JP2009156572A - Ion channel protein biosensor - Google Patents
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Abstract
Description
この出願の発明は、細胞中のイオンチャンネル活性測定のための素子、より具体的にはイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ（プレーナーパッチクランプ）素子とその形成法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、装置の小型化が容易であり、かつ高感度で正確な測定が可能とされる集積回路化イオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子とその形成法に関するものである。 The invention of this application relates to a device for measuring ion channel activity in a cell, more specifically, a planar substrate type patch clamp (planar patch clamp) device for measuring ion channel activity and a method for forming the same. More specifically, the invention of this application relates to a planar substrate type patch clamp element for integrated circuit ion channel activity measurement, which can easily reduce the size of the apparatus, and enables high sensitivity and accurate measurement, and a method of forming the same. Is.
生命体を構成する細胞表面には種々の膜タンパク質が配置されており、細胞表面の特定サイトへの化学物質（リガンドなどの信号伝達物質）の結合や電気あるい は光の刺激（ゲートトリガー）により膜タンパク質の開口部であるチャンネルが変形し、細胞膜の外と内側の間でのイオンや化学物質の輸送（チャンネルカレン ト）が制御されている。上記のような制御を行うタンパク質をチャンネルタンパク質といい、図１に示しているようにチャンネルタンパク質（５）が脂質膜（４）に埋め込まれた状態で存在するチャンネルとして生命機能を保っている。 Various membrane proteins are arranged on the surface of cells that make up living organisms. Binding of chemical substances (signaling substances such as ligands) to specific sites on the cell surface, electrical stimulation, or light stimulation (gate trigger) As a result, the channel that is the opening of the membrane protein is deformed, and the transport of ions and chemical substances (channel current) between the outside and inside of the cell membrane is controlled. A protein that performs the above control is referred to as a channel protein. As shown in FIG. 1, the channel protein (5) retains its vital function as a channel that is embedded in the lipid membrane (4).
このチャンネルタンパク質の電気的変化を測定することにより、そのチャンネルタンパク質を含む細胞の活動状態や細胞外の物質との相互作用を検出できるようになる。
チャンネルタンパク質をシリコン固体表面に保持して電気的結合を作ることにより集積化された測定素子を作ることができ、それらの提案が多くなされている。
By measuring the electrical change of the channel protein, the activity state of the cell containing the channel protein and the interaction with the extracellular substance can be detected.
Integrated measurement elements can be made by holding channel proteins on the surface of silicon solids and making electrical coupling, and many proposals have been made.
近年シリコンチップのような固体基板上のパッチクランプ装置を開発することに多大な努力がなされている。通常、これらの基板は従来のパッチクランプ電極の開口部に相当する細胞の配置及び固着のための一つ以上の開口部を備えている。例えば、国際公開第０１／５９４４７号公報には、複数のパッチクランプ細胞にてパッチクランプ記録を実施するための複数の電極からなる平面的パッチクランプ電極配列について記載されている。
細胞膜での電流の大きさはｐＡレベルであり、バックグランドノイズを極端に小さくする必要があり、固体基板と脂質膜との間の電気抵抗は１０9オームを越えた「ギガオームシール」を形成すべきである。
In recent years, great efforts have been made to develop patch clamp devices on solid substrates such as silicon chips. Typically, these substrates have one or more openings for cell placement and fixation that correspond to the openings of a conventional patch clamp electrode. For example, WO 01/59447 describes a planar patch clamp electrode array comprising a plurality of electrodes for performing patch clamp recording with a plurality of patch clamp cells.
The magnitude of the current in the cell membrane is pA level, the background noise needs to be extremely small, and the electrical resistance between the solid substrate and the lipid membrane forms a “gigaohm seal” exceeding 10 9 ohms Should.
このバックグランドノイズを減少させる目的で、特表２００５−５３６７５１には、細胞との電気的な連通を確立するための非平面素子からなる実質的に平面の基板が開示されている。この平面基板では基板表面は二酸化シリコンで覆われており、その基板上にシリコン基板の性質を利用した回路を直接作りこむことが困難で、外部にチャンネル微小電流を増幅したりする回路を設ける必要があって、抵抗や電気容量を徒に増やすことになり、ノイズを増加させる結果を引き起こす。また素子も巨大となり、測定する際の周辺組織への悪影響が大きくなりやすい。
そして特許文献１の開示している構造は、細胞との電気的な連通を確立するための非平面素子を設ける、すなわち、細胞を置く部分に突起を設けることを趣旨としており、細胞に無用の力学的ストレスを与えイオンチャンネル活性に影響を与え、精度を低下させ、さらに細胞の状態をも変えてしまう虞を有している。
For the purpose of reducing this background noise, JP 2005-536751 discloses a substantially planar substrate comprising non-planar elements for establishing electrical communication with cells. In this flat substrate, the substrate surface is covered with silicon dioxide, and it is difficult to directly make a circuit using the properties of the silicon substrate on the substrate, and it is necessary to provide a circuit for amplifying a channel minute current outside. This increases the resistance and capacitance, and causes the result of increasing noise. In addition, the device becomes enormous, and the adverse effect on the surrounding tissue during measurement tends to increase.
The structure disclosed in Patent Document 1 is intended to provide a non-planar element for establishing electrical communication with a cell, that is, to provide a protrusion on a part where the cell is placed, and is unnecessary for the cell. There is a risk that it exerts mechanical stress, affects the ion channel activity, reduces accuracy, and changes the state of cells.
本願の課題の第一は、イオンチャンネルを含有する細胞膜で基板に形成された微細孔を覆った状態で電極間の抵抗ギガオーム以上の大きさでかつ電気容量が小さい、バックグランドノイズの少ないイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ（プレーナーパッチクランプ）素子および、そのためのシリコン基板を提供することである。
課題の第二は、測定する細胞へのストレスを低減したイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ（プレーナーパッチクランプ）素子および、そのためのシリコン基板を提供することである。
The first of the problems of the present application is an ion channel with a small background noise and a size greater than the resistance gigaohm between the electrodes in a state where the micropore formed in the substrate is covered with a cell membrane containing the ion channel. To provide a planar substrate type patch clamp (planar patch clamp) element for activity measurement and a silicon substrate therefor.
The second problem is to provide a planar substrate type patch clamp (planar patch clamp) element for measuring ion channel activity with reduced stress on the cell to be measured, and a silicon substrate therefor.
上記の課題は、実質的に平面のＳＯＩ基板に極細孔を貫通させ、その極細孔の入り口付近に細胞膜を配置し、細胞膜と極細孔および導電性液を介して電極を設け、その電極間の電流を取り出せるイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子により達成される。
本願の本発明を含むすべての発明およびその説明において、細胞膜は、細胞から取り出した細胞膜、活動している細胞の細胞膜、あるいは固定した状態の細胞の孔に接した部分の細胞膜に孔を開けて細胞外部から細胞内部に流れる全電流を測定するホールセルクランプ法に使用される状態の細胞膜や、イオンチャンネルを支えている天然あるいは人工的な脂質二重膜など、イオンチャンネルを含む物質の意味で使用している。
細胞膜は導電駅流路を通して極細孔の付近に誘導し、孔の下部からの吸引、あるいは、電気泳動効果を利用して、孔の真上に固定する。
上記の課題を解決する発明は、より具体的には下記のとおりである。
発明（１）
第一シリコン層／絶縁膜／第二シリコン層と積層されている実質的に平面のＳＯＩ構造を持つ基板と、
第一シリコン層上のおかれた第一の、導電性液体を保持するための液溜部
第一液溜部におかれた導電性液体とこの液体と電通状態を保っておかれた上部電極、
第二シリコン層上のおかれた第二の、導電性液体を保持するための液溜部
第二液溜部におかれた導電性液体とこの液体と電通状態を保っておかれた上部電極、
を有し、
第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着され、
この細胞膜は、それのイオンチャンネル部分が極細孔の入り口付近に存在するように配置されおり、
第一シリコン側の導電性液体と第二シリコン側のそれとは上記極細孔と細孔を通して且つイオンチャンネルを間にして連通しており、
前記イオンチャンネルの開閉に応じて、上部電極と下部電極が電気的にそれぞれ連通遮断することを特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。
The above-mentioned problem is that a very flat SOI substrate is made to penetrate extremely small pores, a cell membrane is disposed in the vicinity of the entrance of the extremely small pores, electrodes are provided via the cell membrane, the extremely small pores and the conductive liquid, and between the electrodes This is achieved by a planar substrate type patch clamp element for measuring an ion channel activity capable of taking out an electric current.
In all the inventions including the present invention of the present application and the description thereof, the cell membrane is formed by opening a hole in a cell membrane removed from a cell, a cell membrane of an active cell, or a portion of a cell membrane in contact with a fixed cell pore. In the sense of substances containing ion channels, such as cell membranes used in the whole cell clamp method that measures the total current flowing from the outside of the cell to the inside of the cell, and natural or artificial lipid bilayer membranes that support the ion channel I use it.
