翻訳されてリポソーム内での量が増える；
・リポソーム内に存在しなかった特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、新たに翻訳される；
・特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが分解されてリポソーム内での量が減少する；
・特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが分解されてリポソーム内での量が「０」となる；ならびに、
・特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドが分解されて、そのポリペプチドに由来する２つ以上のフラグメントとなる；
ことが挙げられる。
As used herein, the term “substance composition within a liposome” encompasses any component of a substance within a liposome. The substance composition in the liposome is preferably a protein composition. Examples of the case where the “substance composition in the liposome” changes include, but are not limited to:
A polypeptide consisting of a specific amino acid sequence is translated to increase the amount in the liposome;
A polypeptide consisting of a specific amino acid sequence that was not present in the liposome is newly translated;
-A polypeptide consisting of a specific amino acid sequence is degraded to reduce the amount in the liposome;
A polypeptide consisting of a specific amino acid sequence is degraded to an amount of “0” in the liposome; and
A polypeptide consisting of a specific amino acid sequence is broken down into two or more fragments derived from that polypeptide;
Can be mentioned.
本明細書において使用する場合、用語「プロモーター配列」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。代表的なプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）、Ｔ５プロモーター配列（配列番号４）、Ｓｐ６プロモーター配列（配列番号５）、および、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）が挙げられるがこれらに限定されない。 As used herein, the term “promoter sequence” refers to a region on DNA that determines the start site of transcription of a gene and directly regulates its frequency, and RNA polymerase binds to transcription. This is the base sequence to start. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene. The promoter may be inducible, constitutive, site specific, or time specific. Any promoter can be used as long as it can be expressed in host cells such as mammalian cells, E. coli, and yeast. Representative promoter sequences include T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), T5 promoter sequence (SEQ ID NO: 4), Sp6 promoter sequence (SEQ ID NO: 5), and T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6). It is not limited to.
本明細書において使用する「ＲＮＡポリメラーゼ」は、使用するプロモーター配列に適合する、すなわち、その使用するプロモーターからの転写を行なうＲＮＡポリメラーゼであれば、いかなるＲＮＡポリメラーゼを用いてもよい。好ましくは、プロモーター配列とＲＮＡポリメラーゼとが、同じ、あるいは、近接する生物種に由来する。例えば、原核生物由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、原核生物由来であることが好ましい。あるいは、バクテリオファージ由来のプロモーター配列を使用する場合、使用するＲＮＡポリメラーゼもまた、同一または類似のバクテリオファージ由来であることが好ましい。 As used herein, the “RNA polymerase” may be any RNA polymerase as long as it is compatible with the promoter sequence used, that is, RNA polymerase that performs transcription from the promoter used. Preferably, the promoter sequence and the RNA polymerase are derived from the same or adjacent species. For example, when a prokaryotic promoter sequence is used, the RNA polymerase to be used is also preferably prokaryotic. Alternatively, when using a promoter sequence derived from bacteriophage, it is preferable that the RNA polymerase used is also derived from the same or similar bacteriophage.
本明細書において使用する場合、用語「リボスイッチ配列」とは、特定の化合物の存在に依存して、構造変化を起こす配列をいう。特定の「リボスイッチ配列」に対して、この構造変化を起こす化合物を、「リボスイッチ配列が応答する化合物」という。例えば、配列番号１からなる「リボスイッチ配列」について「リボスイッチ配列が応答する化合物」はチアミンピロリン酸であり、配列番号２からなる「リボスイッチ配列」について「リボスイッチ配列が応答する化合物」はテオフィリンである。 As used herein, the term “riboswitch sequence” refers to a sequence that undergoes a structural change depending on the presence of a particular compound. A compound that causes this structural change with respect to a specific “riboswitch sequence” is referred to as a “compound to which the riboswitch sequence responds”. For example, for a “riboswitch sequence” consisting of SEQ ID NO: 1, the “compound to which the riboswitch sequence responds” is thiamine pyrophosphate, and for the “riboswitch sequence” consisting of SEQ ID NO: 2, the “compound to which the riboswitch sequence responds” is Theophylline.
本明細書において使用する場合、用語「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。 As used herein, the term “translation initiation sequence” means any sequence capable of providing a functional ribosome entry site. In bacterial systems, this region is also referred to as the Shine-Dalgarno sequence.
「プロモーター配列」と「翻訳開始配列」との間に「リボスイッチ配列」を配置すると、「リボスイッチ配列が応答する化合物」の存在に依存して、プロモーター配列からの転写が行なわれる。 When the “riboswitch sequence” is arranged between the “promoter sequence” and the “translation initiation sequence”, transcription from the promoter sequence is performed depending on the presence of the “compound to which the riboswitch sequence responds”.
本明細書において使用される用語「無細胞蛋白質合成系」とは、細胞を処理することによって自律複製能を失った細胞由来の成分であって、蛋白質の合成が可能な成分をいう。無細胞蛋白質合成系としては、例えば、市販のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（バイオコゥマー株式会社 東京都文京区）を利用することも可能である。あるいは、無細胞蛋白質合成系に必要とされる成分を精製および／または組換え発現して、作製することも可能である。 As used herein, the term “cell-free protein synthesis system” refers to a component derived from a cell that has lost its autonomous replication ability by treating the cell and is capable of protein synthesis. As the cell-free protein synthesis system, for example, commercially available PURESYSTEM (registered trademark) (Biocommer Corporation Bunkyo-ku, Tokyo) can also be used. Alternatively, components required for a cell-free protein synthesis system can be produced by purification and / or recombinant expression.
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。 As used herein, “homology” of genes (eg, nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc.) refers to the degree of identity of two or more gene sequences with each other. In the present specification, the identity of sequences (nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc.) refers to the degree of two or more comparable sequences that are identical to each other (individual nucleic acids, amino acids, etc.). Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous. In the present specification, “similarity” of genes (for example, nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc.) refers to two or more gene sequences when the conservative substitution is regarded as positive (identical) in the above homology. The degree of identity with each other. Thus, when there is a conservative substitution, homology and similarity differ depending on the presence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, homology and similarity indicate the same numerical value.
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。 In this specification, the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using FASTA, which is a sequence analysis tool, and using default parameters.
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長蛋白質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。 As used herein, “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, the lengths of polypeptides and polynucleotides can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the above numbers are not absolute, and the upper limit is not limited as long as they have the same function. Alternatively, the above-mentioned number as the lower limit is intended to include the upper and lower numbers (or, for example, up and down 10%) of the number. In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the value. The length of a fragment useful in the present specification can be determined by whether or not at least one of the functions of a full-length protein serving as a reference for the fragment is retained.
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。 In the present specification, “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to well-known conditions commonly used in the art. Such a polynucleotide can be obtained by using colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method or the like using a polynucleotide selected from among the polynucleotides of the present invention as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then 0.1 to 2 times the concentration. Means a polynucleotide that can be identified by washing the filter under conditions of 65 ° C. using a SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). To do. Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford Universe. Here, the sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. The “hybridizable polynucleotide” refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions. Specifically, the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% homology with the base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% The polynucleotide which has the above homology, More preferably, the polynucleotide which has 95% or more of homology can be mentioned.
