JP2008534955A - 質量分析法による有利サイロキシンおよび遊離トリヨードサイロニン分析 - Google Patents
質量分析法による有利サイロキシンおよび遊離トリヨードサイロニン分析 Download PDFInfo
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Abstract
質量分析法による、一つ以上のホルモンを同時または系列分析するための方法、システムおよびキットを開示する。本方法は、最小限のサンプル量と最小限の調製時間を提供する。本方法は、ホルモンのイオン化および質量分析法によるホルモン分析からなる。さらに、エレクトロスプレー源を使用したネガティブモードにおける遊離サイロキシン(FT4)および遊離トリヨードサイロニン(FT3)ホルモンのイオン化からなる、(FT4)および(FT3)ホルモンの同時または系列分析するための方法、システムおよびキットを開示する。
Description
本明細書で使用されるセクションの表題は、組織上の目的のみであり、あらゆる方法において、記載されている内容を制限するものであると解釈されるものではない。
分野
本発明は、質量分析法による遊離サイロキシン(FT4)および遊離トリヨードサイロニン(FT3)を分析するための方法およびキットに関する。
本発明は、質量分析法による遊離サイロキシン(FT4)および遊離トリヨードサイロニン(FT3)を分析するための方法およびキットに関する。
背景
ホルモンは、生物学上のメッセンジャーである。これらは、特異的な組織(腺)により合成され、血液中に分泌される。血液は、ホルモンが標的細胞の活動を変更するために作用する標的細胞にホルモンを運搬する。
ホルモンは、生物学上のメッセンジャーである。これらは、特異的な組織(腺)により合成され、血液中に分泌される。血液は、ホルモンが標的細胞の活動を変更するために作用する標的細胞にホルモンを運搬する。
ホルモンは、化学的に多様であり、一般的に、(1)例えばサイロキシンなどのアミノ酸から派生した小分子、(2)インスリンおよび甲状腺刺激ホルモンなどのポリペプチドまたはタンパク質、および(3)例えばステロイドなどのコレステロールから派生した分子、の主に3グループに分類される。
ホルモンの重要な種類は甲状腺ホルモンである。甲状腺ホルモンの例は、サイロキシン(T4)、遊離サイロキシン(FT4)、トリヨードサイロニン(T3)および遊離トリヨードサイロニン(FT3)である。T4およびT3は、細胞に進入し、細胞内部の受容体と結合し、そこで、ミトコンドリアおよびミトコンドリア酵素を増加することにより細胞の代謝機能を増大する。T4およびT3は、成長および発達、糖代謝、酸素消費、タンパク質合成および胎児の神経発達を含む、数多くの生物学上の過程を調節するのに重要である。全ての循環しているT4およびわずかな割合で循環しているT3の合成は、甲状腺内に位置するサイログロブリン分子上で生じる。血中に存在するT3の大半は、濾胞細胞および標的組織[1]の細胞に存在する特異的な細胞内部脱ヨウ素酵素-酵素により、T4のモノ脱ヨウ素化を介して酵素的に生成される。健康なヒト被験者から採取した血清において、全T4は、全T3より約60倍高い濃度で存在する。T4は、活性ホルモンであるT3生成のための貯蔵所としてのホルモン前駆体として作用する。甲状腺ホルモン(TH)と関連する代謝活動は、標的細胞内の特異的な核内受容体と結合するT3により開始される。血中の甲状腺ホルモン濃度は、甲状腺機能の診断において必要不可欠な試験である。
ステロイドは、もう一つの重要なホルモンの種類を形成する。ステロイドホルモンの例は、エストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロンを含む。エストロゲンは、主にエストロン、エストラジオールおよびエストリオールの三種類があるホルモン群の名称である。エストロゲンおよびプロゲステロンは、女性の二次性徴の発達をもたらし、生殖機能を発達させ、維持する。テストステロンは、男性の二次性徴を発達させ、維持し、精子の成長および形成を促進する。ステロイドは、標的細胞に進入し、細胞内部の受容体と結合した後、ステロイドにより誘発される変化を顕在化させるタンパク質のためにmRNAコーディングの生成を促す。
ホルモンの正確な分析および定量化は、より重要になっている。例えば、エストロゲンおよびエストロゲンの様な化合物は、ホルモン補充療法を通して現在の社会において、今までになく増大した役割を担っている。また、エストロゲンおよびエストロゲン様化合物の分析および定量化は、乳癌のようなエストロゲンに関連した疾患の治療に役立つ。さらに、T4およびT3の正確な分析および定量化は、当該分野に精通した者により認識される問題である。全T4およびT3イムノアッセイ(「IA」)に干渉する循環しているヨードサイロニン結合自己抗体の存在は、既知の現象である[2]、[3]、[4]。これらの自己抗体は、使用される検定の分離方法によるが、誤って高いまたは低い甲状腺ホルモン測定値を出す可能性があり、しばしば、臨床的特徴と一致しない[2]、[3]、[4]。血清遊離T4およびT3(FT4およびFT3)測定は、そのような異常結合を補う一方法である。しかし、技術的に、遊離ホルモン濃度を測定するのは、濃度が非常に低いため難しい。全(遊離およびタンパク質結合)甲状腺ホルモンを測定するのは容易である。全ホルモン濃度は、ナノモルレベルで測定される一方、遊離ホルモン濃度は、ピコモルで測定され、有効であり、非常に高い全ホルモン濃度のため干渉されない。
現在、一般的なホルモンの分析方法は、イムノアッセイ技術である。表1は一般的なホルモンおよび現在のそれらの分析方法を挙げている。
例えば、エストリオールは、サンプル中の標識されていないエストリオールと競合で、放射標識された抗原(ヨウ素125)を使用した放射性イムノアッセイにより、既知の抗体量において分析される。本測定法は、ガンマカウンターを使用して判定される。
アンドロステンジオンは、西洋わさびペルオキシダーゼを含む酵素イムノアッセイを使用して分析される。サンプル中の標識されていない抗原は、抗体結合部位の固定された数の酵素標識された抗原と競合する。本測定法は、マイクロタイタープレート酵素免疫測定読取装置を使用して判定される。
いくつかのホルモンは、現在、化学発光イムノアッセイを使用して分析される。例えば、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾルおよびT3は、本方法を使用して分析される。本測定法は、測定法特異の抗体被覆ビーズを使用する。本測定法は、フォトンカウンターを使用して判定される。
しかし、以下の理由により、現在のイムノアッセイは不利である。
(1)イムノアッセイは一つのホルモンに特定され、よって、全てのホルモンは個別に分析されなければならない。
(2)数多くのキットを購入しなければならなく、その工程も、分析する各ホルモンに対して学ばなければならない。
(3)イムノアッセイの結果を読むための多様な装置を購入しなければならない。例えば、サンプルからのエストリオールおよびプロゲステロンの分析には、ガンマカウンターおよびフォトカウンターの双方が必要である。
(4)検定キットは高価な可能性がある。
(5)現在のイムノアッセイは、特異性に欠け、異なる製造会社からのキットを使用することにより、結果が約15倍の差異を示す可能性がある[5]。
(6)工程は、多くの段階を含み、非常に多くの時間を必要とする。
(7)放射性イムノアッセイの場合、放射性同位元素が関与するため注意が必要である。
(1)イムノアッセイは一つのホルモンに特定され、よって、全てのホルモンは個別に分析されなければならない。
(2)数多くのキットを購入しなければならなく、その工程も、分析する各ホルモンに対して学ばなければならない。
(3)イムノアッセイの結果を読むための多様な装置を購入しなければならない。例えば、サンプルからのエストリオールおよびプロゲステロンの分析には、ガンマカウンターおよびフォトカウンターの双方が必要である。
(4)検定キットは高価な可能性がある。
(5)現在のイムノアッセイは、特異性に欠け、異なる製造会社からのキットを使用することにより、結果が約15倍の差異を示す可能性がある[5]。
(6)工程は、多くの段階を含み、非常に多くの時間を必要とする。
(7)放射性イムノアッセイの場合、放射性同位元素が関与するため注意が必要である。
イムノアッセイは、特異性の欠如を指摘するより多くの文献が発表されるごとに、不確実であると酷評されている[6〜13]。表2は、使用される様々な抗体の特異性における差異を明らかに示す、甲状腺ホルモン試験の熟達度において、アメリカ病理学会プログラムにより報告された主な差異を示す。例えば、アメリカ病理学会熟達度試験(CAP PT)プログラムで報告された異なる方法間の平均結果を示す表2は、約二つの要因により変動する。妊娠、エストロゲン治療またはタンパク質結合の遺伝子異常などの要因も、T4およびT3におけるイムノアッセイを診断学的に不確実にすると報告されている[2]、[3]、[14]、[15]。現在、血清全T4(TT4)、遊離T4(FT4)および遊離T3(FT3)濃度は、イムノアッセイにより、主に測定される。最近、高性能液体クロマトグラフ法(HPLC)、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC−MS)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC−MS)、タンデム質量分析(LC−MS/MS)によるT4およびT3の定量化測定の報告が、いくつか発表された[16〜20]。これらの全方法は、非常に時間がかかる抽出、誘導体化および前クロマトグラフ的分離さえ必要とする[21]、[22]。
つい最近まで、ホルモンは質量分析法により分析および定量化されていた。しかし、これらの方法にはいくつかの不都合な点がある。
例えば、エレクトロスプレータンデム質量分析を使用した尿テストステロンおよびジヒドロテストステロングルクロニドの分析方法が記述されている[23]。本方法は、高性能液体クロマトグラフ法(HPLC)および3カラム、2切替え弁を備えた複合システムを必要とする。欠点は、(i)ホルモングルクロニドは、分析されるが、ホルモンはされなかった、(ii)本方法は、尿にのみ適用される、(iii)二つの分析物しか同時に分析されない、(iv)テストステロンの検出限界(LOD)が200pgml−1であり、ジヒドロテストステロンの定量化限界が10ugL−1であった、および(v)本方法は複雑である、という点を含む。
他の出版物では、イオン捕捉ガスクロマトグラフ−タンデム質量分析法によるウシの血漿中のエストラジオールの判定方法を開示している[24]。欠点は、(i)一つの分析物のみしか分析されない、(ii)4mlの血漿が一つの分析物の分析に必要である、(iii)検出限界が5pgml−1である、および(iv)本方法はガスクロマトグラフ法を使用するため、誘導体化が必要とされる、という点を含む。
HPLCエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法により、乾燥血こんからの17−ヒドロキシプロゲステロンの分析方法も、記述されている[25]。しかし、本方法は、一回に一つの分析物しか分析できず、完全にサンプルを抽出するだけでも50分かかる、重労働で時間のかかる、液−液抽出を必要とする。
テストステロンおよびジヒドロステロンの生成速度を分析するためのガスクロマトグラフ質量分析法が開示されている[26]。
最後に、質量分析法による遊離サイロキシン(FT4)または遊離トリヨードサイロニン(FT3)の分析方法は知られていない。多くの研究室は、主な臨床化学プラットホーム上の一つで、類似体(直接)イムノアッセイアプローチを用いたFT4試験を慣例的に実施している。本アプローチは、国際的に認められておらず、批判の対象となっている(29)。本方法により得られるFT4の結果の有効性が問われることが、多々ある。この理由により、全ての直接FT4<2.5th百分位数における「反射」試験は、しばしば、甲状腺機能低下症を診断するために行われる。これらは、平衡透析の現行の判断基準を用いたFT4測定のために送られる。これは、直接FT4が>97.5th百分位数で、TSHが正常である場合、サンプルに対しても行われる。平衡透析により測定された場合、これらのFT4送付の約50%が、正常な範囲内の結果であり、よって、直接FT4法では偽陽性である。しかし、平衡透析の工程は、時間がかかり、高価である。同様に、FT3も、現在、イムノアッセイにより測定される。
概要
出願者の教示は、質量分析法を使用したホルモン分析の速くて正確な方法および定量化を提供する。
出願者の教示は、質量分析法を使用したホルモン分析の速くて正確な方法および定量化を提供する。
複数のホルモンが同時または系列的に分析可能である。工程は、100μLのように非常に少量のサンプルの分析が可能である。さらに、最小限のサンプル調製時間を提供する。
出願者の教示は、例えば人体などの自然の中で発見されるような、複数の複合マトリックスでのホルモンの分析を可能にする。例えば、ホルモン分析は、血液、唾液、血清、血漿および尿のサンプルで実施可能である。
本教示にはいくつかの特徴がある。
(1)サンプル中のホルモンにおける全および特異的分析を提供する。本方法は、多くのホルモンの同時または系列的分析を可能にする。
(2)工程は、免疫沈降反応を必要としない。主な他のホルモン分析は、イムノアッセイを必要とする。イムノアッセイは高価で、特定の分析物に特異的であり、複数の工程を含む。
(3)本教示は、最小限のサンプル調製時間を要する。例えば、ホルモン分析のサンプル調製は、6分以内に完了することができる。
(4)工程は、大量のサンプルを必要としない。甲状腺ホルモンにおける血漿または血清サンプルは、100μLのように非常に少量である。FT4およびFT3において、サンプルは、500から600μLの間であってよい。質量分析法を使用するホルモン分析の現法は、4〜15mLの血漿を必要とする。
(5)本方法は、使用が簡易で高度に再現できる、単純な調製技術を使用する。
(6)本方法は、多様なサンプルの種類において実施できる分析を可能にする。
(7)本方法は、簡易なサンプル採取および分析のための診療所へのサンプルの遠隔依頼を可能にする唾液または尿のサンプル中のホルモンの分析を可能にする。以前の他の臨床方法において、サンプルは、診療所の患者から直接、侵襲的手段により採取される。
(8)質量分析法による分析は高精度である。さらに、本方法の工程は、非常に再現性が高い。
(9)本方法は、ホルモン濃度の広範囲の分析を可能にする。さらに、検出限界は、かなり低い。
(1)サンプル中のホルモンにおける全および特異的分析を提供する。本方法は、多くのホルモンの同時または系列的分析を可能にする。
(2)工程は、免疫沈降反応を必要としない。主な他のホルモン分析は、イムノアッセイを必要とする。イムノアッセイは高価で、特定の分析物に特異的であり、複数の工程を含む。
(3)本教示は、最小限のサンプル調製時間を要する。例えば、ホルモン分析のサンプル調製は、6分以内に完了することができる。
(4)工程は、大量のサンプルを必要としない。甲状腺ホルモンにおける血漿または血清サンプルは、100μLのように非常に少量である。FT4およびFT3において、サンプルは、500から600μLの間であってよい。質量分析法を使用するホルモン分析の現法は、4〜15mLの血漿を必要とする。
(5)本方法は、使用が簡易で高度に再現できる、単純な調製技術を使用する。
(6)本方法は、多様なサンプルの種類において実施できる分析を可能にする。
(7)本方法は、簡易なサンプル採取および分析のための診療所へのサンプルの遠隔依頼を可能にする唾液または尿のサンプル中のホルモンの分析を可能にする。以前の他の臨床方法において、サンプルは、診療所の患者から直接、侵襲的手段により採取される。
(8)質量分析法による分析は高精度である。さらに、本方法の工程は、非常に再現性が高い。
(9)本方法は、ホルモン濃度の広範囲の分析を可能にする。さらに、検出限界は、かなり低い。
つまり、(a)FT4ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、(b)FT4のサンプルからの分離、(c)FT4ホルモンの収集、および(d)質量分析法を使用してFT4ホルモンの分析、のステップを含む、遊離サイロキシン(FT4)ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
つまり、(a)FT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、(b)FT3のサンプルからの分離、(c)FT3ホルモンの収集、および(d)質量分析法を使用してFT3ホルモンの分析、のステップを含む、遊離トリヨードサイロニン(FT3)ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
つまり、(a)FT4およびFT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、(b)FT4およびFT3のサンプルからの分離、(c)FT4およびFT3ホルモンの収集、および(d)質量分析法を使用してFT4およびFT3ホルモンの分析、のステップを含む、遊離サイロキシン(FT4)および遊離トリヨードサイロニン(FT3)ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
FT4および/またはFT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプル分析の手順を提供する。本方法は、上述のように、サンプルを調製および分析する手順の提供を含む。
つまり、(a)内標準を含む、サンプルからFT4を分離するための試薬、(b)質量分析法を使用してFT4ホルモンを分析するための試薬、および(c)質量分析法を含む、FT4を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法におけるシステムを提供する。
つまり、(a)内標準を含む、サンプルからFT3を分離するための試薬、(b)質量分析法を使用してFT3を分析するための試薬、および(c)質量分析法を含む、FT3を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法におけるシステムを提供する。
つまり、(a)サンプルからFT4を分離するための試薬、(b)質量分析法を使用してFT4ホルモンを分析するための試薬、(c)FT4の溶液、および(d)質量分析法を使用してFT4を分析する手順を含む、FT4を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットを提供する。
つまり、(a)サンプルからFT3を分離するための試薬、(b)質量分析法を使用してFT3を分析するための試薬、(c)FT3の溶液、および(d)質量分析法を使用してFT3を分析する手順を含む、FT3を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットを提供する。
また、(a)サンプルからFT4およびFT3を分離するための試薬、(b)質量分析法を使用してFT4およびFT3を分析するための試薬、(c)FT4およびFT3の溶液、および(d)質量分析法を使用してFT4およびFT3を分析する手順を含む、FT4およびFT3を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットも提供する。
つまり、FT4、FT3または双方を含むかまたは含むと考えられるサンプルを分析するための質量分析法の使用を提供する。
これらと出願者の教示の他の特徴を、本明細書に記述する。
当該分野に精通した者は、以下に記述する図は、例示的目的であることを理解する。図は、いかなる手段において、出願者の教示の範囲を制限することを意図したものではない。
発明者に既知である最適なアプローチを含む本方法は、以下の図と組み合わせて、以下の説明を参照することにより、より理解されるであろう。
様々な実施形態の説明
出願者の教示は、ホルモンの分析方法を提供する。ホルモンは、
デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)
硫酸デヒドロエピアンドロステロン(DHEAS)
アルドステロン
コルチゾル
コルチコステロン
11−デオキシコルチゾル
アンドロステンジオン
テストステロン
エストラジオール
17−OHプロゲステロン
プロゲステロン
アロプレグナノロン
16−OHエストロン
2−OHエストロン
エストロン
エストリオール
ビタミンDおよびその代謝物25ヒドロキシビタミンDおよび1,25ジヒドロキシビタミンD
サイロキシン
遊離サイロキシン
トリヨードサイロニン
遊離取りヨードサイロニン
カテコールアミン
メタネフリン
他のステロイドホルモン
他の甲状腺ホルモン
他の小ペプチドホルモン
他のアミン類
サンプル
血液、血漿、血清、尿または唾液のサンプルを含む、ホルモンを含むかまたは含むと考えられるあらゆるサンプルが使用される。サンプルは、遊離および共役性の双方または結合ホルモンを含んでよい。サンプル量は、ホルモンにおいては、一般的に少なくとも約100μL、API3000TMを使用した場合のステロイドホルモンにおいては、少なくとも約700μL、またはAPI4000TMまたはAPI5000TMを使用した場合のステロイドホルモンにおいては200から500μLが使用される。FT4およびFT3において500から600μLのサンプル量が、API4000TMまたはAPI5000TMを使用した場合、使用される。