The cell membrane is guided to the vicinity of the extreme pore through the conductive station channel, and is fixed immediately above the pore by using suction from the lower portion of the pore or an electrophoretic effect.
More specifically, the invention for solving the above-described problems is as follows.
Invention (1)
A substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A liquid reservoir for holding a first conductive liquid placed on the first silicon layer. A conductive liquid placed in the first liquid reservoir and an upper electrode kept in electrical communication with the liquid. ,
A liquid reservoir for holding a second conductive liquid placed on the second silicon layer. A conductive liquid placed in the second liquid reservoir and an upper electrode kept in electrical communication with the liquid. ,
Have
The pores penetrate from the surface of the first silicon layer to the insulating film, and the pores have a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact. Penetrating to the surface,
A cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around the pores,
This cell membrane is arranged so that its ion channel part exists near the entrance of the extreme pore,
The conductive liquid on the first silicon side and that on the second silicon side communicate with each other through the above-mentioned micropores and pores and with an ion channel in between.
A planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement, wherein the upper electrode and the lower electrode are electrically disconnected from each other in response to opening and closing of the ion channel.
発明（２） 絶縁膜が二酸化シリコンである発明（１）に記載のイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。
発明（３） 上部電極が第一シリコン層表面に下部電極が第二シリコン層の表面に作りこまれている発明（１）または（２）に記載のイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。
発明（４） 少なくとも一方の電極の表面がＡｇＣｌで覆われていることを特徴とする発明（１）から（３）に記載のイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。
発明（５） 極細孔の中の電流を増幅するための増幅回路部が、シリコン層表面に集 積されている発明（１）から発明（４）に記載の集積回路化平面基板型パッチクランプ素子。
発明（６） 電極がＳｉ 表面に金属電極が接する構造を有し、この金属電極がシリコンとの間でオーミックコンタクトとなっていることを特徴とする発明（１）から（５）に記載の集積回路化平面基板型パッチクランプ素子
発明（７） シリコン層表面の少なくとも一部が親水性の自己組織有機単分子膜で覆われ、その上に内部が疎水性で上下表面が親水性 の脂質二層膜の脂質膜が堆積され、その自己組織有機単分子膜と脂質膜との間に水もしくは緩衝液の層が存在する構造を有している発明（１）から（６）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
発明（８）極細孔の径が０．１μｍから１００μｍである発明（１）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
発明（９）極細孔があいている周辺のシリコン層表面がプラス電荷を有する化学物質で化学修飾された発明（１）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
発明（１０）極細孔を構成する管の壁の断面が第一シリコン層の側からみて、少なくともシリコン層と絶縁膜層の二層がこの順に積層されている発明（１）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
発明（１１）絶縁膜層の厚さが５ｎｍから１０μｍである発明（１）に記載の平面基板型パッチクランプ素子
発明（１２） 第二シリコン層を貫通している細孔が第二シリコン層表面から絶縁膜との境界の向きに行くに従って径が小さくなっていることを特徴とする発明（１）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
発明（１３） 第二シリコン層を貫通している細孔の径の小さくなるなり方が曲率をもっていることを特徴とする発明（１２）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。
Invention (2) The planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement according to invention (1), wherein the insulating film is silicon dioxide.
Invention (3) Planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement according to invention (1) or (2), wherein the upper electrode is formed on the surface of the first silicon layer and the lower electrode is formed on the surface of the second silicon layer. .
Invention (4) The planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement according to inventions (1) to (3), wherein the surface of at least one electrode is covered with AgCl.
Invention (5) The integrated circuit flat substrate type patch clamp element according to any one of inventions (1) to (4), wherein the amplification circuit section for amplifying the current in the micropore is integrated on the surface of the silicon layer. .
Invention (6) The integration according to inventions (1) to (5), wherein the electrode has a structure in which a metal electrode is in contact with the Si surface, and the metal electrode is in ohmic contact with silicon. Circuitized Planar Substrate Type Patch Clamp Element Invention (7) A lipid bilayer in which at least part of the surface of the silicon layer is covered with a hydrophilic self-organized organic monolayer, and the inside is hydrophobic and the upper and lower surfaces are hydrophilic The planar substrate according to any one of the inventions (1) to (6), wherein a lipid film of the film is deposited and has a structure in which a layer of water or buffer exists between the self-organized organic monomolecular film and the lipid film Type patch clamp element.
Invention (8) The flat substrate type patch clamp element according to invention (1), wherein the pores have a diameter of 0.1 μm to 100 μm.
Invention (9) The planar substrate type patch clamp element according to invention (1), wherein the surface of the surrounding silicon layer having an extremely small pore is chemically modified with a chemical substance having a positive charge.
Invention (10) The planar substrate according to invention (1), wherein at least two layers of the silicon layer and the insulating film layer are laminated in this order when the cross section of the wall of the tube constituting the micropore is viewed from the first silicon layer side Type patch clamp element.
Invention (11) The planar substrate type patch clamp element according to Invention (1), wherein the thickness of the insulating film layer is 5 nm to 10 μm Invention (12) The pores penetrating the second silicon layer are the surface of the second silicon layer The flat substrate type patch clamp element according to the invention (1), characterized in that the diameter decreases from the direction toward the boundary with the insulating film.
Invention (13) The flat substrate type patch clamp element according to invention (12), wherein the diameter of the pores penetrating the second silicon layer is reduced in curvature.
発明（１４）
第一シリコン層／絶縁膜／第二シリコン層と積層されている実質的に平面のＳＯＩ構造を持つ基板と、
第一シリコン層上のおかれた第一の、導電性液体を保持するための液溜部
第一液溜部と導電性液体を介して電気的に接する上部電極、
第二シリコン層上のおかれた第二の、導電性液体を保持するための液溜部
第二液溜部と導電性液体を介して電気的に接する上部電極、
を有し、
第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着される際にその位置を示す標識を有し、
第一シリコン側の液溜部と第二シリコン側の液溜部とは上記極細孔と細孔を通して導電性液体で連通可能になっていることを、
特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。
上記の標識は、掘り込むあるいは凸部で囲むなどして作成された窪みに細胞膜を置くようにしてもよいし、視覚的なものでよい。前者の方法は細胞膜を配置する場所の周りに関するものであり、細胞膜へはストレスを与えることはないが、色をかえるなど平面的なものの方が全体としてより平坦的になり望ましい。さらには、後述の化学修飾によって細胞膜を配置する基板表面の化学的性質を変えてもよいし、それによって視覚的標識を得ることも可能である。化学修飾の場合には細胞膜と基板表面との化学的親和力の差異により細胞膜が自立的に極細孔に定着することも可能である。
Invention (14)
A substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A first liquid reservoir placed on the first silicon layer for holding the conductive liquid; an upper electrode in electrical contact with the first liquid reservoir via the conductive liquid;
A liquid reservoir for holding a second conductive liquid placed on the second silicon layer; an upper electrode in electrical contact with the second liquid reservoir via the conductive liquid;
Have
The pores penetrate from the surface of the first silicon layer to the insulating film, and the pores have a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact. Penetrating to the surface,
When the cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around this pore, it has a label indicating its position,
The liquid reservoir on the first silicon side and the liquid reservoir on the second silicon side can communicate with the conductive liquid through the micropores and pores,
A flat substrate type patch clamp element for measuring ion channel activity.
The label may be placed in a hollow created by digging or surrounding with a convex part, or may be visual. The former method relates to the area around the place where the cell membrane is placed, and does not give stress to the cell membrane. However, a planar method such as changing the color is preferable because it is more flat as a whole. Furthermore, the chemical property of the substrate surface on which the cell membrane is arranged may be changed by chemical modification described later, and thereby a visual label can be obtained. In the case of chemical modification, the cell membrane can be autonomously fixed to the extreme pore due to the difference in chemical affinity between the cell membrane and the substrate surface.
発明（１５） 第一シリコン層から第二シリコン層まで貫通している極細孔およびこれにつながっている細孔（貫通細孔）が複数存在し、それぞれの貫通細孔は導電性液で電通され、さらに電極対に電通している発明（１）から発明（１４）に記載の平面基板型パッチクランプ素子。 Invention (15) There are a plurality of extreme pores penetrating from the first silicon layer to the second silicon layer and a plurality of pores (penetrating pores) connected thereto, and each of the through pores is electrically connected with a conductive liquid. Furthermore, the flat substrate type patch clamp element according to any one of inventions (1) to (14), wherein the electrode pair is electrically connected.