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。 As used herein, “highly stringent conditions” are designed to allow hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences and to exclude hybridization of DNA having significant mismatches. Say conditions. Hybridization stringency is primarily determined by temperature, ionic strength, and the conditions of denaturing agents such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridization and washing are 0.0015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 65-68 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M citric acid. Sodium, and 50% formamide, 42 ° C. For such highly stringent conditions, see Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (ColdSpring Harbor, N, Y. 1989); and Anderson et al. Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, IV, IRL Press Limited (Oxford, England). See Limited, Oxford, England. If necessary, more stringent conditions (eg, higher temperature, lower ionic strength, higher formamide, or other denaturing agents) may be used. Other agents can be included in the hybridization and wash buffers for the purpose of reducing non-specific hybridization and / or background hybridization. Examples of such other agents include 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinyl pyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO 4 or SDS), Ficoll, Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (or another non-complementary DNA) and dextran sulfate, but other suitable agents can also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8-7.4; however, at typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost pH independent. Anderson et al. , Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
Factors that affect the stability of the DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by one of ordinary skill in the art to apply these variables and to allow different sequence related DNAs to form hybrids. The melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:
T m (° C.) = 81.5 + 16.6 (log [Na + ]) + 0.41 (% G + C) −600 / N−0.72 (% formamide)
Where N is the length of the duplex formed, [Na + ] is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or wash solution, and% G + C is the (guanine + Cytosine) base percentage. For imperfectly matched hybrids, the melting temperature decreases by about 1 ° C. for each 1% mismatch.
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
As used herein, “moderately stringent conditions” refers to conditions under which a DNA duplex having a higher degree of base pair mismatch than can be generated under “highly stringent conditions”. . Examples of representative “moderately stringent conditions” are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 50-65 ° C., or 0.015
M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, and 20% formamide, 37-50 ° C. As an example, a “moderately stringent” condition of 50 ° C. in 0.015 M sodium ion tolerates a mismatch of about 21%.
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含ま
れる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いて蛋白質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
As used herein, the percentage of “identity”, “homology” and “similarity” of sequences (such as amino acids or nucleic acids) is determined by comparing two sequences that are optimally aligned in a comparison window. . Here, the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (a gap may occur if the other sequences contain additions, in the part of the polynucleotide or polypeptide sequence within the comparison window, Reference sequences herein shall contain no additions or deletions) and may include additions or deletions (ie gaps). Find the number of match positions by determining the number of positions where the same nucleobase or amino acid residue is found in both sequences, and divide the number of match positions by the total number of positions in the comparison window. Is multiplied by 100 to calculate the percent identity. When used in a search, homology is assessed using an appropriate one from a variety of sequence comparison algorithms and programs well known in the art. Such algorithms and programs include TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA and CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448, Altschul et al., 1990 ,. J. Mol.Biol.215 (3): 403-410, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.22 (2): 4673-4680, Higgins et al., 1996, Methods Enzymol.266: 383-402. , Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, Altschul et al., 1993. Nature Genetics 3: 266-272), but the like, is not intended to be limited to this. In a particularly preferred embodiment, the Basic Local Alignment Tool (BLAST) known in the prior art (eg, Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268, Altschul et al., 1990). J. Mol. Biol. 215: 403-410, Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266-272, Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res.25: 3389-3402). Used to assess protein and nucleic acid sequence homology. In particular, a comparison or search can be achieved by performing the following operations using five dedicated BLAST programs.
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列を蛋白質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物を蛋白質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮで蛋白質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
(1) Compare the amino acid query sequence with BLASTP and BLAST3 to the protein sequence database;
(2) Compare nucleotide query sequence with nucleotide sequence database at BLASTN;
(3) Comparison of a conceptual translation product obtained by converting a nucleotide query sequence (both strands) with BLASTX into six reading frames with a protein sequence database;
(4) Compare protein query sequence with TBLASTN to nucleotide sequence database converted in all six reading frames (both strands);
(5) Comparison of nucleotide query sequence converted by TBLASTX in 6 reading frames with nucleotide sequence database converted in 6 reading frames.
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくは蛋白質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。 The BLAST program identifies similar segments called "high score segment pairs" between an amino acid query sequence or nucleic acid query sequence and a test sequence, preferably obtained from a protein sequence database or nucleic acid sequence database Thus, a homologous sequence is identified. High score segment pairs are preferably identified (ie, aligned) by a scoring matrix well known in the art. Preferably, a BLOSUM62 matrix (Gonnet et al., 1992, Science 256: 1443-1445, Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins 17: 49-61) is used as the scoring matrix. Although not as preferred as this matrix, a PAM or PAM250 matrix can also be used (see, eg, Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrixes for Detection Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Stance and Stance. thing). The BLAST program evaluates the statistical significance of all identified high score segment pairs and preferably selects segments that meet a user-defined threshold level of significance, such as a user-specific homology rate. It is preferred to evaluate the statistical significance of high score segment pairs using Karlin's formula for statistical significance (see Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267-2268). thing).
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。 In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Such variants include one or several substitutions, additions and / or deletions, or one or more substitutions, additions and / or deletions relative to a reference nucleic acid molecule or polypeptide. But are not limited thereto. An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene. Such allelic variants usually have the same or very similar sequence as their corresponding alleles, usually have nearly the same biological activity, but rarely have different biological activities. May have. “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. “Ortholog” is also called an orthologous gene, which is a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, the human and mouse alpha hemoglobin genes are orthologs, but the human alpha and beta hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Orthologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees. Since orthologs can usually perform the same function as the original species in another species, the orthologs of the present invention can also be useful in the present invention.
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。 Similarly, “polynucleotide analog” or “nucleic acid analog” refers to a compound that is different from a polynucleotide or nucleic acid but is equivalent to at least one chemical or biological function of the polynucleotide or nucleic acid. . Thus, polynucleotide analogs or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives are added or substituted to the original peptide.
本明細書において使用される核酸配列は、元の核酸配列と実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。 As long as the nucleic acid sequence used in the present specification has substantially the same activity as the original nucleic acid sequence, even if a part of the nucleic acid sequence is deleted or replaced by another base as described above. Alternatively, other nucleic acid sequences may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 'end and / or the 3' end.
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。 Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.
本明細書において、ポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリヌクレオチドに対して、ヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。 In the present specification, “substitution, addition or deletion” of a polynucleotide means that a nucleotide or an alternative thereof is replaced, added or removed from the original polynucleotide. Such substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such number is a function (for example, information on hormones, cytokines) in a variant having the substitution, addition or deletion. As long as the transmission function is maintained, it can be increased. For example, such a number can be one or several, and preferably can be within 20%, within 10%, or less than 100, less than 50, less than 25, etc. of the total length.
