JP2011103864A - Gene encoding protein having deoxynivalenol and nivalenol decomposing activity - Google Patents

Gene encoding protein having deoxynivalenol and nivalenol decomposing activity Download PDF

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Seiya Tsushima
誠也 對馬
Michihiro Ito
通浩 伊藤
Motoo Koitabashi
基夫 小板橋
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a P450 protein having deoxynivalenol and nivalenol decomposing activity and a gene encoding the protein. <P>SOLUTION: There are disclosed: a deoxynivalenol and/or nivalenol decomposing enzyme protein having an amino acid sequence comprising a specific amino acid sequence or an amino acid sequence in which one or more amino acids in the specific amino acid sequence are deleted, substituted or added and encoding an amino acid sequence having deoxynivalenol and/or nivalenol decomposing activity; and a deoxynivalenol and/or nivalenol decomposing enzyme gene including a specific base sequence or a base sequence in which one or more bases in the specific base sequence are deleted, substituted or added. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、デオキシニバレノール及びニバレノール分解活性を有するタンパク質、及びデオキシニバレノール及びニバレノール分解活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子に関する。   The present invention relates to a protein having deoxynivalenol and nivalenol degrading activity, and a novel gene encoding deoxynivalenol and a protein having nivalenol degrading activity.

かび毒は、ある種のかびが農作物に付着・増殖し、そこで産生する化学物質(天然毒素)のうち、人や家畜の健康に悪影響を及ぼすものの総称であり、現在300種類以上あるといわれている。代表的なかび毒として、アフラトキシン(ナッツ類、穀類)、デオキシニバレノール(穀類)、パツリン(りんご加工品)、オクラトキシンA(穀類、豆類)などがある。このうちわが国では平成20年8月現在、アフラトキシンB1(農作物を含む一般の食品)、デオキシニバレノール(小麦)、パツリン(リンゴ果汁)が食品衛生法に基づく規制の対象となっている。   Mold fungus is a general term for chemical substances (natural toxins) produced by certain types of molds that adhere to and grow on crops, and that have a negative impact on human and livestock health. Yes. Typical mold poisons include aflatoxins (nuts, cereals), deoxynivalenol (cereals), patulin (processed apples), ochratoxin A (cereals, beans) and the like. In Japan, as of August 2008, aflatoxin B1 (general foods including agricultural products), deoxynivalenol (wheat), and patulin (apple juice) are subject to regulation under the Food Sanitation Law.

ムギ類を始めとする穀類に広く感染する赤かび病菌Fusarium graminearumが産生するデオキシニバレノール(以下DONと略称することがある。)、ニバレノール、T−2トキシンは、トリコテセン系マイコトキシンであり、ムギ生産地帯で大きな問題となっている。中でもデオキシニバレノールは、各国のムギ生産地帯で発生しているマイコトキシン汚染の主要因であり、摂取すると嘔吐、下痢などの急性中毒を引き起こすことから、世界的に本毒素の対策が喫緊の課題となっている。我が国でも平成14年5月に、厚生労働省においてコムギ粒の暫定基準濃度が1.1ppm以下と定められた。   Deoxynivalenol (hereinafter sometimes abbreviated as DON) produced by Fusarium graminearum, which is widely infected with cereals such as wheat, nivalenol and T-2 toxin are trichothecene-based mycotoxins, It has become a big problem. Among them, deoxynivalenol is a major cause of mycotoxin contamination occurring in wheat production areas in each country, and when ingested, it causes acute poisoning such as vomiting and diarrhea, so countermeasures against this toxin have become an urgent issue worldwide. ing. In Japan, in May 2002, the Ministry of Health, Labor and Welfare established that the provisional standard concentration of wheat grains was 1.1 ppm or less.

従来この対策としては、化学的手法により赤かび病菌を制御する方法が用いられてきた。また近年は植物体に残存する化学農薬の危険性が指摘されることから、微生物農薬がより安心で安全な植物病害防除剤として注目されている(例えば、特許文献1及び特許文献2を参照)。またバチルス・ズブチリスに属する菌株が産生するアイツリンAのフザリウムに対する増殖抑制効果を利用し、当該菌株の培養液で農産物を処理する方法が提案されている(特許文献3を参照。)。   Conventionally, as a countermeasure, a method for controlling red mold fungus by a chemical method has been used. In recent years, since the danger of chemical pesticides remaining in plants is pointed out, microbial pesticides have attracted attention as safer and safer plant disease control agents (see, for example, Patent Document 1 and Patent Document 2). . Moreover, the method of processing agricultural products with the culture solution of the said strain using the growth inhibitory effect with respect to the fusarium of Aitulin A which the strain which belongs to a Bacillus subtilis produces is proposed (refer patent document 3).

しかしデオキシニバレノールはトリコテセン骨格の構造を有し、121℃ 20分の加圧高温処理に対しても安定である。そのため、一旦赤かび病菌が発生した植物体においては、赤かび病を殺菌剤等で防除した後であっても、罹病した植物体の穂等に残存する。さらにデオキシニバレノールの特徴として、赤かび病が感染した植物体においては、発病したムギ粒等だけではなく、無病徴のムギ粒等にも蓄積される。このため、発病の有無にかかわらず、赤かび病菌汚染にされたムギ粒に蓄積されたデオキシニバレノールを低減する技術が求められている。   However, deoxynivalenol has a trichothecene skeleton structure and is stable to high pressure treatment at 121 ° C. for 20 minutes. For this reason, in plants that have once had mold rot, they remain on the ears of the afflicted plants even after controlling mold rot. Furthermore, as a characteristic of deoxynivalenol, in plants infected with head blight, it accumulates not only in diseased wheat grains but also in disease-free wheat grains. Therefore, there is a need for a technique for reducing deoxynivalenol accumulated in wheat grains contaminated with Fusarium head blight, regardless of whether or not the disease has occurred.

そのためにデオキシニバレノールを直接除去する方法として、食品のレベルで物理的吸着により不活性化または排除する、家畜が食べてもそのまま排泄可能なカビ毒吸着剤(特許文献4を参照。)や、マイコトキシンを吸着除去する金属酸化物粒子複合体(特許文献5を参照。)が提案されている。   Therefore, as a method for directly removing deoxynivalenol, a fungus toxin adsorbent that is inactivated or eliminated by physical adsorption at the food level and can be excreted as it is eaten by livestock (see Patent Document 4), or mycotoxin Has been proposed (see Patent Document 5).

一方で、食品となる以前に、直接穀物等に付着したデオキシニバレノールを除去することが望まれており、デオキシニバレノール分解微生物の探索が進められている。デオキシニバレノール分解微生物としては、現在のところ、土壌から分離されたグラム陰性菌Agrobacterium-RhizobiumグループのE3-39株(非特許文献1を参照。)、嫌気性細菌BBSH797(非特許文献2を参照。)、ムギ根圏土壌から分離されたDevosia属細菌に近縁のRS1株(特許文献6を参照。)、ムギ根圏土壌から分離されたNocardioides属に属するWSN05-2株、LS1株、SS1株及びSS2株(特許文献7を参照。)が報告されている。しかしながら、これまでにデオキシニバレノールの分解活性を有するタンパク質、及びデオキシニバレノール分解酵素をコードする遺伝子がデオキシニバレノール分解細菌株から同定された事例は皆無である。   On the other hand, it is desired to remove deoxynivalenol directly attached to cereals and the like before becoming a food, and the search for deoxynivalenol-degrading microorganisms is in progress. As deoxynivalenol-degrading microorganisms, currently, the E3-39 strain of the Agrobacterium-Rhizobium group (see Non-Patent Document 1), anaerobic bacterium BBSH797 (see Non-Patent Document 2) isolated from soil. ), RS1 strains closely related to Devosia bacteria isolated from wheat rhizosphere soil (see Patent Document 6), WSN05-2, LS1 and SS1 strains belonging to the genus Nocardioides isolated from wheat rhizosphere soil And the SS2 strain (see Patent Document 7) have been reported. However, there has never been a case where a protein having deoxynivalenol-degrading activity and a gene encoding deoxynivalenol-degrading enzyme have been identified from deoxynivalenol-degrading bacterial strains.

特開2003−206212号公報JP 2003-206212 A 特開2003−192515号公報JP 2003-192515 A 特開平5−85911号公報JP-A-5-85911 特表2002−512011号公報Japanese translation of PCT publication No. 2002-512011 特表2004−500214号公報Special table 2004-500214 gazette 特開2008−220179号公報JP 2008-220179 A 特開2008−220184号公報JP 2008-220184 A

Shima J. et. al (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63:3825-3830Shima J. et. Al (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 3825-3830 FuchsE. et al (2002) Food Additives and Contaminants., 19: 379-386FuchsE. Et al (2002) Food Additives and Contaminants., 19: 379-386

本発明は、デオキシニバレノール及びニバレノールを分解する活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide deoxynivalenol, a protein having an activity of degrading nivalenol, and a gene encoding the protein.

本発明者らは、霞ヶ浦湖水に生息する微生物の中から、デオキシニバレノール及びニバレノールを効率よく分解することができる菌株を見出し、該菌株よりデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。   The present inventors have found a strain capable of degrading deoxynivalenol and nivalenol efficiently from microorganisms inhabiting Lake Kasumigaura, and succeeded in cloning a gene encoding deoxynivalenol and nivalenol degrading enzyme from the strain. The present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.

<1> 下記(A)乃至(C)のいずれかのアミノ酸配列を含むデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素タンパク質である。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
(C)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
<2> また本発明は、下記(A)乃至(C)のいずれかのアミノ酸配列をコードするデオキシニバレノール及び/又は分解酵素遺伝子である。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
(C)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
<3> さらに本発明は下記(D)乃至(F)のいずれかの塩基配列を含むデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素遺伝子である。
(D)配列番号1で表される塩基配列。
(E)配列番号1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列であって、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(F)配列番号1に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
<4> さらに本発明は前記の遺伝子を含む組み換えベクターである。
<5> さらに本発明は前記の遺伝子を含む形質転換体である。
<6> さらに本発明は前記の組換えベクターを用いる形質転換体である。
<7> さらに本発明は前記の形質転換体を用いるデオキシニバレノール及びニバレノールの分解方法である。
<1> A deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme protein comprising any one of the following amino acid sequences (A) to (C):
(A) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of deoxynivalenol and / or nivalenol degradation.
(C) an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having deoxynivalenol and / or nivalenol degradation activity.
<2> The present invention also relates to a deoxynivalenol and / or degrading enzyme gene encoding any one of the following amino acid sequences (A) to (C).
(A) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of deoxynivalenol and / or nivalenol degradation.
(C) an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having deoxynivalenol and / or nivalenol degradation activity.
<3> Furthermore, the present invention is a deoxynivalenol and / or nivalenol degrading enzyme gene comprising any one of the following base sequences (D) to (F).
(D) The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(E) A base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and encodes a protein having deoxynivalenol and / or nivalenol degrading activity.
(F) A nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading activity.
<4> Furthermore, the present invention is a recombinant vector containing the gene.
<5> Furthermore, this invention is a transformant containing the said gene.
<6> Furthermore, the present invention is a transformant using the above recombinant vector.
<7> Furthermore, the present invention is a method for deoxynivalenol and nivalenol decomposition using the transformant.

本発明において、熱に安定で、難分解性であるデオキシニバレノール及びニバレノールを分解するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。   The present invention provides deoxynivalenol and a protein that degrades nivalenol, which are heat-stable and hardly degradable, and a gene that encodes the protein.

pKSM1007を保持するUT26株によるDONの分解を示すDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラム図である。FIG. 2 is an HPLC chromatogram of a DON degradation activity assay HPLC sample showing degradation of DON by UT26 strain carrying pKSM1007. pKSM1007の挿入DNA断片に存在するDON分解酵素遺伝子の同定を示す。The identification of the DON degrading enzyme gene present in the inserted DNA fragment of pKSM1007 is shown. 配列番号1(ORF7)の遺伝子を導入したUT26株によるDONの分解を示すDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラム図である。It is a HPLC chromatogram figure of a DON degradation activity assay HPLC sample which shows degradation of DON by UT26 strain which introduce | transduced the gene of sequence number 1 (ORF7). 配列番号1(ORF7)の遺伝子を導入したUT26株によるNIVの分解を示すNIV分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラム図である。It is a HPLC chromatogram figure of the NIV decomposition | disassembly activity assay HPLC sample which shows decomposition | disassembly of NIV by UT26 stock | strain which introduce | transduced the gene of sequence number 1 (ORF7). 配列番号1の開始コドン付近の塩基配列を示す。The base sequence near the start codon of SEQ ID NO: 1 is shown. 配列番号2のアミノ酸配列に比較的近縁なP450酵素群と配列番号2の系統樹を示す。A P450 enzyme group relatively close to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a phylogenetic tree of SEQ ID NO: 2 are shown.

