JP2009520730A - アレルギー性疾患を治療および予防するための手段および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、所定の内部でイオン性を有する（両性イオン性の）リン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体の使用に関する。このような状況において好ましくは、エデルフォシン、ミルテフォシン、および、ペリフォシンである。特に好ましい実施態様において、本発明は、アレルギー性疾患、具体的には即時型アレルギー過敏症、例えば喘息、アトピー性皮膚炎、および、肥満細胞症を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、ミルテフォシンの使用に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、所定の内部でイオン性を有する（両性イオン性の）リン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体の使用に関する。このような状況において好ましくは、エデルフォシン（Ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、ミルテフォシン、および、ペリフォシン（Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）である。特に好ましい実施態様において、本発明は、アレルギー性疾患、具体的には即時型アレルギー過敏症、例えば喘息、アトピー性皮膚炎、および、肥満細胞症を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、ミルテフォシンの使用に関する。

アトピー性疾患は、先進工業国において費やされる健康管理の大部分を占めており、なぜならこのような状態は一般的に治り難く現在のところ治療不能なためである。喘息および鼻炎の現行の治療法は、程度の差はあるがほとんどの患者において有効であるが、それに対して、アトピー性皮膚炎の治療は典型的にはわずかな作用しか示さない。アナフィラキシーショックは、エピネフリンで治療することができるとみなされているが、影響を受けやすい患者のための予防的治療の探求が続いている。従って、高用量のコルチコステロイド吸入では十分に制御されないより重症の喘息のような肥満細胞の感作および／または活性化に関連する障害を処置するための、新規の薬剤の介入への必要性がある。さらに、様々なアトピー性疾患は一緒に起こることが多いため、そのようなアトピー性疾患に有効と予想される安全な薬物療法への必要性が望ましい。

世界人口の約１０％がアレルギーに罹っている。米国においてアレルギーに罹患している４０００万人のうち、約９９０万人は、喘息を有する。加えて、その個体群のうち３５％はアレルギー性鼻炎（「枯草熱」）に罹患しており、１５％はじんましんに罹患しており、１５％は湿疹に罹患しており、１％はアナフィラキシーに罹患している。喘息は、１８歳未満の罹患者において最も高頻度で発生する慢性的な状態である。これらの障害は、失業や生活の質の低下の原因となる可能性があり、喘息およびアナフィラキシーの場合は死に至る可能性もある。

臨床的に言えば、喘息は、気道の活動過多、および、可逆的な気道閉塞によって認識される。組織レベルでの病理学的な障害としては、気道平滑筋の収縮、気道浮腫を引き起こす血管透過性の増加、杯状細胞および粘液腺からの粘液流出、副交感神経系の活性化、気道上皮細胞の露出、および、炎症性細胞の流入が挙げられる。喘息性の反応の初期は、標的の臓器（具体的には平滑筋）において迅速な作用を誘発するヒスタミンおよびその他の肥満細胞の媒介物質が介在している。

肥満細胞症は、種々の組織における肥満細胞の異常な蓄積を特徴とする極めて異質性の障害群であり、主として、皮膚（皮膚肥満細胞症、または、色素性じんましんのようなじんましん）および骨髄に生じるが、病気の性質に応じて脾臓、肝臓、リンパ節および消化管にも生じる（全身性肥満細胞症）。肥満細胞症は、あらゆる年齢の男女に影響を及ぼす可能性がある。肥満細胞症は一般的に後天性疾患であるが、まれに家族性のケースも説明されている。

典型的なアレルギー反応、または、「即時型過敏」（Ｉ型）反応は、可溶性抗原と肥満細胞との相互作用の後の１５分以内に起こる。その病理は、肥満細胞の脱顆粒に関連しており、その反応は、ヒスタミンおよびロイコトリエンＣ４のような肥満細胞の伝達物質によって作動する。インビボでの対応物質の例は、ペニシリンアレルギー患者におけるペニシリン注射後のじんましん反応である。

従って、肥満細胞の活性化はアレルギー性炎症における中心的な事象であり、ほとんどのアレルギー性疾患は、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）が媒介する超過敏反応によって引き起こされる。アレルギー性の個体は、アレルゲンとして知られている外来物質に応答してＩｇＥを合成する。ＩｇＥ抗体は、それらを惹起するアレルゲンに特異的である。ＩｇＥ抗体は、組織内の肥満細胞表面および血液中の好塩基性顆粒球上のＩｇＥ受容体に結合する。多価アレルゲンは、表面に結合したＩｇＥと架橋を形成することができ、それにより細胞の脱顆粒が生じる。このプロセスによって、ヒスタミンおよびプロスタグランジンのような薬理活性物質の放出が起こり、これらは順に、標的臓器中でアレルギー性の症状を引き起こし、例えば喘息の場合は気管支痙攣を引き起こし、または、局所アレルギー反応の場合は浮腫を引き起こす。従って、最も一般的なアレルギーにおける中心的な細胞は、肥満細胞であり、中心的な分子は、ＩｇＥである。

肥満細胞は、骨髄の幹細胞前駆体から誘導される特殊化した造血細胞であり、刺激を受けてそれらの顆粒内の貯蔵部位から多種多様の化学的な媒介物質を分泌することによる即時型（Ｉ型）過敏症および炎症反応において重要な役割を果たす。肥満細胞は、組織の位置および構造に関して不均質なだけでなく、機能的な、および、組織化学的なレベルにおいても不均質であるという特徴を有する。アレルギーおよび喘息のような炎症性疾患において、影響を受けた組織における多数の肥満細胞において、肥満細胞数と、アレルギー性応答の症状の重症度との間に正相関があることが証明されている。複数の臓器の関与を示す全身性肥満細胞症において、組織への肥満細胞の浸潤は、肝臓の門脈域、脾臓の胞周辺領域、皮膚の血管周囲領域、または、リンパ洞における肥満細胞のクラスターによって形成される。全身性肥満細胞症の患者の５０％に、肝腫大および脾腫が観察されている。

肥満細胞において最もよく知られている役割は、ＩｇＥによって活性化するアレルギー反応の媒介である。肥満細胞および循環血液中のそれらに相当する物質である好塩基球は、ＦｃεＲＩとして知られているＩｇＥに高い親和性を有する受容体を有し、これは、ＩｇＥと結合した後に架橋によって刺激され、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、セロトニンのような様々な生物学的に活性な媒介物質を放出することができる。このような肥満細胞および好塩基球において即時型過敏症を開始させる事象は、細胞表面上にＩｇＥが結合した受容体への抗原の結合である。さらにＩｇＥ受容体の架橋は、プロスタグランジン、ロイコトリエン、および、サイトカインの合成および放出を誘導する。ＦｃεＲＩのγ鎖は、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、ＦｃεＲＩにおいて生じるシグナル伝達経路は、ＩＴＡＭを含むその他の免疫受容体の活性化を介して発生するシグナル伝達経路に類似している。簡単に言えば、ＦｃεＲＩの架橋の際に、ｓｒｃファミリーキナーゼｌｙｎがＩＴＡＭをリン酸化し、そこにｓｙｋキナーゼが参入する。ｓｙｋは活性化され、様々な下流の、具体的には細胞質の標的タンパク質をリン酸化する。

また肥満細胞は、ＦｃεＲＩの架橋以外のメカニズムによっても活性化される可能性があり、例えば、単核食細胞によって誘導されたケモサイトカイン（ｃｈｅｍｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）、Ｔ細胞によって誘導されたサイトカイン、および、相補物によって誘導されたアナフィラトキシンに応答して活性化される。また肥満細胞は、その他の炎症性細胞、または、神経系に伝達する役割を有する神経伝達物質を参入させ、それらによって活性化される可能性もある。活性化されると、肥満細胞は様々な媒介物質を放出して、血管への透過の増加、血管拡張、気管支および内臓平滑筋の収縮、および、局所炎症を引き起こす。アナフィラキシーとして知られている即時型超過敏反応の最も極端な形態において、肥満細胞から放出された媒介物質は、窒息状態になるまで気道を閉塞させる可能性がある。強い即時型過敏症応答を発症しやすいいわゆるアトピー性の個体は、喘息、枯草熱または慢性湿疹に罹る可能性がある。これらの個体は、平均的なＩｇＥの血漿レベルよりも高いレベルを有する。抗原によって誘導された細胞の活性化は、多価抗ＩｇＥまたは抗ＦｃεＲＩ抗体によって模擬することができる。このような抗体は、アトピー性の個体由来の肥満細胞だけでなくアトピー性ではない個体由来の肥満細胞も活性化することができるが、それに対してアレルゲンは、アトピー性の個体においてのみ肥満細胞を活性化する。

肥満細胞症において、肥満細胞顆粒の症候的な放出は、情緒障害、発熱、疲労、物理的な刺激（熱、低温、摩擦、運動、日光）、エタノールへの曝露、医薬品、例えばアスピリン、アヘン剤、抗コリン作用薬、非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン）、麻酔剤、麻薬、抗生物質、細菌毒素、殺虫剤、ウイルス、細菌もしくは真菌感染、カビ、毒、生物学的なポリペプチド（ロブスター、ザリガニ、クラゲ）、ある種の食品、食品の着色剤、または、矯味矯臭薬剤、保存剤、または、香料によって発生する可能性がある。

アレルギーの薬物療法は、肥満細胞からのヒスタミンのような顆粒成分の放出を予防するか、または、ヒスタミンへの組織応答をブロックするかのいずれかと予想される。現在のところ利用可能な薬物療法の多くは、ヒスタミン受容体をブロックすることによって組織におけるヒスタミンの作用を減少させる抗ヒスタミン剤（ヒスタミンＨ−１受容体アンタゴニスト）である。抗ヒスタミン剤は、全てではないが多くのアレルギー症状に関与するヒスタミンの生産または放出を予防しない。

またヒスタミン以外の多数の炎症性の媒介物質、例えばロイコトリエン、および、多数の血管作動性のサイトカインも、肥満細胞および好塩基球によって放出される。これらの炎症促進性の媒介物質は抗ヒスタミンの影響を受けずにいるため、アレルギーおよび喘息の病態生理学に著しく寄与する。抗アレルギー薬と抗炎症薬との組み合わせがより優れた効果を奏することもあるが、同時にこれらの組み合わせは、副作用を引き起こす。より重度のアレルギー反応（アナフィラキシー）において、抗ヒスタミンは治療効果がない。肥満細胞症において、従来の色素性じんましんの治療は、比較的効果が低かった。抗ヒスタミン剤は症状のうちいくつかを軽減することができるが、アスピリンおよびコデインは肥満細胞を脱顆粒させ、症状を悪化させる可能性がある。

