JP2010187702A - Reversibly immortalized mammalian liver cell and use thereof - Google Patents

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Naoya Kobayashi
直哉 小林
Michinori Obara
道法 小原
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Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide reversibly immortalized mammalian liver cells with more safety and high reversibility which solve conventional problems, are replaceable with healthy human liver cells, allow mass proliferation, and are controllable in life, and to provide bio-artificial liver cells or cell preparations. <P>SOLUTION: There is provided a nonviral vector having a nonviral promoter, encoding an immortalizing gene between a pair of site-specific recombination sequences, and encoding a suicide gene at a site excluding the prescribed pair of the site-specific recombination sequences. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、可逆的に増殖可能であり、復帰後の細胞においても自殺遺伝子を含有する不死化哺乳類肝臓細胞および該肝臓細胞を用いたバイオ人工肝臓や細胞製剤に関する。   The present invention relates to an immortalized mammalian liver cell that can proliferate reversibly and contains a suicide gene even in cells after reversion, and a bioartificial liver and a cell preparation using the liver cell.

現在、日本におけるC型肝炎感染者数は200万人(米国では400万人)、B型肝炎の患者数は約150万人(中国ではB型肝炎に感染している患者は1億2000万人以上)と報告されている(日経サイエンス、2000年2月号、肝炎情報センター)。C型肝炎の合併症により日本では年間約9000人が死亡し、2010年までに死亡数は3倍に跳ね上がると予想されている。   Currently, there are 2 million people with hepatitis C in Japan (4 million in the United States) and about 1.5 million people with hepatitis B (120 million people in China are infected with hepatitis B) (Nikkei Science, February 2000 issue, Hepatitis Information Center). Approximately 9000 people die annually in Japan due to the complications of hepatitis C, and the number of deaths is expected to triple by 2010.

このような予測から、肝細胞移植や肝不全治療用バイオ人工臓器に対するニーズは高く、代謝性肝疾患でのヒト肝細胞移植の有効例が報告されている(非特許文献1および2)。   From these predictions, there is a high need for bioartificial organs for liver cell transplantation and liver failure treatment, and effective examples of human hepatocyte transplantation in metabolic liver diseases have been reported (Non-patent Documents 1 and 2).

また、欧米、中国では、すでにブタ肝細胞を使用したバイオ人工肝臓治験がヒトで行われているが、ブタ内因性レトロウイルス感染などの人畜共通感染症が問題視されており、今後の進展が厳しい現状にある。   In Europe, the United States, and China, bioartificial liver trials using porcine hepatocytes have already been conducted in humans, but zoonotic infections such as porcine endogenous retrovirus infections are regarded as problems, and future progress is being made. The current situation is severe.

こうした細胞移植やバイオ人工肝臓のソースとしては健常ヒト細胞が理想であるが、深刻なドナー不足から当該細胞の入手はきわめて困難である。   Healthy human cells are ideal as a source for such cell transplantation and bioartificial liver, but such cells are extremely difficult to obtain due to a serious shortage of donors.

よって、胚性幹細胞(embryonic stem(ES)細胞)、幹細胞、異種動物の細胞が研究されている。しかしながら、幹細胞や前駆細胞を利用する際には、こうした細胞の多分化能と活発な増殖能自体に由来する制御の困難さが本質的に内包されており、肝細胞への分化誘導に関しての報告があるものの充分ではない(非特許文献3)。また、異種動物の細胞では、移植細胞が最終的に拒絶される保証は無く、異種動物との安定なキメラ状態やHLA非適合の同種腫瘍の偶発的な生着がヒトにおいて報告されている(非特許文献4)。   Thus, embryonic stem cells (embryonic stem (ES) cells), stem cells, and heterologous animal cells have been studied. However, when using stem cells and progenitor cells, the difficulty of control derived from the pluripotency and active proliferation ability of these cells is inherently involved, and a report on differentiation induction into hepatocytes. However, it is not enough (Non-patent Document 3). Furthermore, in xenogeneic cells, there is no guarantee that the transplanted cells will eventually be rejected, and stable chimerism with xenogeneic animals and accidental engraftment of HLA-incompatible allogeneic tumors have been reported in humans ( Non-patent document 4).

一方、癌遺伝子を導入して細胞を不死化することにより、適度な分化機能を保持した細胞株を産出できることが知られている(非特許文献5)が、不死化細胞株を、生体内に注入することにより、またはバイオ人工肝臓などの体外循環補助装置に使用することにより、予期せぬ癌化の危険性に患者を曝す可能性がある。   On the other hand, it is known that a cell line retaining an appropriate differentiation function can be produced by introducing an oncogene to immortalize a cell (Non-patent Document 5). Infusion or use in extracorporeal circulation assist devices such as bioartificial livers can expose patients to the risk of unexpected canceration.

不死化遺伝子を導入して細胞を不死化し、増殖した後に該不死化遺伝子を切り出すことができる可逆性不死化細胞も研究されている(非特許文献6)。しかしながら、レトロウイルスベクターを使用する際には、ウイルスの構造上のLTRが腫瘍性を引き起こすなどの問題点や、導入されるコピー数が多くなるといった欠点がある。また、不死化遺伝子を部位特異的組換え酵素により切り出したとしても、遺伝子操作を行なった細胞が残留し、こうした細胞が宿主に対して悪影響(腫瘍を形成してくるなど)を及ぼす可能性がゼロではないことから、治療を受ける患者に不安を与える可能性があると指摘されている。   A reversible immortalized cell capable of immortalizing a cell by introducing an immortalized gene and excising the immortalized gene after growing has also been studied (Non-patent Document 6). However, when a retroviral vector is used, there are problems such as that the LTR on the structure of the virus causes tumorigenicity, and disadvantages that the number of copies to be introduced increases. In addition, even if an immortalized gene is excised with a site-specific recombination enzyme, cells that have undergone genetic manipulation may remain, and these cells may adversely affect the host (such as forming a tumor). Since it is not zero, it has been pointed out that it may cause anxiety to patients receiving treatment.

Strom SC, Fisher RA, Thompson MT, Sanyal AJ, Cole PE, Ham JM, Posner MP., Transplantation (1997) 63: 559-569Strom SC, Fisher RA, Thompson MT, Sanyal AJ, Cole PE, Ham JM, Posner MP., Transplantation (1997) 63: 559-569 Fox IJ, Roy Chowdhury J, Kaufman SS, et al., New Eng. J. Med. (1998) 338: 1422-1426Fox IJ, Roy Chowdhury J, Kaufman SS, et al., New Eng. J. Med. (1998) 338: 1422-1426 Rambhatla L, Chiu CP, Kundu P, et al., Cell Transplant. 2003; 12: 1-11; Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al., J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002Rambhatla L, Chiu CP, Kundu P, et al., Cell Transplant. 2003; 12: 1-11; Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al., J. Clin. Invest. 109; 1291-1302, 2002 Gartner et al., N. Eng. J. Med., 335, 1494, (1996); K. Paradis et al., Science, 285, 1236, (1999)Gartner et al., N. Eng. J. Med., 335, 1494, (1996); K. Paradis et al., Science, 285, 1236, (1999) Kobayashi N, et al., Transplantation 69: 202-207, 2000Kobayashi N, et al., Transplantation 69: 202-207, 2000 Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996

本発明は、従来の問題点を解消し、健常ヒト肝臓細胞に替わる、大量に増殖可能で、その生存を制御することのできる、より安全性の高い可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびそれを用いたバイオ人工肝臓や細胞製剤を提供することを目的とする。   The present invention eliminates the conventional problems, replaces healthy human liver cells, can be proliferated in large quantities, can control its survival, and is a safer reversible immortalized mammalian liver cell and use thereof The purpose is to provide bioartificial liver and cell preparations.

前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、我々は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子の外側に自殺遺伝子をコードするベクターを哺乳類の肝臓細胞に導入することにより、可逆的に増殖可能な不死化細胞であって、かつ不死化遺伝子を除去したのちに自殺遺伝子が作動し得るという特徴を有する安全な肝臓細胞株を樹立できることを見出し、本発明を完成させた。   As a result of extensive studies to solve the above problems, we have introduced a vector encoding a suicide gene outside of an immortalized gene sandwiched between a pair of site-specific recombination sequences into mammalian liver cells. Thus, it has been found that a safe liver cell line can be established that is an immortalized cell that can be reversibly grown and has a feature that the suicide gene can be activated after removing the immortalized gene. It was.

すなわち、本発明は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子を含有し、かつ該一対の部位特異的組換え配列外に自殺遺伝子を含有する可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株であって、該一対の部位特異的組換え配列を切り出したのちに自殺遺伝子が作動し得ることを特徴とする可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株に関する。   That is, the present invention relates to a reversible immortalized mammalian liver cell line containing an immortalizing gene sandwiched between a pair of site-specific recombination sequences and containing a suicide gene outside the pair of site-specific recombination sequences. The present invention relates to a reversible immortalized mammalian liver cell line or its passage, wherein a suicide gene can be activated after excising the pair of site-specific recombination sequences.

前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞において、哺乳類がヒトであることが好ましい。   In the reversible immortalized mammalian liver cell, the mammal is preferably a human.

前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞がウイルス由来のプロモーターを含有しないことが好ましい。   It is preferred that the reversible immortalized mammalian liver cell does not contain a virus-derived promoter.

前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株がCYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)であることが好ましい。   The reversible immortalized mammalian liver cell line is CYNK-1 (deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, postal code 305 -8566), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657).

本発明はまた、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株から不死化遺伝子を除去することにより得られる哺乳類肝臓細胞(以下、復帰細胞という)に関する。   The present invention also relates to a mammalian liver cell (hereinafter referred to as reverting cell) obtained by removing an immortalizing gene from the reversibly immortalized mammalian liver cell line or its passage.

本発明はさらに、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株もしくはその継代株またはそれらの復帰細胞を含有するバイオ人工肝臓に関する。   The present invention further relates to a bioartificial liver containing the reversible immortalized mammalian liver cell line or its passages or their reverted cells.

本発明はまた、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株もしくはその継代株またはそれらの復帰細胞を含有する細胞製剤に関する。   The present invention also relates to a cell preparation containing the reversibly immortalized mammalian liver cell line or its passage, or their reverted cells.

本発明は、非ウイルス性プロモーターを含有し、一対の部位特異的組換え配列間に不死化遺伝子をコードし、かつ該一対の部位特異的組替え配列外に自殺遺伝子をコードする非ウイルスベクターに関する。   The present invention relates to a non-viral vector that contains a non-viral promoter, encodes an immortalizing gene between a pair of site-specific recombination sequences, and encodes a suicide gene outside the pair of site-specific recombination sequences.

