JP2009521228A - 単球の樹状細胞への分化を促進する多孔質膜デバイス - Google Patents
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Abstract
研究用途及び臨床用途用の樹状細胞（ＤＣ）は通常、サイトカインのカクテル中で１週間以上の間培養される精製血液単球から得られる。これらのサイトカイン由来のＤＣは幾つかの重要な免疫学的機能が欠損し得ること、並びに生理的条件下で見出される抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を正確に表示し得ないことが示唆されているため、より生理学的に関連した様式でのＤＣの生成を可能にする方法が必要とされる。本発明は、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスにおいて培養される内皮細胞を通った血液単球の１回の遊走に基づき、多数の高度に精製されたＤＣを生成するための簡単且つ信頼性が高い技法を含む。下部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバから収集される得られたＡＰＣは、主要組織適合性（ＭＨＣ）分子及び共刺激分子の発現、外来抗原を貧食する能力並びに抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力において、他のｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたＤＣ集団に似ている。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年１２月２１日に出願された米国仮出願第６０／７５２，０３３号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
本出願は、２００５年１２月２１日に出願された米国仮出願第６０／７５２，０３３号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
哺乳類における病原体及び腫瘍に対する防御免疫の生成は、外来抗原又は改変自己抗原をＴ細胞に提示することができる特殊化細胞を必要とする。樹状細胞（ＤＣ）は、それらが主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子における提示用の抗原を効率的に獲得及びプロセシングし、且つ高レベルのＴ細胞共刺激リガンドを発現するため（これらはともに、コンピテントエフェクター細胞へのナイーブＴ細胞の完全な分化を誘発するのに必要である）、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうちで最も強力なものであると考えられる。また、ＤＣは、他のＡＰＣよりも、内因性（ＭＨＣクラスＩ）経路を通じて外因性タンパク質を交差提示することが可能であり、ＤＣを、腫瘍及び細胞外病原体に対する細胞障害性Ｔリンパ球応答を生成するのに特に重要なものにしていると考えられる。
樹状細胞は通常、身体のほとんどの組織で見出され、末梢組織へと血管内皮を横切る循環単球に由来する。正常な条件下では、これらの細胞は、抗原獲得に関して高い能力を有するが、低レベルの表面ＭＨＣ及び共刺激分子発現を有する。
傷害又は感染により、罹患部位においてＤＣの数の顕著な増加が誘発される。さらに、これらのＤＣは、可溶性分子及び膜結合性分子の発現の増加、抗原を獲得する能力の減少、及び二次リンパ組織に向かう遊走の増強を特徴とする活性化された表現型を獲得する。リンパ節では、これらの細胞は、抗原特異的Ｔ細胞活性化の強力な刺激因子である。ＤＣの生物学に関するより完全な概要に関しては、Rossi & Young(J Immunol 175:1373-1381 (2005))の最近の概説を参照されたい。
ワクチン、薬物又は他の化合物の免疫原性をスクリーニング及び評価するための全体的にｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫応答を構築することは有益である。この目的でヒト被験体を用いることは、危険である可能性があり且つ高価である一方で、実験室動物を使用すると、ヒトにおける応答を正確に反映しない結果を招き得る。
これまでのところ、身体で起こることを模倣する様式で、末梢血細胞からＤＣを調製するための利便性よく、費用効率がよく且つ自動化可能なｉｎ ｖｉｔｒｏでの技法は存在していない。単球は、抗体分離（例えば、磁気ビーズ）により末梢血から隔離され得るが、これは、対象の細胞に対する特殊化抗体の使用を包含するため扱いにくく且つ高価である。次に、これらの単球は、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦのような外因性因子を用いてさらに分化させなくてはならず(Romani他 (1994) J Exp Med 180:83-93; Sallusto & Lanzavecchia(1994) J Exp Med 179:1109-1118)、これはｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答に関与するものと必ずしもよく類似するものではないＤＣへと導き得る(Thurnher他 (2001) FASEB J 15: 1054-1061)。コラーゲン基材上にある内皮細胞層を通って遊出する末梢血単球は、機能的ＤＣへと分化することが知られている(Qu他 (2003) J Immunol 170: 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282:480-483)。
感染及び腫瘍に対する防御免疫の生成は、外来抗原又は改変自己抗原をＴ細胞に提示することができる特殊化細胞を必要とする。幾つかの細胞型がＡＰＣとして作用し得るのに対して、ＤＣはこれらのうちの最も強力なものであり、ナイーブ抗原に対してＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが可能な唯一のものである。正常な条件下では、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は、エンドサイトーシスの様々な経路を介して抗原を活発に獲得するが、低レベルの表面主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子及びＴ細胞共刺激分子を発現する。炎症シグナル又は一般的な病原体モチーフ（Ｔｏｌｌ様受容体リガンド）との遭遇は、外因性タンパク質を取り込むＤＣの能力を減じ、ＭＨＣ／ペプチド複合体及びＴ細胞活性化に重要なリガンドの表面発現を増加し、且つ二次リンパ組織に向かう遊走を増強するＤＣにおける成熟プログラムを誘発する(Rossi & Young (2005) J Immunol 175, 1373-1381)。これらの成熟した抗原負荷ＤＣは、二次リンパ組織内で一次Ｔ細胞応答を誘導するのに特に十分適している。
組織常在ＤＣは、身体のほとんどの臓器中に見出される細胞の異種集団を含む。ｉＤＣを生じる短命の循環単球は、構成的様式で末梢組織へと血管内皮を横切るが、感染又は傷害により、炎症部位でこれらの細胞の蓄積の増加が誘発される。組織内では、血管外遊走した単球のサブセットがｉＤＣへと分化し、局所微小環境は多くの場合、特定の部位に残留しているＡＰＣの表現型及び機能的活性に影響を及ぼす。例えば、腸関連ＤＣはパイアー斑に集合して、ここでそれらはＭ細胞から抗原を受取って、粘膜組織の常在ＡＰＣとして作用する。他方で、ランゲルハンス細胞は、主として皮膚中に見出され、感染後の適応応答の誘導において重要な役割を果たす。
幾つかの研究室は、ｉｎ ｖｉｖｏで単球をＤＣ分化へと誘発する細胞相互作用及びシグナル伝達を概括するｉｎ ｖｉｔｒｏでの系を開発するよう研究してきた。例えば、Muller及びRandolphのグループ(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)は、支持マトリックス上で成長させたＨＵＶＥＣを利用して、内皮層を通って遊出した血液単球からのヒトＤＣの生成を促進する組織構築物の開発を先駆けて行った。この系に由来するＡＰＣは、表現型並びに同種及び一次抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力においてＤＣに似ていた(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。この組織モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで見出されるＤＣ集団をより正確に表示するＡＰＣを生成し得る一方で、その複雑性がこの組織モデルを広範な使用にとって実用的ではないものにしている。別のアプローチでは、ヒト又はブタ内皮細胞とともに直接的に共培養させた接着単球は、炎症誘発性サイトカインを産生し、高レベルの共刺激リガンドを発現し、且つ同種Ｔ細胞を効率的に刺激する強力なＡＰＣを生じた。この技法の制限は、任意の機能的分析が実施され得る前に、ＤＣは磁気ビーズ選択により混入している内皮細胞から選択されなくてはならないという点である。
一次細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を調整することにおけるそれらの特殊な役割のため、ＤＣの生物学をよりよく理解することにおいて多大なる興味が持たれている。身体におけるＤＣの不足は、ヒト由来の組織サンプルの限られた利用可能性と合わせて、ｅｘ ｖｉｖｏでの様式でこれらの細胞を評価することを困難にしている。結果として、サイトカイン由来のＤＣ、即ち外因性成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４）において培養された精製血液単球の研究は、この特有の細胞集団への深い洞察力に寄与し、臨床用途用のＡＰＣの供給源を提供した。しかしながら、この培養法が身体の循環単球からＤＣを発達させることに関与する生理学を再現することができないため、サイトカイン由来のＤＣの利用性は制限される。さらに、研究者らによっては、このＤＣ集団は完全ＡＰＣ機能性を欠如しており、生理学的条件下で見出されるＤＣ集団を正確に表示し得ないことを示唆するものもいる(Romani他 (1994) J Exp Med 180:83-93; Sallusto & Lanzavecchia (1994) J Exp Med 179, 1109-1118; Thurnher他 (2001) FASEB J. 15, 1054-1061)。
本発明は、多数の樹状細胞を生成する方法であって、
多孔質膜の上面上で内皮細胞を培養すること（当該膜は、ウェルの下部チャンバの上方に吊るされ、且つウェルの下部チャンバと分離可能であるウェルの上部チャンバに収容される）、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、多孔質膜上の内皮細胞へ適用すること、
ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、多孔質膜及び内皮細胞を収容しているウェルの上部チャンバを除去すること、並びに
ウェルの下部チャンバから樹状細胞を単離すること、
を含む多数の樹状細胞を生成する方法を提供する。
多孔質膜の上面上で内皮細胞を培養すること（当該膜は、ウェルの下部チャンバの上方に吊るされ、且つウェルの下部チャンバと分離可能であるウェルの上部チャンバに収容される）、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、多孔質膜上の内皮細胞へ適用すること、
ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、多孔質膜及び内皮細胞を収容しているウェルの上部チャンバを除去すること、並びに
ウェルの下部チャンバから樹状細胞を単離すること、
を含む多数の樹状細胞を生成する方法を提供する。
本発明はまた、作用物質に対する動物の潜在的反応を評価する方法であって、
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の上面上に取り付けられたＥＣＭ材料、及び
前記ＥＣＭ材料の上面上に取り付けられた第２の多孔質膜