単離したラット肥満細胞からヒスタミンが放出された際のある種のエーテル脂質およびエーテルリン脂質の影響が調査されている。適用条件に応じて、これらの化合物のうちいくつかが、抗原によって誘導されたヒスタミン放出を強化または阻害することが見出された。これらの研究は、エーテルリン脂質はマクロファージ機能の活性化を刺激するという仮説に基づいて、抗腫瘍性のエーテルリン脂質の癌細胞に対する毒性のメカニズムを調査するために行われた。従って、これらの化合物の将来性のある応用として、癌治療が考察された。Ｇｒｏｓｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９０，２０，１４３〜１４９；Ｇｒｏｓｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９９，４４，２１１〜２２１；Ｇｒｏｓｍａｎ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ ２００２，Ｓ０５〜Ｓ０６を参照。しかしながら、Ｇｒｏｓｍａｎによって提供されたデータは決定的ではなく、可能性のある癌治療において、実験の構成に応じて免疫修飾の変動が大きいことが説明されている。

肥満細胞の脱顆粒を特異的に損なう化合物は、毒性が低いと考えられ、これはなぜなら、調節されたエキソサイトーシスは肥満細胞の生体機能ではなく、それらを免疫機能のその他の形態に参加することができる状態のままにするためである。ヒトの場合、肥満細胞のエキソサイトーシスは、先進国に住む人々にはわずかな有用性しか有さないか、または、有用性がない。ＩｇＥが媒介する免疫性は、主として寄生虫侵襲に対する防御において機能するように進化しているようである。このような侵襲は西欧社会ではまれであり、現在ではほとんど例外なく、肥満細胞の脱顆粒は機能不全性のアレルギー反応の一環として観察される。従って、肥満細胞の脱顆粒の妨害それ自体は、アレルギー性炎症の予防において有効であり、望ましくない結果はほとんど示さない。

肥満細胞の活性化への作用に関して試験された薬理作用のある物質の数は限られている。今日使用されているこのような「肥満細胞安定剤」としては、クロモリンナトリウム（ガストロクロム（Ｇａｓｔｒｏｃｒｏｍ^（Ｒ）））、または、ケトチフェン（アポ（Ａｐｏ^（Ｒ））−ケトチフェン、ザジテン（Ｚａｄｉｔｅｎ^（Ｒ）））、ネドクロミル、および、ロドキサミドが挙げられる。クロモリンナトリウムは、肥満細胞の分泌を減少させることが経験的に見出されている広範囲に適用できる薬物療法であり、これは現在のところ塩素チャンネルを不活性化することによって作用すると考えられているが、低い有効性しか有さない。ここ数年の間、肥満細胞の脱顆粒の阻害に関して数種の新規の物質が試験されている。例としては、トリプターゼ阻害剤（Ｈｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００４，３０９（１），１１９〜１２６）、キマーゼ阻害剤（Ｈｅ等．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９９，２９１，５１７〜５２３）、および、イダンドン（ｉｄａｎｄｏｎｅ）（Ｆｒａｎｋｉｓｈ等．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４，５６，１４２３〜１４２７）が挙げられる。そのうちいくつかは見込みのある結果を示しているが、これらの物質はどれも臨床用途に承認されておらず、それらを臨床的な段階へうまく移行できるかどうかはかなり不明確である。

現在のところ利用可能な治療における上述の欠点を考慮して、アレルギーのような肥満細胞関連障害と闘うための治療剤および方法に関する分野において継続的な必要性がある。

発明の開示
本発明によれば、この技術的な問題の解決は、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、以下の式Ｉで示される化合物の使用を提供することによって達成される：

式中、
Ｒ^１は、第四級窒素原子を含むＣ_４〜１３炭化水素基であり；
Ｘは、Ｏ、または、直接結合であり；
Ｒ^２は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよく、ここで、１個またはそれより多くのＣＨ_２基が、任意に酸素または以下の式ＩＩで示される基で置換されてもよく：

式中、
Ｙは、Ｏ、Ｏ（ＣＯ）、Ｓ、または、Ｓ（ＣＯ）であり；
Ｒ^３は、ＯＨ、Ｃ_１〜４アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｓ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_２〜３アルケニル、または、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ_１〜３アルキルであり；
Ｒ^３’は、Ｈ、または、Ｃ_１〜４アルキルであり；および、
Ｒ^４は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよい。

細胞膜を形成する脂質二重層は、二相の流体であり、その構成は、生化学者および生物物理学者にとって数十年来の調査対象であった。この二重層の大部分が均一な流体とみなされているが、二重層の流体の構造および動力学に関する我々のモデルに、横方向の不均質性、脂質マイクロドメインを導入する試みが繰り返されてきた（Ｇｌａｓｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１９９３），４７５〜４８１；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｃｏｍｍｅｎｔｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．８（１９９２），１〜１４４；Ｊａｉｎ，Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１５（１９７７），１〜６０；Ｗｉｎｃｈｉｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（１９９３），４８２〜４８８）。

上皮細胞を、それらの細胞表面を頂端部のドメインと側底面のドメインと（これらのドメインは、それぞれ異なるタンパク質および脂質組成を有する）に分極させることが実現したことによって、「脂質ラフト」という概念をもたらす新たな発展が始まった（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７（１９８８），６１９７〜６２０２；Ｓｉｍｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３８７（１９９７），５６９〜５７２）。この概念は、膜タンパク質のためのプラットフォームとして機能するスフィンゴ脂質とコレステロールとの集合体のことであり、これらの集合体は、界面活性剤で抽出しても溶解しないという観察から広まったものであり、界面活性剤不溶性膜（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ；ＤＲＭ）と称される（Ｂｒｏｗｎ，Ｃｅｌｌ ６８（１９９２），５３３〜５４４）。これは操作上の大進歩であり、すなわちラフトの会合は、４℃でのトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００抽出に対する耐性と同等であった。第二の基準の追加、すなわちメチル−β−シクロデキストリンを用いてコレステロールを枯渇させると、界面活性剤不溶性の損失が起こったこと（Ｉｌａｎｇｕｍａｒａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３５（１９９８），４３３〜４４０；Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ，ＥＭＢＯ Ｊ．１６（１９９７），５５０１〜５５０８）は、広範囲の生物学的な反応における脂質マイクロドメインの役割を調査する分野において多くのグループを刺激した。現在、細胞極性、タンパク質輸送およびシグナル伝達などの多数の細胞性プロセスを調節することにおいて、脂質集合体が役割を有することに関する支持が高まっている。

細胞膜は、二相の流体である。従って、横方向の不均質性は、膜の面において液体−液体の非混和性を必然的に伴う。水和した脂質二重層が、温度に応じて相転移を受けることがわかっている。これらの転位は、それぞれの脂質種ごとに定義された温度で発生するが、常に系の秩序にいくつかの変化を伴う。これらの転位において最も重要なことは、いわゆる「主要な」または「鎖がほぐれること（ｃｈａｉｎ−ｍｅｌｔｉｎｇ）」による転位であり、すなわち二重層が、高度に秩序だって配置されたほぼ二相の結晶質固体から、ほぼ二相の流体に変換される。このような変換は、系の秩序における劇的な変化、具体的には、二重層面における並進方向の（位置的な）秩序、および、この面に垂直な方向での脂質鎖の構造の秩序の劇的な変化を伴う。並進方向の秩序は、膜の面における横方向の拡散係数に関連し、構造の秩序は、アシル鎖におけるトランス型／ゴーシュ型の比率に関連する。主要な転位は、秩序だって並べられた状態から無秩序な状態への相転移と説明され、つまり、これら２相は、転位温度未満での固形の秩序だった状態（ｓ_ｏ）、および、転位温度より高い温度での液状の無秩序な状態（ｌ_ｄ）と標識することができる。コレステロールおよびリン脂質は、コレステロールが不足した液状の無秩序な状態（ｌ_ｄ）の相と共存可能な液状の秩序だった状態（ｌ_ｏ）の相を形成することができ、それによって、全体的に液相の膜中で相が共存できるようになる（Ｉｐｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９０５（１９８７）１６２〜１７２；Ｉｐｓｅｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５６（１９８９），６６１〜６６７）。ステロールは、それに対応する脂質の並進方向の移動度を劇的に減少させることなく脂肪鎖に最も近接している場合、隣接する脂肪鎖に構造的な秩序化を課すことができるため、ステロールの平坦で硬い分子構造の結果として上記と同様のことができる（Ｓａｎｋａｒａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９（１９９０），１０６７６〜１０６８４）（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ．Ｓｔａｔ．Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｓｍａｓ Ｆｌｕｉｄｓ Ｒｅｌａｔ．Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｔｏｐｉｃｓ ５９（１９９９），５７９０〜５８０３）。ステロールはｓ_ｏ（ゲル）脂質二重層の相の結晶格子に正確に適合しないということから、この相内でステロールが溶解すると、結晶の並進方向の秩序を崩壊させると予想されるが、構造的な秩序を有意に乱すことはない。従って、コレステロールは、十分なモル分率で、ｌ_ｄまたはｓ_ｏ脂質二重層の相を、液状の秩序だった状態（ｌ_ｏ）の相に変換することができる。