本発明は、Sphingobium sp. に近縁の新規微生物KSM1菌株に由来する配列番号1に示されるデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素遺伝子、及び配列番号2に示されるデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素に関するものである。以下本発明について詳説する。   The present invention relates to a deoxynivalenol and nivalenol degrading enzyme gene represented by SEQ ID NO: 1 derived from a novel microorganism KSM1 strain closely related to Sphingobium sp., And a deoxynivalenol and nivalenol degrading enzyme represented by SEQ ID NO: 2. The present invention is described in detail below.

<本発明に係る遺伝子について>
本発明は、デオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素をコードする配列番号1に示される遺伝子である。配列番号1に示す塩基配列は、前記新規微生物KSM1株由来のデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素遺伝子の開始コドンから終始コドンまでの、いわゆるオープンリーディングフレーム(以下ORFとする。)である。
<About the gene according to the present invention>
The present invention is the gene shown in SEQ ID NO: 1 encoding deoxynivalenol and nivalenol-degrading enzyme. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a so-called open reading frame (hereinafter referred to as ORF) from the start codon to the end codon of the deoxynivalenol and nivalenol degrading enzyme genes derived from the novel microorganism KSM1 strain.

本発明に係るデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素遺伝子は好ましくは、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなるORFであるが、この部分に相当する部分が含まれる限り、いずれの遺伝子であってもよい。配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドは、該新規微生物KSM1株(受領番号FERMAP-21835)のゲノミックDNAから取得できる。   The deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme gene according to the present invention is preferably an ORF consisting of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but any gene may be used as long as a part corresponding to this part is included. There may be. A polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be obtained from the genomic DNA of the novel microorganism KSM1 strain (reception number FERMAP-21835).

本発明はまた、配列番号2に記載のデオキシニバレノール及びニバレノールを分解するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ここで「デオキシニバレノール及びニバレノールを分解するタンパク質と機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が配列番号2に記載のタンパク質と同等の生物学的機能、即ちデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解代謝を触媒する機能を有することを指す。   The present invention also includes a gene encoding a protein functionally equivalent to the protein degrading deoxynivalenol and nivalenol described in SEQ ID NO: 2. Here, “functionally equivalent to deoxynivalenol and a protein that degrades nivalenol” means that the target protein has a biological function equivalent to that of the protein described in SEQ ID NO: 2, ie, deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading metabolism. It has the function to catalyze.

本発明の遺伝子には、例えば、配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアント及びホモログが含まれる。   Examples of the gene of the present invention include mutants, derivatives, and the like that encode proteins consisting of amino acid sequences in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Alleles, variants and homologs are included.

アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする遺伝子を調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば「Kramer, W.&Fritz,H.-J. Methods in Enzymology, 154: 350-367(1987)」に記載されている、部位特異的突然変異誘発(site-directedmutagenesis)法が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型の本発明のデオキシニバレノール分解酵素(配列番号2)をコードする遺伝子においても、または該天然型デオキシニバレノール分解酵素に1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても、天然型のアミノ酸配列と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。   Methods well known to those skilled in the art for preparing genes encoding proteins with altered amino acid sequences include, for example, “Kramer, W. & Fritz, H.-J.Methods in Enzymology, 154: 350-367 ( 1987) ”, the site-directed mutagenesis method. In addition, the amino acid sequence of the encoded protein may be mutated in nature due to the mutation of the base sequence. Thus, also in the gene encoding the natural deoxynivalenol-degrading enzyme (SEQ ID NO: 2) of the present invention, or the amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added to the natural deoxynivalenol-degrading enzyme As long as it encodes a protein having a function equivalent to that of a natural amino acid sequence, it is included in the gene of the present invention.

また、たとえ塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合(縮重変異)もあり、このような縮重変異体も本発明の遺伝子に含まれる。対象となる遺伝子を構成するDNAの塩基の変異数は、アミノ酸レベルにおいて、100アミノ酸以内、好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは20アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内である。   Moreover, even if the base sequence is mutated, it may not be accompanied by a mutation of an amino acid in the protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant is also included in the gene of the present invention. The number of mutations in the base of DNA constituting the gene of interest is within 100 amino acids, preferably within 50 amino acids, more preferably within 20 amino acids, and even more preferably within 10 amino acids at the amino acid level.

上記遺伝子を獲得する方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法が採用される。例えば、当該遺伝子を、それを有する生物のゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明のデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素遺伝子には、ゲノムDNA及び化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、対象生物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作成し、これを展開して、本発明のタンパク質をコードするDNA(配列番号1)を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。   The method for obtaining the gene is not particularly limited, and a general method is employed. For example, the gene may be excised from a genomic DNA or a genomic DNA library of an organism having the gene with an appropriate restriction enzyme and purified. That is, the deoxynivalenol and / or nivalenol degrading enzyme gene of the present invention includes genomic DNA and chemically synthesized DNA. Genomic DNA can be prepared by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from the target organism, a genomic library (plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used as vectors) is developed and expanded, It can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on DNA encoding the protein (SEQ ID NO: 1).

また、本発明のデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素をコードするDNA(配列番号1)に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。   It is also possible to prepare a primer specific for the DNA (SEQ ID NO: 1) encoding the deoxynivalenol and nivalenol-degrading enzyme of the present invention and perform PCR using this primer.

なお、デオキシニバレノール分解活性を有する微生物(特許文献6、特許文献7、非特許文献1、非特許文献2)に上記遺伝子を保有する可能性が考えられるが、これらの中でも特にKSM1株を用いれば、より確実に目的の遺伝子を単離することができる。   In addition, there is a possibility that microorganisms having deoxynivalenol-degrading activity (Patent Document 6, Patent Document 7, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2) may possess the above gene. Among these, the KSM1 strain is particularly used. Thus, the target gene can be isolated more reliably.

次に本発明のデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素遺伝子の獲得方法について説明する。具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている微生物から本発明のデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素遺伝子を獲得する場合には、上記ポリヌクレオチドの塩基配列(配列番号1)に基づいて相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるBLASTNによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。   Next, a method for obtaining the deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme gene of the present invention will be described. Specifically, when the deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme gene of the present invention is obtained from a microorganism in which at least a part of the genome is databased, it is based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the polynucleotide. The base sequence having homology can be searched from the database. For example, a base sequence homology search using BLASTN, which is a widely used homology search algorithm, can be preferably used.

また、ゲノムがデータベース化されていない微生物の場合には、例えば、従来公知のDNAライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニングベクターを使用して対象となる微生物からゲノムライブラリーを調製する工程と、上記ポリヌクレオチドの少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明に係る遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、目的とする遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポリヌクレオチドの長さは、100bp以上が好ましい。   In the case of a microorganism whose genome is not databased, for example, a conventionally known hybridization method using a DNA library can also be used. Specifically, a step of preparing a genomic library from a target microorganism using an appropriate cloning vector, and hybridization using at least a part of the polynucleotide as a probe, from the library to the probe. And a method comprising detecting a positive fragment. Thus, the gene according to the present invention is also useful as a probe. The region used for the probe preferably contains a sequence specific to the target gene. The length of the polynucleotide used as the probe is preferably 100 bp or more.

より具体的には、配列番号2に記載のデオキシニバレノール及びニバレノール分解酵素と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法としては、「Southern,E.M. Journal of Molecular Biology, 98, 503(1975)」に記載のハイブリダイゼーション技術や、「Saiki, R.K. et al. Science, 230, 1350-1354(1985)、Saiki, R. K. et al. Science, 239,487-491(1988)」に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を利用する方法が挙げられる。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる本発明のデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた本発明の遺伝子に含まれる。   More specifically, in order to prepare a gene encoding a protein functionally equivalent to deoxynivalenol and nivalenol-degrading enzyme shown in SEQ ID NO: 2, methods well known to those skilled in the art include “Southern, EM Journal of Molecular Biology, 98, 503 (1975) '', `` Saiki, RK et al. Science, 230, 1350-1354 (1985), Saiki, RK et al. Science, 239,487-491 ( 1988) ”, and a method using the polymerase chain reaction (PCR) technique. A gene encoding a protein having a function equivalent to that of the deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme of the present invention that can be isolated by the hybridization technique or the PCR technique is also included in the gene of the present invention.

このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、上記のように0.2%SDS、0.2x SSC、65℃の条件またはこれと同等以上のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション/洗浄条件を指し、例えば、0.2% SDS、0.1x SSC、65℃の条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の効率的な単離を期待することができる。   In order to isolate such a gene, the hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions. In the present invention, stringent hybridization conditions refer to hybridization / washing conditions of 0.2% SDS, 0.2 × SSC, 65 ° C. or stringency that is equal to or higher than the above, for example, 0.2% SDS. If the conditions of 0.1 × SSC and 65 ° C. are used, efficient isolation of genes with higher homology can be expected.

前記により単離された遺伝子は、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、本発明のタンパク質のアミノ酸配列(配列番号2)と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも70%以上、さらに好ましくは80%以上、の配列の同一性を指す。配列の同一性は、FASTA検索(Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2444-2448)やBLASTP検索により決定することができる。   The gene isolated as described above is considered to have high homology with the amino acid sequence of the protein of the present invention (SEQ ID NO: 2) at the amino acid level encoded by the gene. High homology refers to sequence identity of at least 70% or more, more preferably 80% or more in the entire amino acid sequence. Sequence identity can be determined by FASTA search (Pearson W.R. and D.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444-2448) or BLASTP search.

<本発明に係るタンパク質について>
本発明に係るタンパク質は、上記遺伝子によってコードされる配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素の活性を有するタンパク質、もしくは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで80%以上、更に好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性を示し、かつ、デオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素の活性を有するタンパク質である。
<About the protein according to the present invention>
The protein according to the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 encoded by the above gene or a deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 80% or more, more preferably 90% at the amino acid level of a protein having a deoxynivalenol and / or nivalenol-degrading enzyme activity, or a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 As described above, it is particularly preferably a protein having a homology of 95% or more and having the activity of deoxynivalenol and / or nivalenol degrading enzyme.

また、本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のHAやFlag等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、N-グリコシル化などの各種修飾を受けていてもよい。   In addition, the protein according to the present invention may contain a known additional sequence such as HA or Flag at the end or may be a fusion protein in order to easily purify and detect the protein. Further, it may be subjected to various modifications such as N-glycosylation.

本発明による組換えベクターは、上記遺伝子が組み込まれたものである。上記ベクターは、公知の形質転換方法によって宿主に発現可能に導入されることによって、当該宿主において組み込まれた遺伝子あるいは遺伝子断片を発現させて本発明によるタンパク質を得ることが出来るものである。なお、本発明によるタンパク質は下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、微生物から単離、精製したものでもよく、その起源は特に限定されない。   The recombinant vector according to the present invention has the above gene incorporated therein. The above-described vector can be expressed into a host by a known transformation method so that the gene or gene fragment incorporated in the host can be expressed to obtain the protein according to the present invention. The protein according to the present invention may be obtained by recombinant production as described below, or may be isolated and purified from a microorganism, and its origin is not particularly limited.

組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。   When preparing a recombinant protein, the gene encoding the protein of the present invention is usually inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate host cell, and the transformed host cell is cultured and expressed. Purify the protein. The recombinant protein can be expressed as a fusion protein with another protein for the purpose of facilitating purification or the like.