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。 As used herein, “operably linked” refers to a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that has the expression (operation) of a desired sequence. That means. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
本明細書において使用する場合、用語「塩基対形成」とは、ＤＮＡの場合は、ＧとＣとの組み合わせ、または、ＡとＴとの組み合わせによる塩基対の形成、ＲＮＡの場合は、ＧとＣとの組み合わせ、または、ＡとＵとの組み合わせによる塩基対の形成をいう。 As used herein, the term “base pairing” refers to the formation of a base pair by a combination of G and C in the case of DNA, or a combination of A and T, and G in the case of RNA. This refers to the formation of base pairs by a combination with C or a combination of A and U.
本明細書において使用する場合、用語「塩基対形成を維持する置換」とは、塩基対を形成している２つの塩基の両方が置換され、その結果、置換後の２つの塩基が塩基対を形成する置換をいう。 As used herein, the term “substitution that maintains base pairing” refers to the replacement of both of the two bases that form a base pair, so that the two bases after the replacement have a base pair. The substitution that forms.
（一枚膜リポソームの製造）
本発明において使用する一枚膜リポソームは、実施例に記載する遠心沈降法を用いて調製することができるが、調製法は、これに限定されない。例えば、遠心沈降法の他にも、静置水和法（Ｐ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｔ．Ｆ．Ｃｈｉｅｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９８３，４４，３７５−３８１）、および、エレクトロフォーメーション法（Ｍｉｇｌｅｎａ Ｉ．Ａｎｇｅｌｏｖｅ ａｎｄ Ｄｉｍｉｔｅｒ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，８１，３０３−３１１）を利用することが可能である。
(Manufacture of single membrane liposome)
The single membrane liposome used in the present invention can be prepared using the centrifugal sedimentation method described in the Examples, but the preparation method is not limited thereto. For example, in addition to the centrifugal sedimentation method, static hydration method (P. Mueller and TF Chien, Biophys. J., 1983, 44, 375-381) and electroformation method (Migrena I. Angelove) and Dimiter S. Dimitrov, Faraday Discs. Chem. Soc., 1986, 81, 303-311).
静置水和法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）脂質を溶媒に溶かしフラスコ中で自然乾燥することにより、フラスコ表面に脂質膜を形成させる工程；および、（２）水溶液を添加し、脂質膜を膨潤させる工程。この第２工程によって、脂質膜が水溶液を取り込んだリポソームが浮き上がってくる。 The static hydration method is typically a method including the following steps: (1) a step of dissolving a lipid in a solvent and naturally drying in a flask to form a lipid film on the surface of the flask; (2) A step of adding an aqueous solution to swell the lipid membrane. By this second step, the liposome in which the lipid membrane has taken in the aqueous solution rises.
エレクトロフォーメーション法は、代表的には、以下の工程を包含する方法である：（１）導電性電極上に脂質溶液を塗布し、乾燥させて脂質フィルムを形成させる工程；（２）絶縁性スペーサーを介した反対側にも導電性電極を設置し、その間を水溶液で満たす工程；および、（３）二つの電極間に電界を印加することにより、脂質膜を電極から剥がして巨大薄膜リポソームを作製する工程。 The electro-formation method is typically a method including the following steps: (1) a step of applying a lipid solution on a conductive electrode and drying to form a lipid film; (2) an insulating spacer. A process of installing a conductive electrode on the opposite side of the electrode and filling it with an aqueous solution; and (3) applying an electric field between the two electrodes to peel the lipid membrane from the electrode to produce a giant thin film liposome Process.
本発明の一枚膜リポソームは、
（ａ）プロモーター配列、リボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を用いて作製することができる。このＤＮＡ配列は、好ましくは、５’側から順番に、プロモーター配列、リボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含む。リボスイッチ配列は、好ましくは、配列番号１からなるチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に応答するリボスイッチ配列またはその改変体、あるいは、配列番号２からなるテオフィリンに応答するリボスイッチ配列またはその改変体である。
The single membrane liposome of the present invention,
(A) DNA comprising a promoter sequence, a riboswitch sequence, a translation initiation sequence, and a polypeptide coding sequence;
(B) RNA polymerase;
(C) ribonucleotides; and
(D) a cell-free protein synthesis system,
Can be used. This DNA sequence preferably includes a promoter sequence, a riboswitch sequence, a translation initiation sequence, and a polypeptide coding sequence in this order from the 5 ′ side. The riboswitch sequence is preferably a riboswitch sequence responsive to thiamine pyrophosphate (TPP) consisting of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof, or a riboswitch sequence responsive to theophylline consisting of SEQ ID NO: 2 or a variant thereof. .
プロモーター配列は、使用するＲＮＡポリメラーゼと適合する限り、任意の配列を使用することができる。種々のプロモーター配列は周知であり、そして、必要とされる転写量に応じて、当業者は、適宜、適切なプロモーター配列を選択することができる。リボスイッチ配列は、「リボスイッチ配列が応答する化合物」に応じて、適宜、選択ないし作製することができる。例えば、「リボスイッチ配列が応答する化合物」がチアミンピロリン酸の場合、「リボスイッチ配列」は配列番号１からなる配列またはその改変体である。配列番号１からなる配列の改変体としては、以下の核酸配列からなる群から選択される核酸配列からなり、かつ、有意なリボスイッチ活性を有する核酸配列が挙げられる。
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列に対して、高度にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列。
The promoter sequence can be any sequence as long as it is compatible with the RNA polymerase used. Various promoter sequences are well known, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate promoter sequence depending on the amount of transcription required. The riboswitch sequence can be appropriately selected or prepared according to the “compound to which the riboswitch sequence responds”. For example, when the “compound to which the riboswitch sequence responds” is thiamine pyrophosphate, the “riboswitch sequence” is a sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof. The variant of the sequence consisting of SEQ ID NO: 1 includes a nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the following nucleic acid sequences and having significant riboswitch activity.
(I) a nucleic acid sequence that hybridizes to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
A nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
あるいは、上記（ｉｉｉ）において列挙した塩基対形成の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または、９つ、あるいは、それ以上が塩基対形成をしないように置換されていてもよい。 Alternatively, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or more of the base pairing listed in (iii) above is base pairing It may be substituted so that it does not form.
「リボスイッチ配列が応答する化合物」がテオフィリンの場合、「リボスイッチ配列」は配列番号２からなる配列またはその改変体である。配列番号２からなる配列の改変体としては、以下の核酸配列からなる群から選択される核酸配列からなり、かつ、有意なリボスイッチ活性を有する核酸配列が挙げられる。
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列に対して、高度にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列。
When the “compound to which the riboswitch sequence responds” is theophylline, the “riboswitch sequence” is a sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or a variant thereof. The variant of the sequence consisting of SEQ ID NO: 2 includes a nucleic acid sequence consisting of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the following nucleic acid sequences and having significant riboswitch activity.
(I) a nucleic acid sequence that hybridizes to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
A nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
あるいは、上記（ｉｉｉ）において列挙した塩基対形成の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または、９つ、あるいは、それ以上が塩基対形成をしないように置換されていてもよい。 Alternatively, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or more of the base pairing listed in (iii) above is base pairing It may be substituted so that it does not form.
