JP2009543089A - 細胞状態に関連したグリコシル化パターン検出の方法と試験(分析) - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
この群のレクチンは、複合体N−結合複合体グリカンのトリマンノシルコアの2つのα−マンノース残基のいずれかで分岐を認識する。それらは、グリカン構造の大部分に結合するので、この群のいくつかのレクチンは、種々のアンテナ末端に敏感である。複合体(1)及び複合体(4)と称するレクチンは、2,6−分岐構造を好み;レクチン複合体(3)は2,4−分岐構造を好み、レクチン複合体(2)は、両構造に同様の親和性で認識する。
この群のレクチンは、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)及びそのβ4−結合オリゴマーに結合し、後者の鎖長の増加につれてそれとの親和性が強くなる。この群での両レクチンの炭化水素特異性は異ならないが、それにもかかわらず、結合パターンには、相違がみられる、これは、おそらく、サンプルの非炭化水素部分に起因する。
この群のレクチンは、マンノース結合レクチン(下記を参照)の亜群(サブグループ)であり、マンノースに加えて、グルコースにも結合するので、Glc/Man結合レクチンと称する。この群の全てのレクチンは、二分岐複合体N結合グリカンに高い親和性で結合する。二分岐構造の親和性に比べると、レクチンGlc\Man(1)及び(2)は、低親和性の高マンノースグリカンであり、一方、レクチンGlc\Man(3)はより高い親和性で高マンノースグリカンと結合するであろう。
この群は、特異的にマンノースに結合するレクチンからなる。これらのレクチンは、低親和性で高マンノース構造に結合し、2分岐複合体構造のコアマンノースを認識する。
このレクチンは、特異的に末端GlcNAc残基を認識する。
これらのレクチンは、末端α−ガラクトース(a−Gal)に結合する。レクチンアルファ−Gal(1)は、アルファ−ガラクトース及びα−GalNAc(α−N−アセチルガラクトサミン)の両者に結合し、N及びO結合グリカンの両者に結合することができる。レクチンアルファ−Gal(3)は、N−結合アンテナで発見されるガリリ抗原(Gal−3Gal)に主として結合する。
これらのレクチンは、特異的に、末端の(非シアリル化されていない)β−ガラクトース残基に結合する。
これらのレクチンは、末端ガラクトース及びN−アセチルガラクトサミン残基に特異性がある。この群内のさまざまなレクチンは、ガラクトースとN−アセチルガラクトサミンへの相対的な親和性に相違がある。
この群のレクチン(2)及び(5)は、ほぼ例外なくGalに結合する;レクチン(1)、(3)及び(4)は、例外なくGalNAcに結合する。この群の残りのレクチンへのGalNAc/Galの相対的親和性は、(8)>(7)>(6)の順でランク付けされる。
この群のレクチンは、種々の結合でフコース残基と結合する。
レクチンフコース(6)は、1−2−結合フコースに優先的に結合し、レクチンフコース(8)は、1−3及び1−6結合フコースに優先的に結合し;レクチン(12)と(13)はFucl−4Glc(ルイスA抗原)に優先的に結合する。これらのレクチンは、一般的には、立体障害のためにインタクト(無傷の)グリコプロテイン上のN−結合オリゴ糖のコアフコースに結合しない。
シアル酸レクチンは、荷電したシアル酸残基と反応する。他の酸性基(硫酸化など)への第二の特異性は、この基の員にもみられる。レクチンシアル酸(1)は、2−3−結合シアル酸を主として認識し、レクチンシアル酸(4)は、2−6−結合シアル酸を主として認識する。
細胞での広範囲なグリコシル化の変動を確認する方法
本実施例は、細胞中のグリコシル化パターンの変動、好ましくは、全体的なグリコシル化の変動を確認する方法とそのキットに関する。これらは、例であることを意図しており、如何なる方法によっても限定する意味ではない。
抽出用緩衝液CE1を細胞に添加し、原形質膜を溶解することなく選択的に崩壊させ、その結果細胞質タンパク質の放出が生じる。核、ミトコンドリア、小胞体(ER)などの原形質膜とオルガネラは、完全なまま残り、遠心により集める。
Qグリコプロファイリングキット(Qglyco profiling kit)は2つの標識プロトコールを提供する:
−全膜タンパク質抽出物のスルホ−NHS−ビオチン(全膜画分が標識されるであろう)による標識化。
このプロトコールは、膜画分全体を標識し、分画緩衝液1ml中に5x106細胞の処理に適している。
