JP2009244252A - Matrix having novel thiazole derivative immobilized thereon, and production method of same - Google Patents

Matrix having novel thiazole derivative immobilized thereon, and production method of same Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a matrix having a lower-molecular-weight compound immobilized thereon for analysis or purification of a protein. <P>SOLUTION: The matrix having thiazole derivative immobilized thereon is useful for the analysis or purification of the protein, and is represented by general formula (1). In the formula, R<SP>1</SP>and R<SP>2</SP>represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having the carbon number 1-6, Ar represents an optionally substituted aromatic group, n represents an integer of 1 to 12, and M represents a matrix. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に利用可能なチアゾール誘導体を結合させたマトリックス、及びそれらの製造方法に関する。   The present invention relates to a matrix to which a thiazole derivative that can be used for analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins, and a method for producing the same.

近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、その簡便で大規模に実施できる工業的精製技術の確立が切望されている。一般にタンパク質精製技術には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離技術があるが、医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合には、実験室で用いられるような分離剤や装置を使用したのでは経済性に乏しく、実用的とは言い難い。また、医療用タンパク質を工業的に製造する過程では多種類のタンパク質が混在しているため、上記の中の一つの精製技術を用いて目的とするタンパク質を純粋に得ることは極めて困難である。そのため通常はいくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている(特許文献1)。   In recent years, the demand for medical proteins has been expanding, and establishment of an industrial purification technique that can be carried out simply and on a large scale is eagerly desired. In general, protein purification techniques include chromatographic separation techniques such as gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, and affinity chromatography. In the case of practical implementation, the use of a separating agent or apparatus used in a laboratory is not economical and is not practical. In addition, since many kinds of proteins are mixed in the process of industrially producing medical proteins, it is extremely difficult to obtain the target protein purely by using one of the above purification techniques. For this reason, a purification process in which several techniques are combined is generally employed (Patent Document 1).

近年、医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンを精製するための低分子化合物とそれらが結合したマトリックスが数多く開示されており、スルホン誘導体(特許文献2)、トリアジン誘導体(特許文献3)、メルカプト複素環式化合物(特許文献4)、4−ピリジルエチルチオアルキル誘導体(非特許文献1)などの低分子化合物が結合したマトリックスが知られている。しかしながら、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体(1a)が免疫グロブリンを精製するための低分子化合物として有用であるとの報告はない。また、特許文献5や非特許文献2に本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体(1a)に類似の化学構造を有するチアゾール誘導体が報告されているものの、これらの文献に記載のチアゾール誘導体の化学構造は、チアゾール環の2位がアミノ基あるいはアルキル基に限定されており、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体(1a)のように2位にベンゾイルアミノ基が置換した化合物についての記載はない。とりわけ非特許文献2に記載の化合物は、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体(1a)に類似のチアゾール誘導体ではあるものの、それらの用途はヒスタミンH2レセプターアゴニストとしての用途に限定されており、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載はない。   In recent years, many low molecular weight compounds for purifying immunoglobulin, which is one of medical proteins, and matrices to which they are bound have been disclosed, including sulfone derivatives (Patent Document 2), triazine derivatives (Patent Document 3), mercapto. A matrix in which a low molecular weight compound such as a heterocyclic compound (Patent Document 4) or a 4-pyridylethylthioalkyl derivative (Non-Patent Document 1) is bound is known. However, there is no report that the thiazole derivative (1a) used for the production of the matrix of the present invention is useful as a low molecular weight compound for purifying immunoglobulin. Moreover, although the thiazole derivative which has a chemical structure similar to the thiazole derivative (1a) used for manufacture of the matrix of this invention is reported in patent document 5 and nonpatent literature 2, the chemistry of the thiazole derivative described in these documents The structure is limited to the amino group or the alkyl group at the 2-position of the thiazole ring, and the description of the compound in which the benzoylamino group is substituted at the 2-position as in the thiazole derivative (1a) used for the production of the matrix of the present invention is as follows. Absent. In particular, the compound described in Non-Patent Document 2 is a thiazole derivative similar to the thiazole derivative (1a) used in the production of the matrix of the present invention, but their use is limited to use as a histamine H2 receptor agonist, There is no description about the use for purifying immunoglobulin.

なお、特許文献6にはチアゾール環の2位にベンゾイルアミノ基が置換したチアゾール誘導体が記載されているが、これらの化合物のチアゾール環の4位の置換基はカルボニル、5位は無置換にそれぞれ限定されており、それらの用途としては消化管運動改善作用を有する医薬の有効成分に言及されている。更には特許文献6の化合物はマトリックスに固定化されたものではなく、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載もない。   Patent Document 6 describes a thiazole derivative in which a benzoylamino group is substituted at the 2-position of the thiazole ring, but the substituent at the 4-position of the thiazole ring of these compounds is carbonyl, and the 5-position is unsubstituted. It is limited, and as its use, mention is made of an active ingredient of a medicament having an action for improving gastrointestinal motility. Furthermore, the compound of Patent Document 6 is not immobilized on a matrix, and there is no description about the use for purifying immunoglobulin.

WO2004/087761号WO2004 / 087661 米国特許4696980号US Pat. No. 4,696,980 米国特許6117996号US Pat. No. 6,117,996 特許第3844496号Japanese Patent No. 384496 WO1991/10656号WO1991 / 10656 WO1998/17654号WO1998 / 17654 WO1989/10360号WO 1989/10360

Bioseparation,9(4),211−221,2000Bioseparation, 9 (4), 211-221, 2000 Journal of Medicinal Chemistry,35(17),3239−3246,1992Journal of Medicinal Chemistry, 35 (17), 3239-3246, 1992 はじめてのリガンドカップリングハンドブック、アマシャムバイオサイエンス株式会社刊、2005First Ligand Coupling Handbook, published by Amersham Biosciences, 2005

本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に有用なチアゾール誘導体を固定化したマトリックス、及びそれらの製造方法を提供することにある。   The problem to be solved by the present invention is to provide a matrix on which a thiazole derivative useful for analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins, is immobilized, and a method for producing them.

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式(1)で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスが、タンパク質、特に免疫グロブリンの簡便な分析または精製を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has found that the thiazole derivative-immobilized matrix represented by the following general formula (1) of the present invention can easily analyze or purify proteins, particularly immunoglobulins. The present invention has been completed.

本発明は、一般式(1)   The present invention relates to a general formula (1)

Figure 2009244252
(式中、R及びRは水素原子又は置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基を表し、Arは置換されていてもよい芳香族基を表し、nは1から12の整数を表し、Mはマトリックスを表す。)で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
Figure 2009244252
Wherein R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, Ar represents an optionally substituted aromatic group, and n represents 1 to 12 It represents an integer, and M represents a matrix.)

また本発明は、一般式(1)   The present invention also provides a general formula (1)

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)においてMのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、チアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meaning as described above), the matrix of M is any of vinyl polymer, agarose, chitosan, dextran, cellulose, silica and polystyrene. The present invention relates to a thiazole derivative-immobilized matrix.

また本発明は、一般式(1a)   The present invention also provides a compound represented by the general formula (1a)

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar及びnは前記と同じ意味を表し、Rはアミノ基又はアンモニウム塩を表す。)で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式(1)
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar and n represent the same meaning as described above, and R 3 represents an amino group or an ammonium salt) and an activated group-containing matrix is reacted. The general formula (1)

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法に関するものである。
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meanings as described above).

また本発明は、一般式(1)   The present invention also provides a general formula (1)

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法に関するものである。
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meaning as described above), and relates to a method for analyzing or purifying proteins using a thiazole derivative-immobilized matrix.

以下、本発明をさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス(1)及び前記固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体(1a)における、R、R及びArで表される置換基、並びにRで表されるアンモニウム塩(Z N)の定義を以下に示す。 The thiazole derivative-immobilized matrix (1) of the present invention and the substituent represented by R 1 , R 2 and Ar, and the ammonium salt represented by R 3 in the thiazole derivative (1a) used for the production of the immobilized matrix The definition of (Z H 3 + N) is shown below.

及びRで表される炭素数1から6のアルキル基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−ペンチル基、3−ペンチル基、tert−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、2−ヘキシル基、3−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数1から6のアルキル基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、さらに具体的にはジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、2,2,2−トリフルオロエチル基、パーフルオロブチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、4−モルホリノカルボニルメチル基等を例示することができる。特に本発明の固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Rはメチル基が好ましく、Rは水素原子が好ましい。 The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R 1 and R 2 may be linear or branched, and includes a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, Isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isoamyl group, neopentyl group, 2-pentyl group, 3-pentyl group, tert-pentyl group, hexyl group, isohexyl group, 2-hexyl group, 3- A hexyl group can be exemplified. Further, these alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms may be substituted with a halogen atom or the like, and more specifically, a difluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a 2,2,2-trifluoroethyl group, a per Examples thereof include a fluorobutyl group, a hydroxymethyl group, a carboxymethyl group, a 4-morpholinocarbonylmethyl group, and the like. In particular, as a thiazole derivative used in the production of the immobilized matrix of the present invention, R 1 is preferably a methyl group and R 2 is preferably a hydrogen atom in view of good performance in immunoglobulin analysis or purification.

で表されるアンモニウム塩はZ N(Zは共役塩基を表す。)で表され、具体的にはCl N、Br N、F N、I N、NO N、1/2(SO 2−)H N、1/3(PO 3−)H N、CHSO N、4−CHSO N、CHCOO N、CFCOO N等を例示することができるが、マトリックスへの固定化の反応性や操作性に優れている点で、Cl N又はBr Nが好ましい。 Ammonium salt represented by R 3 is Z - H 3 + N (Z - represents a conjugate base.) Is represented by, specifically Cl - H 3 + N, Br - H 3 + N, F - H 3 + N, I - H 3 + N, NO 3 - H 3 + N, 1/2 (SO 4 2-) H 3 + N, 1/3 (PO 4 3-) H 3 + N, CH 3 SO 3 - H 3 + N, 4 -CH 3 C 6 H 4 SO 3 - H 3 + N, CH 3 COO - H 3 + N, CF 3 COO - Although H 3 + N, etc. can be exemplified, matrix in terms of excellent reactivity and operability of immobilization to, Cl - H 3 + N or Br - H 3 + N are preferred.

Arで表される芳香族基は特に制限はないが、フラン−2−イル基、フリル基、チエニル基、チオフェン−3−イル基、ピロール−2−イル基、ピロール−3−イル基、ピラゾール−3−イル基、ピラゾール−4−イル基、イソチアゾール−3−イル基、イソチアゾール−4−イル基、イソキサゾール−3−イル基、イソキサゾール−4−イル基、イミダゾール−2−イル基、イミダゾール−4−イル基、イミダゾール−5−イル基、オキサゾール−2−イル基、オキサゾール−4−イル基、オキサゾール−5−イル基、チアゾール−2−イル基、チアゾール−4−イル基、チアゾール−5−イル基、1,2,4−トリアゾール−3−イル基、フェニル基、2−ピリジル基、3−ピリジル基、4−ピリジル基、2−ピリミジル基、4−ピリミジル基、5−ピリミジル基、1,2,4−トリアジン−3−イル基、1,2,4−トリアジン−5−イル基、1,2,4−トリアジン−6−イル基、ベンゾジオキソラン−3−イル基、ベンゾフラン−2−イル基、ベンゾフラン−3−イル基、ベンゾフラン−4−イル基、ベンゾフラン−5−イル基、ベンゾフラン−6−イル基、ベンゾフラン−7−イル基、ベンゾチオフェン−2−イル基、ベンゾチオフェン−3−イル基、ベンゾチオフェン−4−イル基、ベンゾチオフェン−5−イル基、ベンゾチオフェン−6−イル基、ベンゾチオフェン−7−イル基、インドール−2−イル基、インドール−3−イル基、インドール−4−イル基、インドール−5−イル基、インドール−6−イル基、インドール−7−イル基、ベンゾチアゾール−2−イル基、ベンゾチアゾール−4−イル基、ベンゾチアゾール−5−イル基、ベンゾチアゾール−6−イル基、ベンゾチアゾール−7−イル基、インダゾール−3−イル基、インダゾール−4−イル基、インダゾール−5−イル基、インダゾール−6−イル基、インダゾール−7−イル基、ベンズイソキサゾール−3−イル基、ベンズイソキサゾール−4−イル基、ベンズイソキサゾール−5−イル基、ベンズイソキサゾール−6−イル基、ベンズイソキサゾール−7−イル基、ナフタレン−1−イル基、ナフタレン−2−イル基、キノリン−2−イル基、キノリン−3−イル基、キノリン−4−イル基、キノリン−5−イル基、キノリン−6−イル基、キノリン−7−イル基、キノリン−8−イル基、キノキサリニル基、キノキサリン−5−イル基、キノキサリン−6−イル基、キナゾリニル基、キナゾリン−4−イル基、キナゾリン−5−イル基、キナゾリン−6−イル基、キナゾリン−7−イル基、キナゾリン−8−イル基、ベンゾオキサジン−5−イル基、ベンゾオキサジン−6−イル基、ベンゾオキサジン−7−イル基、ベンゾオキサジン−8−イル基、ベンゾチアジン−5−イル基、ベンゾチアジン−6−イル基、ベンゾチアジン−7−イル基、ベンゾチアジン−8−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−4−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−5−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−6−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−7−イル基、アントラセン−1−イル基を例示できる。特に、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Arはフェニル基、2−ピリジル基、3−ピリジル基あるいは4−ピリジル基が好ましい。   The aromatic group represented by Ar is not particularly limited, but furan-2-yl group, furyl group, thienyl group, thiophen-3-yl group, pyrrol-2-yl group, pyrrol-3-yl group, pyrazole -3-yl group, pyrazol-4-yl group, isothiazol-3-yl group, isothiazol-4-yl group, isoxazol-3-yl group, isoxazol-4-yl group, imidazol-2-yl group, Imidazol-4-yl group, imidazol-5-yl group, oxazol-2-yl group, oxazol-4-yl group, oxazol-5-yl group, thiazol-2-yl group, thiazol-4-yl group, thiazole -5-yl group, 1,2,4-triazol-3-yl group, phenyl group, 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, 2-pyrimidyl group, 4-pyrimid Group, 5-pyrimidyl group, 1,2,4-triazin-3-yl group, 1,2,4-triazin-5-yl group, 1,2,4-triazin-6-yl group, benzodioxolane- 3-yl group, benzofuran-2-yl group, benzofuran-3-yl group, benzofuran-4-yl group, benzofuran-5-yl group, benzofuran-6-yl group, benzofuran-7-yl group, benzothiophene- 2-yl group, benzothiophen-3-yl group, benzothiophen-4-yl group, benzothiophen-5-yl group, benzothiophen-6-yl group, benzothiophen-7-yl group, indol-2-yl Group, indol-3-yl group, indol-4-yl group, indol-5-yl group, indol-6-yl group, indol-7-yl group, benzothiazol-2 Yl group, benzothiazol-4-yl group, benzothiazol-5-yl group, benzothiazol-6-yl group, benzothiazol-7-yl group, indazol-3-yl group, indazol-4-yl group, indazole -5-yl group, indazol-6-yl group, indazol-7-yl group, benzisoxazol-3-yl group, benzisoxazol-4-yl group, benzisoxazol-5-yl group, Benzisoxazol-6-yl group, benzisoxazol-7-yl group, naphthalen-1-yl group, naphthalen-2-yl group, quinolin-2-yl group, quinolin-3-yl group, quinolin- 4-yl group, quinolin-5-yl group, quinolin-6-yl group, quinolin-7-yl group, quinolin-8-yl group, quinoxalinyl group, quinoxaline-5- Yl, quinoxalin-6-yl, quinazolinyl, quinazolin-4-yl, quinazolin-5-yl, quinazolin-6-yl, quinazolin-7-yl, quinazolin-8-yl, benzoxazine -5-yl group, benzoxazin-6-yl group, benzoxazin-7-yl group, benzoxazin-8-yl group, benzothiazin-5-yl group, benzothiazin-6-yl group, benzothiazin-7-yl group Benzothiazin-8-yl group, 1,3-benzodioxol-4-yl group, 1,3-benzodioxol-5-yl group, 1,3-benzodioxol-6-yl group, Examples thereof include a 1,3-benzodioxol-7-yl group and an anthracen-1-yl group. In particular, Ar is preferably a phenyl group, a 2-pyridyl group, a 3-pyridyl group, or a 4-pyridyl group from the viewpoint of showing good performance in immunoglobulin analysis or purification.

Arで表される置換されていてもよい芳香族基の置換基としては、特に制限はないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基が好ましい。   The substituent of the optionally substituted aromatic group represented by Ar is not particularly limited, but may be a halogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or optionally substituted. An alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms, an optionally substituted cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms, an optionally substituted alkenyloxy group having 3 to 6 carbon atoms, and an optionally substituted carbon number 3 To alkynyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted acyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms A sulfinyl group, an optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkoxycarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms, a carboxyl group, nitro , Optionally substituted amino group, a hydroxyl group or a cyano group is preferable.

ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子を例示することができる。   As a halogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom can be illustrated.

置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基としては、直鎖状、分枝状もしくは環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、シクロプロピル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−ペンチル基、3−ペンチル基、2−メチルブチル基、tert−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、2−ヘキシル基、3−ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数1から6のアルキル基はハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基で1個以上置換されていてもよく、さらに具体的には2−クロロエチル基、3−クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、3−フルオロプロピル基、メトキシメチル基、2−エトキシエチル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、2−メチルチオエチル基、2−エチルチオエチル基、2−アリルチオエチル基、2−プロパルギルチオエチル基、2−ベンジルチオエチル基、2−(2−クロロベンジル)チオエチル基、2−(2,4−ジクロロベンジル)チオエチル基、2−メチルスルフィニルエチル基、2−メチルスルホニルエチル基、エトキシメチル基、2−メトキシエチル基、2−クロロエトキシメチル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、1−メトキシカルボニルエチル基、1−エトキシカルボニルエチル基、2−エトキシカルボニルエチル基、カルボキシメチル基、アセトニル基、1−アセチルエチル基、3−アセチルプロピル基、フェナシル基、4−クロロフェナシル基、2,4−ジフルオロフェナシル基、4−メチルフェナシル基、4−イソプロピルフェナシル基、4−イソブチルフェナシル基、4−シクロヘキシルフェナシル基、4−シアノフェナシル基、4−ニトロフェナシル基、チエニル基、2−(チオフェン−2−イル)エチル基、2−(チオフェン−3−イル)エチル基、フルフリル基、(5−メチルフラン−2−イル)メチル基、(5−エチルフラン−2−イル)メチル基、(5−クロロフラン−2−イル)メチル基、2−(5−フルオロフラン−2−イル)エチル基、テトラヒドロフルフリル基、2−ピリジルメチル基、3−ピリジルメチル基、4−ピリジルメチル基、2−(ピリジン−2−イル)エチル基、2−(ピリジン−3−イル)エチル基、2−(ピリジン−4−イル)エチル基、3−(ピリジン−2−イル)プロピル基、3−(ピリジン−3−イル)プロピル基、3−(ピリジン−4−イル)プロピル基を例示することができる。   The optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear, branched or cyclic, and may be a methyl group, an ethyl group, a cyclopropyl group, a propyl group, an isopropyl group, Cyclopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isoamyl group, neopentyl group, 2-pentyl group, 3-pentyl group, 2-methylbutyl group, tert-pentyl group, hexyl Examples thereof include a group, an isohexyl group, a 2-hexyl group and a 3-hexyl group. These alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms are halogen atoms, cycloalkyl groups having 3 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carboxy groups, and acyl groups. , One or more aromatic groups which may be substituted may be substituted, and more specifically, 2-chloroethyl group, 3-chloropropyl group, difluoromethyl group, 3-fluoropropyl group, methoxymethyl group 2-ethoxyethyl group, cyclopropylmethyl group, cyclopentylmethyl group, cyclohexylmethyl group, 2-methylthioethyl group, 2-ethylthioethyl group, 2-allylthioethyl group, 2-propargylthioethyl group, 2-benzyl Thioethyl group, 2- (2-chlorobenzyl) thioethyl group, 2- (2,4-dichlorobenzyl) thioethyl Group, 2-methylsulfinylethyl group, 2-methylsulfonylethyl group, ethoxymethyl group, 2-methoxyethyl group, 2-chloroethoxymethyl group, methoxycarbonylmethyl group, ethoxycarbonylmethyl group, 1-methoxycarbonylethyl group, 1-ethoxycarbonylethyl group, 2-ethoxycarbonylethyl group, carboxymethyl group, acetonyl group, 1-acetylethyl group, 3-acetylpropyl group, phenacyl group, 4-chlorophenacyl group, 2,4-difluorophenacyl Group, 4-methylphenacyl group, 4-isopropylphenacyl group, 4-isobutylphenacyl group, 4-cyclohexylphenacyl group, 4-cyanophenacyl group, 4-nitrophenacyl group, thienyl group, 2- (thiophene- 2-yl) ethyl group, 2- (thiophene) 3-yl) ethyl group, furfuryl group, (5-methylfuran-2-yl) methyl group, (5-ethylfuran-2-yl) methyl group, (5-chlorofuran-2-yl) methyl group, 2 -(5-fluorofuran-2-yl) ethyl group, tetrahydrofurfuryl group, 2-pyridylmethyl group, 3-pyridylmethyl group, 4-pyridylmethyl group, 2- (pyridin-2-yl) ethyl group, 2 -(Pyridin-3-yl) ethyl group, 2- (pyridin-4-yl) ethyl group, 3- (pyridin-2-yl) propyl group, 3- (pyridin-3-yl) propyl group, 3- ( An example is pyridin-4-yl) propyl group.