翻訳開始配列は、無細胞蛋白質合成系と適合性である限り、任意の配列を選択することができる。種々の翻訳開始配列は周知であり、必要とされる翻訳量に応じて、当業者は、適宜、適切なプロモーター配列を選択することができる。 As the translation initiation sequence, any sequence can be selected as long as it is compatible with the cell-free protein synthesis system. Various translation initiation sequences are well known, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate promoter sequence depending on the amount of translation required.
任意の化合物に応答するリボスイッチ配列の設計法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられるがこれに限定されない。 Examples of a method for designing a riboswitch sequence that responds to an arbitrary compound include, but are not limited to, the methods described below.
（リボスイッチ配列の設計法）
所定の化合物に応答するリボスイッチ配列は、例えば、以下の手順で設計することが可能である。
（１）例えば、以下の手順で、インビトロ選択法またはＳＥＬＥＸ法により所定の化合物に結合するＲＮＡ配列を取得する：（ａ）２００塩基程度のランダムＲＮＡライブラリーを用意する；（ｂ）固相（ビーズやレジン）に標的化号物を固定化する；（ｃ）固相に結合したＲＮＡを選択する；（ｄ）得られたＲＮＡを増幅する；（ｅ）増幅したＲＮＡに変異導入し、複数種類のＲＮＡ分子のプールを調製する；（ｆ）工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し、所定の化合物に強く結合するＲＮＡを取得する。
（２）上記（１）で取得したＲＮＡを、実施例で使用したリボスイッチ配列のＴＰＰ結合配列と入れ替える。その際に導入した配列と、導入元の配列の接合部位は数塩基のリンカー配列を入れる。リンカー配列は異なる種類を検討し、最もよく応答する配列を選択する。
(Design method of riboswitch sequence)
A riboswitch sequence that responds to a given compound can be designed, for example, by the following procedure.
(1) For example, in the following procedure, an RNA sequence that binds to a predetermined compound is obtained by an in vitro selection method or a SELEX method: (a) a random RNA library of about 200 bases is prepared; (b) a solid phase ( (C) Select the RNA bound to the solid phase; (d) Amplify the resulting RNA; (e) Mutagenize the amplified RNA, multiple Prepare a pool of types of RNA molecules; (f) repeat steps (c) to (e) to obtain RNA that binds strongly to a given compound.
(2) The RNA obtained in (1) above is replaced with the TPP binding sequence of the riboswitch sequence used in the examples. A linker sequence of several bases is inserted at the junction between the introduced sequence and the original sequence. Consider different types of linker sequences and choose the sequence that responds best.
上記の手法に従い、例えば、環境中の有害物質を認識して応答するリボスイッチ配列を設計し、本発明においてＧＦＰ遺伝子とともに使用することによって、環境中の有害物質に応答して光るリポソームを開発することができる。これはバイオセンサーとして利用できる。あるいは、上記の手法に従い、例えば、リポソーム外部のグルコースに応答するリボスイッチ配列を設計し、血糖値の調整に寄与する酵素（例えば、グルコース分解酵素およびグルコース合成酵素）をコードする遺伝子とともに本発明のリポソームを製造し、そのリポソームを血中に投与した場合に血中のグルコースに応答することにより、血糖値が高い場合には血糖値の低減に寄与する酵素（例えば、グルコース分解酵素）を発現させ、逆に、血糖値が低い場合には血糖値の増加に寄与する酵素（例えば、グルコース合成酵素）を発現させることにより、血糖値を一定に保つことができる。 According to the above method, for example, a riboswitch sequence that recognizes and responds to harmful substances in the environment is designed, and used in the present invention with the GFP gene to develop liposomes that glow in response to harmful substances in the environment. be able to. This can be used as a biosensor. Alternatively, according to the above-described method, for example, a riboswitch sequence that responds to glucose outside the liposome is designed, and together with genes encoding enzymes (for example, glucose degrading enzyme and glucose synthase) that contribute to the adjustment of blood glucose level. When a liposome is produced and the liposome is administered into the blood, it responds to glucose in the blood to express an enzyme that contributes to the reduction of the blood glucose level (for example, glucose-degrading enzyme) when the blood glucose level is high. Conversely, when the blood sugar level is low, the blood sugar level can be kept constant by expressing an enzyme (for example, glucose synthase) that contributes to an increase in the blood sugar level.
本発明はまた、上記以外にも血中の特定化合物濃度の以上が原因となる疾患に応用可能である。具体的には、その特定の化合物に対するリボスイッチとその分解酵素、あるいは合成酵素をリポソームに組み込むことにより、特定の化合物の濃度が一定以上になった場合に酵素反応によって分解する、あるいは一定以下になった場合に合成することができる。 In addition to the above, the present invention can also be applied to diseases caused by the concentration of a specific compound in the blood. Specifically, by incorporating a riboswitch and its degrading enzyme or synthesizing enzyme for a specific compound into a liposome, it degrades by an enzymatic reaction when the concentration of the specific compound exceeds a certain level, or falls below a certain level. Can be synthesized.
たとえば、血中尿酸濃度が高くなりすぎることが原因である痛風に対しては、この方法で血中の尿酸濃度を基準値以下に保つことができる。他にも血中エストロゲン濃度低下により引き起こされる骨粗鬆症についても、この方法で一定濃度に保つことができる。 For example, for gout caused by excessively high blood uric acid concentration, the blood uric acid concentration can be kept below a reference value by this method. In addition, osteoporosis caused by a decrease in blood estrogen concentration can be maintained at a constant concentration by this method.
（リボスイッチ配列の活性の測定）
本発明のリボスイッチ配列は、リボスイッチ活性を有する。所定の化合物に応答するリボスイッチ配列の活性（リボスイッチ活性）は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。
(Measurement of riboswitch sequence activity)
The riboswitch sequence of the present invention has riboswitch activity. The activity of a riboswitch sequence (riboswitch activity) in response to a given compound can be measured, for example, by the following method.
５’から３’に、所定のプロモーター配列、リボスイッチ配列、および、レポーター遺伝子を順番に含むＤＮＡ構築物を作製する。リボスイッチ配列の代わりに、同じ長さのランダムＲＮＡ配列か、もしくはリボスイッチ配列を除いたＲＮＡをネガティブコントロール配列として利用することができる。コントロールＤＮＡ構築物として、５’から３’に、所定のプロモーター配列、上記のネガティブコントロール配列、および、レポーター遺伝子を順番に含むＤＮＡ構築物を作製する。また、レポーター遺伝子の替わりに、所望のアミノ酸配列のコード配列を使用してもよい。 A DNA construct containing a predetermined promoter sequence, riboswitch sequence, and reporter gene in order from 5 'to 3' is prepared. Instead of the riboswitch sequence, a random RNA sequence having the same length or RNA excluding the riboswitch sequence can be used as a negative control sequence. As a control DNA construct, a DNA construct comprising a predetermined promoter sequence, the negative control sequence described above, and a reporter gene in order from 5 'to 3' is prepared. Further, a coding sequence of a desired amino acid sequence may be used in place of the reporter gene.