スルホ−NHS−ビオチン保存液の調製:
DMSO中でスルホ−NHS−ビオチンの20ml保存液を調製し、少量づつ保存し、一度解凍したものの再凍結を避ける。この保存は、−20℃で数箇月は安定である。2mg/mlスルホ−NHS−ビオチンの新鮮溶液は、20mg/mlスルホ−NHS−ビオチン保存溶液1をDMSO10で希釈することにより調製する。
標識化する反応は、タンパク質1分子につき5分子のNHS−ビオチンの比率で行う(B/P=5)。HS−ビオチンの必要量の計算には下記式を用いる:
V=Px1.71
V=標識を必要とする容積2mg/mlのビオチン(μl)
P=膜画分タンパク質濃度(mg/ml)
必要量のNHS−ビオチン(上記計算として)を、膜タンパク質画分100μlに添加する。標識反応物は、4℃2時間、回転攪拌器でインキュベイトする。この反応物を5μlの1MTris・Cl、pH7の添加により急冷し、4℃で15分間インキュベイトする。標識した膜タンパク質画分は、−20℃で3箇月まで保存することができる。これより長期では、この画分は、−70℃で保存する。解凍後、サンプルは、6,000rpm、15秒間遠心する。下記の界面活性剤除去法にしたがって、界面活性剤をビオチン標識サンプルから除く。
レクチン活性を妨害するので、界面活性剤及び他の添加剤をグリコ分析サンプルから除かなければならない。界面活性剤除去は、「Detergent−OUT(登録商標)」スピンカラムを用いて行う。
カラムは、数回反転し、樹脂を再懸濁により調製する。カラムの底部端を外して、液体を流し出す。約500μlの平衡緩衝液をカラムにかけ、緩衝液を流し出す。この過程を3回繰り返す。
カラムを、2ml遠心採取管(centrifuge collection tube)の中に置き、室温20〜30秒間1000xgで遠心し、遠心管に集まった液は捨てる。カラムをカラムキャップで閉じて、遠心採取管の中に戻す。200〜500μlのタンパク質溶液を注意してカラムにかける。5分間静置後、キャップを外し、カラムを遠心採取管に戻し、1000xgで20〜30秒間室温で遠心する。界面活性剤フリータンパク質溶液を集める。
タンパク質サンプルの要件
Qグリコム細胞プロファイリングキットは、膜グリコプロテインの表面上に露出したグリカンを検出する。このサンプルは、ビオチン標識した細胞表面又は界面活性剤が除かれた全膜グリコプロテイン抽出物を含む。スライド上の分析された対象タンパク質画分の濃度は、5〜10μg/mlでなければならない。すべて同一濃度のサンプルをスライド上に付してあるので、試験は相対的である。
Cy3標識ストレプトアビジンは、光から保護されなければならない。研究室で使用するときや、インユーベションの間、この試薬を含む全てのチューブや容器はアルミニウムホイルで包まなければならない。
スライドパックを開く前に室温にする。裏紙をはがしてアレイスライド上にフレームを押しつけ、インキュべーションフレームを Qグリコプロファイリングレクチンスライド上に取り付けて、様々なインキュべーションステップでのチャンバを作る。このアレイは、フレーム上を正しい位置を配置するのを助けるための青色色素を含むスポット付きフレームを具える。全ての青色スポットは、フレームの内側の領域になければならない。この青色色素は、試験の間に洗い落とされる。
各スライドは、交叉汚染をさけるために別々の9cm径のペトリディシュで処理する。デュプリケイトでスライドを処理するときは、デュプリケイトの両方を15cmペトリディシュ中に一緒に置くことができる。関連する各ステップに要する完全洗浄及び阻止溶液の容量は、用いたペトリディシュのサイズに依存する。9cmペトリディシュ(1つのスライド)を用いるときは、25mの完全洗浄又は阻止溶液のlを、また、15cmペトリディシュ(デュプリケイトスライド)を用いるときは60mlを要する。
使用する前に、次の方法により試薬を調製する。濾過された、逆浸透(RO)等級水を用いて、Qグリコプロファイリングキット(Qglyco profiling kit)で用いた全ての溶液を調製する。この水は、以下の仕様に適合しなければならない:
抵抗>18MΩ(導電性 μs/cm=1/抵抗 MΩ)。
全有機炭素 <5ppb
代替的に、HPLC−等級水を使用することができる。
完全洗浄液を調製する前に、全ての成分を室温(15℃〜25℃)におき、溶液中の沈殿が、開始前に完全に溶解していることを確認する。
各ステップで、次の試薬を添加する前に形成された沈殿が溶解するまで溶液が確実に攪拌されていることが重要である。