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
前記第１の多孔質膜の下面上で内皮細胞を培養すること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を内皮細胞へ適用すること、
およそ１．５時間後に、前記第１の多孔質膜の下面の前記ＰＢＭＣ及び前記内皮細胞を洗い落とすこと（樹状細胞はこの段階で前記ＥＣＭ材料中に存在する）、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む前記第２のウェルから除去するとともに、前記第２の多孔質膜を伴う前記第１のウェルを、第２のＥＣＭ材料並びに複数のリンパ球及び白血球を含む三次元人工リンパ組織を基材として含む第３のウェルに上向きに配置すること、
前記第２の多孔質膜の上面へ作用物質を適用すること（前記抗原は、樹状細胞が、前記第１のＥＣＭ材料から前記三次元人工リンパ組織へと遊走するのを可能にする）、並びに
前記作用物質に対する免疫応答を評価すること、
を含む、作用物質に対する動物の潜在的反応を評価する方法を提供する。
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の上面上に取り付けられたＥＣＭ材料、及び
前記ＥＣＭ材料の上面上に取り付けられた第２の多孔質膜
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
前記第１の多孔質膜の下面上で内皮細胞を培養すること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を内皮細胞へ適用すること、
およそ１．５時間後に、前記第１の多孔質膜の下面の前記ＰＢＭＣ及び前記内皮細胞を洗い落とすこと（樹状細胞はこの段階で前記ＥＣＭ材料中に存在する）、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む前記第２のウェルから除去するとともに、前記第２の多孔質膜を伴う前記第１のウェルを、第２のＥＣＭ材料並びに複数のリンパ球及び白血球を含む三次元人工リンパ組織を基材として含む第３のウェルに上向きに配置すること、
前記第２の多孔質膜の上面へ作用物質を適用すること（前記抗原は、樹状細胞が、前記第１のＥＣＭ材料から前記三次元人工リンパ組織へと遊走するのを可能にする）、並びに
前記作用物質に対する免疫応答を評価すること、
を含む、作用物質に対する動物の潜在的反応を評価する方法を提供する。
本発明は、多数の樹状細胞を生成する方法であって、
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の下面上で培養された内皮細胞、
前記第１の多孔質膜より上に位置し、且つ前記第１の多孔質膜と分離される第２の多孔質膜、
前記第２の多孔質膜の上面で培養された内皮細胞、及び
前記第１の多孔質膜と前記第２の多孔質膜との間に位置する作用物質を含む細胞培養培地、
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記第２の多孔質膜の上面上で培養された内皮細胞へ適用すること、
ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、前記第１のウェルを前記第２のウェルから除去すること、及び
樹状細胞を前記第２のウェルから単離すること
を含む、多数の樹状細胞を生成する方法をさらに提供する。
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の下面上で培養された内皮細胞、
前記第１の多孔質膜より上に位置し、且つ前記第１の多孔質膜と分離される第２の多孔質膜、
前記第２の多孔質膜の上面で培養された内皮細胞、及び
前記第１の多孔質膜と前記第２の多孔質膜との間に位置する作用物質を含む細胞培養培地、
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記第２の多孔質膜の上面上で培養された内皮細胞へ適用すること、
ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、前記第１のウェルを前記第２のウェルから除去すること、及び
樹状細胞を前記第２のウェルから単離すること
を含む、多数の樹状細胞を生成する方法をさらに提供する。
本発明の実施形態は、血液単球からのＤＣの内皮細胞媒介性分化に関する簡素且つ利便性の高いＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ベース培養方法を含む。この系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＣを培養するより伝統的な培養方法に匹敵する頻度及び純度でＤＣを産生するが、外因性因子の非存在下で、且つ支持マトリックスを含有する組織構築物を必要とせずにほんの約２日でそれを行う。これらの培養液に由来する遊出ＡＰＣは、ＭＨＣ及び共刺激分子のそれらの発現並びに抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する能力において古典的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＣと似ている。別の実施形態では、一次内皮細胞が系で使用される場合に得られるものに匹敵するＡＰＣを生じる耐久性のある且つ急速に成長する形質転換された内皮細胞系の使用は、このアプローチを高度に精製されたＤＣの生成に関して非常に利便性が高く信頼性の高い技法にする。
研究用途及び臨床用途用のヒト樹状細胞（ＤＣ）は通常、サイトカインのカクテル中で１週間以上の間培養される精製血液単球に由来する。これらのサイトカイン由来のＤＣは幾つかの重要な免疫学的機能が欠損し得ること、及び生理的条件下で見出される抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を正確に表示し得ないことが示唆されているため、より生理学的に関連した様式でＤＣの生成を可能にする方法が引き続き必要とされる。これまでの研究により、内皮細胞を使用して、ＤＣへの単球の分化を促進することができることが実証されている。
本発明は、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイス又は別の類似したデバイスにおいて培養される例えばヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を通る例えばヒト血液単球の１回の遊走に基づく多数の高度に精製されたＤＣを生成する簡素且つ信頼性が高い方法を含む。下部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバから収集された得られたＡＰＣは、主要組織適合性（ＭＨＣ）及び共刺激分子のそれらの発現、外来抗原を貪食する能力、並びに抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力において他のｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されるＤＣ集団と似ている。本発明の別の実施形態では、急速に成長する形質転換された内皮細胞系を一次ＨＵＶＥＣに代わって使用して、ｉＤＣへの単球の分化を誘発する。
本発明は、外因性因子の非存在下での血液単球からのヒトＤＣの内皮駆動型発達に関する新規アプローチを含む。図１は上記方法の図表示を提供し、これは、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバにおいてコンフルエントになるまで成長されている内皮細胞の層から始まる。例えばおよそ１〜５μｍの孔、好ましくは細胞遊出を可能にするおよそ５μｍの孔を有する非免疫原性且つ生物学的に不活性なポリカーボネート（ＰＣ）膜は、ＨＵＶＥＣの成長に関する支持体を提供する。膜は、下部チャンバ（組織培養ウェル）の上方に吊るされ、且つ下部チャンバと分離可能である上部チャンバに収容される。全ＰＢＭＣが上部チャンバに適用されると、内皮細胞は、膜を通る単球の選択的通過を可能にし、同時にＤＣへのそれらの分化を調節及び促進する。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）にＰＢＭＣが播種された約２日後に、上部チャンバを取り出して、さらなる成熟刺激の存在下又は非存在下で、抗原を下部チャンバ中のＤＣへ添加する。
この技法は、以下の：
・このアプローチの迅速性（ＤＣ分化はほんの約２日で起きる）、
・分化プロセス自体（これは、生理学的条件下でのＤＣの発達により類似する）、
・系の費用対効果（単球の予めの選択は必要ではなく、ＤＣ発達は高価な組換えサイトカインの非存在下で起きるため）
を包含する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン駆動型ＤＣ発達の現行の方法を上回る幾つかの利点を提供する。
・このアプローチの迅速性（ＤＣ分化はほんの約２日で起きる）、
・分化プロセス自体（これは、生理学的条件下でのＤＣの発達により類似する）、
・系の費用対効果（単球の予めの選択は必要ではなく、ＤＣ発達は高価な組換えサイトカインの非存在下で起きるため）
を包含する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン駆動型ＤＣ発達の現行の方法を上回る幾つかの利点を提供する。
本発明の実施形態では、前記方法は内皮細胞を使用して、任意の外因性成長因子の非存在下で、且つバルクＰＢＭＣからの単球の予めの選択を伴わずに約２日のうちにＤＣの発達を駆動する。血管壁を通る血液単球管外遊出のプロセスを大まかに模写する本発明は、形態、表現型及び機能において古典的なＤＣに似ている高度に精製されたＡＰＣ集団の生成を可能にする。
他の人々は、関連した様式でヒトｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＣを生成するための組織構築物を開発してきた(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)のに対して、本発明の方法はそれらの簡素さが特有である。本発明は、これまで使用されているように、内皮細胞の培養に関して３次元支持マトリックスを必要とせず、他の方法と異なり、急速に成長する形質転換された内皮細胞系の使用になじみやすく、これは、それらの一貫性及び急速な成長速度のため一次ＨＵＶＥＣと比較して好適である。
循環単球は、いったんそれらが組織へと血管系を横切ると、ｉＤＣ又はマクロファージへ分化することができる。本明細書に記載される組織構築物は、両方の細胞型への血液単球の分化を支持し、内皮下コラーゲンから逆遊出する細胞はｉＤＣに似ている一方で、マクロファージは、細胞外マトリックス中に残存する(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。上部チャンバにおいてコンフルエント内皮層を横切る単球を伴うＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスの幾何学は、亜集団がともに下部チャンバ中で収集されるようなものである。都合のよいことに、非接着／ゆるく接着しているｉＤＣは、温培地でウェルを穏やかに洗浄することにより、強力接着マイクロファージから容易に単離され、このアプローチは、９０％純粋なＤＣを生じる（データは示していない）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）内皮細胞系へ適用したおよそ１００×１０６個のＰＢＭＣは、およそ５×１０６個の非接着ｉＤＣを生じ、これは、単球が同数のＰＢＭＣから生成され、且つ外因性サイトカイン中でおよそ７日間培養された場合に（データは示していない）予測し得るおよそ４×１０６個のｉＤＣに匹敵する。
このＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ベース系においてＤＣへの単球の分化を促進する際の内皮細胞の重要な役割は、ＨＵＶＥＣ層の非存在下でＰＣ膜を通って遊出してきた細胞が、それらの表面マーカープロファイル及び抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力において非遊走細胞と類似するという発見により強調された。これらの結果は、ＨＵＶＥＣを接触させた単球がＴ細胞活性を刺激する際に非操作単球よりも熟達していたというこれまでの観察と一致する(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。これまでの研究により、この分化は、内皮細胞と単球との間の直接的な細胞間接触により促進されることが示唆されているが、この分化プログラムを媒介する特異的相互作用は依然として不明確である。ＤＣの発達を促進するための内皮細胞層状多孔質膜の使用に関する本発明の結果は、文献中の他の報告と異なり得るが、結果の不一致は、モデル系の差により容易に説明される可能性が高い。例えば、Seguin他は、多孔質膜上で内皮細胞層を通って遊出する単球は、ＡＰＣ機能性において非遊走単球よりも実際には悪いことを観察したが、これらの結果は、脳由来の内皮細胞を用いて得られた(Seguin他 (2003) J Neuroimmunol 135, 96-106)。
ＤＣは、それらが見出される組織微小環境を反映している表現型を伴う異種集団であるため、ＤＣ集団全てに一般的である単一マーカーを同定することは、現在のところ困難であった。このため、ＤＣを他の細胞型と正確に識別するのに幾つかの基準を使用することが重要である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）系から収集された非接着ＡＰＣは、他のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの供給源に由来するＤＣの特徴的な機能的属性の多くを有した。例えば、細胞は、細胞体から伸長している長い突起又は樹状突起を有し（データは示していない）、このことは、細胞の表面積を増大させることにより抗原提示を助長することが示されている。同様に、細胞は、ラテックスビーズ及び酵母粒子を貪食するそれらの能力により実証されるように効率的に抗原を獲得し、リコール抗原に対する機能的Ｔ細胞応答を誘発するそれらの能力においてサイトカイン由来のＤＣに等しかった。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣのこの後者の特徴は、他のＡＰＣ集団がコンピテントエフェクターへのＴ細胞の増殖及び分化を刺激することが可能ではないため、これらの細胞は確かにＤＣであるという最も説得力のある論拠を提供する(Rossi & Young (2005) J Immunol 175, 1373-1381)。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣは全て、ＤＣの機能的特色を有したのに対して、それらは、他のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＣ集団と異なる特有の表面プロファイルを発現した。サイトカイン由来のヒトＤＣ（即ち、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４において培養された単球から生成されたもの）は通常、単球マーカー、即ちＣＤ１４に関して陰性であり、ＤＣマーカー、即ちＣＤ１ａに関して陽性である。
対照的に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＤＣは、ＣＤ１４の発現及びＣＤ１ａの欠如を包含するマーカープロファイルを有していた。これらの正反対の結果は、各方法に特異的な培養条件の差により単に説明され得る。例えば、ヒト血清を含有する培養培地由来のＤＣはこの特定の表面タンパク質の発現を欠如することがこれまでに実証されているため、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣ上でのＣＤ１ａの欠如は予想外ではない。本発明者らは、ウシ胎児血清を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）に由来するＡＰＣがＣＤ１ａを発現すると予想する。サイトカイン由来のＤＣに対して専ら比較される場合、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣ上でのＣＤ１４の保持は、これらの細胞がＤＣへ完全に分化されていないことを示唆し得る。しかしながら、これらの結果は、内皮細胞との接触を介してＤＣへ分化するよう誘発される単球がＣＤ１４発現を失わないということを示唆している他の報告と一致する(Randolph他 (1998) Science 282, 480-483; Li他 (2003) J Immunol. 171, 669-677)。実際には、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦに加えてプレート結合性Ｐ−セレクチン（内皮細胞リガンド）上で培養された単球が、ＣＤ１４を保持するＤＣを生じたため、内皮細胞はこれらの細胞上でＣＤ１４の発現を積極的に促進し得ることをLi他は実証した。ＣＤ１４の保持は、これらの細胞のＡＰＣ機能を阻害しなかった。さらに、ＣＤ１４＋ＤＣ集団はｉｎ ｖｉｖｏで同定されている。
本発明の系の柔軟性は、本発明をｉｎ ｖｉｖｏでの各種組織のニッチで見出されるもののような種々のＤＣ集団の研究に十分適したものにする。本明細書で記載される実施例では、ＨＵＶＥＣを使用して、ＤＣへの単球の分化を駆動したのに対して、本発明の他の実施形態では、他の内皮細胞集団をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）系内で使用して、他の組織特異的ＤＣ亜集団への単球の分化を優先的に駆動することができる。例えば、これまでの報告により、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）バケットにおいて培養された腸内皮細胞が、共刺激分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子を欠如する特有のＤＣ集団を生じ、且つＴ細胞応答の乏しい刺激因子であることが示された。このｉｎ ｖｉｔｒｏでの集団は、ｉｎ ｖｉｖｏで腸粘膜に見出される寛容原性ＤＣに似ていた。
脳内皮細胞を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）を通って遊走した単球は、非遊走単球よりも低い機能性を有し(Seguin他 (2003) J Neuroimmunol 135, 96-106)、ＨＵＶＥＣを含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）を用いた場合の本発明者らの知見と対照をなす結果である。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスのモジュール設計は、ＤＣ発達／分化経路のより多彩な精査を可能にする本発明の多数の実施形態を可能にする。例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）から収集された遊出ＡＰＣは、リンパ細胞の単層を含有する第２のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバを通過することができ、これはｉｎ ｖｉｖｏでリンパ管を通る成熟／活性化組織常在ＤＣの遊走をより密接に概括するプロセスである。
ＤＣの分化又は機能を促進することに関与し得るさらなる細胞型もまた、系に導入することができる。例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスの下部チャンバ中に含有される線維芽細胞は、炎症シグナルの供給源として役立つことができ、或る特定のアジュバント又は病原体の適用中の抗原貯蔵所として作用し得る。間質細胞のような他の支持細胞もまた、本発明のデバイスの下部チャンバに含有され得る。
本発明は、血液単球から多数の高度に精製されたヒトＤＣを生成するための新規且つ利便性の高いアプローチを含む。例えば、内皮細胞の培養及びこのコンフルエント単層を通る単球の遊出用の支持構造として柔軟性の且つ十分特徴付けされたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスを使用して、表現型及び機能において他のｉｎ ｖｉｔｒｏＤＣ集団に似ている非接着ＡＰＣの集団が生成された。別の実施形態では、形質転換された内皮細胞系を使用して、ＤＣの発達を促進させた。本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでそれらの発達をより密接に模倣する様式でヒトＤＣを生成する簡素な手段を提供する。
本発明は、免疫応答に関与するようにＤＣを発達させる手段としての膜デバイス、例えば市販のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の使用を包含する。細胞遊出を可能にするサイズの孔を有する非免疫原性の且つ生物学的に不活性な膜は、内皮細胞（例えば、ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又は他の哺乳類内皮膚細胞若しくは細胞系）の成長を支持し、膜を通る単球の選択的通過を可能にし、また同時にＤＣへのそれらの分化を調節及び促進する。
膜は、下部組織培養ウェル（チャンバ）の上方に吊るされ、且つ下部組織培養ウェル（チャンバ）と分離可能な上部チャンバ中に収容され得る。本発明の実施形態を図１に示す。一実施形態では、内皮細胞は、多孔質膜上でコンフルエントになるまで培養させることができ、次にＰＢＭＣを上部チャンバへ適用することができる（図１、工程１）。白血球播種の約２日後、上部チャンバを取り出して、さらなる刺激の存在下又は非存在下で、抗原を下部チャンバに添加する（図１、工程２）。ＤＣは抗原を獲得して、続いて例えばＴ細胞刺激実験又は他のＡＰＣ機能アッセイで使用することができる。
本発明の実施形態では、コンフルエント成長又はさらには多層成長に近いか、或いはこれらを達成した内皮細胞層を保有する多孔質膜を使用することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験及びｉｎ ｖｉｖｏでの治療用の樹状細胞を開発する利便性の高い方法である。
膜は内皮細胞成長を支持し、末梢血細胞から単球を選択するか、又は単球を富化するバリアを提供することができる。例えば末梢血細胞が、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）においてその下面として内皮細胞層状膜を有する上部チャンバに添加される場合、単球は、優先的に細胞層状膜を通って遊出し、内皮細胞とのそれらの相互作用によってＤＣへ分化する(Qu他 (2003) J Immunol 170: 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282:480-483)。
遊出細胞は、コラーゲン支持体−内皮モデルで観察される「逆遊出」の可能性(Randolph他 (1998) Science 282:480-483)が有意に低減されるように、上部チャンバと分離しており上部チャンバを含まない下部チャンバに入る。したがって、抗原を、未成熟ＤＣによるプロセシングのためにこの分離した区画に容易に添加することができる。また、アジュバント、炎症誘発剤、ワクチン、化粧品、薬物、生物学的製剤、免疫療法候補物又は化合物のようなさらなる作用物質を、独立して又は抗原とともに、遊出細胞の活性化及び成熟に対するそれらの影響を評価するのに下部チャンバに添加することができる。