所定の化合物の存在下および非存在下で、目的のＤＮＡ構築物またはコントロールＤＮＡ構築物のいずれかを、所定のプロモーター配列と適合性のＲＮＡポリメラーゼおよび無細胞蛋白質合成系と混合し、レポーター遺伝子からの遺伝子産物の翻訳が行なわれる条件下でインキュベートし、レポーター遺伝子からの遺伝子産物の発現量または活性を測定する。所定の化合物の存在下での遺伝子産物の発現量または活性を所定の化合物非存在下で正規化し、目的のＤＮＡ構築物の値と、コントロールＤＮＡ構築物での値を比較する。値の増加量が、２５％以上、５０％以上、１００％以上、１５０％以上、２００％以上、または、３００％以上の場合、好ましくは１００％以上の場合、用いたリボスイッチ配列は、有意なリボスイッチ活性を有すると判断される。 In the presence and absence of a given compound, either the target DNA construct or the control DNA construct is mixed with an RNA polymerase compatible with the given promoter sequence and a cell-free protein synthesis system, and the gene from the reporter gene Incubation is performed under conditions under which the product is translated, and the expression level or activity of the gene product from the reporter gene is measured. The expression level or activity of the gene product in the presence of the predetermined compound is normalized in the absence of the predetermined compound, and the value of the target DNA construct is compared with the value of the control DNA construct. When the increase in value is 25% or more, 50% or more, 100% or more, 150% or more, 200% or more, or 300% or more, preferably 100% or more, the riboswitch sequence used is significant. Riboswitch activity.
（ポジティブフィードバック回路による高応答性スイッチ）
上記の［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［レポーター遺伝子］とともに、ポジティブフィードバック回路、例えば、リボスイッチ配列上流のプロモーターからの転写を行なうポリメラーゼをコードする配列を、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［プロモーターからの転写を行なうポリメラーゼをコードする配列］を用いてもよい。この［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［プロモーターからの転写を行なうポリメラーゼをコードする配列］は、リボスイッチ配列の応答の結果、プロモーターからの転写を行なうポリメラーゼを発現させ、その結果、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［レポーター遺伝子］の応答のレベルが増加する。すなわち、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［プロモーターからの転写を行なうポリメラーゼをコードする配列］は、ポジティブフィードバック回路として作用し、リボスイッチ配列の応答を、より急激なものにする。このポジティブフィードバック回路のポリメラーゼとして好ましいポリメラーゼは、Ｔ３ポリメラーゼである。
(High-responsiveness switch with positive feedback circuit)
In addition to the above [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[reporter gene], a sequence encoding a polymerase that performs transcription from a positive feedback circuit, for example, a promoter upstream of the riboswitch sequence, is expressed as [promoter sequence]-[ribo Switch sequence]-[sequence encoding a polymerase that performs transcription from a promoter] may be used. This [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[sequence encoding a polymerase that performs transcription from the promoter] expresses a polymerase that performs transcription from the promoter as a result of the response of the riboswitch sequence. The level of response of the promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[reporter gene] is increased. That is, [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[sequence encoding polymerase that performs transcription from the promoter] acts as a positive feedback circuit, and makes the response of the riboswitch sequence more rapid. A preferred polymerase as the polymerase of this positive feedback circuit is T3 polymerase.
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
（実施例１：一枚膜リポソームの調製）
本発明において使用するリポソームは、例えば、以下の方法によって調製することが可能である。
・１０ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン：コレステロール＝９：１）を１００μｌクロロホルムに溶解し、２ｍｌの流動パラフィンと混合した。
・８０℃で３０分インキュベーションした。
・リポソーム外液（２００ｍＭ グルコース、無細胞翻訳系から翻訳タンパク質群とｔＲＮＡを除いたもの）、内液（２００ｍＭ スクロース、無細胞翻訳系、４０ Ｕ／μｕｌ ＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５〜５ Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１０ ｎＭ 鋳型ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター配列、リボスイッチ配列、ＧＦＰ遺伝子を含むＰＣＲ産物：「Ｔ７−ＲＳＷ−ＧＦＰ」と称する）、０．１〜４ｍＭ ＴＰＰ）を調製した。
・脂質を溶解した流動パラフィン４００μｌにリポソーム内液２０μｌを入れ、氷上で１分置いた。
・ボルテックスミキサーの最大強度で４０秒攪拌しエマルションを調整後、氷上で１０分置いた。
・新しいチューブにリポソーム外液１５０μｌをいれ、その上に調製したエマルションを積層し、氷上で１０分置いた。
・１４ｋ×ｇ、４℃で３０分遠心した。
・チューブの底に穴を開け、底に溜まったリポソーム懸濁液８０μｌを回収した。
・リポソーム懸濁液に２μｌの５Ｕ／μｌ ＤＮａｓｅ、あるいは４ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅを添加した。
・リポソーム懸濁液を３７℃で３〜２４時間インキュベーションした。
(Example 1: Preparation of single membrane liposome)
The liposome used in the present invention can be prepared, for example, by the following method.
10 mg lipid (phosphatidylcholine: cholesterol = 9: 1) was dissolved in 100 μl chloroform and mixed with 2 ml liquid paraffin.
Incubated at 80 ° C. for 30 minutes.
-Liposome outer solution (200 mM glucose, cell-free translation system minus translation protein group and tRNA), inner solution (200 mM sucrose, cell-free translation system, 40 U / μul RNase inhibitor (Promega), 0.5-5 U / μl T7 RNA polymerase, 10 nM template DNA (T7 promoter sequence, riboswitch sequence, PCR product containing GFP gene: referred to as “T7-RSW-GFP”, 0.1-4 mM TPP) was prepared.
-20 μl of liposome internal solution was placed in 400 μl of liquid paraffin in which lipid was dissolved, and placed on ice for 1 minute.
-After stirring for 40 seconds at the maximum intensity of a vortex mixer to prepare an emulsion, it was placed on ice for 10 minutes.
-Into a new tube, 150 μl of the liposome external solution was placed, and the prepared emulsion was layered thereon and placed on ice for 10 minutes.
-It centrifuged at 14kxg and 4 degreeC for 30 minutes.
-A hole was made in the bottom of the tube, and 80 μl of the liposome suspension accumulated in the bottom was collected.
-2 μl of 5 U / μl DNase or 4 mg / ml RNase was added to the liposome suspension.
The liposome suspension was incubated at 37 ° C. for 3-24 hours.
鋳型ＤＮＡ配列はプライマーとしてＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧ（配列番号７）とＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ（配列番号８）、鋳型としてプラスミドｐＥＴＧ５＿Ｔ３＿ｒｓｗ＿ＴＴＰ１（配列番号９）を用いたＰＣＲにより調製した。調製したＰＣＲ増幅産物は、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［ＧＦＰコード領域］を含む。 The template DNA sequence was prepared by PCR using ATCGGTGATGTCGGCGATATAG (SEQ ID NO: 7) and GCTAGTTATTGCTCCAGCGG (SEQ ID NO: 8) as a primer and plasmid pETG5_T3_rsw_TTP1 (SEQ ID NO: 9) as a template. The prepared PCR amplification product contains [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[GFP coding region].