完全阻止液を調製する前に、全ての成分を室温(15〜25℃)におく。始める前に溶液中にどのような沈殿も確実に完全に溶解していることが重要である。
5μg/mlのタンパク質サンプル溶液を全量450μlが各スライド(2.25μg)に必要である。この溶液は、22.5μlの完全阻止液(下記の表3を参照)を含んでいなければならない。
Cy3標識ストレプトアビジン用の至適作用濃度を、5μg/mlに決定した。Cy3−標識ストレプトアビジンは、下記表4の記載により調製した。
スライドは、9cmペトリディシュ中で処理した。最小の試験には、1つの基準スライドと1つのサンプルスライドが必要である。試験で処理するスライド量に必要な量を調製する。
処理される各Qグリコムプロファイリングアレイ(glycome profiling arrays)上にインキュべーションフレームを接着させる。インキュベーションフレームはスライドの端を揃えなければならない。各Qグリコムプロファイリングレクチンアレイ(Qglycome profiling rectin arrays)は、スライドの操作中は粉末付きではない手袋をして、膜−被覆表面との接触を避けて、注意して取り扱う。
非特異的なバックグラウンドのシグナルを避けるために、スライドを下記のプロトコールの1つを用いて、スキャニングする前に乾燥させなければならない。
スライド(単数又は複数)を、最後の洗浄水から取り出し、スライドの裏面をゆっくり実験室用拭き取りでゆっくり拭き取る。スライドを200xg、5〜10分間(又はスライドが乾燥するまで)コプリンジャー(Coplin jar)中で遠心し、次いで、膜が完全に白色になるまで暗闇下で空気乾燥させる。
動作手順:
スライド(単数/複数)を最後の洗浄水から取り出し、スライドの裏面を実験室用拭き取りでゆっくり拭き取る。実験室用拭き取りをスライドの膜に押しつけ、膜の中心部分に触れないように注意する。スライドは、膜が完全に白色になるまで暗闇下で空気乾燥(風乾)させる。
注意:凝縮すると、再びスライドが湿潤するので、スライドを覆ってはいけない。
処理したスライドは、2〜8℃で2週間まで暗闇下で保存できる。暗闇下で保存しながら、スキャニングする前にスライドを室温にもどす。
サンプル処理と乾燥に続いて、スライドを調節可能なレーザー出力及び光電子増倍管(PMT)でマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンする。
細胞集団の特徴付け
この実施例は、グリコシル化パターン又はフィンガープリントを決定することによる細胞集団を特徴付けに関し、本実施例では、分化した細胞と未分化幹細胞との比較用の特徴付けに関する。本実施例に記載した方法は、選択的に、ある種の処理などにさらす前と後の細胞を含むどのような細胞集団の比較にも用いることができる。
胚性幹細胞は、有糸分裂的に不活性化したマウスプライマリー胚性線維芽細胞の層上で、通常増殖して、成長を促進し、分化を防ぐ。MES細胞は、当初は選択的にこのような線維芽細胞上で増殖する。代替的に又は追加ステップとして、このようなMES細胞は、ゼラチン塗布組織培養用プラスチック上で、10%牛胎児血清と、100U/ml組み替え白血病細胞抑制因子(LIF)と補填培地でフィーダー(支持細胞層)の無い状態で培養することができる(Smith AG(1991)Culture and differentiation of embryonic stem cells.J Tiss Cult Meth 13:89−94)。未分化ES細胞は、T75フラスコで80%コンフルエンスまで増殖し、トリプシン処理し、N2B27培地に再懸濁させる(Ying QL,Smith AG(2003)Defined conditions for neural commitment and differentiation.Methods Enzymol 365: 327−341)。複数の細胞密度を選択的に用いることができる。
分化過程中と完全分化後では、グリコシル化パターンに変化があることを示し、選択的に、この変化をこれらの細胞の分化状態を測定に用いることもできる。
3T3L1細胞の脂肪細胞への分化
この実施例は、3T3L1細胞の脂肪細胞への分化に関し、実際に行った実験では2つの異なるタイプの細胞中の、異なるグリコシル化パターンの検出に関する。