例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法(米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法(AmershamPharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ)、ヒスチジンタグを付加して調製する方法(Novagen社のpETシリーズ)などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母等の真菌細胞、種々の動植物細胞などを用いることが可能である。   For example, a method of preparing a fusion protein with maltose binding protein using E. coli as a host (vector pMAL series released by New England BioLabs, USA), a method of preparing a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) (AmershamPharmacia Biotech) It is possible to use a vector pGEX series released on the market), a method of preparing a histidine tag (Novagen pET series), and the like. The host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for the expression of a recombinant protein. In addition to the above-mentioned E. coli, for example, fungal cells such as yeast, various animal and plant cells can be used.

宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、「Mandel, M.& Higa,A. Journal of Molecular Biology, 53, 158-162(1970)、Hanahan, D. Journal ofMolecular Biology, 166, 557-580(1983)」に記載のカルシウムイオンを利用した導入方法を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記のマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。   Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce a vector into a host cell. For example, for introduction into E. coli, `` Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, 53, 158-162 (1970), Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, 166, 557-580 (1983) '' The introduction method using calcium ions described in (1) can be used. The recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or its culture supernatant by methods known to those skilled in the art. When the recombinant protein is expressed as a fusion protein with the maltose binding protein or the like, affinity purification can be easily performed.

得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞(ハイブリドーマ)を単離し、該細胞を増殖させ、細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。   If the obtained recombinant protein is used, an antibody that binds to the protein can be prepared. For example, a polyclonal antibody can be prepared by immunizing an immunized animal such as a rabbit with the purified protein of the present invention or a partial peptide thereof, collecting blood after a certain period, and removing the blood clot. is there. Monoclonal antibodies can be obtained by fusing the antibody-producing cells of animal immunized with the above protein or peptide and bone tumor cells, isolating single clone cells (hybridomas) that produce the desired antibody, and proliferating the cells. And obtaining antibodies from the cells. The antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention. The present invention includes antibodies that bind to the proteins of the present invention.

<形質転換体について>
本発明の遺伝子を発現する形質転換体を作製する場合には、該遺伝子を適当なベクターに挿入して、これを対象の宿主細胞に導入する。
<About transformants>
When producing a transformant that expresses the gene of the present invention, the gene is inserted into an appropriate vector and introduced into a target host cell.

本発明に係る形質転換体は、所望により組換えベクターに含まれた、上記遺伝子が導入されたものである。より具体的に言えば、本発明に係る形質転換体は、本発明によるデオキシニバレノール及び/又はニバレノール分解酵素をコードする遺伝子が導入されたものである。ここで、「遺伝子または組換えベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法(遺伝子操作技術)により、宿主内に所望によりベクター内に組み込まれた遺伝子が例えばプロモーターの作用により、発現可能に導入されることを意味する。   The transformant according to the present invention is a transformant into which the above gene, which is contained in a recombinant vector, is introduced as desired. More specifically, the transformant according to the present invention is one into which a gene encoding deoxynivalenol and / or nivalenol degrading enzyme according to the present invention has been introduced. Here, “a gene or a recombinant vector has been introduced” means that a gene incorporated into the vector as desired in a host is expressed by, for example, the action of a promoter, by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). It means to be introduced as possible.

本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子を直接、あるいは上記遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、あるいは、植物、昆虫細胞などを挙げることができる。実施例に記載のように、宿主細胞としては、原核生物が好ましい。   The transformant according to the present invention can be obtained by introducing the gene directly or by introducing a vector incorporating the gene into a host. The host is not particularly limited, and examples thereof include prokaryotes such as Escherichia coli, fungi such as yeast, plants, and insect cells. As described in the examples, prokaryotes are preferred as host cells.

本発明の遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーター、例えば、大腸菌ではLacプロモーター、酵母では、GAPDHプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーター、植物細胞では、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、昆虫細胞では、バキュロウイルスプロモーター等の下流域に連結して使用する。   The gene of the present invention is a promoter that can be expressed in a host cell, such as a Lac promoter in E. coli, a GAPDH promoter or alcohol oxidase promoter in yeast, a cauliflower mosaic virus 35S promoter in plant cells, a baculovirus promoter in insect cells, etc. Used in connection with the downstream area.

上記形質転換宿主細胞を含む形質転換体を作製する方法としては、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法(エレクトロポーレーション)、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。   As a method for producing a transformant containing the transformed host cell, specifically, for example, a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation), an Agrobacterium-mediated method, a particle gun method, etc. Various known methods can be used.

前記形質転換植物を作出する手法について具体的には、「Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer ToPlants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74」に記載のポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、「Tokiet al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507」に記載の電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、「Christouet al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.」に記載のパーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し植物体を再生させる方法、および「Hieiet al. (1994) Plant J. 6: 271-282.」に記載のアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法は、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択されることが好ましい。即ち、例えば宿主が酵母である場合は、塩化リチウム法が好ましい。   Specifically, the method for producing the transformed plant is a plant body in which a gene is introduced into a protoplast with polyethylene glycol described in “Datta, SK (1995) In Gene Transfer ToPlants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66-74”. A method for regenerating a plant body by introducing a gene into a protoplast by an electric pulse described in “Tokiet al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507”, “Christouet al. (1991) Bio / technology, 9 : 957-962. "A method of regenerating a plant by directly introducing a gene into a cell by the particle gun method", and Agrobacterium described in "Hieiet al. (1994) Plant J. 6: 271-282." A method of introducing a gene via a um and regenerating a plant can be exemplified, but the method is not particularly limited. Moreover, it is preferable that the transformation method is appropriately selected according to the type of organism serving as a host. That is, for example, when the host is yeast, the lithium chloride method is preferred.

本発明において使用することができるベクターとしては、従来から細菌、真菌などの形質転換に使用されているベクター、例えば、細菌用には、pUC、pBluescript、pET系、RK2-oriを有する広宿主域ベクターなど、酵母用には、pGYR、pFLD、pYES2等、植物用には、pBI121を挙げることができる。   Examples of vectors that can be used in the present invention include vectors conventionally used for transformation of bacteria, fungi, and the like, for bacteria, a broad host range having pUC, pBluescript, pET system, RK2-ori. For vectors such as yeast, pGYR, pFLD, pYES2, etc., and for plants, pBI121 can be mentioned.

前記ベクターは、上記遺伝子またはその断片の他に、従来公知の遺伝子を発現させるための構成的プロモーター、例えば、GAPDHプロモーターやカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、または発現誘導性プロモーター、例えば、Lacプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーター、そして形質転換体の選抜を容易にする薬剤耐性遺伝子、例えば、アンピシリンあるいは、カナマイシン、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子などを含んでいるのが好ましい。   The vector is a constitutive promoter for expressing a conventionally known gene in addition to the above gene or a fragment thereof, such as GAPDH promoter or cauliflower mosaic virus 35S promoter, or an expression inducible promoter such as Lac promoter or alcohol oxidase. It preferably contains a promoter and a drug resistance gene that facilitates selection of transformants, such as ampicillin, kanamycin, hygromycin resistance gene, and the like.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限り、Molecular Cloning 2nd. ed(Cold Spring Harbor Press (1989))に記載の方法(以下「常法」と呼ぶ)を用いて行った。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples. Unless otherwise stated, the gene recombination experiments shown in the Examples were performed using the method described in Molecular Cloning 2nd. Ed (Cold Spring Harbor Press (1989)) (hereinafter referred to as “ordinary method”).

<KSM1株ゲノミックライブラリーの構築>
(1)ゲノミックDNAの抽出
-80℃冷凍庫に保存したKSM1株のグリセロールストックをR2A寒天培地(Merck社製)に植菌し、28℃で6日間培養した。寒天培地上に生育したKSM1株菌体を、表1に示すCDM培地に、100mg/mlの濃度にDON(Wako社)を添加した培地100 mlに植菌した。植菌後の培地を、28℃、暗所で振とう培養法により6日間培養した。培養後の培地を、9,200x gにて3分間遠心し、KSM1株菌体を集菌した。この菌体より、AquaPureGenomic DNA Isolation Kit (Bio-Rad社製)を用いてゲノミックDNAを抽出した。以上の操作により、約27 mgのKSM1株ゲノミックDNAを得た。
<Construction of KSM1 stock genomic library>
(1) Genomic DNA extraction
A glycerol stock of KSM1 strain stored in a -80 ° C. freezer was inoculated into R2A agar medium (manufactured by Merck) and cultured at 28 ° C. for 6 days. The KSM1 strain cells grown on the agar medium were inoculated into 100 ml of a medium in which DON (Wako) was added to the CDM medium shown in Table 1 at a concentration of 100 mg / ml. The inoculated medium was cultured for 6 days at 28 ° C. in a dark place by a shaking culture method. The cultured medium was centrifuged at 9,200 × g for 3 minutes to collect KSM1 strain cells. From this microbial cell, genomic DNA was extracted using AquaPureGenomic DNA Isolation Kit (Bio-Rad). By the above operation, about 27 mg of KSM1 strain genomic DNA was obtained.

Figure 2011103864
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(2)ゲノミックDNAのサイズ分画
前記により抽出したKSM1株ゲノミックDNAを含む溶液から、20-23 Kb程度のDNA断片のみを得る目的で、以下の手順により該KSM1株ゲノミックDNAのサイズ分画を行った。
(a) 前記KSM1株ゲノミックDNAを約5mg含む溶液10 mlを高速振とう機CM-1000(東京理化器械社製)を用いて8分間撹拌し、該DNA溶液中に含まれる20-23Kb程度のサイズのDNA断片の割合を高めた。
(b)前記攪拌後のDNA溶液を、低融点アガロースゲル(SeaPlaqueGTG Agarose、Lonza社製)を用いた電気泳動に供した。前記低融点アガロースゲルは、0.6 %(weight/volume)のものを用い、電気泳動は50Vで一時間行った。その際ゲルの両端のレーンにはλDNAをHindIII処理することによって作製したマーカー(以下λ/HindIIIマーカーという。)を供した。
(c)前記λ/HindIIIマーカーのレーン部分のアガロースゲルのみをメスを用いて切り取り、エチジウムブロマイドを含むTAE緩衝液(40mMTris-acetate, 1mM EDTA)中で20分間染色した。その後、UVイルミネーターで、切り取ったアガロースゲルにUVを照射しながら、λ/HindIIIマーカーのアガロースゲルのレーンの23 Kbのバンド部分にメスで印をつけた。
(d)前記により印をつけたλ/HindIIIマーカーのアガロースゲルのレーンと、前記KSM1株ゲノミックDNA試料を泳動したレーンとをUV非照射下で並べ、マーカーのレーンにつけた印を目安に23Kb前後のDNA試料を含むゲル画分を切り出した。切り出したゲルはエッペンドルフチューブに1本あたり約100 mlとなるように移した。
(e)b-agarase (Lonza社製)を用い、添付のプロトコールに従って切り出したアガロースゲルを溶解させた。
(f)前記アガロースゲル溶解液200 mlに、PCI (フェノール (pH8.0):クロロホルム:イソアミルアルコール=25:24:1)溶液を等量添加し攪拌した。本該アガロース溶解液・PCI混合溶液を21,600x g で5 分間遠心した。遠心後、水層を回収した。
(g)回収した該水層に2.5倍量のエタノールと0.1 倍量の3 M酢酸ナトリウム水溶液(pH 5.2)を添加し、撹拌したのちに氷上で10分間静置した。静置後、21,600x g で15 分間遠心し、DNAを沈殿させた。上澄を廃棄し、沈殿させた該DNAを含むエッペンドルフチューブに500mlの70 %エタノールを添加した。該チューブを数回静かに反転させた後、ただちに21,600x g で5 分間遠心した。遠心後、上澄を廃棄した。なお本操作を、以後単に「エタノール沈殿」という。
(h)蓋を開いた状態でエッペンドルフチューブを横に倒し、該チューブ内が乾燥するまで該チューブを静置した。なお本操作を、以後単に「風乾」という。
(i)風乾した後の該沈殿物を20 mlのTE緩衝液(10 mMトリス塩酸、1 mM EDTA、pH8.0)に溶解させ、20-23Kb程度の断片のKSM1株ゲノミックDNAを得た。
(2) Size fractionation of genomic DNA For the purpose of obtaining only a DNA fragment of about 20-23 Kb from the solution containing KSM1 strain genomic DNA extracted as described above, the size fractionation of the KSM1 strain genomic DNA was performed by the following procedure. went.
(A) 10 ml of a solution containing about 5 mg of the KSM1 strain genomic DNA was stirred for 8 minutes using a high-speed shaker CM-1000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.), and about 20-23 Kb contained in the DNA solution Increased the proportion of size DNA fragments.
(B) The DNA solution after stirring was subjected to electrophoresis using a low melting point agarose gel (SeaPlaqueGTG Agarose, manufactured by Lonza). The low melting point agarose gel was 0.6% (weight / volume), and electrophoresis was performed at 50 V for 1 hour. At that time, lanes at both ends of the gel were provided with markers prepared by treating λDNA with HindIII (hereinafter referred to as λ / HindIII markers).
(C) Only the agarose gel in the lane portion of the λ / HindIII marker was cut out using a scalpel and stained in TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) containing ethidium bromide for 20 minutes. Thereafter, the UV light was applied to the cut agarose gel with a UV illuminator, and the 23 Kb band portion of the lane of the agarose gel of the λ / HindIII marker was marked with a scalpel.
(D) The lane of the agarose gel of the λ / HindIII marker marked above and the lane where the KSM1 strain genomic DNA sample was migrated were arranged in the absence of UV irradiation, and the mark on the marker lane was around 23 Kb. The gel fraction containing the DNA sample was cut out. The cut gel was transferred to an Eppendorf tube so that the amount of each gel was about 100 ml.
(E) Agarose gel cut out according to the attached protocol was dissolved using b-agarase (manufactured by Lonza).
(F) To 200 ml of the agarose gel solution, an equal amount of a PCI (phenol (pH 8.0): chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24: 1) solution was added and stirred. The agarose solution / PCI mixed solution was centrifuged at 21,600 × g for 5 minutes. After centrifugation, the aqueous layer was recovered.
(G) 2.5 times the amount of ethanol and 0.1 times the amount of 3 M sodium acetate aqueous solution (pH 5.2) were added to the recovered aqueous layer, and after stirring, the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes. After standing, the mixture was centrifuged at 21,600 × g for 15 minutes to precipitate the DNA. The supernatant was discarded and 500 ml of 70% ethanol was added to the Eppendorf tube containing the precipitated DNA. The tube was gently inverted several times and immediately centrifuged at 21,600 × g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded. This operation is hereinafter simply referred to as “ethanol precipitation”.
(H) With the lid open, the Eppendorf tube was laid down sideways, and the tube was allowed to stand until the inside of the tube was dry. This operation is hereinafter simply referred to as “air drying”.
(I) The precipitate after air drying was dissolved in 20 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) to obtain a KSM1 strain genomic DNA having a fragment of about 20-23 Kb.