膜デバイスのモジュール設計は、多重細胞層及び種々のマトリックス材料、並びに系に導入されるべきサイトカイン又は刺激因子のような他の化合物を可能にする。層は、不連続且つ分離可能であってもよく、それにより細胞が、先の事象の生成物又は反応物から妨害されることなく逐次プロセスを受けることが可能となる。例えば、上部チャンバにおいて内皮層を横切る単球は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスの下部チャンバ中のＥＣＭ（細胞外マトリックス）材料と相互作用することができる（図２Ａ）。本発明の実施形態のいずれかで使用されるＥＣＭ材料は好ましくは、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む。抗原をプロセシングした遊出ＤＣはまた、その上面（図２Ｂ）又は下面（図２Ｃ）上にリンパ細胞型又は他の内皮細胞型の層を保有する膜を有する第２のチャンバを通過し得る。或いは、細胞は、単球が２つの細胞単層を通過した後に抗原又は作用物質（前記で定義されるような）を獲得するように、膜の上部側及び下部側の両方上で培養することができる（図２Ｄ）。ＥＣＭ材料はまた、この設計に組み込むことができ（図２Ｅ）、同様に膜上で培養される内皮細胞とともに存在し得る。二重膜デバイスでは、単球は、１つの細胞層を通って遊走し、抗原又は作用物質（前記で定義されるような）を獲得し、続いて第２の細胞集団を通って遊走する（図２Ｆ）。独立したチャンバを有する分離可能な膜は、反応物の容易な添加及び事象のタイミングにおける柔軟性を可能にする。これらの例の設計それぞれにおいて、リンパ内皮細胞を通る単球の遊走は、細胞が生理学的条件下でリンパ管へ遊走する場合に起こる成熟に類似して、ＤＣに向かうそれらの分化をさらに促進することができる。
ＤＣの分化又は機能を促進するのに必要であり得るさらなる細胞型もまた、系に導入することができる。例えば、線維芽細胞は、炎症性シグナルの供給源として役立つことができ、或る特定のアジュバント又は病原体の適用中の抗原貯蔵所として作用し得る。間質細胞のような他の支持細胞もまた、系に含有させることができる。したがって、これらの細胞は、単一膜デバイスの下部チャンバに（図２Ｇ及び図２Ｈ）又は二重膜デバイスにおける層間に（図２Ｉ及び図２Ｊ）に添加することができる。この後者の例では、ＥＣＭもまた膜層間に添加され得る（図２Ｊ）。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）が１２ウェルプレート、２４ウェルプレート及び９６ウェルプレート並びにより大きなスケールフォーマットで市販されており、またウェル間の細胞、液体、化学作用物質又は他の材料の輸送及び下部チャンバへのアクセスのための上部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバの取り出しを自動化することができるロボット液体取扱いシステムが利用可能であるため、本明細書に記載されるプロセスは、規模の拡張が可能且つ自動化可能である。
内皮細胞の多くの供給源が、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスにおける使用に適している。一次内皮細胞は、医療機関から入手可能であり、また商業的に購入することができる（例えば、Cambrex(East Rutherford, NJ)及びVEC Technologies (Rensselaer, NY)）。解凍したての細胞が本明細書に記載される実験で使用されたが、広範囲な一次細胞が類似した結果を伴って使用され得る。二次（不死）内皮細胞は、それらの長寿命及び急速な成長速度のため利便性が高い。例えば、長期的ＨＵＶＥＣ系であるＥＡ．ｈｙ９２６(Edgell他 (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:3734-3737)及び一次内皮細胞は、類似した分化プログラムを受けるように遊出単球を誘発することが、実験により示唆されている。
単球と内皮細胞との間の直接的な接触が、ＤＣに向かうそれらの分化を促進するのに要されることが示されており(Qu他 (2003) J Immunol 170:1010-1018)、内皮細胞により発現される可能性ではないが表面結合性のタンパク質は単球分化を誘発することを示唆する。したがって、培養された内皮細胞から単離された細胞膜は、ポリカーボネート（ＰＣ）膜に係留される場合に単球分化を促進するのに十分であり得る可能性が高い。このような実施形態では、内皮膜は、個々に又はＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスへすでに統合されて長期間にわたって保管することができ、生内皮細胞の必要性を排除する。
単球をＤＣへ分化させる目的での内皮細胞層状多孔質膜又は支持体の使用に関する本発明者らの知見は、文献中の幾つかのデータに反する。具体的には、Seguin他(2003)は、多孔質膜上の脳内皮細胞層を通って遊出した単球はすでに形態を有さず、同種Ｔ細胞を刺激するそれらの能力により評価される場合、ＡＰＣ機能において非遊走単球と同等であることを観察した(J Neuroimmunol 135:96-106)。対照的に、本発明者のデータは、遊出単球が、非遊出細胞と表現型的に及び機能的に異なることを示唆している。本発明の実施例で提示されるデータにより、ＤＣ表現型に向かう単球の分化を促進するための膜−内皮細胞デバイスの使用が確認される。
[実施例]
[実施例]
ＨＵＶＥＣ。一次ＨＵＶＥＣは、例えばVEC Technologies(Rensselaer, NY)から継代＃２で入手された。一次内皮細胞の凍結ストックを解凍して、ＭＣＢＤ−１３１完全培地(VEC Technologies)中でおよそ９×１０５細胞／ｃｍ２の密度で１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイス(Corning, Corning, NY)へ直接適用した。培地のおよそ８５％を１日おきに交換して、ＨＵＶＥＣは通常、およそ７日間Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で培養した後、単球遊走アッセイで使用された。およそ５μｍのポリカーボネート膜を伴うＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）がこれらのアッセイに使用されたが、様々な不活性材料及び／又は孔サイズの他の膜もまた適切である。
ＨＵＶＥＣコンフルエンシー。ＨＵＶＥＣ単層におけるタイト−ギャップ接合の形成は、蛍光顕微鏡法により可視化された。染色プロセスは、３．２％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Science, Hatfield, PAからの３２％ストック)でおよそ１０分間細胞を固定すること、及びそれらを−２０℃でおよそ５分間、メタノールで透過処理することを包含した。次に、細胞を加湿チャンバ中で室温でおよそ１時間、ヒトＣＤ３１に対する抗体（Ｍ８９Ｄ３、BD Pharmingen）の１：１０の希釈物で標識し、続いて１ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ(Sigma)でおよそ５分間核を標識した。次に、細胞を室温でおよそ１０分間、３．２％パラホルムアルデヒドで再び固定して、次にＧｅｌＭｏｕｎｔ(Biomedia, Foster City, CA)で覆った。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による広範な洗浄が工程間に含まれた。標識細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１蛍光顕微鏡を使用して検査した。内皮細胞単層の透過性は、標準的な拡散アッセイにより測定された。拡散アッセイの開始の２４時間前にアッセイ培地（５％熱失活（５６℃、３０分）自己血清又はヒトＡＢ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含有するイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Mediatech, Inc., Herndon, VA）へ、及び拡散アッセイの開始の１時間前に拡散培地（１％ＢＳＡを補充したＩＭＤＭ）へ細胞を切り換えた以外は、ＨＵＶＥＣは上述したように膜上で培養された。拡散培地中に１ｍｇ／ｍＬへ希釈したＦＩＴＣ結合デキストラン（７０ｋＤａ、Sigma）を上部ウェルに添加して、４つの１００μＬアリコートを下部ウェルから３０分間隔で採取した。静水圧の変化を回避するために、サンプルを取り出した後、等容量の新鮮な拡散培地を下部チャンバに添加した。培地サンプルの蛍光は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ(Winooski, VT) Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ分光光度計で４８０／５２０ｎｍフィルタセットを使用して測定した。既知量のＦＩＴＣ−デキストランの蛍光を測定することにより確立される標準曲線を使用して、ＨＵＶＥＣ単層を通って透過するデキストランの濃度を算出した。
経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を第２の方法として使用して、ＨＵＶＥＣ単層の完全性を検査した。内皮細胞をＭＣＢＤ−１３１完全培地中でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で培養して、アッセイ培地へ２４時間切り換えて、次にＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物と適合性の抵抗チャンバを使用して、電圧抵抗計（ＥＶＯＭ−ＥＮＤＯＨＭ−６、World Precision Instruments, Sarasota, FL）でＴＥＥＲを算出した。電圧抵抗計は、製造業者の指示書に従って毎日較正され、各ウェルに関して３つの別個の読取りを取得した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上のＨＵＶＥＣ単層のＴＥＥＲ読取りは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物単独から（内皮細胞の非存在下で）収集される値に対して標準化した。
ヒトＰＢＭＣ調製。富化白血球は、Central Florida Blood Bank(Orlando, FL)から入手した。ドナーは全て、良好な健康状態にあり、血液製剤は全て、標準的なアッセイにより検出される場合に血液媒介性病原体に対して陰性であった。ＰＢＭＣは、密度遠心分離により富化された。簡潔に述べると、白血球およそ４５〜５０ｍＬを、最終容量およそ１４０ｍＬになるようにクエン酸塩緩衝液（０．１％ＢＳＡ及び０．６％クエン酸Ｎａを含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。希釈血液（およそ３５ｍＬ）を５０ｍＬのコニカルチューブ中でおよそ１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上へ層状にして、遠心分離した（４００ｇ、２５分、室温）。バフィコートを取り出して、クエン酸塩緩衝液で二度洗浄して、再度遠心分離して（４００ｇ、１０分、４℃）、アッセイ培地中に再懸濁させた。ＰＢＭＣを４℃で最大２４時間維持した後に、アッセイで使用されたか、又は拡張された保管のために液体窒素中で凍結及び保管された。
単球遊出アッセイ。ＰＢＭＣは、およそ２４時間前にアッセイ培地へ移したコンフルエント内皮細胞へ適用された。およそ１０×１０６個の総ＰＢＭＣは、各１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）へ適用されて、およそ１．５時間インキュベートされた。上部チャンバをアッセイ培地で二度洗浄して、非接着細胞及びゆるく結合された細胞を除去して、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートをさらにおよそ４８時間インキュベートして、白血球遊出及び分化を可能にした。次に、上部チャンバを除去し、下部チャンバ中の細胞を、表現型分析又は機能性分析用に収集した。