発明（１６）
第一シリコン層／絶縁膜／第二シリコン層と積層されている実質的に平面のＳＯＩ構造を持つ細胞膜配置基板と、
第一シリコン層表面に配置される第一流体回路基板と
第二シリコン層表面に配置される第二流体回路基板と
細胞膜の中のイオンチャンネルタンパク質を通過する電流を取り出すための電極対とを有するイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子であって、
前記細胞膜配置基板には、第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着される際に細胞膜を固着する位置を示す標識を有し、
前記第一流体回路基板は、細胞膜配置基板上におかれた細胞膜の上に液溜部を形成するための孔が少なくとも一つ貫通した板と、形成された液溜部と一方の電極と電通させるための導電液流路を有する板とを積み重ねて形成されており、
前記第二流体回路基板は、細胞膜配置基板上の細孔と残りの電極と電通させるための導電液流路を有しており、
第一シリコン側の液溜部と第二シリコン側の細孔とは上記極細孔を通して導電性液体で連通可能になっており、
前記流体回路と細胞膜配置基板とは脱着可能であることを
特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。発明（１６）上記細胞膜配置基板には流体回路基板を配置するための標識が設けられているのが好ましい。
また、第二流体回路基板の導電液流路は発明（１）の第二液溜部の機能も兼ねることができる。発明（１６）の脱着の思想は発明（１）から（１５）の発明にすべて応用できる。
標識は、視覚的なものでも物理的な凹凸でもなんでもよい。凹凸を与える方法は細胞膜を配置する場所の周りに関するものであり、細胞膜へはストレスを与えることはないが、色をかえるなど平面的なものの方が全体として、より平坦的になり望ましい。細胞膜配置基板表面への化学修飾によって化学的性質を変えて視覚的な差異、あるいは流体回路基板との化学的親和力を差異を与えてもよい。
Invention (16)
A cell membrane arrangement substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A first fluid circuit substrate disposed on the surface of the first silicon layer; a second fluid circuit substrate disposed on the surface of the second silicon layer; and an electrode pair for extracting an electric current passing through an ion channel protein in the cell membrane. A planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement,
The cell membrane substrate has pores penetrating from the surface of the first silicon layer to the insulating film and having a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact with each other. The hole penetrates to the surface of the second silicon layer,
When the cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around the pores, it has a label indicating the position where the cell membrane is fixed,
The first fluid circuit board includes a plate having at least one hole for forming a liquid reservoir on the cell membrane placed on the cell membrane arrangement substrate, a formed liquid reservoir, one electrode, It is formed by stacking plates with conductive liquid channels for
The second fluid circuit board has a conductive liquid channel for communicating with the pores on the cell membrane arrangement substrate and the remaining electrodes,
The liquid reservoir on the first silicon side and the pores on the second silicon side can communicate with the conductive liquid through the above-mentioned pores,
The planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement, wherein the fluid circuit and the cell membrane arrangement substrate are detachable. Invention (16) It is preferable that a label for arranging a fluid circuit board is provided on the cell membrane arrangement substrate.
Further, the conductive liquid flow path of the second fluid circuit board can also serve as the function of the second liquid reservoir of the invention (1). The idea of desorption of the invention (16) can be applied to the inventions of the inventions (1) to (15).
The signs may be visual or physical irregularities. The method of providing the unevenness relates to the area around the place where the cell membrane is arranged, and does not give stress to the cell membrane, but a flat one such as changing the color is more flat as a whole and is desirable. Chemical modification to the cell membrane-arranged substrate surface may change the chemical properties to give a visual difference or a chemical affinity with the fluid circuit board.
発明の具体的態様は図１である。
本発明では、SOI基板を利用する。
ＳＯＩ基板は、シリコン基板の第二シリコン層（３）の上に絶縁膜（２）を設け、その上に単結晶シリコン(SOI層)からなる第一シリコン層（１）を設けたものである。
ＳＯＩ基板において、極細孔が第一シリコン層（１）と絶縁膜（２）を貫通しており、それは細孔（９）に繋がって第二シリコン層（３）を貫通している。
極細孔付近に、細胞膜の中に存在するイオンチャンネルタンパク質（５）が、配置されている。
A specific embodiment of the invention is shown in FIG.
In the present invention, an SOI substrate is used.
In the SOI substrate, an insulating film (2) is provided on a second silicon layer (3) of a silicon substrate, and a first silicon layer (1) made of single crystal silicon (SOI layer) is provided thereon. .
In the SOI substrate, the extreme pore penetrates the first silicon layer (1) and the insulating film (2), which is connected to the pore (9) and penetrates the second silicon layer (3).
An ion channel protein (5) present in the cell membrane is arranged near the extreme pore.
極細孔付近に、イオンチャンネルを発現させた細胞を直接おいてもよい。
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ）細胞またはチャイニーズハムスタ ー卵巣ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ）細胞などに遺伝子導入により、所定のイオンチャンネルを発現したものを、所定の流路を通して微細孔の付近に誘導し、孔の下部からの吸引、あるいは、電気泳動効果を利用して、孔の真上に固定する。このようにした状態で微細孔に接した部分の細胞膜表面にあるイオンチャンネルを流れる電流を測定するモードをセルアタッチドモードという。固定した状態で孔に接した部分の細胞膜に孔を開けて細胞外部から細胞内部に流れる全電流を測定するモードをホールセルクランプという。
いずれの測定モードにたいしても、本発明素子構造によれば、表面が非常に平坦であるために容易にギガオームシールが達成でき、また、SOI構造の故に、高い絶縁抵抗と十分小さい容量が容易に実現できる。
A cell in which an ion channel is expressed may be directly placed in the vicinity of the extreme pore.
By introducing genes into human fetal kidney-derived HEK (Human Embryonic Kidney) cells or Chinese hamster ovary CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, a gene expressing a specific ion channel is induced in the vicinity of a micropore through a specific flow path. Then, using the suction from the lower part of the hole or the electrophoretic effect, it is fixed directly above the hole. In this state, a mode for measuring the current flowing through the ion channel on the surface of the cell membrane in contact with the micropore is referred to as a cell attached mode. A mode in which a hole is made in a cell membrane in a fixed state in contact with the hole and the total current flowing from the outside of the cell to the inside of the cell is measured is called a whole cell clamp.
Regardless of the measurement mode, according to the element structure of the present invention, a gigaohm seal can be easily achieved because the surface is very flat, and because of the SOI structure, high insulation resistance and sufficiently small capacity can be easily achieved. realizable.
イオンチャンネルタンパク質（５）の周り、極細孔、細孔、には、導電性液体が充填されている。しかし脂質二重膜（４）、あるいは細胞膜は、第一シリコン層に固着していて、イオンが第一シリコン表面と細孔との間を移動できないようなっており、イオンチャンネルタンパク質が導電状態になった時のみ、すなわちイオンチャンネル（５）が開いた時のみ、電極（６）と（７）との間に電通状態が生じるように保たれている。 Around the ion channel protein (5), the pores and pores are filled with a conductive liquid. However, the lipid bilayer membrane (4) or cell membrane is fixed to the first silicon layer so that ions cannot move between the first silicon surface and the pores, and the ion channel protein becomes conductive. Only when this occurs, that is, only when the ion channel (5) is open, an electrical conduction state is maintained between the electrodes (6) and (7).
そして本願発明では、ＳＯＩ基板を使用しているので極めて絶縁性の高い絶縁膜（２）が2つのシリコン層の間に存在し、イオンチャンネル（５）が開いていないときは高抵抗状態を確立でき、バックグランドのノイズを低減でき、ピコアンペアレベルの電流を正確に測定することができる。
また、ＳＯＩ基板を使用しているので、極めて高い電気抵抗と細胞膜をおく部分を凹凸１ｎｍ以下の極めて高い平坦性を両立させることができるので、ギガオームシールを達成しつつ、細胞膜にストレスを与えることなくイオンチャンネルタンパクの電気的特性を測定できる素子を得ることできる。
In the present invention, since an SOI substrate is used, an extremely highly insulating film (2) exists between two silicon layers, and a high resistance state is established when the ion channel (5) is not open. The background noise can be reduced, and the picoampere level current can be accurately measured.
In addition, since an SOI substrate is used, it is possible to achieve both extremely high electrical resistance and extremely high flatness with an unevenness of 1 nm or less on the part where the cell membrane is placed, so that stress is applied to the cell membrane while achieving a gigaohm seal. Thus, an element capable of measuring the electrical characteristics of the ion channel protein can be obtained.
絶縁膜には、通常ＳｉＯ2が用いられる。厚みは、ＳＯＩ基板利用により、５nmから１０μm が可能であるが、寄生容量低減と絶縁抵抗増大の観点から、BOX層の膜厚は厚い方が好ましいが、厚すぎると孔開け加工が簡単でなくなる。薄すぎれば容量が大きくなり、抵抗は低くなってノイズが高くなる。 For the insulating film, SiO 2 is usually used. The thickness can be 5 nm to 10 μm by using an SOI substrate. From the viewpoint of reducing parasitic capacitance and increasing insulation resistance, the BOX layer is preferably thicker, but if it is too thick, drilling is not easy. . If it is too thin, the capacity increases, the resistance decreases, and the noise increases.
極細孔の管の中間での絶縁膜の配置により、極細孔の部分のコンデンサー容量Ｃが小さくなり、ノイズを低減できる。
誘電率の大きなシリコンだけであると容量が大きくなり雑音が大きくなり、バイオセンサーとしては不利である。（Ｓｉの比誘電率：１２．１、ＳｉＯ2の比誘電率:４．５、 真空の誘電率：８．８５×１０-12 Ｆｍ-1）。誘電率(ギャップd面積S平衡平板コンデンサーの容量は、Ｃ=Ｓｘ（ε／ｄ）で与えられる。
By disposing the insulating film in the middle of the extremely fine tube, the capacitor capacity C in the extremely fine pore portion is reduced, and noise can be reduced.