(3)ゲノミックDNAの末端平滑化
前記20-23Kb程度の断片のKSM1株ゲノミックDNAの末端の平滑化を、DNABlunting Kit(タカラバイオ社製)を用い、その添付説明書に従って行った。本操作により末端平滑化済みゲノミックDNAを得た。ただしBlunting後のKSM1株ゲノミックDNAとコスミドベクターとのライゲーションに関しては、該DNABlunting Kitに付属の試薬は用いずに、下記に記載の「(5)ゲノミックDNAとコスミドベクターとのライゲーション」によりおこなった。
(3) Genomic DNA end blunting The KSM1 strain genomic DNA blunting of the fragments of about 20-23 Kb was performed using DNABlunting Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached instructions. By this operation, end-blunted genomic DNA was obtained. However, the ligation between the KSM1 strain genomic DNA after Blunting and the cosmid vector was carried out by “(5) Ligation of genomic DNA and cosmid vector” described below without using the reagent attached to the DNA Blunting Kit.

(4)コスミドベクターの調製
KSM1株のゲノミックライブラリー作製にあたり、ベクターには「Ono,A. et al. (2007)Applied Microbiology and Biotechnology, 74 (2): 501-510」の記載に従い、以下の手順により調製した広宿主域のコスミドベクターであるpKS13Sを用いた。
(a)pKS13Sを保持する大腸菌DH5a株(タカラバイオ社製、以後単にDH5a株という。)の-80℃冷凍ストックより、テトラサイクリンを15mg/mlの濃度で含む10 mlのTerrific broth液体培地(培地組成:水1L当たり、酵母エキス, 24 g; ペプトン, 12 g ; K2HPO4 , 9.4 g;KH2PO4, 2.2 gを入れ、全体で1,000mlとした。)(以下TB液体培地という。)にDH5a株を一白金耳植菌し、37℃で一晩振とう培養を行った。
(b)振とう培養後の該培養液を、10,000 x g にて遠心して集菌した後、QuantumPrep Mini Prep Kit (Bio-Rad社製)を用い、該菌体よりpKS13SをTE緩衝液に抽出した。Quantum Prep Mini PrepKitの操作は添付説明書に従った。さらに抽出したpKS13Sを含むTE緩衝液をエタノール沈殿し、該沈殿物を滅菌済み超純水に溶解させた。
(c)前記、pKS13SをScaIにより切断した。ScaI処理はpKS13Sを5 mg、ScaIを30 unit含む100 mlの反応液中で、37℃で2時間行った。その後、該反応液をエタノール沈殿し、風乾後に31 mlの滅菌済み超純水に溶解させた。
(d)前記31 ml のpKS13S含有溶液に、BAP(タカラバイオ社製)に添付のアルカリフォスファターゼ反応用緩衝液を4 ml、BAPを5 ml添加して計40 mlとし、ピペッティングによってよく混合した後、65℃にて30分間静置した。30分間の静置後、60 mlのTE緩衝液を添加し、pKS13S含有溶液の総量を100 mlとした。
(e)PCIを該pKS13S含有溶液に等量添加し攪拌した。その後該pKS13S含有溶液・PCI混合溶液を21,600x g で5 分間遠心した。遠心後、水層を回収した。該操作を3回行い、回収した該水層をエタノール沈殿した。風乾後、20mlのTE緩衝液に溶解させた。以上の(a)から(e)の操作により、下記のゲノミックDNAとのライゲーションに用いるコスミドベクターを得た。
(4) Preparation of cosmid vector
In preparing a genomic library of the KSM1 strain, the vector is a broad host range prepared by the following procedure according to the description of “Ono, A. et al. (2007) Applied Microbiology and Biotechnology, 74 (2): 501-510”. PKS13S which is a cosmid vector was used.
(A) 10 ml Terrific broth liquid medium (medium composition) containing tetracycline at a concentration of 15 mg / ml from a -80 ° C frozen stock of Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Takara Bio Inc., hereinafter simply referred to as DH5a strain) carrying pKS13S : Yeast extract per liter of water, 24 g; Peptone, 12 g; K 2 HPO 4 , 9.4 g; KH 2 PO 4 , 2.2 g to make a total of 1,000 ml.) (Hereinafter referred to as TB liquid medium) The DH5a strain was inoculated into one platinum ear and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
(B) The culture solution after shaking culture was collected by centrifugation at 10,000 xg, and then pKS13S was extracted from the cells into a TE buffer solution using QuantumPrep Mini Prep Kit (Bio-Rad). . The operation of Quantum Prep Mini PrepKit followed the attached instruction. Further, the extracted TE buffer containing pKS13S was ethanol precipitated, and the precipitate was dissolved in sterilized ultrapure water.
(C) The pKS13S was cleaved with ScaI. ScaI treatment was performed at 37 ° C. for 2 hours in a 100 ml reaction solution containing 5 mg of pKS13S and 30 units of ScaI. Thereafter, the reaction solution was ethanol precipitated, air-dried, and dissolved in 31 ml of sterilized ultrapure water.
(D) To 31 ml of the pKS13S-containing solution, 4 ml of alkaline phosphatase reaction buffer attached to BAP (manufactured by Takara Bio Inc.) and 5 ml of BAP were added to make a total of 40 ml, and mixed well by pipetting Then, it was left still at 65 ° C. for 30 minutes. After standing for 30 minutes, 60 ml of TE buffer was added to make the total amount of the pKS13S-containing solution 100 ml.
(E) An equal amount of PCI was added to the pKS13S-containing solution and stirred. Thereafter, the pKS13S-containing solution / PCI mixed solution was centrifuged at 21,600 × g for 5 minutes. After centrifugation, the aqueous layer was recovered. This operation was performed three times, and the recovered aqueous layer was ethanol precipitated. After air drying, it was dissolved in 20 ml of TE buffer. The cosmid vector used for the ligation with the following genomic DNA was obtained by the above operations (a) to (e).

(5)ゲノミックDNAとコスミドベクターとのライゲーション
前記により調製した末端平滑化済みゲノミックDNAと、前記により調製したコスミドベクターpKS13Sを用い、以下の手順で該ゲノミックDNAと該コスミドベクターのライゲーションを行った。
(a)該ゲノミックDNA約600ngを含むTE緩衝液、該コスミドベクター約2000 ngを含むTE緩衝液をエッペンドルフチューブ内で混合し、エタノール沈殿した。
(b)前記により得た沈殿物を風乾した後、該風乾物を滅菌済み超純水5 mlに溶解させた。
(c)前記(b)において調製した該風乾済みDNA溶解液に、DNA Ligation Kit Ver.2.1 (タカラバイオ社製)のI液を10 ml、II液を5 ml加え、計20 mlの溶液とした。各溶液を混合後ただちに数回ピペッティングした。軽く遠心した後、26 ℃で一晩反応させ、KSM1株ゲノミックDNAと、pKS13Sのライゲーション反応液を得た。
(5) Ligation of genomic DNA and cosmid vector The genomic DNA and the cosmid vector were ligated by the following procedure using the end-blunted genomic DNA prepared above and the cosmid vector pKS13S prepared above.
(A) TE buffer containing about 600 ng of the genomic DNA and TE buffer containing about 2000 ng of the cosmid vector were mixed in an Eppendorf tube and ethanol precipitated.
(B) After the precipitate obtained above was air-dried, the air-dried material was dissolved in 5 ml of sterilized ultrapure water.
(C) To the air-dried DNA solution prepared in (b) above, 10 ml of DNA Ligation Kit Ver.2.1 (manufactured by Takara Bio Inc.) and 5 ml of II solution are added, and a total of 20 ml of solution is obtained. did. Each solution was pipetted several times immediately after mixing. After light centrifugation, the reaction was allowed to proceed overnight at 26 ° C. to obtain a ligation reaction solution of KSM1 strain genomic DNA and pKS13S.

(6)バクテリオファージへのin vitroパッケージング
本操作にはEPICENTRE社製のMaxPlaxLambda Packaging Extracts (-80 ℃保存)を用い、その操作は添付の説明書に従って行った。添加するDNA溶液には前記において調製したライゲーション反応液20mlのうちの8 mlを用いた。8ml の該ライゲーション反応液を65℃で15分間静置、さらに氷上で5分間静置した後に、添付説明書に記載の操作に用い、パッケージング反応液を得た。
(6) In vitro packaging into bacteriophages For this operation, MaxPlax Lambda Packaging Extracts (stored at −80 ° C.) manufactured by EPICENTRE was used, and the operation was performed according to the attached instructions. As the DNA solution to be added, 8 ml of 20 ml of the ligation reaction solution prepared above was used. 8 ml of the ligation reaction solution was allowed to stand at 65 ° C. for 15 minutes, and further allowed to stand on ice for 5 minutes, and then used for the operation described in the attached instructions to obtain a packaging reaction solution.