ＤＣ表現型決定。ヒトＣＤ１ａ（ＨＩ１４９）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１６（３Ｇ８）、ＣＤ４０（５Ｃ３）、ＣＤ８０（Ｌ３０７．４）、ＣＤ８６（２３３１）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ｅ）及びＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）に特異的なＰＥ結合モノクローナル抗体、ＡＰＣ結合モノクローナル抗体又はＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５結合モノクローナル抗体をBD Pharmingenから購入して、製造業者により推奨されるように希釈した。アイソタイプ対照としてはＭＩｇＧ２ａ（ＧＩ５５−１７８）及びＭＩｇＧ１（ＭＯＰＣ−２１）が挙げられ、これらもまたBD Pharmingenから購入した。ＨＵＶＥＣ陰性及びＨＵＶＥＣ陽性のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）からのおよそ１〜２×１０５個の遊出細胞を、ＰＢＭＣ播種後の様々な時間で収集して、４℃でおよそ４５分間特異的抗体で標識して、広範にわたって洗浄して、２％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞標識に使用した緩衝液は、２％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳであった。サンプルはＦＡＣＳＡｒｒａｙ(BD Pharmingen)上に獲得されて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Treestar, Ashland, OR)を分析に使用した。
Ｔ細胞刺激アッセイ。ＰＢＭＣをＨＵＶＥＣ単層に適用した約２日後に、遊出細胞をおよそ２０μｇ／ｍＬのカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)タンパク質抗原抽出物(Greer Laboratorires, Lenoir, NC)でパルス化した。およそ４８時間後、遊出細胞を収集して、洗浄して、同系Ｔ細胞と組み合わせた。サイトカイン由来のＤＣは、標準的な手順を使用して調製された。簡潔に述べると、単球は、抗ＣＤ−１４抗体結合磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用して総ＰＢＭＣから精製され、続いておよそ１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ(R & D Systems, Minneapolis, MN)及びおよそ２５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−４(Endogen, Rockford, IL)を含有するアッセイ培地中でおよそ１×１０６個／ｍｌでおよそ７日間培養した。培養の５日目に、細胞をおよそ２０μｇ／ｍＬのカンジダ・アルビカンスでパルス化した。
同系ＰＢＭＣの凍結ストックをリンパ球の供給源として使用した。総Ｔ細胞は、磁気ビーズ及び自動ＭＡＣＳシステム(Miltenyi Biotec(Auburn, CA))を使用して、ネガティブ選択により精製した。精製Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄して、５μＭ ＣＦＤＡ−ＳＥ（ＣＦＳＥ、Invitrogen, Carlsbad, CA）で標識して、次にアッセイ培地で二度洗浄して、標識反応を停止した。細胞は、９６ウェル平底組織培養プレート(Corning, Inc., Corning, NY)においておよそ２〜３×１０５個／ウェルで平板培養して、ＤＣを、指示された比で添加した。ウェルはそれぞれ、およそ２００μＬの最終容量を含有した。
白血球共培養液を３７℃及び５％ＣＯ２でおよそ７日間インキュベートした後、活性化Ｔ細胞を、標準的な手順を使用して細胞内サイトカイン産生（即ち、抗原特異性）に関して試験した。標的ＡＰＣ（サイトカイン由来のＤＣ）は上述したように調製された。５日目に、細胞の分画を２０μｇ／ｍＬ カンジダ・アルビカンスでパルス化して、次に６日目に、２５ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα(Endogen)を添加することにより、これらの細胞をさらに活性化した。７日目に、標的ＤＣを、１μｇ／ｍＬ ブレフェルジンＡ(Sigma, St. Louis, MO)の存在下でおよそ１：１０の比でおよそ８時間、活性化Ｔ細胞とともに培養した。細胞を、ＣＤ３εに特異的な抗体（ＳＫ７、BD Pharmingen)で表面標識して、次にBD PharmingenからのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ及びｐｅｒｍ／ｗａｓｈ試薬を使用してヒトＩＬ−２に特異的な抗体(Endogen)で細胞内標識した。
コンフルエントＨＵＶＥＣ層は、樹状細胞への遊出単球の分化を促進するのに必要とされることが示唆されている(Qu他 (2003) J Immunol 170: 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282: 480-483)。したがって、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で成長させた内皮細胞を、静止状態の内皮細胞を示すタイト−ギャップ接合の形成に関して播種後の幾つかの時点で検査した(Dye他 (2001) Microvasc Res 62:94-113)。およそ１〜２日以内にコンフルエント層を形成するのに十分な密度で細胞を播種したが、タイト−ギャップ接合の形成は、表面ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）蛍光により実証されるように(Dusserre他 (2004) Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 1796-1802)、およそ３〜４日目まで認められなかった（図３Ａは、播種後の７日目の細胞を示す）。ＤＡＰＩを使用して、細胞核を対比染色した（図３Ａ、右パネル）。また、内皮細胞におけるタイト−ギャップ接合の形成が、経内皮抵抗（ＴＥＥＲ）の増加及び単層を横切る拡散の減少に関連することが十分確立される。したがって、ＴＥＥＲが、播種後の約３日目〜４日目の間に劇的に増加したことを実証する図３Ｂ、及びＰＢＭＣ適用後の２日目〜７日目の間にＨＵＶＥＣを通るＦＩＴＣ−デキストラン拡散の損失を強調する図３Ｃの結果は、内皮細胞が、ポリカーボネートＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上でコンフルエント／静止状態になるまで培養され得るという結論をさらに支持する。続く実験では、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）は、ＨＵＶＥＣ播種後の７日目に使用した。
単球遊出及び分化に対する内皮細胞の影響は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）系を適合させるよう修飾された公表されているプロトコル(Qu他 (2003) J Immunol 170:1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282:480-483)を使用して評価した。これまでの研究からの重要な観察は、単球は、他の細胞型よりも急速に且つより多数でＨＵＶＥＣ単層を渡るため、コラーゲンマトリックス上で静止状態の内皮細胞に適用される総血中白血球から有意に富化され得ることである(Randolph他 (1998) Science 282: 480-483)。同様に、ＰＢＭＣがＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）−ＰＣ膜上でコンフルエント内皮単層へ適用される場合、播種のおよそ２日後の遊出細胞のほぼ全て、サイズが一様であり、ＤＣの特徴である細胞体から伸長している突起／ベールを有した（図４Ａ、右パネル）。対照的に、内皮細胞単層の非存在は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜（図４Ａ、左パネルで矢印により示される）を通るより不均一な集団（赤血球及びリンパ球に形態学的に似ている細胞を含む）の遊出を可能にした。
ＨＵＶＥＣが、遊出している単球の分化状態に影響を及ぼすかどうかを判定するために、内皮細胞層の存在下又は非存在下でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜を通過する細胞を、ＤＣに特徴的な表面タンパク質に特異的な抗体で標識した。多孔質膜を通って遊走する簡単なプロセスは、単球において改変された表現型を誘発し得ることが可能であったため、非遊走細胞を比較用に包含させた。この目的のために、ＣＤ１４−陽性単球を、任意の外因性サイトカインなしでアッセイ培地中でおよそ２日間培養した後、フローサイトメトリーによりプロファイリングした（図４Ｂ）。この実験の結果は、循環単球が、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６のような幾つかのＡＰＣマーカーに関して陽性であるが、ＣＤ４０及びＣＤ８０を含む他のものに関しては陰性であることを示すこれまでの報告と一致する(Elkord他 (2005) Immunology 114: 204-212; Salek-Ardakani他 (2004) J Immunol 173:321-331)。図４Ｂに示される非遊走単球上の表面タンパク質のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、遊走単球が比較されるベースラインプロファイルを確立した(図４Ｃ）。
外因性サイトカインの存在下でＤＣへ分化される単球は通常、膜ＣＤ１４を損失し、未成熟ＤＣマーカーであるＣＤ１ａを獲得する。しかしながら、ＣＤ１ａは通常依然として低いままであり、且つＣＤ１４は、ヒト血清中で培養される単球由来のＤＣ上で損失されないため、遊出ＤＣが異なるプロファイルを有することは驚くべきことではなかった(Piemonti他 (2000) Cancer Immunol Immunother 49:544-550)。遊出細胞上での成熟ＤＣのマーカーであるＣＤ８３の低い発現は、それらが大いに未成熟状態であることを示唆する（図４Ｃ）。この分析に含まれる他の分子は、抗原獲得及びＴ細胞共刺激に重要である。具体的には、ＨＵＶＥＣ層を通って遊走する単球上で上方調節された低親和性ＩｇＧ受容体であるＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、抗体でコーティングされたタンパク質の取込みにおいて重要な役割を果たす。ＣＤ８６及びＣＤ８０は、ナイーブＴ細胞活性化及び増殖にとって重要な刺激シグナルを提供する。ＣＤ８６は、精製単球上で高レベルですでに発現された（図４Ｂ）が、ＣＤ８０は、非遊走単球上で陰性であり、単球が内皮単層を通って遊走した後に増加したに過ぎなかった（それぞれ、図４Ｂ及び図４Ｃ）。類似した結果が、ＤＣ自体に成熟シグナルを提供するマーカーであるＣＤ４０に関して得られた。
ＤＣにより発現される表面マーカーが、それらを他の細胞型と識別するのに有用であり得るのに対して、ＡＰＣを明確に表す特徴は、Ｔ細胞応答を誘発するそれらの能力である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＤＣの機能性は、同系Ｔ細胞刺激アッセイにおいて同じドナーからのサイトカイン由来のＤＣに対して判断した。両方の細胞型が、Ｔ細胞増殖（ＣＦＳＥ希釈）を効率的に誘発して、短期間の抗原刺激に続いてＩＬ−２を分泌することが可能である類似した頻度のエフェクター細胞を誘発した（図５）。バックグラウンドを超えるレベルでＩＬ−２を分泌することが可能なＴ細胞のみが、７日の刺激及び８時間のＩＣＣＳアッセイの両方中にカンジタ・アルビカンスに遭遇するものであったため、この応答は抗原特異的である可能性が高かった（図５）。
膜のみを通って遊走するプロセスが、単球において強力なＡＰＣ活性を誘発するのに十分でなかったことを確実にするために、ＨＵＶＥＣの非存在下及び存在下で膜を通過した遊出細胞を、Ｔ細胞応答を誘発するそれらの能力に関して試験した。結果により、膜のみを通過する細胞がバックグラウンドを超える抗原特異的Ｔ細胞刺激活性を有さなかったため、単球と内皮細胞との間の相互作用はそれらの完全な分化を促進するのに必要であることが実証された。図５Ａ及び図５ＢにおけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＤＣに応答するＴ細胞の頻度の不一致は、これらの独立した実験で使用されたドナーの免疫歴に起因する可能性が高い。