脂質ラフトは、細胞膜内で膜成分を隔離するように機能する特殊な化学組成（細胞膜の外葉においてスフィンゴミエリンおよびコレステロールが豊富）を有する脂質のプラットフォームである。ラフトは、比較的小さい（直径３０〜５０ｎｍであり、推測のサイズは、用いられるプローブ、および、解析される細胞型に応じて顕著に変化する）と考えられているが、ラフトは、所定の条件下で融合する可能性がある。それらの脂質組成に関する特異性は、不均質な膜モデル系における相分離の挙動を連想させる。実際に、化学組成および界面活性剤への溶解性に関するそれらの特性の多くは、不飽和ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン（または長鎖飽和ホスファチジルコリン）、および、コレステロールからなる三成分の混合物で構成されるモデル系で観察された特性に類似している（ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８５（２００３），２４０６〜２４１６）。ラフトは、細胞質膜を構成する不均質なｌ相の脂質二重層におけるｌ_ｏ相のドメインとみなされる場合がある。今のところ、その他の共存する相（またはいくつかの相）がどのようなものかは明らかになっていない。生体膜は流体であるため、ｓ_ｏ相の共存は、ほとんどの場合に関して無視される可能性があるという総意がある。その他の相（複数の相）がｌ_ｄ相であるか、または、ｌ_ｏ相であるかは、この相（これらの相）を構成するリン脂質の化学的な同一性、および、それらにおけるコレステロールのモル分率に依存すると予想される。ラフトは、液状の秩序だった状態の相と同等とみなされ、ラフト以外の液相のような膜の残り部分も含む場合もある。熱力学の枠組み内では、相は、多数の分子からなる常に巨視的な系である。しかしながら、脂質二重層において、相は、小さいドメイン（場合によってはわずか数千個の分子）に断片化される傾向があり、このようなドメインはそれぞれ、それ自体、厳密な意味で相の熱力学的な定義を満たすのに十分な数の分子を有さない可能性がある。従って、液状の秩序だった状態のラフトの相は、膜中におけるラフト相のあらゆる（小さい、または、クラスター化した）ドメインを含む。ラフトを取り囲む膜の残部（液相）は、均一な浸透性の液相であるか、または、流体ドメイン（未だ特徴付けられていない）にさらに細分化される可能性もある。

Ｐｒａｌｌｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１４８，９９７〜１００８では、脂質ラフトのサイズを測定するためにフォトニックフォース顕微鏡（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いており、それにより、線維芽細胞の細胞質膜中のラフトは、約３，０００個のスフィンゴ脂質で被覆された表面積に相当する直径５０ｎｍの集合体として放散されることが見出された。培養した乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞の脂質組成および細胞器官の表面積を詳細に試験して得られたデータによれば、個々の細胞は、約２，０００μｍ^２の表面積を有するようである。このような細胞の細胞質膜の脂質組成は、２６％ホスファチジルコリン、２４％スフィンゴミエリン、および、１２％グリコスフィンゴリピドを含む。細胞質膜における脂質構造が非対称な性質を有することから、二重層の外葉は、ほとんどスフィンゴ脂質で占有されているが、この外葉においてホスファチジルコリンは半分未満と推定される。

スフィンゴ脂質の多くがラフトに関連すると仮定すれば、ラフトは、細胞表面の半分より多くを覆っている。膜タンパク質の密度は、約２０，０００分子／μｍ^２と推定されている。従って、細胞質膜は、約４０×１０^６個のタンパク質分子を含むと予想される。ラフト中のタンパク質の密度が周囲の二重層中の密度と同じである場合、５０ｎｍのラフトの数は約１０^６と予想され、それぞれのラフトは約２０個のタンパク質分子を有すると予想される。ＢＨＫ細胞が典型的である場合、必然的に線維芽細胞の細胞質膜中に浮遊するラフトの密度が高いということになる。２０×１０^６個のラフトタンパク質分子が程度の差はあるがランダムに分散している場合、それぞれのラフトは、タンパク質の様々な部分集合を含む可能性が高いと思われる。それゆえに、ラフトの細胞質側に結合したキナーゼは、その同じラフト中でその基質と出会う可能性が低い。個々のラフトのサイズが小さいことは、ラフトが媒介するシグナル伝達のタンパク質を「オフ」状態に維持することにとって重要である可能性がある。従って、活性化を起こすためには、多くのラフトが一緒にクラスターを形成して、シグナル伝達の過程に参加するタンパク質が接近することができるより大きいプラットフォームを形成する必要があり、このようなプラットフォームは、プラットフォームの外側で発生する事象による干渉を受けない。従って、ラフトは小さく、活性化されると、それらはクラスターを形成し、機能的に関連するタンパク質が相互作用できるより大きいプラットフォームを形成する。

ラフトの会合およびクラスター形成を解析する一つの方法は、生きた細胞の表面上のラフトおよびラフト以外の成分を特異的な抗体でパッチすることである（Ｈａｒｄｅｒ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４１（１９９８），９２９〜９４２；Ｊａｎｅｓ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２０００），２３〜３４）。２つのラフト成分が抗体によって架橋されると、これらは、細胞質膜においてオーバーラップするパッチを形成すると予想される。しかしながら、ラフトタンパク質、および、非ラフトマーカー、例えばトランスフェリン受容体をパッチすることにより、隔離されたパッチの形成が起こる。２つのラフト成分を共にパッチすることは、両方の抗体を細胞に同時添加することに依存する。抗体が連続的に添加されると、隔離されたパッチの形成が優勢になる。注目すべきことは、パッチ形成の挙動がコレステロール依存性であることである。個々のラフトのサイズが小さく、不均質な組成を有している結果として、これらの構造は、シグナル伝達が続いて起こる場合、特異的な方法でクラスターを形成するはずである。

日常的な臨床実践において遭遇するこのようなラフトのクラスター形成プロセスの一例は、アレルギー性の免疫反応中のＩｇＥシグナル伝達である（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（１９９９），９５〜９９；Ｈｏｌｏｗｋａ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１），９９〜１０５）。肥満細胞または好塩基性細胞の脱顆粒を刺激することによってアレルギー反応を惹起するアレルゲンは多価であり、数種のＩｇＥ抗体分子に結合する。２またはそれより多くのＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）の架橋により、それらとラフトとの会合が増加するが、これは界面活性剤不溶性が高くなることによって測定される。ラフト内で、架橋されたＦｃεＲＩは、ラフト関連のＬｙｎ、二重にアシル化されたＳｒｃ関連のキナーゼによってチロシンリン酸化されるようになる。ＦｃεＲＩのリン酸化によってチロシンキナーゼＳｙｋが補充され、これらは活性化され、順に、下流のシグナル伝達および足場分子をリン酸化して、最終的に、シグナル伝達プラットフォームの形成をもたらす。この構造は、ラフトタンパク質ＬＡＴ（Ｔ細胞活性化のリンカー）を含み、これは、追加のラフトをクラスター形成させて、プラットフォームの拡張に導く（Ｒｉｖｅｒａ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４（２００１），１３７〜１４１）。シグナル伝達によりカルシウム動員が起こり、それにより、細胞内の貯蔵部からのヒスタミンのような予め形成された媒介物質の放出が始まる。ラフトのプラットフォームに集合する参加者が多ければ多いほど、シグナル伝達応答が大きくなる。ラフトのクラスター形成によるシグナル伝達カスケードの制御不能な増幅は、クインケ浮腫およびアレルギー性ショックのような生命を脅かす結果を伴う過活性化を開始させる可能性がある。全体のシグナル伝達集合体は、脱リン酸化によって解離するか、または、エンドサイトーシスによる成分の内在化によりダウンレギュレートされる可能性がある（Ｘｕ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１（１９９８），２３８５〜２３９６）。従って、ＩｇＥ受容体のシグナル伝達において、脂質ラフトは、参加するタンパク質および脂質を流体状のマイクロドメインに濃縮すること、および、タンパク質がシグナル伝達部位に残るようにそれらの横方向の拡散を制限することによって効率を高めるのに役立つ。脂質ラフトへ分配される変化がわずかであっても、増幅を介して、シグナル伝達カスケードを開始させるか、または、アレルギー反応で生じるような有害な過剰反応を刺激する可能性がある（Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０（２０００），１７３〜１７８）。

本発明の状況において、驚くべきことに、所定の内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体、例えばエデルフォシン、ミルテフォシン、ペリスフォシン（Ｐｅｒｉｓｆｏｓｉｎｅ）、イルモフォシン（Ｉｌｍｅｏｆｏｓｉｎｅ）、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、および、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−エチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンは、肥満細胞の脱顆粒の有力な阻害剤であるか、または、肥満細胞安定剤として機能することが見出された。具体的には、本明細書において開示された化合物は、驚くべきことに、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する障害、具体的には肥満細胞の脱顆粒に関連する免疫疾患の治療、予防および／または改善において治療的に用いることができることが見出された。

従って、本発明は、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、以下の式Ｉ：

で示される化合物の使用を提供する。
Ｒ^１は、第四級窒素原子を含むＣ_４〜１３炭化水素基である。好ましくは、Ｒ^１は、以下の式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｃのうちいずれか一種の基である：

式中、ｎ^１は、１〜７の整数であり、好ましくは２〜６であり、より好ましくはｎ^１は、２である。ｎ^２は、１または２の整数である。
Ｘは、Ｏ、または、直接結合である。好ましくは、Ｘは、Ｏである。

一実施態様において、Ｒ^２は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよく、ここで、１個またはそれより多くの（好ましくは１または２個の）ＣＨ_２基が、任意に酸素で置き換えられいてもよい。好ましくは、Ｒ^２は、１個またはそれより多くの（例えば、２、３または４個の）二重結合を含むＣ_{１０〜２０}炭化水素基、または、Ｃ_{１０〜２０}アルキル基である。その他の好ましい実施態様において、Ｒ^２は、Ｃ_{１０〜２０}アルキレン基、または、Ｃ_{１０〜２０}アルキル基である。より好ましくは、Ｒ^２は、Ｃ_{１２〜１８}アルキル基である。

その代わりの実施態様において、Ｒ^２は、以下の式ＩＩで示される基である：

式中、
Ｙは、Ｏ、Ｏ（ＣＯ）、Ｓ、Ｓ（ＣＯ）である。好ましくは、Ｙは、Ｏである。
Ｒ^３は、ＯＨ、Ｃ_１〜４アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｓ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_２〜３アルケニル、または、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ_１〜３アルキルである。一実施態様において、Ｒ^３は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｓ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_２〜３アルケニル、または、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ_１〜３アルキルである。好ましくは、Ｒ^３は、Ｏ（Ｃ_１〜２アルキル）、または、ＯＣＯＮＨＣＨ_３である。その他の好ましいＲ^３基は、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキルである。より好ましくは、Ｒ^３は、Ｏ（Ｃ_１〜２アルキル）である。