(7)E.coli XL-1 blue MR株への形質導入
E.coli XL-1 blue MR株(Stratagene社製)を0.2%マルトース及び10 mM硫酸マグネシウムを含むLB培地(10 ml)で、37℃で約16時間振とう培養し、OD610=0.8〜0.9となったE.coli XL-1 blue MR株培養液を得た。該E.coli XL-1 blue MR株培養液の200 mlと、前記パッケージング反応液の40 mlをエッペンドルフチューブ内で混合した。この混合液を37℃で20分間静置培養した後、1mlのLB培地を添加し、37℃で1時間振とう培養した。その後、該培養液を室温にて500 x gで10分間遠心し、上澄を廃棄して菌体を集菌した。この菌体を100 mlのLB培地に懸濁し、形質転換体候補E.coli XL-1 blue MR株菌液を得た。
(7) Transduction into E.coli XL-1 blue MR strain
E.coli XL-1 blue MR strain (Stratagene) was cultured with shaking in LB medium (10 ml) containing 0.2% maltose and 10 mM magnesium sulfate at 37 ° C. for about 16 hours, OD 610 = 0.8 to 0.9 The obtained E. coli XL-1 blue MR strain culture solution was obtained. 200 ml of the E. coli XL-1 blue MR strain culture solution and 40 ml of the packaging reaction solution were mixed in an Eppendorf tube. The mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes, 1 ml of LB medium was added, and the mixture was cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the culture solution was centrifuged at 500 × g for 10 minutes at room temperature, and the supernatant was discarded to collect the cells. This microbial cell was suspended in 100 ml of LB medium to obtain a transformant candidate E. coli XL-1 blue MR strain bacterial solution.

(8)テトラサイクリン耐性形質転換体の選択と保存
15 mg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天培地に、前記形質転換体候補E.coli XL-1 blue MR株菌液を塗布し、37℃、暗所にて18時間培養し、E.coli XL-1 blue MR株のテトラサイクリン耐性形質転換体を生育させた。培養後、該E.coli XL-1 blue MR株テトラサイクリン耐性形質転換体を保存するため、該テトラサイクリン耐性形質転換体が生育したLB寒天培地上に、15%グリセロールを含むLB培地を2 ml添加し、該テトラサイクリン耐性形質転換体を該添加液に懸濁した。その後、該テトラサイクリン耐性形質転換体懸濁液を収集し、滅菌済みの1.5ml容スクリューチューブに菌体溶液を移し、該スクリューチューブを-80℃で保存した。前記(7)及び(8)の操作を、1,800クローンのテトラサイクリン形質転換体が得られるまで繰り返し行った。
(8) Selection and storage of tetracycline resistant transformants
The transformant candidate E. coli XL-1 blue MR strain was applied to an LB agar medium containing 15 mg / ml tetracycline, cultured at 37 ° C. in the dark for 18 hours, and E. coli XL- 1 Blue MR strain tetracycline resistant transformant was grown. After culture, in order to preserve the E. coli XL-1 blue MR strain tetracycline resistant transformant, 2 ml of LB medium containing 15% glycerol is added to the LB agar medium on which the tetracycline resistant transformant has grown. The tetracycline resistant transformant was suspended in the added solution. Subsequently, the tetracycline resistant transformant suspension was collected, the bacterial cell solution was transferred to a sterilized 1.5 ml screw tube, and the screw tube was stored at -80 ° C. The operations (7) and (8) were repeated until 1,800 clones of tetracycline transformants were obtained.

<KSM1株ゲノミックライブラリーのSphingobium japonicum UT26株への導入>
(1)KSM1株ゲノムのコスミドライブラリーを構成する組換えコスミドの抽出
前記により-80℃冷凍ストックとして保存したE.coli XL-1 blue MR株テトラサイクリン耐性形質転換体を、テトラサイクリンを15mg/mlの濃度で含む10 mlのTB液体培地に一白金耳植菌し、37℃で一晩培養した。該E.coli XL-1 blue MR株テトラサイクリン耐性形質転換体の培養後、QuantumPrep Mini Prep Kit(Bio-Rad社製)により組換えコスミドをTE緩衝液に抽出した。その後、該組換えコスミド含有TE緩衝液をエタノール沈殿した。沈殿物を風乾した後、該風乾済みDNAを滅菌済み超純水に溶解させた。以上の操作は1.800種の全組換えコスミドをカバーするよう行った。1,800種の組換えコスミドの全種を含むDNA溶液を、組換えコスミド1種あたりのモル数が概ね等しくなるように、かつ組換えコスミド濃度が約100ng/mlとなるように組換えコスミド溶液を調製した。
<Introduction of KSM1 strain genomic library to Sphingobium japonicum UT26 strain>
(1) Extraction of recombinant cosmid constituting KSM1 strain cosmid library E.coli XL-1 blue MR tetracycline resistant transformant stored as -80 ° C frozen stock as described above, tetracycline at 15 mg / ml One platinum ear was inoculated into 10 ml of TB liquid medium containing a concentration and cultured at 37 ° C. overnight. After culturing the E. coli XL-1 blue MR strain tetracycline resistant transformant, the recombinant cosmid was extracted into TE buffer using QuantumPrep Mini Prep Kit (Bio-Rad). Thereafter, the recombinant cosmid-containing TE buffer was ethanol precipitated. After air-drying the precipitate, the air-dried DNA was dissolved in sterilized ultrapure water. The above operation was performed to cover all 1.800 kinds of recombinant cosmids. A DNA solution containing all 1,800 recombinant cosmids should be prepared so that the number of moles per recombinant cosmid is approximately equal and the recombinant cosmid concentration is approximately 100 ng / ml. Prepared.

(2)Sphingobium japonicum UT26株のコンピテントセルの作製
(a)「Nagata, Y. et al. (2007) Applied Microbiology andBiotechnology, 76:741-752」に記載のSphingobium japonicum UT26株 (以下UT26株という。)を、-80℃冷凍ストックより1/3LB寒天培地 (per liter:Bact tryptone, 3.33 g; Bact yeast extract 1.67 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g)に植菌した。その後2日間、30 ℃で培養し、UT26菌体を生育させた。
(b)前記1/3LB寒天培地上に生育した該UT26菌体を回収し、氷冷した2 mlのMOPS-10%グリセロール溶液に移した。その後、該菌体を含むMOPS-10%グリセロール溶液を、4℃、5,800x gで2分間遠心し、UT26菌体を沈殿させた。
(c)前記遠心後の上澄を廃棄し、前記の沈殿させたUT26菌体に、氷冷したMOPS-10%グリセロール溶液を新たに1.5 ml加え、懸濁した。該懸濁液を4℃、7,400x gで2分間遠心した。本操作を3回繰り返した。
(d)前記遠心した上澄を残らず廃棄し、氷冷したMOPS-10%グリセロール溶液を50 ml加えて懸濁し、UT26菌体懸濁液を得た。該菌体懸濁液を形質転換に用いるUT26株のコンピテントセルとした。
(2) Production of competent cells of Sphingobium japonicum UT26 strain (a) Sphingobium japonicum UT26 strain (hereinafter referred to as UT26 strain) described in “Nagata, Y. et al. (2007) Applied Microbiology and Biotechnology, 76: 741-752”. ) Was inoculated into a 1 / 3LB agar medium (per liter: Bact tryptone, 3.33 g; Bact yeast extract 1.67 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g) from a -80 ° C. frozen stock. Thereafter, the cells were cultured at 30 ° C. for 2 days to grow UT26 cells.
(B) The UT26 cells grown on the 1 / 3LB agar medium were collected and transferred to an ice-cooled 2 ml MOPS-10% glycerol solution. Thereafter, the MOPS-10% glycerol solution containing the cells was centrifuged at 4 ° C. and 5,800 × g for 2 minutes to precipitate UT26 cells.
(C) The supernatant after the centrifugation was discarded, and 1.5 ml of an ice-cooled MOPS-10% glycerol solution was newly added and suspended in the precipitated UT26 cells. The suspension was centrifuged at 7,400 xg for 2 minutes at 4 ° C. This operation was repeated 3 times.
(D) All of the centrifuged supernatant was discarded and 50 ml of ice-cooled MOPS-10% glycerol solution was added and suspended to obtain a UT26 cell suspension. The cell suspension was used as a competent cell of UT26 strain used for transformation.

(3)UT26株への組換えコスミドの導入
前記により調製したUT26コンピテントセルに、前記により調製したライブラリーを構成する組換えコスミド溶液(約100 ng/ml)を5 ml添加し、組換えコスミド含有コンピテントセルを得た。その後、緩やかな数回のピペッティングによって該組換えコスミド含有コンピテントセルを撹拌し、1mm幅のエレクトロポレーション用キュベット(Bio-Rad社製)に移した。該組換えコスミド含有コンピテントセルを含むキュベットをGene Pulser(Bio-Rad社製)にセットし、電圧1.8 KV、抵抗値200 Ω、静電容量25 mFで通電した。通電後直ちにキュベット内の菌液を1mlの1/3 LB液体培地(per liter: Bact tryptone, 3.33 g; Bact yeast extract 1.67 g; NaCl, 5 g)に移し、30℃で2時間培養を行った。培養後、該培養液を5,800x gで2分間遠心し、上澄を100 ml程度を残して廃棄し、残した100 ml程度の菌液をピペッティングにより撹拌した。該菌液を、テトラサイクリンを15mg/mlの濃度で含む1/3LB寒天培地に塗布した。菌液を塗布後の寒天培地を、30℃で4日間培養し、テトラサイクリン耐性のUT26株形質転換体のコロニーを得た。本方法を以下エレクトロポレーション法という。
(3) Introduction of recombinant cosmid into UT26 strain Add 5 ml of the recombinant cosmid solution (approximately 100 ng / ml) that constitutes the library prepared above to the UT26 competent cell prepared as described above. A cosmid-containing competent cell was obtained. Thereafter, the recombinant cosmid-containing competent cell was stirred by gentle pipetting several times, and transferred to a 1 mm-wide electroporation cuvette (manufactured by Bio-Rad). The cuvette containing the recombinant cosmid-containing competent cell was set in Gene Pulser (manufactured by Bio-Rad), and energized at a voltage of 1.8 KV, a resistance value of 200 Ω, and a capacitance of 25 mF. Immediately after energization, the bacterial solution in the cuvette was transferred to 1 ml of 1/3 LB liquid medium (per liter: Bact tryptone, 3.33 g; Bact yeast extract 1.67 g; NaCl, 5 g) and cultured at 30 ° C. for 2 hours. . After culturing, the culture solution was centrifuged at 5,800 × g for 2 minutes, the supernatant was discarded leaving about 100 ml, and the remaining about 100 ml of the bacterial solution was stirred by pipetting. The bacterial solution was applied to a 1 / 3LB agar medium containing tetracycline at a concentration of 15 mg / ml. The agar medium after the bacterial solution was applied was cultured at 30 ° C. for 4 days to obtain a tetracycline resistant UT26 strain transformant colony. This method is hereinafter referred to as electroporation method.

<DON分解活性を有するUT26株組換え体の選択>
(1)UT26株形質転換体の植えつぎ
前記により寒天培地上に生育させたUT26株の形質転換体のコロニーを、テトラサイクリンを15 mg/ml含む1/3LB寒天培地に、約10mmの線を引くように植え継ぎ、3日間、30℃で培養を行った。その結果、それぞれのUT26株形質転換体が約10 mmの長さのコロニーを形成した。
<Selection of UT26 strain recombinants having DON degradation activity>
(1) Planting of UT26 strain transformant A colony of UT26 strain transformant grown on an agar medium as described above is drawn on a 1/3 LB agar medium containing 15 mg / ml of tetracycline with a line of about 10 mm. And then cultured at 30 ° C. for 3 days. As a result, each UT26 strain transformant formed a colony having a length of about 10 mm.