本発明の実施形態では、人工免疫系（ＡＩＳ）に導入される抗原分子は、ワクチン接種部位（ＶＳ）で樹状細胞（ＤＣ）により獲得される。次に、ＤＣをリンパ組織等価体（ＬＴＥ）に移し、ここでＤＣは抗原をＴ細胞に提示して、それらの免疫機能を活性化する。活性化されたヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞を共刺激して、抗体産生を誘導するのに対して、活性化された細胞障害性Ｔ細胞は、抗原保有細胞を溶解させる。可溶化抗原もまた、ＬＴＥに導入されて、Ｂ細胞を直接的に活性化することができる。
マイクロキャリアリンパ組織等価体（ＬＴＥ）へ配置されたＴｒａｎｓｗｅｌｌ(登録商標）ベースのワクチン接種部位（ＶＳ）モデルからのＤＣを使用して、統合実験を実施した。これらのＡＰＣは、抗原をＴ細胞に提示することが可能であり、抗原特異的Ｔ細胞応答（増殖）を示す。結果を、２Ｄ培養皿で観察されるものと比較した。
ワクチン接種部位。本発明の実施形態では、コラーゲン、多孔質ポリカーボネート膜、膜ベースモデルへの抗原の組込み及び製造可能な様式で膜ベースＶＳモデルの複雑性を増大させる能力（例えば、間質細胞の添加、上皮の添加等）とともに、様々な形状を使用した。多孔質ポリカーボネート（ＰＣ）膜は、コラーゲンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）用の支持体層として作用し得る（図６の例を参照）。
遊出抗原特異的ＤＣの表現型及び数に対するこれらの可変要素の影響を検査した。検査された実験的可変要素としては、図６に示される形状が挙げられる。
本発明の実施形態では、本発明者は、標準的な９６ウェルプレートモデル、簡単なＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ベースモデル、フィルタ膜と統合されたコラーゲンマトリックスを用いたモデル、多孔性及び潜在的に細胞流束を増大させるようにレーザー微細加工されたポリカーボネート膜を用いたモデル、並びに細胞遊走経路、細胞遊走数、ＤＣ表現型及びＤＣ機能に対する１つの内皮層対２つの内皮層の影響を検査するために一方がＶＳ膜構築物の上面上に、また一方がＶＳ膜構築物の下面上に２つの内皮層が創出されたモデルにおいてコラーゲンクッションを検査した。
本発明の実施形態では、コラーゲン膜は、ウェルベースのフォーマットで流延された。本発明は、簡単なウェルベース系において膜フォーマットでコラーゲンを流延させる方法を開発した。例として、本発明者は、コラーゲン膜を伴う３つの支持構造を検査した：連続ポリカーボネート（ＰＣ）膜（孔直径およそ８μｍ）、レーザー微細加工されたＰＣ膜（利用可能な孔直径の範囲［およそ１００〜５５０μｍ］）及びナイロンメッシュ（利用可能なメッシュサイズの範囲［およそ１００〜５００μｍ］）。図７は、レーザー微細加工されたＰＣ膜の例、及び９６ウェルフォーマット又は簡単な単一ウェルフォーマットのいずれかでコラーゲン膜を創出するのに行われた工程を示す。
本発明者は、コラーゲン及び／又はＰＣ膜が細胞遊走を妨げるかどうかを検査した。本発明者は、連続ＰＣ膜支持体上にコラーゲン膜を含むモデル（図６における第３のモデル）において細胞遊走を検査した。コンフルエントＨＵＶＥＣ単層は、コラーゲン膜の上面上で成長させて、ＰＢＭＣは、単球選択及びＨＵＶＥＣ層を通る遊走用に添加した。
およそ１．５時間後、非遊走性細胞を洗い落として、遊走性細胞はおよそ４８時間構築物中に残されて、ＨＵＶＥＣ層を通って戻る逆遊出、コラーゲン及びＰＣ膜を通る遊出又はコラーゲン膜内での保持を可能にした。本発明者らは、細胞遊走数が、コラーゲンの上面上で内皮細胞層を通って逆流する逆遊出するものと比較してコラーゲン及びＰＣ膜を通って遊出する細胞に関して少なく、コラーゲンもＰＣ膜も細胞遊走を妨げないことを見出した。
図８は、コラーゲン膜全体にわたる遊走性細胞の出現、及び構築物を通って完全に遊走したプレートの下面上の細胞を示す。構築物を通る細胞遊走はまた、コラーゲン密度、コラーゲン膜の厚さ、及び構築物の下面への第２のＨＵＶＥＣ層の付加のような他の要因にも依存した。
様々なワクチン接種部位モデルでは、本発明者は、遊出細胞の表現型及び数に対する設計可変要素の幾つかの影響を検査した。本発明者は、連続ＰＣ膜上のコラーゲンで構成されるモデル（図６に示される第３のモデル）からの遊出細胞の表現型及び細胞数を、コラーゲンクッションモデル（図６に示される第１のモデル）及びＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ベースモデル（図６に示される第２のモデル）と比較した。図９は、各モデルからの細胞数を示す。
本発明者はまた、３つのモデルそれぞれから遊走した細胞のＤＣ表現型を比較した。図１０、図１１及び図１２は、それぞれ遊走細胞の各モデルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６及びＣＣＲ７の発現のレベルを示す。ＶＳから産生されたＤＣは未成熟表現型を有するため、ザイモサン（ＤＣを成熟させることで知られている）を各モデルに関する試験サンプルとして添加して、３つのモデルそれぞれからの成熟ＤＣ表現型を比較した。
図１０に示されるように、ＰＣ膜モデル上のコラーゲンからの成熟遊走細胞（ザイモサンに暴露された）のＨＬＡ−ＤＲ発現のレベルは、コラーゲンクッションモデルのレベルと非常に類似しており、ともに、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）モデルに関して見られるよりも高かった。同じことが、それぞれ図１１及び図１２に示されるＣＤ８６及びＣＣＲ７のレベルに関しても見られた。表現型分析により、ＰＣ膜上のコラーゲンのモデルから遊走する細胞は、コラーゲンクッションモデルから遊走する細胞と類似した表現型を有することが示され、それらは類似して機能すると予想される。
複雑性を構築する能力。図１３では、本発明者は、本発明の他の実施形態と、どのようにして複雑性を加えることができるかを示す。一例として、本発明者は、コラーゲン膜を覆ってコンフルエント内皮を形成することができ、コラーゲン膜への単球経内皮遊走を観察することが可能であり、ＤＣ及び常在マクロファージへの単球の分化を観察することが可能であり、コラーゲンへ線維芽細胞を導入することが可能であり、且つ、これらの実施形態が例えば９６ウェルフォーマットで製造され得ることを示すことが可能であった。
ＶＳへの抗原導入。図１４は、どのようにしてウェル基材のフォーマットへ統合された膜ベースＡＩＳに抗原を添加することができるかの例を示す。この図は、存在するコンフルエントＨＵＶＥＣ層を有するコラーゲン膜へ抗原を導入する手段を示す。いったんＨＵＶＥＣが播種され、コンフルエントになるまで成長されると、ＰＢＭＣがＨＵＶＥＣ面に適用されて、内皮を通って血管外遊出することを可能にした。およそ１．５時間後（典型的なプロトコル）、非遊走性細胞を内皮表面から洗い落として、次にバケット／ウェルを反転させて、ＡＩＳ系のＬＴＥセクションに配置させた。続いて、抗原、ワクチン及び／又はアジュバントが、反転されたＶＳ構築物の裏面を通って導入され得る。次に、成熟中のＤＣは、ＶＳから遊走して、下流のＬＴＥへ入る。抗原取込みが行われる一方で、単球由来のＤＣはコラーゲン膜中に存在する。このアプローチのさらなる利益は、ＡＰＣにより飲み込まれない可溶化抗原もまたＬＴＥへ入ることができ、ここでそれはＢ細胞により直接的にプロセシングされ得ることである。
一次ＨＵＶＥＣ培養液は、１０％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍＬ 内皮成長因子、１μｇ／ｍＬ ヒドロコルチゾン、０．２ｍｇ／ｍＬ ＥＮＤＯＧＲＯ、０．１ｍｇ／ｍＬ ヘパリン及び抗生物質／抗真菌薬溶液を含有するＭＣＤＢ−１３１完全培地中で成長させた（試薬は全て、VEC technologiesから）。形質転換された内皮細胞系であるＥＡ．ｈｙ９２６(Edgell他 (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80, 3734-3737)は、Cora-Jean Edgell(University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC)から寄贈された。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＭ１９９培地(Invitrogen)中で成長させて、およそ６〜７日毎におよそ１：１０で継代培養させた。
免疫細胞培養及びアッセイは全て、０．２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（全て、Sigmaから)、並びに様々な濃度の熱失活（５６℃、３０分）ヒト血漿又はウシ胎児血清(HyClone Laboratories)を補充したイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Media Tech）中で実施した。
遊出性単球は、ＰＢＭＣ適用のおよそ２日後に収集して、細胞に対しておよそ３：１の比で直径１μｍの橙色蛍光ビーズ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識したザイモサン粒子（試薬はともに、Molecular Probesから）とともに一晩インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で一度洗浄して、フローサイトメトリーにより分析した。場合によっては、ＡＰＣは、２０μｇ／μＬ サイトカラシンＤで３７℃にて２時間処理した後、ビーズ又は粒子とともにインキュベートして、食作用活性を阻止した（図１６）。
これまでの研究により、コラーゲン基材上でコンフルエントになるまで成長させたＨＵＶＥＣは、内皮単層を通ったほとんどのＰＢＭＣ集団（単球を除く）の遊走に関する非常に制限的なバリアを創出することが示されている(Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。同様に、ＰＢＭＣが上部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）バケットにおいてコンフルエントＨＵＶＥＣに適用される場合、遊出細胞はほぼ全て、サイズ及び形態が一様であった（図４Ａ、右パネル）。対照的に、ＨＵＶＥＣ単層の非存在は、より不均一なＰＢＭＣ集団（赤血球及びリンパ球を含む）が下部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバへとＰＣ膜を通過するのを可能にした（図４Ａ、左パネル）（この特定のアッセイにおける非接着プレートの使用は、遊出単球のいずれかが下部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバへ結合するのを防いだ）。およそ１〜５×１０６個のＰＢＭＣが上部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバへ適用される場合、白血球のおよそ１０％がＨＵＶＥＣを通って遊出した。培養液を標準的な組織培養処理プラスチック皿で確立させた場合、遊出細胞の約５０％が低／非接着性であったのに対して、他の半分は強力な接着を示し、形態学的にマクロファージに似ていた（データは示していない）。
これまでの研究により、コンフルエント内皮細胞単層を２回通過した単球は、表現型及び機能において古典的なＤＣに似ているＡＰＣへ分化することが示唆されている(Qu他 (2003) J Immunol 170, 1010-1018; Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。本発明者は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）系で起こるようなコンフルエントＨＵＶＥＣ層を通る単球の１回の遊走が、ｉＤＣに向かうそれらの分化を促進するのに十分であるかどうかを判定しようとした。この目的のために、ＰＢＭＣが上部チャンバに適用されたおよそ４８時間後に、遊出ＡＰＣを下部Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）チャンバから収集して、ＤＣの特性に関して検査した。これらの分析の多くに関して、単球の分化状態を調節する際の内皮細胞の役割は、ＨＵＶＥＣ単層の非存在下又は存在下でＰＣ膜を通って遊走した細胞を比較することにより検査された。