置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブチルオキシ基、sec−ブチルオキシ基、tert−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、2−ペンチルオキシ基、3−ペンチルオキシ基、tert−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、2−ヘキシルオキシ基、3−ヘキシルオキシ基、デセニルオキシ基を例示することができる。また、これらのアルコキシ基はハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基等で1個以上置換されていてもよく、さらに具体的には2−クロロエトキシ基、3−クロロプロピルオキシ基、ジフルオロメトキシ基、4−トリフルオロメトキシ基、3−フルオロプロピルオキシ基、シクロプロピルメトキシ基、シクロペンチルメトキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、2−メチルチオエトキシ基、2−エチルチオエトキシ基、2−アリルチオエトキシ基、2−プロパルギルチオエトキシ基、2−ベンジルチオエトキシ基、2−(2−クロロベンジル)チオエトキシ基、2−(2,4−ジクロロベンジル)チオエトキシ基、2−メチルスルフィニルエトキシ基、2−メチルスルホニルエトキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、2−メトキシエトキシ基、2−クロロエトキシメトキシ基、メトキシカルボニルメトキシ基、エトキシカルボニルメトキシ基、1−メトキシカルボニルエトキシ基、1−エトキシカルボニルエトキシ基、2−エトキシカルボニルエトキシ基、カルボキシメトキシ基、1−アセチルエトキシ基、3−アセチルプロポキシ基、2−ピリジルメトキシ基、3−ピリジルメトキシ基、4−ピリジルメトキシ基、2−(ピリジン−2−イル)エトキシ基、2−(ピリジン−3−イル)エトキシ基、2−(ピリジン−4−イル)エトキシ基、3−(ピリジン−2−イル)プロポキシ基、3−(ピリジン−3−イル)プロポキシ基、ベンジルオキシ基を例示することができる。   The optionally substituted alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms may be linear or branched, and is a methoxy group, ethoxy group, propyloxy group, isopropyloxy group, butoxy group, isobutyl group. Oxy group, sec-butyloxy group, tert-butoxy group, pentyloxy group, isoamyloxy group, neopentyloxy group, 2-pentyloxy group, 3-pentyloxy group, tert-pentyloxy group, hexyloxy group, isohexyl Examples thereof include an oxy group, a 2-hexyloxy group, a 3-hexyloxy group, and a decenyloxy group. These alkoxy groups may be halogen atoms, cycloalkyl groups having 3 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carboxy groups, acyl groups, One or more may be substituted with a good aromatic group, and more specifically, 2-chloroethoxy group, 3-chloropropyloxy group, difluoromethoxy group, 4-trifluoromethoxy group, 3-fluoropropyloxy Group, cyclopropylmethoxy group, cyclopentylmethoxy group, cyclohexylmethoxy group, 2-methylthioethoxy group, 2-ethylthioethoxy group, 2-allylthioethoxy group, 2-propargylthioethoxy group, 2-benzylthioethoxy group, 2 -(2-chlorobenzyl) thioethoxy group, 2- (2,4-dichlorobenzyl) Thioethoxy group, 2-methylsulfinylethoxy group, 2-methylsulfonylethoxy group, methoxymethoxy group, ethoxymethoxy group, 2-methoxyethoxy group, 2-chloroethoxymethoxy group, methoxycarbonylmethoxy group, ethoxycarbonylmethoxy group, 1- Methoxycarbonylethoxy group, 1-ethoxycarbonylethoxy group, 2-ethoxycarbonylethoxy group, carboxymethoxy group, 1-acetylethoxy group, 3-acetylpropoxy group, 2-pyridylmethoxy group, 3-pyridylmethoxy group, 4-pyridyl Methoxy group, 2- (pyridin-2-yl) ethoxy group, 2- (pyridin-3-yl) ethoxy group, 2- (pyridin-4-yl) ethoxy group, 3- (pyridin-2-yl) propoxy group 3- (Pyridin-3-yl) propyl Epoxy group can be exemplified benzyl group.

置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基としては、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、2−メチルシクロブチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、2−メチルシクロペンチルオキシ基、3−メチルシクロペンチルオキシ基、4−メチルシクロペンチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms include cyclopropyloxy group, cyclobutyloxy group, cyclopentyloxy group, 2-methylcyclobutyloxy group, cyclohexyloxy group, and 2-methylcyclopentyloxy group. , 3-methylcyclopentyloxy group, 4-methylcyclopentyloxy group, and cyclooctyloxy group.

置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基としては、アリルオキシ基、2−メチル−2−プロペニルオキシ基、2−ブテニルオキシ基、1−ブテン−3−イルオキシ基、3−ブテニルオキシ基、4−ペンテニルオキシ基、5−ヘキセニルオキシ基を例示することができる。また、これらの炭素数3から6のアルケニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、3,3−ジフルオロアリルオキシ基、3,3−ジクロロアリルオキシ基、3,3−ジブロモアリルオキシ基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkenyloxy group having 3 to 6 carbon atoms include allyloxy group, 2-methyl-2-propenyloxy group, 2-butenyloxy group, 1-buten-3-yloxy group, 3-butenyloxy group, A 4-pentenyloxy group and a 5-hexenyloxy group can be exemplified. Further, these alkenyloxy groups having 3 to 6 carbon atoms may be substituted with a halogen atom or the like, such as 3,3-difluoroallyloxy group, 3,3-dichloroallyloxy group, 3,3-dibromoallyloxy group. Groups can be exemplified.

置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基としては、プロパルギルオキシ基、1−ブチン−3−イルオキシ基、2−ブチニルオキシ基、3−ブチニルオキシ基、2−ペンチニルオキシ基、3−ペンチニルオキシ基、4−ペンチニルオキシ基、2−ヘキシニルオキシ基、3−ヘキシニルオキシ基、4−ヘキシニルオキシ基、5−ヘキシニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、4,4,4−トリフルオロブチン−2−イル基等を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkynyloxy group having 3 to 6 carbon atoms include propargyloxy group, 1-butyn-3-yloxy group, 2-butynyloxy group, 3-butynyloxy group, 2-pentynyloxy group, 3- Examples thereof include a pentynyloxy group, a 4-pentynyloxy group, a 2-hexynyloxy group, a 3-hexynyloxy group, a 4-hexynyloxy group, and a 5-hexynyloxy group. In addition, these optionally substituted alkynyloxy groups having 3 to 6 carbon atoms may be substituted with a halogen atom or the like, and examples thereof include a 4,4,4-trifluorobutyn-2-yl group and the like. Can do.

置換されていてもよいアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよいアシルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、トリフルオロアセトキシ基や2,2,2−トリフルオロプロピオニルオキシ基等を例示することができる。   Examples of the acyloxy group which may be substituted include an acetoxy group and a propionyloxy group. These optionally substituted acyloxy groups may be substituted with a halogen atom or the like, and examples thereof include a trifluoroacetoxy group and a 2,2,2-trifluoropropionyloxy group.

置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、sec−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、イソアミルチオ基、ネオペンチルチオ基、2−ペンチルチオ基、3−ペンチルチオ基、2−メチルブチルチオ基、ヘキシルチオ基、イソヘキシルチオ基、3−メチルペンチルチオ基、2−メチルペンチルチオ基を例示することができる。また、これらのアルキルチオ基はハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には2−クロロエチルチオ基、3−クロロプロピルチオ基、ジフルオロメチルチオ基、3−フルオロプロピルチオ基、シクロプロピルメチルチオ基、シクロペンチルメチルチオ基、シクロヘキシルメチルチオ基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms include methylthio group, ethylthio group, propylthio group, isopropylthio group, butylthio group, isobutylthio group, sec-butylthio group, pentylthio group, isoamylthio group, neo Examples thereof include a pentylthio group, a 2-pentylthio group, a 3-pentylthio group, a 2-methylbutylthio group, a hexylthio group, an isohexylthio group, a 3-methylpentylthio group, and a 2-methylpentylthio group. Further, one or more of these alkylthio groups may be substituted with a halogen atom, a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, a 2-chloroethylthio group, a 3-chloropropylthio group, a difluoro. Examples thereof include a methylthio group, a 3-fluoropropylthio group, a cyclopropylmethylthio group, a cyclopentylmethylthio group, and a cyclohexylmethylthio group.

置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、イソブチルスルフィニル基、sec−ブチルスルフィニル基、ペンチルスルフィニル基、イソアミルスルフィニル基、ネオペンチルスルフィニル基、2−ペンチルスルフィニル基、3−ペンチルスルフィニル基、2−メチルブチルスルフィニル基、ヘキシルスルフィニル基、イソヘキシルスルフィニル基、3−メチルペンチルスルフィニル基、2−メチルペンチルスルフィニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルフィニル基はハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には2−クロロエチルスルフィニル基、3−クロロプロピルスルフィニル基、ジフルオロメチルスルフィニル基、3−フルオロプロピルスルフィニル基、シクロプロピルメチルスルフィニル基、シクロペンチルメチルスルフィニル基、シクロヘキシルメチルスルフィニル基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkylsulfinyl group having 1 to 6 carbon atoms include methylsulfinyl group, ethylsulfinyl group, propylsulfinyl group, isopropylsulfinyl group, butylsulfinyl group, isobutylsulfinyl group, sec-butylsulfinyl group, pentylsulfinyl group Group, isoamylsulfinyl group, neopentylsulfinyl group, 2-pentylsulfinyl group, 3-pentylsulfinyl group, 2-methylbutylsulfinyl group, hexylsulfinyl group, isohexylsulfinyl group, 3-methylpentylsulfinyl group, 2-methylpentyl A sulfinyl group can be exemplified. One or more of these alkylsulfinyl groups may be substituted with a halogen atom, a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, 2-chloroethylsulfinyl group, 3-chloropropylsulfinyl group, Examples thereof include a difluoromethylsulfinyl group, a 3-fluoropropylsulfinyl group, a cyclopropylmethylsulfinyl group, a cyclopentylmethylsulfinyl group, and a cyclohexylmethylsulfinyl group.

置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、sec−ブチルスルホニル基、ペンチルスルホニル基、イソアミルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、2−ペンチルスルホニル基、3−ペンチルスルホニル基、2−メチルブチルスルホニル基、ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、3−メチルペンチルスルホニル基、2−メチルペンチルスルホニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルホニル基はハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には2−クロロエチルスルホニル基、3−クロロプロピルスルホニル基、ジフルオロメチルスルホニル基、3−フルオロプロピルスルホニル基、シクロプロピルメチルスルホニル基、シクロペンチルメチルスルホニル基、シクロヘキシルメチルスルホニル基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms include methylsulfonyl group, ethylsulfonyl group, propylsulfonyl group, isopropylsulfonyl group, butylsulfonyl group, isobutylsulfonyl group, sec-butylsulfonyl group, and pentylsulfonyl. Group, isoamylsulfonyl group, neopentylsulfonyl group, 2-pentylsulfonyl group, 3-pentylsulfonyl group, 2-methylbutylsulfonyl group, hexylsulfonyl group, isohexylsulfonyl group, 3-methylpentylsulfonyl group, 2-methylpentyl A sulfonyl group can be illustrated. In addition, one or more of these alkylsulfonyl groups may be substituted with a halogen atom or a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, 2-chloroethylsulfonyl group, 3-chloropropylsulfonyl group, difluoro Examples thereof include a methylsulfonyl group, a 3-fluoropropylsulfonyl group, a cyclopropylmethylsulfonyl group, a cyclopentylmethylsulfonyl group, and a cyclohexylmethylsulfonyl group.

置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、tert−ブトキシカルボニル基を例示することができる。また、これらのアルコキシカルボニル基はハロゲン原子等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的にはトリフルオロメトキシカルボニル基、2,2,2−トリフルオロエトキシカルボニル基等を例示することができる。   Examples of the optionally substituted alkoxycarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms include methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, propoxycarbonyl group, butoxycarbonyl group, hexyloxycarbonyl group, dodecyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, tert -A butoxycarbonyl group can be illustrated. In addition, one or more of these alkoxycarbonyl groups may be substituted with a halogen atom or the like, and more specifically, trifluoromethoxycarbonyl group, 2,2,2-trifluoroethoxycarbonyl group and the like can be exemplified. .

置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、N−エチル−N−メチルアミノ基、ジエチルアミノ基、N−メチル−N−プロピルアミノ基、N−エチル−N−プロピルアミノ基、2,2,2−トリフルオロエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、N−メチル−N−イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、N−ブチル−N−メチルアミノ基、イソブチルアミノ基、sec−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソアミルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、2−ペンチルアミノ基、3−ペンチルアミノ基、2−メチルブチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、イソヘキシルアミノ基、4−メチルペンチルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基、N−ベンゼンスルホニル−N−メチルアミノ基、p−トルエンスルホニルアミノ基、4−クロロベンゼンスルホニルアミノ基、4−ニトロベンゼンスルホニルアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、クロロメチルスルホニルアミノ基、トリフルオロメチルスルホニルアミノ基、N−メチルスルホニル−N−メチルアミノ基、N−メチルスルホニル−N−エチルアミノ基、N−メチルスルホニル−N−プロピルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、N−エチルスルホニル−N−メチルアミノ基、N−エチルスルホニル−N−エチルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基を例示することができる。   Examples of the optionally substituted amino group include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, an N-ethyl-N-methylamino group, a diethylamino group, an N-methyl-N-propylamino group, and an N-ethyl- group. N-propylamino group, 2,2,2-trifluoroethylamino group, dipropylamino group, isopropylamino group, N-methyl-N-isopropylamino group, butylamino group, N-butyl-N-methylamino group , Isobutylamino group, sec-butylamino group, pentylamino group, isoamylamino group, neopentylamino group, 2-pentylamino group, 3-pentylamino group, 2-methylbutylamino group, hexylamino group, isohexylamino Group, 4-methylpentylamino group, benzenesulfonylamino group, N-benzenesulfonyl N-methylamino group, p-toluenesulfonylamino group, 4-chlorobenzenesulfonylamino group, 4-nitrobenzenesulfonylamino group, methylsulfonylamino group, chloromethylsulfonylamino group, trifluoromethylsulfonylamino group, N-methylsulfonyl- N-methylamino group, N-methylsulfonyl-N-ethylamino group, N-methylsulfonyl-N-propylamino group, ethylsulfonylamino group, N-ethylsulfonyl-N-methylamino group, N-ethylsulfonyl-N -An ethylamino group, a methoxycarbonylamino group, and an ethoxycarbonylamino group can be illustrated.