3T3L1細胞を藩種し、2日後にインシュリン、デキサメサゾン、IBMXを用いて分化を誘導した。分化を誘導して10日後、80%以上の細胞が細胞体内に大きな脂肪滴を示したとき(図1Fを参照)、細胞を糖分析用に採取した。対照細胞は、同じ期間、通常の培地で維持した。この細胞をキプロテムグリコプロファイリングキット(Qproteme Glycoprofiling Kits) (Qiagen USA;試験は、使用説明書にしたがって、キット操作手順書により行った。)で分析した。
図2で見られるように、これらの細胞のグリコシル化パターンは、分化と共に変化する。N−結合複合体アンテナ構造及びアンテナ(β−ガラクトース及びシアル酸)の共通の末端に結合する全てのレクチンが示すように、アンテナ性(antennarity)は、分化後大きく減少する。これは、高いアンテナ性(antennarity)のグリカンを認識したレクチン、チョウセンアサガオで(図2の複合体(1))最も顕著である。
ブレフェルディン(BREFELDIN)Aにより誘導されたERストレス
この実施例は、アポトーシスに導く、小胞体(ER)ストレスの公知の誘導剤である、ブレフェルディン(BREFELDIN)A(BFA)で誘導されたグリコシル化の変動に関する。これも実際に行われた試験におけるものである。
PC12細胞を12μg/mlのBFAで24時間処理した。この時点で形態変化が観察され、細胞は剥離した。細胞を次いで採取し、キプロテムグリコプロファイリングキット(Qproteme Glycoprofiling Kits)(Qiagen USA; 試験は、使用説明書に従ったキット手順書の記載により行った。)で分析した。
BFA処理後に、N−結合複合体アンテナ構造を結合するレクチンが示したように、膜グリコプロテインのアンテナ性(antennarity)に有意な減少を検出した(図3)。これは、高アンテナグリカンを認識するダツラ ストラモニウム(Datura stramonium)において最も顕著である。α−ガラクトース、β−ガラクトース、シアル酸及びフコースなどの末端糖を認識するレクチンからのシグナルの減少も、明白である。これは、例えば、アンテナ性フコースを認識するレクチン ウレックス エウロパエウス I(Ulex europaeus I)(図3におけるフコース(6))での実験などでみることができる。
N−グリカン合成の阻害
この実施例は、マンノシダーゼIの公知の阻害剤である1−デオキシマンノジリマイシン(deoxymannnojirimycin(DMJ))により誘導されるグリコシル化パターンの変動に関し、これも実際に行われた試験によるものである。
コンフルエント前の3T3L1細胞を、800μg/mlのDMJの存在下又は非存在下で3日間培養した。次いで、細胞を、採取し、キプロテムグリコプロファイリングキット(Qproteme Glycoprofiling Kits)(Qiagen USA; 使用説明書に従ったキット手順書の記載により行った。)で分析した。
N−結合複合体アンテナ構造に結合するレクチンが示すように、アンテナ性は、DMJ処理後に大きく減少する。さらに、レクチンを結合する全てのオリゴマンノースからのシグナルが有意に増加したが、これは、非処理細胞に比べて、高マンノースグリカンの量が増加したことを示唆する。このことは、マンノースを認識するレクチン コンカナバリンA(図4中のGlc/Man(3))及びハイペイーストラムハイブリッド(Hippestraum hybrid)(図4中のGlc/Man(3))において顕著である。
成体幹細胞の分化
この実施例は、幹細胞の分化及び、分化した及び分化していない細胞における様々なグリコシル化パターンの検出に関する。
間葉系幹細胞(MSCs)の初代培養を、様々な年齢の男女のドナーの正常な腸骨稜の骨髄穿刺液から確立した。培養接着細胞を増殖させ、サブカルチャーし、次いで、糖分析により骨及び軟骨分化の試験をした。培養方法の記述については、Haynesworth SEらの実施例、「Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow」;Bone.1992;13(1):81−8.を参照されたい。このような細胞を分化させる方法の記述については、Jaiswal Nらの実施例、「Osteogenic differentiation of purified,culture−expanded human mesenchymal stem cells in vitro; J Cell Biochem.1997Feb;64(2):295−312」を同様に参照されたい。
以下に示すように、これらの細胞のグリコシル化パターンは、分化により変動する。
癌細胞の悪性度の決定