免疫細胞、及びこれらの集団の様々な活性化／成熟状態は多くの場合、表面タンパク質の特定のパターンのそれらの発現により規定される。したがって、単球分化に対するＨＵＶＥＣの影響は、内皮細胞と接触させた遊出単球の表現型を、空のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）バケットを通過したものと最初に比較することにより検査した。ＨＵＶＥＣ層の非存在下で多孔質ＰＣ膜を通過する単球もまた、それらのマーカープロファイルの変化を受け得ることが可能であったため、外因性因子の存在しないアッセイ培地中で２日間培養した非遊走ＣＤ１４＋細胞を使用して、対象の各マーカーに関するベースライン発現レベルを確立させた。図４Ｂでは、非遊走単球に関するマーカーのメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）は、１００％で設定されて、４８時間前にＰＣ膜を通って遊出した単球上の同じマーカーのＭＦＩの変化に対して比較された。ＨＵＶＥＣ単層の存在は、それぞれＤＣ及びＴ細胞に重大な共刺激／活性化シグナルを提供する遊出ＡＰＣ上での２つの分子、即ちＣＤ４０及びＣＤ８０の発現の顕著な増加を引き起こした。低親和性ＩｇＧ受容体であるＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（これは、抗体でコーティングされたタンパク質の取込みに重要である）は、ＨＵＶＥＣ層を通って遊走するＡＰＣ上で上方調節されたが、それはまた、より少ない程度ではあるが、内皮単層を欠如しているＰＣ膜を通過する細胞上でも上昇された。遊出単球上でのＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現のごくわずかな増加は、これらのタンパク質が非遊走単球上で高レベルですでに発現されたため驚くべきことではなかった（データは示していない）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣは、単球マーカーであるＣＤ１４のそれらの保持、及びＤＣマーカーであるＣＤ１ａの欠如において伝統的なサイトカイン由来のＤＣと異なっていた（図４Ｂ）。図４Ｂにおいてグラフで示されたコンフルエント内皮単層を通って遊出した単球に関するフローサイトメトリーデータは、図４Ｃにおいてヒストグラム形態で示される。
ｉｎ ｖｉｖｏデータ及びｉｎ ｖｉｔｒｏデータにより、単球はマクロファージ又はｉＤＣのいずれかへ分化することができることが示されている(Randolph他 (1998) Science 282, 480-483)。これらの報告と一致して、形態及び接着により、経内皮遊走細胞が少なくとも２つの別個の集団を含むことは明白であった（データは示していない）。表現型分析（図１５）は、遊走接着細胞と遊走非接着細胞との間で幾つかの区別を明らかにした。接着集団上でのＣＤ６８の高発現とあいまったＤＣマーカーであるＤＣ−ＳＩＧＮの低レベルの発現により、これらの細胞は実にマクロファージであることが示唆される。非接着細胞上でのこれらのマーカーの反対の表現型、具体的にはＤＣ−ＳＩＧＮの発現の上昇は、これらの遊出細胞がＤＣに向かって分化しているという本発明者らの主張をさらに支持する。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来の細胞上の共刺激リガンドの発現の増大により、１回の経内皮遊走は、強力なＡＰＣへのこれらの細胞の分化を誘発するのに十分であり得ることが示唆された。さらなる実験を実施して、表現型の変化がまた、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来の細胞の機能性の増大に関連するかどうかを判定した。例えば、ＤＣを明確に表す特徴は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩのプロセシング並びに提示用の可溶性材料及び粒状材料を捕獲するそれらの能力である。ＡＰＣの、蛍光標識されたおよそ１μｍのラテックスビーズ及びザイモサン（酵母）粒子を獲得する能力は、強力な食作用活性を示している。図１６に示されるように、ザイモサン粒子は、ほぼ全てのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣにより捕獲され、細胞の約３０％がラテックスビーズを獲得した。材料はともに、マンノース受容体を介して捕獲される一方で、ＡＰＣ内のラテックスビーズの蓄積の減少はビーズのサイズに関連付けられ得、小（およそ０．２μｍ）ビーズが、より大きなビーズよりも遥かに効率的に貪食されることはこれまでに言及されている。他方で、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来の細胞による酵母粒子取込みの効率の増加は、ＴＬＲ２のような他の受容体により媒介され得る。食作用の阻害剤であるサイトカラシンＤの添加は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣによる両方の材料の取込みの部分的な低減を誘発し、粒子が能動メカニズムにより摂取されることが示唆された。
ＤＣの別の顕著な特徴は、成熟／活性化プログラムを受けるそれらの能力であり、これは、様々な炎症性刺激との遭遇後の抗原提示及びＴ細胞刺激と関連する分子の改変された発現を包含する。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣの成熟能を評価するために、下部チャンバから収集された遊走細胞をＴＮＦ−α及びＬＰＳでおよそ２４時間刺激して、それらの表面マーカープロファイルの変化に関してフローサイトメトリーにより分析した（図１７）。低親和性Ｆｃ受容体であるＣＤ３２のような抗原取込みに関連したマーカーは、活性化ＤＣ上で減少したのに対して、適応免疫の誘導にとって重要な共刺激機能に役立つＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような他のものは、ＴＮＦ−α／ＬＰＳ処理細胞上で上昇された。ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）及びＣＤ１４が成熟刺激により影響を受けなかったという事実は、サイトカイン由来のヒト成熟ＤＣが通常、ＭＨＣクラスＩＩを上方調節するように、またさらにはＣＤ１４を下方調節するように誘発されるため、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣの特有の表現型をさらに強調している（データは示していない）。
ＤＣを他のＡＰＣ集団と区別する重要な特徴は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するそれらの能力である。このため、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスからの経内皮遊走ＡＰＣを、リンパ球増殖及びエフェクター機能を含む抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するそれらの能力に関して評価した。ヒトにおける天然微生物叢の構成成分であるカンジダ・アルビカンス（Ｃ．アルビカンス）は、これらのアッセイに関する抗原供給源として選択された。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣは、Ｃ．アルビカンス由来の全タンパク質抗原でパルス化して、ＴＮＦ−αを用いて成熟させて、次に増殖感受性色素である５−（及び６−）カルボキシフルオレセインジアセテートのスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ、ＣＦＳＥ）で標識した自己Ｔ細胞とともにおよそ７日間培養した。その後、特異的抗原でパルス化したＡＰＣを標的とする短期間のＴＣＲ刺激後のサイトカインの増殖（ＣＦＳＥ希釈）及び産生に関してＴ細胞を評価した。短期間の抗原再刺激後のＣ．アルビカンス特異的ＣＦＳＥｌｏｗＩＬ−２＋Ｔ細胞の存在は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣの、完全コンピテントエフェクターへの抗原特異的Ｔ細胞の完全な分化を誘発する能力の強力な証拠を提供する。このアッセイにおける対照は、ＤＣ刺激因子、及びＣ．アルビカンス抗原でパルス化されていない標的を包含した（図１８）。Ｔ細胞応答の刺激因子としてのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣの品質は、同じドナーから調製されたサイトカイン由来のＤＣに対して評価された。図１８の結果により、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣは、両方のＡＰＣ型が、ＴＣＲライゲーション後にＩＬ−２を分泌することが可能である類似した頻度のＣ．アルビカンス特異的エフェクター細胞を誘発したため、Ｔ細胞応答を誘発するそれらの能力において古典的なＤＣとほぼ同等であることが実証される。
本発明者らの手腕では、非遊走単球は、特異的Ｔ細胞応答を誘発することが不可能であった（データは示していない）が、本発明者は、ＨＵＶＥＣ単層の非存在下でＰＣ膜を通過した単球が強力なＴ細胞刺激能を有し得るという可能性を考察した。しかしながら、図４Ｃの結果により、ＰＣ膜のみを通過する細胞はバックグラウンドを超える特異的Ｔ細胞応答を誘発することが不可能であったため、単球と内皮細胞との相互作用は、ＡＰＣへのそれらの完全な分化を促進するのに重要であることが実証される。図４Ｂ及び図４ＣにおけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＤＣに応答したＴ細胞の頻度の不一致は、これらの実験で使用された２つのドナーの免疫歴の差に起因する可能性が高い。経内皮遊走単球のＴ細胞刺激能の増大は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣ上での共刺激リガンド、即ちＣＤ４０及びＣＤ８６の発現の増加に関連付けることができる（図４Ｃ）が、この可能性を確認するにはさらなる実験が必要である。
本明細書に記載されるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ベース系の全体的な実用性に関する制約は、単球をＤＣ分化へ駆動させるための一次ＨＵＶＥＣの使用である。これらの成長が遅い細胞の使用を克服するために、本発明では、ＨＵＶＥＣをヒト肺癌細胞系｛Edgell, 1983 #24｝と融合させることにより得られる耐久性のある急減に成長する形質転換された内皮細胞系であるＥＡ．ｈｙ９２６を用いてこの一連の実験を繰り返した(Edgell他 (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80, 3734-3737)。示されていないデータでは、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、ＨＵＶＥＣよりも急速に、ＰＣ膜上でコンフルエントになるまで成長して、タイト−ギャップ接合を形成した。経内皮遊走非接着ＡＰＣは、成熟因子による刺激前及び刺激後に表面マーカー表現型において一次内皮培養液からのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＡＰＣと似ていた（データは示していない）。最も重要なことには、一連のドナーにわたって、二次ＨＵＶＥＣを含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）に由来するＡＰＣのＴ細胞刺激能は、他のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ＡＰＣ及びサイトカイン由来のＤＣに匹敵していた。