出願者の教示は、ホルモンの分析方法を提供する。ホルモンは、
デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)
硫酸デヒドロエピアンドロステロン(DHEAS)
アルドステロン
コルチゾル
コルチコステロン
11−デオキシコルチゾル
アンドロステンジオン
テストステロン
エストラジオール
17−OHプロゲステロン
プロゲステロン
アロプレグナノロン
16−OHエストロン
2−OHエストロン
エストロン
エストリオール
ビタミンDおよびその代謝物25ヒドロキシビタミンDおよび1,25ジヒドロキシビタミンD
サイロキシン
遊離サイロキシン
トリヨードサイロニン
遊離取りヨードサイロニン
カテコールアミン
メタネフリン
他のステロイドホルモン
他の甲状腺ホルモン
他の小ペプチドホルモン
他のアミン類
サンプル
血液、血漿、血清、尿または唾液のサンプルを含む、ホルモンを含むかまたは含むと考えられるあらゆるサンプルが使用される。サンプルは、遊離および共役性の双方または結合ホルモンを含んでよい。サンプル量は、ホルモンにおいては、一般的に少なくとも約100μL、API3000TMを使用した場合のステロイドホルモンにおいては、少なくとも約700μL、またはAPI4000TMまたはAPI5000TMを使用した場合のステロイドホルモンにおいては200から500μLが使用される。FT4およびFT3において500から600μLのサンプル量が、API4000TMまたはAPI5000TMを使用した場合、使用される。
除タンパク
サンプルは、除タンパクされてよい。これは、当該分野に精通した者に既知の従来の技術により行われてよい。例えば、サンプルは、内標準を含むアセトニトリルと除タンパクした後、ボルテックスおよび遠心分離を行ってよい。内標準は、例えば、重水素化ホルモンであってよい。
サンプルは、除タンパクされてよい。これは、当該分野に精通した者に既知の従来の技術により行われてよい。例えば、サンプルは、内標準を含むアセトニトリルと除タンパクした後、ボルテックスおよび遠心分離を行ってよい。内標準は、例えば、重水素化ホルモンであってよい。
サンプルからのホルモンの分離
ホルモンは、当該分野に精通した者に知られる方法により分離される。例えば、ホルモンは、カラムを通して液体クロマトグラフ法により分離されてよい。多くの異なるカラムを使用してよい。例えば、カラムはC−18カラム、または、例えば、C−8カラムであってよい。カラムは、C6、C4、C2または同等のカラムでもよい。当該分野に精通した者に既知であるように、炭素鎖が短いほど、滞留時間が短い。ホルモンは、引き続き、カラムから溶出される。
ホルモンは、当該分野に精通した者に知られる方法により分離される。例えば、ホルモンは、カラムを通して液体クロマトグラフ法により分離されてよい。多くの異なるカラムを使用してよい。例えば、カラムはC−18カラム、または、例えば、C−8カラムであってよい。カラムは、C6、C4、C2または同等のカラムでもよい。当該分野に精通した者に既知であるように、炭素鎖が短いほど、滞留時間が短い。ホルモンは、引き続き、カラムから溶出される。
ホルモンは、遠心分離により分離されてもよい。例えば、FT4は、限外濾過装置を使用して遠心分離により、結合T4を含む他の化合物から分離されてよい。遠心分離後、限外濾過は、FT4を含むが、結合T4および他の化合物は、フィルターを通過することができない。代替的に、ホルモンは、平衡透析または当該分野で知られる他の方法により分離されてよい。
ホルモンの質量分析計への導入
ホルモンは、次に、質量分析計に導入される。任意に、分離ステップおよび質量分析計へのホルモンの導入は、併用液体クロマトグラフィー分析装置(LC/MS)を使用して組み合わせてよい。この工程は、サンプル注入のオンライン抽出に続いて、内蔵切替え弁を使用する質量分析計への導入に基づく。
ホルモンは、次に、質量分析計に導入される。任意に、分離ステップおよび質量分析計へのホルモンの導入は、併用液体クロマトグラフィー分析装置(LC/MS)を使用して組み合わせてよい。この工程は、サンプル注入のオンライン抽出に続いて、内蔵切替え弁を使用する質量分析計への導入に基づく。
同位体希釈タンデム質量分析法
本方法は、同位体希釈質量分析法を使用する。
本方法は、同位体希釈質量分析法を使用する。
装置およびイオン化技法
ホルモンは、イオン化の対象である。多様なイオン化技法を使用してよい。例えば、光イオン化、熱電気イオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)および電子捕獲イオン化を使用してよい。エレクトロスプレーイオン化は、甲状腺ホルモンを分析する場合に使用される。
ホルモンは、イオン化の対象である。多様なイオン化技法を使用してよい。例えば、光イオン化、熱電気イオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)および電子捕獲イオン化を使用してよい。エレクトロスプレーイオン化は、甲状腺ホルモンを分析する場合に使用される。
次の質量分析法が使用できる。米国特許4,121,099;4,137,750;4,328,420;4,963,736;5,179,278;5,248,875;5,412,208;および5,847,386(Applied Biosystems/MDS SCIEX,Foster City,Calif./Concord Ontario,Canada)に記述されるAPI3000TM質量分析計およびAPI4000TM質量分析計などのハイブリッド4極子リニアイオン捕捉質量分析計および液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計を含む、あらゆるタンデム分析装置。甲状腺ホルモンを分析する場合、API2000TMおよびAPI3000TM質量分析計などのターボスプレーイオン源を備えた分析装置が使用可能である。FT4を分析する場合、API4000TM質量分析計が使用可能である。FT3を分析する場合、API5000TM質量分析計が使用可能である。FT3およびFT4を同時分析する場合、API5000TM質量分析計が使用可能である。
当該分野に精通した者に知られるように、特定のイオン形態を引き起こす特定の分析物の傾向にもよるが、イオン化は質量分析計を使用して、ネガティブまたはポジティブモードで実施されてよい。基本的に、甲状腺ホルモンにおいて、分析装置は、ネガティブモードで実施される。
ホルモンは、当該分野に精通した者に知られるように、分子イオンと断片イオンの質量電荷比を基準に同定される。ホルモンが液体クロマトグラフにより精製される場合、ホルモンは、その滞留時間によっても同定される。
ホルモンは、カウント/秒で質量分析計により測定されるように、その強度により定量化される。既知のホルモン濃度における校正曲線は、比較のために設定される。
キット
FT4、FT3または双方を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析に用いられるキットも提供する。本キットは、当該分野に精通した者に既知であるように、組み合わせられる。本キットは、例えば、サンプルからホルモンを分離するための試薬、質量分析計を使用してホルモンを分析するための試薬、ホルモンの溶液および説明書を含む。
実施例
出願者の教示の側面は、本教示の範囲を制限することを意図するものではないが、以下の実施例を参照することにより、より理解されるだろう。
1.甲状腺ホルモンのサンプルの分析
100μLの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、150μLのアセトニトリルで沈殿させ、蓋をしてボルテックスにかけた。次に、サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをSupelco Discovery C−18TMモニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DBTMクロマトグラフカラム上に注入し、タンデム質量分析計(LC/MS/MS)と共役した。5mMの酢酸アンモニウム中の20%のメタノールで3分カラムを洗浄した。弁を切替え、サンプルを75%から95%のメタノールで溶出した。総実行時間は6分であった。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
FT4、FT3または双方を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析に用いられるキットも提供する。本キットは、当該分野に精通した者に既知であるように、組み合わせられる。本キットは、例えば、サンプルからホルモンを分離するための試薬、質量分析計を使用してホルモンを分析するための試薬、ホルモンの溶液および説明書を含む。
実施例
出願者の教示の側面は、本教示の範囲を制限することを意図するものではないが、以下の実施例を参照することにより、より理解されるだろう。
1.甲状腺ホルモンのサンプルの分析
100μLの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、150μLのアセトニトリルで沈殿させ、蓋をしてボルテックスにかけた。次に、サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをSupelco Discovery C−18TMモニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DBTMクロマトグラフカラム上に注入し、タンデム質量分析計(LC/MS/MS)と共役した。5mMの酢酸アンモニウム中の20%のメタノールで3分カラムを洗浄した。弁を切替え、サンプルを75%から95%のメタノールで溶出した。総実行時間は6分であった。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
溶出液をイオンスプレー電離箱に入れ、ネガティブモードを用いてAPI2000TM質量分析計で分析した。T4およびT3イオンの質量/電荷比は、それぞれ775.8と650であった。イオン化は、ターボイオンスプレー箱を使用してエレクトロスプレーにより行われてよい。
これは、ホルモン含有の分析における複雑な生体マトリックスを調製する簡単な方法およびT3とT4双方のホルモンの同時分析を可能にする高感度な分析方法を示す。
2.ホルモンを溶出するためにメタノール勾配を使用した甲状腺ホルモンの分析