Arで表される置換されていてもよい芳香族基としては、特に制限はないが、フラン−2−イル基、5−ブロモフラン−2−イル基、5−メチルフラン−2−イル基、フリル基、チエニル基、5−クロロチエニル基、5−ブロモチエニル基、5−メチルチエニル基、5−メトキシチエニル基、5−エトキシチエニル基、チオフェン−3−イル基、5−メチルチオフェン−3−イル基、5−メトキシチオフェン−3−イル基、5−エトキシチオフェン−3−イル基、1−メチルピロール−2−イル基、1−メチルピロール−3−イル基、1−エチルピラゾール−3−イル基、ピラゾール−2−イル基、3−エトキシ−1−メチルピラゾール−2−イル基、1−エチル−4−メトキシピラゾール−3−イル基、イソチアゾール−3−イル基、5−メトキシイソチアゾール−3−イル基、イソチアゾール−4−イル基、イソキサゾール−3−イル基、イソキサゾール−4−イル基、1−メチルイミダゾール−2−イル基、1−メチルイミダゾール−4−イル基、1−メチルイミダゾール−5−イル基、オキサゾール−2−イル基、オキサゾール−4−イル基、オキサゾール−5−イル基、チアゾール−2−イル基、3−メトキシチアゾール−2−イル基、4−メトキシチアゾール−2−イル基、チアゾール−4−イル基、チアゾール−5−イル基、1,2,4−トリアゾール−3−イル基、1,2,4−トリアゾール−5−イル基、フェニル基、2−フルオロフェニル基、3−フルオロフェニル基、4−フルオロフェニル基、2,3−ジフルオロフェニル基、3,5−ジフルオロフェニル基、3,4,5−トリフルオロフェニル基、2,3,4,5,6−ペンタフルオロフェニル基、3−フルオロ−4−メチルフェニル基、4−トリフルオロメトキシフェニル基、2−クロロフェニル基、3−クロロフェニル基、4−クロロフェニル基、4−クロロ−3−メチルフェニル基、4−クロロ−3−エチルフェニル基、4−クロロ−3−メトキシフェニル基、4−クロロ−3−エトキシフェニル基、2,3−ジクロロフェニル基、3,5−ジクロロフェニル基、3,4,5−トリクロロフェニル基、3−トリフルオロメチルフェニル基、4−トリフルオロメチルフェニル基、3−ブロモフェニル基、4−ブロモフェニル基、4−ブロモ−3−メチルフェニル基、4−ブロモ−3−エチルフェニル基、4−ブロモ−3−メトキシフェニル基、4−ブロモ−3−エトキシフェニル基、3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシフェニル基、3−ヨードフェニル基、4−ヨードフェニル基、4−ヨード−3−メチルフェニル基、4−ヨード−3−エチルフェニル基、4−ヨード−3−メトキシフェニル基、4−ヨード−3−エトキシフェニル基、2−メチルフェニル基、3−メチルフェニル基、4−メチルフェニル基、3,4−ジメチルフェニル基、3,4,5−トリメチルフェニル基、3−ヒドロキシ−4−メチルフェニル基、2−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、3−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、4−トリフルオロフェニルメチルフェニル基、4−メトキシメチルフェニル基、3,4−ジエトキシフェニル基、3−エチル−4−メチルフェニル基、4−エチル−3−メチルフェニル基、4−エチルフェニル基、3,4−ジエチルフェニル基、4−プロピルフェニル基、4−イソプロピルフェニル基、3−ブチルフェニル基、4−ブチルフェニル基、4−イソブチルフェニル基、4−(sec−ブチル)フェニル基、4−(tert−ブチル)フェニル基、4−ペンチルフェニル基、4−イソアミルフェニル基、4−ネオペンチルフェニル基、4−(2−ペンチル)フェニル基、4−(3−ペンチル)フェニル基、4−(2−メチルブチル)フェニル基、4−(tert−ペンチル)フェニル基、4−ヘキシルフェニル基、4−イソヘキシルフェニル基、4−(2−クロロエチル)フェニル基、4−(3−クロロプロピル)フェニル基、4−(ジフルオロメチル)フェニル基、4−(3−フルオロプロピル)フェニル基、4−メトキシメチルフェニル基、4−エトキシメチルフェニル基、4−シクロプロピルメチルフェニル基、4−シクロペンチルメチルフェニル基、シクロヘキシルメチルフェニル基、4−(2−メチルチオエチル)フェニル基、4−(2−エチルチオエチル)フェニル基、4−(2−アリルチオエチル)フェニル基、4−(2−プロパルギルチオエチル)フェニル基、4−(2−ベンジルチオエチル)フェニル基、3−メトキシフェニル基、3−メトキシ−4−メチルフェニル基、4−エチル−3−メトキシフェニル基、3−メトキシ−4−プロピルフェニル基、4−メトキシフェニル基、4−メトキシ−3−メトキシフェニル基、3,4−ジメトキシフェニル基、3−エトキシ−4−メトキシフェニル基、4−エトキシ−3−メトキシフェニル基、4−イソプロピルオキシ−3−メトキシフェニル基、3−イソプロピルオキシ−4−メトキシフェニル基、3−エトキシフェニル基、4−エトキシフェニル基、4−エトキシ−3−メチルフェニル基、4−エトキシ−3−エチルフェニル基、4−エトキシ−3−プロピルフェニル基、4−エトキシ−3−イソプロピルフェニル基、4−プロピルオキシフェニル基、4−イソプロピルオキシフェニル基、4−ブトキシフェニル基、4−イソブチルオキシフェニル基、4−(sec−ブチルオキシ)フェニル基、3−(2−クロロエトキシ)フェニル基、3−(2−クロロエトキシ)フェニル基、4−(2−クロロエトキシ)フェニル基、3−(3−クロロプロピルオキシ)フェニル基、4−(3−クロロプロピルオキシ)フェニル基、3−ジフルオロメトキシフェニル基、4−ジフルオロメトキシフェニル基、4−(3−フルオロプロピルオキシフェニル基)、4−シクロプロピルメトキシフェニル基、4−シクロペンチルメトキシ基、4−シクロヘキシルメトキシ基、3−シクロプロピルオキシフェニル基、4−シクロプロピルオキシフェニル基、4−シクロプロピルオキシ−3−メトキシフェニル基、4−シクロプロピルオキシ−3−メチルフェニル基、4−シクロブチルオキシフェニル基、4−シクロペンチルオキシフェニル基、4−(2−メチルシクロブチルオキシ)フェニル基、4−シクロヘキシルオキシフェニル、4−アリルオキシフェニル基、4−(3,3−ジクロロアリルオキシ)フェニル基、4−プロパルギルオキシフェニル基、3−メチル−4−プロパルギルオキシフェニル基、3−エチル−4−プロパルギルオキシフェニル基、3−メトキシ−4−プロパルギルオキシフェニル基、3−エトキシ−4−プロパルギルオキシフェニル基、3−プロポキシ−4−プロパルギルオキシフェニル基、4−(1−ブチン−3−イルオキシ)フェニル基、4−(2−ブチニルオキシ)フェニル基、3−メチルチオフェニル基、4−メチルチオフェニル基、4−メチル−3−メチルチオフェニル基、3−メチル−4−メチルチオフェニル基、4−メトキシ−3−メチルチオフェニル基、3−エトキシ−4−メチルチオフェニル基、4−エトキシ−3−メチルチオフェニル基、3−プロポキシ−4−メチルチオフェニル基、4−エチルチオフェニル基、3−プロピルチオフェニル基、4−イソプロピルチオフェニル基、4−ブチルチオフェニル基、4−イソブチルチオフェニル基、2−(sec−ブチルチオ)フェニル基、2−ペンチルチオフェニル基、2−イソアミルチオフェニル基、4−ネオペンチルチオフェニル基、4−(2−クロロエチルチオ)フェニル基、3−(3−クロロプロピルチオ)フェニル基、ジフルオロメチルチオフェニル基、3−アセトキシフェニル基、4−アセトキシフェニル基、3−メチルスルフィニルフェニル基、4−メチルスルフィニルフェニル基、4−メトキシ−3−メチルスルフィニルフェニル基、3−メトキシ−4−メチルスルフィニルフェニル基、4−エトキシ−3−メチルスルフィニルフェニル基、3−エトキシ−4−メチルスルフィニルフェニル基、4−メチル−3−メチルスルフィニルフェニル基、3−エチル−4−メチルスルフィニルフェニル基、4−(2−クロロエチルスル)フィニルフェニル基、4−(3−クロロプロピルスルフィニル)フェニル基、4−(ジフルオロメチルスルフィニル)フェニル基、3−メチルスルホニルフェニル基、4−メチルスルホニルフェニル基、4−メチル−3−メチルスルホニルフェニル基、4−エチル−3−メチルスルホニルフェニル基、4−メトキシ−3−メチルスルホニルフェニル基、4−エトキシ−3−メチルスルホニルフェニル基、3−メトキシ−4−メチルスルホニルフェニル基、3−エトキシ−4−メチルスルホニルフェニル基、エチルスルホニルフェニル基、プロピルスルホニルフェニル基、イソプロピルスルホニルフェニル基、ブチルスルホニルフェニル基、2−クロロエチルスルホニルフェニル基、3−クロロプロピルスルホニルフェニル基、ジフルオロメチルスルホニルフェニル基、4−カルボキシフェニル基、4−メトキシカルボニルフェニル基、4−エトキシカルボニルフェニル基、3−メチルアミノフェニル基、4−メチルアミノフェニル基、4−メトキシ−3−メチルアミノフェニル基、3−メトキシ−4−メチルアミノフェニル基、4−エトキシ−3−メチルアミノフェニル基、3−エトキシ−4−メチルアミノフェニル基、4−メチル−3−メチルアミノフェニル基、3−メチル−4−メチルアミノフェニル基、4−エチル−3−メチルアミノフェニル基、3−ジメチルアミノフェニル基、4−ジメチルアミノフェニル基、4−メトキシ−3−ジメチルアミノフェニル基、3−メトキシ−4−ジメチルアミノフェニル基、4−エトキシ−3−ジメチルアミノフェニル基、3−エトキシ−4−ジメチルアミノフェニル基、4−メチル−3−ジメチルアミノフェニル基、3−メチル−4−ジメチルアミノフェニル基、4−エチル−3−ジメチルアミノフェニル基、3−メチル−4−ジメチルアミノフェニル基、3−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、4−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、4−メトキシ−3−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、3−メトキシ−4−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、4−エトキシ−3−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、3−エトキシ−4−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、4−メチル−3−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、3−メチル−4−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、4−エチル−3−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、3−メチル−4−(N−エチル−N−メチルアミノ)フェニル基、3−ジエチルアミノフェニル基、4−ジエチルアミノフェニル基、4−メトキシ−3−ジエチルアミノフェニル基、3−メトキシ−4−ジエチルアミノフェニル基、4−エトキシ−3−ジエチルアミノフェニル基、3−エトキシ−4−ジエチルアミノフェニル基、4−メチル−3−ジエチルアミノフェニル基、3−メチル−4−ジエチルアミノフェニル基、4−エチル−3−ジエチルアミノフェニル基、4−メチルスルホニルアミノフェニル基、4−トリフルオロメチルスルホニルアミノフェニル基、4−アセチルアミノフェニル基、2−ヒドロキシフェニル基、3−ヒドロキシフェニル基、4−ヒドロキシフェニル基、3−ヒドロキシ−4−メチルフェニル基、3−ヒドロキシ−4−エチルフェニル基、3−ヒドロキシ−4−メトキシフェニル基、4−ヒドロキシ−3−メチルフェニル基、4−ヒドロキシ−3−エチルフェニル基、4−ヒドロキシ−3−メトキシフェニル基、2−シアノフェニル基、3−シアノフェニル基、4−シアノフェニル基、2−ニトロフェニル基、3−ニトロフェニル基、3−ニトロ−4−メチルフェニル基、4−ニトロフェニル基、ピリジン−2−イル基、5−クロロピリジン−2−イル基、5−メチルピリジン−2−イル基、5−エチルピリジン−2−イル基、5−メトキシピリジン−2−イル基、5−エトキシピリジン−2−イル基、2,3−ジメチルピリジン−6−イル基、2,3−ジメトキシピリジン−6−イル基、ピリジル−3−イル基、2−クロロピリジン−5−イル基、2−メチルピリジン−5−イル基、2−エチルピリジン−5−イル基、2−メトキシピリジン−5−イル基、2
−エトキシピリジン−5−イル基、2,3−ジメチルピリジン−5−イル基、ピリジル−4−イル基、2−メチルピリジン−4−イル基、2−エチルピリジン−4−イル基、2−メトキシピリジン−4−イル基、2−エトキシピリジン−4−イル基、2−ピリミジル基、5−メチルピリミジン−2−イル基、5−エチルピリミジン−2−イル基、2−エトキシピリジン−5−イル基、2,3−ジメチルピリジン−5−イル基、2−メチルピリジン−4−イル基、2−エチルピリジン−4−イル基、2−メトキシピリジン−4−イル基、2−エトキシピリジン−4−イル基、5−クロロピリミジン−2−イル基、5−ブロモピリミジン−2−イル基、5−メトキシピリミジン−2−イル基、ピリミジル−4−イル基、ピリミジル−5−イル基、1,2,4−トリアジン−3−イル基、1,2,4−トリアジン−5−イル基、1,2,4−トリアジン−6−イル基、ベンゾジオキソラン−3−イル基、ベンゾフラン−2−イル基、ベンゾフラン−3−イル基、ベンゾフラン−4−イル基、ベンゾフラン−5−イル基、ベンゾフラン−6−イル基、ベンゾフラン−7−イル基、ベンゾチオフェン−2−イル基、ベンゾチオフェン−3−イル基、ベンゾチオフェン−4−イル基、ベンゾチオフェン−5−イル基、ベンゾチオフェン−6−イル基、ベンゾチオフェン−7−イル基、1−メチルインドール−2−イル基、ベンゾチアゾール−2−イル基、ベンゾチアゾール−4−イル基、ベンゾチアゾール−5−イル基、ベンゾチアゾール−6−イル基、ベンゾチアゾール−7−イル基、ベンズイソキサゾール−3−イル基、ベンズイソキサゾール−4−イル基、ベンズイソキサゾール−5−イル基、ベンズイソキサゾール−6−イル基、ベンズイソキサゾール−7−イル基、ナフタレン−1−イル基、ナフタレン−2−イル基、キノリン−2−イル基、キノリン−3−イル基、キノリン−4−イル基、キノリン−5−イル基、キノリン−6−イル基、キノリン−7−イル基、キノリン−8−イル基、キノキサリン−5−イル基、キノキサリン−6−イル基、キナゾリン−4−イル基、キナゾリン−5−イル基、キナゾリン−6−イル基、キナゾリン−7−イル基、キナゾリン−8−イル基、ベンゾオキサジン−5−イル基、ベンゾオキサジン−6−イル基、ベンゾオキサジン−7−イル基、ベンゾオキサジン−8−イル基、ベンゾチアジン−5−イル基、ベンゾチアジン−6−イル基、ベンゾチアジン−7−イル基、ベンゾチアジン−8−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−4−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−5−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−6−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−7−イル基、アントラセン−1−イル基等を例示することができる。
The aromatic group which may be substituted represented by Ar is not particularly limited, but furan-2-yl group, 5-bromofuran-2-yl group, 5-methylfuran-2-yl group, furyl Group, thienyl group, 5-chlorothienyl group, 5-bromothienyl group, 5-methylthienyl group, 5-methoxythienyl group, 5-ethoxythienyl group, thiophen-3-yl group, 5-methylthiophen-3-yl Group, 5-methoxythiophen-3-yl group, 5-ethoxythiophen-3-yl group, 1-methylpyrrol-2-yl group, 1-methylpyrrol-3-yl group, 1-ethylpyrazol-3-yl Group, pyrazol-2-yl group, 3-ethoxy-1-methylpyrazol-2-yl group, 1-ethyl-4-methoxypyrazol-3-yl group, isothiazol-3-yl group, 5- Toxiisothiazol-3-yl group, isothiazol-4-yl group, isoxazol-3-yl group, isoxazol-4-yl group, 1-methylimidazol-2-yl group, 1-methylimidazol-4-yl group 1-methylimidazol-5-yl group, oxazol-2-yl group, oxazol-4-yl group, oxazol-5-yl group, thiazol-2-yl group, 3-methoxythiazol-2-yl group, 4 -Methoxythiazol-2-yl group, thiazol-4-yl group, thiazol-5-yl group, 1,2,4-triazol-3-yl group, 1,2,4-triazol-5-yl group, phenyl Group, 2-fluorophenyl group, 3-fluorophenyl group, 4-fluorophenyl group, 2,3-difluorophenyl group, 3,5-difluorophenyl 3,4,5-trifluorophenyl group, 2,3,4,5,6-pentafluorophenyl group, 3-fluoro-4-methylphenyl group, 4-trifluoromethoxyphenyl group, 2-chlorophenyl group, 3-chlorophenyl group, 4-chlorophenyl group, 4-chloro-3-methylphenyl group, 4-chloro-3-ethylphenyl group, 4-chloro-3-methoxyphenyl group, 4-chloro-3-ethoxyphenyl group, 2,3-dichlorophenyl group, 3,5-dichlorophenyl group, 3,4,5-trichlorophenyl group, 3-trifluoromethylphenyl group, 4-trifluoromethylphenyl group, 3-bromophenyl group, 4-bromophenyl Group, 4-bromo-3-methylphenyl group, 4-bromo-3-ethylphenyl group, 4-bromo-3-methoxyphenyl group 4-bromo-3-ethoxyphenyl group, 3,5-dibromo-4-hydroxyphenyl group, 3-iodophenyl group, 4-iodophenyl group, 4-iodo-3-methylphenyl group, 4-iodo-3 -Ethylphenyl group, 4-iodo-3-methoxyphenyl group, 4-iodo-3-ethoxyphenyl group, 2-methylphenyl group, 3-methylphenyl group, 4-methylphenyl group, 3,4-dimethylphenyl group 3,4,5-trimethylphenyl group, 3-hydroxy-4-methylphenyl group, 2-trifluorophenylmethylphenyl group, 3-trifluorophenylmethylphenyl group, 4-trifluorophenylmethylphenyl group, 4- Methoxymethylphenyl group, 3,4-diethoxyphenyl group, 3-ethyl-4-methylphenyl group, 4-ethyl-3 Methylphenyl group, 4-ethylphenyl group, 3,4-diethylphenyl group, 4-propylphenyl group, 4-isopropylphenyl group, 3-butylphenyl group, 4-butylphenyl group, 4-isobutylphenyl group, 4- (Sec-butyl) phenyl group, 4- (tert-butyl) phenyl group, 4-pentylphenyl group, 4-isoamylphenyl group, 4-neopentylphenyl group, 4- (2-pentyl) phenyl group, 4- ( 3-pentyl) phenyl group, 4- (2-methylbutyl) phenyl group, 4- (tert-pentyl) phenyl group, 4-hexylphenyl group, 4-isohexylphenyl group, 4- (2-chloroethyl) phenyl group, 4- (3-chloropropyl) phenyl group, 4- (difluoromethyl) phenyl group, 4- (3-fluoropropyl) Phenyl group, 4-methoxymethylphenyl group, 4-ethoxymethylphenyl group, 4-cyclopropylmethylphenyl group, 4-cyclopentylmethylphenyl group, cyclohexylmethylphenyl group, 4- (2-methylthioethyl) phenyl group, 4- (2-ethylthioethyl) phenyl group, 4- (2-allylthioethyl) phenyl group, 4- (2-propargylthioethyl) phenyl group, 4- (2-benzylthioethyl) phenyl group, 3-methoxyphenyl Group, 3-methoxy-4-methylphenyl group, 4-ethyl-3-methoxyphenyl group, 3-methoxy-4-propylphenyl group, 4-methoxyphenyl group, 4-methoxy-3-methoxyphenyl group, 3, 4-dimethoxyphenyl group, 3-ethoxy-4-methoxyphenyl group, 4-ethoxy-3- Methoxyphenyl group, 4-isopropyloxy-3-methoxyphenyl group, 3-isopropyloxy-4-methoxyphenyl group, 3-ethoxyphenyl group, 4-ethoxyphenyl group, 4-ethoxy-3-methylphenyl group, 4- Ethoxy-3-ethylphenyl group, 4-ethoxy-3-propylphenyl group, 4-ethoxy-3-isopropylphenyl group, 4-propyloxyphenyl group, 4-isopropyloxyphenyl group, 4-butoxyphenyl group, 4- Isobutyloxyphenyl group, 4- (sec-butyloxy) phenyl group, 3- (2-chloroethoxy) phenyl group, 3- (2-chloroethoxy) phenyl group, 4- (2-chloroethoxy) phenyl group, 3- (3-chloropropyloxy) phenyl group, 4- (3-chloropropyloxy) Enyl group, 3-difluoromethoxyphenyl group, 4-difluoromethoxyphenyl group, 4- (3-fluoropropyloxyphenyl group), 4-cyclopropylmethoxyphenyl group, 4-cyclopentylmethoxy group, 4-cyclohexylmethoxy group, 3 -Cyclopropyloxyphenyl group, 4-cyclopropyloxyphenyl group, 4-cyclopropyloxy-3-methoxyphenyl group, 4-cyclopropyloxy-3-methylphenyl group, 4-cyclobutyloxyphenyl group, 4-cyclopentyl Oxyphenyl group, 4- (2-methylcyclobutyloxy) phenyl group, 4-cyclohexyloxyphenyl, 4-allyloxyphenyl group, 4- (3,3-dichloroallyloxy) phenyl group, 4-propargyloxyphenyl group , 3-methyl 4-propargyloxyphenyl group, 3-ethyl-4-propargyloxyphenyl group, 3-methoxy-4-propargyloxyphenyl group, 3-ethoxy-4-propargyloxyphenyl group, 3-propoxy-4-propargyloxyphenyl group 4- (1-butyn-3-yloxy) phenyl group, 4- (2-butynyloxy) phenyl group, 3-methylthiophenyl group, 4-methylthiophenyl group, 4-methyl-3-methylthiophenyl group, 3-methyl -4-methylthiophenyl group, 4-methoxy-3-methylthiophenyl group, 3-ethoxy-4-methylthiophenyl group, 4-ethoxy-3-methylthiophenyl group, 3-propoxy-4-methylthiophenyl group, 4-ethyl Thiophenyl group, 3-propylthiophenyl group, 4-isopro Pyrthiophenyl group, 4-butylthiophenyl group, 4-isobutylthiophenyl group, 2- (sec-butylthio) phenyl group, 2-pentylthiophenyl group, 2-isoamylthiophenyl group, 4-neopentylthiophenyl group 4- (2-chloroethylthio) phenyl group, 3- (3-chloropropylthio) phenyl group, difluoromethylthiophenyl group, 3-acetoxyphenyl group, 4-acetoxyphenyl group, 3-methylsulfinylphenyl group, 4 -Methylsulfinylphenyl group, 4-methoxy-3-methylsulfinylphenyl group, 3-methoxy-4-methylsulfinylphenyl group, 4-ethoxy-3-methylsulfinylphenyl group, 3-ethoxy-4-methylsulfinylphenyl group, 4-Methyl-3-methylsulfinyl Nyl group, 3-ethyl-4-methylsulfinylphenyl group, 4- (2-chloroethylsulfinyl) phenyl group, 4- (3-chloropropylsulfinyl) phenyl group, 4- (difluoromethylsulfinyl) phenyl group, 3-methylsulfonylphenyl group, 4-methylsulfonylphenyl group, 4-methyl-3-methylsulfonylphenyl group, 4-ethyl-3-methylsulfonylphenyl group, 4-methoxy-3-methylsulfonylphenyl group, 4-ethoxy -3-methylsulfonylphenyl group, 3-methoxy-4-methylsulfonylphenyl group, 3-ethoxy-4-methylsulfonylphenyl group, ethylsulfonylphenyl group, propylsulfonylphenyl group, isopropylsulfonylphenyl group, butylsulfonylphenyl group, 2-black Ethylsulfonylphenyl group, 3-chloropropylsulfonylphenyl group, difluoromethylsulfonylphenyl group, 4-carboxyphenyl group, 4-methoxycarbonylphenyl group, 4-ethoxycarbonylphenyl group, 3-methylaminophenyl group, 4-methylamino Phenyl group, 4-methoxy-3-methylaminophenyl group, 3-methoxy-4-methylaminophenyl group, 4-ethoxy-3-methylaminophenyl group, 3-ethoxy-4-methylaminophenyl group, 4-methyl -3-methylaminophenyl group, 3-methyl-4-methylaminophenyl group, 4-ethyl-3-methylaminophenyl group, 3-dimethylaminophenyl group, 4-dimethylaminophenyl group, 4-methoxy-3- Dimethylaminophenyl group, 3-methoxy-4- Dimethylaminophenyl group, 4-ethoxy-3-dimethylaminophenyl group, 3-ethoxy-4-dimethylaminophenyl group, 4-methyl-3-dimethylaminophenyl group, 3-methyl-4-dimethylaminophenyl group, 4 -Ethyl-3-dimethylaminophenyl group, 3-methyl-4-dimethylaminophenyl group, 3- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 4- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group 4-methoxy-3- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 3-methoxy-4- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 4-ethoxy-3- (N-ethyl- N-methylamino) phenyl group, 3-ethoxy-4- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 4-methyl-3- (N-ethyl-N-methyl) Mino) phenyl group, 3-methyl-4- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 4-ethyl-3- (N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 3-methyl-4- ( N-ethyl-N-methylamino) phenyl group, 3-diethylaminophenyl group, 4-diethylaminophenyl group, 4-methoxy-3-diethylaminophenyl group, 3-methoxy-4-diethylaminophenyl group, 4-ethoxy-3- Diethylaminophenyl group, 3-ethoxy-4-diethylaminophenyl group, 4-methyl-3-diethylaminophenyl group, 3-methyl-4-diethylaminophenyl group, 4-ethyl-3-diethylaminophenyl group, 4-methylsulfonylaminophenyl Group, 4-trifluoromethylsulfonylaminophenyl group, 4-acetylamino Phenyl group, 2-hydroxyphenyl group, 3-hydroxyphenyl group, 4-hydroxyphenyl group, 3-hydroxy-4-methylphenyl group, 3-hydroxy-4-ethylphenyl group, 3-hydroxy-4-methoxyphenyl group 4-hydroxy-3-methylphenyl group, 4-hydroxy-3-ethylphenyl group, 4-hydroxy-3-methoxyphenyl group, 2-cyanophenyl group, 3-cyanophenyl group, 4-cyanophenyl group, 2 -Nitrophenyl group, 3-nitrophenyl group, 3-nitro-4-methylphenyl group, 4-nitrophenyl group, pyridin-2-yl group, 5-chloropyridin-2-yl group, 5-methylpyridin-2 -Yl group, 5-ethylpyridin-2-yl group, 5-methoxypyridin-2-yl group, 5-ethoxypyridin-2- Yl group, 2,3-dimethylpyridin-6-yl group, 2,3-dimethoxypyridin-6-yl group, pyridyl-3-yl group, 2-chloropyridin-5-yl group, 2-methylpyridin-5 -Yl group, 2-ethylpyridin-5-yl group, 2-methoxypyridin-5-yl group, 2
-Ethoxypyridin-5-yl group, 2,3-dimethylpyridin-5-yl group, pyridyl-4-yl group, 2-methylpyridin-4-yl group, 2-ethylpyridin-4-yl group, 2- Methoxypyridin-4-yl group, 2-ethoxypyridin-4-yl group, 2-pyrimidyl group, 5-methylpyrimidin-2-yl group, 5-ethylpyrimidin-2-yl group, 2-ethoxypyridin-5 Yl group, 2,3-dimethylpyridin-5-yl group, 2-methylpyridin-4-yl group, 2-ethylpyridin-4-yl group, 2-methoxypyridin-4-yl group, 2-ethoxypyridine- 4-yl group, 5-chloropyrimidin-2-yl group, 5-bromopyrimidin-2-yl group, 5-methoxypyrimidin-2-yl group, pyrimidyl-4-yl group, pyrimidyl-5-yl group, , 2,4-Triazin-3-yl group, 1,2,4-triazin-5-yl group, 1,2,4-triazin-6-yl group, benzodioxolan-3-yl group, benzofuran-2- Yl group, benzofuran-3-yl group, benzofuran-4-yl group, benzofuran-5-yl group, benzofuran-6-yl group, benzofuran-7-yl group, benzothiophen-2-yl group, benzothiophene-3 -Yl group, benzothiophen-4-yl group, benzothiophen-5-yl group, benzothiophen-6-yl group, benzothiophen-7-yl group, 1-methylindol-2-yl group, benzothiazol-2 -Yl group, benzothiazol-4-yl group, benzothiazol-5-yl group, benzothiazol-6-yl group, benzothiazol-7-yl group, benz Soxazol-3-yl group, benzisoxazol-4-yl group, benzisoxazol-5-yl group, benzisoxazol-6-yl group, benzisoxazol-7-yl group, naphthalene-1 -Yl group, naphthalen-2-yl group, quinolin-2-yl group, quinolin-3-yl group, quinolin-4-yl group, quinolin-5-yl group, quinolin-6-yl group, quinolin-7- Yl, quinolin-8-yl, quinoxalin-5-yl, quinoxalin-6-yl, quinazolin-4-yl, quinazolin-5-yl, quinazolin-6-yl, quinazolin-7-yl Group, quinazolin-8-yl group, benzoxazin-5-yl group, benzoxazin-6-yl group, benzoxazin-7-yl group, benzoxazin-8-yl group, benzothia Gin-5-yl group, benzothiazin-6-yl group, benzothiazin-7-yl group, benzothiazin-8-yl group, 1,3-benzodioxol-4-yl group, 1,3-benzodioxole Examples include a -5-yl group, a 1,3-benzodioxol-6-yl group, a 1,3-benzodioxol-7-yl group, and an anthracen-1-yl group.