これらの実施例で提示した結果により、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）内皮細胞デバイスは、単球からＤＣ様細胞を誘導するための簡単且つ迅速なアプローチを提供する。遊出単球は形態学的にＤＣに似ており、完全Ｔ細胞活性化を誘発するのに重要である共刺激分子の発現の増加を有する。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）由来のＤＣはまた、標準的なＴ細胞アッセイにおいてカンジダ・アルビカンスに対してＴ細胞応答を生成する際に十分特徴付けされたサイトカイン由来のＤＣに非常に類似していた。単球からＤＣ分化を得るのに要される短いインキュベート時間、ＤＣをｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＣにより匹敵させ得る系複雑性を増加することが可能であるモジュール設計、及びその比較的低い費用を含むＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスの利点は、それをｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験用にＤＣを生成する現行の方法に代わる魅力的な代替手段にする。
上記説明及び実施例は、本発明をどのように実施するかを当業者に教示するという目的であり、説明に目を通すことで当業者に明らかとなる本発明の全ての明白な変更形態及び変形形態を詳述すると意図されない。しかしながら、全てのこのような明白な変更形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に包含されると意図される。特許請求の範囲は、文脈が具体的に反対を示さない限りは、そこで意図される目的を満たすのに有効である任意の配列での特許請求される構成要素及び工程を網羅すると意図される。
Claims (49)
- 多数の樹状細胞を生成する方法であって、
多孔質膜の上面（top）上で内皮細胞を培養すること（該膜は、ウェルの下部チャンバの上方に吊るされ、且つウェルの下部チャンバと分離可能であるウェルの上部チャンバに収容される）、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記多孔質膜上の前記内皮細胞へ適用すること、
前記ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、前記多孔質膜及び前記内皮細胞を収容している前記ウェルの前記上部チャンバを除去すること、並びに
前記ウェルの前記下部チャンバから樹状細胞を単離すること、
を含む多数の樹状細胞を生成する方法。 - 前記多孔質膜はポリカーボネート膜である、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、形質転換された内皮細胞系である、請求項１に記載の方法。
- 前記樹状細胞は、温培地で前記ウェルを洗浄することにより前記下部チャンバから単離される、請求項１に記載の方法。
- Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスは、前記ウェルの前記上部チャンバ、前記ポリカーボネート膜及び前記ウェルの前記下部チャンバを提供するのに使用される、請求項２に記載の方法。
- 前記樹状細胞はＣＤ１４陽性である、請求項１に記載の方法。
- 前記多孔質膜は、およそ５μｍの孔を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記ウェルの前記下部チャンバから前記樹状細胞を単離する前に、作用物質が添加される、請求項１に記載の方法。
- 前記作用物質は、ワクチン、アジュバント、免疫療法候補物、免疫調節物質、化粧品、薬物、生物学的製剤(biologic)、炎症誘発剤及び化合物から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、前記ＰＢＭＣを添加する前にコンフルエントになるまで培養される、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、前記ＰＢＭＣを添加する前に、多層細胞成長が達成されるまで培養される、請求項１に記載の方法。
- 前記ウェルの前記下部チャンバは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ＥＣＭ材料は、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記ウェルの前記下部チャンバは、線維芽細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ウェルの前記下部チャンバは、他の支持細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ウェルの前記下部チャンバは、間質細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、ＥＣＭ材料へ付着される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＥＣＭ材料は、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記多孔質膜は、多孔性を増大させるようにレーザー微細加工される(laser-micromachined)、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞はまた、前記多孔質膜の下面（bottom）上で培養される、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞はまた、ＥＣＭ材料の存在下で前記多孔質膜の下面上で培養される、請求項１に記載の方法。
- 作用物質に対する動物の潜在的反応を評価する方法であって、
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の上面上に取り付けられたＥＣＭ材料、及び
前記ＥＣＭ材料の上面上に取り付けられた第２の多孔質膜
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
前記第１の多孔質膜の下面上で内皮細胞を培養すること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記内皮細胞へ適用すること、
およそ１．５時間後に、前記第１の多孔質膜の前記下面の前記ＰＢＭＣ及び前記内皮細胞を洗い落とすこと（樹状細胞はこの段階で前記ＥＣＭ材料中に存在する）、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む前記第２のウェルから除去し、前記第２の多孔質膜を伴う前記第１のウェルを、第２のＥＣＭ材料並びに複数のリンパ球及び白血球を含む三次元人工リンパ組織を基材として含む第３のウェルに上向きに配置すること、
前記第２の多孔質膜の前記上面へ作用物質を適用すること（前記抗原は、前記樹状細胞が、前記第１のＥＣＭ材料から前記三次元人工リンパ組織へと遊走するのを可能にする）、並びに
前記作用物質に対する免疫応答を評価すること、
を含む、作用物質に対する動物の潜在的反応を評価する方法。 - 前記内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項２３に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、形質転換された内皮細胞系である、請求項２３に記載の方法。
- 前記第１の多孔質膜及び前記第２の多孔質膜は、ポリカーボネート膜である、請求項２３に記載の方法。
- 前記第１の多孔質膜及び前記第２の多孔質膜は、およそ５μｍの孔を有する、請求項２３に記載の方法。
- 前記作用物質は、ワクチン、アジュバント、免疫療法候補物、免疫調節物質、化粧品、薬物、生物学的製剤、炎症誘発剤及び化合物から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、前記ＰＢＭＣを添加する前にコンフルエントになるまで培養される、請求項２３に記載の方法。
- 前記ＥＣＭ材料は、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記第１の多孔質膜及び前記第２の多孔質膜は、多孔性を増大させるようにレーザー微細加工される、請求項２３に記載の方法。
- 多数の樹状細胞を生成する方法であって、
以下の：
基材としての第１の多孔質膜、
前記第１の多孔質膜の下面上で培養された内皮細胞、
前記第１の多孔質膜より上に位置し、且つ前記第１の多孔質膜と分離される第２の多孔質膜、
前記第２の多孔質膜の上面で培養された内皮細胞、及び
前記第１の多孔質膜と前記第２の多孔質膜との間に位置する作用物質を含む細胞培養培地
を含む第１のウェルを作製すること、
前記第１のウェルを、細胞培地を含む第２のウェルへ反転させること、
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記第２の多孔質膜の前記上面上で培養された前記内皮細胞へ適用すること、
前記ＰＢＭＣの適用の少なくとも約４８時間後に、前記第１のウェルを前記第２のウェルから除去すること、及び
樹状細胞を前記第２のウェルから単離すること、
を含む、多数の樹状細胞を生成する方法。 - 前記内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項３２に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、形質転換された内皮細胞系である、請求項３２に記載の方法。
- 前記樹状細胞は、温培地で前記ウェルを洗浄することにより前記第２のウェルから単離される、請求項３２に記載の方法。
- Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）デバイスは、前記第１のウェルを提供するのに使用される、請求項３２に記載の方法。
- 前記樹状細胞はＣＤ１４陽性である、請求項３２に記載の方法。
- 前記多孔質膜は、およそ５μｍの孔を有する、請求項３２に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、前記ＰＢＭＣを添加する前にコンフルエントになるまで培養される、請求項３２に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、前記ＰＢＭＣを添加する前に、多層細胞成長が達成されるまで培養される、請求項３２に記載の方法。
- 前記第２のウェルは、該ウェルの前記基材に位置するＥＣＭ材料を有する、請求項３２に記載の方法。
- 前記ＥＣＭ材料は、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記第２のウェルは、該ウェルの前記基材に位置する線維芽細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記第２のウェルは、該ウェルの前記基材に位置する支持細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記第２のウェルは、該ウェルの前記基材に位置する間質細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記内皮細胞は、ＥＣＭ材料へ結合される、請求項３２に記載の方法。
- 前記ＥＣＭ材料は、ゼラチン、コラーゲン、合成ＥＣＭ材料、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、天然ＥＣＭ材料、キトサン、プロトサン及びそれらの混合物から成る群から選択される材料を含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記多孔質膜は、多孔性を増大させるようにレーザー微細加工される、請求項３２に記載の方法。
- 前記多孔質膜はポリカーボネート膜である、請求項３２に記載の方法。
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