本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、需要に見合った数だけ容易に確保することができ、さらに安全性に優れ、患者に不安感を与えることなく、バイオ人工肝臓や細胞製剤の材料として使用することができる。また、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、アルブミンや血液凝固因子といった生理活性物質を製造することができるため、細胞性医薬品の開発にも応用可能である。また、復帰細胞は、さらに安全性に優れており、かつ、肝臓細胞の能力を保持し、肝臓疾患の治療において非常に有用である。   The reversible immortalized mammalian liver cells of the present invention can be easily secured in a number corresponding to the demand, and are excellent in safety, without causing anxiety to the patient, as a material for bioartificial liver and cell preparations Can be used. In addition, the reversible immortalized mammalian liver cell of the present invention can produce physiologically active substances such as albumin and blood coagulation factors, and therefore can be applied to the development of cellular medicines. In addition, reverted cells are further safe and retain the ability of liver cells, and are very useful in the treatment of liver diseases.

図1は、非ウイルスベクターpYK1を示す模式図である。ここで、ATGは開始コドン、CAGはCAGプロモーター配列、LoxPはLoxP配列、HygRはハイグロマイシン耐性遺伝子、HSVTKは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、EMCV IRESは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、SV40Tはシミアンウイルス40ラージT抗原遺伝子、ZeoRはゼオシン耐性遺伝子、pAはポリAシグナルをそれぞれ示す。FIG. 1 is a schematic diagram showing a non-viral vector pYK1. Where ATG is the initiation codon, CAG is the CAG promoter sequence, LoxP is the LoxP sequence, HygR is the hygromycin resistance gene, HSVTK is the herpes simplex virus-thymidine kinase, EMCV IRES is the ribosome entry site in encephalomyocarditis virus, and SV40T is the simian Virus 40 large T antigen gene, ZeoR is a zeocin resistance gene, and pA is a poly A signal. 図2は、非ウイルスベクターpYK1の製造方法の一例を示す図である。ここで、ATGは開始コドン、CAGはCAGプロモーター配列、LoxPはLoxP配列、HygRはハイグロマイシン耐性遺伝子、HSVTKは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、EMCV IRESは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、SV40Tはシミアンウイルス40ラージT抗原遺伝子、ZeoRはゼオシン耐性遺伝子、pAはポリAシグナルをそれぞれ示す。FIG. 2 is a diagram showing an example of a method for producing the non-viral vector pYK1. Where ATG is the initiation codon, CAG is the CAG promoter sequence, LoxP is the LoxP sequence, HygR is the hygromycin resistance gene, HSVTK is the herpes simplex virus-thymidine kinase, EMCV IRES is the ribosome entry site in encephalomyocarditis virus, and SV40T is the simian Virus 40 large T antigen gene, ZeoR is a zeocin resistance gene, and pA is a poly A signal. 図3は、CreDNA組換え酵素によるLoxP配列の切り出し機構を示す図である。ここで、ATGは開始コドン、LoxPはLoxP配列、HygRはハイグロマイシン耐性遺伝子、HSVTKは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ、EMCV IRESは脳心筋炎ウイルス内リボゾームエントリー部位、SV40Tはシミアンウイルス40ラージT抗原遺伝子、ZeoRはゼオシン耐性遺伝子、pAはポリAシグナルをそれぞれ示す。FIG. 3 is a diagram showing the excision mechanism of the LoxP sequence by CreDNA recombinase. Here, ATG is the initiation codon, LoxP is the LoxP sequence, HygR is the hygromycin resistance gene, HSVTK is herpes simplex virus-thymidine kinase, EMCV IRES is the ribosome entry site in encephalomyocarditis virus, SV40T is the simian virus 40 large T antigen gene ZeoR represents a zeocin resistance gene, and pA represents a poly A signal. 図4は、可逆性不死化ヒト肝細胞CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)の位相差顕微鏡写真である。部分1は核小体を示し、部分2は核小体を有する大きな核を示し、部分3は細胞内顆粒を示す。Fig. 4 shows reversible immortalized human hepatocytes CYNK-1 (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 6th post 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657). Part 1 shows a nucleolus, part 2 shows a large nucleus with nucleolus and part 3 shows an intracellular granule. 図5は、本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、作製過程の一実施態様を示す図である。図5(a)は裏打ち4が施された不織布5の上に中空糸膜6を並べた図である。ここで、裏打ち4が施された不織布5にはスリット7が設けられている。図5(b)は、図5(a)をロール状に巻く過程を示す図である。図5(c)は、図5(b)のX−X線断面拡大図である。図5(d)は、両端に液漏れ防止部材8を設けた筒状容器9に中空糸膜6と不織布5からなるロールを組み込んだバイオ人工肝臓リアクター10を表わす概略図である。リアクターには細胞注入口11および細胞のサンプル採取を行なうことが可能な取り出し口12が設けられており、スリット7は、細胞注入口11と連絡するように配置される。FIG. 5 is a diagram showing one embodiment of the production process, taking one embodiment of the bioartificial liver reactor of the present invention as an example. FIG. 5A is a diagram in which the hollow fiber membranes 6 are arranged on the nonwoven fabric 5 on which the backing 4 is applied. Here, a slit 7 is provided in the nonwoven fabric 5 provided with the backing 4. FIG.5 (b) is a figure which shows the process of winding Fig.5 (a) in roll shape. FIG. 5C is an enlarged cross-sectional view taken along the line XX of FIG. FIG. 5D is a schematic diagram showing a bioartificial liver reactor 10 in which a roll made of a hollow fiber membrane 6 and a nonwoven fabric 5 is incorporated in a cylindrical container 9 provided with a liquid leakage preventing member 8 at both ends. The reactor is provided with a cell inlet 11 and an outlet 12 from which a cell sample can be collected, and the slit 7 is arranged so as to communicate with the cell inlet 11. 図6(a)は、CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)における肝特異的遺伝子およびSV40T遺伝子の発現を示す写真である。レーン1から7は、それぞれアルブミン遺伝子、アシアログリコプロテイン受容体(以下、ASGPRという)遺伝子、肝臓性ビリルビン−ウリジンジフォスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ(以下、ビリルビン−UGTという)遺伝子、グルタミンシンセターゼ(以下、GSという)遺伝子、グルタチオン−S−トランスフェラーゼπ(以下、GST−πという)遺伝子、ヒト血液凝固因子X(以下、HBCF−Xという)遺伝子およびSV40T遺伝子の発現を示す。Mはマーカーを示す。図6(b)は、復帰CYNK−1細胞における肝特異的遺伝子およびSV40T遺伝子の発現を示す写真である。レーン1から7は、それぞれアルブミン遺伝子、ASGPR遺伝子、ビリルビン−UGT遺伝子、GS遺伝子、GST−π遺伝子、HBCF−X遺伝子およびSV40T遺伝子の発現を示す。Mはマーカーを示す。Fig. 6 (a) shows CYNK-1 (depositing organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, Address: 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 6th postal code (305-8856). , Deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657), is a photograph showing the expression of liver-specific gene and SV40T gene. Lanes 1 to 7 respectively show an albumin gene, an asialoglycoprotein receptor (hereinafter referred to as ASGPR) gene, a hepatic bilirubin-uridine diphosphate glucuronosyltransferase (hereinafter referred to as bilirubin-UGT) gene, and a glutamine synthetase (hereinafter referred to as “Glucamine synthetase”). , GS) gene, glutathione-S-transferase π (hereinafter referred to as GST-π) gene, human blood coagulation factor X (hereinafter referred to as HBCF-X) gene and SV40T gene. M represents a marker. FIG. 6 (b) is a photograph showing the expression of liver-specific gene and SV40T gene in reverted CYNK-1 cells. Lanes 1 to 7 show the expression of albumin gene, ASGPR gene, bilirubin-UGT gene, GS gene, GST-π gene, HBCF-X gene and SV40T gene, respectively. M represents a marker. 図7は、可逆性不死化ヒト肝細胞CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号FERM:BP−08657)のガンシクロビル感受性を示すグラフである。Fig. 7 shows reversible immortalized human hepatocytes CYNK-1 (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, Central 6 (postal code) 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number FERM: BP-08657) is a graph showing the sensitivity to ganciclovir. 図8は、ガンシクロビルで処理した可逆性不死化ヒト肝細胞CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)の位相差顕微鏡写真である。死滅した細胞13が観察される。Fig. 8 shows reversibly immortalized human hepatocytes CYNK-1 treated with ganciclovir (Depositor: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Address: 1-1 1-1 Higashi 1-chome Tsukuba, Ibaraki, Japan 6 (zip code 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657). Dead cells 13 are observed. 図9は、ガンシクロビルで処理した復帰CYNK−1細胞の位相差顕微鏡写真である。死滅した細胞13が観察される。FIG. 9 is a phase contrast micrograph of reverted CYNK-1 cells treated with ganciclovir. Dead cells 13 are observed. 図10は、D−ガラクトサミン投与後のブタの生存曲線を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the survival curve of pigs after administration of D-galactosamine. 図11は、バイオ人工肝臓治療にて可動後の、BAL−1の不織布の走査電子顕微鏡写真である。細胞14は、不織布の繊維15に良好に付着している。FIG. 11 is a scanning electron micrograph of a non-woven fabric of BAL-1 after being moved by bioartificial liver treatment. The cells 14 adhere well to the non-woven fibers 15. 図12は、バイオ人工肝臓治療にて可動後の、BAL−1の中空糸膜の走査電子顕微鏡写真である。中空糸膜16の表面には、細胞が一切付着していない。FIG. 12 is a scanning electron micrograph of the BAL-1 hollow fiber membrane after movement in bioartificial liver treatment. No cells are attached to the surface of the hollow fiber membrane 16.

本発明において、「可逆性不死化」または「可逆的に増殖可能な」とは、不死化遺伝子を細胞に形質導入して、当該細胞を無限に増殖可能な状態にしたものであって、目的の細胞数まで増殖させた後、当該不死化遺伝子を取り除くことで、細胞増殖を停止し、元の安全性の高い状態に復帰させることのできる状態を意味する。   In the present invention, “reversible immortalization” or “reversibly proliferative” means that a cell is transduced with an immortalizing gene so that the cell can proliferate indefinitely. After the cells are grown to the number of cells, the immortalized gene is removed to stop cell growth and return to the original highly safe state.

本発明で用いられる哺乳類の肝臓細胞は、たとえば豚、猿、類人猿、ヒトの肝臓細胞などであり、好ましくはヒトの肝臓細胞である。たとえば、ヒトの成人肝臓細胞およびヒトの胎児肝臓細胞などを本発明に使用することができる。   The mammalian liver cells used in the present invention are, for example, pigs, monkeys, apes, human liver cells and the like, and preferably human liver cells. For example, human adult liver cells and human fetal liver cells can be used in the present invention.

本発明に用いられる「肝臓細胞」とは、たとえば肝機能の指標であるアルブミンや各種凝固因子などのタンパク質の産生能、糖新生能、尿素産生能、血液の解毒および浄化能、ならびに、アミノ酸、糖質、および脂質代謝能を有する細胞である。具体的には、肝細胞、肝類洞内皮細胞、肝星状細胞、ピット細胞およびクッパー細胞などがあげられる。   “Liver cells” used in the present invention include, for example, the ability to produce proteins such as albumin and various coagulation factors, which are indicators of liver function, gluconeogenic ability, urea producing ability, blood detoxification and purification ability, and amino acids, It is a cell having carbohydrate and lipid metabolism ability. Specific examples include hepatocytes, hepatic sinusoidal endothelial cells, hepatic stellate cells, pit cells, and Kupffer cells.