使用した無細胞翻訳系（無細胞蛋白質合成系）の組成は、以下のとおりである：
各０．３ ｍＭ アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、システイン、チロシン）、３．６μｇ／μｌ ｔＲＮＡ、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、１４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ７．８）、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン、２０ｍＭ クレアチンリン酸、２ｍＭ ジチオスレイトール、１０ｎｇ／μｌ １０−ホルミル−５．６．７．８．−テトラヒドロ葉酸、翻訳タンパク質群（２５００ｎＭ ＩＦ１、４１１ｎＭ ＩＦ２、７２８ｎＭ ＩＦ３、２４７ｎＭ ＲＦ１、４８４ｎＭ ＲＦ２、１６８ｎＭ ＲＦ３、４８５ｎＭ ＲＲＦ、７２７ｎＭ ＡｌａＲＳ、９９ｎＭ ＡｒｇＲＳ、４２０ｎＭ ＡｓｎＲＳ、１２１ｎＭ ＡｓｐＲＳ、１００ｎＭ ＣｙｓＲＳ、１０１ｎＭ ＧｌｎＲＳ、２３２ｎＭ ＧｌｕＲＳ、８６ｎＭ ＧｌｙＲＳ、８５ｎＭ ＨｉｓＲＳ、３６５ｎＭ ＩｌｅＲＳ、９９ｎＭ ＬｅｕＲＳ、１１５ｎＭ ＬｙｓＲＳ、１０９ｎＭ ＭｅｔＲＳ、１３４ｎＭ ＰｈｅＲＳ、１６６ｎＭ ＰｒｏＲＳ、９９ｎＭ ＳｅｒＲＳ、８４ｎＭ ＴｈｒＲＳ、１０２ｎＭ ＴｒｐＲＳ、１０１ｎＭ ＴｙｒＲＳ、１００ｎＭ ＶａｌＲＳ、５８８ｎＭ ＭＴＦ、９２６ｎＭ ＭＫ、４６５ｎＭ ＣＫ、１３０７ｎＭ ＮＤＫ、６２１ｎＭ Ｐｐｉａｓｅ２、１２９０ｎＭ ＥＦ−Ｇ、２３１５ｎＭ ＥＦ−Ｔｕ、３３００ｎＭ ＥＦ−Ｔｓ、５２９ｎＭ Ｔｉｇ、２２ｎＭ ＨｒｐＡ、１４４０ｎＭ ＴｒｘＣ）。
The composition of the cell-free translation system (cell-free protein synthesis system) used is as follows:
0.3 mM amino acids (alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, serine, threonine, proline, tryptophan, phenylalanine, glutamine, glutamic acid, asparagine, aspartic acid, lysine, arginine, histidine, methionine, cysteine, tyrosine), 3 .6 μg / μl tRNA, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 14 mM magnesium acetate, 50 mM Hepes-KOH (pH 7.8), 100 mM potassium glutamate, 2 mM spermidine, 20 mM creatine phosphate, 2 mM dithiothreitol, 10 ng / Μl 10-formyl-5.5.6.7.8. -Tetrahydrofolate, translated proteins (2500 nM IF1, 411 nM IF2, 728 nM IF3, 247 nM RF1, 484 nM RF2, 168 nM RF3, 485 nM RRF, 727 nM AlaRS, 99 nM ArgRS, 420 nM AsnRS, RSnM GRSRS100n RSG 86 nM GlyRS, 85 nM HisRS, 365 nM IleRS, 99 nM LeuRS, 115 nM LysRS, 109 nM MetRS, 134 nM PheRS, 166 nM ProRS, 99 nM SerRS, 84 nM ThrRS, 102 nM TrpRS, 101 nM TrpRS, 101 nM TrpRS, 101 nM TrpRS 07nM NDK, 621nM Ppiase2,1290nM EF-G, 2315nM EF-Tu, 3300nM EF-Ts, 529nM Tig, 22nM HrpA, 1440nM TrxC).
（実施例２：ＧＦＰ活性の測定）
実施例１で調製したリポソームを含む溶液に、１ｍＭのＴＰＰ（チアミンピロリン酸）を添加し、３７℃で、２４時間インキュベートした後、リポソームを明視野および蛍光視野において観察した。結果を図２に示す。
(Example 2: Measurement of GFP activity)
1 mM TPP (thiamine pyrophosphate) was added to the solution containing the liposome prepared in Example 1 and incubated at 37 ° C. for 24 hours, and then the liposome was observed in a bright field and a fluorescent field. The results are shown in FIG.
図２の結果から明らかなように、ＴＰＰの添加によって、ＧＦＰの発現が誘導された。 As is clear from the results in FIG. 2, GFP expression was induced by the addition of TPP.
（実施例３：種々のプロモーター配列の比較）
実施例１において使用したＤＮＡ構築物におけるＴ７プロモーター配列（配列番号３）を、Ｔ５プロモーター配列（配列番号１０）、Ｓｐ６プロモーター配列（配列番号５）、または、Ｔ３プロモーター配列（配列番号６）のいずれかに置き換えたＤＮＡ構築物、Ｔ５−ＲＳＷ−ＧＦＰ、Ｓｐ６−ＲＳＷ−ＧＦＰ、および、Ｔ３−ＲＳＷ−ＧＦＰを作製し、１ｍＭのＴＰＰ（チアミンピロリン酸）を添加し、３７℃で、各時間インキュベートした後、蛍光輝度を蛍光光度計（ＡｇｉｌｅｎｔのＭｘ３００５Ｐ）によって測定した。その結果を図３に示す。図３において、「Ｔ７」はＴ７−ＲＳＷ−ＧＦＰを用いた結果であり、「Ｔ５」はＴ５−ＲＳＷ−ＧＦＰを用いた結果であり、「Ｓｐ６」はＳｐ６−ＲＳＷ−ＧＦＰを用いた結果であり、そして、「Ｔ３」はＴ３−ＲＳＷ−ＧＦＰを用いた結果である。
(Example 3: Comparison of various promoter sequences)
The T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3) in the DNA construct used in Example 1 is any of the T5 promoter sequence (SEQ ID NO: 10), the Sp6 promoter sequence (SEQ ID NO: 5), or the T3 promoter sequence (SEQ ID NO: 6). After constructing DNA constructs, T5-RSW-GFP, Sp6-RSW-GFP, and T3-RSW-GFP, adding 1 mM TPP (thiamine pyrophosphate) and incubating at 37 ° C. for each time The fluorescence intensity was measured with a fluorimeter (Agilent Mx3005P). The result is shown in FIG. In FIG. 3, “T7” is the result using T7-RSW-GFP, “T5” is the result using T5-RSW-GFP, and “Sp6” is the result using Sp6-RSW-GFP. Yes, and “T3” is the result using T3-RSW-GFP.