(2)DON分解活性アッセイ溶液の作製と培養
20 mg/mlのDONを含む1.5 mlのCDM培地をエッペンドルフチューブに添加し、これを100チューブ準備した。この該CDM培地を含むチューブ1本に、前記の約10mmの長さのコロニーとして生育したUT26組換え体を12クローン接種した。該UT26組換え体の接種にあたっては、約10 mmの長さのUT26組換え体コロニーのうち、3mm程度を採取して該CDM培地に接種し、懸濁した。このようにして得た懸濁液をDON分解活性アッセイ溶液とした。他のクローンについても同様に12クローンずつ1本のチューブに接種・懸濁し、100本のDON分解活性アッセイ溶液を作製した。各アッセイ溶液を撹拌したのち該アッセイ溶液を15ml容プラスチックチューブに移し、28 ℃で2日間振とう培養した。なお本項のDON分解活性アッセイ溶液の作製と培養方法を、以後単にDON分解活性アッセイ溶液培養法という。
(2) Preparation and culture of DON degradation activity assay solution
1.5 ml of CDM medium containing 20 mg / ml DON was added to an Eppendorf tube, and 100 tubes were prepared. One clone containing the CDM medium was inoculated with 12 clones of the UT26 recombinant grown as a colony having a length of about 10 mm. When inoculating the UT26 recombinant, about 3 mm of a UT26 recombinant colony having a length of about 10 mm was collected, inoculated into the CDM medium, and suspended. The suspension thus obtained was used as a DON degradation activity assay solution. Other clones were similarly inoculated and suspended in 12 tubes of 12 clones to prepare 100 DON degradation activity assay solutions. After stirring each assay solution, the assay solution was transferred to a 15 ml plastic tube and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 days. The preparation and culture method of the DON degradation activity assay solution in this section is hereinafter simply referred to as the DON degradation activity assay solution culture method.

(3)DONの減少したDON分解活性アッセイ溶液の探索
振とう培養後の前記DON分解活性アッセイ溶液のチューブ100本の内容物の全量を、それぞれ1本ずつエッペンドルフチューブに移した。このDON分解活性アッセイ溶液が移されたエッペンドルフチューブを、常温、21,600x g にて2分間遠心し、該アッセイ溶液の上澄と菌体を分離した。上澄の液体培地を採取して口径0.20mmの滅菌フィルター(ADVANTEC社製)を用いてろ過し、ろ過後の該液体培地を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析を下記HPLC分析条件で行った。なお本項のろ過後の液体培地を以後DON分解活性アッセイHPLCサンプルという。また、本項のDON分解活性アッセイ溶液の作製と培養方法を、以後単にDON分解活性アッセイ溶液探索法という。
(3) Search for DON Degradation Activity Assay Solution with Reduced DON The entire contents of 100 tubes of the DON degradation activity assay solution after shaking culture were transferred to Eppendorf tubes one by one. The Eppendorf tube into which the DON degradation activity assay solution was transferred was centrifuged at room temperature at 21,600 × g for 2 minutes to separate the supernatant of the assay solution and the cells. The supernatant liquid medium was collected and filtered using a 0.20 mm sterilization filter (manufactured by ADVANTEC), and the filtered liquid medium was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) analysis under the following HPLC analysis conditions. The liquid medium after filtration in this section is hereinafter referred to as DON degradation activity assay HPLC sample. The preparation and culture method of the DON degradation activity assay solution in this section is hereinafter simply referred to as the DON degradation activity assay solution search method.

HPLC分析条件
分析装置:600 Controller, 717plus Autosampler, 2487 Dual λ Absorbance Detector
(Waters社)
カラム:Symmetry C18 5mm 3.9x150mm (Waters社)
溶媒:水/メタノール(85:15)
流速:1 ml/分
温度:室温
HPLC analysis condition analyzer: 600 Controller, 717plus Autosampler, 2487 Dual λ Absorbance Detector
(Waters)
Column: Symmetry C18 5mm 3.9x150mm (Waters)
Solvent: water / methanol (85:15)
Flow rate: 1 ml / min Temperature: Room temperature

DON濃度の減少の成否を100本の該DON分解活性アッセイHPLCサンプルについて検討することにより、DON分解活性が付与されたUT26形質転換体を含むDON分解活性アッセイ溶液を探索した。その結果、1本のDON分解活性アッセイ溶液「10番」において、他にDONが減少するとともに、該アッセイ溶液中に他の物質を示すピークが新たに観察された。本結果から、該アッセイ溶液に接種された12クローンのうちの少なくとも1クローンにDONを減少させる活性があるものと考えられた。   The DON degradation activity assay solution containing the UT26 transformant imparted with the DON degradation activity was searched by examining the success or failure of the decrease in the DON concentration with respect to the 100 DON degradation activity assay HPLC samples. As a result, in one DON degradation activity assay solution “No. 10”, DON was reduced in the other, and a peak indicating another substance was newly observed in the assay solution. From this result, it was considered that at least one of the 12 clones inoculated in the assay solution had an activity of reducing DON.

(4)DON分解活性を有するUT26形質転換体の確定
前記DON分解活性アッセイ溶液「10番」に含まれる12クローンのそれぞれを、個別に20mg/mlのDONを含む1 mlのCDM培地に接種してDON分解活性アッセイ溶液を作製し、DONの減少をHPLC分析により検討した。培養は前記DON分解活性アッセイ溶液培養法と同様に行った。HPLC分析は前記DON分解活性アッセイ溶液探索法と同様に行った。その結果、それらの12クローンのうちの1クローンである「クローン10-07」を接種した培養液から、図1に示す通りDON分解活性が検出された。該培養液中には、他の物質が新たに出現したことを示す新規ピークが観察された。本クローンの保持する組換えコスミドを「pKSM1007」と命名した。
(4) Determination of UT26 transformant having DON degradation activity Each of the 12 clones contained in the DON degradation activity assay solution “No. 10” was individually inoculated into 1 ml of CDM medium containing 20 mg / ml of DON. A DON degradation activity assay solution was prepared, and the decrease in DON was examined by HPLC analysis. Culturing was performed in the same manner as in the DON degradation activity assay solution culture method. The HPLC analysis was performed in the same manner as the DON degradation activity assay solution search method. As a result, DON degrading activity was detected from the culture medium inoculated with “clone 10-07”, one of those 12 clones, as shown in FIG. In the culture broth, a new peak indicating that another substance newly appeared was observed. The recombinant cosmid retained by this clone was named “pKSM1007”.

図1にpKSM1007を保持するUT26株によるDONの分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを示す。(a)は培養開始時点のHPLCクロマトグラムを、(b)は培養開始後3日の時点でのHPLCクロマトグラムを示す。   FIG. 1 shows an HPLC chromatogram of a DON degradation activity assay HPLC sample prepared from a DON degradation activity assay solution by the UT26 strain carrying pKSM1007. (a) shows an HPLC chromatogram at the start of culture, and (b) shows an HPLC chromatogram at 3 days after the start of culture.

(5)クローン10-07のDON分解活性がpKSM1007に起因することの検証
クローン10-07は、図1に示す通り確かにDON分解活性を有していた。ここで、該クローンがDON分解活性を有していたことの原因として、a)クローン10-07が保持するpKSM1007の挿入DNA断片上にDON分解酵素遺伝子が存在する、b) pKSM1007を保持する宿主菌株であるUT26株のゲノムDNAにDON分解活性が生じるような突然変異が生じた、の2通りが考えられる。そこで、クローン10-07のDON分解活性がpKSM1007に起因するのか否かを検証することを目的として、クローン10-07から抽出したpKSM1007を再度UT26株に導入し直し、該再導入株にDON分解活性が付与されるか否かの検討を行った。
(5) Verification of clone 10-07 DON degradation activity due to pKSM1007 Clone 10-07 certainly had DON degradation activity as shown in FIG. Here, as a cause of the fact that the clone had DON degrading activity, a) a DON-degrading enzyme gene exists on the inserted DNA fragment of pKSM1007 retained by clone 10-07, b) a host retaining pKSM1007 There are two possible cases in which a mutation that causes DON degradation activity has occurred in the genomic DNA of the UT26 strain. Therefore, in order to verify whether or not the DON degradation activity of clone 10-07 is due to pKSM1007, pKSM1007 extracted from clone 10-07 was reintroduced into UT26 strain, and DON degradation was performed on the reintroduced strain. It was examined whether or not activity was imparted.

クローン10-07からのpKSM1007の抽出は前記QuantumPrep Mini Prep Kitを用いて行い、TE緩衝液にpKSM1007を抽出した。その後、該pKSM1007含有TE緩衝液をPCI処理し、さらにエタノール沈殿してpKSM1007沈殿物を得た。該沈殿物を風乾したのち、滅菌超純水中に溶解させた。超純水に溶解させた該pKSM1007を、前記エレクトロポレーション法によってUT26株に導入し、pKSM1007含有UT26組換え体を得た。該UT26株組換え体を、前記DON分解活性アッセイ溶液培養法に従って、20mg/mlのDONを含むCDM培地に接種し、前記DON分解活性アッセイ溶液を調製した。該アッセイ溶液を30℃で3日間培養し、該アッセイ溶液を用いて前記DON分解活性アッセイHPLCサンプルを作製した。該DON分解活性アッセイHPLCサンプルを、前記HPLC分析条件で分析した結果、該UT26組換え体はクローン10-07と同様のDON分解活性を示した。以上の結果より、UT26にpKSM1007を導入することで、UT26にDON分解能が付与されることが明らかとなった。すなわち、クローン10-07のDON分解活性は、pKSM1007に起因することが示された。   Extraction of pKSM1007 from clone 10-07 was performed using the QuantumPrep Mini Prep Kit, and pKSM1007 was extracted into TE buffer. Thereafter, the pKSM1007-containing TE buffer was subjected to PCI treatment, and further ethanol precipitated to obtain a pKSM1007 precipitate. The precipitate was air-dried and then dissolved in sterilized ultrapure water. The pKSM1007 dissolved in ultrapure water was introduced into the UT26 strain by the electroporation method to obtain a pKSM1007-containing UT26 recombinant. According to the DON degradation activity assay solution culture method, the UT26 strain recombinant was inoculated into CDM medium containing 20 mg / ml DON to prepare the DON degradation activity assay solution. The assay solution was cultured at 30 ° C. for 3 days, and the DON degradation activity assay HPLC sample was prepared using the assay solution. As a result of analyzing the DON degradation activity assay HPLC sample under the above-mentioned HPLC analysis conditions, the UT26 recombinant showed the same DON degradation activity as clone 10-07. From the above results, it became clear that by introducing pKSM1007 to UT26, DON resolution was given to UT26. That is, it was shown that the DON degradation activity of clone 10-07 is due to pKSM1007.

<pKSM1007上に存在するDON分解酵素遺伝子の同定>
(1)pKSM1007の大腸菌株への導入とpKSM1007の大腸菌株からの再抽出
pKSM1007を公知のヒートショック法によって大腸菌DH5a株に導入し、pKSM1007を保持する組換え大腸菌株を作製した。該組換え大腸菌株から前記QuantumPrep Mini Prep Kitを用いて再度pKSM1007を抽出し、以後、pKSM1007は全てこの大腸菌株から抽出したものを使用した。
<Identification of the DON-degrading enzyme gene present on pKSM1007>
(1) Introduction of pKSM1007 into E. coli strain and re-extraction of pKSM1007 from E. coli strain
pKSM1007 was introduced into Escherichia coli DH5a strain by a known heat shock method to prepare a recombinant Escherichia coli strain carrying pKSM1007. PKSM1007 was extracted again from the recombinant Escherichia coli strain using the QuantumPrep Mini Prep Kit, and all the pKSM1007 extracted from this Escherichia coli strain was used thereafter.