この実施例は、癌細胞の悪性度の決定に関し、悪性と良性の細胞のタイプについて、及び悪性細胞と正常(非癌性)細胞において異なるグリコシル化パターンの検出に関する。
ヒト器官の悪性腫瘍から細胞を分離し、完全培地で増殖させる。細胞が70から80%コンフルエントのとき、糖分析用に細胞を採取する。対照細胞は同じ器官から分離した非癌細胞であり、同じ増殖培地で同じ期間維持する。細胞をキプロテムグリコプロファイリングキット(Qproteme Glycoprofiling Kits)(キアゲン USA;試験は、使用説明書に従いキットの操作手順書に記載により行った。)を用いて分析した。
以下に示すように、悪性腫瘍と良性腫瘍は、異なるグリコシル化パターンを示す。
化学療法に対する患者の反応の予測
この実施例は、治療の前後における細胞サンプルのグリコシル化パターンを測定することによる化学療法に対する患者の反応の予測に関する。
コンフルエント前のマウス3T3L1細胞をシスプラチンの存在下で3日間培養し、次いで細胞を糖分析用に、トリプシン処理により採取した。対照細胞は、通常の培養培地で同じ期間維持した。ホールセル(細胞全体)の抽出物を、トリプシン処理とCE1とCE2抽出緩衝液を用いて記載した再懸濁により調製する。細胞をキプロテムグリコプロファイリングキット(Qproteme Glycoprofiling Kits)(キアゲン USA;試験は、使用説明書に従いキットの操作手順書の記載により行った。)を用いて分析した。
糖分析の方法
本発明の態様によれば、糖結合剤を用いた1又はそれ以上の試験の結果を、糖分析方法により検討される。この方法は、選択的に及び好ましくは、ソフトウエア(代替的に、ファームウエア又はハードウエアとして提供できる)の形式で提供され、「比較解釈モジュール」として本明細書に記載している。比較し得る解釈モジュールは、有意なレクチン差に基づいて2サンプル間のグリコシル化における変化の推測を目指している。
その方法を本実施例に記載する。
ある態様では、サブモジュール比較フィンガープリントを提供する。比較サブモジュールへの入力は、1対のフィンガープリント、つまり、基準フィンガープリントと標的フィンガープリントである。最初に、フィンガープリントを標的フィンガープリントと基準フィンガープリント間のシグナルを比較できるように標準化する。この標準化の後、フィンガープリントを比較して、差異のリストを抽出する。
ある態様によれば、1又はそれ以上の解釈分類器を提供する。解釈分類器は、多様なレクチン差を論理項の中へ様々な条件を統合する数学的機能である。単一のレクチンシグナルが、明白な特異性をもつ信頼できるシグナルを提供する場合には、エピトープ変動を規定するこのレクチンで観察された異なるレベルに基づいた単一の状態が存在する。他の場合には、変動の定義を満たすものであるか否かの、代替となる幾つかの基準がある。この方法で、フィンガープリントにおける変動の様々な組み合わせが同一の最終判断を導き、これは、様々な変動が異なるレクチンのセットにより明らかにされる事実に一致する。
上記モジュールをフィンガープリント比較モジュールでうまく標準化された878フィンガープリントペアの基準を試験した。これらのペアは、様々な細胞株、様々な生物学的系、及び グリコシル化パターンを制御された状態で改変した酵素的に処理したサンプルに由来する213のフィンガープリントサンプルから生じたものである。生物学的に比較し得るペアのみを、標準化用とした。各ペアについて、少なくとも1つの期待される結果を、(1)特定の処理を行う、(2)HPLC分析、(3)フコースエピトープのELISA試験、又は(4)文献的報告のいずれかにより規定した。この基準は、各々が特定のエピトープ中にで公知の変動があるペアのみを含む、部分的に重複した9個のトレイニングセットに分割した。これらの9個のセットについて、対照ペアセット、試験した変化が生じないと思われるフィンガープリントペアを集めた。
各エピトープについて、成績を、このエピトープの予想される解釈が公知である、適当なデータセットを用いて個別に計算した。このデータセットを、試験エピトープについて変動を示すことが予想されるフィンガープリントペアのセット及び予想される変動が起こらないと考えられる対照セットに分割した。表6は、全基準に対するアルゴリズムの成績を要約したものである。感度誤差は、1−レベル及び2−レベル誤差に細分し、変化がで検出されないか(1−レベル)、又は、間違った方向で検出される(2−レベル)を表示する。この細分は、変動のフォールスポジティブの検出が1−レベルの誤差でしかないので、特異性分析には適用できない。
Claims (73)