Ｒ^３’は、Ｈ、または、Ｃ_１〜４アルキルであり、好ましくはＨ、または、ＣＨ_３である。一実施態様において、Ｒ^３’は、Ｈである。
Ｒ^４は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよい。好ましくは、Ｒ^４は、１個またはそれより多くの（例えば、２、３または４個の）二重結合を含むＣ_{１０〜２０}炭化水素基、または、Ｃ_{１０〜２０}アルキル基である。より好ましくは、Ｒ^４は、Ｃ_{１２〜１８}アルキル基である。

その代わりのさらなる実施態様において、Ｒ^２は、以下の式ＩＶまたは以下の式Ｖで示される基であり：

は、単結合または二重結合を示すために用いられる。
Ｒ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、および、Ｃ_１〜３アルキルから選択される。好ましくは、式ＩＶまたはＶで示される基において、１個のＲ^５がＨであり、その他のＲ^５がＣＨ_３である。

Ｒ^６は、Ｃ_９〜１５炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよい。好ましくは、Ｒ^６は、Ｃ_{１１〜１３}アルキル基である。

本発明で示される一般式は、指定された化合物の可能性のあるあらゆる立体異性体およびジアステレオ異性体を包含することを目的とする。式ＩＩで示される基を含む化合物において、天然に存在するグリセロリン脂質において一般的な立体化学が好ましい。一般式ＩＶまたはＶで示される基を含む化合物において、天然に存在するスフィンゴシンに存在する立体化学が好ましい。

表１は、式Ｉで示される化合物の好ましい例である化合物１〜２１および２３〜２８を示す。

化合物１〜２１および２３〜２８のなかでも、化合物１、２、３、４、５および６が、好ましい化合物群である。また化合物９、１７および２３〜２７も好ましい。化合物１、２、３、４、５は、さらにより好ましい化合物群である。また化合物９、２３および２４も、さらにより好ましい化合物群である。特に好ましい実施態様において、式Ｉで示される化合物は、ミルテフォシン（化合物３）である。

本発明に従って使用可能な化合物は、表１で指定されたような市販の化合物でもよいし、または、当業界既知の標準的な方法によって製造してもよい。
リン脂質（ＸはＯであり、Ｒ^２は式ＩＩで示される基である）のクラスに属する一般式Ｉで示される化合物、例えばアルキルオキシリン脂質（ＹはＯである）、および、それに対応するアルキルチオ誘導体（Ｙは、Ｓである）は、文献で説明されているようにして製造してもよいし（Ｂｉｔｔｍａｎ，Ｒ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４０，１３９１〜１３９５；Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｃ．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，２６７９〜２６８２；Ｇｕｉｖｉｓｄａｌｓｋｙ，Ｐ．Ｎ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９０，３３，２６１４〜２６２１、および、そこで引用された文献）、または、そこで説明されている手法の標準的な改変法によって製造してもよい。それに対応するエステルおよびチオエステル類似体（それぞれＹはＯＣＯおよびＳＣＯである）の合成は、ヒドロキシまたはチオ前駆体物質の標準的なアシル化によって達成することができる。

ホスホノリピド（Ｘは直接結合であり、および、Ｒ^２は式ＩＩで示される基である）のクラスに属する一般式Ｉで示される化合物、例えばアルキルオキシホスホノリピド（ＹはＯであり、Ｒ^２は式ＩＩで示される基である）、および、それに対応するアルキルチオ誘導体（ＹはＳである）は、Ｂｉｔｔｍａｎ等によって公開されたようにして製造してもよいし（Ｂｉｔｔｍａｎ，Ｒ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９３，３６，２９７〜２９９；Ｂｉｔｔｍａｎ，Ｒ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，４２５〜４３０、および、そこで引用された文献）、または、そこで説明されている手法の合成の改変法によって製造してもよい。それに対応するエステルおよびチオエステル類似体（ＹはＯＣＯまたはＳＣＯである）の合成は、ヒドロキシまたはチオ前駆体物質の標準的なアシル化によって達成することができる。

ホスホコリン部分（Ｒ^１は、式ＩＩＩａで示される基であり、ｎ^１は２である）、または、それらの誘導体を提供するための第四級窒素を有する様々な置換基Ｒ^１の導入は、文献で広く説明されており（Ｒｅｄｄｙ，Ｋ．Ｃ．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，２６７９〜２６８２、および、そこで引用された文献）、適切なグリセロール誘導体から開始して達成することができる。

グリセロール誘導体の代わりにアルコールを用いた類似の合成法において、それに対応する両性イオン性リン酸誘導体（Ｒ^２は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素である）を得ることができる。

本発明の状況において用いられるその他の置換基Ｒ^１、具体的には異なるリン−窒素の距離を有する基（ｎ^１は２ではない）、または、窒素を含む複素環を有する基（Ｒ^１は、式ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃで示される基である）は、文献で概説されたプロトコールおよび方策を用いて提供することができる（Ｅｉｂｌ，Ｈ．；Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ １９８８，４７，６３〜６８；Ｐａｊｏｕｈｅｓｈ，Ｈ．；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９８４，２５，２９４〜３０３；Ｄｉｅｍｂｅｃｋ，Ｗ．；Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ １９７９，２４，２３７〜２４４；Ｄｕｃｌｏｓ，Ｒ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，４１４７〜４１５４；Ｏｈｎｏ，Ｍ．；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９８５，３３，５７２〜５８２；Ｋｒｉｓｅ，Ｊ．Ｐ．；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２，３０９４〜３１００）。

Ｒ^２が式ＩＶまたはＶで示される基である一般式Ｉで示される化合物は、様々な置換基Ｒ^１およびＲ^２を導入するための上述されたプロトコール、および、文献（Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ａ．Ｈ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，１０７５；Ｙａｍａｎｏｒｉ，Ｔ．；Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９８９，３３５）で説明されているスフィンゴ脂質を合成するためのプロトコールの合成法の組み合わせにより得ることができる。

理論にとらわれずにいえば、本明細書で説明されているような内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピドおよびリン酸誘導体は、ラフトを崩壊させる、および、１）細胞表面におけるＦｃεＲＩの輸送および凝集を妨害する、２）細胞表面においてＬＡＴ（Ｔ細胞活性化のリンカー）によりラフトの輸送および凝集を妨害するために適用される場合もある。本明細書で説明される化合物は、免疫疾患、加えて自己免疫疾患において有用な物質を試験するための分析である細胞ベースの分析（脱顆粒分析）において肯定的な結果を示す。

従って、本発明は、肥満細胞の感作および／または活性化、具体的には肥満細胞の脱顆粒に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、本明細書で説明されているように内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体の使用を提供する。

本発明の状況において、肥満細胞の感作には、ＩｇＥの肥満細胞への結合、および／または、結合したＩｇＥの抗原による架橋が含まれ、これらは肥満細胞の活性化と称される場合もある。本発明の使用および方法は、特に、肥満細胞の活性化に関連する免疫疾患の治療、予防および／または改善に適している。

本発明の状況において、治療、予防または改善しようとする障害としては、具体的には、急性アレルギー性疾患、アレルギー性障害、および／または、アレルギー性炎症が挙げられる。また自己免疫疾患、加えてアレルギー性過敏反応も、治療されると予想される。具体的には、本明細書において開示された化合物の使用によって、喘息およびその他の免疫疾患を治療することが可能である。

本発明の状況において治療しようとするアレルギー性障害の例は、移植片対宿主疾患、または、移植による拒絶反応である。
本発明の状況において、移植片対宿主疾患とは、特に、免疫適格細胞を含む同種移植片が、それを拒絶することができない宿主に対する免疫反応を生じさせる場合に発症する症候群であり、これは、このような宿主が免疫学的に未成熟であるか、または、免疫機能が低下しているか、または、抑制されている（例えば放射線または薬物によって）ために起こる。しかしながら、本発明の使用および手段は、同種移植片拒絶反応の改善に限定されることはなく、一般的に移植術における改善／医療介入に関する。

本明細書において用いられる用語「移植」は、好ましくは自己、同種異系、相同、同系または異種移植に関連し、さらに同種移植にも関連する。これらの移植術は当業界周知であり、細胞の移植だけでなく、組織および臓器の移植にもに関連する。また細胞の移植は、幹細胞移植も含む。本明細書において用いられる用語「同種移植」は、同種だがレシピエントの遺伝子型とは異なる遺伝子型を有するその他の動物の体から得られた組織の移植、および／または、ある種の遺伝子型のドナー由来の組織の、その他の遺伝子型の宿主への移植（宿主およびドナーは同種のものである）に関連する。この点において、宿主およびドナーは、「同種異系」と呼ばれる。また用語「移植」には、「同系移殖」または「同質移殖」、すなわち１つの個体から、同じ種の遺伝学的に同一な個体（例えば遺伝学的に同一な双生児／同胞）への移植も含まれる。ヒト以外の動物において、これらの「同系移殖」はトランスジェニック動物に行ってもよい。

本発明の状況において治療され得るアレルギー性疾患の例は、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、紅斑病変、アトピー性湿疹、および、全身性アナフィラキシー、例えばアナフィラキシーショックである。治療しようとする紅斑病変のなかでも、じんましん、および、肥満細胞症が挙げられる。じんましんの具体的な例としては、コリン性じんましん、皮膚描記症、寒冷じんましん、日光じんましん、水性じんましん、薬物関連のじんましん、および、毒素関連のじんましんが挙げられる。

従って、本発明、ならびに本明細書で示された使用および方法は、肥満細胞症、および／または、肥満細胞症関連の症状の医療介入、加えてじんましんにおけるの医療介入において特に有用である。肥満細胞症、加えてじんましんは、情緒障害（例えば「潮紅」）、発熱、疲労、加えて本明細書の上記で定義されたような物理的な刺激によって発症する可能性もあるし、または、それらがベースとなっている可能性もある。従って、本明細書で示された物質および化合物、具体的にはエデルフォシン、ミルテフォシン、イルメオフォシン、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、および、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−エチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンはまた、医療介入で用いてもよいし、予防的に用いてもよいし、または、前記物理的な刺激、または、毒素、薬物および／またはエタノールのような高悪性度の物質への曝露、医薬品、例えばアスピリン、アヘン剤、抗コリン作用薬、非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン）、麻酔剤、麻薬、抗生物質、細菌毒素、殺虫剤、ウイルス、細菌もしくは真菌感染、カビ、毒、生物学的なポリペプチド（ロブスター、ザリガニ、クラゲ）、ある種の食品、食品の着色剤、または、矯味矯臭薬剤、保存剤、香料、および、（放射性の）造影剤への曝露の治癒的治療で用いてもよいし。また本明細書において説明される化合物、すなわち内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体は、ＩｇＥが媒介する障害、例えばアトピー、抗原感作、例えば花粉、食品、薬物、蠕虫類などにおいても有用である。従って、本明細書で示される化合物は、アレルギー、アレルギー性障害、および、アレルギー反応の予防、改善および／または治療において特に有用である。