本発明に使用する肝臓細胞は、商業的に入手可能である(たとえば、三光純薬株式会社、大日本製薬株式会社など)。   Liver cells used in the present invention are commercially available (for example, Sanko Junyaku Co., Ltd., Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., etc.).

本発明において「部位特異的組換え配列」とは、部位特異的組換え酵素によって認識される特異的な塩基配列であり、同一のDNA分子上に同方向の一対の配列が存在する場合は、この配列間でDNA鎖の切断が行なわれる。   In the present invention, a “site-specific recombination sequence” is a specific base sequence recognized by a site-specific recombination enzyme, and when a pair of sequences in the same direction are present on the same DNA molecule, DNA strands are cleaved between these sequences.

部位特異的組換え配列としては、LoxP配列やFRT配列などがあるが、LoxP配列が好ましい。LoxP配列は、Cre組換え酵素によって認識される公知の部位特異的組換え配列であり、同一のDNA分子上に同方向の一対のLoxP配列が存在する場合は、大腸菌のP1ファージ由来であるCre組換え酵素が、1)34塩基 からなるLoxP配列を認識し、2)その部位に結合してLoxP配列間にコードされるDNAを切り出すという一連の反応を単独で行なうことが出来る。   Site-specific recombination sequences include LoxP sequences and FRT sequences, with LoxP sequences being preferred. The LoxP sequence is a known site-specific recombination sequence recognized by Cre recombinase. When a pair of LoxP sequences in the same direction are present on the same DNA molecule, Crex derived from P1 phage of E. coli is used. A series of reactions in which the recombinant enzyme 1) recognizes a LoxP sequence consisting of 34 bases, 2) binds to the site and cuts out the DNA encoded between the LoxP sequences can be carried out independently.

したがって、一対のLoxP配列間にコードさせた遺伝子は、後にCre組換え酵素を作用させることで切り出すことができる。   Therefore, the gene encoded between a pair of LoxP sequences can be excised later by the action of Cre recombinase.

本発明において「不死化遺伝子」とは、ヒト体細胞を無限分裂寿命化する遺伝子を意味し、たとえば、SV40T遺伝子およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子などがあげられる。   In the present invention, “immortalizing gene” means a gene that makes human somatic cells have an infinite mitotic life, and examples thereof include the SV40T gene and the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene.

前記SV40T遺伝子は、公知のDNA型腫瘍ウイルスの腫瘍抗原(T抗原)遺伝子である。   The SV40T gene is a known tumor antigen (T antigen) gene of a DNA type tumor virus.

前記hTERT遺伝子は、正常細胞のTERT遺伝子由来である。hTERT遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜など、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子である。   The hTERT gene is derived from the TERT gene of normal cells. The hTERT gene is naturally expressed in stem and progenitor cells of organs that regenerate throughout life, such as blood, skin, intestinal mucosa, and endometrium, and lymphocytes that are clonally proliferating each time they are exposed to a specific antigen It is an enhanced gene.

本発明において「自殺遺伝子」とは、細菌やウイルス由来の酵素であって、活性の低いプロドラッグを代謝して強い細胞障害活性のある物質に変換させる働きを有する酵素をコードする遺伝子を意味し、このような自殺遺伝子が導入された細胞は、プロドラッグの投与により選択的に死滅する。   In the present invention, the term “suicide gene” refers to a gene encoding an enzyme derived from bacteria or viruses, which has a function of metabolizing a prodrug having low activity to convert it into a substance having strong cytotoxic activity. A cell into which such a suicide gene has been introduced is selectively killed by administration of a prodrug.

したがって、自殺遺伝子を標的とする細胞に導入した場合、プロドラッグの投与により目的に応じて標的細胞を選択的に除去することができる。代表的な自殺遺伝子とプロドラッグとの組み合わせとしては、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ(HSVTK)遺伝子と抗ウイルス剤として臨床で用いられているガンシクロビルとの組み合わせ、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子と抗菌剤である5−フルオロシトシンとの組み合わせなどがあげられる(Elion GB. Am. J. Med. 73, 7, 1982; Craig AM. Proc. Acad. Sci. USA 89, 33, 1992)。本発明で使用する自殺遺伝子としては、その有効性が既に動物実験にて証明されおり(Moolten FL, Wells JM: J Natl Cancer Inst. 82: 297-300, 1990; Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, Ishii H, Oldfield EH. Science 1992; 256: 1550)、さらに、ヒト前立腺癌の遺伝子治療の臨床応用においてもその有効性が確認されている点からHSVTK遺伝子が好ましい。   Therefore, when the suicide gene is introduced into a target cell, the target cell can be selectively removed according to the purpose by administration of the prodrug. Typical combinations of suicide gene and prodrug include herpes simplex thymidine kinase (HSVTK) gene and ganciclovir, which is clinically used as an antiviral agent, and Escherichia coli cytosine deaminase gene and antibacterial agent. -Combinations with fluorocytosine (Elion GB. Am. J. Med. 73, 7, 1982; Craig AM. Proc. Acad. Sci. USA 89, 33, 1992). The effectiveness of the suicide gene used in the present invention has already been proven in animal experiments (Moolten FL, Wells JM: J Natl Cancer Inst. 82: 297-300, 1990; Culver KW, Ram Z, Wallbridge S Ishii H, Oldfield EH. Science 1992; 256: 1550), and HSVTK gene is preferred because its effectiveness has been confirmed in clinical application of gene therapy for human prostate cancer.

本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、一対の部位特異的組換え配列に挟まれた不死化遺伝子と、該一対の部位特異的組換え配列外に自殺遺伝子とをコードするDNA配列を、ベクターにより哺乳類肝臓細胞に導入することにより作製することができる。   The reversible immortalized mammalian liver cell of the present invention comprises an immortalizing gene sandwiched between a pair of site-specific recombination sequences, and a DNA sequence encoding a suicide gene in addition to the pair of site-specific recombination sequences. It can be prepared by introducing it into mammalian liver cells using a vector.

ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのいずれも使用することができるが、ウイルスベクターは、組み換えウイルスベクター産生細胞の培養上清をろ過し、目的とする細胞に添加するだけで効率よく遺伝子導入が可能である点では好ましいが、ウイルスの構造上のLTRが腫瘍性を引き起こすなどの問題点があり、また、導入されるコピー数も多くなるといった欠点も有する。したがって、非ウイルスベクターを使用することが好ましい。   As the vector, both viral vectors and non-viral vectors can be used, but viral vectors can be efficiently transferred by simply filtering the culture supernatant of recombinant virus vector-producing cells and adding them to the target cells. Although it is preferable in that it is possible, there is a problem that the LTR on the structure of the virus causes tumorigenicity, and there are also disadvantages that the number of copies to be introduced is increased. Therefore, it is preferable to use a non-viral vector.

このようなベクターとしては、たとえば、非ウイルス性プロモーターCAGを含有し、Cre組換え酵素の標的となる一対のloxP配列間にSV40T遺伝子とハイグロマイシン耐性(HygR)・単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ(HSVTK)融合遺伝子とをコードし、さらに該LoxP配列外にゼオシン耐性(ZeoR)・HSVTK融合遺伝子を同時にコードする非ウイルスベクターpYK1(図1)が使用できる。ここで、非ウイルス性プロモーターとしては、CAGプロモーターなどが使用できるが、発現の強さからCAGプロモーターが好ましい。なお、CAGプロモーターは、サイトメガロウイルスIEエンハンサー(cytomegalovirus IE enhancer)、チキンβ−アクチンプロモーター(chicken β-actin promoter)およびウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル(rabbit β-globin polyadenylation signal)から構成されており、以下の論文を参照することで当業者なら製造可能である(Kanegae Y, Takamori K, Sato Y, et al., Gene (1996) 181: 207-212.)。   Such vectors include, for example, the SV40T gene and hygromycin resistance (HygR) herpes simplex virus-thymidine kinase (HSVTK) between a pair of loxP sequences that contain the non-viral promoter CAG and are targeted by Cre recombinase. A non-viral vector pYK1 (FIG. 1) that encodes a fusion gene and also encodes a zeocin resistance (ZeoR) / HSVTK fusion gene outside the LoxP sequence can be used. Here, as the non-viral promoter, a CAG promoter or the like can be used, but the CAG promoter is preferable because of its strong expression. The CAG promoter is composed of cytomegalovirus IE enhancer, chicken β-actin promoter and rabbit β-globin polyadenylation signal. It can be produced by those skilled in the art by referring to the following paper (Kanegae Y, Takamori K, Sato Y, et al., Gene (1996) 181: 207-212.).

非ウイルスベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ヌクレオフェクターなどを用いたエレクトロポレーション法があげられる。遺伝子の導入効率の面からは、ヌクレオフェクターなどを用いたエレクトロポレーション法が好ましい。   Non-viral vector introduction methods include calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method using nucleofector and the like. From the viewpoint of gene introduction efficiency, an electroporation method using a nucleofector or the like is preferable.

当該遺伝子導入及びその後の不死化株の樹立、継代に関しては、無血清培地での細胞培養が好ましい。無血清培地としては、CS−C無血清培地やISE−RPMIやHGM (hepatocyte growth medium)などがある。調達の面から、たとえば、セルシステムズ(Cell System)社(シアトル、ワシントン州、米国)や大日本製薬株式会社より入手可能なCS−C無血清培地が好ましい。   For the gene transfer and subsequent establishment and passaging of an immortalized strain, cell culture in a serum-free medium is preferable. Examples of serum-free media include CS-C serum-free media, ISE-RPMI, and HGM (hepatocyte growth medium). From the viewpoint of procurement, for example, CS-C serum-free medium available from Cell Systems (Seattle, Washington, USA) or Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. is preferable.

以上より、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞のなかでも、正常ヒト肝細胞に非ウイルス性ベクターであるpYK1を導入することにより樹立したCYNK−1細胞株(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)およびその継代株が最も好ましい。また、本発明の可逆性不死化肝臓細胞は、図2(CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成15年3月10日、受託番号:FERM BP−08657))に示すように、数個の核小体1を有する大きな核2をもった細胞内顆粒3に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を有する。   As described above, among the reversible immortalized mammalian liver cells of the present invention, the CYNK-1 cell line established by introducing pYK1 which is a non-viral vector into normal human hepatocytes (deposit agency: Industrial Technology, Incorporated Administrative Agency) Research Institute Patent Biological Depositary Center, Address: 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 6th (Postal Code 305-8656), Deposit Date: March 10, 2004, Deposit Number: FERM BP-08657 And its passage strains are most preferred. Further, the reversible immortalized hepatocytes of the present invention are shown in FIG. 2 (CYNK-1 cells (deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, address: 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) As shown in Chuo No. 6 (zip code 305-8656), deposit date: March 10, 2003, deposit number: FERM BP-08657)), it has a large nucleus 2 with several nucleoli 1 It has morphological characteristics of so-called liver parenchymal cells rich in intracellular granules 3.