- インビトロで、細胞の状態を検出する方法であって:
少なくとも細胞の一部を、少なくとも1つの糖結合剤と接触させるステップ;
前記細胞への、前記糖結合剤の結合を測定するステップ;
前記少なくとも1つの糖結合剤の結合によってグリコシル化パターンを決定するステップ;及び、
前記細胞状態に対するグリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、検出方法。 - インビトロで、細胞の状態を検出する方法であって;
前記細胞の少なくとも一部に、少なくとも1つのレクチンを接触するステップ;
前記細胞に、前記少なくとも1つのレクチンとの結合を決定するステップ;
前記細胞に、前記レクチンとの前記結合により前記細胞のグリコシル化パターンを確認するステップ;及び、
前記細胞状態に対する前記グリコシル化パターンを相互比較するステップ、
を含む、検出方法。 - インビトロで、細胞の状態を検出する方法であって;
1つの試験において、少なくとも前記細胞の一部を、少なくとも5つのレクチンに接触させるステップ;
前記細胞への少なくとも一部を、前記少なくとも5つのレクチンの各々との結合を測定するステップ;
前記細胞への、前記レクチンの前記結合により前記細胞のグリコシル化パターンを確認するステップ;及び、
前記細胞の状態に対する前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、検出方法。 - インビトロで、ホールセル(細胞全体)の状態を検出する方法であって;
前記細胞を、固定するステップ;
前記細胞の少なくとも一部に、少なくとも1つのレクチンに接触させるステップ;
前記細胞への、前記少なくとも1つのレクチンの結合を測定するステップ;
前記細胞への、前記少なくとも1つのレクチンの前記結合により前記細胞のグリコシル化パターンを確認するステップ;及び、
前記細胞の状態に対する前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、検出方法。 - インビトロで、ホールセル(細胞全体)の状態を検出する方法であって;
前記細胞を固定するステップ;
1つの試験において前記細胞への、少なくとも5つのレクチンを接触させるステップ;
前記細胞への、前記少なくとも5つのレクチンの各々の結合を決定するステップ;
前記細胞への、前記レクチンの前記結合により前記細胞のグリコシル化パターンを確認するステップ;及び、
前記細胞の状態に対する前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、検出方法。 - インビトロで、細胞の状態を検出する方法であって;
少なくとも一部の細胞標本へ少なくとも1つのレクチンを接触させるステップ;
前記細胞標本への前記レクチンの結合を測定するステップ;
前記細胞標本への前記レクチンの前記結合により前記細胞のグリコシル化パターンを確認するステップ;及び、
前記細胞の状態に対する前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、検出方法。 - 前記細胞標本が、全膜プロテイン抽出物、ホモジナイズした細胞、及び粗膜混合物からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも10のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも15のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも20のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも25のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも30のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも35のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも40のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも45のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも5つのレクチンが、少なくとも50のレクチンを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも一部との前記接触が;