特に免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Arは4−メチルフェニル基、4−エチルフェニル基、3,4−ジメチルフェニル基、3−エチル−4−メチルフェニル基、4−エチル−3−メチルフェニル基、4−メトキシフェニル基、4−エトキシフェニル基、3,4−ジメトキシフェニル基、3,4−ジエトキシフェニル基、3−エトキシ−4−メトキシフェニル基、4−エトキシ−3−メトキシフェニル基、4−メトキシ−3−メチルフェニル基、4−メチル−3−エトキシフェニル基、4−ジメチルアミノフェニル基、2−メトキシピリジン−5−イル基、2−エトキシピリジン−5−イル基、2,3−ジメチルピリジン−5−イル基、4−ピリジル基、2−メチルピリジン−4−イル基、2−エチルピリジン−4−イル基、2−メトキシピリジン−4−イル基、2−エトキシピリジン−4−イル基、2−クロロピリジン−5−イル基、3−メトキシ−4−メチルフェニル基、3−ヒドロキシ−4−メチルフェニル基、4−メチルチオフェニル基のいずれかが好ましい。   Ar is a 4-methylphenyl group, a 4-ethylphenyl group, a 3,4-dimethylphenyl group, a 3-ethyl-4-methylphenyl group, 4- Ethyl-3-methylphenyl group, 4-methoxyphenyl group, 4-ethoxyphenyl group, 3,4-dimethoxyphenyl group, 3,4-diethoxyphenyl group, 3-ethoxy-4-methoxyphenyl group, 4-ethoxy -3-methoxyphenyl group, 4-methoxy-3-methylphenyl group, 4-methyl-3-ethoxyphenyl group, 4-dimethylaminophenyl group, 2-methoxypyridin-5-yl group, 2-ethoxypyridine-5 -Yl group, 2,3-dimethylpyridin-5-yl group, 4-pyridyl group, 2-methylpyridin-4-yl group, 2-ethylpyridyl -4-yl group, 2-methoxypyridin-4-yl group, 2-ethoxypyridin-4-yl group, 2-chloropyridin-5-yl group, 3-methoxy-4-methylphenyl group, 3-hydroxy- Either a 4-methylphenyl group or a 4-methylthiophenyl group is preferable.

Mで表されるマトリックスの材質としては特に限定はなく、例えば、架橋結合アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、澱粉などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリウレタンなどの合成高分子、シリカ、ガラス、多孔質珪藻土、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄または他の金属酸化物などの無機化合物、上記物質を2つまたはそれ以上任意に組み合わせて構成される共重合体などのマトリックスをあげることができる。さらにそれらは、液相分配で使用されるデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは加水分解澱粉などの水溶性の高分子を包含するマトリックス、またはエマルジョンを形成するのに使用されるペルフルオロデカリンなどの化合物を包含するマトリックスも含まれる。特に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス製造におけるマトリックスの材質としては、トヨパール(商品名)(東ソー株式会社製)などのビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンが好ましい。   The material of the matrix represented by M is not particularly limited. For example, a polypeptide or protein such as cross-linked albumin, agarose, alginate, carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch or other polysaccharides, polyacrylamide, polystyrene , Synthetic polymers such as polyacrolein, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2-hydroxyethyl methacrylate), polyurethane, inorganic compounds such as silica, glass, porous diatomaceous earth, alumina, zirconia, iron oxide or other metal oxides And a matrix such as a copolymer formed by arbitrarily combining two or more of the above substances. In addition, they contain compounds such as dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or hydrolyzed polymers such as hydrolyzed starch used in liquid phase partitioning, or compounds such as perfluorodecalin used to form emulsions. An included matrix is also included. In particular, as a matrix material in the production of the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention, vinyl polymers such as Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosoh Corporation), agarose, chitosan, dextran, cellulose, silica, and polystyrene are preferable.

ここでいうビニルポリマーとは、ビニル基などを持ったモノマーをビニル重合して得られたものを指し、モノマーとしてはメタアクリル酸メチル、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステルなどが含まれる。さらに、ここでいうビニルポリマーとしては前記モノマーを2種類以上用いた共重合体や、架橋したものなどが含まれる。   The vinyl polymer here refers to a polymer obtained by vinyl polymerization of a monomer having a vinyl group, and examples of the monomer include methyl methacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, acrylamide, and vinyl ester. Furthermore, the vinyl polymer here includes a copolymer using two or more of the above-mentioned monomers, and a crosslinked one.

また、マトリックスは、粒状物または非粒状物、水性溶媒に対して可溶性または不溶性、多孔性または非多孔性、いずれであっても良い。   The matrix may be granular or non-particulate, soluble or insoluble in an aqueous solvent, porous or non-porous.

nについては、1から12の整数から適宜選択することができるが、特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、nが3,4又は5が好ましい。   n can be appropriately selected from an integer of 1 to 12, but as a thiazole derivative used for producing the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention, n is preferably 3, 4 or 5.

次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体の製造方法を詳細に説明する。   Next, the manufacturing method of the thiazole derivative used for manufacture of the thiazole derivative fixed matrix of this invention is demonstrated in detail.

製造方法1   Manufacturing method 1

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar及びnは前記と同じ意味を表し、Rはアミノ基又はそのアンモニウム塩を表し、Yは脱離基を表す。)
工程1はフタルイミド誘導体(2)をアシルチオウレア誘導体(3)と反応させ、チアゾール誘導体(4)を合成する方法である。フタルイミド誘導体(2)は非特許文献2や特許文献7等を参考に合成することができる。
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar and n represent the same meaning as described above, R 3 represents an amino group or an ammonium salt thereof, and Y represents a leaving group.)
Step 1 is a method of synthesizing the thiazole derivative (4) by reacting the phthalimide derivative (2) with the acylthiourea derivative (3). The phthalimide derivative (2) can be synthesized with reference to Non-Patent Document 2, Patent Document 7, and the like.

工程1の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン(以下THF)、1,2−ジメトキシエタン(以下DME)、1,4−ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、N,N−ジメチルホルムアミド(以下DMF)、N−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、ジメチルスルホキシド(以下DMSO)、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でDMFを用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、0℃から150℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で60℃から150℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−tert−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。   In the reaction of Step 1, the reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used. For example, diethyl ether, tetrahydrofuran (hereinafter THF), 1,2-dimethoxyethane ( DME), ether solvents such as 1,4-dioxane, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, benzene, toluene and xylene , Aromatic hydrocarbon solvents such as chlorobenzene, amide solvents such as N, N-dimethylformamide (hereinafter DMF), N-methylpyrrolidone, alcohol solvents such as methanol and ethanol, dimethyl sulfoxide (hereinafter DMSO), water or By using these mixed solvents , It is preferable to use DMF in terms of a good yield. Although there is no restriction | limiting in particular about reaction temperature, The target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 degreeC to 150 degreeC, and it is in the range of 60 degreeC to 150 degreeC at a point with a sufficient yield. It is preferable to react. This step can also be carried out in the presence of a base. Examples of the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, hydroxide Alkali metal bases such as potassium, organic amines such as triethylamine, tributylamine, N-methylmorpholine, pyridine and dimethylaniline can be used. The amount of the base used is not particularly limited, but the target product can be obtained with good yield by carrying out the reaction using an equal amount or more with respect to the reaction substrate. After completion of the reaction, the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but if necessary, it can be purified by a method such as column chromatography or recrystallization.

工程2はチアゾール誘導体(4)を塩基で処理し、チアゾール誘導体(1a)を製造する方法である。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−tert−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンなどの有機アミン類、ヒドラジン類を用いることができる。収率が良い点でヒドラジンあるいはメチルアミンが好ましい。塩基の使用量は反応基質に対して2等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。本反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、DMF、N−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール系溶媒、DMSO、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点や後処理が簡便である点でメタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒を用いることが好ましい。反応温度については特に制限はないが、0℃から150℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。また、反応終了後、酸で処理しアンモニウム塩として単離することもできる。反応に害を及ぼさない酸であれば使用することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸、メタンスルホン酸やトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いることができるが、目的物の単離が容易であることから塩酸を用いるのが好ましい。   Step 2 is a method for producing a thiazole derivative (1a) by treating the thiazole derivative (4) with a base. Bases include alkali metal bases such as sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, methylamine, ethylamine, dimethyl Organic amines such as amines and hydrazines can be used. Hydrazine or methylamine is preferred in terms of good yield. The target product can be obtained in good yield by carrying out the reaction with the base used in an amount of 2 equivalents or more with respect to the reaction substrate. In this reaction, the reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used. For example, ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane, acetone, methyl ethyl ketone, etc. Ketone solvents, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene and chlorobenzene, DMF, N-methylpyrrolidone and the like An amide solvent, an alcohol solvent such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, DMSO, water, or a mixed solvent thereof can be used, and an alcohol such as methanol or ethanol can be used because of its good yield and simple post-treatment. It is preferable to use a system solvent. Although there is no restriction | limiting in particular about reaction temperature, A target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 to 150 degreeC. After completion of the reaction, the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but if necessary, it can be purified by a method such as column chromatography or recrystallization. Moreover, after completion | finish of reaction, it can process with an acid and can also be isolated as an ammonium salt. Any acid that does not harm the reaction can be used, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydrofluoric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and other inorganic acids, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid However, it is preferable to use hydrochloric acid because the target product can be easily isolated.

製造方法2   Manufacturing method 2

Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar及びnは前記と同じ意味を表し、Wはハロゲン原子を表す。)
製造方法2は2−置換アミノチアゾール誘導体(5)と酸ハロゲン化物(6)を反応させ、チアゾール誘導体(4a)を製造する方法である。当該方法の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、DMF、N−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、DMSO、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒を用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、0℃から150℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で0℃から100℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−tert−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などにより精製することもできる。当該方法で合成されたチアゾール誘導体(4a)は、製造方法1の工程2を経由することによって、チアゾール誘導体(1a)へと導くことができる。
Figure 2009244252
(In the formula, R 1 , R 2 , Ar and n represent the same meaning as described above, and W represents a halogen atom.)
Production method 2 is a method for producing a thiazole derivative (4a) by reacting a 2-substituted aminothiazole derivative (5) with an acid halide (6). In the reaction of this method, the reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used. For example, halogen solvents such as dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, diethyl Ether solvents such as ether, THF, DME and dioxane, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, benzene, toluene, xylene and chlorobenzene Aromatic hydrocarbon solvents such as DMF, amide solvents such as N-methylpyrrolidone, DMSO, water or a mixed solvent thereof can be used, and dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane are preferable in terms of yield. Use halogenated solvents such as Preference is. Although there is no restriction | limiting in particular about reaction temperature, The target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 degreeC to 150 degreeC, and it is in the range of 0 degreeC to 100 degreeC at a point with a sufficient yield. It is preferable to react. This step can also be carried out in the presence of a base. Examples of the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, hydroxide Alkali metal bases such as potassium, organic amines such as triethylamine, tributylamine, N-methylmorpholine, pyridine and dimethylaniline can be used. The amount of the base used is not particularly limited, but the target product can be obtained with good yield by carrying out the reaction using an equal amount or more with respect to the reaction substrate. After completion of the reaction, the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but can be purified by column chromatography or recrystallization if necessary. The thiazole derivative (4a) synthesized by the method can be led to the thiazole derivative (1a) by passing through step 2 of production method 1.

次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法を詳細に説明する。   Next, the manufacturing method of the thiazole derivative fixed matrix of this invention is demonstrated in detail.

製造方法3   Manufacturing method 3

Figure 2009244252
(式中、R、R、R、M、Ar及びnは前記と同じ意味を表す。)
製造方法3はチアゾール誘導体(1a)と活性化基(活性化基とは、アミノ基あるいはアンモニウム塩と容易に反応できる官能基のことで、例えば、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基(トレシル基)、塩化スルホニル基、トシル基、ビニルスルホニル基、エポキシ基をあげることができる。)含有マトリックスと反応させてチアゾール誘導体固定化マトリックス(1)を製造する方法である。なお、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスの活性化基としては、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基(トレシル基)、エポキシ基、カルボキシル基が特に好ましい。また、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスは、活性化基を有しないマトリックスから周知の方法で活性化基を付加することで調製しても良く、HiTrap NHS−activated HP(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)、エポキシトヨパール(商品名)、ホルミルトヨパール(商品名)、トレシルトヨパール(商品名)、カルボキシトヨパール(商品名)(以上東ソー株式会社製)、活性化キトパールK−66(商品名)ゲル(富士紡ホールディングス株式会社製)、BIOACT EPO(商品名)ゲル(昭和電工株式会社製)、POROS−EP(商品名)ゲル(アプライドバイオシステムズ株式会社製)、セルファインホルミル(商品名)ゲル(チッソ株式会社製)、Profinity Epoxide(商品名)ゲル(バイオラッド株式会社製)、M.S.GEL Epoxy−D−50−1000AW(商品名、AGCエスアイテック株式会社製)などのリガンド固定化用担体として市販されているものをそのまま用いても良い。
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , R 3 , M, Ar and n have the same meaning as described above).
Production method 3 is a thiazole derivative (1a) and an activating group (an activating group is a functional group that can easily react with an amino group or an ammonium salt. For example, succinimideoxycarbonyl group, formyl group, carboxyl group, 2 , 2,2-trifluoroethylsulfonyl group (tresyl group), sulfonyl chloride group, tosyl group, vinylsulfonyl group, and epoxy group.) The thiazole derivative-immobilized matrix (1) is reacted with a matrix containing It is a manufacturing method. The activating group of the activating group-containing matrix used in the method is particularly preferably a succinimideoxycarbonyl group, formyl group, 2,2,2-trifluoroethylsulfonyl group (tresyl group), epoxy group, or carboxyl group. . In addition, the activation group-containing matrix used in the method may be prepared by adding an activation group from a matrix having no activation group by a known method. HiTrap NHS-activated HP (trade name) (GE) Healthcare Biosciences Inc.), Epoxy Toyopearl (trade name), Formyl Toyopearl (trade name), Tresyl Toyopearl (trade name), Carboxy Toyopearl (trade name) (above Tosoh Corporation), activity Chitopearl K-66 (trade name) gel (manufactured by Fujibo Holdings Co., Ltd.), BIOACT EPO (trade name) gel (manufactured by Showa Denko KK), POROS-EP (trade name) gel (manufactured by Applied Biosystems) , Cellufine Formyl (trade name) Gel (manufactured by Chisso Corporation), Profinity Epo xide (trade name) gel (manufactured by Bio-Rad Co., Ltd.), M.I. S. A commercially available carrier for immobilizing a ligand such as GEL Epoxy-D-50-1000AW (trade name, manufactured by AGC S-Tech Co., Ltd.) may be used as it is.

本反応では、中性あるいは塩基性条件下にて反応させることにより容易に目的物を得ることができる。特に塩基性条件下にて反応を行なうことにより、チアゾール誘導体の固定化率の高いマトリックスを得ることができる。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−tert−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等モル以上用いて反応を実施することにより、目的とするチアゾール誘導体の固定化比率の高いマトリックスを得ることができる。また、溶液のpHを保つために緩衝液を加えて反応を行なうこともできる。反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、DMF、N−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、DMSO、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応温度については特に制限はないが、0℃から150℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより、目的とするチアゾール誘導体固定化マトリックスを得ることができる。マトリックス上のチアゾール誘導体の固定化量は、吸光度分析、高速液体クロマトグラフィー、元素分析などの分析法を単独あるいは組み合わせて用いることにより測定できる。   In this reaction, the desired product can be easily obtained by reacting under neutral or basic conditions. In particular, by carrying out the reaction under basic conditions, a matrix with a high immobilization rate of thiazole derivatives can be obtained. Examples of the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide and other alkali metal bases, triethylamine, tributylamine, N -Organic amines such as methylmorpholine, pyridine, dimethylaniline can be used. The amount of the base used is not particularly limited, but by carrying out the reaction using equimolar amounts or more with respect to the reaction substrate, a matrix having a high immobilization ratio of the desired thiazole derivative can be obtained. Moreover, in order to maintain the pH of a solution, it can also react by adding a buffer solution. The reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used. For example, ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane, and ketones such as acetone and ethyl methyl ketone. Solvents, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene and chlorobenzene, amides such as DMF and N-methylpyrrolidone A solvent, DMSO, water, or a mixed solvent thereof can be used. Although there is no restriction | limiting in particular about reaction temperature, The target thiazole derivative fixed matrix can be obtained by making it react at the temperature selected suitably from the range of 0 to 150 degreeC. The amount of the thiazole derivative immobilized on the matrix can be measured by using an analytical method such as absorbance analysis, high performance liquid chromatography, elemental analysis alone or in combination.

次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いてタンパク質を分析、分離、または単離、精製する方法について説明する。   Next, a method for analyzing, separating, isolating and purifying proteins using the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention will be described.

製造方法3によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスをカラム管に充填し、溶離液として緩衝液、金属塩の水溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液などの溶液を通液し、タンパク質を分析や分離、及び単離や精製を行なうことができる。この方法で分析、分離、または単離、精製することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分や乳タンパク質成分をあげることができ、天然に存在するものでは血漿中の免疫グロブリン、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミン、ラクトフェリンを例示できる。また遺伝子組換えタンパク質では前記に加えて、天然には微量しか存在しない、あるいは人工的に設計されたペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンを例示できる。特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、免疫グロブリンの精製に好ましい。通液する緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Tris、PIPES、ACES、Cholamine、BES、MOPS、TES、HEPESを例示でき、金属塩としては硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを例示でき、アミノ酸としてはグリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸を例示でき、アルコールとしてはエタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、エチレングリコールを例示でき、これらを混合溶媒として用いることもできる。pHは3から11の範囲内で目的とするタンパク質を分離、単離または精製することができるが、pHは5から9の範囲内で精製することが好ましい。また、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)などのクロマトグラフィー装置を使用して、タンパク質を分析、分離、または単離、精製することもできる。製造方法3によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いて免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体を分析または精製する場合は、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液を通液し、pHは5から9の範囲で、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーを実施することが好ましい。ここでいう免疫グロブリンの類縁体とは免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された天然あるいは人工的に作られたタンパク質あるいはタンパク質コンジュゲートを指し、免疫グロブリンのフラグメントとは酵素的な処理あるいは遺伝子工学的な設計によって作製された免疫グロブリンの部分構造を持ったタンパク質を指し、免疫グロブリンの融合体とは各種サイトカインあるいはサイトカイン受容体などの生物活性をもったタンパク質の機能部分を免疫グロブリンの全部または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。   The thiazole derivative-immobilized matrix obtained by the production method 3 is packed in a column tube, and a buffer solution, an aqueous solution of a metal salt, an amino acid solution, an alcohol solution, or the like is passed as an eluent, and the protein is analyzed or separated. Isolation and purification can be performed. Proteins that can be analyzed, separated, or isolated and purified by this method include plasma protein components and milk protein components, and naturally occurring proteins such as immunoglobulins in plasma, serum albumin, blood coagulation Examples include factors, lactalbumin, and lactoferrin. In addition to the above, the recombinant protein may be exemplified by peptide hormones, interferons, interleukins, growth factors, growth inhibitory factors, and vaccines that are naturally present in minute amounts or are artificially designed. In particular, the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention is preferred for immunoglobulin purification. Examples of the buffer solution to be passed include phosphate buffer solution, citrate buffer solution, Tris, PIPES, ACES, Cholamine, BES, MOPS, TES, HEPES, and metal salts include sodium sulfate, potassium sulfate, lithium sulfate, Examples include magnesium sulfate, ammonium sulfate, sodium citrate, potassium citrate, sodium chloride, and potassium chloride. Examples of amino acids include glycine, arginine, beta-alanine, and gamma aminobutyric acid. Examples of alcohol include ethanol, isopropyl alcohol, glycerol, and ethylene. A glycol can be illustrated and these can also be used as a mixed solvent. The target protein can be separated, isolated or purified within the pH range of 3 to 11, but the pH is preferably purified within the range of 5 to 9. In addition, the protein can be analyzed, separated, isolated, or purified using a chromatography apparatus such as AKTAprime plus (trade name) (manufactured by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.). When analyzing or purifying immunoglobulins or analogs, fragments or fusions thereof using the thiazole derivative-immobilized matrix obtained by production method 3, a phosphate buffer containing sodium sulfate or ammonium sulfate is passed through. The pH is preferably in the range of 5 to 9, and it is preferable to perform chromatography utilizing hydrophobic interaction. An immunoglobulin analog here refers to a natural or artificially produced protein or protein conjugate in which the structure and function of the immunoglobulin is at least partially retained, and an immunoglobulin fragment is an enzymatic treatment. Alternatively, it refers to a protein having an immunoglobulin partial structure produced by genetic engineering design. An immunoglobulin fusion is a functional part of a protein having biological activity such as various cytokines or cytokine receptors. It refers to those produced by fusing all or part of them with genetic engineering.

製造方法3によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液などの酸性水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、SDS、Tweenなどの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、あるいは、これらを含んだ混合水溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。   The thiazole derivative-immobilized matrix obtained by the production method 3 includes alkaline aqueous solutions such as sodium hydroxide aqueous solution and potassium hydroxide aqueous solution, acidic aqueous solutions such as hydrochloric acid aqueous solution, sulfuric acid aqueous solution, nitric acid aqueous solution and phosphoric acid aqueous solution, guanidine hydrochloride aqueous solution, urea Protein denaturant aqueous solution such as aqueous solution, aqueous solution containing amino acids such as arginine and histidine, aqueous surfactant solution such as SDS, Tween, alcohol solution such as methanol, ethanol, isopropanol, glycerol, ethylene glycol, or these By washing with the mixed aqueous solution, it can be returned to the initial state and can be used repeatedly.

本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製に有用な耐久性に富む選択的な吸脱着剤となることから医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用である。   The thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention is a highly durable selective adsorption / desorption agent useful for the analysis and purification of proteins, particularly immunoglobulins. Therefore, the thiazole derivative-immobilized matrix is extremely useful for industrial purification of medical proteins, particularly immunoglobulins. Useful.

チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物286の結果)。The chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 286). チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物304の結果)。The chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of the compound 304). チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物320の結果)。The chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of the compound 320). チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物329の結果)。The chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 329). チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物384の結果)。The chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 384). チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果(化合物423の結果)Chromatographic results of immunoglobulin using thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 423) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物286の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 286) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物304の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 304) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物320の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using a thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 320) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物329の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using a thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 329) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物384の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 384) チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果(化合物423の結果)Chromatographic results of bovine serum albumin using a thiazole derivative-immobilized HiTrap column (results of compound 423) 化合物286固定化HiTrapカラムを用いたリボヌクレア−ゼA、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンAの混合液のクロマトグラフィー結果Chromatographic results of a mixture of ribonuclease A, lysozyme, and α-chymotrypsinogen A using a compound 286-immobilized HiTrap column 化合物286固定化HiTrapカラムを用いたヒト−マウスキメラ抗体のパパイン消化物のクロマトグラフィー結果Chromatographic results of papain digest of human-mouse chimeric antibody using Compound 286-immobilized HiTrap column 図14の画分I、II、III、IVのSDS−PAGE分析の結果Results of SDS-PAGE analysis of fractions I, II, III and IV in FIG. 化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果Chromatographic results of immunoglobulins using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel 化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果Chromatographic results of humanized monoclonal antibody using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel 化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果Chromatographic results of bovine serum albumin using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel 化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果Chromatographic results of humanized monoclonal antibody using Compound 329-immobilized Epoxy Toyopearl gel 化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果Chromatographic results of bovine serum albumin using Compound 329-immobilized Epoxy Toyopearl gel 化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果Chromatographic results of humanized monoclonal antibody using Compound 286 immobilized formyl toyopearl gel 化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果Chromatographic results of bovine serum albumin using Compound 286 immobilized formyl toyopearl gel 化合物286固定化BIACOREセンサーチップCM5に各種抗体をアナライトとして流したBIACOREセンサーグラム(A:マウスIgM、B:マウスIgG、C:ニワトリIgY、D:ウシ血清アルブミン)BIACORE sensorgram (A: mouse IgM, B: mouse IgG, C: chicken IgY, D: bovine serum albumin) in which various antibodies were run as analytes on the compound 286-immobilized BIACORE sensor chip CM5

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these.

実施例1 チアゾール誘導体の合成
(合成例1)
Example 1 Synthesis of Thiazole Derivative (Synthesis Example 1)

Figure 2009244252
6−フタルイミド−1−ヘキサナール(4.95g,20.2mmol)を四塩化炭素(100mL)に溶解し臭素(1.03mL,20.2mmol)の四塩化炭素溶液(100mL)を滴下し2時間反応した。反応液を水(100mL)、飽和食塩水(100mL)で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し油状物を得た。得られた油状物をDMF(100mL)に溶解し、4−メチルベンゾイルチオウレア(5.87g,26.3mmol)を加え、10時間加熱還流した。反応終了後、反応混合物に1M塩酸(300mL)を加え酢酸エチル(300mL)で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水(300mL)で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=2:1)で精製することによって、4−メチル−N−[5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドの白色固体(0.424g,5%)を得た。m.p.203から205℃;H−NMR(CDCl,TMS,ppm):δ 1.58から1.82(m,4H),2.44(s,3H),2.82(t,J=7.5Hz,2H),3.72(t,J=7.5Hz,2H),6.97(s,1H),7.32(d,J=7.5Hz,2H),7.69から7.86(m,4H),7.91(d,J=7.5Hz,2H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
6-phthalimido-1-hexanal (4.95 g, 20.2 mmol) is dissolved in carbon tetrachloride (100 mL), and a solution of bromine (1.03 mL, 20.2 mmol) in carbon tetrachloride (100 mL) is added dropwise and reacted for 2 hours. did. The reaction mixture was washed with water (100 mL) and saturated brine (100 mL) and dried over anhydrous magnesium sulfate, and then the desiccant was filtered off and the solvent was evaporated under reduced pressure to give an oil. The obtained oil was dissolved in DMF (100 mL), 4-methylbenzoylthiourea (5.87 g, 26.3 mmol) was added, and the mixture was heated to reflux for 10 hr. After completion of the reaction, 1M hydrochloric acid (300 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate (300 mL). The organic layers were combined and washed twice with saturated brine (300 mL). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 2: 1) to give 4-methyl-N- [5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide. A white solid (0.424 g, 5%) was obtained. m. p. 1 3 H-NMR (CDCl 3 , TMS, ppm): δ 1.58 to 1.82 (m, 4H), 2.44 (s, 3H), 2.82 (t, J = 7) .5 Hz, 2H), 3.72 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.97 (s, 1H), 7.32 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.69 to 7 .86 (m, 4H), 7.91 (d, J = 7.5 Hz, 2H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例2)   (Synthesis Example 2)

Figure 2009244252
2−アミノ−4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール(0.50g,1.66mmol)のクロロホルム(10mL)溶液に、4−メチルベンゾイルクロリド(0.31g,1.99mmol)とトリエチルアミン(1mL)を加え、2日間撹拌した。反応終了後、反応液を水(10mL)で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル−ヘキサン=1:2)で精製し、4−メチル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドの白色固体(0.40g,56%)を得た。m.p.178から180℃;H−NMR(CDCl,TMS,ppm):δ 1.58から1.66(m,4H),2.21(s,3H), 2.41(s,3H),2.73(t,J=7.4Hz,2H),3.72(t,J=7.5Hz,2H),7.26(d,J=7.5Hz,2H),7.76から7.86(m,6H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
To a solution of 2-amino-4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazole (0.50 g, 1.66 mmol) in chloroform (10 mL) was added 4-methylbenzoyl chloride (0.31 g, 1.99 mmol). And triethylamine (1 mL) were added and stirred for 2 days. After completion of the reaction, the reaction solution was washed with water (10 mL), the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane = 1: 2) to give 4-methyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl]. A white solid of benzamide (0.40 g, 56%) was obtained. m. p. 178 to 180 ° C .; 1 H-NMR (CDCl 3 , TMS, ppm): δ 1.58 to 1.66 (m, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.73 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.72 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.76 to 7 .86 (m, 6H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例3)   (Synthesis Example 3)

Figure 2009244252
N−(5−ブロモ−6−オキソヘプチル)フタルイミド(1.30g,3.85mmol)のDMF(20mL)溶液に、N−(3−アセトキシ−4−メチルベンゾイル)チオウレアを加え、80℃で7時間反応させた。反応終了後、反応混合物に1M塩酸(30mL)を加え酢酸エチル(50mL)で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水(30mL)で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム(山善社製;Rf=0.32:ヘキサン/酢酸エチル=1/1)で精製し、得られた褐色固体を酢酸エチル/ヘキサンの混合溶媒で洗浄することによって、白色固体の3−アセトキシ−4−メチル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.823g,49%)を得た。:m.p.170から172℃;H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.60から1.66(m,4H),2.20(s,3H),2.21(s,3H),2.35(s,3H),2.72から2.74(m,2H),3.53から3.64(m,2H),7.45(d,J=7.5Hz,1H),7.79から7.93(m,6H),12.4(br s,1H)。
Figure 2009244252
N- (3-acetoxy-4-methylbenzoyl) thiourea was added to a solution of N- (5-bromo-6-oxoheptyl) phthalimide (1.30 g, 3.85 mmol) in DMF (20 mL), and the mixture was stirred at 80 ° C. for 7 minutes. Reacted for hours. After completion of the reaction, 1M hydrochloric acid (30 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate (50 mL). The organic layers were combined and washed twice with saturated brine (30 mL). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The resulting mixture was purified by an automatic medium pressure column chromatography system (manufactured by Yamazen; Rf = 0.32: hexane / ethyl acetate = 1/1), and the resulting brown solid was mixed with ethyl acetate / hexane. To give white solid 3-acetoxy-4-methyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.823 g, 49%). Obtained. : M. p. 170 to 172 ° C .; 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.60 to 1.66 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.21 (s, 3H) ), 2.35 (s, 3H), 2.72 to 2.74 (m, 2H), 3.53 to 3.64 (m, 2H), 7.45 (d, J = 7.5 Hz, 1H) ), 7.79 to 7.93 (m, 6H), 12.4 (br s, 1H).

(合成例4)   (Synthesis Example 4)

Figure 2009244252
モノテレフタル酸メチルクロリド(1.41g,7.10mmol)のクロロホルム(30mL)溶液に、氷冷下にて2−アミノ−4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール(1.56g,4.74mmol)とトリエチルアミン(1.20mL,7.98mmol)のクロロホルム(10mL)溶液を加え、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水(20mL)、飽和食塩水(20mL)で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム(山善社製;Rf=0.16:ヘキサン/酢酸エチル=2/1)で精製し、4−メトキシカルボニル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドの白色固体(0.815g,33%)を得た。:m.p.173から174℃;H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.60から1.67(m,4H),2.22(s,3H),2.72(t,J=7.5Hz,2H),3.62(t,J=7.5Hz,2H),3.90(d,3H),7.80から7.90(m,4H),8.06から8.20(m,4H),12.7(br s,1H)。
Figure 2009244252
To a solution of methyl terephthalate methyl chloride (1.41 g, 7.10 mmol) in chloroform (30 mL) was added 2-amino-4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazole (1.56 g) under ice cooling. , 4.74 mmol) and triethylamine (1.20 mL, 7.98 mmol) in chloroform (10 mL) were added and allowed to react overnight. After completion of the reaction, the reaction mixture was washed successively with water (20 mL) and saturated brine (20 mL), the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The resulting mixture was purified by an automatic medium pressure column chromatography system (manufactured by Yamazen; Rf = 0.16: hexane / ethyl acetate = 2/1), and 4-methoxycarbonyl-N- [4-methyl-5. A white solid (0.815 g, 33%) of-{4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide was obtained. : M. p. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.60 to 1.67 (m, 4H), 2.22 (s, 3H), 2.72 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.90 (d, 3H), 7.80 to 7.90 (m, 4H), 8.06 to 8 .20 (m, 4H), 12.7 (br s, 1H).

(合成例5)   (Synthesis Example 5)

Figure 2009244252
2−アミノ−4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール(1.0g,3.17mmol)のクロロホルム(10mL)溶液に、3−シアノベンゾイルクロリド(0.79g,4.75mmol)を氷冷下にて加えた。次いでトリエチルアミン(0.72mL,4.79mmol)のクロロホルム(10mL)溶液を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水(20mL)、飽和食塩水(20mL)で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/2)で精製し、3−シアノ−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドの白色固体(0.57g,40%)を得た。m.p.170から172℃;H−NMR(CDCl,TMS,ppm):δ 1.69から1.70(m,4H),1.97(s,3H),2.74(t,J=6.5,2H),3.73(t,J=6.8,2H),7.56(dd,J=8.0 and 8.0Hz,1H),7.71から7.86(m,5H),8.05(m,1H),8.16(s,1H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
To a solution of 2-amino-4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazole (1.0 g, 3.17 mmol) in chloroform (10 mL) was added 3-cyanobenzoyl chloride (0.79 g, 4.75 mmol). Was added under ice cooling. Next, a solution of triethylamine (0.72 mL, 4.79 mmol) in chloroform (10 mL) was added dropwise and allowed to react overnight. After completion of the reaction, the reaction mixture was washed successively with water (20 mL) and saturated brine (20 mL), the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate / hexane = 1/2), and 3-cyano-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl]. A white solid of benzamide (0.57 g, 40%) was obtained. m. p. 170 to 172 ° C .; 1 H-NMR (CDCl 3 , TMS, ppm): δ 1.69 to 1.70 (m, 4H), 1.97 (s, 3H), 2.74 (t, J = 6) .5, 2H), 3.73 (t, J = 6.8, 2H), 7.56 (dd, J = 8.0 and 8.0 Hz, 1H), 7.71 to 7.86 (m, 5H), 8.05 (m, 1H), 8.16 (s, 1H). The proton of the amide could not be assigned.

(参考例1)
アルゴン雰囲気下、4−メチル−N−{5−(4−フタルイミドブチル)チアゾール−2−イル}ベンズアミド(0.105g,0.25mmol)とフェロセン(0.023g,0.125mmol)に、DMSO(1.5mL)、3M−ヨウ化トリフルオロメチル/DMSO溶液(0.25mL,0.75mmol)、1M−硫酸/DMSO溶液(0.25mL,0.25mmol)を加えて撹拌した。この溶液に、室温下で31%過酸化水素水(75μL,0.75mmol)を滴下した。反応終了後、反応溶液を水(200mL)にあけ、しばらく撹拌した。クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、4−メチル−N−{4−トリフルオロメチル−5−(4−フタルイミドブチル)チアゾール−2−イル}ベンズアミドの白色固体(0.023g,19%)を得た。H−NMR(CDCl,TMS,ppm):δ 1.79から1.82(m,4H),2.47(s,3H),3.01(t,J=7.5Hz,2H),3.76(t,J=7.5Hz,2H),7.34(d,J=7.5Hz,1H),7.72から7.90(m,6H),9.37(s,1H);19F−NMR(CDCl,TMS,ppm):−60.87。
(Reference Example 1)
Under an argon atmosphere, 4-methyl-N- {5- (4-phthalimidobutyl) thiazol-2-yl} benzamide (0.105 g, 0.25 mmol) and ferrocene (0.023 g, 0.125 mmol) were added to DMSO (0.023 g, 0.125 mmol). 1.5 mL), 3M-trifluoromethyl iodide / DMSO solution (0.25 mL, 0.75 mmol), and 1M-sulfuric acid / DMSO solution (0.25 mL, 0.25 mmol) were added and stirred. To this solution, 31% hydrogen peroxide solution (75 μL, 0.75 mmol) was added dropwise at room temperature. After completion of the reaction, the reaction solution was poured into water (200 mL) and stirred for a while. After extracting with chloroform and drying the obtained organic layer with magnesium sulfate, the desiccant was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography to give 4-methyl-N- {4-trifluoromethyl-5- (4-phthalimidobutyl) thiazol-2-yl} benzamide as a white solid (0.023 g, 19% ) 1 H-NMR (CDCl 3 , TMS, ppm): δ 1.79 to 1.82 (m, 4H), 2.47 (s, 3H), 3.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.76 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.72 to 7.90 (m, 6H), 9.37 (s, 1H); 19 F-NMR (CDCl 3 , TMS, ppm): −60.87.

(合成例6から81)
合成例1または2の方法に準じて、表1から12に記載したチアゾール誘導体を得た。
(Synthesis Examples 6 to 81)
In accordance with the method of Synthesis Example 1 or 2, thiazole derivatives described in Tables 1 to 12 were obtained.

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
(合成例82)
Figure 2009244252
(Synthesis Example 82)

Figure 2009244252
4−メチル−N−{5−(4−フタルイミドブチル)チアゾール−2−イル}ベンズアミド(0.60g,1.43mmol)のエタノール(10mL)溶液に、ヒドラジン一水和物(0.35mL、7.12mmol)を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、1M 塩酸(6mL)を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を酢酸エチルで洗浄し、水層を減圧留去した。得られた固体にエタノールとトルエンを加え共沸し十分に乾燥し、固体を瀘取した。得られた固体を酢酸エチルにて洗浄することによって、4−{2−(4−メチルベンゾイル)アミノチアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.44g,収率:95%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.64から1.67(m,4H),2.40(s,3H),2.77から2.80(m,4H),7.32(s,1H),7.35(d,J=7.5Hz,2H),8.01(d,J=7.5Hz,2H),8.07(br s,3H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
To a solution of 4-methyl-N- {5- (4-phthalimidobutyl) thiazol-2-yl} benzamide (0.60 g, 1.43 mmol) in ethanol (10 mL) was added hydrazine monohydrate (0.35 mL, 7 .12 mmol) was added at room temperature and stirred overnight. After completion of the reaction, the reaction solution was distilled off under reduced pressure, and 1M hydrochloric acid (6 mL) was added. The precipitated solid was separated by filtration, the filtrate was washed with ethyl acetate, and the aqueous layer was distilled off under reduced pressure. Ethanol and toluene were added to the obtained solid, azeotroped and dried sufficiently, and the solid was collected. The obtained solid was washed with ethyl acetate to obtain a white solid (0.44 g, yield: 95%) of 4- {2- (4-methylbenzoyl) aminothiazol-5-yl} butylamine hydrochloride. Obtained. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.64 to 1.67 (m, 4H), 2.40 (s, 3H), 2.77 to 2.80 (m, 4H) 7.32 (s, 1H), 7.35 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.07 (brs, 3H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例83)   (Synthesis Example 83)

Figure 2009244252
2−クロロ−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.22g,0.48mmol)のエタノール(5mL)溶液に、0.05Mのヒドラジンエタノール溶液(34mL)を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、1M 塩酸(3mL)を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて固体を洗浄することにより、4−{2−(2−クロロベンゾイルアミノ)−4−メチルチアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の褐色固体(0.050g,収率:21%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.42から1.77(m,4H),2.21(s,3H),2.63から2.92(m,4H),7.33から7.67(m,4H),7.68から8.16(m,3H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
To a solution of 2-chloro-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.22 g, 0.48 mmol) in ethanol (5 mL), 0.05 M hydrazine Ethanol solution (34 mL) was added at room temperature and stirred overnight. After completion of the reaction, the reaction solution was distilled off under reduced pressure, and 1M hydrochloric acid (3 mL) was added. The precipitated solid was filtered off and the filtrate was distilled off under reduced pressure. The obtained solid was washed with ethanol and ethyl acetate to give a brown solid (0. 2- (2- (2-chlorobenzoylamino) -4-methylthiazol-5-yl} butylamine hydrochloride). 050 g, yield: 21%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.42 to 1.77 (m, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.63 to 2.92 (m, 4H) , 7.33 to 7.67 (m, 4H), 7.68 to 8.16 (m, 3H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例84)   (Synthesis Example 84)

Figure 2009244252
3,4−ジクロロ−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.25g,0.51mmol)のエタノール(5mL)溶液に、ヒドラジン一水和物(0.07mL,1.53mmol)を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を留去し、1M 塩酸(3mL)を加え、室温で一晩撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、4−{2−(3,4−ジクロロベンゾイルアミノ)−4−メチルチアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.10g, 収率:50%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.46から1.74(m,4H),2.24(s,3H), 2.62から2.91(m,4H),7.82(d,J=8.4Hz,1H),7.85から7.99(m,3H),8.03から8.13(m,1H),8.04(dd,J=2.0 and 8.4Hz,1H),8.33(d,J=2.0Hz,1H)。
Figure 2009244252
To a solution of 3,4-dichloro-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.25 g, 0.51 mmol) in ethanol (5 mL) was added hydrazine monohydrate. The Japanese product (0.07 mL, 1.53 mmol) was added at room temperature and stirred overnight. After completion of the reaction, the reaction solution was distilled off, 1M hydrochloric acid (3 mL) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The precipitated solid was filtered off and the filtrate was distilled off under reduced pressure. The obtained solid was washed with ethanol and ethyl acetate to give 4- {2- (3,4-dichlorobenzoylamino) -4-methylthiazol-5-yl} butylamine hydrochloride as a white solid (0. 10 g, yield: 50%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.46 to 1.74 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.62 to 2.91 (m, 4H) 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.85 to 7.99 (m, 3H), 8.03 to 8.13 (m, 1H), 8.04 (dd, J = 2.0 and 8.4 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 2.0 Hz, 1H).

(合成例85)   (Synthesis Example 85)

Figure 2009244252
4−メチル−N−[4−メチル−5-{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.23g,0.53mmol)のエタノール(5mL)溶液に、ヒドラジン一水和物(0.23mL,5.30mmol)を加え3時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、残渣に1M 塩酸(5mL)を加え、撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、4−{4−メチル−2−(4−メチルベンゾイルアミノ)チアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.043g,収率:24%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.55から1.80(m,4H),2.24(s,3H),2.39(s,3H),2.64から2.92(m,4H),7.34(d,J=8.2Hz,2H),7.78から8.05(m,3H),7.99(d,J=8.2Hz,2H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
Hydrazine monohydrate was added to a solution of 4-methyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.23 g, 0.53 mmol) in ethanol (5 mL). (0.23 mL, 5.30 mmol) was added and refluxed for 3 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was distilled off, and 1M hydrochloric acid (5 mL) was added to the residue and stirred. The precipitated solid was filtered off and the filtrate was distilled off under reduced pressure. The obtained solid was washed with ethanol and ethyl acetate to give a white solid (0.043 g, 4- {4-methyl-2- (4-methylbenzoylamino) thiazol-5-yl} butylamine hydrochloride). Yield: 24%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.55 to 1.80 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.64 To 2.92 (m, 4H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.78 to 8.05 (m, 3H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 2H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例86)   (Synthesis Example 86)

Figure 2009244252
4−トリフルオロメチル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.30g,0.62mmol)のエタノール(5mL)溶液に、0.05M ヒドラジンエタノール溶液(30mL)を室温にて加え、2時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、1M 塩酸(3mL)を加え、室温で2時間撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、4−{4−メチル−2−(4−トリフルオロメチルベンゾイルアミノ)チアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.10g,収率:41.7%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.49から1.73(m,4H),2.24(s,3H),2.60から2.90(m,4H),7.91(d,J=8.1Hz,2H),7.97から8.19(m,3H),8.26(d,J=8.1Hz,2H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
To a solution of 4-trifluoromethyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.30 g, 0.62 mmol) in ethanol (5 mL) was added 0.05M. A hydrazine ethanol solution (30 mL) was added at room temperature, and the mixture was refluxed for 2 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was distilled off, 1M hydrochloric acid (3 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The precipitated solid was filtered off and the filtrate was distilled off under reduced pressure. The obtained solid was washed with ethanol and ethyl acetate to give a white solid (0. 4-methyl-4- (4-trifluoromethylbenzoylamino) thiazol-5-yl} butylamine hydrochloride). 10 g, yield: 41.7%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.49 to 1.73 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.60 to 2.90 (m, 4H) 7.91 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.97 to 8.19 (m, 3H), 8.26 (d, J = 8.1 Hz, 2H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例87)   (Synthesis Example 87)

Figure 2009244252
4−メトキシカルボニル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]−ベンズアミド(0.535g,1.12mmol)に0.5Mヒドラジンエタノール溶液(13.5mL)を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した。残渣に1M塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、4−[2−{4−(メトキシカルボニル)ベンゾイルアミノ}−4−メチルチアゾール−5−イル]ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.36g,収率:84%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.60から1.70(m,4H),2.42(s,3H),2.72から2.80(m,4H),3.90(s,3H),7.97(br s,3H),8.07から8.21(m,4H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
4-Methoxycarbonyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] -benzamide (0.535 g, 1.12 mmol) in 0.5 M hydrazine ethanol solution (13.5 mL) ) And allowed to react overnight at room temperature. After completion of the reaction, the solution was distilled off under reduced pressure. 1M hydrochloric acid was added to the residue, and the mixture was suspended with ultrasound, and the solid was filtered off with a glass filter covered with celite. The filtrate was distilled off under reduced pressure and the solid was precipitated again, and washed with a small amount of hot ethanol to give 4- [2- {4- (methoxycarbonyl) benzoylamino} -4-methylthiazol-5-yl] butylamine hydrochloride. A white solid salt (0.36 g, yield: 84%) was obtained. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.60 to 1.70 (m, 4H), 2.42 (s, 3H), 2.72 to 2.80 (m, 4H) 3.90 (s, 3H), 7.97 (br s, 3H), 8.07 to 8.21 (m, 4H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例88)   (Synthesis Example 88)