If only silicon with a large dielectric constant is used, the capacitance increases and the noise increases, which is disadvantageous for a biosensor. (Si dielectric constant: 12.1, SiO 2 relative dielectric constant: 4.5, vacuum dielectric constant: 8.85 × 10 −12 Fm −1 ). Dielectric constant (capacitance of gap d area S balanced plate capacitor is given by C = Sx (ε / d).
導電性液体は、イオンを含むものであれがよいが、チャンネルタンパク質のチャ ンネルの開閉に係わる化学物質が運搬される緩衝液を使用すればよい。また細胞が生体内でさらされる外部イオン環境と同じ溶液が使用可能であり、さらに細胞の生体膜を通過するイオン電流を測定するために通常使用される溶液も使用できる。
The conductive liquid may contain ions, but a buffer solution that transports chemical substances related to the channel protein channel opening and closing may be used. The same solution as the external ionic environment to which the cell is exposed in the living body can be used, and a solution usually used for measuring the ionic current passing through the biological membrane of the cell can also be used.
また、図2の製作工程で説明示すように、XeF2エッチングやTMAH エッチングはエッチング速度が１００〜１０００倍異なるため、（Si>>SiO2）第二シリコン層側からのエッチングにおいてSiO2層でほぼ完全に停止できるため（図２の（２−８））、極細孔を第二シリコン層（３）と絶縁膜（２）との境界部分まで貫通させ、第二シリコン層（３）の部分については極細孔より径が大きい細孔をあけることができるのである。
すなわち、極細孔で第一シリコン層と絶縁膜を貫通して極細孔のコンデンサー容量を低くして電気的高抵抗を維持し、第二シリコン層については構造が維持できる程度の強度を維持しつつ、第二シリコン層を貫通する細孔の径を大きくすることで、イオンチャンネルタンパク質の開いたときの導電性は高めるという相反する目的を同時に満たすことが可能となる。
本発明では基板をシンプルな形の極細孔で貫通させているので、文献１のような構造に比べ余分のコンデンサー容量を誘発せず、製作もシンプルであり、センサーチップを製造する際にもっとも重視される歩留まりを高くすることができる。
In addition, as shown in the manufacturing process of FIG. 2, XeF 2 etching and TMAH etching have different etching rates of 100 to 1000 times, and therefore (Si >> SiO2) in the etching from the second silicon layer side, the SiO 2 layer is almost the same. Since it can be completely stopped ((2-8) in FIG. 2), the pores are penetrated to the boundary between the second silicon layer (3) and the insulating film (2), and the second silicon layer (3) is Can open pores that are larger in diameter than the extreme pores.
That is, through the first silicon layer and the insulating film through the extremely small pores, the capacitor capacity of the very small pores is lowered to maintain high electrical resistance, and the second silicon layer is maintained at such a strength that the structure can be maintained. By increasing the diameter of the pores penetrating the second silicon layer, it becomes possible to simultaneously satisfy the conflicting purpose of increasing the conductivity when the ion channel protein is opened.
In the present invention, since the substrate is penetrated by a simple pore, the extra capacitor capacity is not induced compared to the structure as in Reference 1, and the manufacturing is simple, and the most important factor when manufacturing the sensor chip. The yield can be increased.
ＳＯＩ基板を利用することで、極めて精密な構造体を形成可能である。
本発明では、第二シリコン層を貫通する細孔は、球状に絶縁膜との境界までえぐられた形をもち、そこで上記の極細孔につながっている。
この細孔は形状が第二シリコン層側の表面から奥に行くほど徐々に口径が小さくなることが重要である。例えば、角錐あるいは円錐状である。
この作業はドリルを用いてもよいし、通常の電子ビーム露光も利用でき、さらに光露光によるリソグラフィによりパタン形成した後プラズマエッチングにより穴形成をしてもよい。
By using an SOI substrate, an extremely precise structure can be formed.
In the present invention, the pores penetrating the second silicon layer have a shape that is spherically formed to the boundary with the insulating film, and is connected to the above-mentioned extreme pores there.
It is important that the diameter of the pores gradually decreases from the surface on the second silicon layer side toward the back. For example, it is a pyramid or a cone.
For this operation, a drill may be used, normal electron beam exposure may be used, and holes may be formed by plasma etching after pattern formation by lithography using light exposure.
上記細孔の径は第二シリコン層の表面で１００〜３０００μｍ程度である。大きいほどイオンセンサーを介して電通性を持っている電極間の導電性が高まり、イオンチャンネルたんぱく質からの微弱電流に対する応答速度が速くなる。 The diameter of the pores is about 100 to 3000 μm on the surface of the second silicon layer. The larger the conductivity, the higher the conductivity between the electrodes having conductivity through the ion sensor, and the faster the response speed to the weak current from the ion channel protein.
製作工程（図２）
ＳＯＩ基板（Ｓｉ層：１〜１００μｍが使用できるが、例えば２μｍ、ＳｉＯ2 層：０．１μｍ〜１０μｍが使用できるが、例えば１μｍ）の第一シリコン層表面にレジスト塗布（２−２）、電子ビーム露光或いは、光露光によるパターンニング、反応性イオンエッチング(RIE)により極細孔（径0.1~100ミクロン）を形成する。微細孔は通常のRIE工程では ＳＯＩ基板のＳｉＯ2層と第一シリコン層との境界でストップする（２−３）。但し、先に第二シリコン層側からの穴を先に空けておく工程の場合は、第一シリコン層に引き続いてＳｉＯ2層もエッチング穴空けをしてしまう方が能率的である。
次に熱酸化（600〜1000C, 10分〜1時間）により薄い酸化膜を形成する。或いは、第一シリコン層表面にCVD, 電子ビーム蒸着あるいはスパッターによりＳｉＯ2 膜を堆積する。このＳｉＯ2 膜の厚みは0、1〜0．2ミクロン程度である（２−５）。
Production process (Figure 2)
Resist coating on the surface of the first silicon layer of the SOI substrate (Si layer: 1 to 100 μm, but 2 μm, for example, SiO 2 layer: 0.1 μm to 10 μm, but 1 μm, for example), electron Extreme pores (diameter: 0.1 to 100 microns) are formed by beam exposure or patterning by light exposure and reactive ion etching (RIE). In the normal RIE process, the fine holes stop at the boundary between the SiO 2 layer and the first silicon layer of the SOI substrate (2-3). However, in the step of previously making the hole from the second silicon layer side, it is more efficient to make the etching hole in the SiO 2 layer following the first silicon layer.
Next, a thin oxide film is formed by thermal oxidation (600 to 1000 C, 10 minutes to 1 hour). Alternatively, a SiO 2 film is deposited on the surface of the first silicon layer by CVD, electron beam evaporation or sputtering. The thickness of the SiO 2 film is about 0,1～0.2 microns (2-5).
ついでこの表面を保護テープで覆い（２−６）、第二シリコン層の表面からボール状の研磨用ドリルで研磨して直径0.5mm~数mmの穴を掘る。この研磨による穴堀はＳＯＩ基板中のＳｉＯ2層の数十ミクロン手前でストップさせる（２−７）。
ついで、穴の中の薄い自然酸化膜を1〜3％の希フッサン溶液に数分浸して除去する。ついで、XeF2ガスにさらすか、TMAH（溶液に浸してＳｉをエッチングする。これらのエッチングは 速度が Ｓｉ>>ＳｉＯ2のため、ＳｉＯ2 層で停止するため、非常に精密な加工が可能である。またドリルでの穴掘りのため穴の先端部は球状をしており、それをさらにエッチングしているため球状の形でＳｉＯ2 層に到達する。先端の球状を維持するには穴の最先端がＳｉＯ2 層に到達するときにエッチングをやめることで可能である（２−８）。
第一シリコン層側からの極細孔と第二シリコン層側からの穴の間にあるＳｉＯ2 膜は、数％から10％の希フッサンによるエッチング或いは、フェムト秒レーザー光の照射によるアブレーションによって除去することで極細孔は第二シリコン層側の穴と結ばれる（２−９）。
Next, this surface is covered with a protective tape (2-6), and a hole having a diameter of 0.5 mm to several mm is dug by polishing with a ball-shaped polishing drill from the surface of the second silicon layer. Drilling by this polishing is stopped several tens of microns before the SiO 2 layer in the SOI substrate (2-7).
Next, the thin natural oxide film in the hole is removed by immersing it in a 1-3% dilute fluorine solution for several minutes. Next, it is exposed to XeF2 gas or TMAH (dipped in a solution to etch Si. Since these etchings stop at the SiO 2 layer because of Si >> SiO 2 , very precise processing is possible. Moreover, the tip of the hole has a spherical shape due to drilling, and since it is further etched, it reaches the SiO 2 layer in a spherical shape. It is possible to stop the etching when the tip reaches the SiO 2 layer (2-8).