本明細書で説明される内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体は、薬理作用団または医薬組成物としてのそれらの使用において、化合物そのものとして投与してもよいし、または、医薬品として製剤化してもよい。本医薬組成物は、任意に、製薬上許容できる賦形剤、例えばキャリアー、希釈剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、着色剤、顔料、安定剤、保存剤、または、抗酸化剤を含んでいてもよい。

本医薬組成物は当業者既知の技術によって製剤化することができ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）で公開された技術で製剤化することができる。本医薬組成物は、経口、非経口、例えば筋肉内、静脈内、皮下、皮下（ｉｎｆｒａｄｅｒｍａｌ）、動脈内、直腸、経鼻、外用または膣内投与のための剤形として製剤化することができる。経口投与のための剤形としては、コーティング錠剤、および、コーティングされていない錠剤、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、ロゼンジ、トローチ、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシル、再溶解させるための粉末および顆粒、分散性の粉末および顆粒、薬用ガム、噛むタイプの錠剤、および、発泡錠が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、溶液、エマルジョン、懸濁液、分散液、ならびに、再溶解させるための粉末および顆粒が挙げられる。エマルジョンは、非経口投与に好ましい剤形である。直腸投与および膣内投与のための剤形としては、坐剤、および、膣内用製剤（ｏｖｕｌａ）が挙げられる。経鼻投与用の剤形は、吸入法および通気法によって投与することができ、例えば定量吸入器によって投与することができる。外用投与用の剤形としては、クリーム、ゲル、軟膏、軟膏、パッチ、および、経皮送達システムが挙げられる。

本発明で用いることができる化合物の製薬上許容できる塩は、様々な有機および無機酸ならびに塩基を用いて形成することができる。典型的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルスルホン酸塩、リン酸塩、ピケート（ｐｉｃａｔｅ）、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、例えばトシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。典型的な塩基付加塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム、リチウムおよびカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩；有機塩基（例えば有機アミン）との塩、例えばベンズアゼチン（ｂｅｎｚａｚｅｔｈｉｎｅ）、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラビン（ｈｙｄｒａｂｉｎｅ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミン、アミノ酸との塩、例えばアルギニン、リシンなどが挙げられる。

本発明で用いることができる化合物の製薬上許容できる溶媒化合物は、水との溶媒化合物（例えば水和物）の形態で存在する可能性があり、または、メタノール、エタノールもしくはアセトニトリルのような有機溶媒との溶媒化合物の形態（すなわちそれぞれメタノール付加物、エタノール付加物、または、アセトニトリル付加物（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌａｔｅ）として）で存在する可能性がある。

本発明で用いることができる化合物の製薬上許容できるのプロドラッグは、化学的または代謝によって切断可能な基を有する誘導体であり、これらは、加溶媒分解によって、または、生理学的条件下で、本発明のインビボで医薬活性を有する化合物になる。本発明で用いることができる化合物のプロドラッグは、従来の方式で化合物の官能基（例えばアミノまたはヒドロキシ基）を用いて形成されてもよい。プロドラッグ誘導体の形態は、哺乳動物において溶解性、組織適合性または遅延放出の利点を提供することが多い（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．，Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，７〜９，２１〜２４頁，エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），アムステルダム１９８５を参照）。

本明細書で説明されるこれらの医薬組成物は、適切な用量で被検体に投与することができる。用法は、担当医、および、臨床的な要因によって決定されると予想される。医療分野において周知であるように、誰か１人の患者のための投与量は、例えば患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、時間および投与経路、全体的な健康状態、ならびに、同時に投与されるその他の薬物などの多くの要因に依存する。一般的に、本医薬組成物を規則的に投与するような場合の用法は、１日あたり０．１μｇ〜５０００ｍｇの単位の範囲内と予想され、いくつかの実施態様において、１日あたり０，１μｇ〜１０００ｍｇ単位の範囲内である。用法が持続点滴である場合、その用量は、それぞれ体重１キログラムあたり０．１ｎｇ／分〜１０μｇ／分の単位の範囲内であってもよい。定期的な評価によって進行をモニターしてもよい。

本発明の状況において、以下の外用投与および全身投与様式が好ましい。
本明細書で説明される化合物の外用塗布は、皮膚肥満細胞症、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹およびその他の皮膚疾患、ならびに、肥満細胞に関連する皮膚疾患のような徴候を軽減するために想定され、適切な外用塗布は、軟膏、クリーム、ゲル、フォーム、溶液、ローション、エマルジョン、スプレー、リポソームまたはミセル性の懸濁液、もしくは、皮膚の外層に浸透するその他の調合物の形態である。上述した外用塗布される調合物中の活性成分の典型的な適切な濃度は、０．１％〜２％ｗ／ｗであり、軟膏、クリーム、ゲル、発泡体、溶液、ローション、エマルジョン、スプレー、リポソームまたはミセル性の懸濁液、もしくは、その他の調合物のそれぞれ１００グラム中に０．１ｇ〜２ｇの活性成分が含まれるようにする。外用塗布される調合物の活性成分のさらなる適切な濃度は、３％〜６％ｗ／ｗであり、さらに、それほど好ましくはないが適切な調合物における濃度は、７〜１５％ｗ／ｗである。しかしながらこのような濃度を改変することは、関連する技術者の能力の範囲内である。治療を受ける患者にとって適切な典型的な投与計画は、患者の年齢、性別、体重、および、全体的な健康状態のような要因に基づいて担当医が決定してもよい。治療の濃度および投与計画の選択は、徴候に依存すると予想される。外用製剤に適した投与計画は、好ましくは１日あたり１〜２回の皮膚のあらゆる領域の治療を想定しているが、１日あたり３〜６回の治療も適切である。塗布ごとに、罹患した領域を完全に覆うように薄い膜状に塗布することが予想される。治療期間は、１回の治療サイクルあたり１日〜６週間である。

全身性肥満細胞症、ヒスタミン耐性のじんましん、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過敏性腸症候群、およびその他の肥満細胞に関連する全身性の障害のような徴候を軽減するために適切な全身性の適用も想定され、さらに本明細書で説明される。このような全身性の適用は、迅速または遅延放出製剤の形態であってもよく、例えば、経口、鼻腔内の、皮下または筋肉内投与に適したカプセル、錠剤、コーティングされたペレット、マトリックス、リポソームもしくはミセル、またはその他の調合物が挙げられる。上述の全身に適用される調合物における活性成分の典型的な適切な濃度は、錠剤、カプセル、ペレットなど１個あたり１ｍｇ〜２００ｍｇである。さらに、治療を受ける患者にとって適切な投与計画は、患者の年齢、性別、体重、および、全体的な健康状態のような要因に基づいて担当医が決定してもよい。治療の濃度および投与計画の選択は、徴候に依存すると予想される。活性成分の適切な用量は広範囲であり、好ましくは、治療１回ごとにレシピエントの体重１キログラムあたり約１〜約２５０マイクログラム（μｇ／ｋｇ）である。その他の適切な用量は、約１〜約１００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよく、より好ましくは約１０〜約５０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。用量は、１日〜６ヶ月の間毎日投与してもよいし、または、必要かつ安全とみなされるだけ長く投与してもよく、このような期間は、治療される障害の性質に応じて、担当医による標準的な試験によって容易に確認される。この場合においても、当業者であれば、本明細書で示されたプロトコールを改変することが可能である。

本発明はまた、肥満細胞の感作および／または活性化に関連する障害または疾患を治療、改善または予防する方法を提供する。相当する病気／障害は本明細書で上述した通りであり、また、このような改善、治療、および／または、予防が必要な患者に投与することができる有用な相当する内部でイオン性を有するリン脂質、ホスホノリピド、および、リン酸誘導体も上記で開示されており、添付の実施例および請求項で特徴付けられる。これらの治療方法において、本明細書で説明される化合物は、最も好ましい環境では、このような治療が必要な被検体、具体的にはヒトへ前記化合物を投与することによって用いられる。

本明細書において用いられる用語「治療」、「〜を治療すること」等は、一般的に、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。このような効果は、病気またはそれらの症状を完全に、または、部分的に予防するという観点では予防的なものであり、および／または、病気および／またはその病気が原因の有害効果を部分的に、または、完全に治すという観点では治療的であり得る。本明細書で用いられる用語「治療」は、哺乳動物、具体的にはヒトにおける病気のあらゆる治療を包含し、例えば：（ａ）病気の素因を有する可能性がある被検体において病気の発生を予防すること；（ｂ）病気を抑制すること、すなわちその進行を止めること；または、（ｃ）病気を緩和すること、すなわち病気を軽減させることを含む。

「患者」または「被検体」は、本発明の目的において、ヒトおよびその他の動物（具体的には哺乳動物）、ならびに、その他の生物の両方を含む。従って、本方法は、ヒトの治療と、獣医学における用途との両方に適用可能である。好ましい実施態様において、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様において、患者はヒトである。

以下の非限定的な図および実施例によって、本発明を説明する。
図１〜８は、フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。
図９および１０は、それぞれ抗ヒトＩｇＥおよびイオノフォアＡ２３１８７によって、Ｃ５７細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。
図１１および１２は、それぞれ抗ヒトＩｇＥおよびサブスタンスＰによって、一次ヒト肥満細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。
図１３は、Ｃ５ａまたは抗ヒトＩｇＥによって、ヒト好塩基球において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。
図１４は、ミルテフォシンおよびプラセボで予め治療された皮膚において、ヒスタミン、または、患者に特異的なアレルゲンを用いたプリックテストを行った後の個々のタイムポイントにおける膨疹の直径を示す。