Figure 2009244252
3−アセトキシ−4−メチル−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(0.80g,1.62mmol)に0.5Mヒドラジンエタノール溶液(10mL)を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶液を減圧留去した後、残渣に1M塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、4−{2−(3−ヒドロキシ4−メチルベンゾイルアミノ)−4−メチルチアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.48g,収率:75%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.60から1.70(m,4H),2.19(s,3H),2.23(s,3H),2.72から2.81(m,4H),7.20(d,J=7.5Hz,1H),7.44から7.50(m,2H),7.94(br s,3H)9.80(br s,1H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
3-acetoxy-4-methyl-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide (0.80 g, 1.62 mmol) in 0.5 M hydrazine ethanol solution (10 mL ) And allowed to react overnight at room temperature. After completion of the reaction, the solution was evaporated under reduced pressure, 1M hydrochloric acid was added to the residue, and the mixture was suspended with ultrasound, and the solid was filtered off with a glass filter covered with celite. The filtrate was distilled off under reduced pressure, the solid was precipitated again, and washed with a small amount of hot ethanol to give 4- {2- (3-hydroxy-4-methylbenzoylamino) -4-methylthiazol-5-yl} butylamine hydrochloride A white solid salt (0.48 g, yield: 75%) was obtained. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.60 to 1.70 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 2.72 To 2.81 (m, 4H), 7.20 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.44 to 7.50 (m, 2H), 7.94 (br s, 3H) 9.80 (Br s, 1H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例89)   (Synthesis Example 89)

Figure 2009244252
3−シアノ−N−[4−メチル−5−{4−(フタルイミド)ブチル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドに0.5Mヒドラジンエタノール溶液(7mL)を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣に1M塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで濾過した。溶媒を減圧留去し、少量のエタノールを加え溶解した後、酢酸エチルで再沈殿させて精製し、4−{2−(3−シアノベンゾイルアミノ)−4−メチルチアゾール−5−イル}ブチルアミン塩酸塩の白色固体(0.25g,収率:46%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.62から1.65(m,4H),2.24(s,3H),3.43から3.46(m,4H),7.56(dd,J=8.0 and 8.0Hz,1H),8.05(d,J=8.0Hz,1H),8.10から8.22(m,4H),8.49(s,1H)。アミドのプロトンは帰属できなかった。
Figure 2009244252
A 0.5 M hydrazine ethanol solution (7 mL) was added to 3-cyano-N- [4-methyl-5- {4- (phthalimido) butyl} thiazol-2-yl] benzamide and reacted at room temperature overnight. After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure, 1M hydrochloric acid was added to the residue, the mixture was suspended with ultrasound, and filtered through a glass filter with celite. The solvent was distilled off under reduced pressure, a small amount of ethanol was added and dissolved, and then purified by reprecipitation with ethyl acetate, and 4- {2- (3-cyanobenzoylamino) -4-methylthiazol-5-yl} butylamine hydrochloride A white solid salt (0.25 g, yield: 46%) was obtained. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.62 to 1.65 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 3.43 to 3.46 (m, 4H) 7.56 (dd, J = 8.0 and 8.0 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.10 to 8.22 (m, 4H), 8. 49 (s, 1H). The proton of the amide could not be assigned.

(合成例90から179)
合成例89の方法に準じて、表13から26に記載したチアゾール誘導体を得た。
(Synthesis Examples 90 to 179)
The thiazole derivatives described in Tables 13 to 26 were obtained according to the method of Synthesis Example 89.

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
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Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
合成例1から81に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体(4)を表27から32にまとめて例示した。
Figure 2009244252
Examples of thiazole derivatives (4) according to the present invention synthesized by the methods exemplified in Synthesis Examples 1 to 81 are summarized in Tables 27 to 32.

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
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Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
また、合成例82から179に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体(1a)を表33から41にまとめて例示した。
Figure 2009244252
In addition, the thiazole derivatives (1a) according to the present invention synthesized by the methods exemplified in Synthesis Examples 82 to 179 are collectively shown in Tables 33 to 41.

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
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Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
Figure 2009244252

Figure 2009244252
(参考例2)
Figure 2009244252
(Reference Example 2)

Figure 2009244252
化合物276(2.50g,8.64mmol)のクロロホルム(50mL)溶液にトリエチルアミン(2.50mL,18mmol)を添加した。次に氷冷下でメタクリル酸クロリド(0.93mL,9.5mmol)を滴下したのち、氷冷下で30分反応させた。反応終了後、反応混合物にクロロホルム(50mL)を追加し、水(100mL)、飽和炭酸ナトリウム水溶液(100mL)、飽和食塩水(100mL)で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/2(v/v))で精製することで、淡黄色粘性液体の4−メチル−N−[4−メチル−5−{3−(2−プロペニルカルボニルアミノ)プロピル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(1.07g,3.0mmol,収率:35%)を得た。H−NMR(DMSO−d,DMSO,ppm):δ 1.70から1.82(m,2H),1.87(s,3H),2.21(s,3H),2.39(s,3H),2.68(t,J=7.5Hz,2H),3.10から3.25(m,2H),5.32(s,1H),5.64(s,1H),7.34(d,J=8.5Hz,2H),7.90(s,1H),7.98(d,J=8.5Hz,2H)。
Figure 2009244252
Triethylamine (2.50 mL, 18 mmol) was added to a solution of compound 276 (2.50 g, 8.64 mmol) in chloroform (50 mL). Next, methacrylic acid chloride (0.93 mL, 9.5 mmol) was added dropwise under ice cooling, followed by reaction for 30 minutes under ice cooling. After completion of the reaction, chloroform (50 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was washed successively with water (100 mL), saturated aqueous sodium carbonate solution (100 mL), and saturated brine (100 mL). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained mixture was purified by silica gel chromatography (ethyl acetate / hexane = 1/2 (v / v)) to give 4-methyl-N- [4-methyl-5- {3- (2-propenylcarbonylamino) propyl} thiazol-2-yl] benzamide (1.07 g, 3.0 mmol, yield: 35%) was obtained. 1 H-NMR (DMSO-d 6 , DMSO, ppm): δ 1.70 to 1.82 (m, 2H), 1.87 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.39 (S, 3H), 2.68 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.10 to 3.25 (m, 2H), 5.32 (s, 1H), 5.64 (s, 1H) ), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.90 (s, 1H), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 2H).

実施例2 チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化(その1)
チアゾール誘導体を40μmol/mLになるようDMSOに溶解し、これに等量の0.5M 塩化ナトリウムを含む0.2M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.3)を加えて濃度20μmol/mLのチアゾール誘導体溶液を調製した。N−ヒドロキシスクシニミド(NHS)にて活性化されたアガロースゲルであるHiTrap NHS−activated HP 1mL(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製;以下HiTrapカラムと略記する)に、非特許文献3に記載された方法に従って前記チアゾール誘導体溶液を2mL通液することによって固定化を行なった。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献3に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献3に記載された方法のうち「B.酸性条件法」に従って、HiTrapカラム通液前後のリガンド(チアゾール誘導体)溶液の紫外吸収極大波長(300nm付近)における吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定することにより算出した。当該方法で固定化した各化合物の固定化リガンド密度を表42に示す。なお、本実施例以降で記載の化合物番号は表33から41記載の化合物番号に対応する。
Example 2 Immobilization of thiazole derivative on agarose gel (Part 1)
Dissolve thiazole derivative in DMSO to 40 μmol / mL, add 0.2 M sodium carbonate buffer (pH 8.3) containing an equal amount of 0.5 M sodium chloride to obtain a thiazole derivative solution with a concentration of 20 μmol / mL. Prepared. Non-patent to HiTrap NHS-activated HP 1 mL (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences; hereinafter abbreviated as HiTrap column), which is an agarose gel activated with N-hydroxysuccinimide (NHS). Immobilization was carried out by passing 2 mL of the thiazole derivative solution according to the method described in Document 3. Unreacted succinimideoxycarbonyl group was blocked according to the method described in Non-Patent Document 3. As for the amount of immobilization, according to “B. Acidic condition method” among the methods described in Non-Patent Document 3, the absorbance at the maximum absorption wavelength (around 300 nm) of the ligand (thiazole derivative) solution before and after passing through the HiTrap column was measured as U−. It was calculated by measuring with a 2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Table 42 shows the immobilized ligand density of each compound immobilized by this method. In addition, the compound numbers described in the examples and thereafter correspond to the compound numbers described in Tables 33 to 41.

Figure 2009244252
実施例3 チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化(その2)
チアゾール誘導体を20μmol/mL、トリエチルアミンを40μmol/mL含むDMSO溶液を調製した。HiTrapカラムをDMSOで置換後、これに前記チアゾール誘導体−トリエチルアミンのDMSO溶液を2mL通液した。一時間放置した後、HiTrapカラムに3mLのDMSOを通液して、さらに5mLの0.5M 塩化ナトリウムを含む0.2M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.3)を通液した。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献3に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献3に記載された方法のうち「B.酸性条件法」に従って、HiTrapカラム通液前後のリガンド(チアゾール誘導体)溶液の紫外吸収極大波長(300nm付近)における吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定することにより算出した。当該方法で固定化した化合物304の固定化リガンド密度を表43に示す。
Figure 2009244252
Example 3 Immobilization of thiazole derivative on agarose gel (Part 2)
A DMSO solution containing a thiazole derivative at 20 μmol / mL and triethylamine at 40 μmol / mL was prepared. After replacing the HiTrap column with DMSO, 2 mL of the above-mentioned thiazole derivative-triethylamine in DMSO was passed through it. After standing for 1 hour, 3 mL of DMSO was passed through the HiTrap column, and then 0.2 mL of sodium carbonate buffer (pH 8.3) containing 5 mL of 0.5 M sodium chloride was passed. Unreacted succinimideoxycarbonyl group was blocked according to the method described in Non-Patent Document 3. As for the amount of immobilization, according to “B. Acidic condition method” among the methods described in Non-Patent Document 3, the absorbance at the maximum absorption wavelength (around 300 nm) of the ligand (thiazole derivative) solution before and after passing through the HiTrap column was measured as U−. It was calculated by measuring with a 2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Table 43 shows the immobilized ligand density of Compound 304 immobilized by this method.

Figure 2009244252
実施例4 チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その1)
実施例2あるいは3に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウムを含む10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)(以下平衡化緩衝液と呼ぶ)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤(化血研製、本製剤の免疫グロブリンは免疫グロブリンGである)0.5mg(OD280=0.7)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。チアゾール誘導体を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図1から図6に示し、これらのクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表44に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときも免疫グロブリンは50%以上の回収率で回収され、チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムによる免疫グロブリンの吸脱着が確認された。特に化合物286、304、329を用いた場合の回収率は90%以上と極めて高かった。
Figure 2009244252
Example 4 Adsorption / desorption of protein using agarose gel immobilized with thiazole derivative (Part 1)
The thiazole derivative-immobilized HiTrap column prepared by the method described in Example 2 or 3 was attached to AKTAprime plus (trade name) (a chromatography device manufactured by GE Healthcare Biosciences), and 10 mM containing 0.7 M sodium sulfate. 20 mL of sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) (hereinafter referred to as equilibration buffer) was passed through to equilibrate. AKTAprime plus is automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, equilibrated buffer solution is passed through 10 mL, and human plasma-derived immunoglobulin preparation dissolved in the same buffer solution (manufactured by Kakenken, the immunoglobulin of this preparation is immunoglobulin G) ) 0.5 mg (OD 280 = 0.7) was added and passed through the column. Further, after 10 mL of the equilibration buffer was passed, linear concentration gradient chromatography on sodium sulfate from the equilibration buffer to 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was performed. Elution of the immunoglobulin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using a HiTrap column immobilized with a thiazole derivative are shown in FIG. 1 to FIG. 6, and the immunoglobulin recovery rate in these chromatography is shown in Table 44. When any thiazole derivative was used, the immunoglobulin was recovered at a recovery rate of 50% or more, and the adsorption / desorption of the immunoglobulin by the thiazole derivative-immobilized HiTrap column was confirmed. In particular, the recovery rate when using compounds 286, 304, and 329 was as extremely high as 90% or more.

Figure 2009244252
それぞれの吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウム水溶液を10mL通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After each adsorption / desorption operation, the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM aqueous sodium hydroxide solution. Any of the above-mentioned thiazole derivative-immobilized HiTrap columns could be restored to the initial state by this regeneration treatment, and the characteristics were not changed by repeated use.

実施例5 チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その2)
実施例2あるいは3に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン(SIGMA社製)0.5mg(OD280=0.3)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。各種チアゾール誘導体を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図7から12に示す。また、これらのクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表45に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときもウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出しており、カラムへの吸着はほとんど見られなかった。また、図1から6に示した免疫グロブリンを通液したときの結果とは大きく異なっていた。よって、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとウシ血清アルブミンとの分離が可能であることが示された。
Example 5 Adsorption / desorption of protein using agarose gel immobilized with thiazole derivative (Part 2)
The Thiazole derivative-immobilized HiTrap column prepared by the method described in Example 2 or 3 was attached to AKTAprime plus (trade name) (a chromatography apparatus manufactured by GE Healthcare Biosciences), and 20 mL of the equilibration buffer was passed through. Liquid and equilibrate. AKTA prime plus is automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, and after 10 mL of equilibration buffer is passed, 0.5 mg (OD 280 = 0.3) of bovine serum albumin (manufactured by SIGMA) dissolved in the same buffer is added. And passed through the column. Further, after 10 mL of the equilibration buffer was passed, linear concentration gradient chromatography on sodium sulfate from the equilibration buffer to 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was performed. The elution of bovine serum albumin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using HiTrap columns with various thiazole derivatives immobilized are shown in FIGS. In addition, Table 45 shows the recovery rates of bovine serum albumin in these chromatography. When any thiazole derivative was used, bovine serum albumin was eluted by the 10th fraction, and almost no adsorption was observed on the column. Also, the results shown in FIGS. 1 to 6 were significantly different from the results obtained when the immunoglobulin was passed. Therefore, it was shown that the use of the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention enables separation of immunoglobulins and bovine serum albumin in a sample.

Figure 2009244252
それぞれの吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウム水溶液を10mL通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体を固定化HiTrapカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After each adsorption / desorption operation, the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM aqueous sodium hydroxide solution. Any HiTrap column immobilized with the thiazole derivative could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its characteristics did not change even after repeated use.

実施例6 チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その3)
実施例2に記載の方法にて調製した化合物286を固定化したHiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したリボヌクレア−ゼA、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンAの混合液(リボヌクレア−ゼA 0.15mg、リゾチ−ム 0.03mg、αキモトリプシノ−ゲンA 0.04mg)(OD280=0.24)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度の吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図13に示し、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を表46に示す。いずれのタンパク質も10番目の画分以内に溶出しており、免疫グロブリン(25番目から45番目までの画分に溶出、図1参照)とは異なる画分となった。このことから、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとリボヌクレア−ゼA、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンAとの分離が可能であることが示された。
Example 6 Adsorption / desorption of protein using thiazole derivative-immobilized agarose gel (Part 3)
A HiTrap column on which compound 286 prepared by the method described in Example 2 was immobilized was attached to AKTAprime plus (trade name) (a chromatography device manufactured by GE Healthcare Biosciences), and 20 mL of the equilibration buffer was passed through. Liquid and equilibrate. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, and 10 mL of equilibration buffer was passed through, followed by a mixture of ribonuclease A, lysozyme, α chymotrypsinogen A dissolved in the same buffer (ribonuclease A 0.15 mg, lysozyme 0.03 mg, α chymotrypsinogen A 0.04 mg) (OD 280 = 0.24) was added and passed through the column. Further, after 10 mL of the equilibration buffer was passed, linear concentration gradient chromatography on sodium sulfate from the equilibration buffer to 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was performed. Protein elution from the column was detected by monitoring absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using a HiTrap column with compound 286 immobilized thereon are shown in FIG. 13 and the protein recovery rate in this chromatography is shown in Table 46. All the proteins were eluted within the 10th fraction, which was a fraction different from that of immunoglobulin (eluted in the 25th to 45th fractions, see FIG. 1). From this, it was shown that the use of the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention makes it possible to separate the immunoglobulin in the sample from ribonuclease A, lysozyme, and α-chymotrypsinogen A.

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウム水溶液を10mL通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM sodium hydroxide aqueous solution. The above-mentioned thiazole derivative-immobilized HiTrap column could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its characteristics did not change even after repeated use.

実施例7 チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その4)
ヒト−マウスキメラ抗体であるリツキサン(商品名)(中外製薬株式会社製、10mg/mL)を固定化パパイン(Immobilized Papain、PIERCE株式会社製)を用い、同説明書記載の方法で37℃、10時間処理することによって、限定加水分解物を得た。
Example 7 Adsorption / desorption of protein using agarose gel immobilized with thiazole derivative (Part 4)
Rituxan (trade name) (manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 10 mg / mL), which is a human-mouse chimeric antibody, was immobilized at 37 ° C. using the immobilized papain (Immobilized Papain, manufactured by PIERCE) at 10 ° C. Limited hydrolyzate was obtained by time treatment.

実施例2に記載の方法にて調製した化合物286を固定化したHiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、上記パパイン処理抗体を1.2mg(OD280=1.7)添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出し、溶出液は1mLずつ分画した。このクロマトグラフィーの結果を図14に示す。またこのうち7、29、39、43番目の画分(それぞれI、II、III、IVと表記)についてそれぞれ5μLを還元条件下で15%アクリルアミドを含むSDS−PAGEにかけ、銀染色試薬(銀染色「第一」(商品名)、第一化学薬品株式会社製)を用いて染色した(図15)。これにより、IはFab(H鎖に由来する27kDaタンパク質とL鎖である27kDaタンパク質より構成される)、IIはFc(H鎖に由来する30kDaタンパク質のダイマーで構成される)、IIIは部分消化抗体(H鎖である60kDaタンパク質とH鎖に由来する30kDaタンパク質とL鎖である27kDaタンパク質で構成される)、IVは未消化抗体(H鎖である60kDaタンパク質のダイマーとL鎖である27kDaタンパク質のダイマーで構成される)と同定され、抗体に由来する各フラグメントの分離が可能であることが示された。 A HiTrap column on which compound 286 prepared by the method described in Example 2 was immobilized was attached to AKTAprime plus (trade name) (a chromatography device manufactured by GE Healthcare Biosciences), and 20 mL of the equilibration buffer was passed through. Liquid and equilibrate. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, 10 mL of equilibration buffer was passed, 1.2 mg (OD 280 = 1.7) of the papain-treated antibody was added, and passed through the column. Further, after 10 mL of the equilibration buffer was passed, linear concentration gradient chromatography on sodium sulfate from the equilibration buffer to 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was performed. The elution of the protein from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm, and the eluate was fractionated by 1 mL. The result of this chromatography is shown in FIG. In addition, 5 μL of each of the seventh, 29th, 39th, and 43rd fractions (represented as I, II, III, and IV, respectively) was subjected to SDS-PAGE containing 15% acrylamide under reducing conditions to obtain a silver staining reagent (silver staining It dye | stained using "1st" (brand name), the Dai-ichi Chemical Co., Ltd. product (FIG. 15). Thus, I is Fab (composed of 27 kDa protein derived from H chain and 27 kDa protein which is L chain), II is Fc (composed of dimer of 30 kDa protein derived from H chain), and III is partial digestion An antibody (consisting of a 60 kDa protein that is an H chain, a 30 kDa protein derived from the H chain, and a 27 kDa protein that is an L chain), and an IV is an undigested antibody (a dimer of an 60 kDa protein that is an H chain and an 27 kDa protein that is an L chain) It was shown that each fragment derived from an antibody can be separated.

実施例8 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その1)
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物286が127μmol/mL(gel)固定化されていることを確認した。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物286が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
Example 8 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 1)
Compound 286 (102 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), buffer (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 8 mL), triethylamine (90 μL, 0.6 mmol) were added to the centrifuge tube to obtain compound 286. After confirming dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, the compound 286 was 127 μmol / It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the obtained Toyopearl gel was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride, pH 8). .3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 286 was immobilized. Further, when the compound 286 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 286 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.

実施例9 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その2)
遠沈管に化合物329(107mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(2.4mL)、水(5.6mL)を添加して化合物329が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物329を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物329が81μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物329が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物329を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物329は残存していないことが確認された。
Example 9 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 2)
Compound 329 (107 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution (2.4 mL), and water (5.6 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 329 was dissolved, and then 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 24 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 By quantifying the remaining compound 329 at PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), compound 329 was found to be 81 μmol / mL (gel) in epoxy toyopearl. It was confirmed that it was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 329 was immobilized. Moreover, when the compound 329 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 329 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例10 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その3)
遠沈管に化合物286(30mg、88μmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.1mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(2.4mL)、緩衝液(組成:0.1M NaHPO−NaHPO、pH7.0;2.5mL)、トリエチルアミン(30μL、0.2mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、3mLのホルミルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、ホルミル基含量:65μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから30分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体(250μL、2.5mmol)を添加し、さらに165rpmで2.5時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、化合物286が19μmol/mL(gel)固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
Example 10 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 3)
Compound 286 (30 mg, 88 μmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.1 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (2.4 mL), buffer (composition: 0.1 M Na 2 HPO 4 —NaH 2 PO 4 , pH 7.0; 2.5 mL), triethylamine (30 μL, 0.2 mmol) were added to the centrifuge tube. After confirming that compound 286 was dissolved, 3 mL of formyl toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, formyl group content: 65 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 25 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm. 30 minutes after the start of stirring and shaking, borane-pyridine complex (250 μL, 2.5 mmol) was added to the centrifuge tube, and the mixture was further stirred and shaken at 165 rpm for 2.5 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, compound 286 was 19 μmol / mL (gel) An immobilized formyl toyopearl gel was obtained.