The SiO 2 film between the extreme pore from the first silicon layer side and the hole from the second silicon layer side is removed by etching with several to 10% dilute fluorine or by ablation by femtosecond laser light irradiation. Thus, the micropore is connected to the hole on the second silicon layer side (2-9).
なお、上記の第二シリコン層側の穴の形状を問題にしなければ、他の加工法も可能である。例えば、研磨を行わないで、第二シリコン層表面に付加された酸化膜のうち穴になる部分についてＳｉＯ2を除いておき、最初からXeF2エッチングやTMAHエッチングを行い時間をかかてエッチングだけで裏の穴構造を制作することも可能である。
なお、ＳＯＩ基板のＳｉＯ2とした部分については、Ａｌ2O3などの絶縁体でも同様の効果が期待される。
If the shape of the hole on the second silicon layer side is not a problem, other processing methods are possible. For example, without polishing, SiO 2 is removed from the portion of the oxide film added to the surface of the second silicon layer that becomes holes, and XeF2 etching and TMAH etching are performed from the beginning, and only etching is performed over time. It is also possible to create a hole structure on the back.
The same effect can be expected with an insulator such as Al 2 O 3 with respect to the SiO 2 portion of the SOI substrate.
本願発明においては、微細孔周辺の第一シリコン（１）表面と細胞膜あるいは脂質二重膜（４）との密着性は、パッチクランプの手法においてギガオームシールと呼ばれ、密着性を良くし、その隙間を流れる電流に対する抵抗を1ギガオーム程度以上にすることが、雑音低下などの観点から必須の条件である。
そのために、細胞を吸着させた後、裏側から吸引するなどを行うが、さらに孔周辺の第一シリコン（１）表面を化学修飾することにより密着性を向上させることが出来る。以下その方法を説明する。
シリコン表面は、空気中で薄い酸化膜が形成される。細胞膜表面は通常中性であり、細胞膜や脂質二重膜の固着を妨げる。そこでシリコン表面をプラス電荷を持った化学物質で化学修飾しておくと固着性が向上する。この場合表面の平坦性は失われないようにしなくてはいけない。
上記のような理由で、本願発明では、発明（９）に記載したように、極細孔周辺の第一シリコン層表面に細胞や脂質二重膜が固着しやすくするために、第一シリコン層表面に化学修飾によりタンパク質と反応活性な基、たとえば、−ＣＯＯＨ基、あるいはＮＨ2を配置するのが、望ましい形態である。
In the present invention, the adhesion between the surface of the first silicon (1) around the micropore and the cell membrane or the lipid bilayer membrane (4) is called a gigaohm seal in the patch clamp method, and improves the adhesion. It is an essential condition from the viewpoint of noise reduction and the like that the resistance to the current flowing through the gap is about 1 gigaohm or more.
Therefore, after adsorbing the cells, suction is performed from the back side, and the adhesion can be improved by chemically modifying the surface of the first silicon (1) around the hole. The method will be described below.
A thin oxide film is formed on the silicon surface in the air. The cell membrane surface is usually neutral and prevents the cell membrane and lipid bilayer from sticking together. Therefore, if the silicon surface is chemically modified with a chemical substance having a positive charge, the fixing property is improved. In this case, the flatness of the surface must not be lost.
For the reasons as described above, in the present invention, as described in the invention (9), in order to make cells and lipid bilayers easily adhere to the surface of the first silicon layer around the pores, It is desirable to arrange a group reactive with the protein by chemical modification, for example, a —COOH group or NH 2 .
例えば、３−アミノプロピルジメチレトキシシラン（3-Aminopropyldimethylethoxysilane (ＡＰＳ) ）の２％トルエン溶液に８時間浸すことで表面を＋電荷のＮＨ2 基で覆うことが出来る（文献 A. Berquand, P.E. Mazeran, J. Pantigny, V. Proux-Delrouyre, J.M. Laval, C. Bourdillon, Langmuir 19 (2003) 1700.参照）。
この表面化学修飾は微細孔周辺の細胞が接触する領域のみを行うことが望ましいので、パターンニングを行う。
シリコン表面を例えばオクタデシルトリクロロシラン（OTS）などのシランカップリング剤を用いて先端がCH3基の自己組織単分子膜で覆う。ついで、レジストで所定のパターンを形成し、上部から、紫外線アッシングもしくはプラズマアッシングを施すと薄いＯＴＳ膜はレジストで覆われていない部分で除去される。しかし、このままでは一部除去されないレジスト（レジスト残滓）が残り表面の凹凸の原因となるため、このレジストを完全に除去するために、Ｈ2ＳＯ4＋Ｈ2Ｏ2（４：１）溶液に浸す（50℃３分程度）。
このようなパターンニングの手法はAPS に限らず、自己組織単分子膜と呼ばれる各種の有機薄膜による化学修飾膜のパターン形成に応用できる。ついで、ここに上記の方法でＡＰＳ膜を形成すれば、ＯＴＳの無いところにのみAPS膜を堆積することができる。
For example, the surface can be covered with a positively charged NH 2 group by immersing in a 2% toluene solution of 3-aminopropyldimethylethoxysilane (APS) for 8 hours (reference A. Berquand, PE Mazeran). , J. Pantigny, V. Proux-Delrouyre, JM Laval, C. Bourdillon, Langmuir 19 (2003) 1700.).
Since this surface chemical modification is desirably performed only in the area where cells around the micropores are in contact, patterning is performed.
The silicon surface is covered with a self-assembled monolayer having a CH3 group at the tip by using a silane coupling agent such as octadecyltrichlorosilane (OTS). Next, when a predetermined pattern is formed with a resist and ultraviolet ashing or plasma ashing is performed from above, the thin OTS film is removed at a portion not covered with the resist. However, since the resist (resist residue) which is not partially removed as it is causes unevenness of the remaining surface, it is immersed in a H 2 SO 4 + H 2 O 2 (4: 1) solution in order to completely remove the resist. (50 ° C for about 3 minutes).
Such a patterning method is not limited to APS, and can be applied to pattern formation of chemically modified films using various organic thin films called self-assembled monolayers. Then, if an APS film is formed here by the above-described method, an APS film can be deposited only where there is no OTS.
一般にシリコン基板を利用すると表面を1nm以下の凹凸で平坦度を保つことが容易であり、レジストによるパターン化の後に本方法の処理をすることは表面を平坦に保つ上で意義が大きい。 In general, when a silicon substrate is used, it is easy to keep the surface flat with unevenness of 1 nm or less, and the treatment of this method after patterning with a resist is significant in keeping the surface flat.
さらなる化学修飾の例として下記がある。
A)ウンデセン酸で表面を処理する方法
シリコンを１０００℃で１〜２時間酸素雰囲気中で加熱、冷却後２％ＨＦ酸溶液に３０秒つけて表面のＳｉＯ２をとる（水素終端化処理）。その後ウンデセン酸に１５０〜２００℃で漬ける。
B)アビチンビオチン処理の方法
処理方法自体広く知られており、例えば、
Analytical Sciences ２００１、Vol 17 Supplement I1379〜I1382
に記載の方法で可能である。
Ｃ）オクテニルトリクロロシランで表面を処理する方法
シリコン基板をオクテニルトリクロロシラン（ＯＴＴＳ）の１〜２ｍＭのトルエン溶液に基板を３０分〜ｌ時問６０℃で浸潰し、表面に形成されたＯＴＴＳの自己組織有機単分子膜のＣＨ＝ＣＨ２の基を酸化して、ＣＯＯＨ基に変換する。
表面に導入したこれらのＣＯＯＨ基或いはNH2基とタンパク質を直接反応させるか、あるいは一旦これらとアビヂン(avidin)を反応させ、タンパク質にビオチンを導入し、このアビヂン-ビオチン反応を利用してタンパク質をシリコン表面に固定する。
Examples of further chemical modifications include:
A) Method of treating the surface with undecenoic acid Silicon is heated in an oxygen atmosphere at 1000 ° C. for 1 to 2 hours, cooled and then immersed in a 2% HF acid solution for 30 seconds to remove the surface SiO 2 (hydrogen termination treatment). Then, it is soaked in undecenoic acid at 150 to 200 ° C.
B) Method of treatment with abitine biotin The treatment method itself is widely known, for example,
Analytical Sciences 2001, Vol 17 Supplement I1379-I1382
It is possible by the method described in 1.
C) Method of treating the surface with octenyltrichlorosilane OTTS formed on the surface by immersing the silicon substrate in a 1-2 mM toluene solution of octenyltrichlorosilane (OTTS) at 60 ° C. for 30 minutes to 1 hour The CH═CH 2 group of the self-assembled organic monomolecular film is oxidized and converted to a COOH group.
These COOH groups or NH 2 groups introduced on the surface are directly reacted with the protein, or once they are reacted with avidin, and biotin is introduced into the protein, and the protein is converted using this avidin-biotin reaction. Fix to the silicon surface.