実施例１：肥満細胞の脱顆粒の分析
肥満細胞は、アレルギー性過敏反応または喘息に関する広く使用されているモデル系である。それらの表面に、ＩｇＥに対する高親和性受容体が発現される（ＦｃεＲＩ）。抗原特異的なＩｇＥが結合すると、受容体細胞は、抗原（アレルゲン）に対して感受性になる。感作細胞が多価の抗原に遭遇すると、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体のクラスター形成によって、細胞の現象のカスケードが始動し、それにより最終的に、脱顆粒、すなわちサイトカイン、エイコサノイド、ヒスタミンおよび酵素のような炎症および細胞の活性化の媒介物質の放出が起こる。このカスケードにおける数種の工程は、ラフト依存性であり、例えば抗原によって作動するＦｃεＲＩのラフトへの再配置、ＬＡＴ周辺に集合したシグナル伝達複合体の破壊、および／または、ホスホイノシチドの移動、Ｃａ^２＋流入（細胞質膜カルシウムチャンネルのラフトへの局在化）、膜の波打ち現象（Ａｋｔ／ＷＡＳＰ／ＦＡＫが関与する細胞骨格の再構築）、および、エキソサイトーシスが含まれる。それゆえに、このような分析は、ラフトを調節する化合物、具体的には喘息の医学的管理において有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法として用いることができる。

１．序論
上記分析は、多価の抗原−ＩｇＥ複合体による高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のクラスター形成に応答した、様々な予め形成された薬理作用のある物質の放出のマーカーとして、β−ヘキソサミニダーゼの放出を測定する。ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞は、肥満細胞の脱顆粒の一般的に使用されるモデルであり、これを抗ＤＮＰ特異的なＩｇＥで感作して、多価のＤＮＰ−ＢＳＡで攻撃する。上清へのβ−ヘキソサミニダーゼの放出を、蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン、および、高い蛍光性を有するメチルウンベリフェロンへの酵素による変換によって測定し、テカン（Ｔｅｃａｎ）のサファイア（Ｓａｆｉｒｅ^ＴＭ）プレートリーダーで蛍光検出によって定量する。

２．材料
化学物質および特殊な試薬
サーファクト−アンプス（Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ）Ｘ−１００溶液を、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手し、ＤＮＰ−ウシアルブミン結合体（ＤＮＰ−ＢＳＡ）、および、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵＧ）を、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手し、トリ（エチレングリコール）モノエチルエーテル（ＴＥＧＭＥ）を、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手し、ＤＭＳＯハイブリ−マックス（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ）、および、ヒトＤＮＰ−アルブミンを、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。ラット抗ＤＮＰ ＩｇＥモノクローナル抗体を、バイオゾル（Ｂｉｏｚｏｌ）から入手した。全ての細胞培養培地、緩衝液およびサプリメントを、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得たが、ただしウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、ＰＡＡラボラトリーズ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（コルベ，ドイツ）から入手した。その他の試薬は、標準的な実験グレードを有するものか、または、それより優れたものであった。その他の化学物質は、特に他の規定がなければ、標準的な実験グレードを有するものか、または、それより優れたものであった。

緩衝液および溶液
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および、１ＭのＨＥＰＥＳは、社内のサービス施設によって提供された。タイロード緩衝液（ＴｙＢ）（インビトロジェン）は、フェノールレッドを含まず、２ｍＭのグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ^ＴＭ）−Ｉサプリメント（インビトロジェン）、および、１０ｍＭのＨＥＰＥＳが添加された最小必須培地からなる。溶解緩衝液は、２５ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、および、１％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００からなる。ヒトＤＮＰ−ＢＳＡを、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水に１ｍｇ／ｍｌになるように溶解させた。ＭＵＧ基質溶液は、２．５ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、０．０５Ｍのクエン酸塩（ｐＨ４．５）であり、停止溶液は、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３／０．１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（ｐＨ１０）であった。

細胞培養
ドイツの微生物および細胞培養物の保存機関（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；ブラウンシュバイク，ドイツ）から得たＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、２ｍＭのグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ^ＴＭ）−Ｉが添加されたイーグル塩類溶液／２０％のＲＰＭＩ１６４０／１０％の熱で不活性化したウシ胎児血清を含む７０％最小必須培地中で、５％ＣＯ_２中、３７℃で維持し、マイコプラスマ汚染がないかどうかを定期的にチェックした。１７５ｃｍ^２フラスコ中で増殖させた細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで分配し、２０ｍｌの新しい培地に再懸濁した。１ウェルあたり１００および５０μｌの細胞懸濁液を、２４ウェルのクラスタープレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ），Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ，オランダ）で平板培養し、平板培養の１または２日後の細胞をそれぞれ用いた。

３．β−ヘキソサミニダーゼ放出の測定
方法
試験化合物とインキュベートする２〜２４時間前に、培地を除去し、新しい培地中で細胞を０．４μｇ／ｍｌの抗ＤＮＰＩｇＥで感作した。感作後、細胞を温めたＴｙＢで一回洗浄し、最大１００μＭ、または、最高の非毒性の濃度（合計の媒体濃度を、１％に調節した）の試験化合物、または、ＴｙＢ中の１％媒体と共に、３７℃で６０分間インキュベートした。ＤＮＰ−ＨＳＡ（最終濃度は０．１μｇ／ｍｌ）、または、緩衝液単独を添加し、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。プレートを、４℃で５分間、２５０×ｇで遠心分離し、即座に氷に移した。上清を回収し、溶解緩衝液で細胞を溶解させた。上清および溶解産物中のヘキソサミニダーゼ活性を、９６ウェルプレート中で、２５μｌのアリコートを１００μｌのＭＵＧ基質溶液と共に３７℃で３０分間インキュベートすることによって測定した。この反応を、１５０μｌの停止溶液の添加によって止めた。テカンのサファイア（Ｓａｆｉｒｅ^ＴＭ）プレートリーダーにおいて、３６５ｎｍの励起、および、４４０ｎｍの発光の設定で蛍光を測定した。

分析結果の定量化
各化合物は、少なくとも３回の独立した実験においてそれぞれ二連で試験した。β−ヘキソサミニダーゼ放出は、以下の式を用いて非特異的な放出（抗原添加なしでの放出）を差し引いた後に計算した：
脱顆粒（％）＝１００×ＲＦＵ上清／ＲＦＵ溶解産物
コントロールと比較したβ−ヘキソサミニダーゼ放出阻害は、以下のように計算した：
阻害（％）＝１００×（１−（化合物のＲＦＵ上清／コントロールのＲＦＵ上清））
独立した実験から得られた脱顆粒の阻害に関する値は平均値であり、標準偏差（ＳＤ）が１５％以下の場合を許容した。

表２に、肥満細胞の脱顆粒の分析で得られた結果を示す。

表２に、化合物１〜２８の肥満細胞の脱顆粒活性における効力（ＩＤ５０）、および、最大阻害、加えて、膜の完全性の分析（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＣｙｔｏｔｏｘ−Ｏｎｅ，カタログ番号６７８９１）における細胞毒性（ＣＤ５０）を列挙した。５０％またはそれより大きい脱顆粒の阻害、それと組み合わせて１０またはそれより大きい治療指数（ＣＤ５０／ＩＤ５０）を示すことが、医薬誘導体の開発に適切であるとみなした。従って、高い関連性を有する化合物１および２（２−Ｏ−メチルＰＡＦＣ−１６および２−Ｏ−エチルＰＡＦＣ−１６）、および、化合物９、２３および２４は、類似の効力および最大阻害活性を有するが、化合物９は細胞毒性がより少ない。化合物３、４および５（ミルテフォシン、イルモフォシン（Ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）、および、エデルフォシン）、および、化合物１７、２５、２６および２７は、類似の最大活性を有するが、効力がより低く、エデルフォシンの場合は、細胞毒性がより高い。化合物６、７、８（ｍｃＰＡＦＣ−１６、ブテノイルＰＡＦＣ−１６、および、ピロリジノＰＡＦＣ−１６）および２８は、化合物１、２、９、２３および２４の効力のわずか１５〜４０％しか有していない。化合物６および９は低い毒性を有するため、１０より大きい将来性のある治療指数を有する。残りの化合物のうち、試験された最大用量で５０％阻害より大きい阻害を達成したものはなかった。

化合物１〜５、９、１７および２３〜２７は、１０または２５μＭにおいて７５％を超える阻害を示したため、本発明の状況において特に好ましい。化合物６は、５０μＭで７５％を超える阻害を示したため、これもまた、本発明の状況において好ましい。化合物７、８、１１〜１４、１６、２０および２８は、化合物１〜６、９、１７および２３〜２７ほどの活性を有さないにもかかわらず、なお肥満細胞の脱顆粒の分析において活性を示したため、本発明の状況において適切に用いることができる。比較のために化合物２２を試験したところ、肥満細胞の脱顆粒の分析において不良な結果を得た。

肥満細胞の脱顆粒の阻害における化合物活性を示す図１〜８において、典型的な化合物に関する結果をさらに説明する。この分析は、将来性のある抗アレルギー性の化合物の活性が肥満細胞を安定化するかどうかを決定するための当業界の標準的分析法である。この分析において、２種の承認された臨床上用いられる肥満細胞安定剤（フマル酸ケトチフェン、および、クロモグリク酸）は活性がないか、または、低い活性しか有さなかった（図７および８）が、化合物１〜６は、低いマイクロモル濃度で優れた効力（ＩＤ５０）を示したことが観察できる（図１〜６）。

実施例２：インビトロおよびインビボでのヒト皮膚肥満細胞の活性化の阻害および媒介物質放出
実験の設計
インビトロおよびエクスビボでの実験：
ミルテフォシンは、インビトロでヒト皮膚肥満細胞の活性化および媒介物質放出を阻害することができるかどうかを決定するために、我々は、以下の技術および材料、ならびに実験アプローチを用いた：
ミルテフォシンのストック溶液の製造
ミルテフォシンのストック溶液（５ｍＭ）をＤＭＳＯで製造し、−２０℃で保存した。使用時の濃度（２ｍＭ）に調製するために、ストック溶液を、ＰＡＧ−ＣＭ（ＰＡＧ−ＣＭ＝カルシウムおよびマグネシウムを含むＰＩＰＥＳアルブミングルコース）で希釈した。これ以外の全てのミルテフォシン希釈液は、ＰＡＧ−ＣＭ緩衝液中の４０％ＤＭＳＯを用いて製造した。