図３の結果から明らかなように、Ｔ３プロモーター配列を用いた場合には、他のプロモーター配列と比較して、ＴＰＰに対する応答が高レベルであった。 As is apparent from the results of FIG. 3, when the T3 promoter sequence was used, the response to TPP was at a high level compared to other promoter sequences.
（実施例４：ポジティブフィードバック回路による高応答性スイッチ）
実施例１では、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［ＧＦＰコード領域］を含むＰＣＲ増幅産物を調製して使用した。本実施例では、実施例１で調製したＰＣＲ産物のＧＦＰコード領域を、Ｔ３ポリメラーゼコード領域（配列番号１０）で置換したＰＣＲ産物を、実施例１で調製したＰＣＲ産物とともにリポソーム内に封入して用いる。
(Example 4: High-responsiveness switch using positive feedback circuit)
In Example 1, a PCR amplification product containing [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[GFP coding region] was prepared and used. In this example, the PCR product prepared by replacing the GFP coding region of the PCR product prepared in Example 1 with the T3 polymerase coding region (SEQ ID NO: 10) was encapsulated in a liposome together with the PCR product prepared in Example 1. Use.
実施例２と同様に、リポソーム外部にＴＰＰを添加してインキュベートすることによって、ＧＦＰとＴ３ポリメラーゼの両方の発現が誘導される。実施例２の実験では、Ｔ３ポリメラーゼの量が一定であることから、ＧＦＰが誘導される速度はほぼ一定であるが、本実施例の場合には、Ｔ３ポリメラーゼの発現も誘導されることから、ＧＦＰの誘導発現量が指数的に増加すると考えられる。実際、試験管内で（１）［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［ＧＦＰコード領域］のみの場合、と（２）［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［ＧＦＰコード領域］と、［プロモーター配列］−［リボスイッチ配列］−［Ｔ３ポリメラーゼコード領域］との組み合わせの場合、を比較したところ、（２）は（１）と比較して急激な蛍光の応答を示した。 As in Example 2, expression of both GFP and T3 polymerase is induced by adding TPP outside the liposome and incubating. In the experiment of Example 2, since the amount of T3 polymerase is constant, the rate at which GFP is induced is almost constant, but in this example, the expression of T3 polymerase is also induced. It is considered that the induced expression level of GFP increases exponentially. In fact, in the case of (1) [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[GFP coding region] alone in a test tube, and (2) [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[GFP coding region], When the combination of [promoter sequence]-[riboswitch sequence]-[T3 polymerase coding region] was compared, (2) showed a sharper fluorescence response than (1).
したがって、上記のようなポリメラーゼのポジティブフィードバック回路を用いることによって、高応答性スイッチを作製することが可能になる。 Therefore, a high-responsive switch can be produced by using the polymerase positive feedback circuit as described above.
本発明に従って、リポソーム内の組成を、リポソーム外部から制御することが可能となる。その結果、リポソーム内の微小区画での反応を、外界から制御することが可能となる。さらに、本発明に従い、リポソーム外界からの物質に応答して、レポーター遺伝子の発現を誘発するバイオセンサーを作製することも可能となる。この手法によって、例えば、環境中の有害物質を認識して光るリポソームを開発することができる。あるいは、本発明を用いて、生体内の環境に応答して、有効成分を発現する医薬の製造も可能となる。例えば、リポソームを血中に投与し、血中のグルコースに応答することにより、血糖値が高い場合にはグルコース分解酵素を発現させ、逆に血糖値が低い場合にはグルコース合成酵素を発現させることにより、血糖値を一定に保つことができる。 According to the present invention, the composition in the liposome can be controlled from the outside of the liposome. As a result, the reaction in the microcompartments in the liposome can be controlled from the outside. Furthermore, according to the present invention, a biosensor that induces expression of a reporter gene in response to a substance from the outside of the liposome can be produced. By this technique, for example, liposomes that recognize and recognize harmful substances in the environment can be developed. Alternatively, by using the present invention, it is possible to produce a medicine that expresses an active ingredient in response to an in vivo environment. For example, by administering liposomes into the blood and responding to glucose in the blood, glucose degrading enzymes are expressed when the blood glucose level is high, and conversely, glucose synthase is expressed when the blood glucose level is low Thus, the blood sugar level can be kept constant.
配列番号１：チアミンピロリン酸に応答するリボスイッチの核酸配列
配列番号２：テオフィリンに応答するリボスイッチの核酸配列
配列番号３：Ｔ７プロモーターの核酸配列
配列番号４：Ｔ５プロモーターの核酸配列
配列番号５：Ｓｐ６プロモーターの核酸配列
配列番号６：Ｔ３プロモーターの核酸配列
配列番号７：実施例１で使用したＰＣＲプライマーの核酸配列
配列番号８：実施例１で使用したＰＣＲプライマーの核酸配列
配列番号９：実施例１でＰＣＲの鋳型として使用したプラスミドの核酸配列
配列番号１０：実施例３で使用したＴ５プロモーターの核酸配列
配列番号１１：Ｔ３ポリメラーゼコード領域の核酸配列
配列番号１２：Ｔ３ポリメラーゼのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 1: Nucleic acid sequence of riboswitch in response to thiamine pyrophosphate SEQ ID NO: 2: Nucleic acid sequence of riboswitch in response to theophylline SEQ ID NO: 3: Nucleic acid sequence of T7 promoter SEQ ID NO: 4: Nucleic acid sequence of T5 promoter SEQ ID NO: 5 Sp6 promoter nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6: T3 promoter nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7: PCR primer nucleic acid sequence used in Example 1 SEQ ID NO: 8: PCR primer nucleic acid sequence used in Example 1 SEQ ID NO: 9: Example The nucleic acid sequence of the plasmid used as the template for PCR in SEQ ID NO: 10: the nucleic acid sequence of the T5 promoter used in Example 3 SEQ ID NO: 11: the nucleic acid sequence of the T3 polymerase coding region SEQ ID NO: 12: the amino acid sequence of T3 polymerase
Claims (17)
（ａ）プロモーター配列、リボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）リボヌクレオチド；ならびに、
（ｄ）無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。 Less than:
(A) DNA comprising a promoter sequence, a riboswitch sequence, a translation initiation sequence, and a polypeptide coding sequence;
(B) RNA polymerase;
(C) ribonucleotides; and
(D) a cell-free protein synthesis system,
Single-membrane liposomes.