(2)pKSM1007のBamHI切断断片のpNIT6012へのクローニング
pKSM1007をBamHI処理し、該BamHI反応液を0.8 %アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、3本のバンド(それぞれ約9.5 Kb, 6.3 Kb, 及び4.7Kb)が出現した。これらのDNA断片の全てを、それぞれBglII処理及びアルカリフォスファターゼ処理を行ったpNIT6012に常法によってクローニングした。BglII切断断片の突出部分は3’-GATC-5’となり、一方BamHI切断断片の突出部分もBglII切断断片の突出部分と同様に3’-GATC-5’であって、これら2種の突出末端は連結することができる。pNIT6012のマルチクローニングサイトにはBamHI切断部位が存在しないがBglII切断部位が存在するため、pNIT6012のBglII切断部位に上記3種のpKSM1007BamHI切断DNA断片をクローニングした。上記約9.5 Kb, 6.3 Kb,及び4.7 KbのDNA断片をpNIT6012にBamHI切断断片をクローニングして作製した組換えプラスミドをそれぞれp1007BB1、p1007BB2及びp1007BB3と命名した。なおpNIT6012はカナマイシン耐性遺伝子由来の構成的発現プロモーターを備えており、プロモーター下流のマルチクローニングサイトに連結した遺伝子を大腸菌内及びUT26株内で構成的に発現させることが可能である。
(2) Cloning of pKSM1007 BamHI cleavage fragment into pNIT6012
When pKSM1007 was treated with BamHI and the BamHI reaction solution was electrophoresed using a 0.8% agarose gel, three bands (about 9.5 Kb, 6.3 Kb, and 4.7 Kb, respectively) appeared. All of these DNA fragments were cloned by standard methods into pNIT6012 that had been treated with BglII and alkaline phosphatase, respectively. The protruding part of the BglII cleaved fragment is 3'-GATC-5 ', while the protruding part of the BamHI cleaved fragment is 3'-GATC-5' like the protruding part of the BglII cleaved fragment, and these two protruding ends Can be linked. Since there is no BamHI cleavage site at the multicloning site of pNIT6012 but a BglII cleavage site, the above three types of pKSM1007BamHI cleavage DNA fragments were cloned into the BglII cleavage site of pNIT6012. Recombinant plasmids prepared by cloning the above 9.5 Kb, 6.3 Kb, and 4.7 Kb DNA fragments into pNIT6012 with BamHI digested fragments were named p1007BB1, p1007BB2, and p1007BB3, respectively. PNIT6012 has a constitutive expression promoter derived from a kanamycin resistance gene, and a gene linked to a multicloning site downstream of the promoter can be constitutively expressed in E. coli and UT26.

(3)組換えプラスミドのUT26株への導入
前記の計3種の組換えプラスミドを、それぞれ前記エレクトロポレーション法によってUT26株に導入し、3種類のUT26株組換え体を作出した。
(3) Introduction of Recombinant Plasmid into UT26 Strain The total of the three types of recombinant plasmids were each introduced into the UT26 strain by the electroporation method to produce three types of UT26 strain recombinants.

(4)UT26株組換え体のDON分解活性の確認
前記にて作出した3種類のUT26株組換え体について、前記DON分解活性アッセイ溶液培養法、及び前記DON分解活性アッセイ溶液探索法により、DON分解活性の有無の検討を行った。その結果、p1007BB2を保持するUT26株組換え体でのみ、DON分解活性が検出された。図2にpKSM1007の挿入DNA断片に存在するDON分解酵素遺伝子の同定を示す。本結果から、DON分解酵素をコードする遺伝子は、その機能を発揮しうる単位として、p1007BB2の挿入DNA断片上、すなわちpKSM1007の2カ所のBamHI切断サイトに挟まれた約6.3 Kbの領域に存在すると考えられた。
(4) Confirmation of DON degradation activity of UT26 strain recombinants For the three types of UT26 strain recombinants produced above, DON degradation activity assay solution culture method and DON degradation activity assay solution search method The presence or absence of degradation activity was examined. As a result, DON degradation activity was detected only in the UT26 strain recombinant carrying p1007BB2. FIG. 2 shows the identification of the DON degrading enzyme gene present in the inserted DNA fragment of pKSM1007. From these results, the gene encoding DON degrading enzyme is present on the inserted DNA fragment of p1007BB2, that is, in a region of about 6.3 Kb sandwiched between two BamHI cleavage sites of pKSM1007 as a unit that can exert its function. it was thought.

(5)p1007BB2の挿入DNA断片及びその周辺領域のDNA塩基配列解析
pKSM1007挿入DNA断片上の2カ所のBamHI切断部位に挟まれた約6.3 Kbの領域(図2)のDNA塩基配列解析を行った。塩基配列の決定にはBigDyeTerminator Ver.3.1 (ABI社製)とABI PRISM 3100 DNAシーケンサー (ABI社製)を用いた。p1007BB2の挿入DNA断片の末端シーケンス配列の決定にあたっては、鋳型DNAにp1007BB2を用い、プライマーにはpNIT6012のマルチクローニングサイト近傍のDNA塩基配列に基づいた下記配列番号3、及び配列番号4に示す2種のオリゴヌクレオチド(A)及び(B)を用いた。その他のDNA領域はpKSM1007を鋳型DNAとしたプライマーウォーキング法により塩基配列を決定した。
(5) DNA sequence analysis of p1007BB2 inserted DNA fragment and its surrounding region
DNA base sequence analysis of a region of about 6.3 Kb (FIG. 2) sandwiched between two BamHI cleavage sites on the pKSM1007 inserted DNA fragment was performed. For the determination of the base sequence, BigDyeTerminator Ver.3.1 (ABI) and ABI PRISM 3100 DNA sequencer (ABI) were used. In determining the terminal sequence sequence of the insert DNA fragment of p1007BB2, p1007BB2 is used as a template DNA, and two kinds of primers shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 based on the DNA base sequence in the vicinity of the multiple cloning site of pNIT6012 are used. Oligonucleotides (A) and (B) were used. The other DNA regions were sequenced by the primer walking method using pKSM1007 as template DNA.

プライマー
(A)pNIT6012-MCS-CW
5’- gatttattcaacaaagccacgttgtgtctc-3’ (配列番号3)
(B)pNIT6012-MCS-CCW
5’-gattccgactcgtccaacatcaatacaacc -3’ (配列番号4)
Primer
(A) pNIT6012-MCS-CW
5'-gatttattcaacaaagccacgttgtgtctc-3 '(SEQ ID NO: 3)
(B) pNIT6012-MCS-CCW
5'-gattccgactcgtccaacatcaatacaacc -3 '(SEQ ID NO: 4)

塩基配列を決定したp1007BB2挿入DNA断片を含む約6.3 Kbの解析の結果、図2に示すように、7個のオープンリーディングフレーム(ORF1-ORF7)が同定された(ただしORF1のみ遺伝子全長を含まない)。   As a result of analysis of about 6.3 Kb including the p1007BB2 inserted DNA fragment whose base sequence was determined, as shown in Fig. 2, seven open reading frames (ORF1-ORF7) were identified (however, only ORF1 does not include the entire gene length) ).

(6)p1007BB2挿入DNA断片上のORF7のPCR増幅
KSM1株ゲノミックDNAを鋳型DNAとして、下記配列番号5、及び配列番号6に示すオリゴヌクレオチド配列(C)(D)をプライマーとして用い、PCR法によってORF7を増幅した。配列番号5のオリゴヌクレオチド(C)にはNcoI切断部位(CCATGG)を、配列番号6のオリゴヌクレオチド(D)にはEcoRII切断部位(GAATTC)を付加してある。PCR反応の酵素にはKODPlus Ver.2 (TOYOBO社製)を用い、以下のPCRプログラムで反応させた。反応液組成は添付説明書に従った。その結果、約1,300 bpのPCR増幅産物を得た。
(6) PCR amplification of ORF7 on p1007BB2 inserted DNA fragment
ORF7 was amplified by PCR using the KSM1 strain genomic DNA as a template DNA and the oligonucleotide sequences (C) and (D) shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 below as primers. The oligonucleotide (C) of SEQ ID NO: 5 has an NcoI cleavage site (CCATGG) added thereto, and the oligonucleotide (D) of SEQ ID NO: 6 has an EcoRII cleavage site (GAATTC) added thereto. KODPlus Ver.2 (manufactured by TOYOBO) was used as the enzyme for the PCR reaction, and the reaction was performed with the following PCR program. The composition of the reaction solution was in accordance with the attached instructions. As a result, a PCR amplification product of about 1,300 bp was obtained.

プライマー
(C)Nco-SD1007P450a-F
5’- gccCCATGGtggagaatgacatggtagaa -3’ (配列番号5)
(D)Eco-1007P450a-R
5’- gccGAATTCtcagctcatttgatagcgaa -3’ (配列番号6)
制限酵素切断部位は大文字で示した。
Primer
(C) Nco-SD1007P450a-F
5'- gccCCATGGtggagaatgacatggtagaa -3 '(SEQ ID NO: 5)
(D) Eco-1007P450a-R
5'- gccGAATTCtcagctcatttgatagcgaa -3 '(SEQ ID NO: 6)
Restriction enzyme cleavage sites are shown in capital letters.

PCRプログラム
ステップ1 94℃ 2分 (1サイクル)
ステップ2 98℃ 10秒 → 50℃ 30秒 → 68℃ 80秒 (1サイクル)
ステップ3 98℃ 10秒 → 59℃ 30秒 → 68℃ 80秒 (29サイクル)
ステップ4 4℃(∞)
PCR program step 1 94 ℃ 2 minutes (1 cycle)
Step 2 98 ℃ 10 seconds → 50 ℃ 30 seconds → 68 ℃ 80 seconds (1 cycle)
Step 3 98 ℃ 10 seconds → 59 ℃ 30 seconds → 68 ℃ 80 seconds (29 cycles)
Step 4 4 ℃ (∞)

(7)PCR増幅産物のpNITdSへのクローニング
前記ORF7がDON分解酵素遺伝子であるか否かを検討することを目的として、ORF7をベクターにクローニングしてUT26株に導入し、作出された組換えUT26株にDON分解能が付与されるか否かの検討を以下のように行った。
(7) Cloning of PCR amplification product into pNITdS For the purpose of examining whether ORF7 is a DON degrading enzyme gene, ORF7 was cloned into a vector and introduced into UT26 strain. Whether the strain was given DON resolution or not was examined as follows.

ORF7の前記PCR増幅産物をNcoI及びEcoRI処理によって切断し、該反応産物を0.8 %アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動後、該反応産物を含むゲル画分を切り出し、QIAEXII Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて切り出したゲル画分からの該反応産物の抽出を行った。本操作により下記ライゲーション反応に用いる調製済みPCR反応産物を得た。   The PCR amplification product of ORF7 was cleaved by NcoI and EcoRI treatment, and the reaction product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel. After electrophoresis, the gel fraction containing the reaction product was cut out, and the reaction product was extracted from the gel fraction cut out using QIAEXII Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN). By this operation, a prepared PCR reaction product used for the following ligation reaction was obtained.

一方、ORF7をクローニングするベクターにはpNITdS(SmaI切断部位に1塩基の置換があるためSmaIによる切断を受けないこと以外はpNIT6012と同一のベクター)を用いることとした。該ベクターをNcoI及びEcoRI処理し、該制限酵素反応産物を0.8 %のアガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動後、該反応産物を含むゲル画分を切り出し、該ゲル画分からの該反応産物の抽出を前記QIAEXII Gel Extraction Kitを用いて行った。以上の操作で下記のライゲーション反応に用いる調整済みpNITdSを得た。前記調製済みPCR反応産物と、前記調製済みpNITdSを混合し、TakaraDNA Ligation kit <Mighty Mix> (タカラバイオ社製)を用いてライゲーション反応を行った。本ライゲーション反応の操作は添付説明書の記載に従った。   On the other hand, pNITdS (the same vector as pNIT6012 except that it does not undergo cleavage by SmaI due to the substitution of one base at the SmaI cleavage site) was used as the vector for cloning ORF7. The vector was treated with NcoI and EcoRI, and the restriction enzyme reaction product was electrophoresed using a 0.8% agarose gel. After electrophoresis, the gel fraction containing the reaction product was cut out, and the reaction product was extracted from the gel fraction using the QIAEXII Gel Extraction Kit. The adjusted pNITdS used for the following ligation reaction was obtained by the above operation. The prepared PCR reaction product and the prepared pNITdS were mixed, and a ligation reaction was performed using TakaraDNA Ligation kit <Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.). The operation of this ligation reaction was as described in the attached instructions.

前記反応終了後、該ライゲーション反応産物を公知のヒートショック法により大腸菌DH5a株に導入し、テトラサイクリン耐性大腸菌形質転換体を得た。ORF7をクローニングした組換えpNITdSの挿入DNA断片の塩基配列は前記のプライマー(A)及び(B)を用いて決定し、pKSM1007上のORF7の塩基配列がクローニングされていることを確認した。本項において作製した、ORF7をクローニングしたpNITdS組換えベクターをp1007P450aと命名した。   After completion of the reaction, the ligation reaction product was introduced into Escherichia coli DH5a by a known heat shock method to obtain a tetracycline resistant Escherichia coli transformant. The base sequence of the inserted DNA fragment of recombinant pNITdS into which ORF7 was cloned was determined using the primers (A) and (B), and it was confirmed that the base sequence of ORF7 on pKSM1007 was cloned. The pNITdS recombinant vector cloned in ORF7 prepared in this section was named p1007P450a.