ヒト好塩基球の単離および精製
フィコールパック（Ｄ＝１．０７７）を用いてヒト好塩基球を全血から単離した。簡単に言えば、ヘパリン化された全血をＰＢＳ（ｗ／ｏＣａおよびＭｇ）で１：３に希釈し、フィコールパック溶液上で層状にし、４００×ｇで３０分間遠心分離した。血漿とフィコール溶液との境界面から、リンパ球、単球、好塩基球、および、血小板のような低密度の粒子を回収した。好塩基球分画から血小板を除去するために、境界面からの細胞懸濁液を、２００×ｇで１０分間、２回遠心分離した。細胞懸濁液中の好塩基球の数を、トルイジンブルー染色によって決定した。好塩基球の収率は約２％であった。ヒスタミン放出分析に、これらの予め精製した好塩基球を用いた。サイトカイン放出分析のために、境界面の細胞懸濁液から好塩基球以外のものを取り除くための「好塩基球単離キット」を用いて、好塩基球をさらに精製した。この目的を達成するために、第一工程で、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ３６およびＣＤ４５ＲＡを含むハプテン結合抗体混合物と共に細胞懸濁液を３０分間インキュベートし、続いてハプテン特異的な抗体で被覆された磁気ビーズに曝露した。磁気ビーズに結合した細胞をオートＭＡＣＳ（ＡｕｔｏＭＡＣＳ）で分離した。この分離プロトコールの陰性の分画に、好塩基球が９５パーセントより高い純度で含まれていた。

一次皮膚肥満細胞の単離および精製
組織の肥満細胞を、美容外科手術の際に得られたヒトの皮膚から単離した。ヒトの皮膚の使用は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行われ、ベルリンのシャリテ医科大学（Ｃｈａｒｉｔｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉｚｉｎ）の治験審査委員会によって承認された。肥満細胞を単離するために、１ｍｇ／ｍｌの濃度のディスパーゼと共に４℃で一晩インキュベートすることによって表皮を酵素によって剥離させた。残存した真皮を、コラゲナーゼＩおよびヒアルロニダーゼの混合物と共に３７℃で１時間インキュベートすることによって分散させた。分散を３回繰り返し、回収した細胞を洗浄した。その後、細胞を、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、および、モノチオグリセロールが添加された基礎イスコベ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地中で、５％Ｃｏ２／９５％の空気中で、３７℃で一晩培養した。冷ＰＢＳで繰り返した洗浄することによって、付着細胞からの非接着性の肥満細胞の分離を達成した。ヒスタミン放出分析のために、回収した細胞をＰＡＧ−ＣＭに懸濁し、Ｋｉｔ受容体（ＣＤ１１７）に対して向けられたＣＤ１１７マイクロビーズ（ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて親和性によって精製した。簡単に言えば、皮膚細胞をＣＤ１１７磁気ビーズと共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をオートＭＡＣＳシステムに通過させることによって、標識細胞の非標識細胞からの分離を達成した。最終的な肥満細胞の純度はトルイジンブルー染色によって測定したところ、９０％を超えていた。肥満細胞の生存率は、トリパンブルー染色によって評価したところ、９５％を超えていた（Ｇｒｕｔｚｋａｕ等，２０００，Ａｒｔｕｃ等，２００２）。

ヒスタミン放出分析（ＨＲＡ）
自動式のヒスタミン解析システム（フィルム・ボルグヴェルト・テクニーク（Ｆｉｒｍ Ｂｏｒｇｗｅｌｔ Ｔｅｃｈｎｉｋ））を用いてヒスタミンレベルの定量化を達成した。励起波長は３５５〜３６０ｎｍであり、蛍光測定の発光波長は４５０〜４６０ｎｍであった。蛍光強度は、サンプル中のヒスタミン濃度に正比例していた。放出されたヒスタミンの量を以下の式に従って計算した：正味のヒスタミン放出＝（放出−ブランク）×（１００／総量）。このような状況において、「放出」は、刺激された細胞（例えば抗ＩｇＥによって）の上清と定義し、それに対して、刺激されていない細胞（すなわち自発的な放出）の上清を「ブランク」と名付けた。「総量」は、肥満細胞の総ヒスタミン含有量（過塩素酸で溶解させた後の）を意味する。ヒスタミン放出分析を、ＰＡＧ−ＣＭ緩衝液システム中で行った。ヒスタミン放出分析に用いられた各サンプル中の多数の肥満細胞または好塩基球は、約１×１０^４細胞であった。刺激のために、細胞を抗ＩｇＥ、サブスタンスＰ、Ｃａ−イオノフォア、または、Ｃ５ａに晒した。

ミルテフォシンでのプレインキュベートおよび細胞の刺激
細胞を、ＰＢＳｗ／ｏＣａ、Ｍｇで２回、ＰＡＧ−ＣＭで一回洗浄し、その後２５０×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを予め温めたＰＡＧ−ＣＭ（３７℃）に懸濁した。この細胞懸濁液を、６種の異なる処理でそれぞれ３種のインキュベート時間（１０分間、３０分間または６０分間）のための１８個のファルコンチューブに分配した：
１−ＰＡＧ−ＣＭ、
２−ＤＭＳＯ／ＰＡＧ−ＣＭ、
３−５μＭのミルテフォシン、
４−１０μＭのミルテフォシン、
５−２０μＭのミルテフォシン、
６−２５μＭのミルテフォシン。

温かい水浴中で（３７℃）インキュベーションを行った。
プレインキュベートした細胞懸濁液のアリコートを準備したチューブに添加し、刺激のために３７℃で３０分間インキュベートした：
チューブ１＝２％過塩素酸、
チューブ２＝ＰＡＧ−ＣＭ、
チューブ３＝抗ＩｇＥ、または、サブスタンスＰ、または、Ｃａ−イオノフォア。

冷ＰＡＧ−ＣＭ緩衝液で反応を止め、サンプルを４℃、２５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清をヒスタミンを概算するための特殊なカップにデカントした。サイトカインまたはアラキドン酸代謝産物の測定のために、細胞懸濁液を、様々な濃度のミルテフォシンと共にプレインキュベートした後に２つのアリコートに分配し、抗ＩｇＥ（３７℃で）と共に、または、それらを含まないで３０分間インキュベートし、続いて２５０×ｇで１０分間遠心分離した。後のアラキドン酸代謝産物解析のために上清を−８０℃で保存した。細胞分画を、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、および、モノチオグリセロールが添加された基礎イスコベ培地中で再懸濁し、３７℃でさらに２４時間培養した。その後、上清を除去し、−８０℃で保存した（ＴＮＦアルファの解析のために）。

インビボでの実験：
ミルテフォシンは、インビボでＩｇＥ依存性のヒト肥満細胞の刺激、および、媒介物質放出を阻害するという概念の証明を提供するために、我々は、選択された既知のＩ型の感作を有するアレルギー性の志願者（ｎ＝５）に関する研究行った。志願者を、それらの既知のアレルゲン、加えてポジティブ（ヒスタミン）およびネガティブ（食塩水）コントロール（表３）を両方の前腕に用いた、標準的なプリックテストで処理した。二重盲検のプラセボ制御されたアプローチを用いて、各試験における志願者の一方の前腕を、外用ミルテフォシン（６％溶液）で前処理した。いずれもプリックテストの２時間前に、反対側を、プラセボ溶液（食塩水）での前処理で処理した。その後、皮膚の症状の進行を、高性能の標準化した方法、すなわち肉眼で見える標準的なプリックテスト評価（Ｈｅｉｎｚｅｒｌｉｎｇ等，２００５）、容量測定のためのイメージング、サーモグラフィー、および、デジタル低速度撮影（ＤＴＬＰ）を用いて測定した。この研究から、永続的な重度の病気（特に免疫系に影響を及ぼす病気）に罹っていることがわかっている志願者を排除した。志願者は、研究開始前の７日間、経口ヒスタミンまたはロイコトリエンアンタゴニストをまったく摂取しなかった。さらに志願者は、試験前の２１日間、経口コルチコステロイドまたはコルチコステロイドのデポー剤、またはその他の免疫抑制薬をまったく摂取しなかった。

病変が発達する経過（膨疹および紅斑の大きさ）を、膨疹および紅斑の大きさの垂直方向の直径およびそれに直角な方向の直径を測定することによって、目視で評価した。その後、両方の直径の合計を２で割った。加えて、プリックテストの前に、および、プリックテスト後の既定の時間に、容量測定およびサーモグラフィーによるイメージング、加えてＤＴＬＰを行った。

サーモグラフィーによるイメージングは、特殊なサーモグラフィー用カメラを用いて、電磁スペクトルの赤外領域における放射線を検出する。赤外線は、あらゆる物体からそれらの温度に基づいて放出される。物体から放出された放射線の量は、温度に伴い増加する。それゆえに、サーモグラフィーは、温度の変動の検出を可能にする。プリックテストによる病変の発達と退縮は温度変化を伴い、さらにサーモグラフィーによるイメージングは、わずかな温度変化でも（０．１℃でも）識別することができるため、サーモグラフィーは、プリックテスト反応を可視化する極めて正確な方法である。サーモグラフィーによるイメージングは、プリックテストの後の１時間の期間中、５分間のインターバルで行われた（ＦＬＩＲ ＴｈｅｒｍａＣＡＭ Ｓ６０、ＦＬＩＲシステム社（ＦＬＩＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ），フランクフルト／マイン，ドイツ）。

デジタル低速度撮影（ＤＴＬＰ）は、検出可能なプリックテストの病変を肉眼でモニターするために行われた。１時間の期間中、５分間のインターバルでデジタル写真を撮影し、プリックテスト反応の影響を受けた皮膚面積を、面積測定解析システムを用いて計算した。

プリックテストの病変の容量測定解析を、新規の容量測定システム（プリモス・コンタクト（Ｐｒｉｍｏｓ ｃｏｎｔａｃｔ），ＧＦＭメステクニーク社（ＧＦＭ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ），テルトウ，ドイツ）を用いて行った。このシステムは、皮膚表面に関してプリックテストの病変の腫れによる隆起を測定する。容量測定は、サーモグラフィーによる、および、デジタル写真撮影によるイメージングの期間中に、５分間のインターバルで行われた。