実施例11 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その4)
遠沈管に化合物320(111mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.6mL)、水(7.4mL)を添加して化合物320が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV254nm)にて残存する化合物320を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物320が176μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液(溶媒は水)、pH8.3;5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物320が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物320を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物320は残存していないことが確認された。
Example 11 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 4)
Compound 320 (111 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution (0.6 mL), and water (7.4 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 320 was dissolved, and then 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 24 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV254 nm), by quantifying the remaining compound 320, the compound 320 was 176 μmol / mL in Epoxy Toyopearl. (Gel) It was confirmed to be immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M aqueous sodium chloride solution ( The solvent was water), pH 8.3; 5 mL). The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 320 was immobilized. Moreover, when the compound 320 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 320 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例12 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その5)
遠沈管に化合物384(112mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.9mL)、水(7.1mL)を添加して化合物384が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物384を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物384が126μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物384が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物384を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物384は残存していないことが確認された。
Example 12 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 5)
Compound 384 (112 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution (0.9 mL), and water (7.1 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 384 was dissolved, and then 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 24 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 384, the compound 384 was 126 μmol / It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 384 was immobilized. Moreover, when the compound 384 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 384 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例13 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その6)
遠沈管に化合物423(111mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.9mL)、水(7.1mL)を添加して化合物423が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物423を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物423が114μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物423が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物423を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物423は残存していないことが確認された。
Example 13 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 6)
Compound 423 (111 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution (0.9 mL), and water (7.1 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 423 was dissolved, and then 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 24 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying remaining compound 423, compound 423 was found to be 114 μmol / epoxy toyopearl. It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice each with ethanol (5 mL) and water (5 mL) to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 423 was immobilized. Moreover, when the compound 423 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 423 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例14 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その7)
遠沈管に化合物283(94mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物283が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物283を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物283が102μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物283が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物283を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物283は残存していないことが確認された。
Example 14 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 7)
Compound 283 (94 mg, 0.3 mmol) was measured in a centrifuge tube, and 0.3 mL of 1,2-dimethoxybenzene in acetonitrile (1 mmol / mL) was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), buffer (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 8 mL), triethylamine (90 μL, 0.6 mmol) were added to the centrifuge tube to add compound 283. After confirming dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying remaining compound 283, compound 283 was found to be 102 μmol / epoxy toyopearl. It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 283 was immobilized. Moreover, when the compound 283 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 283 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例15 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その8)
遠沈管に化合物284(98mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物284が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物284を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物284が117μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物284が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物284を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物284は残存していないことが確認された。
Example 15 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 8)
Compound 284 (98 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of an acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), buffer (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 8 mL), triethylamine (90 μL, 0.6 mmol) were added to the centrifuge tube to obtain compound 284. After confirming dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 284, the compound 284 was added to the epoxy toyopearl at 117 μmol / It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 284 was immobilized. Moreover, when the compound 284 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 284 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例16 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その9)
遠沈管に化合物292(191mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;4mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物292が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製;エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物292を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物292が56μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物292が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物292を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物292は残存していないことが確認された。
Example 16 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (No. 9)
Compound 292 (191 mg, 0.5 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.5 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.5 mL), buffer solution (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 4 mL), triethylamine (140 μL, 1.0 mmol) were added to the centrifuge tube, and compound 292 was added. After confirming dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation; epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm) by quantifying the remaining compound 292, the compound 292 was found to be 56 μmol / mol in the epoxy toyopearl. It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 292 was immobilized. Moreover, when the compound 292 which remains in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid was measured by the high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 292 does not remain in the solution which combined the blocking solution and the washing | cleaning liquid.

実施例17 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その10)
遠沈管に化合物364(193mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物364が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物364を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物364が257μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物364が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物364を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物364は残存していないことが確認された。
Example 17 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 10)
Compound 364 (193 mg, 0.5 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.5 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.5 mL), buffer solution (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 8 mL), triethylamine (140 μL, 1.0 mmol) were added to the centrifuge tube to obtain compound 364. After confirmation of dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 364, epoxide Toyopearl was compounded with 257 μmol / It was confirmed that mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5 M monoethanolamine, 0.5 M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain an epoxy toyopearl gel in which compound 364 was immobilized. Further, when the compound 364 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 364 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.

実施例18 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その11)
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;4mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのトレシルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、トレシルトヨパールに化合物286が94μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のトレシル基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3;5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存トレシル基をトリスヒドロキシメチルアミノメタンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物286が固定化されたトレシルトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
Example 18 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 11)
Compound 286 (102 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), buffer (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 4 mL), triethylamine (90 μL, 0.6 mmol) were added to the centrifuge tube to obtain compound 286. After confirming dissolution, 0.3 g of Tresyl Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, 94 μmol of compound 286 was added to tresyl toyopearl. / ML (gel) was confirmed to be immobilized. Furthermore, in order to block the unreacted tresyl group in the Toyopearl gel obtained by the above operation, the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M trishydroxymethylaminomethane hydrochloride, 0.5M Sodium chloride aqueous solution, pH 8.3; 5 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining tresyl group in the gel was blocked with trishydroxymethylaminomethane by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain a tresyl toyopearl gel in which compound 286 was immobilized. Further, when the compound 286 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 286 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.

実施例19 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その12)
遠沈管に化合物329(30mg、84μmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.1mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(2.4mL)、緩衝液(組成:0.1M NaHPO−NaHPO、pH7.0;2.5mL)、トリエチルアミン(30μL、0.2mmol)を添加して化合物329が溶解したことを確認したのち、3mLのホルミルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、ホルミル基含量:65μmol/mL(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから30分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体(250μL、2.5mmol)を添加し、さらに165rpmで2.5時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物329を定量し、化合物329が14μmol/mL(gel)固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
Example 19 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 12)
Compound 329 (30 mg, 84 μmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.1 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (2.4 mL), buffer (composition: 0.1 M Na 2 HPO 4 —NaH 2 PO 4 , pH 7.0; 2.5 mL), triethylamine (30 μL, 0.2 mmol) were added to the centrifuge tube. After confirming that compound 329 was dissolved, 3 mL of formyl toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, formyl group content: 65 μmol / mL (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 25 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm. 30 minutes after the start of stirring and shaking, borane-pyridine complex (250 μL, 2.5 mmol) was added to the centrifuge tube, and the mixture was further stirred and shaken at 165 rpm for 2.5 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), the remaining compound 329 was quantified, and compound 329 was immobilized at 14 μmol / mL (gel) The obtained formyl toyopearl gel was obtained.

実施例20 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その13)
遠沈管に化合物286(170mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで63時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物286が167μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。この化合物286固定化エポキシトヨパールゲル中の窒素原子含有量及び硫黄原子含有量を測定したところ、窒素原子が1.2重量%、硫黄原子が0.89重量%含まれることを確認した。
Example 20 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 13)
Compound 286 (170 mg, 0.5 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.5 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.5 mL), buffer solution (composition: 0.2 M NaHCO 3 , 0.5 M NaCl, pH 8.3; 8 mL), triethylamine (140 μL, 1.0 mmol) were added to the centrifuge tube, and compound 286 was added. After confirming dissolution, 0.3 g of Epoxy Toyopearl (trade name) gel (manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 63 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, epoxide Toyopearl was compounded with 167 μmol / It was confirmed that mL (gel) was immobilized. When the nitrogen atom content and sulfur atom content in this compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel were measured, it was confirmed that 1.2% by weight of nitrogen atoms and 0.89% by weight of sulfur atoms were contained.

実施例21 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その14)
遠沈管に化合物358(134mg、0.4mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.4mL添加した。次いで、遠沈管に1,4−ジオキサン(10mL)、トリエチルアミン(120μL、0.9mmol)を添加して化合物358が溶解したことを確認したのち、2.5mLのトヨパールCM−650S(商品名)ゲル(東ソー株式会社製;イオン交換容量:0.1mol/L(gel))と1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(154mg、0.8mmol)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで14時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを1,4−ジオキサン(10mL)で2回洗浄したのち、洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=45/55;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV254nm)にて残存する化合物358を定量し、化合物358が16μmol/mL(gel)固定化されたトヨパールCM−650Sゲルを得た。
Example 21 Immobilization of Thiazole Derivative on Vinyl Polymer Gel (Part 14)
Compound 358 (134 mg, 0.4 mmol) was weighed in a centrifuge tube, and 0.4 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, 1,4-dioxane (10 mL) and triethylamine (120 μL, 0.9 mmol) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 358 was dissolved, and then 2.5 mL of Toyopearl CM-650S (trade name) gel (Tosoh Corporation; ion exchange capacity: 0.1 mol / L (gel)) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (154 mg, 0.8 mmol) were added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 25 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 14 hours. After completion of the reaction, Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the Toyopearl gel on the glass filter was washed twice with 1,4-dioxane (10 mL), and then the washing liquid (composition: 0.05% trifluoroacetic acid-containing CH 3 CN / 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution = 45 / 55; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: 0.05% trifluoroacetic acid The remaining compound 358 was quantified with CH 3 CN / 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV254 nm), and compound 358 was immobilized at 16 μmol / mL (gel). Toyopearl CM-650S gel was obtained.

実施例22 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その1)
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウヒト血漿由来免疫グロブリン製剤(化血研製)0.5mg(OD280=0.7)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図16に示し、このクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表47に示す。免疫グロブリンはHiTrapカラムを用いたとき(図1参照)よりもいくぶん幅広く20番目から50番目までの画分に溶出していた。
Example 22 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-immobilized Vinyl Polymer Gel (Part 1)
1 mL of Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 8 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). Attached to a chromatography device manufactured by Care Bioscience Co., Ltd.) and equilibrated by passing 20 mL of the equilibration buffer. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, 10 mL of equilibration buffer was passed through, and 0.5 mg (OD 280 = 0.7) of a human plasma-derived immunoglobulin preparation (manufactured by Kakenken) dissolved in the same buffer Was added and passed through the column. Further, after 10 mL of the equilibration buffer was passed, linear concentration gradient chromatography on sodium sulfate from the equilibration buffer to 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was performed. Elution of the immunoglobulin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography carried out using Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel are shown in FIG. The immunoglobulin eluted in the 20th to 50th fractions somewhat wider than when the HiTrap column was used (see FIG. 1).

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.

実施例23 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その2)
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.7)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図17に示し、このクロマトグラフィーにおけるヒト化モノクローナル抗体の回収率を表48に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出し、免疫グロブリン(図16参照)と比べていくぶん後ろの位置で溶出していた。
Example 23 Adsorption / desorption of protein using thiazole derivative-immobilized vinyl polymer gel (Part 2)
1 mL of Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 8 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). (Chromatography apparatus manufactured by Care Bioscience Co., Ltd.), and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was passed and equilibrated. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min. After passing 10 mL of the equilibration buffer, 0.5 mg of a humanized monoclonal antibody (OD 280 = 0.7) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). Elution of the humanized monoclonal antibody from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. FIG. 17 shows the results of chromatography performed using Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel, and Table 48 shows the recovery rates of humanized monoclonal antibodies in this chromatography. The humanized monoclonal antibody eluted in the 30th to 45th fractions, and was eluted at a position somewhat behind the immunoglobulin (see FIG. 16).

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.

実施例24 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その3)
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図18に示し、このクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表49に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これは免疫グロブリン(図16参照)とは異なる画分であり、HiTrapカラムを用いたとき(図1及び図7参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体と固定化するマトリックスをアガロースからトヨパールに変更しても同様な免疫グロブリンの分離性能を有していることが示された。
Example 24 Adsorption / desorption of protein using thiazole derivative-immobilized vinyl polymer gel (Part 3)
1 mL of Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 8 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). (Chromatography apparatus manufactured by Care Bioscience Co., Ltd.), and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was passed and equilibrated. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, and after 10 mL of the equilibration buffer was passed, 0.5 mg of bovine serum albumin (OD 280 = 0.3) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). The elution of bovine serum albumin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel are shown in FIG. 18, and the recovery rate of bovine serum albumin in this chromatography is shown in Table 49. Bovine serum albumin elutes up to the 10th fraction, which is a fraction different from that of immunoglobulin (see FIG. 16), and results similar to those when using HiTrap columns (see FIG. 1 and FIG. 7). became. From this, it was shown that even when the matrix to be immobilized with the thiazole derivative was changed from agarose to Toyopearl, the same immunoglobulin separation performance was obtained.

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.

実施例25 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その4)
実施例9に記載の方法にて調製した化合物329固定化エポキシトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.7)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図19に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表50に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出と、化合物286をチアゾール誘導体として用いたとき(図17参照)と同じ画分の位置で溶出していた。
Example 25 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-immobilized Vinyl Polymer Gel (Part 4)
Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 9 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). A chromatography device manufactured by Bioscience Co., Ltd.) and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer solution (pH 7.5) was passed through and equilibrated. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min. After passing 10 mL of the equilibration buffer, 0.5 mg of a humanized monoclonal antibody (OD 280 = 0.7) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). Elution of the humanized monoclonal antibody from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. FIG. 19 shows the results of chromatography performed using Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel, and Table 50 shows the recovery rates of humanized monoclonal antibodies in this chromatography. The humanized monoclonal antibody eluted in the 30th to 45th fractions and eluted in the same fractional position as when compound 286 was used as the thiazole derivative (see FIG. 17).

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.

実施例26 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その5)
実施例9に記載の方法にて調製した化合物329固定化エポキシトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図20に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表51に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体(図19参照)とは異なる画分であり、化合物286をチアゾール誘導体として用いたとき(図18参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体を化合物286から化合物329に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
Example 26 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-immobilized Vinyl Polymer Gel (Part 5)
Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 9 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). A chromatography device manufactured by Bioscience Co., Ltd.) and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer solution (pH 7.5) was passed through and equilibrated. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, and after 10 mL of the equilibration buffer was passed, 0.5 mg of bovine serum albumin (OD 280 = 0.3) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). The elution of bovine serum albumin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. FIG. 20 shows the results of chromatography performed using Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel, and Table 51 shows the recovery rate of bovine serum albumin by this chromatography. Bovine serum albumin elutes by the 10th fraction, which is a fraction different from the humanized monoclonal antibody (see FIG. 19) and is the same as when compound 286 was used as the thiazole derivative (see FIG. 18). The result was. From this, it was shown that even when the thiazole derivative was changed from compound 286 to compound 329, the protein separation performance was similar.

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.

実施例27 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その6)
実施例10に記載の方法にて調製した化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを1mL TRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.8)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図21に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表52に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出と、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき(図17参照)と同じ画分の位置で溶出していた。
Example 27 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-immobilized Vinyl Polymer Gel (Part 6)
Compound 286-immobilized formyltoyopearl gel prepared by the method described in Example 10 was packed into a 1 mL TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). A chromatography device manufactured by Care Bioscience Co., Ltd.) and equilibrated with 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min. After passing 10 mL of the equilibration buffer, 0.5 mg of humanized monoclonal antibody (OD 280 = 0.8) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). Elution of the humanized monoclonal antibody from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using Compound 286-immobilized formyl toyopearl gel are shown in FIG. 21, and the recovery rate of the humanized monoclonal antibody of this chromatography is shown in Table 52. The humanized monoclonal antibody eluted in the 30th to 45th fractions, and eluted in the same fractional position as when epoxytoyopearl was used for immobilization of thiazole derivatives (see FIG. 17).

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 286-immobilized formyl toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties were not changed by repeated use.

実施例28 チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着(その7)
実施例10に記載の方法にて調製した化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図22に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表53に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体(図21参照)とは異なる画分であり、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき(図18参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体の固定化に用いるマトリックスの有する活性化基をエポキシ基からホルミル基に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
Example 28 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-immobilized Vinyl Polymer Gel (Part 7)
Compound 286-immobilized formyltoyopearl gel prepared by the method described in Example 10 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). A chromatography device manufactured by Bioscience Co., Ltd.) and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer solution (pH 7.5) was passed through and equilibrated. AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min, and after 10 mL of the equilibration buffer was passed, 0.5 mg of bovine serum albumin (OD 280 = 0.3) dissolved in the same buffer was added. Further, 10 mL of the equilibration buffer was passed through, followed by concentration gradient chromatography of sodium sulfate using 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). The elution of bovine serum albumin from the column was detected by monitoring the absorbance at 280 nm. The eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate. The results of chromatography performed using Compound 286-immobilized formyl toyopearl gel are shown in FIG. 22, and the recovery rate of bovine serum albumin by this chromatography is shown in Table 53. Bovine serum albumin elutes by the 10th fraction, which is a fraction different from the humanized monoclonal antibody (see FIG. 21), and when epoxytoyopearl was used for immobilization of thiazole derivatives (see FIG. 18). ) And similar results. From this, it was shown that even if the activation group of the matrix used for immobilizing the thiazole derivative was changed from an epoxy group to a formyl group, the same protein separation performance was obtained.

Figure 2009244252
吸脱着操作後には100mM 水酸化ナトリウムを10mL通液してカラムの再生を行なった。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
Figure 2009244252
After the adsorption / desorption operation, 10 mL of 100 mM sodium hydroxide was passed through to regenerate the column. Compound 286-immobilized formyl toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties were not changed by repeated use.

実施例29 チアゾール誘導体のキトサンゲルへの固定化
水で洗浄した5mLの活性化キトパールK−66(商品名)ゲル(富士紡ホールディングス株式会社製;スクシンイミドオキシカルボニル基含量:15μmol/mL(gel))を遠沈管に計り取り、これにDMSOを10mL添加した。次に化合物286のDMSO溶液(0.25M)を900μL、1Mの1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液を225μL、トリエチルアミンを68μL、順次添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで3時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでキトパールゲルと反応溶液を分離し、グラスフィルター上のキトパールゲルをジメチルスルホキシド(5mL)、洗浄液(組成:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5;15mL)で洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CHCN/MeOH/50mM NHPO=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量し、化合物286が5.0μmol/mL(gel)固定化されているキトパールゲルを得た。
Example 29 Immobilization of thiazole derivatives on chitosan gel 5 mL of activated chitopearl K-66 (trade name) gel washed with water (Fujibo Holdings Co., Ltd .; succinimideoxycarbonyl group content: 15 μmol / mL (gel)) Was measured into a centrifuge tube, and 10 mL of DMSO was added thereto. Next, 900 μL of a DMSO solution of compound 286 (0.25M), 225 μL of 1M acetonitrile solution of 1,2-dimethoxybenzene, and 68 μL of triethylamine were sequentially added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 3 hours. After completion of the reaction, the chitopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter, and the chitopearl gel on the glass filter was washed with dimethyl sulfoxide (5 mL) and a washing solution (composition: CH 3 CN / MeOH / 50 mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5). ; 15 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: CH 3 CN / MeOH / 50mM NH 4 H 2 PO 4 = 4/1/5, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), the remaining compound 286 was quantified, and compound 286 was 5.0 μmol / mL (gel) An immobilized chitopearl gel was obtained.

実施例30 チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化(その15)
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、1M 水酸化ナトリウム水溶液(1.2mL)、水(6.8mL)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.5gのBIOACT−EPO(商品名)ゲル(昭和電工株式会社製、エポキシ基含量:200μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで43時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでBIOACT−EPOゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のBIOACT−EPOゲルを洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、BIOACT−EPOゲルに化合物286が46μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたBIOACT−EPOゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたBIOACT−EPOゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:アセトニトリル;2mL、0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);4mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで23時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてBIOACT−EPOゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄することで、化合物286が固定化されたBIOACT−EPOゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
Example 30 Immobilization of thiazole derivative on vinyl polymer gel (Part 15)
Compound 286 (102 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube, and 0.3 mL of acetonitrile solution (1 mmol / mL) of 1,2-dimethoxybenzene was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 1M aqueous sodium hydroxide solution (1.2 mL), and water (6.8 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 286 was dissolved, and then 0.5 g of BIOACT- EPO (trade name) gel (manufactured by Showa Denko KK, epoxy group content: 200 μmol / g (gel)) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 43 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and the BIOACT-EPO gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the BIOACT-EPO gel on the glass filter was washed twice with a washing liquid (composition: 0.05% trifluoroacetic acid-containing CH 3 CN / 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution = 1/1; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: 0.05% trifluoroacetic acid-containing CH 3 CN /0.05% aqueous trifluoroacetic acid = 1/1, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, the compound 286 was found on the BIOACT-EPO gel. It was confirmed that 46 μmol / mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block unreacted epoxy groups in the BIOACT-EPO gel obtained by the above operation, the obtained BIOACT-EPO gel was placed in a centrifuge tube (blocking solution (composition: acetonitrile; 2 mL, 0.5 M mono). Ethanolamine, 0.5M aqueous sodium chloride solution, pH 8.3 (solvent is water); 4 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 23 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and the BIOACT-EPO gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain a BIOACT-EPO gel in which compound 286 was immobilized. Further, when the compound 286 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 286 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.

実施例31 チアゾール誘導体のスチレン−ジビニルベンゼン共重合体ゲルへの固定化
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、1M 水酸化ナトリウム水溶液(1.2mL)、水(6.8mL)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのPOROS−EP(商品名)ゲル(アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製、エポキシ基含量:非開示)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで36時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでPOROS−EPゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のPOROS−EPゲルを洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CHCN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、POROS−EPゲルに化合物286が91μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたPOROS−EPゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたPOROS−EPゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:アセトニトリル;2mL、0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);4mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで6時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてPOROS−EPゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄することで、化合物286が固定化されたPOROS−EPゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
Example 31 Immobilization of thiazole derivative on styrene-divinylbenzene copolymer gel Compound 286 (102 mg, 0.3 mmol) was weighed into a centrifuge tube and 1,2-dimethoxybenzene in acetonitrile (1 mmol / mL) was added to 0. 3 mL was added. Next, acetonitrile (1.7 mL), 1M aqueous sodium hydroxide solution (1.2 mL), and water (6.8 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 286 was dissolved, and then 0.3 g of POROS- EP (trade name) gel (Applied Biosystems Japan Co., Ltd., epoxy group content: not disclosed) was added. The centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 36 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and the POROS-EP gel and the reaction solution were separated with a glass filter. Next, the POROS-EP gel on the glass filter was washed twice with a washing liquid (composition: 0.05% trifluoroacetic acid-containing CH 3 CN / 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution = 1/1; 10 mL). The combined reaction solution and washing solution, high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: 0.05% trifluoroacetic acid-containing CH 3 CN /0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution = 1/1, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm), by quantifying the remaining compound 286, compound 286 was found on the POROS-EP gel. It was confirmed that 91 μmol / mL (gel) was immobilized. Furthermore, in order to block the unreacted epoxy group in the POROS-EP gel obtained by the above operation, the obtained POROS-EP gel was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: acetonitrile; 2 mL, 0.5M mono). Ethanolamine, 0.5M aqueous sodium chloride solution, pH 8.3 (solvent is water); 4 mL) was added. The centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 6 hours. After completion of the reaction, acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and the POROS-EP gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain a POROS-EP gel in which compound 286 was immobilized. Further, when the compound 286 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 286 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.