図３-aは製作した基板に脂質二重膜（デイフィタノイルホスファテイデイルコリン D(PC）にグラミシジンAというイオンチャンネルを取り込んで単一イオンチャンネル電流を計測した例。導電性液体は1MのＫＣｌ電解質溶液を使用。バックグランド電流、すなわちノイズが低く、３ピコアンペアの変化を明瞭に捉えており、ピコアンペアレベルの電流について十分な分解能を有していることがわかる。また、図3-b)に示すように、従来技術と比較し、20倍近くノイズが減少していることがわかる。
すなわち、本願発明の構成により、ギガオームシールを具体的に達成する手段を提供でき、プレナークランプ法に最適のデバイスを提供できた。
Fig. 3-a shows an example in which a single ion channel current was measured by incorporating an ion channel called gramicidin A into a lipid bilayer membrane (Difitanoyl Phosphate Deycholine D (PC)) on the fabricated substrate. Using KCl electrolyte solution, the background current, that is, the noise is low, the change of 3 picoamperes is clearly seen, and it can be seen that there is sufficient resolution for picoampere level currents. As shown in (), it can be seen that the noise is reduced by almost 20 times compared to the conventional technique.
That is, according to the configuration of the present invention, a means for specifically achieving a gigaohm seal can be provided, and an optimum device for the planar clamp method can be provided.
さらに、ＳＯＩ基板を利用すれば、シリコン層が表面にあるため、この部分にMOSトランジスタなどの電子回路を形成でき、膜タンパクセンサー部と一体の回路が製作できるため、体内埋め込み可能な超小型の素子が製作可能である。
図4は実際に製作した素子と電子回路部分の等価回路を示す。
図４のプレーナーパッチクランプ素子部の脂質二重膜に支えられたチャンネルタンパク質（５）の上方は、上部液溜部の導電性液をとおして電極（７）と通電状態にあり、チャンネルタンパク質（５）の下部は下部液溜部の導電液を介して電極（６）と通電状態にある。このプレーナーパッチクランプ素子部からの1pAレベルのイオンチャンネル電流が電極（６）（７）を経由して基板上に作られた電子回路（ここでは、等価回路を示してある。）に流れ、そこで増幅されて計測可能となる。
Furthermore, if an SOI substrate is used, since the silicon layer is on the surface, an electronic circuit such as a MOS transistor can be formed in this part, and a circuit integrated with the membrane protein sensor part can be manufactured. The element can be manufactured.
FIG. 4 shows an equivalent circuit of the actually manufactured element and the electronic circuit part.
The upper part of the channel protein (5) supported by the lipid bilayer membrane of the planar patch clamp element part of FIG. 4 is in an energized state with the electrode (7) through the conductive liquid in the upper liquid reservoir, and the channel protein ( The lower part of 5) is in an energized state with the electrode (6) through the conductive liquid in the lower liquid reservoir. An ion channel current of 1 pA level from the planar patch clamp element portion flows through the electrodes (6) and (7) to an electronic circuit (here, an equivalent circuit is shown) formed on the substrate. It is amplified and can be measured.
本発明では、基板上に細胞膜をおく極細孔を複数あけた素子も一つの実施態様であり、それにより同時に複数の細胞膜の活動を測定することができる。この態様を具体的に記載したものが、図5である。
また発明（１６）の思想が図5の態様において具体化されており、細胞膜配置基板の上に導電性液流路を形成するための、孔の開いた流体回路基板をその孔が、シリコン基板上の細胞膜を置く部分にあわせておくことで、細胞膜をプレーナーパッチクランプ素子に簡単に配置し、導電性液流路も直ちに作れる形態をとっている。電極（６）（７）は増幅用電子回路に接続されている。
図6は流体回路基板の概念図である。また図6では、細胞をそのまま置いた態様がとられている。
In the present invention, an element having a plurality of extremely small pores for placing a cell membrane on a substrate is also an embodiment, whereby the activities of a plurality of cell membranes can be measured simultaneously. This embodiment is specifically described in FIG.
Further, the idea of the invention (16) is embodied in the embodiment of FIG. 5, and a fluid circuit substrate having a hole for forming a conductive liquid channel on the cell membrane-arranged substrate is formed on the silicon substrate. By aligning with the part where the upper cell membrane is placed, the cell membrane can be easily arranged on the planar patch clamp element, and a conductive liquid flow path can be formed immediately. The electrodes (6) and (7) are connected to an amplifying electronic circuit.
FIG. 6 is a conceptual diagram of a fluid circuit board. In FIG. 6, the cell is left as it is.
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、タンパク質１つのチャンネルカレントを直接測定することができ、また基板上に電子回路をセンサー部と 一体の集積回路として作製することが可能なため、増幅器部も含めると従来素子と比較して百万分の一程度に素子を小型化することができる。 As described above in detail, according to the invention of this application, it is possible to directly measure the channel current of one protein, and it is possible to produce an electronic circuit on the substrate as an integrated circuit integrated with the sensor unit. Including the element can reduce the size of the element to one millionth compared with the conventional element.
このため体内に埋め込んで病気の診断をしたり、ドラッグデリバリーを行うなどの新しい応用が開かれる。また、構造的にタンパク質１つのチャンネルカレント を直接測定できる方式であるので、センサー部と増幅回路部が一体となっていることで雑音を拾いにくいというという特性と併せて、極めて高感度かつ正確な測 定を行うことが可能となる。また、複数の信号伝達物質の同時計測や脂質膜面内でのチャンネルカレントの分布など、従来のバイオセンサーではなし得なかった 測定が可能となる。 This opens up new applications such as diagnosing illnesses and implanting drugs in the body. In addition, because it is a method that can directly measure the channel current of one protein in structure, it is extremely sensitive and accurate with the characteristic that the sensor part and the amplifier circuit part are integrated, making it difficult to pick up noise. Measurement can be performed. In addition, measurements such as simultaneous measurement of multiple signaling substances and distribution of channel currents within the lipid membrane surface are possible, which could not be achieved with conventional biosensors.
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。 The invention of this application has the features as described above, and an embodiment thereof will be described below.
この出願の発明のイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプでは、前述のとおり基本的に、二酸化シリコンなどの絶縁膜上にシリコン単結晶が配置されている基板を使用しており、その基板を、極細孔が貫通している。
したがって両方のシリコン層表面にもうけられた電極は、イオンチャンネルが開いていないときは高抵抗下でノイズ電流がほとんどゼロとなり、開いたときの微弱イオン電流を高精度に測定することができる。
そしてさらにチャンネルタンパク質の チャンネルカレントを増幅するための増幅回路部を、イオンチャンネルがある基板と同一の基板上に集積していることを大きな特徴としており、素子の小型化が可能となり、増幅回路部も含めると従来素子と比較して１００万分の１程度まで小型化することができる。
In the planar substrate type patch clamp for ion channel activity measurement of the invention of this application, as described above, basically, a substrate in which a silicon single crystal is arranged on an insulating film such as silicon dioxide is used. , The pores are penetrating.
Therefore, the electrodes provided on both silicon layer surfaces have almost no noise current under high resistance when the ion channel is not open, and the weak ion current when the ion channel is open can be measured with high accuracy.
In addition, an amplification circuit unit for amplifying the channel current of the channel protein is integrated on the same substrate as the substrate on which the ion channel is located, which makes it possible to reduce the size of the device. If included, the size can be reduced to about 1 / 1,000,000 compared with the conventional element.
また、この出願の発明の素子では、タンパク質１つのチャンネルカレントを直接測定することができる方式としていることから、測定部と増幅回路部を一体の集積回路とすることによって雑音を拾いにくくできるという特性と併せて、極めて高感度かつ正確な測定が可能となる。また、人工細胞 膜面内の電流分布も測ることも可能となる。 In addition, since the element of the invention of this application is a method that can directly measure the channel current of one protein, it is difficult to pick up noise by making the measurement unit and the amplification circuit unit an integrated circuit. In addition, extremely sensitive and accurate measurement is possible. It is also possible to measure the current distribution in the artificial cell membrane surface.
また、上部電極および下部電極の表面をＡｇＣｌで覆われた状態とすることで、電極表面の電位を一定に保つことができる。また下部電極をＳｉ表面にＰｔなど の金属電極が接する構造とし、この金属電極をＳｉとの間でオーミックコンタクトとすることで、雑音の原因となる、Ｓｉ表面と金属電極との間の接触電位をほ ぼ０とでき、微小なチャンネルカレントを精度よく測定することが可能となる。とくに下部電極を、表面側からＡｇＣｌ／Ａｇ／Ｐｔの積層構造とした場合に微 小なチャンネルカレントを極めて精度よく測定することができる。 In addition, by making the surfaces of the upper electrode and the lower electrode covered with AgCl, the potential of the electrode surface can be kept constant. Also, the lower electrode has a structure in which a metal electrode such as Pt is in contact with the Si surface, and this metal electrode is in ohmic contact with Si, thereby causing a contact potential between the Si surface and the metal electrode that causes noise. Therefore, it is possible to measure a minute channel current with high accuracy. In particular, when the lower electrode has an AgCl / Ag / Pt laminated structure from the surface side, a minute channel current can be measured with extremely high accuracy.