結果
インビトロおよびエクスビボでの実験：
Ｃ５７細胞におけるヒスタミン放出に対するミルテフォシンの作用
ヒト高親和性ＩｇＥ受容体のアルファ鎖でトランスフェクションされたＣ５７マウス肥満細胞系は、抗ヒトＩｇＥで刺激した後に確かな脱顆粒応答を示した。様々なの濃度のミルテフォシンと共にＣ５７細胞をプレインキュベートすることによって、ヒスタミン放出の阻害が起こった。この阻害は、用量および時間依存性であった（図９）。ミルテフォシンと６０分間プレインキュベートした後に、最大阻害（４０パーセント）が達成された。ミルテフォシンは、Ｃ５７細胞において、ＩｇＥ受容体依存性のヒスタミン放出だけでなく、Ｃａ−イオノフォアによって誘導されたヒスタミン放出も阻害した（図１０）。

ミルテフォシンは、Ｃａ−イオノフォアによって誘導されたヒスタミン放出を用量依存的に阻害し、２５μＭが試験された最大阻害濃度であった（図１０）。様々なプレインキュベート時間によって、抗ＩｇＥ依存性またはＣａ−イオノフォアによって誘導されたヒスタミン放出に対する有意に異なる阻害作用が得られた（図９および１０）。

ヒト肥満細胞におけるヒスタミン放出に対するミルテフォシンの作用
ミルテフォシンは、ヒト肥満細胞において、ＩｇＥによって誘導されたヒスタミン放出を用量依存的に阻害し、最大作用は２５μＭにおいて達成された。ヒト肥満細胞におけるミルテフォシンの阻害作用は、プレインキュベート時間に依存しておらず、すなわち短いプレインキュベート時間でも、最大の阻害作用が生じる（３５％）（図１１）。

サブスタンスＰ（ＳＰ）によって誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用は、抗ＩｇＥによって誘導された放出に対する作用に類似していた。ミルテフォシンは、ヒスタミン放出を用量依存的に阻害したが（４５％）、ＩｇＥによって誘導されたヒスタミン放出の場合のように、プレインキュベート時間には依存していなかった（図１２）。

ヒト好塩基球におけるヒスタミン放出に対するミルテフォシンの作用
ミルテフォシンは、好塩基球において抗ＩｇＥによって誘導されたヒスタミン放出を用量依存的に阻害したが、この作用は極めて小さかった。従って、１０分間プレインキュベートした後の最大の阻害作用は、２５μＭミルテフォシンを用いると、合計でちょうど１０パーセントになった。抗ＩｇＥ刺激の後に観察された作用に対して、我々は、２５μＭミルテフォシン（７５％）によるＣ５ａによって誘導されたヒスタミン放出の強く有意な阻害を観察した（図１３）。

インビボでの実験：
プリックテストの病変が発達する経過を評価するために、膨疹の大きさを、プリックテスト後の別個のタイムポイントで直径を測定することによって目視で評価した。興味深いことに、アレルゲンにより誘導された膨疹の大きさは、６％ミルテフォシン溶液で前処理された領域において、プラセボ（食塩水）で前処理されたコントロール領域と比較してかなり小さかった。加えて、食塩水処理されたコントロールの腕と比較して、ヒスタミンによって誘導されたコントロールの膨疹も、程度は低いがミルテフォシンで前処理された腕においてアレルゲンによって誘導された膨疹よりも減少した（表４および図７）。

考察
肥満細胞に関連する病気における実質的に全ての治療的介入が、Ｈ_１−ヒスタミン受容体を抗ヒスタミン剤でブロックすることによってヒスタミンが媒介するプロセスを阻害することに焦点を当てている。肥満細胞の脱顆粒の阻害は、ヒスタミンおよびその他の肥満細胞媒介物質が関連する症状を制御するためのそれ以外の関心の高いアプローチである。しかしながら、これまで特異的かつ有効な肥満細胞を安定化する特性を有する物質は同定されていなかった。ここで我々は初めて、ミルテフォシンが、肥満細胞および好塩基球の活性化および脱顆粒を阻害することができること、さらに、６％ミルテフォシン溶液での外用治療は、インビボでのＩｇＥ依存性のヒト肥満細胞の刺激を阻害することができることを示す。最も注目すべきことは、インビトロでの肥満細胞を安定化するミルテフォシンの作用は、ＩｇＥ依存性の活性化に限定されないと思われ、インビボでの抑制作用は、１人の被検体を除く全ての被検体において強力（すなわち検出可能）であり、さらに、顕著である（すなわち、これまでに説明されているあらゆる肥満細胞安定剤（例えばクロモグリク酸塩）に関して予想される作用よりも強い）ことである。興味深いことに、ヒスタミンによって誘導された膨疹形成において、インビボでのミルテフォシンの阻害作用も、低い程度ではあるが検出可能であり、これは、ミルテフォシンは、さらなる炎症促進性の経路をブロックする可能性を有することを示唆している。

フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 フマル酸ケトチフェンおよびクロモグリク酸と比較した、化合物１〜６による肥満細胞の脱顆粒の用量依存性阻害を示す。 抗ヒトＩｇＥおよびイオノフォアＡ２３１８７によって、Ｃ５７細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。 抗ヒトＩｇＥおよびイオノフォアＡ２３１８７によって、Ｃ５７細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。 抗ヒトＩｇＥおよびサブスタンスＰによって、一次ヒト肥満細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。 抗ヒトＩｇＥおよびサブスタンスＰによって、一次ヒト肥満細胞において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。 Ｃ５ａまたは抗ヒトＩｇＥによって、ヒト好塩基球において誘導されたヒスタミン放出に対するミルテフォシンの阻害作用を示す。 ミルテフォシンおよびプラセボで予め治療された皮膚において、ヒスタミン、または、患者に特異的なアレルゲンを用いたプリックテストを行った後の個々のタイムポイントにおける膨疹の直径を示す。

Claims (22)

1. 肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患を治療、予防および／または改善するための医薬組成物を製造するための、以下の式Ｉ：
   

   

   で示される化合物の使用であって、
   式中、
   Ｒ^１は、第四級窒素原子を含むＣ_４〜１３炭化水素基であり；
   Ｘは、Ｏ、または、直接結合であり；
   Ｒ^２は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよく、ここで、１個またはそれより多くのＣＨ_２基が、任意に酸素または以下の式ＩＩで示される基で置換されてもよく：
   

   

   式中、
   Ｙは、Ｏ、Ｏ（ＣＯ）、Ｓ、または、Ｓ（ＣＯ）であり；
   Ｒ^３は、ＯＨ、Ｃ_１〜４アルキル、Ｏ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）ＮＨ−Ｃ_１〜３アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｓ（ＣＯ）−Ｃ_１〜６アルキル、Ｏ（ＣＯ）−Ｃ_２〜３アルケニル、または、ＣＨ_２Ｏ−Ｃ_１〜３アルキルであり；
   Ｒ^３’は、Ｈ、または、Ｃ_１〜４アルキルであり；および、
   Ｒ^４は、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよい、上記使用。
2. Ｒ^１が、以下の式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｃ：
   

   

   （式中、ｎ^１は、１〜７の整数であり、ｎ^２は、１または２の整数である）
   のうちいずれか一種の基である、請求項１に記載の使用。
3. ＸがＯである、請求項１または２に記載の使用。
4. Ｒ^２が、Ｃ_{１０〜２０}炭化水素基であり、ここで、１個またはそれより多くの水素が、任意にフッ素で置き換えられいてもよく、ここで、１個またはそれより多くのＣＨ_２基が、任意に酸素で置き換えられいてもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. Ｒ^２が、Ｃ_{１２〜１８}アルキル基である、請求項４に記載の使用。
6. Ｒ^２が、式ＩＩで示される基であり、Ｘ、Ｙ、Ｒ^３、Ｒ^３’およびＲ^４は請求項１で定義された通りである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
7. ＹがＯである、請求項５に記載の使用。
8. Ｒ^３が、Ｏ−Ｃ_１〜２アルキルである、請求項６または７に記載の使用。
9. Ｒ^４が、Ｃ_{１２〜１８}アルキル基である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記式Ｉで示される化合物が、エデルフォシン（Ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、ミルテフォシン、ペリフォシン（Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、イルメオフォシン（Ｉｌｍｅｏｆｏｓｉｎｅ）、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、および、１−Ｏ−パルミトイル−２−Ｏ−エチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから選択される、請求項１に記載の使用。
11. 前記式Ｉで示される化合物が、ミルテフォシンである、請求項１０に記載の使用。
12. 前記免疫疾患が、肥満細胞の脱顆粒に関連する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記免疫疾患が、急性アレルギー性疾患、アレルギー性障害、または、アレルギー性炎症である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
14. 前記免疫疾患が、腎線維症、肝線維症および肺線維症、強皮症、神経線維腫症、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、食物アレルギー、および、周期性嘔吐症からなる群より選択される、請求項１３に記載の使用。
15. 前記アレルギー性疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、紅斑病変、アトピー性湿疹、全身性アナフィラキシー、神経皮膚炎、および、アトピー性皮膚炎からなる群より選択される、請求項１３に記載の使用。
16. 前記紅斑病変が、じんましん、肥満細胞症、および、紅斑性狼瘡からなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
17. 前記じんましんが、コリン性じんましん、皮膚描記症、寒冷じんましん、日光じんましん、水性じんましん、薬物関連のじんましん、および、毒素関連のじんましんからなる群より選択される、請求項１６に記載の使用。
18. 前記アレルギー性障害が、移植片対宿主疾患、または、移植による拒絶反応である、請求項１３に記載の使用。
19. 肥満細胞の感作および／または活性化に関連する免疫疾患の治療、予防および／または改善方法であって、該方法は、請求項１〜１１のいずれか一項で定義された化合物の医薬活性を有する用量を、このような治療、予防および／または改善が必要な被検体に投与することを含む、上記方法。
20. 前記免疫疾患が、肥満細胞の脱顆粒に関連する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記免疫疾患が、急性アレルギー性疾患、アレルギー性障害、または、アレルギー性炎症である、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記被検体が、ヒトである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。

Images