100μLの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、重水素化されたT4の内標準を含有する150μLのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをタンデム質量分析計(LC/MS/MS)と共役したC−18カラムに注入した。5mMの酢酸アンモニウム中の20%のメタノールで3分カラムを洗浄した。カラム上の弁を切替え、サンプルを20%から100%のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は7分であった。当該分野に精通した者に既知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
2.ホルモンを溶出するためにメタノール勾配を使用した甲状腺ホルモンの分析
100μLの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、重水素化されたT4の内標準を含有する150μLのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをタンデム質量分析計(LC/MS/MS)と共役したC−18カラムに注入した。5mMの酢酸アンモニウム中の20%のメタノールで3分カラムを洗浄した。カラム上の弁を切替え、サンプルを20%から100%のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は7分であった。当該分野に精通した者に既知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
溶出液のサンプルをイオンスプレー電離箱に入れ、ネガティブモードを用いてAPI3000TM質量分析計で分析した。イオン化は、ターボイオンスプレー箱を使用してエレクトロスプレーにより行われてよい。図1および図2は、T3およびT4に対して作成された質量スペクトルを示す。
これは、甲状腺ホルモン含有の分析における複雑な生体マトリックスを調製する簡単な方法および複数のホルモンの同時分析を可能にする高感度な分析方法を示す。
3.同位体希釈タンデム質量分析法を用いた甲状腺ホルモンの分析
本実施例は、血清中のT4およびT3の同時判定における同位体希釈タンデム質量分析法を説明する。本方法は、正確、特異的、精密(%CV:3.5と9.0の間)かつ簡単であり、抽出をする必要がなく、タンパク質の沈殿のみを必要とし、迅速である。例えば、これは7分以下で実行できる。
本実施例は、血清中のT4およびT3の同時判定における同位体希釈タンデム質量分析法を説明する。本方法は、正確、特異的、精密(%CV:3.5と9.0の間)かつ簡単であり、抽出をする必要がなく、タンパク質の沈殿のみを必要とし、迅速である。例えば、これは7分以下で実行できる。
化学物質および試薬
T4およびT3の標準は、Sigma(St.Louis,MO,USA)から購入された。安定した重水素標識された内標準、L−サイロキシン−d2をGeorgetown J UniversityのChemistry DepartmentのDr Tomas Classによる文献[16]、[17]に記述された手順で合成した。HPLCグレードメタノールをVWR Scientificから購入した。他の全ての化学物質は、分析グレードのものであり、Sigmaから購入した。
T4およびT3の標準は、Sigma(St.Louis,MO,USA)から購入された。安定した重水素標識された内標準、L−サイロキシン−d2をGeorgetown J UniversityのChemistry DepartmentのDr Tomas Classによる文献[16]、[17]に記述された手順で合成した。HPLCグレードメタノールをVWR Scientificから購入した。他の全ての化学物質は、分析グレードのものであり、Sigmaから購入した。
溶液および標準
T3、T4の原液および内標準(IS)を、それぞれ1mg/mLの濃度を得るため別々に調製した。メタノール中の40%水酸化アンモニウム(v/v)を溶媒として使用した。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は4℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。T3は0.325から5ng/mL、T4は12.5から200ng/mLの範囲での校正曲線の標準は、分析物を3%のヒトγ−グロブリン(スパイク状溶液量<2%最終量)に添加して調製された。低、中、高レベルの品質管理(QC)サンプル(Diagnostic Product Corp.,Los Angeles,USA)を使用した。メタノール中の50−ng/mL d2−T4の溶液を内標準として使用した。
T3、T4の原液および内標準(IS)を、それぞれ1mg/mLの濃度を得るため別々に調製した。メタノール中の40%水酸化アンモニウム(v/v)を溶媒として使用した。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は4℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。T3は0.325から5ng/mL、T4は12.5から200ng/mLの範囲での校正曲線の標準は、分析物を3%のヒトγ−グロブリン(スパイク状溶液量<2%最終量)に添加して調製された。低、中、高レベルの品質管理(QC)サンプル(Diagnostic Product Corp.,Los Angeles,USA)を使用した。メタノール中の50−ng/mL d2−T4の溶液を内標準として使用した。
サンプルの調製
血清または血漿のサンプルを室温で解凍した。150μLのIS溶液を100μLの血清または血漿サンプルのアリコートに添加した。ボルテックスに30秒かけた後、サンプルを室温で10分間保管し、タンパク質の沈殿を完了した。サンプルを15,000rpmで10分間遠心分離し、100μLの上澄みをLC−MS−MSシステムに注入した。
血清または血漿のサンプルを室温で解凍した。150μLのIS溶液を100μLの血清または血漿サンプルのアリコートに添加した。ボルテックスに30秒かけた後、サンプルを室温で10分間保管し、タンパク質の沈殿を完了した。サンプルを15,000rpmで10分間遠心分離し、100μLの上澄みをLC−MS−MSシステムに注入した。
LC/MS/MS条件
ターボイオンスプレーを備えたAPI3000TMタンデム質量分析計(SCIEX,Toronto,Canada)およびShimadzu HPLCシステムを分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング(MRM)モードを使用した。モニターへの移行は、T3にはm/z 650→127、T4にはm/z 776→127、d2−T4にはm/z 778→127で選択された。窒素は、補助的なカーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源温度、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、20μL/分でのメタノール中の1μg/mLの標準液注入およびLC流量でのフロー注入分析(FIA)により、各化合物に対して最適化された。質量分析計における主な作動パラメータは、表3に要約されている。データ処理は、Analyst1.2ソフトウェアパッケージで実行された。
ターボイオンスプレーを備えたAPI3000TMタンデム質量分析計(SCIEX,Toronto,Canada)およびShimadzu HPLCシステムを分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング(MRM)モードを使用した。モニターへの移行は、T3にはm/z 650→127、T4にはm/z 776→127、d2−T4にはm/z 778→127で選択された。窒素は、補助的なカーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源温度、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、20μL/分でのメタノール中の1μg/mLの標準液注入およびLC流量でのフロー注入分析(FIA)により、各化合物に対して最適化された。質量分析計における主な作動パラメータは、表3に要約されている。データ処理は、Analyst1.2ソフトウェアパッケージで実行された。
LC−MS−MS手順
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出/洗浄後に内蔵Valco切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。100μlのサンプルを、Supelco Discovery C−18(3.0mm)モニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DB(3.3cmx3.0mm,3.0μmID)クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは0.8mL/分の流量でpH=4.0の5mM酢酸アンモニウム中20%(v/v)メタノールで洗浄される。3.5分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを0.5mL/分の流量で水/メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表4に示す。
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出/洗浄後に内蔵Valco切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。100μlのサンプルを、Supelco Discovery C−18(3.0mm)モニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DB(3.3cmx3.0mm,3.0μmID)クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは0.8mL/分の流量でpH=4.0の5mM酢酸アンモニウム中20%(v/v)メタノールで洗浄される。3.5分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを0.5mL/分の流量で水/メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表4に示す。
T4およびT3のイムノアッセイ