実施例32 チアゾール誘導体のセンサーチップへの固定化
化合物286を4mg/mLになるようにDMSOに溶解し、これを10mMホウ酸−1M NaCl緩衝液(pH8.5)で8倍に希釈して0.5mg/mL濃度の化合物溶液を調製した。BIACOREセンサーチップCM5(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)をBIACORE2000(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に装着し、BIACOREアミンカップリングキット(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いてセンサーチップCM5上のカルボキシメチルデキストランをN−ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。これに前記0.5mg/mL濃度の化合物286溶液を25℃で5分間接触させることにより固定化を行なった。その後1M モノエタノールアミン水溶液を用いて未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングを行なった。一連の固定化過程はセンサーチップCM5表面のSPR共鳴単位(RU)の増加によってモニタリングした。
Example 32 Immobilization of thiazole derivative on sensor chip Compound 286 was dissolved in DMSO to 4 mg / mL, and this was diluted 8-fold with 10 mM boric acid-1 M NaCl buffer (pH 8.5) to obtain 0 A compound solution having a concentration of 5 mg / mL was prepared. BIACORE sensor chip CM5 (trade name, manufactured by GE Healthcare Biosciences Co., Ltd.) is mounted on BIACORE 2000 (trade name, manufactured by GE Healthcare Biosciences Co., Ltd.), and BIACORE amine coupling kit (trade name, GE Healthcare Biosciences, Inc.) Was used to activate carboxymethyldextran on sensor chip CM5 with N-hydroxysuccinimide (NHS). Immobilization was performed by contacting the compound 286 solution having a concentration of 0.5 mg / mL at 25 ° C. for 5 minutes. Thereafter, unreacted succinimideoxycarbonyl groups were blocked using a 1M monoethanolamine aqueous solution. A series of immobilization processes was monitored by increasing SPR resonance units (RU) on the surface of the sensor chip CM5.

実施例33 BIACORE(商品名)を用いた親和性解析
実施例32によって調製したリガンド−マトリックス複合体(化合物286を固定化したセンサーチップCM5)に対して、HBS−EP緩衝液(組成:10mM HEPES(pH7.4),0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005% SP20)で希釈したマウスIgM(10μg/mL、試料A)、マウスIgG(320μg/mL、試料B)、ニワトリIgY(400μg/mL、試料C)、ウシ血清アルブミン(320μg/mL、試料D)をそれぞれ120秒間通液(結合相)し、その後280秒間HBS−EP緩衝液で置換(解離相)して親和性を解析した。またそれぞれの分析終了ごとに10mM水酸化ナトリウムを80秒間通液してセンサーチップCM5の再生を行った。化合物286を固定化したセンサーチップCM5のセンサーグラムを図23に示す。また解離時間240秒後の残存RUを表54に示す。
Example 33 Affinity analysis using BIACORE (trade name) The HBS-EP buffer (composition: 10 mM HEPES) was applied to the ligand-matrix complex (sensor chip CM5 on which compound 286 was immobilized) prepared in Example 32. (PH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% SP20) diluted mouse IgM (10 μg / mL, sample A), mouse IgG (320 μg / mL, sample B), chicken IgY (400 μg / mL, sample C) and bovine serum albumin (320 μg / mL, sample D) were each passed through for 120 seconds (binding phase), and then replaced with HBS-EP buffer (dissociation phase) for 280 seconds to analyze the affinity. . At the end of each analysis, 10 mM sodium hydroxide was passed for 80 seconds to regenerate the sensor chip CM5. FIG. 23 shows a sensorgram of the sensor chip CM5 on which the compound 286 is immobilized. Table 54 shows the residual RU after 240 seconds of dissociation time.

Figure 2009244252
図23及び表54より、マウスIgM(試料A)が他の試料(試料B、C、D)と比較し、化合物286を固定化したセンサーチップCM5に対する親和性が高いことが示された。よって、化合物286を固定化したデキストランゲルが、マウスIgMを特異的に吸着することが判明した。
Figure 2009244252
FIG. 23 and Table 54 show that mouse IgM (sample A) has a higher affinity for the sensor chip CM5 on which compound 286 is immobilized, as compared with other samples (samples B, C, and D). Therefore, it was found that dextran gel immobilized with compound 286 specifically adsorbs mouse IgM.

実施例34 チアゾール誘導体のセルロースゲルへの固定化
0.1M N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液(pH9.0)/アセトニトリル=1/1の混合液を調製し、これを溶媒として、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に3.0mLのセルファインホルミル(商品名)ゲル(チッソ株式会社製、ホルミル基を10から15μmol/mL含有)をとり、そこに前記の化合物486を含んだ溶液を5mL加え、卓上振盪機を用いて、30分間、25℃、160rpmで振盪した後、ボラン−ピリジン複合体(0.17mL、1.7mmol)を添加し、同じ条件で16時間振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、セルファインホルミルゲルに化合物486が5μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
Example 34 Immobilization of thiazole derivative on cellulose gel A mixture of 0.1 M N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid buffer (pH 9.0) / acetonitrile = 1/1 was prepared, and this was used as a solvent. Compound 486 and sodium hydroxide were added to 41 mM each. Take 3.0 mL of Celfine Formyl (trade name) gel (manufactured by Chisso Corp., containing 10-15 μmol / mL formyl group) in a centrifuge tube, add 5 mL of the solution containing the compound 486 to it, and shake on the table. After shaking for 30 minutes at 25 ° C. and 160 rpm, borane-pyridine complex (0.17 mL, 1.7 mmol) was added and shaken for 16 hours under the same conditions. The reaction mixture was filtered through a glass filter, washed once with 5 mL of acetonitrile, and then 4 times with 5 mL of a washing solution (acetonitrile / water / trifluoroacetic acid = 45/55 / 0.05). Together these filtrate and washings high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: same composition as the cleaning solution, flow rate: 1 mL / Min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm) was quantified to confirm that compound 486 was immobilized on Serfine Formyl gel at 5 μmol / mL (gel).

実施例35 チアゾール誘導体のアクリルアミド−ビニル共重合体ゲルへの固定化
0.1M N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液(pH9.0)/アセトニトリル=1/1の混合溶媒に、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に0.3gのProfinity Epoxide(商品名)ゲル(バイオラッド株式会社製、エポキシ基を50から132μmol/g含有)をとり、そこに前記の化合物486を含んだ溶液を5mL加え、卓上振盪機を用いて、15時間、40℃、160rpmで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、Profinity Epoxideゲルに化合物486が4μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
Example 35 Immobilization of Thiazole Derivative on Acrylamide-Vinyl Copolymer Gel Compound 486 in a mixed solvent of 0.1M N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid buffer (pH 9.0) / acetonitrile = 1/1 And sodium hydroxide were added to 41 mM each. Take 0.3 g of Profitity Epoxide (trade name) gel (manufactured by Bio-Rad Co., Ltd., containing 50 to 132 μmol / g epoxy group) in a centrifuge tube, add 5 mL of the solution containing the compound 486 to it, and shake on the table The mixture was shaken for 15 hours at 40 ° C. and 160 rpm. The reaction mixture was filtered through a glass filter, washed once with 5 mL of acetonitrile, and then 4 times with 5 mL of a washing solution (acetonitrile / water / trifluoroacetic acid = 45/55 / 0.05). Together these filtrate and washings high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: same composition as the cleaning solution, flow rate: 1 mL / Min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm) was quantified to confirm that compound 486 was immobilized on Profinity Epoxide gel at 4 μmol / mL (gel).

実施例36 チアゾール誘導体のシリカゲルへの固定化
2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸緩衝液(0.1M、pH8.0)/アセトニトリル=1/1の混合溶媒に、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に1.3gのM.S.GEL Epoxy−D−50−1000AW(商品名、AGCエスアイテック株式会社製、エポキシ基を73μmol/g含有)をとり、そこに、6.1mLの前記の溶液を加え、卓上振盪機を用いて、4日間、40℃、160rpmで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80T(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、M.S.GEL Epoxy−D−50−1000AWに化合物486が22μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
Example 36 Immobilization of thiazole derivative on silica gel 2-hydroxy-3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid buffer (0.1 M, pH 8.0) / acetonitrile = 1 / Compound 486 and sodium hydroxide were each added to 1 mixed solvent so that it might become 41 mM. 1.3 g of M.p. S. GEL Epoxy-D-50-1000AW (trade name, manufactured by AGC S-Tech Co., Ltd., containing 73 μmol / g epoxy group), 6.1 mL of the above solution is added thereto, and using a desktop shaker, The mixture was shaken at 40 ° C. and 160 rpm for 4 days. The reaction mixture was filtered through a glass filter, washed once with 5 mL of acetonitrile, and then 4 times with 5 mL of a washing solution (acetonitrile / water / trifluoroacetic acid = 45/55 / 0.05). Together these filtrate and washings high performance liquid chromatography (Column: manufactured by Tosoh Corporation TSK-gel ODS-80T M (internal diameter 4.6 mm × length 15cm), eluent: same composition as the cleaning solution, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm). S. It was confirmed that 22 μmol / mL (gel) of Compound 486 was immobilized on GEL Epoxy-D-50-1000AW.

実施例37 4−メチル−N−[4−メチル−5−{3−(2−プロペニルカルボニルアミノ)プロピル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化(その1)
200mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(159mg,1.61mmol)、ペンタメチルジエチレントリアミン(419mg,2.42mmol)、メタノール(19.5mL)、及び2−ヒドロキシエチルメタクリレート(19.5mL,161mmol)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に1.4gのクロロメチル化ポリスチレンビーズ(渡辺化学工業株式会社製、クロロメチル基含量:1.15meq/g)を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を40℃で12時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをメタノール(200mL)で2回洗浄した後、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(1L)で3回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)修飾ポリスチレンビーズ(18.4g、グラフト率:1200%)を得た。なおここでグラフト率は、
グラフト率=(反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量)/(反応前のポリスチレンビーズ重量)
と定義する。
Example 37 Immobilization of 4-methyl-N- [4-methyl-5- {3- (2-propenylcarbonylamino) propyl} thiazol-2-yl] benzamide on polystyrene beads (Part 1)
In a 200 mL eggplant-shaped flask, copper (I) chloride (159 mg, 1.61 mmol), pentamethyldiethylenetriamine (419 mg, 2.42 mmol), methanol (19.5 mL), and 2-hydroxyethyl methacrylate (19.5 mL, 161 mmol) Were sequentially added and stirred at room temperature to confirm that the reaction mixture was uniformly dissolved. Next, 1.4 g of chloromethylated polystyrene beads (Watanabe Chemical Co., Ltd., chloromethyl group content: 1.15 meq / g) was added to the reaction solution, and dissolved oxygen in the reaction solution was removed by freeze degassing. After that, the reaction vessel was stirred at 40 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, the polystyrene beads and the reaction solution were separated, and the polystyrene beads were washed twice with methanol (200 mL) and then washed three times with ethanol / 5% aqueous ammonia = 9/1 (v / v) (1 L). . After completion of the washing, the polystyrene beads and the washing liquid were separated, and then vacuum-dried to obtain pale blue poly (2-hydroxyethyl methacrylate) -modified polystyrene beads (18.4 g, graft ratio: 1200%). Here, the graft ratio is
Graft rate = (weight of polystyrene beads after reaction−weight of polystyrene beads before reaction) / (weight of polystyrene beads before reaction)
It is defined as

次に50mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(22mg,0.22mmol)、1,4,8,11−テトラメチル−1,4,8,11−テトラアザテトラデカン(56mg,0.22mmol)、参考例2で合成した4−メチル−N−[4−メチル−5−{3−(2−プロペニルカルボニルアミノ)プロピル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(525mg,1.47mmol)、及び2−ブタノン/2−プロパノール=7/3(v/v)の混合溶媒(3mL)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に2.5gのポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を60℃で63時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール(300mL)で2回、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(300mL)で2回、DMF(200mL)で1回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄茶色のポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)修飾ポリスチレンビーズ(2.61g)を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均2分子結合しており、その当量は0.12meq/gであると見積られた。FT−IR,ν(cm−1,reflect):3440(br,O−H),2949(w),1720(s,C=O),1637(w,C=O),1450(m),1243(m),1149(s),1074(s)。 Next, copper (I) chloride (22 mg, 0.22 mmol), 1,4,8,11-tetramethyl-1,4,8,11-tetraazatetradecane (56 mg, 0.22 mmol) was placed in a 50 mL eggplant-shaped flask. 4-methyl-N- [4-methyl-5- {3- (2-propenylcarbonylamino) propyl} thiazol-2-yl] benzamide (525 mg, 1.47 mmol) synthesized in Reference Example 2, and 2- A mixed solvent (3 mL) of butanone / 2-propanol = 7/3 (v / v) was sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature to confirm that the reaction mixture was uniformly dissolved. Next, 2.5 g of poly (2-hydroxyethyl methacrylate) modified polystyrene beads were added to the reaction solution, dissolved oxygen in the reaction solution was removed by freeze degassing, and the reaction vessel was stirred at 60 ° C. for 63 hours. After completion of the reaction, the polystyrene beads and the reaction solution were separated, twice with ethanol (300 mL), twice with ethanol / 5% aqueous ammonia = 9/1 (v / v) (300 mL), and once with DMF (200 mL). Washed. After completion of the washing, the polystyrene beads and the washing liquid were separated, followed by vacuum drying to obtain light brown poly (2-hydroxyethyl methacrylate) modified polystyrene beads (2.61 g) to which a thiazole derivative was bound. As a result of calculating from the weight increase of the obtained polystyrene beads, it was estimated that an average of 2 molecules of thiazole derivatives were bonded to the end of the graft chain, and the equivalent was 0.12 meq / g. FT-IR, ν (cm −1 , reflect): 3440 (br, O—H), 2949 (w), 1720 (s, C═O), 1637 (w, C═O), 1450 (m), 1243 (m), 1149 (s), 1074 (s).

実施例38 4−メチル−N−[4−メチル−5−{3−(2−プロペニルカルボニルアミノ)プロピル}チアゾール−2−イル]ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化(その2)
200mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(500mg,5.0mmol)、ペンタメチルジエチレントリアミン(1.30g,7.5mmol)、2−プロパノール(22mL)、及びアクリルアミド水溶液(組成:17.8g/22mL;250mmol)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に5.0gのクロロメチル化ポリスチレンビーズ(株式会社ペプチド研究所製、クロロメチル基含量:0.97meq/g)を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を80℃で18時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをエタノール(150mL)で洗浄した後、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(200mL)で2回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ(12.3g、グラフト率:146%)を得た。なおここでグラフト率は
グラフト率=(反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量)/(反応前のポリスチレンビーズ重量)
と定義する。
Example 38 Immobilization of 4-methyl-N- [4-methyl-5- {3- (2-propenylcarbonylamino) propyl} thiazol-2-yl] benzamide on polystyrene beads (Part 2)
In a 200 mL eggplant-shaped flask, copper (I) chloride (500 mg, 5.0 mmol), pentamethyldiethylenetriamine (1.30 g, 7.5 mmol), 2-propanol (22 mL), and an aqueous acrylamide solution (composition: 17.8 g / 22 mL). 250 mmol) was sequentially added and stirred at room temperature to confirm that the reaction mixture was uniformly dissolved. Next, 5.0 g of chloromethylated polystyrene beads (Peptide Laboratories, Inc., chloromethyl group content: 0.97 meq / g) was added to the reaction solution, and dissolved oxygen in the reaction solution was removed by freeze degassing. After that, the reaction vessel was stirred at 80 ° C. for 18 hours. After completion of the reaction, the polystyrene beads and the reaction solution were separated, and the polystyrene beads were washed with ethanol (150 mL), and then washed twice with ethanol / 5% aqueous ammonia = 9/1 (v / v) (200 mL). After completion of the washing, the polystyrene beads and the washing liquid were separated, and vacuum-dried to obtain a light blue polyacrylamide-modified polystyrene beads (12.3 g, graft ratio: 146%). Here, the graft ratio is graft ratio = (weight of polystyrene beads after reaction−weight of polystyrene beads before reaction) / (weight of polystyrene beads before reaction).
It is defined as

次に50mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(60mg,0.60mmol)、トリス(2−(ジメチルアミノ)エチル)アミン(208mg,0.9mmol)、参考例2で合成した4−メチル−N−[4−メチル−5−{3−(2−プロペニルカルボニルアミノ)プロピル}チアゾール−2−イル]ベンズアミド(1.07g,3.0mmol)、及び2−プロパノール/水=2/1(v/v)の混合溶媒(3mL)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に1.5gのポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を80℃で87時間撹拌した。反応終了後、反応溶液にエタノール(30mL)及び5%アンモニア水(5mL)を添加し、室温で1時間撹拌した。次にポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(50mL)で2回、DMF(250mL)で1回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄緑色のポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ(1.84g)を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均2分子結合しており、その当量は0.52meq/gであると見積られた。FT−IR,ν(cm−1,reflect):3336(br),2922(m),1654(s,C=O),1600(m),1492(m),1450(m),1028(w),756(m),698(s)。 Next, copper (I) chloride (60 mg, 0.60 mmol), tris (2- (dimethylamino) ethyl) amine (208 mg, 0.9 mmol), 4-methyl-synthesized in Reference Example 2 was placed in a 50 mL eggplant-shaped flask. N- [4-Methyl-5- {3- (2-propenylcarbonylamino) propyl} thiazol-2-yl] benzamide (1.07 g, 3.0 mmol), and 2-propanol / water = 2/1 (v / V) mixed solvent (3 mL) was sequentially added and stirred at room temperature to confirm that the reaction mixture was uniformly dissolved. Next, 1.5 g of polyacrylamide-modified polystyrene beads were added to the reaction solution, dissolved oxygen in the reaction solution was removed by freeze degassing, and the reaction vessel was stirred at 80 ° C. for 87 hours. After completion of the reaction, ethanol (30 mL) and 5% aqueous ammonia (5 mL) were added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Next, the polystyrene beads and the reaction solution were separated, and washed twice with ethanol / 5% aqueous ammonia = 9/1 (v / v) (50 mL) and once with DMF (250 mL). After completion of the washing, the polystyrene beads and the washing liquid were separated, and then vacuum-dried to obtain light green polyacrylamide-modified polystyrene beads (1.84 g) to which a thiazole derivative was bound. As a result of calculating from the weight increase of the obtained polystyrene beads, it was estimated that an average of 2 molecules of thiazole derivatives were bonded to the graft chain terminal and the equivalent was 0.52 meq / g. FT-IR, ν (cm −1 , reflect): 3336 (br), 2922 (m), 1654 (s, C═O), 1600 (m), 1492 (m), 1450 (m), 1028 (w ), 756 (m), 698 (s).

Claims (9)

一般式(1)
Figure 2009244252
(式中、R及びRは水素原子又は置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基を表し、Arは置換されていてもよい芳香族基を表し、nは1から12の整数を表し、Mはマトリックスを表す。)で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックス。
General formula (1)
Figure 2009244252
Wherein R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, Ar represents an optionally substituted aromatic group, and n represents 1 to 12 An integer, and M represents a matrix.)
Arの置換基が、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基である請求項1に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。 Ar is a halogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms, or an optionally substituted carbon group having 3 to 8 carbon atoms. A cycloalkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group having 3 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkynyloxy group having 3 to 6 carbon atoms, an optionally substituted acyloxy group having 1 to 6 carbon atoms Group, optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkylsulfinyl group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, substituted An optionally substituted alkoxycarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms, a carboxyl group, a nitro group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group or a cyano group Thiazole derivatives immobilization matrix according to 1. Arが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基から選ばれた1つ以上の置換基で置換されていてもよい芳香族基である請求項1に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。 Ar is a halogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms, an optionally substituted cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms Group, optionally substituted alkenyloxy group having 3 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkynyloxy group having 3 to 6 carbon atoms, optionally substituted acyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, substituted An optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkylsulfinyl group having 1 to 6 carbon atoms, an optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, One or more selected from an alkoxycarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms, a carboxyl group, a nitro group, an optionally substituted amino group, a hydroxyl group or a cyano group. Thiazole derivatives immobilization matrix according to claim 1 substituted with a substituent which is also an aromatic group. 一般式(1)
Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)においてMのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、請求項1から3に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
General formula (1)
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meaning as described above), the matrix of M is any one of vinyl polymer, agarose, chitosan, dextran, cellulose, silica and polystyrene. The thiazole derivative-immobilized matrix according to claim 1, characterized in that it is characterized in that
一般式(1a)
Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar及びnは前記と同じ意味を表し、Rはアミノ基又はアンモニウム塩を表す。)で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式(1)
Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
General formula (1a)
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar and n represent the same meaning as described above, and R 3 represents an amino group or an ammonium salt) and an activated group-containing matrix is reacted. The general formula (1)
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n, and M represent the same meaning as described above), a method for producing a thiazole derivative-immobilized matrix.
活性化基含有マトリックスの活性化基がスクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、ホルミル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基、カルボキシル基のいずれかであることを特徴とする請求項5に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。 6. The activation group of the activation group-containing matrix is any one of succinimideoxycarbonyl group, epoxy group, formyl group, 2,2,2-trifluoroethylsulfonyl group, and carboxyl group. A method for producing a thiazole derivative-immobilized matrix. 一般式(1)
Figure 2009244252
(式中、R、R、Ar、n及びMは前記と同じ意味を表す。)で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法。
General formula (1)
Figure 2009244252
(Wherein R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meaning as described above), and a method for analyzing or purifying proteins using a thiazole derivative-immobilized matrix.
タンパク質が免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。 8. A method according to claim 7, characterized in that the protein is an immunoglobulin or an analogue, fragment or fusion thereof. 免疫グロブリンが免疫グロブリンG(IgG)であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。 9. A method according to claim 8, characterized in that the immunoglobulin is immunoglobulin G (IgG).
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