(8)ORF7がUT26株にDON分解活性を付与する遺伝子であることを証明
p1007P450aをUT26株に導入した形質転換体を前記の方法により導入し、DON分解活性アッセイ溶液培養法によりDON分解活性の有無の検討を行った。その結果、該UT26株組換え体はDON分解活性を示した。なおネガティブコントロールである野生型UT26株はDON分解活性を示さなかった。
(8) Prove that ORF7 is a gene conferring DON degradation activity on UT26 strain
A transformant in which p1007P450a was introduced into the UT26 strain was introduced by the above method, and the presence or absence of DON degradation activity was examined by a DON degradation activity assay solution culture method. As a result, the UT26 strain recombinant showed DON degrading activity. The wild type UT26 strain, which is a negative control, did not show DON degrading activity.

図3に配列番号1(ORF7)の遺伝子を導入したUT26株によるDON(20mg/ml)の分解について、DON分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを示す。ORF7をpNITdSにクローニングしたp1007P450aをUT26株に導入したUT26株形質転換体を用いた。(a)は野生型UT26株(ネガティブコントロール)の培養開始時点でのDON分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを、(b)は野生型UT26株(ネガティブコントロール)の培養開始40時間後でのDON分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを、(c)はp1007P450aを保持するUT26株組換え体の培養開始時点のDON分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを、(d)はp1007P450aを保持するUT26株組換え体の培養開始後40時間の時点でのDON分解活性アッセイ溶液から作製したDON分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムをそれぞれ示す。   FIG. 3 shows an HPLC chromatogram of a DON degradation activity assay HPLC sample prepared from a DON degradation activity assay solution for the degradation of DON (20 mg / ml) by the UT26 strain introduced with the gene of SEQ ID NO: 1 (ORF7). A UT26 strain transformant in which p1007P450a obtained by cloning ORF7 into pNITdS was introduced into the UT26 strain was used. (a) is the HPLC chromatogram of the DON degradation activity assay HPLC sample prepared from the DON degradation activity assay solution at the start of cultivation of the wild type UT26 strain (negative control), and (b) is the wild type UT26 strain (negative control). The HPLC chromatogram of the DON degradation activity assay HPLC sample prepared from the DON degradation activity assay solution 40 hours after the start of culturing, (c) DON degradation activity assay at the start of the UT26 strain recombinant carrying p1007P450a The HPLC chromatogram of the DON degradation activity assay HPLC sample prepared from the solution, (d) is the DON degradation activity prepared from the DON degradation activity assay solution at 40 hours after the start of culture of the recombinant UT26 strain carrying p1007P450a. The HPLC chromatogram of each assay HPLC sample is shown.

以上の結果から、p1007P450aに含まれるORF7がUT26株にDON分解活性を付与する遺伝子であることが示された。本ピークは組換え体でないUT26株を接種した際の培養液からは観察されないものであったため、DONが代謝されて出現したDON代謝産物であると考えられた。   From the above results, it was shown that ORF7 contained in p1007P450a is a gene that imparts DON degradation activity to the UT26 strain. Since this peak was not observed in the culture solution when inoculated with a non-recombinant UT26 strain, it was considered to be a DON metabolite that appeared after DON was metabolized.

<ORF7はUT26株にNIV分解活性を付与する>
p1007P450aをUT26株に導入した前記形質転換体のNIV分解能についても検討を行った。DONをNIVに変えた以外は全前記DON分解活性アッセイ溶液培養法にある方法により、該形質転換体のNIV分解活性の有無の検討を行った。
<ORF7 confers NIV degradation activity to UT26 strain>
The NIV resolution of the transformant in which p1007P450a was introduced into the UT26 strain was also examined. Except for changing DON to NIV, the transformants were examined for the presence or absence of NIV-degrading activity by the same method as in the DON-degrading activity assay solution culture method.

図4に配列番号1(ORF7)の遺伝子を導入したUT26株によるNIV(20mg/ml)の分解について、NIV分解活性アッセイ溶液から作製したNIV分解活性アッセイHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムを示す。ORF7をpNITdSにクローニングしたp1007P450aをUT26株に導入したUT26株形質転換体を用いた。(a)は野生型UT26株(ネガティブコントロール)の培養開始時点でのHPLCクロマトグラム(b)は野生型UT26株(ネガティブコントロール)の培養開始40時間後でのHPLCクロマトグラム、(c)はp1007P450aを保持するUT26株組換え体の培養開始時点のHPLCクロマトグラム、(d)はp1007P450aを保持するUT26株組換え体の培養開始後40時間の時点でのHPLCサンプルのHPLCクロマトグラムである。   FIG. 4 shows an HPLC chromatogram of the NIV degradation activity assay HPLC sample prepared from the NIV degradation activity assay solution for the degradation of NIV (20 mg / ml) by the UT26 strain introduced with the gene of SEQ ID NO: 1 (ORF7). A UT26 strain transformant in which p1007P450a obtained by cloning ORF7 into pNITdS was introduced into the UT26 strain was used. (a) is the HPLC chromatogram at the start of cultivation of the wild type UT26 strain (negative control) (b) is the HPLC chromatogram after 40 hours of the cultivation of the wild type UT26 strain (negative control), (c) is p1007P450a (D) is the HPLC chromatogram of the HPLC sample at the point of 40 hours after the start of the culture of the UT26 strain recombinant holding p1007P450a.

上記の結果、該形質転換体はNIV分解活性を示した。なおネガティブコントロールである野生型UT26株はNIV分解活性を示さなかった。以上の結果から、p1007P450aに含まれるORF7が、UT26株にNIV分解活性を付与する遺伝子であることが示された。   As a result, the transformant showed NIV degradation activity. The wild type UT26 strain, which is a negative control, did not show NIV degradation activity. From the above results, it was shown that ORF7 contained in p1007P450a is a gene that imparts NIV degradation activity to the UT26 strain.

<ORF7の配列解析>
ORF7は終止コドンを含めて全長1,281塩基対(配列番号1)で、推定426アミノ酸残基からなるタンパク質(配列番号2)をコードしていた。開始コドンの上流5bpから10 bpの領域には推定Shine Dalgano (SD)配列が認められた。図5に配列番号1の開始コドン付近の塩基配列を示す。推定SD(ShineDalgano)配列を四角内に示した。
<Sequence analysis of ORF7>
ORF7 encoded a protein (SEQ ID NO: 2) consisting of a predicted 426 amino acid residues with a total length of 1,281 base pairs (SEQ ID NO: 1) including a stop codon. A putative Shine Dalgano (SD) sequence was found in the region from 5 bp to 10 bp upstream of the start codon. FIG. 5 shows the base sequence near the start codon of SEQ ID NO: 1. The putative SD (ShineDalgano) sequence is shown in the square.

配列番号2に示すアミノ酸配列をクエリとしてProtein Blast検索を行うと、40 %以上の相同性を示す配列が多数検出された。ただし相同性が最も高かった配列で48 %の相同性にとどまった。ヒットした配列の殆どがcytochromeP450とアノテーションされていた。最もE-valueの低い相同配列はHyphomonas neptunium ATCC 15444由来のcytochromeP450 family proteinであり、E-valueは1e-114、相同性は47 %であった。「cytochrome P450スーパーファミリー」は原核生物から菌類、高等動物、高等植物などの真核生物まで幅広く保持している酵素群であり、アミノ酸レベルの相同性が40%以上だと同一のファミリー、55 %以上だと同一のサブファミリーに分類される。配列番号2に示される意アミノ酸配列には40 %以上の相同性を示すものが多数存在した。それらのいくつかは、CYP108ファミリーと分類されている酵素であった。配列番号2と40%以上の相同性を示し、同一のファミリーに分類される酵素群の配列情報を利用した系統樹を図6に示す。なおP450camはCYP101ファミリーに分類される酵素であり、アウトグループとして用いた。図6より、配列情報2のタンパク質はP450スーパーファミリー、CYP108ファミリーに分類される酵素であることが強く示唆された。   When a protein Blast search was performed using the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a query, a large number of sequences having a homology of 40% or more were detected. However, the sequence with the highest homology only had 48% homology. Most of the hit sequences were annotated with cytochromeP450. The homologous sequence with the lowest E-value was cytochrome P450 family protein derived from Hyphomonas neptunium ATCC 15444, with an E-value of 1e-114 and a homology of 47%. `` Cytochrome P450 superfamily '' is a group of enzymes widely held from prokaryotes to eukaryotes such as fungi, higher animals, higher plants, etc., the same family with amino acid level homology of 40% or more, 55% If it is above, it will be classified into the same subfamily. There were many amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 showing homology of 40% or more. Some of them were enzymes classified as CYP108 family. FIG. 6 shows a phylogenetic tree using the sequence information of enzyme groups that show 40% or more homology with SEQ ID NO: 2 and are classified into the same family. P450cam is an enzyme classified into the CYP101 family and used as an outgroup. 6 strongly suggests that the protein of sequence information 2 is an enzyme classified into the P450 superfamily and the CYP108 family.

本発明の遺伝子の利用により、デオキシニバレノール分解酵素の高発現微生物の作製とデオキシニバレノール汚染現場での利用、デオキシニバレノールの分解活性を備えデオキシニバレノールを蓄積させない新規組み換えムギの作製と栽培、ならびにデオキシニバレノール分解酵素製剤の製造など、デオキシニバレノール汚染問題の解決に向けた、新規の組み換え生物や酵素製剤の開発の可能性が喚起される。   By using the gene of the present invention, production of microorganisms that highly express deoxynivalenol-degrading enzyme, use in the field of deoxynivalenol contamination, production and cultivation of new recombinant wheat that has deoxynivalenol degrading activity and does not accumulate deoxynivalenol, and deoxynivalenol The possibility of the development of new recombinant organisms and enzyme preparations to solve deoxynivalenol contamination problems such as the production of degrading enzyme preparations is evoked.

Claims (7)

下記(A)乃至(C)のいずれかのアミノ酸配列を含むデオキシニバレノール分解酵素タンパク質。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
(C)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
A deoxynivalenol-degrading enzyme protein comprising any one of the following amino acid sequences (A) to (C):
(A) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of deoxynivalenol degradation.
(C) an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having deoxynivalenol decomposing activity.
下記(A)乃至(C)のいずれかのアミノ酸配列をコードするデオキシニバレノール分解酵素遺伝子。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
(C)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、デオキシニバレノール分解活性を有するアミノ酸配列。
A deoxynivalenol degrading enzyme gene encoding an amino acid sequence of any one of (A) to (C) below.
(A) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of deoxynivalenol degradation.
(C) an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having deoxynivalenol decomposing activity.
下記(D)乃至(F)のいずれかの塩基配列を含むデオキシニバレノール分解酵素遺伝子。
(D)配列番号1で表される塩基配列。
(E)配列番号1に記載の塩基配列において1若しくは複数の塩基が欠失、置換または付加されている塩基配列であって、デオキシニバレノール分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(F)配列番号1に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデオキシニバレノール分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
A deoxynivalenol degrading enzyme gene comprising any one of the following base sequences (D) to (F):
(D) The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(E) A base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and encodes a protein having deoxynivalenol degrading activity.
(F) A base sequence that encodes a protein that hybridizes with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has deoxynivalenol-degrading activity.
請求項2又は請求項3に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。   A recombinant vector comprising the gene according to claim 2 or 3. 請求項2又は請求項3に記載の遺伝子を含む形質転換体。   A transformant comprising the gene according to claim 2 or 3. 請求項4に記載の組み換えベクターを用いる形質転換体。   A transformant using the recombinant vector according to claim 4. 請求項5又は請求項6に記載の形質転換体を用いるデオキシニバレノールの分解方法。

A method for degrading deoxynivalenol using the transformant according to claim 5 or 6.

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