製造会社の使用に従って、T4をDade RxL DimensionTM(Dade−Behring Diagnostics,Glasgow,DE)で、T3をDPC ImmuliteTM(Diagnostic Product Corporation,Los Angeles,CA)で測定した。
製造会社の使用に従って、T4をDade RxL DimensionTM(Dade−Behring Diagnostics,Glasgow,DE)で、T3をDPC ImmuliteTM(Diagnostic Product Corporation,Los Angeles,CA)で測定した。
結果
使用した質量分析計作動パラメータは、表3および4に示す。
使用した質量分析計作動パラメータは、表3および4に示す。
複製セラをいくつかの濃度で日内および日間の双方で測定した。日内および日間の正確なデータを表5および6に示す。
T4およびT3の回復試験を表7および8に示す。示される全ての結果は、8つの複製の平均である。
図3は、T3およびT4に対して得た典型的なタンデム質量分析クロマトグラフを示す(T4m/z(776/127);D2T4m/z(778/127);T3m/z(650/127))。
被験物は、双方のイムノアッセイ(T3 DPC Immulite,T4 Dade Behring DimensionTM RxL)およびタンデム質量分析法により、T3およびT4に対して試験された。直線回帰相関(Prism)を図4および5に示す。
質量分析法の定量化の最低限界は、T3およびT4の双方において0.15ng/mLであった。検出限界は、ほぼ0.062ng/mLであった。
考察
CAP PTプログラムおよび異なる免疫測定を使用した小児参照範囲の双方から初めに集めた証拠は、T4およびT3免疫測定試験の特異性の欠如の可能性を示す。この現象を適切に評価するために、同位体希釈タンデム質量分析法を本実施例に示すように発達させた。血清T4およびT3検出法は、1950年代より様々な技術を通して発展した。甲状腺ホルモンを検出するために、放射性イムノアッセイ(RIA)が1970年代に開発された。血清T4およびT3濃度は、現在、ほとんど非同位体で、酵素、蛍光または化学発光性分子をシグナルとして使用する比較イムノアッセイ(IA)により測定される[27]。表2は、現在のT4およびT3におけるIAは、特異性に欠け、アメリカ病理学会熟達度試験(CAP PT)プログラムで、約二つの要因により異なる平均結果が得られることを明確に示している。全ホルモン測定法は、結合タンパク質からホルモンを剥離する置換剤(サリシレートなど)の含有を必要とする[28]。そのような薬剤による血清タンパク質からのホルモン結合の置換は、現在の測定法に使用される大規模なサンプル希釈と共に、ホルモンの抗体試薬への結合を促進する。
CAP PTプログラムおよび異なる免疫測定を使用した小児参照範囲の双方から初めに集めた証拠は、T4およびT3免疫測定試験の特異性の欠如の可能性を示す。この現象を適切に評価するために、同位体希釈タンデム質量分析法を本実施例に示すように発達させた。血清T4およびT3検出法は、1950年代より様々な技術を通して発展した。甲状腺ホルモンを検出するために、放射性イムノアッセイ(RIA)が1970年代に開発された。血清T4およびT3濃度は、現在、ほとんど非同位体で、酵素、蛍光または化学発光性分子をシグナルとして使用する比較イムノアッセイ(IA)により測定される[27]。表2は、現在のT4およびT3におけるIAは、特異性に欠け、アメリカ病理学会熟達度試験(CAP PT)プログラムで、約二つの要因により異なる平均結果が得られることを明確に示している。全ホルモン測定法は、結合タンパク質からホルモンを剥離する置換剤(サリシレートなど)の含有を必要とする[28]。そのような薬剤による血清タンパク質からのホルモン結合の置換は、現在の測定法に使用される大規模なサンプル希釈と共に、ホルモンの抗体試薬への結合を促進する。
血中のT4と比較してT3は、10倍低い濃度のため、よって、より多くの試料量が使用されるにもかかわらず、技術的感度と精度問題の双方が存在する。信頼性の高い高域なT3測定が、甲状腺機能亢進症の診断に対して批判的であるが、信頼性の高い正常域の測定も、逆説的にT3値が甲状腺機能亢進症を示す可能性がある、病気入院中の患者の抗甲状腺薬量の調節および甲状腺機能亢進症の検知に重要である。
T4比較(0.931)における相関率は、T3比較(0.848)より格段に優れている(図4および5)。タンデム質量測定法によるT3は、DPC ImmuliteTMにより得られたそれらよりわずかに高い結果を示した(図4)。これは子供には当てはまるが、妊娠していない女性と妊娠している女性における仮集計データは、両グループのT3において非常に低い相関性を示す(r:0.407〜0.574間)(すなわち、DPC Immuliteと妊娠していない女性および妊娠している女性の双方における現在の教示法間の相関性は低い。)
この理由は、明らかではないが、標準化の問題、異好抗体などを含む可能性がある。重要な娘イオンである127m/zに欠けるリバースT3は、タンデム質量分析法では干渉しない。K/fCN(甲状腺)凡用リガントプログラムのCAP PTサンプルに対するタンデム質量分析法の適用は、T3のイムノアッセイの約85%が、本出願者の教示のタンデム質量分析法により得た平均より低いサンプルの平均を与え、15%が高い平均を与えることを再度明らかにした。T4において、タンデム質量分析法は、イムノアッセイの平均より低い平均結果を生じた。
この理由は、明らかではないが、標準化の問題、異好抗体などを含む可能性がある。重要な娘イオンである127m/zに欠けるリバースT3は、タンデム質量分析法では干渉しない。K/fCN(甲状腺)凡用リガントプログラムのCAP PTサンプルに対するタンデム質量分析法の適用は、T3のイムノアッセイの約85%が、本出願者の教示のタンデム質量分析法により得た平均より低いサンプルの平均を与え、15%が高い平均を与えることを再度明らかにした。T4において、タンデム質量分析法は、イムノアッセイの平均より低い平均結果を生じた。
結論として、T4およびT3におけるイムノアッセイとタンデム質量分析法間の相関が示された。相関は、T3に対してよりT4に対して優れている。さらに、相関は、妊娠中はあまり際立たない。内標準として重水素化されたT4を使用したいくつかの異なるセラからの回復試験は、T4およびT3の双方において、一定(90〜109%)の回復を示した(表7および8)。サンプル間に見られる回復差異は、T3に対してよりT4に対して驚くほど大きい。これは、T3内標準として重水素化されたT3を使用する必要がないことを示す。出願者の教示の同位体希釈タンデム質量分析法は、迅速(7分以下)、正確(回復試験により評価されるように、真の結果を提供する)、特異的(測定を主張する分析物のみを測定する)、精密(低い%CV)および実施が容易である。
多くの一般的な臨床化学サービス研究所は、週7日24時間利用可能な類似体(直接)による遊離サイロキシン(FT4)の測定を提供する。にもかかわらず、類似体FT4イムノアッセイの有効性は、長い間、問題であり、本アプローチを使用した患者の結果は、しばしば臨床像を一致しない。これにより、2.5番目の分位数以下および97.5番目の百分位数以上の直接遊離T4は、しばしば、FT4の現在の「判断基準」方法である平衡透析により、さらなる測定に送られた。これらの約50%において、平衡透析によるFT4が正常と見なされてきた。現法は、同位体希釈タンデム質量分析法を用いた迅速で信頼できる遊離T4法を教示し、類似体(直接)遊離T4と時間がかかり比較的高価な平衡透析法の双方を用いて、本方法により得られた結果を比較する。
方法:
化学物質および試薬
サイロキシン(TA)は、Sigma(St.Louis,MO)から購入された。安定した重水素標識された内標準、L−サイロキシン−d2をGeorgetown J UniversityのChemistry DepartmentのDr Tomas Classによる文献(29、30)に記述された手順で合成した。HPLCグレードメタノールをVWR Scientificから購入した。他の全ての化学物質は、分析グレードのものであり、Sigmaから購入した。
溶液および標準
T4の原液および内標準(IS)は、メタノール中の40%水酸化アンモニウム(v/v)を溶媒として、それぞれ10mg/mLの濃度を得るため別々に調製された。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は−20℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。2.5〜50pg/mLの範囲でのT4校正曲線の標準は、分析物を水に添加して調製された。メタノール中0.05ng/mLのd2−T4溶液を内標準として使用した。
T4の原液および内標準(IS)は、メタノール中の40%水酸化アンモニウム(v/v)を溶媒として、それぞれ10mg/mLの濃度を得るため別々に調製された。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は−20℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。2.5〜50pg/mLの範囲でのT4校正曲線の標準は、分析物を水に添加して調製された。メタノール中0.05ng/mLのd2−T4溶液を内標準として使用した。
サンプルの調製
血清または血漿のサンプルを、治験審査委員会(IRB)により承認された試験で、42人以上の健康な妊娠女性と29人以上の妊娠していない女性から得、室温で解凍した。0.6mlのサンプルを、Eppendorf温度制御遠心分離(モデル#5702 R,Eppendorf,AG,Hamburg)を用い、2900rpmで、1時間25oの温度で、固定角ローターを使用した遠心分離により、Centrifree YM−30限外濾過装置(30,000MW cut−off,Millipore,Bedford,MA)を通して濾過した。180μLのIS[0.05ng/mL]を360μLの限外濾過物質に添加に、400μLがLC/MS/MSシステムのC−18カラム上に注入された。この限外濾過工程は、従来の平衡透析法の透析工程を置換える。限外濾過ステップは、30,000以上の分子量をもつ全タンパク質の除去を含む。液体クロマトグラフ工程は、ホルモンをさらに分離し精製するために使用してよい。