本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞は、前述したように部位特異的組換え酵素を作用させることにより不死化遺伝子を除去することができる。組換え酵素は、前述したように使用する部位特異的組替え配列に合わせて、当業者が容易に選択し得る。   As described above, the reversible immortalized mammalian liver cell of the present invention can remove an immortalized gene by acting a site-specific recombinant enzyme. The recombinant enzyme can be easily selected by those skilled in the art according to the site-specific recombination sequence used as described above.

部位特異的組換え酵素を作用させる方法としては、たとえば、Cre組換え酵素の場合、(1)遺伝子導入効率の良好なアデノウイルスベクターによりCre組換え酵素を形質導入する方法、(2)リン酸カルシウム法にて、Cre組換え酵素DNAを細胞培養液中に添加する方法、(3)培養上清中に、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)(HIV)由来のTATタンパク質とCre組み換え酵素との融合タンパク質を添加する方法、(4)Cre組換え酵素タンパク質をカチオニック化して、細胞培養液中に添加する方法、さらに(5)薬剤誘導性Cre組み換え酵素発現ベクターを導入することにより、薬剤を添加することで該遺伝子の除去を自由に起こさせるシステムを付加する方法などがあげられる。   For example, in the case of Cre recombinase, (1) a method of transducing Cre recombinase with an adenovirus vector having good gene transfer efficiency, and (2) a calcium phosphate method. (3) Fusion of TAT protein derived from human immunodeficiency virus (HIV) and Cre recombinase into the culture supernatant. A method of adding a protein, (4) a method of cationically adding a Cre recombinase protein and adding it to a cell culture medium, and (5) adding a drug by introducing a drug-inducible Cre recombinase expression vector. Thus, a method of adding a system for freely causing the removal of the gene can be used.

本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞株またはその継代株から不死化遺伝子を除去することにより得られる復帰細胞は、復帰前の細胞よりやや大型化し、数個の核小体を有する核をもった細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を維持している。   The reverting cells obtained by removing the immortalizing gene from the reversible immortalized mammalian liver cell line of the present invention or its passages are slightly larger than the cells before reversion, and have nuclei having several nucleoli. It maintains the morphological characteristics of so-called liver parenchymal cells, rich in intracellular granules.

一方、肝機能不全を改善するための肝臓細胞としては、いくつかの生化学的な要求を満たさなければならない。すなわち、i)ビリルビン血漿や黄疸を軽減する、ii)高アンモニア血症に起因する肝性脳症の改善、iii)血液の解毒と浄化作用、iv)アルブミンや血液凝固因子の補給、などである。高アンモニア血症の軽減はとりわけ、肝性脳症および脳死の進展防止に重要である(Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997)。グルタミンシンセターゼ(GS)は、アンモニア除去の主要な酵素であり、肝機能不全を改善するための樹立肝細胞株としては、この酵素の発現が重要である(Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997)。   On the other hand, as a liver cell for improving liver dysfunction, several biochemical requirements must be satisfied. That is, i) reduces bilirubin plasma and jaundice, ii) improves hepatic encephalopathy due to hyperammonemia, iii) detoxification and purification of blood, iv) supplementation of albumin and blood coagulation factors, and the like. Reduction of hyperammonemia is particularly important in preventing the development of hepatic encephalopathy and brain death (Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997). Glutamine synthetase (GS) is a major enzyme for ammonia removal, and expression of this enzyme is important as an established hepatocyte cell line for improving liver dysfunction (Strom SC. Transplantation 63, 559, 1997). ).

したがって、可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびその継代細胞ならびにそれらの復帰細胞は、少なくともアルブミン遺伝子、ビリルビン−UGT遺伝子、GS遺伝子、GST−π遺伝子およびHBCF−X遺伝子のいずれかが発現していることが好ましく、これらすべての遺伝子が発現していることがより好ましい。   Therefore, reversible immortalized mammalian liver cells and their passage cells and their reverted cells express at least one of albumin gene, bilirubin-UGT gene, GS gene, GST-π gene and HBCF-X gene. It is preferable that all these genes are expressed.

このような、本発明の可逆性不死化哺乳類肝臓細胞およびその継代細胞ならびにそれらの復帰細胞は、バイオ人工肝臓や細胞製剤として種々の肝疾患の治療に使用することができる。   Such reversible immortalized mammalian liver cells of the present invention and their passage cells and their reverted cells can be used as bioartificial livers or cell preparations for the treatment of various liver diseases.

本発明における「肝疾患」としては、たとえばウイルス、薬剤、そして中毒(キノコ等)による急性肝不全などの肝不全、血友病、α1−抗トリプシン欠損症、ガラクトース血症、肝腎性チロシン血症、カエデシロップ尿症、糖原病1a型、肝性ポルフィリン症、低ベータリポ蛋白血症、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症1型、クリグラー−ナジャー症候群1型、高フェニルアラニン血症などの代謝性肝疾患、慢性肝疾患の急性増悪などが含まれる。本発明の治療剤は、肝不全および代謝性肝疾患の治療に用いられることが好ましい。   Examples of the “liver disease” in the present invention include liver failure such as acute liver failure due to viruses, drugs, and poisoning (mushrooms, etc.), hemophilia, α1-antitrypsin deficiency, galactosemia, hepatorenal tyrosineemia , Maple syrup urine disease, glycogenosis type 1a, hepatic porphyria, hypobetalipoproteinemia, hypercholesterolemia, primary hyperoxaluria type 1, Crigler-Nager syndrome type 1, hyperphenylalaninemia, etc. Metabolic liver disease, acute exacerbation of chronic liver disease and the like. The therapeutic agent of the present invention is preferably used for the treatment of liver failure and metabolic liver disease.

本発明の細胞製剤は、前記可逆性不死化哺乳類肝臓細胞もしくはその継代細胞またはそれらの復帰細胞を、培地、等張液、または緩衝液に懸濁した懸濁液、もしくは遠心などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などがあげられる。培地、等張液、または緩衝液は、前記肝臓細胞に適合するよう適宜選択される。さらに、前記細胞製剤は、DMSOなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。また、前記細胞製剤としては、ヒト体内に接種されることを考慮して、不死化遺伝子を除去した復帰細胞を使用することが好ましい。細胞製剤は、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンC処理など、細胞製剤としての機能を残しつつ、病原細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる。   In the cell preparation of the present invention, the reversible immortalized mammalian liver cells or their passage cells or their reverted cells are concentrated by a suspension suspended in a medium, an isotonic solution, a buffer solution, or centrifugation. Examples include cell clusters such as pellets. The medium, isotonic solution, or buffer is appropriately selected so as to be compatible with the liver cells. Furthermore, the cell preparation can be cryopreserved by adding a protective agent such as DMSO. As the cell preparation, it is preferable to use reverted cells from which the immortalizing gene has been removed in consideration of being inoculated into the human body. In order to use the cell preparation more safely, the cell preparation may be treated under conditions such as heat treatment, radiation treatment, mitomycin C treatment, etc. while leaving the function as a cell preparation and the protein of the pathogenic cell is denatured. it can.

細胞製剤の投与形態(移植方法)としては、経門脈的投与、腹くう内投与、脾臓内投与などが使用できる。なかでも、経門脈的投与や脾臓内投与がさらに好ましく、経門脈的投与が最も好ましい。細胞製剤の投与量(移植量)は、1億個〜100億個/固体が好ましく、5億個〜100億個/固体がさらに好ましく、10億個から100億個/固体が最も好ましい。また、投与量(移植量)は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。   As the administration form (transplantation method) of the cell preparation, transportal administration, intraperitoneal administration, intrasplenic administration, and the like can be used. Of these, transportal administration and intrasplenic administration are more preferable, and transportal administration is most preferable. The dose (transplantation amount) of the cell preparation is preferably 100 to 10 billion / solid, more preferably 500 to 10 billion / solid, and most preferably 1 to 10 billion / solid. The dose (transplant amount) can be appropriately changed depending on the age, weight, symptoms, etc. of the patient to be administered.

バイオ人工肝臓としては、中空糸型のリアクター(デバイス)と分離・培養細胞を組み合わせたバイブリッド型の人工肝臓などが挙げられる。バイオ人工肝臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の可逆性不死化肝臓細胞および復帰肝臓細胞はどちらも、いずれの形態のバイオ人工肝臓にも使用可能である。   Examples of the bioartificial liver include a hybrid type artificial liver combining a hollow fiber type reactor (device) and separated / cultured cells. There are three types of bioartificial livers: those that are attached outside the body and connected to blood vessels, those that are placed in the body and connected to blood vessels, and those that are placed in the abdominal cavity without being connected to blood vessels. Both the reversible immortalized and reverted liver cells of the present invention can be used in any form of bioartificial liver.

バイオ人工肝臓の開発においては、リアクターの設計・開発も重要な要素である。バイオリアクターとしては、サーシ バイオメディカル社(Circe Biomedical Inc.)(レキシントン、マサチューセッツ州、米国)の支援下でシダーズサイナイ医療センター(Cedars-Sinai Medical Center)(ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国)のディメトリュー(Demetriou)らを中心としたブタ肝細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のヘパトアシスト(HepatAssist)(Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15.)や、ブタ肝細胞を使用したドイツのGerlachらのMELS(モジュラー体外肝臓システム(Modular Extracorporeal Liver System))など、様々なタイプが知られている。これらのリアクターは、もちろん本発明において使用することができるが、肝細胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。肝細胞は、浮遊状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、ストレス刺激を受けやすい。   In the development of bioartificial liver, the design and development of reactors is also an important factor. Bioreactors include Demetriou of Cedars-Sinai Medical Center (Los Angeles, California, USA) with the support of Circe Biomedical Inc. (Lexington, Massachusetts, USA). HepatAssist (Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15.) And porcine hepatocytes for bioartificial liver treatment using porcine hepatocytes Various types are known, such as MELS (Modular Extracorporeal Liver System) by Gerlach et al. In Germany. These reactors can of course be used in the present invention, but because there is no scaffold for hepatocytes to attach, the cells are simply suspended in the space inside the hollow fiber or the space outside the hollow fiber. There is a tendency to become a state. In the floating state, hepatocytes have a tendency that the differentiation function is not sufficiently expressed, and further, they collide with surrounding cells and are easily subjected to stress stimulation.

したがって、本発明においては、肝細胞に足場が提供できるよう、中空糸と不織布からなるリアクターが好ましい。   Therefore, in the present invention, a reactor comprising a hollow fiber and a non-woven fabric is preferable so that a scaffold can be provided for hepatocytes.