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。 The riboswitch sequence is responsive to thiamine pyrophosphate, the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
The single membrane liposome according to claim 1, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。 The riboswitch sequence is a sequence that responds to theophylline and is:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
The single membrane liposome according to claim 1, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
（ｅ）前記（ａ）と同一のポリメラーゼによって転写される第２のプロモーター配列、前記（ａ）のリボスイッチ配列と同一の化合物に対して応答する第２のリボスイッチ配列、翻訳開始配列、および、前記（ａ）のプロモーター配列および該第２のプロモーター配列からの転写を行なうポリメラーゼのコード配列を含む第２のＤＮＡ
をさらに含む、請求項１に記載の一枚膜リポソーム。 further,
(E) a second promoter sequence transcribed by the same polymerase as in (a), a second riboswitch sequence that responds to the same compound as the riboswitch sequence in (a), a translation initiation sequence, and A second DNA comprising the promoter sequence of (a) and a coding sequence of a polymerase that performs transcription from the second promoter sequence
The single membrane liposome according to claim 1, further comprising:
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項８に記載の一枚膜リポソーム。 The riboswitch sequence of (a) is a sequence that responds to thiamine pyrophosphate, and the riboswitch sequence of the generation 2 is the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
The single membrane liposome according to claim 8, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項８に記載の一枚膜リポソーム。 The riboswitch sequence of (a) is a sequence that responds to theophylline, and the riboswitch sequence of the generation 2 is the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
The single membrane liposome according to claim 8, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
（１）請求項１または８に記載の一枚膜リポソームを提供する工程；および、
（２）前記リボスイッチ配列が応答する化合物と、該一枚膜リポソームとを接触させる工程；
を包含する、方法。 A method for changing the composition of a substance in a liposome, comprising:
(1) providing the single membrane liposome according to claim 1 or 8; and
(2) contacting the compound to which the riboswitch sequence is responsive with the single membrane liposome;
Including the method.
（ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と１４４位との間の塩基対形成、
３位と１４３位との間の塩基対形成、
４位と１４２位との間の塩基対形成、
５位と１４１位との間の塩基対形成、
６位と１４０位との間の塩基対形成、
７位と１３９位との間の塩基対形成、
８位と１３８位との間の塩基対形成、
９位と１３７位との間の塩基対形成、
１０位と１３６位との間の塩基対形成、
１５位と１３１位との間の塩基対形成、
１６位と１３０位との間の塩基対形成、
１７位と１２９位との間の塩基対形成、
１８位と１２８位との間の塩基対形成、
１９位と１２７位との間の塩基対形成、
２０位と１２６位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と１２４位との間の塩基対形成、
５０位と８６位との間の塩基対形成、
５１位と８５位との間の塩基対形成、
５２位と８４位との間の塩基対形成、
５３位と８３位との間の塩基対形成、
５４位と８２位との間の塩基対形成、
５５位と８０位との間の塩基対形成、
５６位と７３位との間の塩基対形成、
５７位と７２位との間の塩基対形成、
５８位と７１位との間の塩基対形成、
６０位と６９位との間の塩基対形成、
９２位と１１７位との間の塩基対形成、
９３位と１１６位との間の塩基対形成、
９４位と１１５位との間の塩基対形成、
９８位と１１１位との間の塩基対形成、
９９位と１１０位との間の塩基対形成、
１００位と１０９位との間の塩基対形成、および、
１０１位と１０８位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１１に記載の方法。 The riboswitch sequence is responsive to thiamine pyrophosphate, the following:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(Iii) a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 144,
Base pairing between positions 3 and 143,
Base pairing between positions 4 and 142,
Base pairing between positions 5 and 141,
Base pairing between positions 6 and 140,
Base pairing between positions 7 and 139,
Base pairing between positions 8 and 138,
Base pairing between positions 9 and 137,
Base pairing between positions 10 and 136,
Base pairing between positions 15 and 131,
Base pairing between positions 16 and 130;
Base pairing between positions 17 and 129,
Base pairing between positions 18 and 128,
Base pairing between positions 19 and 127,
Base pairing between positions 20 and 126,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 124,
Base pairing between positions 50 and 86,
Base pairing between positions 51 and 85,
Base pairing between positions 52 and 84,
Base pairing between positions 53 and 83,
Base pairing between positions 54 and 82,
Base pairing between positions 55 and 80,
Base pairing between positions 56 and 73;
Base pairing between positions 57 and 72,
Base pairing between positions 58 and 71,
Base pairing between positions 60 and 69,
Base pairing between positions 92 and 117,
Base pairing between positions 93 and 116,
Base pairing between positions 94 and 115;
Base pairing between positions 98 and 111,
Base pairing between positions 99 and 110,
Base pairing between positions 100 and 109, and
Base pairing between positions 101 and 108,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
12. The method according to claim 11, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
（ｉ）配列番号２に記載の核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の核酸配列において、１または数個の欠失、付加、または、置換を有する核酸配列であって、ここで、
２位と９７位との間の塩基対形成、
３位と９６位との間の塩基対形成、
４位と９５位との間の塩基対形成、
５位と９４位との間の塩基対形成、
６位と９３位との間の塩基対形成、
７位と９２位との間の塩基対形成、
８位と９１位との間の塩基対形成、
９位と９０位との間の塩基対形成、
１０位と８９位との間の塩基対形成、
１５位と８４位との間の塩基対形成、
１６位と８３位との間の塩基対形成、
１７位と８２位との間の塩基対形成、
１８位と８１位との間の塩基対形成、
１９位と８０位との間の塩基対形成、
２０位と７９位との間の塩基対形成、
２８位と４１位との間の塩基対形成、
２９位と４０位との間の塩基対形成、
３０位と３９位との間の塩基対形成、
３１位と３８位との間の塩基対形成、
４５位と７７位との間の塩基対形成、
４７位と７５位との間の塩基対形成、
４８位と７４位との間の塩基対形成、
５２位と７０位との間の塩基対形成、
５３位と６９位との間の塩基対形成、
５４位と６８位との間の塩基対形成、
５５位と６４位との間の塩基対形成、
５６位と６３位との間の塩基対形成、
５７位と６２位との間の塩基対形成、
が維持される核酸配列；ならびに、
（ｉｖ）配列番号２に記載の核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１１に記載の方法。 The riboswitch sequence is a sequence that responds to theophylline and is:
(I) the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Ii) a nucleic acid sequence having one or several deletions, additions or substitutions in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(Iii) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 having one or several deletions, additions or substitutions, wherein
Base pairing between positions 2 and 97,
Base pairing between positions 3 and 96,
Base pairing between positions 4 and 95,
Base pairing between positions 5 and 94,
Base pairing between positions 6 and 93,
Base pairing between positions 7 and 92,
Base pairing between positions 8 and 91,
Base pairing between positions 9 and 90,
Base pairing between positions 10 and 89,
Base pairing between positions 15 and 84,
Base pairing between positions 16 and 83,
Base pairing between positions 17 and 82,
Base pairing between positions 18 and 81,
Base pairing between positions 19 and 80,
Base pairing between positions 20 and 79,
Base pairing between positions 28 and 41,
Base pairing between positions 29 and 40,
Base pairing between positions 30 and 39,
Base pairing between positions 31 and 38,
Base pairing between positions 45 and 77,
Base pairing between positions 47 and 75,
Base pairing between positions 48 and 74,
Base pairing between positions 52 and 70,
Base pairing between positions 53 and 69,
Base pairing between positions 54 and 68,
Base pairing between positions 55 and 64,
Base pairing between positions 56 and 63;
Base pairing between positions 57 and 62,
A nucleic acid sequence in which is maintained; and
(Iv) a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
12. The method according to claim 11, comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:
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