血清または血漿のサンプルを、治験審査委員会(IRB)により承認された試験で、42人以上の健康な妊娠女性と29人以上の妊娠していない女性から得、室温で解凍した。0.6mlのサンプルを、Eppendorf温度制御遠心分離(モデル#5702 R,Eppendorf,AG,Hamburg)を用い、2900rpmで、1時間25oの温度で、固定角ローターを使用した遠心分離により、Centrifree YM−30限外濾過装置(30,000MW cut−off,Millipore,Bedford,MA)を通して濾過した。180μLのIS[0.05ng/mL]を360μLの限外濾過物質に添加に、400μLがLC/MS/MSシステムのC−18カラム上に注入された。この限外濾過工程は、従来の平衡透析法の透析工程を置換える。限外濾過ステップは、30,000以上の分子量をもつ全タンパク質の除去を含む。液体クロマトグラフ工程は、ホルモンをさらに分離し精製するために使用してよい。
LC/MS/MSセットアップ
ターボイオンスプレーおよびAgilent1100HPLCシステムを備えたAPI4000TMタンデム質量分析計(SCIEX,Toronto,Canada)を分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング(MRM)モードを使用した。モニターへの移行が選択され、T4はm/z 775.9→126.9、d2−T4はm/z 777.9→126.9であった。窒素は、補助、カーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源to、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、20μL/分でのメタノール中のlμg/mLの標準液注入およびLC流量でのフロー注入分析(FIA)により、各化合物に対して最適化された。使用された質量分析計の主な作動パラメータは、表9に要約されている。データ処理は、Analyst1.4.1ソフトウェアパッケージで実行された。ネガティブモードが本実施例で使用されたが、ポジティブモードが使用可能であるが感度が低い。
ターボイオンスプレーおよびAgilent1100HPLCシステムを備えたAPI4000TMタンデム質量分析計(SCIEX,Toronto,Canada)を分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング(MRM)モードを使用した。モニターへの移行が選択され、T4はm/z 775.9→126.9、d2−T4はm/z 777.9→126.9であった。窒素は、補助、カーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源to、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、20μL/分でのメタノール中のlμg/mLの標準液注入およびLC流量でのフロー注入分析(FIA)により、各化合物に対して最適化された。使用された質量分析計の主な作動パラメータは、表9に要約されている。データ処理は、Analyst1.4.1ソフトウェアパッケージで実行された。ネガティブモードが本実施例で使用されたが、ポジティブモードが使用可能であるが感度が低い。
LC−MS−MS手順
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出/洗浄後に内蔵Valco切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。400μlのサンプルを、Supelco Discovery C−18(3.0mm)モニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DB(3.3cmx3.0mm,3.0μmID)クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは0.8mL/分の流量でpH=4.0の5mM酢酸アンモニウム中の20%(v/v)メタノールで洗浄される。4分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを0.6mL/分の流量で水/メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表10に示す。遊離T4クロマトグラフは図6に示す。
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出/洗浄後に内蔵Valco切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。400μlのサンプルを、Supelco Discovery C−18(3.0mm)モニタリングカラムを備えたSupelco LC−18−DB(3.3cmx3.0mm,3.0μmID)クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは0.8mL/分の流量でpH=4.0の5mM酢酸アンモニウム中の20%(v/v)メタノールで洗浄される。4分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを0.6mL/分の流量で水/メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表10に示す。遊離T4クロマトグラフは図6に示す。
平衡透析法
Nichols遊離T4キット(Nichols Institute Diagnostics,Catalogue #30−0652,San Clemente,CA)を製造者により提供された手順により使用した。平衡透析法とタンデム質量分析法の比較は、患者のサンプル(n=68)で実施された。
類似体/直接遊離T4
Dade RxL Dimensionを直接遊離T4法に対して使用した(Dade−Behring Diagnostics,Glasgow,DE)。患者のサンプルにおける結果は、タンデム質量分析法(n=154)を使用して得た値と比較した。
Nichols遊離T4キット(Nichols Institute Diagnostics,Catalogue #30−0652,San Clemente,CA)を製造者により提供された手順により使用した。平衡透析法とタンデム質量分析法の比較は、患者のサンプル(n=68)で実施された。
類似体/直接遊離T4
Dade RxL Dimensionを直接遊離T4法に対して使用した(Dade−Behring Diagnostics,Glasgow,DE)。患者のサンプルにおける結果は、タンデム質量分析法(n=154)を使用して得た値と比較した。
日間および日内変動
日間および日内変動を三つの異なる濃度で評価した(表12)。
日間および日内変動を三つの異なる濃度で評価した(表12)。
結果および考察
表9および10は、タンデム質量分析法を用いた分析パラメータを表す。図6は、上述した方法を使用したタンデム質量分析法により測定した遊離T4の典型的なクロマトグラフを示す。急勾配は、約6分にこれを短くするが、分析毎の時間は、約8.5分である。Eppendorf遠心分離は、30のチューブの遠心分離を同時に行えるので、25℃で使用した30人の患者のサンプルの総実行時間は、1時間プラス3時間15分、または4時間15分である。限外濾過プラスLC/MS/MS測定は、時間のかかる平衡透析法より非常に速い。後者は、37℃で16〜18時間の透析の後、免疫測定を必要とするため、応答時間は数日に及ぶ。また、北米のほとんどの研究所は、平衡分析アプローチを提供しない。FT4濃度は、温度に依存する(31)。Amicon Centrifreeチューブの遠心分離が、25℃で生じる場合(図7および表11を参照)、タンデム質量分析法により得られた結果は、37℃の温度で行われる平衡透析法により得られる結果と密接に関わる。この12℃の温度の醒は、多分、平衡透析法と遠心分離法で用いられた異なる膜の結果である。新しい同位体希釈タンデム質量分析法と従来の判断基準である平衡透析法の間の相関は、良好である。平衡分析法=0.971質量分析法+0.041、n=68、Syx=1.381、r=0.954(図8)。対照的に、相関性の低さが、類似体(直接)FT4法で示された(イムノアッセイ=0.326質量分析法+6.27、n=154、Syx=1.96、r=0.459、図9)。日内および日間変動は、試験された全濃度が、7.1%以下の変動(Cv)率であることを示した。本結果は、異なる平衡透析法を使用して得られたものより優れている。検出最低限度(ベースラインのノイズに対して三つの標準偏差以上を読取る)は、2.5pg/mLである。
表9および10は、タンデム質量分析法を用いた分析パラメータを表す。図6は、上述した方法を使用したタンデム質量分析法により測定した遊離T4の典型的なクロマトグラフを示す。急勾配は、約6分にこれを短くするが、分析毎の時間は、約8.5分である。Eppendorf遠心分離は、30のチューブの遠心分離を同時に行えるので、25℃で使用した30人の患者のサンプルの総実行時間は、1時間プラス3時間15分、または4時間15分である。限外濾過プラスLC/MS/MS測定は、時間のかかる平衡透析法より非常に速い。後者は、37℃で16〜18時間の透析の後、免疫測定を必要とするため、応答時間は数日に及ぶ。また、北米のほとんどの研究所は、平衡分析アプローチを提供しない。FT4濃度は、温度に依存する(31)。Amicon Centrifreeチューブの遠心分離が、25℃で生じる場合(図7および表11を参照)、タンデム質量分析法により得られた結果は、37℃の温度で行われる平衡透析法により得られる結果と密接に関わる。この12℃の温度の醒は、多分、平衡透析法と遠心分離法で用いられた異なる膜の結果である。新しい同位体希釈タンデム質量分析法と従来の判断基準である平衡透析法の間の相関は、良好である。平衡分析法=0.971質量分析法+0.041、n=68、Syx=1.381、r=0.954(図8)。対照的に、相関性の低さが、類似体(直接)FT4法で示された(イムノアッセイ=0.326質量分析法+6.27、n=154、Syx=1.96、r=0.459、図9)。日内および日間変動は、試験された全濃度が、7.1%以下の変動(Cv)率であることを示した。本結果は、異なる平衡透析法を使用して得られたものより優れている。検出最低限度(ベースラインのノイズに対して三つの標準偏差以上を読取る)は、2.5pg/mLである。
これらの研究は類似体工程が、遊離T4において不良な結果を生じることを確証する。これは、正常甲状腺刺激ホルモン(TSH)値も有する、2.5番目の百分位数以下の全FT4と97.5番目の百分位数以上の全FT4の反射試験が行われることにより、さらに支持される。近似的に、Dade RxL DimensionTMまたはDPC ImmuliteTMのいずれかで実行されるこれらの遊離T4の50%は、平衡透析法により実行される場合、正常な結果を示す。最後に、今回の研究において、タンデムMSによる96.7番目の百分位数以上のFT4の80%は、1.0uIU/mL以下のTSHと関係するが(後者は、Dade RxL DimensionTMにより測定された)、同一の患者縦断において、直接IAにより測定された96.7番目の百分位数以上のFT4の40%が、1.0uIU/mL以下のTSHを有する。