中空糸膜としては、膜表面に細胞が付着して物質交換が妨げられることがなければどのようなものでも使用することができ、具体的には、従来医療用に用いられている市販の物、たとえば、ポリスルフォン膜、エチレン−酢酸ビニルランダム共重合体けん化物膜(たとえば、商品名:エバール、クラレメディカル株式会社製など)などが好ましい。市販の中空糸膜のポアサイズは、その用途から透析膜(〜5nm)、血漿成分分離膜(20〜30nm)、血漿分離膜(30〜200nm)などがある。物質の透過性の点からは、血漿分離膜(30〜200nm)が好ましい。   Any hollow fiber membrane can be used as long as cells do not adhere to the membrane surface and hinder the substance exchange. Specifically, it is a commercially available product that has been used for medical purposes. For example, a polysulfone film, an ethylene-vinyl acetate random copolymer saponified film (for example, trade name: EVAL, manufactured by Kuraray Medical Co., Ltd.) and the like are preferable. The pore size of commercially available hollow fiber membranes includes dialysis membranes (˜5 nm), plasma component separation membranes (20-30 nm), plasma separation membranes (30-200 nm), and the like. From the viewpoint of substance permeability, a plasma separation membrane (30 to 200 nm) is preferred.

不織布としては、細胞が接着することが出来るように加工・修飾されているものが好ましい。なかでも、その加工のしやすさの点から、ポリ四フッ化エチレン(PTFE)にポリアミノ酸ウレタン(PAU)加工を施したものが好ましい。   The nonwoven fabric is preferably processed and modified so that cells can adhere to it. Of these, polytetrafluoroethylene (PTFE) subjected to polyamino acid urethane (PAU) processing is preferable from the viewpoint of ease of processing.

本発明のバイオ人工肝臓リアクターの一実施態様を例に、ハウジングまでの過程を図5に示す。裏打4を施した不織布5上に中空糸膜6を置く(図5(a))。ここで、裏打ち4を施した不織布5にはスリット7が設けられている。これをロール状に巻く(図5(b))。そのX−X線断面が図5(c)である。これを両端に液漏れ防止部材8を設けた筒状容器9に組み込む。リアクターには細胞注入口11および細胞のサンプル採取を行なうことができる取り出し口12が設けられており、スリット7は、細胞注入口11と連絡するように配置される。   Taking one embodiment of the bioartificial liver reactor of the present invention as an example, the process up to the housing is shown in FIG. A hollow fiber membrane 6 is placed on the nonwoven fabric 5 provided with the backing 4 (FIG. 5A). Here, slits 7 are provided in the nonwoven fabric 5 provided with the backing 4. This is wound into a roll shape (FIG. 5B). The XX line cross section is FIG.5 (c). This is incorporated into a cylindrical container 9 provided with a liquid leakage preventing member 8 at both ends. The reactor is provided with a cell inlet 11 and an outlet 12 through which a cell sample can be collected, and the slit 7 is disposed so as to communicate with the cell inlet 11.

また、バイオ人工肝臓治療は、安全かつ科学的に施行するために、1)人工肝臓リアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、2)気泡が発生した際のアラームの作動、3)リアクターの温暖化(37度)などができる機能を一体化した装置で実施されることが好ましい。   In order to implement bioartificial liver treatment safely and scientifically, 1) real-time monitoring of inflow pressure and outflow pressure of the artificial liver reactor, 2) activation of alarm when bubbles are generated, and 3) reactor It is preferable to implement with an apparatus that integrates a function capable of warming (37 degrees).

以下、具体的な実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例1
非ウイルスベクターpYK−1の製造
非ウイルスベクターpYK−1(図1)を以下の手順で作製した(図2参照)。
Example 1
Production of non-viral vector pYK-1 A non-viral vector pYK-1 (FIG. 1) was prepared by the following procedure (see FIG. 2).

(1)ゼオシン耐性遺伝子(ZeoR)フラグメントを得るために、pCMV/Zeo(インビトロジェン社製)を鋳型にし、5′側にXhoIを組み込んだプライマーP3、3′側にHSVTKを組み込んだプライマーP5′をゼオシン領域の両端に設定し、これを用いて反応条件、95℃、5分、(95℃、30秒、60℃、30秒、72℃、2分)×30サイクル、72℃、15分でPCR反応を行なった。P3プライマーは、ゼオシン開始コドンを抜き、ゼオシンが発現できないようにした。 (1) In order to obtain a zeocin resistance gene (ZeoR) fragment, using pCMV / Zeo (manufactured by Invitrogen) as a template, primer P3 incorporating XhoI on the 5 ′ side and primer P5 ′ incorporating HSVTK on the 3 ′ side Set at both ends of zeocin region, using this, reaction conditions, 95 ° C, 5 minutes, (95 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 72 ° C, 2 minutes) x 30 cycles, 72 ° C, 15 minutes PCR reaction was performed. The P3 primer removed the zeocin start codon so that zeocin could not be expressed.

(2)HSVTKフラグメントを得るためにSSR#69(Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93: 8971-8976, 1996)を鋳型にし、プライマーP6′、P7をHSVTK領域の両端に設定し、これを用いて反応条件、95℃、5分、(95℃、30秒、60℃、30秒、72℃、2分)×30サイクル、72℃、15分でPCR反応を行なった。 (2) In order to obtain an HSVTK fragment, SSR # 69 (Westerman KA, Leboulch P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8971-8976, 1996) was used as a template, and primers P6 ′ and P7 were used in the HSVTK region. Set at both ends and use this for PCR reaction at 95 ° C, 5 minutes, (95 ° C, 30 seconds, 60 ° C, 30 seconds, 72 ° C, 2 minutes) × 30 cycles, 72 ° C, 15 minutes I did it.

(3)ゼオシン、HSVTK結合フラグメントを得るために前記(1)で回収したゼオシン、前記(2)で回収したTKフラグメントのミックスを鋳型にし、プライマーP3、P7を用いて反応条件、95℃、5分、(95℃、30秒、61℃、1分、72℃、3分)×30サイクル、72℃、15分でPCR反応を行なった。プライマーP5′の3′側とP6′の5′側は相補的に設計してあるため、このPCRによりゼオシンおよびHSVTKフラグメントは結合された。 (3) In order to obtain a zeocin, HSVTK-binding fragment, the zeocin recovered in (1) above and the TK fragment recovered in (2) above were used as templates, using primers P3 and P7, reaction conditions, 95 ° C., 5 ° C. The PCR reaction was carried out in minutes (95 ° C., 30 seconds, 61 ° C., 1 minute, 72 ° C., 3 minutes) × 30 cycles, 72 ° C., 15 minutes. Since 3 'side of primer P5' and 5 'side of P6' were designed to be complementary, zeocin and HSVTK fragment were combined by this PCR.

(4)ハイグロマイシン耐性遺伝子、HSVTK遺伝子、EMCV−IRES遺伝子、SV40T遺伝子を含むフラグメントを得るために、SSR69を鋳型にし、この領域の両端に設定したプライマーP1、P2を用いて反応条件、95℃、5分、(95℃、30秒、60℃、1分、72℃、5分)×30サイクル、72℃、15分でPCR反応を行なった。 (4) In order to obtain a fragment containing a hygromycin resistance gene, HSVTK gene, EMCV-IRES gene, and SV40T gene, reaction conditions were set at 95 ° C. using primers P1 and P2 set at both ends of this region using SSR69 as a template. The PCR reaction was performed for 5 minutes (95 ° C., 30 seconds, 60 ° C., 1 minute, 72 ° C., 5 minutes) × 30 cycles, 72 ° C., 15 minutes.

なお、P1プライマーの5′側にはHCV5′UTRとLoxPが、P2プライマーの3′側にはLoxPおよびXhoIが組み込んである。   HCV 5′UTR and LoxP are incorporated on the 5 ′ side of the P1 primer, and LoxP and XhoI are incorporated on the 3 ′ side of the P2 primer.

得られたPCR産物は、NuSieveアガロースとSeaKemアガロースとを3:1の割合で混合したものを1.2%含有するゲルで電気泳動した後、DNACELL(第一化学薬品株式会社製)で精製し、回収した。   The obtained PCR product was subjected to electrophoresis on a gel containing 1.2% of a mixture of NuSieve agarose and SeaKem agarose at a ratio of 3: 1, and then purified by DNACELL (Daiichi Chemical Co., Ltd.). Recovered.

次いで、ゼオシン、HSVTK結合フラグメントをXhoI、T4PNK処理し、XhoI、SmaI処理したLoxPスイッチング発現ベクターであるpCALNL5/pBR322Hに、LigaFast Rapid DNA Ligation System(プロメガ(Promega)社)を用いて挿入ライゲーションした。なお、pCALNL5/pBR322Hは、pCALNL5(理研バンクRDB−1862)のpUC OriをpBR322 Oriに交換することにより作製した。エレクトロポレーションによりコンピテントセル(JM109)に形質転換し、アンピシリンを含むLBプレートで選抜した。得られたクローンをMluI、T4pol、XhoIで処理したものに、XhoI、T4K処理したハイグロマイシン耐性遺伝子、HSVTK遺伝子、EMCV−IRES遺伝子、SV40T遺伝子を含むフラグメントを挿入し、コンピテントセル(JM109)に形質転換し、アンピシリンを含むLBプレートで選抜し、pYK1を製造した。   Next, the Zeocin and HSVTK binding fragments were treated with XhoI and T4PNK, and inserted into a LOXP switching expression vector pCALNL5 / pBR322H treated with XhoI and SmaI using a LigaFast Rapid DNA Ligation System (Promega). In addition, pCALNL5 / pBR322H was produced by exchanging pUC Ori of pCALNL5 (RIKEN Bank RDB-1862) with pBR322 Ori. The cells were transformed into competent cells (JM109) by electroporation and selected on LB plates containing ampicillin. A fragment containing the hygromycin resistance gene, HSVTK gene, EMCV-IRES gene, and SV40T gene treated with XhoI and T4K was inserted into the clone treated with MluI, T4pol, and XhoI, and inserted into a competent cell (JM109). After transformation, selection was performed on an LB plate containing ampicillin to produce pYK1.