またこの出願の発明の素子では、脂質膜が配置される箇所において、Ｓｉ基板表面の一部あるいは全部を親水性の自己組織有機単分子膜で覆い、その上に内部が 疎水性で上下表面が親水性の脂質二層膜の脂質膜を堆積し、その自己組織有機単分子膜と脂質膜との間に水もしくは緩衝液の層が存在する構造とすることによ り、脂質膜と親水性の自己組織単分子膜との間に薄い水の層を介することで、脂質膜が緩衝液内で安定に存在することができる構成とすることができる。 Further, in the device of the invention of this application, at the place where the lipid membrane is arranged, part or all of the surface of the Si substrate is covered with a hydrophilic self-organized organic monomolecular film, and the inside is hydrophobic and the upper and lower surfaces are By depositing a lipid membrane of a hydrophilic lipid bilayer membrane and having a structure in which a layer of water or buffer exists between the self-organized organic monolayer and the lipid membrane, the lipid membrane and the hydrophilic membrane By interposing a thin water layer between the self-assembled monolayer and the lipid membrane, the lipid membrane can be stably present in the buffer solution.
さらに、自己組織有機単分子膜を複数種類の有機分子から構成し、その一部の種類の有機分子が他の種類の有機分子よりも長く先端部が疎水性を有するものとす ることにより、自己組織有機単分子膜の一部が脂質膜の内部の疎水性の領域に入り込んだ状態とすることができ、このようにすることで流動性の脂質膜をさらに 緩衝液中で安定に保持することができる。このような自己組織単分子膜の一例としては、先端が疎水性のものとしてはオクテニルトリクロロシラン（ＯＴＳ）やオクタデシルトリクロロシラン(OTS)が ある。また親水性のものとしては、オクテニルトリクロロシラン（ＯＴＴＳ）を堆積後、その表面を酸化してＣＯＯＨ基にしたもの、先端がＣＯＯＣＨ3などのアルキルエステルとなっている自己組織単分子膜を形成した後、個の部分を酸で加水分解してＣＯＯＨ期に変換したもの、あるいは、先端がアミノ基（−ＮＨ2）となったものなどが例示されるが、同様な構造でＣＨ2鎖を長くしたものなどほかにも各種のものが利用できる。さらに、自己組織単分子膜の中にＣＨ2鎖が長く且つ先端部が疎水性となっており、脂質膜内部に突き刺さって流動性の脂質膜を緩衝液中で安定に保持する役目を果たすアンカー分子を混入することも可能である。このようなアンカー分子は、−ＣＨ2鎖の長いアルキル単分子膜を用いたり、あるいは表面がＣＯＯＨ基に変換された後、先端にＯＨ基を有する長鎖分子と反応させることにより導入が可能である。 Furthermore, the self-organized organic monomolecular film is composed of a plurality of types of organic molecules, and some types of organic molecules are longer than other types of organic molecules, and the tip has hydrophobicity. A part of the self-assembled organic monolayer can enter the hydrophobic region inside the lipid membrane, and in this way, the fluid lipid membrane can be further stably retained in the buffer solution. be able to. Examples of such a self-assembled monolayer include octenyltrichlorosilane (OTS) and octadecyltrichlorosilane (OTS) having a hydrophobic tip. In addition, as hydrophilic ones, octenyltrichlorosilane (OTTS) is deposited and then the surface is oxidized to COOH group, and the self-organized monomolecular film whose tip is an alkyl ester such as COOCH 3 is formed. after, those that have been converted into phase COOH hydrolysis of the number of partial acid, or the like that the tip becomes an amino group (-NH 2) is exemplified, the CH 2 chain in the same structure Various things can be used besides long ones. Furthermore, the CH 2 chain is long and the tip is hydrophobic in the self-assembled monolayer, and the anchor functions to hold the fluid lipid membrane stably in the buffer solution by piercing the lipid membrane. It is also possible to mix molecules. Such an anchor molecule can be introduced by using a long monomolecular film of —CH 2 chain or by reacting with a long chain molecule having an OH group at the tip after the surface is converted to a COOH group. is there.
この 出願発明において、脂質膜が配置される箇所においては、Ｓｉ層表面に先端部が疎水性の有機分子 を島状成長させて自己組織有機単分子膜の島を形成し、その自己組織有機単分子膜の島が脂質膜の内部の疎水性の領域に入り込んだ状態とすることができ、この ようにすることによって、疎水性である自己組織有機単分子膜の島の先端部が、疎水性相互作用により脂質膜の内部の疎水性の領域に食い込んで、脂質膜を確実 に基板上につなぎとめることができる。すなわち自己組織有機単分子膜の島がアンカーの役割を果たすのである。このような自己組織単分子膜の一例としては、 たとえばオクタデシルトリクロロシラン(OTS)やオクテニルトリクロロシラン（ＯＴＳ）がある。 In the present invention, at the location where the lipid membrane is disposed, a hydrophobic organic molecule having a tip on the Si layer surface is grown in an island shape to form an island of a self-organized organic monolayer, and the self-organized organic monolayer is formed. The islands of the molecular membrane can enter the hydrophobic region inside the lipid membrane, and in this way, the tip of the island of the self-organized organic monolayer that is hydrophobic is hydrophobic. By interacting into the hydrophobic region inside the lipid membrane, the lipid membrane can be securely attached to the substrate. In other words, islands of self-organized organic monolayers play the role of anchors. Examples of such self-assembled monolayers include octadecyltrichlorosilane (OTS) and octenyltrichlorosilane (OTS).
なおこの出願の発明の集積回路に用いるタンパク質や脂質膜については、自然界あるいは人工的に存在するすべての脂質膜およびチャンネルタンパク質に適用することができる。 The proteins and lipid membranes used in the integrated circuit of the invention of this application can be applied to all lipid membranes and channel proteins that exist in nature or artificially.
そして、この出願の発明は、脂質膜、チャンネルタンパク質、液溜部、流路および電極対が複数配置された測定部と、それぞれ の電極対に対応した複数の増幅回路部が測定部と同一シリコン基板上に集積されている構成とすることもでき、このような構成とすることにより複数の種類 の信号伝達物質を同時に計測することが可能となる。 The invention of this application is that a measurement unit in which a plurality of lipid membranes, channel proteins, liquid reservoirs, flow paths and electrode pairs are arranged, and a plurality of amplification circuit units corresponding to each electrode pair are the same silicon as the measurement unit. It is also possible to adopt a configuration integrated on a substrate. With such a configuration, it is possible to simultaneously measure a plurality of types of signal transmitting substances.
さらには、この出願の発明は、脂質膜の上方 と下方の電極対を１つの脂質膜部の面内に複数対形成し、それぞれの電極対に対応して増幅回路部を集積し、脂質膜面内でのチャンネルカレントの分布とその時 間変化が計測できるようにすることも可能である。このようにすることで、複数の信号伝達物質の同時計測や脂質膜面内でのチャンネルカレントの分布など従来 のバイオセンサーではなし得なかった測定が可能となる。 Furthermore, in the invention of this application, a plurality of pairs of electrodes above and below the lipid membrane are formed in the plane of one lipid membrane portion, and an amplification circuit portion is integrated corresponding to each electrode pair. It is also possible to measure the channel current distribution and its change over time in the plane. In this way, measurements that cannot be performed by conventional biosensors, such as simultaneous measurement of a plurality of signal transmitting substances and distribution of channel currents within the lipid membrane surface, can be achieved.
ゆがみの少ない脂質二重膜の形成法としてベシクルフージョンがよく知られており、これを利用することもできる。
水中では脂質二重膜はマリモのような形をしてお り、これはベシクルと読ばれており、このベシクルを固体表面に供給し、表面で平らな二重膜を形成することをベシクルフージョンという。
Vesicle fusion is well known as a method for forming a lipid bilayer with little distortion, and this can also be used.
In water, the lipid bilayer is shaped like a marimo, which is read as a vesicle, and it is vesicle fusion to supply this vesicle to a solid surface and form a flat bilayer on the surface. That's it.
またこの出願の発明では、液溜部およびシリコン層や絶縁膜の穴を電子シンクロトロン放射光エッチングにより形成できる。このようにすることで、シリコン基板上に側壁が垂直で底面が 非常に平らな流路、液溜部を形成することができ、また絶縁膜の穴における側壁を垂直にすることができ、また穴の底面を非常に平ら（凸凹０．４ｎｍ程度）に することができ精度の良い加工を行うことができる。 In the invention of this application, the liquid reservoir and the hole of the silicon layer or the insulating film can be formed by electron synchrotron radiation etching. By doing so, a flow path and a liquid reservoir can be formed on the silicon substrate with the side wall vertical and the bottom surface very flat, and the side wall in the hole of the insulating film can be made vertical. The bottom surface of the hole can be made very flat (roughness of about 0.4 nm), and high-precision processing can be performed.