血漿限外濾過でタンデム質量分析法を使用する前に、RIAキット(Nichols)、Dade RxLTMおよびDPC MMULITETMプラットホームを含むいくつかのアプローチを使用して、IAにより限外濾過でFT4を測定する試みがなされたことにも留意するべきである。全ての場合において、これが実行可能な選択肢ではないことを示す、きわめて低い結果であった。
結論として、限外濾過を用いたFT4測定のための新しい同位体希釈質量分析法が、開発された。工程はきわめて精密であり、判断基準と良好に比較できる。これらの魅力的な特徴に基づき、FT4の測定法は、臨床現場において、広い応用性を有するだろう。
5.甲状腺ホルモンおよびステロイドホルモンの分析
500から1000μLの血漿をサンプルとして使用した。タンパク質は、150μLのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをタンデム質量分析計(LC/MS/MS)に結合したC−18カラムに注入した。カラムを5mMの酢酸アンモニウム中の20%メタノールで3分間洗浄した。カラムの弁を切替え、サンプルを20から100%のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は、10分である。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
500から1000μLの血漿をサンプルとして使用した。タンパク質は、150μLのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、200μLの上澄みをタンデム質量分析計(LC/MS/MS)に結合したC−18カラムに注入した。カラムを5mMの酢酸アンモニウム中の20%メタノールで3分間洗浄した。カラムの弁を切替え、サンプルを20から100%のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は、10分である。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
溶出物のサンプルをイオンスプレー電離箱に入れ、サンプル中の甲状腺ホルモンに対してネガティブモードを使用し、API3000TM質量分析計により分析した。サンプル中のステロイドホルモンは、分析装置をネガティブまたはポジティブモードにして、光イオン化によりイオン化する。ポジティブモードでの分析は、基本的に、DHEA、アルドステロン、コルチゾル、11−デオキシコルチゾル、アンドロステンジオン、テストステロン、エストラジオール、17−OHプロゲステロン、プロゲステロン、アロプレグナノロン、ビタミンD、25,ヒドロキシルビタミンD、1,25ジヒドロキシビタミンD、コルチコステロンおよびアルドステロンに対してなされ、ネガティブモードでの分析は、基本的に、16−OHエストロン、2−OHエストロン、エストリオールおよびDHEASに対してなされる。しかし、陽性またはネガティブモードのいずれかであらゆるホルモンを分析することが可能である。
これは、ステロイドおよび甲状腺ホルモンの含有の可能性がある分析に対して、複合生体マトリックスを調製する簡単な方法を示す。ネガティブモードで実行されるステロイドホルモンは、甲状腺ホルモンと同時に実行してよい。
結果は、本技術が、ヒトの血漿および唾液中の甲状腺ホルモンの低レベルの同定および特徴づけを可能にすることを示す。
6.FT3ホルモンの分析
FT3は、全T3の同遷移イオンの分析およびAPI5000TMTM質量分析計の使用を除き、FT4(実施例4)と同様の方法で分析された。
FT3は、全T3の同遷移イオンの分析およびAPI5000TMTM質量分析計の使用を除き、FT4(実施例4)と同様の方法で分析された。
7.FT4およびFT3の同時分析
甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症の患者は、FT4およびFT3濃度の測定を通して甲状腺機能の評価を頻繁に必要とする。さらに、甲状腺を切断した患者は、synthroidなどの甲状腺補充治療を必要とする。これらの患者のFT4およびFT3濃度の測定は、調剤処方の判定に重要である。つまり、FT4およびFT3の同時分析の効果的な測定法が有益である。
甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症の患者は、FT4およびFT3濃度の測定を通して甲状腺機能の評価を頻繁に必要とする。さらに、甲状腺を切断した患者は、synthroidなどの甲状腺補充治療を必要とする。これらの患者のFT4およびFT3濃度の測定は、調剤処方の判定に重要である。つまり、FT4およびFT3の同時分析の効果的な測定法が有益である。
API5000TM質量分析計を使用することを除き、FT4およびFT3を実施例4と類似した方法で同時分析をおこなった。内標準T4−d2を混ぜたT3(25pg/mL)とT4(1ng/mL)の混合液100μLを自動サンプラーでカラムに注入し、カラムを20%のMeOH緩衝液で2分間洗浄した。Valco弁を2分間作動させた後、20%MeOHから100%MeOHへ2分間勾配溶出を開始させ、次に、2分間100%を維持した。滞留時間は、T3で4.34分、T4で4.60分、T4−d2で4.61分であった。図10は、分析物の質量スペクトルを示す。FT3(1〜25pg/ml)およびFT4(5〜50pg/ml)の標準曲線は、サンプルの分析中に実行可能である。
出願者の教示は、多様な実施形態と併用して説明されるが、出願者の教示は、そのような実施形態に制限されるものではない。逆に、出願者の教示は、当該分野に精通した者に理解されるように、様々な代替例、修正例および同等例を含む。
参考文献
本明細書に列挙されるすべての参考文献は、その全体が参考として援用される。
本明細書に列挙されるすべての参考文献は、その全体が参考として援用される。
Claims (78)
- 遊離サイロキシン(FT4)ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
(a)FT4ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
(b)FT4ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
(c)FT4ホルモンを収集するステップと、
(d)質量分析計を使用してFT4ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。 - 前記サンプルからFT4ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルからFT4ホルモンを分離する前記ステップは、約30,000MWのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルからFT4ホルモンを分離する前記ステップは、Centrifree YM−30TM限外濾過装置の使用を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記FT4ホルモンは、約25℃で約1時間の遠心分離法により分離される、請求項3または4のいずれかに記載の方法。
- FT4ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血液である、請求項6に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項6に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血清である、請求項6に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、尿である、請求項6に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項6に記載の方法。
- FT4ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約500μLである、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT4ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項1に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項14に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項16に記載の方法。
- 前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項17に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項1に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項1に記載の方法。
- FT4ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項1に記載のステップ(b)および(c)に従い前記サンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項1に記載のステップ(d)に従い前記サンプルからのFT4ホルモンを分析することを含む、方法。
- 遊離トリヨードサイロニン(FT3)ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
(a)FT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
(b)FT3ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
(c)FT3ホルモンを収集するステップと、
(d)質量分析計を使用してFT3ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。 - 前記サンプルからFT3ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルからFT3ホルモンを分離する前記ステップは、約30,000MWのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記サンプルからFT3ホルモンを分離する前記ステップは、Centrifree YM−30TM限外濾過装置の使用を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記FT3ホルモンは、約25℃で約1時間の遠心分離法により分離される、請求項24または25のいずれかに記載の方法。