実施例2
可逆性不死化ヒト肝細胞株CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)の樹立
T−25フラスコ内で80%コンフルエントの状態の継代数1の正常ヒト肝細胞(CS-ABI-3716、大日本製薬株式会社販売)をトリプシン処理し、100万個のヒト肝細胞を得た。これを、ヌクレオフェクターシステム用緩衝液(NucleofectorTM Solution、和光純薬工業株式会社製)1mlで希釈し、そこにpYK−1のプラスミドDNAのTE緩衝液(TE buffer、シグマ社製)の懸濁液(1μg/μl)2μlを添加して、ヌクレオフェクターシステム(NucleofectorTMシステム、和光純薬工業株式会社製)により、該システムのプロトコールにしたがって遺伝子導入した。得られた細胞をT−25フラスコに播種し、CS−C無血清培地(CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売)にて培養を継続した。遺伝導入して48時間後に、100μg/mlのハイグロマイシン含有CS−C無血清培地にて、耐性クローンの選択を行なった。選択開始から2週間後に耐性クローンの出現を認め、4週間後にクローニングリングを使用し、CYNK−1細胞株(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)を樹立した。
Example 2
Reversible immortalized human hepatocyte cell line CYNK-1 (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, Central 6 (Zip 305-8856) ), Date of deposit: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657), normal human hepatocytes with passage number 1 (CS-ABI-3716, 80% confluent in T-25 flask) Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was treated with trypsin to obtain 1 million human hepatocytes. This was diluted with 1 ml of Nucleofector System Buffer (Nucleofector TM Solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and a suspension of pYK-1 plasmid DNA in TE buffer (TE buffer, manufactured by Sigma) was added thereto. 2 μl of the solution (1 μg / μl) was added, and the gene was introduced by a Nucleofector system (Nucleofector system, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the protocol of the system. The obtained cells were seeded in a T-25 flask and cultured in a CS-C serum-free medium (CS-SF-4Z0-500, sold by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Forty-eight hours after gene transfer, resistant clones were selected in a 100-g / ml hygromycin-containing CS-C serum-free medium. Two weeks after the start of selection, the appearance of resistant clones was confirmed. After four weeks, the cloning ring was used, and the CYNK-1 cell line (Depositor: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Address: Ibaraki, Japan) Tsukuba City East 1-chome 1 1 Chuo 6th (Postal Code 305-8656), Deposit Date: March 10, 2004, Deposit Number: FERM BP-08657).

この細胞を、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した(あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)。   The cells were deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: 1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 6th postal code (305-8856), date of deposit: 2004 March 10, accession number: FERM BP-08657).

得られたCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)は、数個の核小体1を有する大きな核2をもった細胞内顆粒3に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を示した(図4)。CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)は、増殖が停止する危機(クライシス)もなく不死化し、無血清のCS−C培地下に単層に増殖し、約48時間でその数が倍加した。   CYNK-1 cells obtained (Depositing organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Chuo 6th (zip code 305-8666), date of deposit : March 10, 2004, accession number: FERM BP-08657) is a so-called liver parenchymal cell morphology rich in intracellular granules 3 with a large nucleus 2 having several nucleoli 1 The characteristic was shown (FIG. 4). CYNK-1 cells (Deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, Address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, Central 6th (Zip code 305-8666), Date of deposit: Heisei 16 March 10, 2010, accession number: FERM BP-08657), immortalized without the crisis of stopping the growth (crisis), proliferated in a monolayer under serum-free CS-C medium, the number in about 48 hours Doubled.

実施例3
Cre組換え酵素によるSV40T遺伝子の切り出し(図3参照)
核内限局信号(NLS)標識されたCre組換え酵素を産生する複製不可能な組換えアデノベクターAxCANCre(3×108pfu/ml)(理研ジーンバンク、日本、RDB No.1748)をMOI(感染多重度)=5でCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)に感染させた。AxCANCreで1時間感染したのち、細胞をトリプシンで処理して回収し、5日間のゼオシン選択(5μg/mlゼオシン(シグマ社)含有CS−C無血清培地で培養)により完全なるSV40T遺伝子発現細胞の排除が達成された。一過性のCre組換え酵素の発現で、LoxP配列間のDNAの切り出しが生じた。
Example 3
Excision of SV40T gene by Cre recombinase (see FIG. 3)
A non-replicatable recombinant adenovector AxCANCre (3 × 10 8 pfu / ml) (RIKEN Genebank, Japan, RDB No. 1748) that produces a nuclear recombination signal (NLS) -labeled Cre recombinase (MOI) Multiplicity of infection) = 5 and CYNK-1 cells (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 6th Central (Zip 305-8586) ), Deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657). After infection with AxCANCre for 1 hour, the cells were collected by treatment with trypsin, and a complete SV40T gene-expressing cell was obtained by zeocin selection (cultured in CS-C serum-free medium containing 5 μg / ml zeocin (Sigma)) for 5 days. Elimination was achieved. Transient Cre recombinase expression resulted in excision of DNA between LoxP sequences.

得られた細胞は、復帰前の細胞よりやや大型化し、数個の核小体を有する核をもった細胞内顆粒に富んだ、いわゆる肝臓の実質細胞の形態学的特徴を維持していた。   The obtained cells were slightly larger than the cells before reversion, and maintained the morphological characteristics of so-called liver parenchymal cells, rich in intracellular granules with nuclei having several nucleoli.

試験例1
SV40T遺伝子除去前後のCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)における遺伝子発現
RT−PCR法により、SV40T遺伝子切り出し前後のCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)において、肝臓代謝に関わる重要な遺伝子、すなわち、アルブミン遺伝子、アルブミン遺伝子、ASGPR遺伝子、ビリルビン−UGT遺伝子、GS遺伝子、GST−π遺伝子およびHBCF−X遺伝子、ならびにSV40T遺伝子の発現を調べた。RT−PCR法では、RNAzol(シンナ/バイオテックス社、フレンズウッド、テキサス州、米国)を用いてCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)からRNAを抽出し、1μgの総RNAを22℃で10分間、さらに42℃で20分間、RNA逆転写酵素を用いて逆転写反応させた。
Test example 1
CYNK-1 cells before and after SV40T gene removal (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, Central 6 (Zip 305-8586), Deposit date: March 10, 2004, Deposit number: FERM BP-08657) CYNK-1 cells before and after SV40T gene excision by RT-PCR method (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Patent Biological Depositary Center, Address: 1st East, 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 1st Central (Postal Code: 305-8656), Deposit Date: March 10, 2004, Deposit Number: FERM BP-08657) Important genes involved in metabolism, ie, albumin gene, albumin gene, ASGPR gene, biryl The expression of bin-UGT gene, GS gene, GST-π gene, HBCF-X gene, and SV40T gene was examined. In the RT-PCR method, CYNK-1 cells (deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, Japan) using RNAzol (Sinna / Biotex, Friendswood, Texas, USA) Extract 1 RNA from Tsukuba 1-chome, Ibaraki Prefecture, 1st Central 1 (Postal Code 305-8666), Deposit Date: March 10, 2004, Deposit Number: FERM BP-08657), 1 μg of total RNA Reverse transcription reaction was carried out using RNA reverse transcriptase at 22 ° C for 10 minutes and further at 42 ° C for 20 minutes.

得られた2μgの逆転写産物を、各プライマー20pmol/mlで、AmpliTag Goldキット(パーキン−エルマー/シータス社、ノーウォーク、コネチカット州、米国)を用い、そのプロトコールにしたがってPCR増幅に用いた。PCRは95℃で10分間インキュベーションし、95℃で30秒、60℃で30秒および72℃で30秒からなるインキュベーションを35サイクル行ない、最後に72℃で7分間インキュベーションして実施した。各遺伝子に対するプライマーには下記のものを使用した。   2 μg of the reverse transcription product obtained was used for PCR amplification using the AmpliTag Gold kit (Perkin-Elmer / Cetus, Norwalk, Conn., USA) with 20 pmol / ml of each primer. PCR was performed at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 35 cycles of incubation consisting of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds, and finally 72 ° C. for 7 minutes. The following primers were used for each gene.

アルブミン遺伝子(576bp)
5′プライマー:AAACCTCTTGTGGAAGAGCC(配列番号1)
3′プライマー:CAAAGCAGGTCTCCTTATCG(配列番号2)
ASGPR遺伝子(495bp)
5′プライマー:TAGGAGCCAAGCTGGAGAAA(配列番号3)
3′プライマー:ACCTGCAGGCAGAAGTCATC(配列番号4)
ビリルビン−UGT遺伝子(495bp)
5′primer:ATGACCCGTGCCTTTATCAC(配列番号5)
3′primer:TCTTGGATTTGTGGGCTTTC(配列番号6)
GST−π遺伝子(496bp)
5′primer:GCCCTACACCGTGGTCTATT(配列番号7)
3′primer:GGCTAGGACCTCATGGATCA(配列番号8)
GS遺伝子(535bp)
5′primer:ATGCTGGAGTCAAGATTGCG(配列番号9)
3′primer:TCATTGAGAAGACACGTGCG(配列番号10)
HBCF−X遺伝子(493bp)
5′プライマー:GTGCATGGAAGAGACCTGCT(配列番号11)
3′プライマー:GAAGTCAAGCAGGTCGAAGG(配列番号12)
SV40T遺伝子(422bp)
5′プライマー:CAGGCATAGAGTGTCTGC(配列番号13)
3′プライマー:CAACAGCCTGTTGGCATATG(配列番号14)
Albumin gene (576 bp)
5 'primer: AAACCCTCTTGTGGAAGAGCC (SEQ ID NO: 1)
3 'primer: CAAAGCAGGTCTCCTTATG (SEQ ID NO: 2)
ASGPR gene (495 bp)
5 'primer: TAGGAGCCAAGCTGGGAGAAA (SEQ ID NO: 3)
3 'primer: ACCTGCAGGGCAAGAGTCATC (SEQ ID NO: 4)
Bilirubin-UGT gene (495 bp)
5 'primer: ATGACCCGTGCCTTTATACAC (SEQ ID NO: 5)
3'primer: TCTTGGATTTGTGGGCTTTC (SEQ ID NO: 6)
GST-π gene (496 bp)
5 ′ primer: GCCCTACACCGTGGTCCTATT (SEQ ID NO: 7)
3 'primer: GGCTAGGACCCATCATGGATCA (SEQ ID NO: 8)
GS gene (535 bp)
5'primer: ATGCTGGAGTCAAAGTGCG (SEQ ID NO: 9)
3'primer: TCATTGAGAAGACACTGTGCG (SEQ ID NO: 10)
HBCF-X gene (493 bp)
5 'primer: GTGCATGGAAGAGACCTGCT (SEQ ID NO: 11)
3 'primer: GAAGTCCAAGCAGGTCGAAGG (SEQ ID NO: 12)
SV40T gene (422 bp)
5 'primer: CAGGCATAGAGGTCTGC (SEQ ID NO: 13)
3 'primer: CAACAGCCCTGTTGCATATTG (SEQ ID NO: 14)

可逆性不死化の前後でこうした肝機能遺伝子の発現は保存され、Cre/loxP組み替えによるSV40T遺伝子除去が認められた(図6(a)および図6(b)参照)。また、当該結果は、SV40T遺伝子の除去前後のCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)にアルブミンや血液凝固因子といった生理活性物質を製造させ、細胞性医薬品の開発に応用することが可能であることを示唆するデータである。   Expression of these liver function genes was preserved before and after reversible immortalization, and SV40T gene removal by Cre / loxP recombination was observed (see FIGS. 6 (a) and 6 (b)). In addition, the results are as follows. CYNK-1 cells before and after the removal of the SV40T gene (deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Postal code 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657) to manufacture physiologically active substances such as albumin and blood coagulation factors and apply them to the development of cellular medicines This data suggests that it is possible.