多糖の糖認識配列に結合し、様々な基本的な配列−特異的な、及び/又は部位−特異的な複数の糖結合剤を基体の表面上に提供するステップであって、前記様々な基本的な配列−特異的、及び/又は部位−特異的な複数の糖結合剤の多くが前記基体の同じ表面上に固定されている、糖結合剤を提供するステップ;
前記表面を、分析すべき多糖、又は、前記多糖の複数のフラグメントを含む混合物に接触させるステップ;
結合していない多糖又は多糖フラグメントを洗浄又は除去するステップ;
得られた表面に、基本的な配列−特異的な、及び/又は、部位−特異的な糖結合マーカー又は基本的配列−特異的、及び/又は、部位−特異的な糖結合マーカーの混合物を添加するステップであって、前記マーカ又はマーカの混合物が前記結合した多糖に結合しているステップ;及び、
前記表面に結合した前記糖結合マーカの結合の検出をするステップ;
を含む請求項1に記載の方法。 - 前記糖結合マーカの結合を検出するステップが、目視を含むものである、請求項18に記載の方法。
- 前記糖結合マーカーの結合の前記検出が;
前記結合した糖結合マーカーの1以上の画像を獲得するステップ;及び、
前記1以上の画像から、分析する前記多糖の認識部位マップをつくり出し、それにより、前記多糖の部分配列情報を導き出すステップ;
を含む、請求項18に記載の方法。 - 前記マーカーが、色素生産性結合剤であり、前記マーカーの前記画像が、前記表面上で発現する色彩である、請求項20に記載の方法。
- 前記マーカーが、標識された結合剤であり、前記マーカーの前記画像が、前記標識からのシグナルにより提供されるものである、請求項20に記載の方法。
- 前記1以上の画像の獲得が、光学的フィルターの使用を含むものである、請求項20に記載の方法。
- 前記1以上の画像の獲得が、前記画像を撮影し、及び/又は前記画像のデジタル化を含むものである、請求項20に記載の方法。
- 前記基本的な配列−特異的、及び/又は、部位−特異的な結合剤がレクチンである、請求項18に記載の方法。
- 前記レクチンが、着色レクチンである、請求項25に記載の方法。
- 前記レクチンが、蛍光レクチンである請求項25に記載の方法。
- 前記レクチンが、ビオチン−標識レクチンである請求項25に記載の方法。
- 前記、基本的に配列−特異的、及び/又は部位特異的結合剤が抗体である、請求項18に記載の方法。
- 前記抗体が、蛍光抗体である、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体がビオチン−標識抗体である請求項29に記載の方法。
- 前記抗体が、酵素標識抗体である請求項29に記載の方法。
- 前記細胞の状態に対する前記グリコシル化パターンの相互比較検討が、少なくとも1つの公知のカテゴリーに対する前記グリコシル化パターンの比較を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記グリコシル化パターンが、コンピュータで分析されたものである、請求項33に記載の方法。
- 前記表面がビーズを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記表面が、アレイを含む、請求項18に記載の方法。
- インビトロでの複数の細胞集団間の差異を決定する方法であって:
前記複数の細胞集団の各々から細胞のグリコシル化パターンを測定するステップ;及び、
前記グリコシル化パターンにより前記複数の細胞集団間の差異を決定するステップを含む方法。 - 前記細胞が成体幹細胞を含む請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の状態が、前記幹細胞の分化の状態である請求項38に記載の方法。
- 前記細胞が、癌細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の状態が、前記癌細胞の悪性の状態である、請求項40に記載の方法。
- 治療に対する患者の応答を予測する方法であって:
インビトロで患者の細胞のグリコシル化パターンを測定するステップ;及び
治療に対する患者の予測された応答に対して前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ、
を含む、治療に対する患者の反応を予測する方法。 - 前記グリコシル化パターンの測定が、患者からのサンプルを得ることを含む請求項42に記載の方法。
- 前記治療が化学療法を含む、請求項42に記載の方法。