なお、電子シンクロトロン放射光エッチングの際に反応ガスとしてフッ素系ガスを用いることができる。とくに電子シンクロとロン放射光エッチングの反応ガスとしてＳＦ6またはＸｅＦ2を好適に用いることができ、また放射光エッチングの反応ガスとしてフッ素を含む化合物ガスと酸素ガスの混合ガスがとくに好適に用いられる。 Note that a fluorine-based gas can be used as a reactive gas in the electron synchrotron radiation etching. In particular, SF 6 or XeF 2 can be preferably used as a reaction gas for electron synchrotron and Ron radiation etching, and a mixed gas of fluorine-containing compound gas and oxygen gas is particularly preferably used as a reaction gas for radiation light etching. .
電子シンクロトロン放射光エッチングのエッチングマスク材料として１０％以下の低濃度の酸水溶液にて溶解しやすい金属の薄膜を用いることができ、とくにその金属の薄膜としてＣｏ、Ｎｉ、Ｆｅあるいはこれらの合金を好適に用いることができる。 As an etching mask material for electron synchrotron radiation etching, it is possible to use a metal thin film that is easily dissolved in an acid aqueous solution having a low concentration of 10% or less. It can be used suitably.
電子シンクロトロン放射光エッチングの終了後、上記の金属薄膜からなるエッチングマスクの除去を前述のとおりの１０％以下の低濃度の塩酸、硝酸あるいは フッ酸などの酸の水溶液を用いて行うことで、エッチング時およびエッチング後のエッチングマスク除去時に、基板のみならず基板に堆積した有機材料あるいは 生体物質を損傷するのを防止することができる。 After the electron synchrotron radiation etching is completed, the etching mask made of the metal thin film is removed using an aqueous solution of acid such as hydrochloric acid, nitric acid or hydrofluoric acid having a low concentration of 10% or less as described above. It is possible to prevent not only the substrate but also the organic material or biological material deposited on the substrate from being damaged at the time of etching and removing the etching mask after the etching.
本発明の素子を作る際には、収束イオンビーム法をとることもできるが、その際の工程は図7に記載のとおりである。
本発明ではＳＯＩ基板の第二シリコン層側からのイオンビームでのエッチング（図７−６）のあと、希フッ素酸でエッチングするので、第一シリコン層表面に残るエッチング残渣を完全に排除でき、極めて平坦な素子基板をえることできる。すなわちギガオームシールの平面基板型パッチクランプの作成に極めて適合した製法である。
When making the device of the present invention, the focused ion beam method can be used, and the process at that time is as shown in FIG.
In the present invention, after etching with an ion beam from the second silicon layer side of the SOI substrate (FIG. 7-6), etching with dilute fluoric acid, the etching residue remaining on the surface of the first silicon layer can be completely eliminated, An extremely flat element substrate can be obtained. In other words, it is a manufacturing method that is extremely suitable for the production of a flat substrate type patch clamp with a gigaohm seal.
１ シリコン単結晶層
２ 絶縁膜（ＳｉＯ2層）
３ シリコン単結晶層
４ 脂質二重膜
５ チャンネルタンパク質
６ 電極
７ 電極
８ 電流増幅部
９ 細孔
1 Silicon single crystal layer 2 Insulating film (SiO 2 layer)
3 Silicon single crystal layer 4 Lipid bilayer membrane 5 Channel protein 6 Electrode 7 Electrode 8 Current amplification part 9 Pore
Claims (17)
第一シリコン層上のおかれた第一の、導電性液体を保持するための液溜部
第一液溜部におかれた導電性液体とこの液体と電通状態を保っておかれた上部電極、
第二シリコン層上のおかれた第二の、導電性液体を保持するための液溜部
第二液溜部におかれた導電性液体とこの液体と電通状態を保っておかれた上部電極、
を有し、
第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着され、
この細胞膜は、それのイオンチャンネル部分が極細孔の入り口付近に存在するように配置されおり、
第一シリコン側の導電性液体と第二シリコン側のそれとは上記極細孔と細孔を通して且つイオンチャンネルを間にして連通しており、
前記イオンチャンネルの開閉に応じて、上部電極と下部電極が電気的にそれぞれ連通遮断することを特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。 A substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A liquid reservoir for holding a first conductive liquid placed on the first silicon layer. A conductive liquid placed in the first liquid reservoir and an upper electrode kept in electrical communication with the liquid. ,
A liquid reservoir for holding a second conductive liquid placed on the second silicon layer. A conductive liquid placed in the second liquid reservoir and an upper electrode kept in electrical communication with the liquid. ,
Have
The pores penetrate from the surface of the first silicon layer to the insulating film, and the pores have a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact. Penetrating to the surface,
A cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around the pores,
This cell membrane is arranged so that its ion channel part exists near the entrance of the extreme pore,
The conductive liquid on the first silicon side and that on the second silicon side communicate with each other through the above-mentioned micropores and pores and with an ion channel in between.
A planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement, wherein the upper electrode and the lower electrode are electrically disconnected from each other in response to opening and closing of the ion channel.
第一シリコン層上のおかれた第一の、導電性液体を保持するための液溜部
第一液溜部と導電性液体を介して電気的に接する上部電極、
第二シリコン層上のおかれた第二の、導電性液体を保持するための液溜部
第二液溜部と導電性液体を介して電気的に接する上部電極、
を有し、
第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着される際にその位置を示す標識を有し、
第一シリコン側の液溜部と第二シリコン側の液溜部とは上記極細孔と細孔を通して導電性液体で連通可能になっていることを、
特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。 A substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A first liquid reservoir placed on the first silicon layer for holding the conductive liquid; an upper electrode in electrical contact with the first liquid reservoir via the conductive liquid;
A liquid reservoir for holding a second conductive liquid placed on the second silicon layer; an upper electrode in electrical contact with the second liquid reservoir via the conductive liquid;
Have
The pores penetrate from the surface of the first silicon layer to the insulating film, and the pores have a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact. Penetrating to the surface,
When the cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around this pore, it has a label indicating its position,
The liquid reservoir on the first silicon side and the liquid reservoir on the second silicon side can communicate with the conductive liquid through the micropores and pores,
A flat substrate type patch clamp element for measuring ion channel activity.
第一シリコン層表面に配置される第一流体回路基板と
第二シリコン層表面に配置される第二流体回路基板と
細胞膜の中のイオンチャンネルタンパク質を通過する電流を取り出すための電極対とを有するイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子であって、
前記細胞膜配置基板には、第一シリコン層の表面から絶縁膜まで極細孔が貫通し、絶縁膜と第二シリコン層とが接している位置から極細孔より開口面積の大きい細孔となり、その細孔が第二シリコン層の表面まで貫通しており、
この極細孔のまわりの第一シリコン層表面に細胞膜が固着される際に細胞膜を固着する位置を示す標識を有し、
前記第一流体回路基板は、細胞膜配置基板上におかれた細胞膜の上に液溜部を形成するための孔が少なくとも一つ貫通した板と、形成された液溜部と一方の電極と電通させるための導電液流路を有する板とを積み重ねて形成されており、
前記第二流体回路基板は、細胞膜配置基板上の細孔と残りの電極と電通させるための導電液流路を有しており、
第一シリコン側の液溜部と第二シリコン側の細孔とは上記極細孔を通して導電性液体で連通可能になっており、
前記流体回路と細胞膜配置基板とは脱着可能であることを
特徴とするイオンチャンネル活性測定用平面基板型パッチクランプ素子。 A cell membrane arrangement substrate having a substantially planar SOI structure laminated with a first silicon layer / insulating film / second silicon layer;
A first fluid circuit substrate disposed on the surface of the first silicon layer; a second fluid circuit substrate disposed on the surface of the second silicon layer; and an electrode pair for extracting an electric current passing through an ion channel protein in the cell membrane. A planar substrate type patch clamp element for ion channel activity measurement,
The cell membrane substrate has pores penetrating from the surface of the first silicon layer to the insulating film and having a larger opening area than the pores from the position where the insulating film and the second silicon layer are in contact with each other. The hole penetrates to the surface of the second silicon layer,
When the cell membrane is fixed to the surface of the first silicon layer around the pores, it has a label indicating the position where the cell membrane is fixed,
The first fluid circuit board includes a plate having at least one hole for forming a liquid reservoir on the cell membrane placed on the cell membrane arrangement substrate, a formed liquid reservoir, one electrode, It is formed by stacking plates with conductive liquid channels for
The second fluid circuit board has a conductive liquid channel for communicating with the pores on the cell membrane arrangement substrate and the remaining electrodes,
The liquid reservoir on the first silicon side and the pores on the second silicon side can communicate with the conductive liquid through the above-mentioned pores,
A planar substrate type patch clamp element for measuring an ion channel activity, wherein the fluid circuit and the cell membrane arrangement substrate are detachable.
An ion channel that allows extremely small pores to penetrate through a substantially planar SOI substrate, places a cell membrane near the entrance of the very small pore, provides electrodes via the cell membrane, the very small pores, and a conductive liquid, and extracts current between the electrodes. Flat substrate type patch clamp element for activity measurement
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