試験例2
SV40T遺伝子除去前後のCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)のガンシクロビル感受性
200個のCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)を96ウェルプレートに播種し、CS−C無血清培地のみ、または種々の濃度のガンシクロビル(5、10、20、50および100μM)を添加したCS−C無血清培地にて培養し、MTTアッセイ(Mcsmann T.J., Immunol. Methods, 65, 55, 1983)にて細胞増殖を検討した。
Test example 2
CYNK-1 cells before and after SV40T gene removal (Deposit organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, Central 6 (Zip 305-8586), Deposit date: March 10, 2004, accession number: FERM BP-08657) susceptibility to ganciclovir 200 CYNK-1 cells (Depositor: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Address: Japan) 1-chome, 1-chome, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref. 6 (postal code 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657), seeded in a 96-well plate, CS-C CS-C bloodless with serum-free medium alone or with various concentrations of ganciclovir (5, 10, 20, 50 and 100 μM) Cultured in medium, MTT assay (Mcsmann TJ, Immunol. Methods, 65, 55, 1983) at was examined cell proliferation.

細胞の生存率を、相対的感受性として図7に示す。CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)のガンシクロビルに対する感受性は、ガンシクロビルの濃度に依存し、5μMのGCVで1週間培養することで増殖を停止し、一部の細胞は死滅した(図7および8)。   Cell viability is shown in FIG. 7 as relative sensitivity. CYNK-1 cells (Deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, Address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, 6th postal code (305-8565), Date of deposit: 2004 The sensitivity to ganciclovir of March 10, 2010, accession number: FERM BP-08657) was dependent on the concentration of ganciclovir, and the growth was stopped by culturing with 5 μM GCV for 1 week, and some cells died ( 7 and 8).

復帰CYNK−1細胞も同様にGCVに対して感受性を示し、5μMのGCV存在下で1週間培養することにより増殖を停止し、一部の細胞は死滅し(図9)、10日以内にすべての細胞が死滅した。   Reverted CYNK-1 cells were similarly sensitive to GCV and stopped growing by culturing for 1 week in the presence of 5 μM GCV, some cells died (FIG. 9), all within 10 days Cells were killed.

これらのデータは、細胞の増殖がガンシクロビルの投与にて制御可能であることを示す。   These data indicate that cell proliferation can be controlled by administration of ganciclovir.

試験例3
復帰CYNK−1細胞による肝不全治療効果
T225の細胞培養フラスコ(コーニング社(Corning)、ニューヨーク州、米国)を使用して、CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)を、培養液A(CS−C無血清培地(CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売)に、0.1mg/L ストレプトマイシン、100U/ml ペニシリンGを加えたもの)を用い、室温37℃、二酸化炭素濃度5%のインキュベーターで培養した。CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)が増殖し、1個のフラスコにて2千万個の細胞を調達した。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に0.02% EDTAを加えた0.25%トリプシン液8mlを使用して、細胞をフラスコの表面から剥がし、さらに培養液Aを40ml加えたて撹拌した後、4℃、800rpm、7minで遠心分離器にかけ細胞を回収した。得られたCYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)(3個のT225細胞培養フラスコ分、計6千万個)に培養液A30mlを加え撹拌後、ローラーボトル(正式名:1700cm2 Expanded Surface Roller Bottle、コーニング社)に播種し、培養液A500mlを加えて培養を行なった。4本のローラーボトルを、細胞製造ローラー装置(Cell preparation roller apparatus)(ベルコ(Bellco)社)を利用して、大量培養を施行した。細胞がコンフルエントになった状態で、アデノウイルスベクターAxCANCreを添加し、組み換え反応を起こした。AxCANCreを添加48時間後から5日間ゼオシン含有培地にて培養した後、同様にトリプシン処理して細胞を回収した。1本のローラーボトルから3億個、計4本で、12億個の復帰細胞が入手できた。
Test example 3
Hepatic failure treatment effect by reverted CYNK-1 cells Using T225 cell culture flask (Corning, NY, USA), CYNK-1 cells (Deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Patented Biology Deposit Center, Address: 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 1st Central (Postal Code 305-8656), Date of Deposit: March 10, 2004, Deposit Number: FERM BP-08657) A (CS-C serum-free medium (CS-SF-4Z0-500, sold by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) with 0.1 mg / L streptomycin and 100 U / ml penicillin G) at room temperature of 37 ° C., The cells were cultured in an incubator with a carbon dioxide concentration of 5%. CYNK-1 cells (Deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, Address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, Central 6th (Zip code 305-8666), Date of deposit: Heisei 16 On March 10, 2012, the accession number: FERM BP-08657) proliferated and procured 20 million cells in one flask. Using 8 ml of 0.25% trypsin solution in which 0.02% EDTA is added to PBS (phosphate buffered saline), the cells are detached from the surface of the flask, and 40 ml of culture medium A is added and stirred. The cells were collected by centrifuging at 4 ° C., 800 rpm, 7 min. CYNK-1 cells obtained (Depositing organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Chuo 6th (zip code 305-8666), date of deposit : March 10, 2004, accession number: FERM BP-08657) (3 T225 cell culture flasks, 60 million in total), after adding 30 ml of culture medium A, stirring, roller bottle (official name: 1700 cm 2 (Expanded Surface Roller Bottle, Corning) was added, and 500 ml of the culture solution A was added to carry out the culture. The four roller bottles were subjected to mass culture using a cell preparation roller apparatus (Bellco). With the cells confluent, the adenovirus vector AxCANCre was added to cause a recombination reaction. After 48 hours from the addition of AxCANCre and culturing in a zeocin-containing medium for 5 days, the cells were collected by trypsin treatment in the same manner. From one roller bottle, 300 million cells, a total of 4 cells, obtained 1.2 billion reverted cells.

岡山県美星町農協より購入したランドレースホワイト(Landrace White)種の雌性ブタ(5kg)10頭を使用し、術前12時間絶食とした。硫酸アトロピン(扶桑薬品工業株式会社製、大阪、日本)0.5mgおよび動物用ケタラール(塩酸ケタミン)(三共株式会社製、東京、日本)3mgを筋肉注射し、鎮静後、ドロレプタン(ドロペリドール)(三共株式会社製、東京、日本)1mg、ミオブロック(臭化パンクロニウム)(オルガノン社製、オランダ)2mgを静脈内注射し、気管内挿管を行った。酸素、笑気、セボフルレンを使用し、人工呼吸器にて麻酔を維持し左外頸静脈を露出し、6Frアトムチューブ(アトムメディカル株式会社製、東京、日本)のカニュレーションを行った。そして、腹部正中切開にて開腹後、脾静脈から6Frアトムチューブ(アトムメディカル株式会社製、東京、日本)のカニュレーションを行い、先端を門脈本幹に留置した。先端が門脈本幹に位置していることを触診にて確認した。各々のアトムチューブの末端は、皮下トンネルを形成後、皮膚表面に縫合固定した。術前、術後にセパトレン(セファロスポリン系抗生物質)(住友製薬株式会社製、大阪、日本)0.5gを静脈内注射した。術後、完全に覚醒したのを確認し気管内チューブを抜去した。その後直ちに、左外頸静脈へ挿入されているアトムチューブから0.5g/kgのD−ガラクトサミン(シグマ社製)を生理食塩水50mlに溶解した後10分かけて静注し、薬剤性肝障害を誘導した。   Ten female pigs (5 kg) of Landrace White purchased from Miho-cho, Okayama Prefecture, were fasted for 12 hours before surgery. Atropine sulfate (manufactured by Fuso Yakuhin Kogyo Co., Ltd., Osaka, Japan) and ketal for animals (ketamine hydrochloride) (manufactured by Sankyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) were injected intramuscularly, and after sedation, doloreptan (droperidol) (Sankyo) Intratracheal intubation was performed by intravenously injecting 1 mg of Myoblock (pancuronium bromide) (manufactured by Organon, Netherlands) 2 mg, manufactured by Tokyo, Japan. Using oxygen, laughter, and sevoflurane, anesthesia was maintained with a ventilator, the left external jugular vein was exposed, and a 6Fr atom tube (Atom Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan) was cannulated. Then, after abdominal midline incision, a 6Fr atom tube (Atom Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan) was cannulated from the splenic vein, and the tip was placed on the portal trunk. It was confirmed by palpation that the tip was located at the portal vein trunk. The end of each atom tube was sutured to the skin surface after forming a subcutaneous tunnel. Before and after surgery, 0.5 g of cepatren (cephalosporin antibiotic) (Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan) was injected intravenously. After the operation, the endotracheal tube was removed after confirming complete awakening. Immediately after that, 0.5 g / kg D-galactosamine (manufactured by Sigma) was dissolved in 50 ml of physiological saline from an atom tube inserted into the left external jugular vein, and then intravenously administered over 10 minutes to cause drug-induced liver injury. Induced.

各アトムチューブは血栓形成を防止するため、ヘパリン1ml(1000単位)にてロックした。D−ガラクトサミン投与18時間後に、ローラーボトル培養にて調達した10億個の復帰CYNK−1細胞をリンゲル液100mlに希釈して、脾静脈に挿入されている6Frアトムチューブから経門脈的に約30分かけて移植した(移植群、n=5)。コントロール実験として、残りの5匹は細胞を移植しなかった(コントロール群、n=5)。   Each atom tube was locked with 1 ml of heparin (1000 units) to prevent thrombus formation. 18 hours after administration of D-galactosamine, 1 billion reverted CYNK-1 cells procured by roller bottle culture were diluted to 100 ml of Ringer's solution and about 30 portal veins from a 6Fr atom tube inserted into the splenic vein. Transplanted over minutes (transplant group, n = 5). As a control experiment, the remaining 5 mice did not transplant cells (control group, n = 5).

ブタの全身状態の把握のため、心電図、心拍数、動脈圧のモニタリングを行った。移植群では、移植時に一過性の門脈圧の上昇(25cmH20)を認めたが、ブタは肝細胞移植に耐えることが出来た。 ECG, heart rate, and arterial pressure were monitored to understand the general condition of the pig. In the transplant group, a transient increase in portal vein pressure (25 cmH 2 0) was observed at the time of transplantation, but the pigs were able to withstand hepatocyte transplantation.

結果を図10に示す。コントロール群は全例肝不全にて死亡したが、復帰CYNK−1細胞移植群では5例中4例が1ヵ月以上生存し、統計学的に有意差を認めた。当該データは、復帰CYNK−1細胞の移植がヒト肝不全でも有効であることを示唆するものである。   The results are shown in FIG. In the control group, all cases died of liver failure, but in the reverted CYNK-1 cell transplantation group, 4 out of 5 cases survived for 1 month or more, and a statistically significant difference was observed. The data suggests that transplantation of reverted CYNK-1 cells is also effective in human liver failure.

実施例4
バイオ人工肝臓の作製
中空糸と不織布からなる全血還流型システムのバイオ人工肝臓(BAL)(図5参照)を以下の手順に従い作製した。中空糸膜の種類により、表1に示すように、それぞれBAL−1〜BAL−6とした。
Example 4
Production of Bioartificial Liver A bioartificial liver (BAL) (see FIG. 5) of a whole blood reflux system composed of a hollow fiber and a nonwoven fabric was produced according to the following procedure. As shown in Table 1, BAL-1 to BAL-6 were used depending on the type of hollow fiber membrane.