- さらに、前記細胞へ界面活性剤の添加を含む、請求項1から45のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、細胞膜の可溶化を含む、請求項45に記載の方法。
- さらに、膜プロテインの抽出を含む、請求項46に記載の方法。
- 請求項1から47のいずれか1項に記載の方法を実行するキット。
- 前記糖結合剤が、少なくとも1つのレクチンを含む、請求項48に記載のキット。
- 前記レクチンが、着色レクチンである、請求項49に記載の方法。
- 前記レクチンが、蛍光レクチンである、請求項49に記載の方法。
- 前記レクチンが、ビオチン−標識レクチンである請求項49に記載の方法。
- 前記糖結合剤が、少なくとも1つの抗体を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記抗体が、蛍光抗体である請求項53に記載の方法。
- 前記抗体が、ビオチン−標識抗体である請求項53に記載の方法。
- 前記抗体が、酵素−標識抗体である、請求項53に記載の方法。
- インビボで、細胞の状態を検出する方法であって:
少なくとも細胞の一部へ、少なくとも1つの糖結合剤に接触させるステップ;
前記細胞へ、少なくとも1つの糖結合剤の結合を決定するステップ;及び、
前記細胞の状態と、前記グリコシル化パターンを相互比較するステップ、
を含む方法。 - 複数の細胞集団間の差異を決定する方法であって:
前記複数の細胞集団の各々からの細胞のグリコシル化パターンを測定するステップ;及び、
前記グリコシル化パターンにより、複数の細胞間の差異を決定するステップ;
を含む方法。 - 前記細胞が、幹細胞を含む、請求項57に記載の方法。
- 細胞の状態が、前記幹細胞の分化の状態である、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞が、癌細胞である請求項58に記載の方法。
- 前記細胞の状態が、前記癌細胞の悪性度の状態である、請求項61に記載の方法。
- 治療に対する患者の応答を予測する方法であって:
前記患者の細胞のグリコシル化パターンを測定するステップ;
患者の予測応答に対する前記グリコシル化パターンを治療と相互比較検討するステップ;
を含む方法。 - 細胞の状態を検出する方法であって:
少なくとも全細胞膜の一部を少なくとも1つの糖結合剤に接触させるステップ;
前記全細胞膜の前記糖結合剤の結合を測定し;
前記全細胞膜への前記少なくとも1つの糖結合剤の結合により前記グリコシル化パターンを決定するステップ;及び、
細胞の状態に対する全細胞膜の前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ;
を含む方法。 - 細胞の状態を検出する方法であって:
少なくとも前記細胞表面の一部に、少なくとも1つの糖結合剤を接触させるステップ;
前記細胞表面に、前記糖結合剤の結合を決定するステップ;
前記細胞表面への前記少なくとも1つの糖結合剤の結合により前記グリコシル化パターンを測定するステップ;及び、
前記細胞の前記状態に、前記細胞表面の前記グリコシル化パターンを相互比較検討するステップ;
を含む方法。 - 前記糖結合剤が、少なくとも1つのレクチンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレクチンが、1試験で少なくとも5つのレクチンを含む、請求項66に記載の方法。
- さらに、少なくとも前記細胞の一部に少なくとも1つのレクチンを接触させる前に、前記細胞を固定することを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞が、ホールセル(細胞全体)を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞標本を含む、請求項66に記載の方法。
- 少なくとも処置前の第一の測定と少なくとも処置後の第二の測定を含む、複数の測定により、前記細胞の状態が決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記処置が物理的処置又は化学的処置である請求項71に記載の方法。
- 前記処置が、薬剤を投与を含む、請求項72記載の方法。
- 前記細胞の状態が、疾病のない状態での少なくとも1つの測定と、疾病存在下での少なくとも1の測定を含む複数の測定により決定される、請求項1に記載の方法。
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