- FT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項22に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血液である、請求項27に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項27に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血清である、請求項27に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、尿である、請求項27に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項27に記載の方法。
- FT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約500μLである、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT3ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項22に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項35に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT3ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項37に記載の方法。
- 前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項38に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT3ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項22に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT3ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項22に記載の方法。
- FT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項22に記載のステップ(b)および(c)に従い前記サンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項22に記載のステップ(d)に従い前記サンプルからのFT3ホルモンを分析することを含む、方法。
- FT4およびFT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
(a)FT4およびFTホルモン3を含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
(b)FT4およびFT3ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
(c)FT4およびFT3ホルモンを収集するステップと、
(e)質量分析計を使用してFT4およびFT3ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。 - 前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項43に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血液である、請求項43に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項43に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血清である、請求項43に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、尿である、請求項43に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項43に記載の方法。
- FT4およびFT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約500μLである、請求項43に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT4およびFT3ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT4およびFT3ホルモンを分離する前記ステップは、約30,000MWのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT4およびFT3ホルモンを分離する前記ステップは、Centrifree YM−30TM限外濾過装置の使用を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記FT4およびFT3ホルモンは、約25℃で、約1時間、遠心分離法により分離される、請求項52または53に記載の方法。
- 前記サンプルから前記FT4およびFT3ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項43に記載の方法。
- 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項43に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項43に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4およびFT3ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項58に記載の方法。
- 前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項59に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4およびFT3ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項43に記載の方法。
- 質量分析計を使用した前記FT4およびFT3ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記ホルモンは、同時に分析される、請求項43に記載の方法。
- 前記ホルモンは、連続して分析される、請求項43に記載の方法。
- 前記サンプルは、同位体希釈タンデム質量分析法により分析される、請求項43に記載の方法。
- FT4およびFT3ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項43に記載のステップ(b)および(c)に従いサンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項43に記載のステップ(e)に従いFT4およびFT3ホルモンを分析することを含む、方法。
- FT4を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のためのシステムであって、
(a)内標準を含む、前記サンプルからFT4を分離するための試薬と、
(b)質量分析計を使用してFT4ホルモンを分析するための試薬と、
(c)質量分析計と、
を含む、システム。 - 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項67に記載のシステム。
- FT3を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のためのシステムであって、
(a)内標準を含む、前記サンプルからFT3を分離するための試薬と、
(b)質量分析計を使用してFT3を分析するための試薬と、
(c)質量分析計と、
を含む、システム。 - 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項69に記載のシステム。
- FT4を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
(a)前記サンプルからFT4を分離するための試薬と、
(b)質量分析計を使用してFT4を分析するための試薬と、
(c)FT4の溶液と、
(d)質量分析計を使用してFT4を分析するための指示書と、
を含む、キット。 - FT3を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
(a)前記サンプルからFT3を分離するための試薬と、
(b)質量分析計を使用してFT3を分析するための試薬と、
(c)FT3の溶液と、
(d)質量分析計を使用してFT3を分析するための指示書と、
を含む、キット。 - FT3およびFT4を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
(a)前記サンプルからFT3およびFT4を分離するための試薬と、
(b)質量分析計を使用してFT3およびFT4を分析するための試薬と、
(c)FT3およびFT4の溶液と、
(d)質量分析計を使用してFT3およびFT4を分析するための指示書と、
を含む、キット - FT3、FT4または双方のホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを分析するための質量分析計の使用。
- 前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項73に記載の使用。
- 前記質量分析計は、API4000TMである、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記質量分析計は、API5000TMである、請求項22〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記質量分析計は、API5000TMである、請求項43〜66のいずれか一項に記載の方法。
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