10cmの中空糸膜550本をレーヨンで裏打ちした不織布(10×10cm)の上に規則正しく置き(図5(a)参照)、これをロール状に巻き込んだ(図5(b)参照)。断面の模式図を図5(c)に示す。この不織布と中空糸膜からなるロールを、両端に液漏れ防止部材を設けた筒状容器に組み込んだ(図5(d)参照)。こうして作製されたリアクターに可逆性不死化肝細胞CYNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)約10億個をCS−C無血清培地(CS-SF-4Z0-500、大日本製薬株式会社販売)10mlに懸濁して充填した。   550 pieces of 10 cm hollow fiber membranes were regularly placed on a non-woven fabric (10 × 10 cm) lined with rayon (see FIG. 5A), and wound into a roll (see FIG. 5B). A schematic diagram of the cross section is shown in FIG. The roll made of the nonwoven fabric and the hollow fiber membrane was incorporated into a cylindrical container provided with a liquid leakage preventing member at both ends (see FIG. 5 (d)). Reactor immortalized hepatocytes CYNK-1 (repository organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, address: 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) No. 305-8656), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657) about 1 billion CS-C serum-free medium (CS-SF-4Z0-500, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (Sales) Suspended in 10 ml and filled.

なお、不織布としては、細胞接着性を有するポリアミノ酸ウレタン(PAU)加工のPTFE(polytetrafluoroethylene)不織布(クラレメディカル株式会社製)を使用した。   In addition, as a nonwoven fabric, the PTFE (polytetrafluoroethylene) nonwoven fabric (made by Kuraray Medical Co., Ltd.) of the polyamino acid urethane (PAU) process which has cell adhesiveness was used.

得られたリアクターの生体適合性を判定するために、各リアクターをそれぞれ健常ブタの頚部動静脈間に装着して作動させたところ、24時間循環動態に悪影響なく無事に稼働させることができた。また、赤血球・血小板などの血球成分の減少も認めなかった。   In order to determine the biocompatibility of the obtained reactor, each reactor was installed and operated between the cervical arteriovenous veins of healthy pigs, and was able to operate safely without adversely affecting the circulation dynamics for 24 hours. Also, no decrease in blood cell components such as red blood cells and platelets was observed.

また、BAL治療を安全かつ科学的に施行するために、1)BALリアクターの流入圧と流出圧のリアルタイムでのモニタリング、2)気泡が発生した際のアラームの作動、3)リアクターの温暖化(37度)できる機能を一体化した装置を開発し、システムが良好に作動することをブタ実験にて検証した。   In order to implement BAL treatment safely and scientifically, 1) real-time monitoring of inflow and outflow pressures of BAL reactors, 2) activation of alarms when bubbles occur, and 3) warming of reactors ( 37 degrees), we developed a device that integrates the functions that can be performed, and verified that the system works well in pig experiments.

試験例4
バイオ人工肝臓の肝不全治療効果
施設動物実験取り扱い指針に従い、検疫済みのカニクイザル(日本クレアから購入)を用いて実施例4において作製したバイオ人工肝臓の安全性と有効性を検討した。
Test example 4
Liver Failure Treatment Effect of Bioartificial Liver According to institutional animal experiment handling guidelines, the safety and effectiveness of the bioartificial liver produced in Example 4 using quarantined cynomolgus monkeys (purchased from Clea Japan) were examined.

雄性カニクイザル(4kg、n=6)に、0.5g/kgのD−ガラクトサミン(シグマ社から購入)を静注して薬剤性肝障害を誘導した。   Male cynomolgus monkeys (4 kg, n = 6) were intravenously injected with 0.5 g / kg of D-galactosamine (purchased from Sigma) to induce drug-induced liver injury.

D−ガラクトサミン投与18時間後に、全身麻酔下に治療群のサル(n=2)の左内頚動脈にアトム6Frのカテーテル(アトムメディカル株式会社、東京、日本)を挿入し、そして左外頚静脈にアトム6Frのカテーテルを挿入してその間に、実施例4で作製したリアクターBAL−1を接続した。ポンプにPERISTA BIO-MINIPUNP(ATTO、東京、日本)を用い、流量10ml/分で6時間、体外循環させた。麻酔は、静脈麻酔として、デュプリバンを使用した(5ml/時間)。抗血栓療法として、血液がリアクターを通過する直前に、リアクターの中枢側よりヘパリン1000単位を注入し、以後体外循環中はヘパリンの持続注入(ヘパリン500単位/時間)により、全身ヘパリン化を行なった。   18 hours after administration of D-galactosamine, an Atom 6Fr catheter (Atom Medical Co., Tokyo, Japan) was inserted into the left internal carotid artery of the monkey (n = 2) in the treatment group under general anesthesia, and the left external jugular vein was inserted. An Atom 6Fr catheter was inserted, and the reactor BAL-1 prepared in Example 4 was connected between them. Using PERISTA BIO-MINIPUNP (ATTO, Tokyo, Japan) as a pump, extracorporeal circulation was performed at a flow rate of 10 ml / min for 6 hours. For anesthesia, dupriban was used as intravenous anesthesia (5 ml / hour). As anti-thrombotic therapy, 1000 units of heparin were injected from the central side of the reactor immediately before blood passed through the reactor, and then heparinization was performed by continuous infusion of heparin (heparin 500 units / hour) during extracorporeal circulation. .

ポジティブ・コントロール群(n=2)として、CYNK−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成16年3月10日、受託番号:FERM BP−08657)の代わりに約10億個の新鮮分離ブタ肝細胞(生存率 >90%)を充填したリアクターにより、治療群と同様にして6時間のBAL治療を施行した。新鮮分離ブタ肝細胞は、外科的に切除した肝臓外側区域をディスパーゼとコラーゲナーゼを用いた4段階還流法にて分離した(丸山昌伸,小林直哉,都津川敏範ら、Organ Biology、Vol.9, No.3. 295-301, 2002)。   As a positive control group (n = 2), CYNK-1 cells (deposited organization: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, address: 1-chome, 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, Chuo 6th (postal mail) No. 305-8666), deposit date: March 10, 2004, deposit number: FERM BP-08657), instead of a reactor filled with about 1 billion freshly isolated porcine hepatocytes (viability> 90%) The BAL treatment for 6 hours was performed in the same manner as in the treatment group. Freshly isolated porcine hepatocytes were isolated from the surgically excised outer liver by a four-step reflux method using dispase and collagenase (Masayama Maruyama, Naoya Kobayashi, Toshinori Tsutsukawa et al., Organ Biology, Vol. 9). No. 3. 295-301, 2002).

ネガティブ・コントロール群(n=2)として、細胞を充填していない空リアクターを用いて、同様の試験を行なった。   As a negative control group (n = 2), a similar test was performed using an empty reactor not filled with cells.

結果は、ネガティブ・コントロール群では、2例のサルはいずれもD−ガラクトサミン投与後1週間以内に肝不全で死亡した。剖検では、肝臓の出血壊死、著名な萎縮、黄疸性の胸・腹水の貯留を認め、組織学的にも肝細胞の広範な壊死を認めた。一方、約10億個のブタ肝臓細胞を装填したポジティブ・コントロール群はいずれも3週間以上生存し、剖検所見でも一切の異常を認めなかった。   As a result, in the negative control group, 2 monkeys both died of liver failure within 1 week after administration of D-galactosamine. At necropsy, hepatic hemorrhage necrosis, prominent atrophy, jaundiceous pleural effusion and ascites were observed, and extensive hepatocyte necrosis was observed. On the other hand, all positive control groups loaded with about 1 billion pig liver cells survived for 3 weeks or more, and no abnormalities were found in autopsy findings.

治療群では、2例とも3週間以上生存した。肝臓は肉眼的にも組織学的にも全く正常化していた。また、治療群では、フィシャー比(分岐鎖アミノ酸/芳香族アミノ酸の比)の改善を認めた。   In the treatment group, both cases survived for more than 3 weeks. The liver was completely normalized both macroscopically and histologically. In the treatment group, an improvement in the Fischer ratio (ratio of branched chain amino acids / aromatic amino acids) was observed.

治療後、リアクターを固定して細胞の付着の程度を走査電子顕微鏡下に観察した。細胞は不織布の繊維に良好に付着しており(図11)、さらには数個の細胞からなる集塊が観察された。このような集塊は、細胞の分化機能の発揮に好ましい。一方、中空糸膜の表面には、細胞が一切付着しておらず(図12)、中空糸膜を介した物質交換を鑑みると非常に好ましい所見を得た。   After treatment, the reactor was fixed and the degree of cell attachment was observed under a scanning electron microscope. The cells adhered well to the non-woven fibers (FIG. 11), and agglomerates consisting of several cells were observed. Such an agglomeration is preferable for exerting the differentiation function of cells. On the other hand, no cells adhered to the surface of the hollow fiber membrane (FIG. 12), and a very favorable finding was obtained in view of material exchange through the hollow fiber membrane.

配列番号1:アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号2:アルブミン遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号3:ASGPR遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号4:ASGPR遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号5:ビリルビン−UGT遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号6:ビリルビン−UGT遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号7:GST−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号8:GST−π遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号9:GS遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号10:GS遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号11:HBCF−X遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号12:HBCF−X遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
配列番号13:SV40T遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′primer
配列番号14:SV40T遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′primer
SEQ ID NO: 1 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting albumin gene
SEQ ID NO: 3 3 'primer for polymerase chain reaction for detecting albumin gene
SEQ ID NO: 5 5 'primer for polymerase chain reaction for detecting ASGPR gene
SEQ ID NO: 4: 3 'primer for polymerase chain reaction for detecting ASGPR gene
SEQ ID NO: 5: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting bilirubin-UGT gene
SEQ ID NO: 6: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting bilirubin-UGT gene
SEQ ID NO: 7: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting GST-π gene
SEQ ID NO: 8: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting GST-π gene
SEQ ID NO: 9: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting GS gene
SEQ ID NO: 10: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting GS gene
SEQ ID NO: 11: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting HBCF-X gene
SEQ ID NO: 12: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting HBCF-X gene
SEQ ID NO: 13: 5 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting SV40T gene
SEQ ID NO: 14: 3 ′ primer for polymerase chain reaction for detecting SV40T gene

Claims (1)

非ウイルス性プロモーターを含有し、一対の部位特異的組換え配列間に不死化遺伝子をコードし、かつ該一対の部位特異的組替え配列外に自殺遺伝子をコードする非ウイルスベクターであって、つぎの構造を有する非ウイルスベクター。
A non-viral vector containing a non-viral promoter, encoding an immortalizing gene between a pair of site-specific recombination sequences, and encoding a suicide gene outside the pair of site-specific recombination sequences, A non-viral vector having a structure.
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